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CN112654364A - 反向肽疫苗 - Google Patents

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CN112654364A
CN112654364A CN201980047427.8A CN201980047427A CN112654364A CN 112654364 A CN112654364 A CN 112654364A CN 201980047427 A CN201980047427 A CN 201980047427A CN 112654364 A CN112654364 A CN 112654364A
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拉米拉·菲利普
理查德·大卫·佩林斯
黄小芳
托马斯·拉德马赫
克里斯多夫·厄普顿
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Emergex Vaccines Holding Ltd
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Abstract

本发明涉及疫苗组合物和此类组合物用于治疗和预防病毒感染的用途，所述疫苗组合物包含肽，所述肽由开放阅读框（ORF）编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。

Description

反向肽疫苗
发明领域
本发明涉及疫苗组合物和此类组合物用于治疗和预防病毒感染的用途，所述疫苗组合物包含肽，所述肽由开放阅读框(ORF)编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
发明背景
流感是一个严重的全球健康问题，每年感染世界人口的多达20％，导致全球多达500万例严重疾病和超过30万人死亡。仅在美国，每年估计有超过30,000人死亡以及近30万人住院治疗是由于流感感染。随着最近新的、严重的和可能复发的季节性疾病的出现，世界卫生组织正在鼓励开展广泛的疫苗接种运动，以降低流感引起的肺炎的发病率。有效地降低流感的发病率将需要持续的密集的监测、增加目前可用的流感疫苗的使用、以及能够提供更广泛的保护以防止流感的毒株移位和漂变(shift-and-drift)的替代的疫苗和抗病毒药物的可用性。成功的流感疫苗接种运动能够产生巨大的社会和经济影响。
对流感的免疫反应是由先天免疫和适应性免疫共同控制的。对流感的先天免疫反应限制了最初的病毒复制，但相对来说是非特异性的。流感病毒的有效清除需要强大的适应性免疫反应。常规的流感疫苗旨在通过诱导针对流感病毒的体液免疫来引起这种适应性免疫反应。分泌性IgA和IgM抗体介导的体液免疫提供了对初始感染建立的保护，而IgG抗体在已建立的感染中中和新复制的病毒。CD4+T细胞反应可能有助于体液免疫的发展，并在同型转换为IgG中以及更高亲和力抗体和CTL记忆的产生中发挥作用。这由以下发现得到强调，即在人类中血凝素(HA)特异性CD4+T细胞在流感疫苗接种后增殖，并有助于异型流感抗体反应的发展。
尽管它们具有诱导体液免疫的能力，但常规的流感疫苗并非完全具有保护作用。这至少部分是由于抗原变异的发生。此外，人们认为细胞介导的免疫可能在预防流感中起着关键作用。CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导病毒清除，并且已显示出对不同亚型的甲型流感病毒具有交叉反应性反应。这可能有助于解释在年龄较大和接种过流感疫苗或以前多次接触过流感病毒的个体中疾病相对较少的原因。
目前市场上的流感疫苗每年更新一次。它们的设计是基于世界卫生组织每年的菌株建议，并且它们是在流感季节或大流行开始之前制造的。目前的流感疫苗诱导针对病毒表面上HA和神经氨酸酶(NA)糖蛋白的保护性体液免疫反应。然而，病毒HA和NA糖蛋白极易受到频繁和不可预测的抗原漂变以及导致抗体识别丧失的较不频繁但更严重的移位突变的影响。这就需要经常开发新的疫苗，以匹配感染人群的目前的病毒血清型。因此，现有流感疫苗的生产成本很高，并且不太可能对季节中期出现的新菌株(例如2009年H1N1猪流感、H5N1、H7N9)起到保护作用。此外，这些疫苗被设计来提供基于抗体的保护，很少考虑对于从体内消除病毒感染的细胞而言重要的细胞介导的免疫的诱导。
FDA已经批准了几种四价疫苗(预防两种甲型流感和两种乙型流感病毒)。虽然这些疫苗提供了比常规的流感疫苗更广泛的保护，但它们仍然不太可能对季节中出现的新菌株或新兴的大流行菌株起到保护作用，并且生产成本高昂。此外，与常规的流感疫苗一样，四价疫苗不是被设计来引起对于从体内清除病毒感染的细胞很重要的细胞介导的免疫。
因此，需要一种针对所有季节性流感毒株和大流行毒株提供多年(如果不是整个寿命)的广泛保护的“通用”流感疫苗。开发有效的通用的流感疫苗可以减少对未来流感大流行的担忧，并且比按照目前的做法开发、制造和施用年度的季节性流感疫苗更具成本效益。
发明概述
本发明涉及一种疫苗组合物，其包含所述免疫原性肽由开放阅读框(ORF)编码的免疫原性肽，所述ORF由ssRNA病毒(例如流感病毒)的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。免疫原性肽包含能够被CD8+T细胞识别的表位。
本申请的发明人令人惊讶地鉴定出多种肽，所述肽由感染了流感病毒的细胞上的MHC I类分子递呈和由ORF编码，所述ORF由流感病毒节段(segment)8的基因组负链的一部分编码。该ORF在人流感病毒中普遍保守，并且因此被认为赋予此类病毒选择性的优势。疫苗组合物中包括由该保守的ORF编码的一种或多种肽可以赋予针对多种人流感病毒毒株的保护能力，克服由它们的抗原移位和漂变趋势引起的问题。疫苗组合物中包括多种这样的肽(每种肽能够结合不同的HLA超型)可以提供对具有不同HLA类型的个体有效的广谱疫苗。
本申请的发明人认为，感染了其他ssRNA病毒(如丝状病毒(filovirus)或黄病毒(flavivirus))的细胞也可以在它们的MHC I类分子上递呈由保守的ORF编码的肽，所述ORF由基因组的一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。疫苗组合物中包括这些肽中的一种或多种可以赋予针对多种病毒种类、菌株或血清型的保护能力，在病毒家族中提供交叉保护。
因此，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由开放阅读框(ORF)编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
本发明进一步提供：
-一种预防或治疗病毒感染的方法，包含将本发明的疫苗组合物施用于感染了或有风险感染ssRNA病毒的个体；
-一种鉴定免疫原性肽的方法，所述免疫原性肽包含来自ORF的CD8+T细胞表位，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，所述方法通过以下步骤进行：
(a)鉴定ORF，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；
(b)预测由ORF编码的多肽的序列；以及
(c)评估结合MHC I类分子的肽是否包含存在于预测序列中的序列，
从而鉴定免疫原性肽，所述免疫原性肽包含能够被CD8+T细胞识别的表位；
-一种免疫原性肽，其包含来自多肽的CD4+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；以及
-一种确定甲型流感病毒的大流行潜力的方法，所述方法包括以下步骤：(i)鉴定第一ORF，所述第一ORF由甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；(ii)确定第一ORF中包含的密码子数量；以及(iii)将第一ORF中包含的密码子数量与第二ORF中包含的密码子数量进行比较，所述第二ORF由已知的大流行甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，其中第一ORF与第二ORF的密码子数量差异表示大流行潜力。
附图说明
图1：来自甲型流感病毒感染的细胞的IAPSSVKALS(A)和合成的IAPSSVKALS肽(B)的质谱的比较。每个光谱中的一些典型离子被圈出以强调来自感染的细胞的肽与合成的肽的同一性。
图2：来自甲型流感病毒感染的细胞的LMQRGPSTF(A)和合成的LMQRGPSTF肽(B)的质谱的比较。每个光谱中的一些典型离子被圈出以强调来自感染的细胞的肽与合成的肽的同一性。
图3：来自甲型流感病毒感染的细胞的KITLKFAFNMM(A)和合成的KITLKFAFNMM肽(B)的质谱的比较。每个光谱中的一些典型离子被圈出以强调来自感染的细胞的肽与合成的肽的同一性。
图4：SEQ ID NO：1和3至15的NEG8多肽序列的比对。
图5：ORF长度(按年份)。图表显示了按收集年份和月份(X轴)收集的甲型流感病毒数量(Y轴)。颜色编码表示存在于每个时间点收集的病毒中的ORF的长度。
图6：ORF同一性(按年份)。颜色编码显示每种标绘(plotted)病毒的血清型。
图7：ORF同一性(按年份)。颜色编码显示每种标绘病毒的血清型。
图8：在不同种类的甲型流感病毒中普遍存在的ORF长度。
发明详述
疫苗组合物
本发明提供了一种疫苗组合物，其包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。所述疫苗组合物具有许多益处，这些益处将从下文的讨论中变得显而易见。本文总结了主要的益处。
首先，本发明的疫苗组合物有利地包含肽，所述肽包含CD8+T细胞表位，例如在SEQID NO：5至41中列出并由本申请的发明人新近鉴定的表位。疫苗组合物因此能够刺激针对ssRNA病毒的细胞免疫反应(例如CD8+T细胞反应)。CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)通过其对感染细胞的细胞毒性活性来介导病毒清除。因此，刺激细胞免疫可以提供抗病毒感染(例如流感病毒、黄病毒或丝状病毒感染)的有益防御。
第二，编码免疫原性肽中包含的表位的ORF在多种病毒之间可以是保守的。因此，表位本身在多种病毒之间可以是保守的。例如，ORF和/或表位在人甲型流感病毒之间可以是保守的。因此，疫苗组合物可以提供针对多种人甲型流感病毒的交叉保护。以这种方式，本发明的疫苗组合物适合于提供针对人甲型流感病毒的广谱预防，来抵抗由人甲型流感病毒倾向于的抗原移位和抗原漂变引起的问题。换句话说，本发明的单一疫苗组合物可以诱导针对多种现有的和新兴的人甲型流感病毒的保护性免疫，从而减少或消除每年开发新的季节性流感疫苗的需要。
ORF和/或表位在人甲型流感病毒与猪、马和/或禽甲型流感病毒之间可以是保守的。以这种方式，本发明的疫苗组合物可以防止猪、马和/或禽甲型流感病毒在人类群体中建立。换句话说，除了预防现有的和新兴的人甲型流感病毒外，本发明的疫苗组合物还可以防止猪、马和/或禽甲型流感病毒跨越物种界限。这可以防止大流行甲型流感病毒毒株的出现。
第三，本发明的疫苗组合物中包含的免疫原性肽可能能够结合不同的HLA超型。包含多个肽(其中每个肽包含能够结合不同的HLA超型的CD8+T细胞表位)导致疫苗组合物在具有不同的HLA类型的个体中是有效的。以这种方式，单一疫苗组合物可以被用于在大部分人群中赋予针对ssRNA病毒的保护。这为控制病毒感染的发生和传播提供了一种经济有效的手段。
第四，由ORF编码的多肽可以增强ssRNA病毒在人类中的适应性。换句话说，所述多肽可以在其被编码的ssRNA病毒上赋予选择优势。因此，本发明的疫苗组合物可以靶向与具有选择优势的ssRNA病毒相关的表位。因此，可以对本发明的疫苗组合物进行精心设计，从而提供针对ssRNA病毒的新兴的和/或可能的大流行菌株的有效预防。
第五，包含在本发明的疫苗组合物中的免疫原性肽可以连接至纳米颗粒，例如金纳米颗粒。如下文更详细描述的，与纳米颗粒的连接减少或消除了在疫苗组合物中包括佐剂的需要。因此，本发明的疫苗组合物在施用于个体时不太可能引起负面临床作用。
反向肽疫苗
单链RNA(ssRNA)病毒根据其基因组RNA的有义或极性分为正义或反义。在反义ssRNA病毒中，反义(3'至5')基因组RNA与mRNA互补，并且通常必须在翻译前通过RNA聚合酶被转化为正义RNA。在正义ssRNA病毒中，正义(5'至3')基因组RNA还可以作为mRNA，并且可以在宿主细胞中翻译成蛋白质。也就是说，反义ssRNA病毒的复制通常发生在基因组转录来形成与基因组互补的mRNA和mRNA的翻译之后。正义ssRNA病毒的复制通常发生在充当mRNA的基因组RNA的翻译之后。
传统上，已经考虑到ssRNA病毒的反义RNA是非编码的。但是，可能会进行非标准的翻译。看来流感病毒的反义基因组RNA实际上可能能够在5'到3'方向上翻译，从而产生与通过标准翻译(即3'至5'转录形成互补的mRNA，并且mRNA从5'至3'翻译)获得的基因产物不同的基因产物。同样地，与正义ssRNA病毒的基因组互补的RNA实际上可能是可翻译的。
本申请的发明人获得的数据表明，从ssRNA病毒中的非标准翻译获得的多肽可以包含被该ssRNA病毒感染的个体的免疫系统识别的肽。例如，从ssRNA病毒中的非标准翻译获得的多肽可以包含能够由MHC I类分子递呈和能够被存在于CD8+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别的肽。换句话说，从ssRNA病毒中的非标准翻译获得的多肽可以包含作为CD8+T细胞表位的肽。这种免疫原性肽可以被施用于个体(例如在疫苗组合物中)来诱导针对ssRNA病毒的免疫应答。以这种方式，可以实现预防和/或治疗。
因此，本发明提供了一种包含免疫原性肽的疫苗组合物，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
免疫原性肽
免疫原性肽是能够引发免疫反应的肽。本发明的疫苗组合物包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。疫苗组合物可以包含约1种至约50种这样的免疫原性肽，例如约2种至40种、3种至30种、4种至25种、5种至20种、6种至15种、7种、8种、9种或10种这样的免疫原性肽。
免疫原性肽包含CD8+T细胞表位。CD8+T细胞表位是能够(i)由MHC I类分子递呈和(ii)被存在于CD8+T细胞上的T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别的肽。优选地，被TCR识别导致CD8+T细胞的活化。CD8+T细胞活化可以导致增殖、细胞因子产生和/或细胞毒性作用增加。通常，CD8+T细胞表位的长度为约9个氨基酸。CD8+T细胞表位可以更短或更长。例如，CD8+T细胞表位的长度可以是约8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。CD8+T细胞表位的长度可以是约8个至15个、9个至14个或10个至12个氨基酸。
免疫原性肽中包含的CD8+T细胞表位来自由ORF编码的多肽，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。换句话说，CD8+T细胞表位本质上可以被包含在多肽中或形成多肽的一部分，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。多肽可以在ssRNA病毒的表面上表达，或在ssRNA病毒内细胞内表达。病毒对多肽的表达可能是瞬时的，即所述多肽可能仅仅在其生命周期的某些时刻和/或在某些环境条件下由ssRNA病毒表达。可替代地，ssRNA病毒可以具有多肽的持续表达。多肽可以是结构肽或功能肽，例如参与ssRNA病毒的代谢或复制的肽。然而，在某些情况下，多肽的目的和/或功能可能是未知的。
产生CD8+T细胞表位的多肽可以增强ssRNA病毒在人类中的适应性，例如，多肽可以改善病毒在人类宿主细胞中的存活和/或复制。因此，多肽可以赋予在ssRNA病毒上的选择优势。换句话说，多肽的表达可以使ssRNA病毒比不表达多肽的ssRNA病毒更好地存活和/或复制。在这种情况下，进化的选择过程可以选择病毒，其中所述病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码ORF，所述ORF编码多肽。因此，ORF(以及因此的多肽)在特定类型的不同ssRNA病毒之间可以是保守的。例如，ORF和/或多肽在甲型流感病毒的不同的毒株之间，或者在黄病毒(例如寨卡病毒(Zika viru)和登革热病毒(Dengueviru)之间)之间是保守的。如果由每种病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码的ORF之间有至少20％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性，则ORF(以及因此的多肽)在两种或多种不同的ssRNA病毒之间是保守的。
免疫原性肽可以包含来自多肽的仅一个CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。可替代地，免疫原性肽可以包含两个或更多个这样的表位，例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个。
和来自多肽的CD8+T细胞表位一样，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，免疫原性肽可以包含一个或多个其他CD8+T细胞表位、一个或多个CD4+T细胞表位和/或一个或多个B细胞表位。例如，免疫原性肽可以包含一个或多个CD8+T细胞表位，例如两个或更多、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个或二十个或更多个，所述CD8+T细胞表位不是来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。免疫原性肽可以包含一个或多个CD4+T细胞表位，例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个或二十个或更多个。免疫原性肽可以包含一个或多个B细胞表位，例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个或二十个或更多个。
优选地，免疫原性肽包含在SEQ ID NO：5至41中列出的一个或多个序列。
疫苗组合物可以包含两种或更多种免疫原性肽，例如约1种至约50种、2种至40种、3种至30种、4种至25种、5种至20种、6种至15种、7种、8种、9种或10种免疫原性肽。在这种情况下，两种或更多种免疫原性肽中的每一种可以例如是包含来自多肽的CD8+T细胞表位的免疫原性肽，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。可替代地，疫苗组合物可以包含以下组分的混合物：(i)免疫原性肽，其包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；以及(ii)其他免疫原性肽。
疫苗组合物可以包含两种或更多种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自多肽的不同的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。换句话说，疫苗组合物可以包含两种或更多种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含多肽的不同片段，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。优选地，片段是免疫原性的。疫苗组合物可以包含约1种至约50种、2种至40种、3种至30种、4种至25种、5种至20种、6种至15种、7种、8种、9种或10种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自多肽的不同的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。如下文详细描述的，在一些方面，每个免疫原性肽可以与不同的HLA亚型相互作用。
疫苗组合物可以包含(i)一种或多种(例如约2种至40种、3种至30种、4种至25种、5种至20种、6种至15种、7种、8种、9种或10种)免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；以及(ii)一种或多种其他免疫原性肽(即不包含来自多肽的CD8+T细胞表位的免疫原性肽，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码)。因此，其他免疫原性肽可以包含一个或多个表位，例如约2个至40个、3个至30个、4个至25个、5个至20个、6个至15个、7个、8个、9个或10个表位。表位可以是B细胞表位、CD4+T细胞表位和/或CD8+T细胞表位。CD4+T细胞表位可以例如是肽，所述肽由一种或多种ssRNA病毒表达，并且能够(i)由MHC II类分子递呈和(ii)被存在于CD4+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别。可替代地，CD4+T细胞表位可以是一种或多种ssRNA病毒不表达的CD4+T细胞表位。CD8+T细胞表位可以例如是肽，所述肽由一种或多种ssRNA病毒表达，并且能够(i)由MHC I类分子递呈和(ii)被存在于CD8+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别。优选地，所述CD8+T细胞表位是CD8+T细胞表位但不是来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。CD8+T细胞表位可以是一种或多种ssRNA病毒不表达的CD8+T细胞表位。
本领域已知许多B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位(例如来自ssRNA病毒的B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位)。鉴定B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位的方法是本领域已知的。表位作图方法包括X射线共晶体学、基于阵列的寡肽扫描(有时称为重叠肽扫描或肽扫描分析)、定点突变、高通量突变作图、氢-氘交换、交联耦合质谱法、噬菌体展示和限制性蛋白水解。也可以使用MHC基序预测方法。如下所述，可以鉴定由ssRNA病毒感染的细胞递呈的CD8+T细胞表位，从而直接鉴定疫苗组合物中包含的CD8+T细胞表位。
本文所述的任何免疫原性肽可以包含任何数量的氨基酸，即具有任何长度。通常，免疫原性肽的长度为约8个至约30个、35个或40个氨基酸，例如长度为约9个至约29个、约10个至约28个、约11个至约27个、约12个至约26个、约13个至约25个、约13个至约24个、约14个至约23个、约15个至约22个、约16个至约21个、约17个至约20个或约18个至约29个氨基酸。
本文所述的任何免疫原性肽可以化学地来源于多肽抗原，例如通过蛋白水解切割。更典型地，可以使用本领域众所周知的方法来合成免疫原性肽。
术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括其中肽键被逆转的分子。这种逆反(retro-inverso)模拟肽可以使用本领域已知的方法制备，例如Meziere et al(1997)J.Immunol.159,3230-3237中描述的方法。该方法涉及制备含有涉及骨架的变化的伪肽，而不是侧链的方向。Meziere等(1997)表明，至少对于MHC II类和T辅助细胞反应，这些伪肽是有用的。含有NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽对蛋白质水解具有更强的抗性。
类似地，肽键可以被完全省略，条件是使用适合的连接部分保持氨基酸残基的碳原子之间的间隔；如果连接部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面性，则是特别优选的。还应理解，肽可以方便地在其N-或C-末端被封闭，以帮助降低对外蛋白水解消化的易感性。例如，肽的N-末端氨基可以通过与羧酸反应来保护，肽的C-末端羧基可以通过与胺反应来保护。修饰的其他实施例包括糖基化和磷酸化。另一种可能的修饰是R或K的侧链胺上的氢可以被亚甲基取代(-NH2可以被修饰为-NH(Me)或-N(Me)2)。
术语“肽”还包括在体内增加或减少肽的半衰期的肽变体。根据本发明使用的能够增加肽的半衰期的类似物的实施例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合物。根据本发明使用的变体多肽的另一个实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽，大大降低了这种试剂通过正常代谢过程的任何不希望的分解，减少了需要施用的试剂的量以及其施用频率。
开放阅读框(ORF)
免疫原性肽中包含的CD8+T细胞表位来自多肽，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
阅读框是核酸序列(例如RNA序列)中三个连续核苷酸的组，其由用于通过核酸序列编码氨基酸的密码子组成。ORF是阅读框中可以被翻译的部分。ORF是包含起始密码子和终止密码子的连续密码子序列。在ORF内，起始密码子(例如ATG)可以作为RNA翻译成蛋白质的起始位点。
在本发明中，ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。在反义ssRNA病毒中，ORF存在于基因组RNA中(通常被认为是反义)，并且例如可以在不干预转录的情况下进行翻译。在正义ssRNA病毒中，病毒基因组RNA与mRNA具有相同的义，并且可以在不干预转录的情况下进行翻译，即，基因组RNA也是mRNA。在此，按照与病毒基因组RNA和mRNA相反的方向编码ORF。
例如，ORF可以由ssRNA病毒的整个基因组按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。可替代地，ORF可以仅由ssRNA病毒的基因组的一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，ORF可以由ssRNA病毒的基因组的约1％至约99％按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，例如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。
一些ssRNA病毒具有分段的基因组。ORF可以由基因组节段的全部或部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，ORF可以由基因组节段的约1％至约99％按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，例如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约50％。基因组节段可以例如是甲型流感病毒的基因组的节段1、节段2、节段3、节段4、节段5、节段6、节段7或节段8。优选地，基因组节段是甲型流感病毒的基因组的节段8。
ORF可以是任何长度。例如，ORF的长度可以是约8至约300个密码子，例如约9个至约290个、约10个至约280个、约11个至约275个、约12个至约270个、约13个至约260个、约14个至约250个、约15个至约240个、约16个至约230个、约17个至约225个、约18个至约220个、约19个至约210个、约20个至约200个、约25个至约190个、约30个至约180个、约35个至约175个、约40个至约170个、约45个至约160个、约50个至约150个、约55个至约140个、约60个至约130个、约65个至约125个、约70个至约120个、约75个至约110个、约80个至约100个、约85个至约95个、约167个至约216个或约90个。ORF的长度可以是至少8个密码子，例如至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个或至少275个。ORF的长度可以例如是至少31个、至少36个、至少37个、至少39个、至少40个、至少41个、至少45个、至少48个、至少49个、至少50个、至少53个、至少58个、至少60个、至少63个、至少73个、至少74个、至少80个、至少81个、至少84个、至少85个、至少87个、至少88个、至少89个、92个、93个、至少94个、至少105个、至少121个、至少135个、至少140个、至少167个、至少170个、至少178个、至少197个、至少216或至少246个密码子。ORF的长度可以例如是至少85个密码子。ORF的长度可以例如是至少167个密码子。ORF的长度可以例如是至少216个密码子。
ORF可以包含序列：
TTAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCTTGCTCCACTTCAAGCAATAGTTGTAAGGCTTGCATAAATGTTATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTATCTTCAGTCTATGTCTCACTTCTTCAATCAACCATCTTATTTCTTCAAACTTCTGACTTAATTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGGGAGTGGAGGTCTCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGTTTCAGAGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAACTGCATTTTTGACATCCTCATCAGTATGTCCTGGAAGAGAAGGCAATGGTGAAATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAGTATTAGAGTCTCCAGCCGGTCGAAAATCACACTGAAGTTCGCTTTCAGTATGATGTTCTTATCCATGATCGCCTGGTCCATTCTGATACAAAGAGAGCCTGCCACTTTCTGCTTGGGCATGAGCATGAACCAGTCCCTTGACATCTCCTCAAGAGTCATGTCAGTTAGGTAGCGCGAAGCAGGTACAGAGGCAATGGTCATTTTAAGTGCCTCATCGGATTCTTCCTTCAGAATCCGCTCCACTATCTGCTTTCCAGCACGGGTGGCTGTCTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCTGCCTCTTCCTCTTAGGGACTTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACCCAGTTCTTGGTCTGCAAACCGTTTGCGGACATGCCAAAGAAAGCAGTCTACCTGAAAGCTTGACACAGTGTTGGAATCCAT(SEQ ID NO:56)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：MLFAQNYSLLSSVYVSLLQSTILFLQTSDLIVLAIFRFCFGGSGGLPFSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSSVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSSIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:1)。
ORF可以包含序列：
TATCATTAAATAAGCTGAAATGAGAAAGTTCTTATCTCCTGTTCCACTTCAAACAGCAGTTGTAATGCTTGCATGAATGTTATTTGTTCAAAGCTATTTTCCGTTGTTTTTAGTCTGTGTCTCACTTCTTCAATCAGCCATCTTATCTCTTCAAACTTTTGACCTAGCTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGTAAGTGGAGGTCCCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGATTTTTAGAGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAATTGCATTTTTGACATCCTCAATAGTATGTCCTGGAAAAGAAGGCAATGGTGAGATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAATACTATGGTCTCTAGTCGGTCAAAAATCACACTGAAATTCGCTTTCAATATGATGTTTTTCTCCATGATTGCCTGGTCCATTCTGATGCAAAGAGGTCCTTCCACTTTCTGCTTGGGCATTAGCATGAACCAGTTTCTTGACAATTCCTCAATAGTCATGTCAGTTATGTATCGCGAAGCAGGTGTGGAGACCATGGTCATTTTAAGTGCCTCATCAGATTCTTCTTTCAGAATCTTTTCTACAATTTGCTTTCCAACATGGGTGGCTGCTTTGATGTCTAGACCGAGAGTATTGCCTCTTCCCCTTAGGGACCTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACTCAGTTCTTGGTCTACAACTTGTTTCCGGATATGCCAAAGAAAGCAATCTACCTGGAAACTTGACACAGTGTTGGAATCCATTATGT(SEQ ID NO:57)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:2)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFARNYSLLSSIYVSLLQSTTLFLQTSDSIVLAIFRFCFGGSGGLLSSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSSVCPGREGTGEISPTIAPSSVKALSSIRVSNRSKIILKFAFSVMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:3)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLSSVCVSLLQSTILFLQTSDLIVPAISRFCFGVSCGLPFSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSAVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMDQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:4)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLFSICVSLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMSVR(SEQ ID NO:5)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLFSICASLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPYIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMSVR(SEQ ID NO:6)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF(SEQID NO:7)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFYFGVSGGLPFSSLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPASVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSBRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF(SEQID NO:8)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLTVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLPQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMTFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SEQID NO:9)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLIVLAIYRFCFGVSGCLPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDFSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SEQ ID NO:10)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSQLFSVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:11)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPYIAPSSVKALSNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVISVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:12)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKTTLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALISRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:13)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFVQSYFQLFLICVSLLQLAILSLQTFDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTIVSSRSKITLKFAFNVMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:14)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFVQSYFQLFLICVSPLQLAILSLQTSDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTASIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRPKITLKFAFNMIFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDSSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSIICFPAWVAALVSRPRVLPLPLRDL(SEQID NO:15)。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列：
MLFVRNYSLSLSICAAFLQLTTLFPQISVPIALATFHFCSGGSEGLPFSSQFLQANLCIFSETRTVLPFHSSPPMRTPTAFLTSS(SEQ ID NO:58)。
如上所述，编码免疫原性肽中包含的表位的ORF在不同的ssRNA病毒(例如相同类型的不同的ssRNA病毒)之间可以是保守的。如果ORF之间有至少50％(例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性，则ORF在两种或更多种不同的ssRNA病毒之间可以是保守，所述ORF由每一种病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，如果ORF之间有约75％(例如约70％至约80％，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约76％、约77％、约78％、或者约79％)的同一性，则ORF在两种或更多种不同的ssRNA病毒之间可以是保守，所述ORF由每一种病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。由ORF编码的多肽可以增强ssRNA病毒在人类中的适应性，即在ssRNA病毒上赋予选择优势。
ORF在两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在具有相同的血清型的甲型流感病毒之间是保守的。ORF在具有不同的血清型的甲型流感病毒之间是保守的。例如，ORF在两种或更多种病毒之间可以是保守的，每种病毒属于以下血清型之一：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9、H6N1。ORF在两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)人甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)人甲型流感病毒和一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)猪甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)人甲型流感病毒和一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)禽甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)人甲型流感病毒和一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、750种或更多种、或者1000种或更多种)马甲型流感病毒之间可以是保守的。
ORF在两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种或20种或更多种)黄病毒之间可以是保守的。例如，ORF在选自DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的两种或更多种登革热病毒血清型之间可以是保守的。ORF在两种或更多种寨卡病毒菌株(例如非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒)之间可以是保守的。ORF在一种或多种登革热病毒血清型(例如DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4中的一种或多种)和一种或多种寨卡病毒菌株(例如非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒中的一种或两种)之间可以是保守的。
ORF在两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、或者20种或更多种)丝状病毒之间可以是保守的。例如，ORF在选自扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)(ZEBOV)、本迪布焦型埃博拉病毒(Bundibugyo ebolavirus)(BDBV)、雷斯顿型埃博拉病毒(Reston ebolavirus)(RESTV)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan ebolavirus)(SUDV)和泰伊森林埃博拉病毒(
Figure BDA0002899578950000181
Forest ebolavirus)(TAFV)的两种或更多种埃博拉病毒之间可以是保守的。ORF在两种或更多种马尔堡病毒(Marburg viruses)之间可以是保守的，例如马尔堡病毒(MARV)和拉温病毒(Ravn virus)(RAVV)。ORF在一种或多种埃博拉病毒(例如ZEBOV、BDBV、RESTV、SUDV和TAFV中的一种或多种)和一种或多种马尔堡病毒(例如MARC和RAVV中的一种或两种)之间可以是保守的。
类似地，由ORF编码的多肽和/或其包含的表位在两种或更多种病毒之间可以是保守的。因此，疫苗组合物可能能够提供针对多种病毒的交叉保护。因此，本发明的单一疫苗组合物可能能够诱导针对多种现有的和新兴的ssRNA病毒(例如甲型流感病毒、黄病毒或丝状病毒)的保护性免疫。例如，一方面，多肽和/或表位在两种或更多种人甲型流感病毒之间可以是保守的。在这种情况下，本发明的疫苗组合物可能能够提供针对两种或更多种人甲型流感病毒的保护。在另一方面，多肽和/或表位在人甲型流感病毒和猪、马和/或禽甲型流感病毒之间可以是保守的。在这种情况下，本发明的疫苗组合物可能能够保护人类对象免受猪、马和/或禽甲型流感病毒的感染，防止猪、马和/或禽甲型流感病毒跨越物种界限。在任何情况下，两种或更多种人甲型流感病毒可以是相同或不同的血清型。两种或更多种人甲型流感病毒的每一种可以是血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9或H6N1。
病毒
ssRNA病毒可以是反义ssRNA病毒或正义ssRNA病毒，所述ssRNA病毒的基因组按照与能够翻译RNA的正义RNA相反的方向编码ORF，所述ORF编码多肽。
ssRNA病毒可以是任何的反义ssRNA病毒。反义ssRNA病毒在本领域中是众所周知的，并且包括来自Mononegavirales目和Bunyvirales目的病毒。Mononegavirales目包括博尔纳病毒科(Bornavirida)、丝状病毒科(Filoviridae)、Mymonaviridae、Nyamiviridae、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、肺泡病毒科(Pneumoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和Sunviridae家族、以及Anphevirus、Arlivirus、Chengtivirs、Crustavirus和Wastrivirus属。Bunyavirales目包括Feraviridae、Fimoviridae、Hantavirida、Jonviridae、Nairoviridae、Peribunyaviridae、Phasmaviridae、Phenuiviridae和Tospoviridae家族。其他反义ssRNA病毒包括Arenaviridae、Ophiovirida和正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的病毒，以及Deltavirus属。
ssRNA病毒可以是正粘病毒(Orthomyxovirus)。例如，ssRNA病毒可以是流感病毒。基于表达的HA和NA蛋白，存在数百种流感病毒菌株，其可以被分为三个主要类别，即甲型流感、乙型流感或丙型流感。ssRNA病毒可以是任何毒株的甲型、乙型或丙型流感病毒。因此，编码包含CD8+T细胞表位的多肽的ORF由甲型、乙型和/或丙型流感病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。优选地，ssRNA病毒是甲型流感病毒。甲型流感病毒可以是任何血清型。优选地，甲型流感病毒是血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9或H6N1。下文将更详细地考虑流感病毒及其可能编码的ORF。
ssRNA病毒可以是丝状病毒。跨越两个主要属(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的丝状病毒种很多。埃博拉病毒种包括扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBOV)、本迪布焦型埃博拉病毒(BDBV)、雷斯顿型埃博拉病毒(RESTV)、苏丹型埃博拉病毒(SUDV)和泰伊森林埃博拉病毒(TAFV)。马尔堡病毒种包括马尔堡病毒(MARV)和拉温病毒(RAVV)。第三个属(cuevaviruses)包括Lloviu病毒种。优选地，ssRNA病毒是埃博拉病毒或马尔堡病毒。
ssRNA病毒可以是任何的正义ssRNA病毒正义。正义ssRNA病毒是本领域公知的，包括微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)和冠状病毒科(Coronaviridae)家族。
ssRNA病毒可以是黄病毒。存在多种黄病毒，包括寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒，以及圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷(Murray Valley)脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津(Kunjin)脑炎病毒、罗西奥(Rocio)脑炎病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克(Omsk)出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒和Modoc病毒。登革热病毒有四种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)，寨卡病毒有两种毒株(非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒)。优选地，ssRNA病毒是登革热病毒或寨卡病毒。
流感病毒
如上所述，ssRNA病毒可以是反义ssRNA病毒。例如，ssRNA病毒可以是正粘病毒，例如流感病毒。流感病毒可以例如是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。优选地，ssRNA病毒是甲型流感病毒。甲型流感病毒可以例如是人甲型流感病毒、猪甲型流感病毒、马甲型流感病毒或禽甲型流感病毒。甲型流感病毒可以是人畜共患的甲型流感病毒。
流感病毒可以例如是西班牙流感病毒(Spanish flu virus)，例如引起1918年流感大流行的H1N1甲型流感病毒(“1918流感病毒”)。1918流感病毒的完整编码序列是本领域已知的。流感病毒可以例如是重组的西班牙流感病毒。重组的西班牙流感病毒是这样的流感病毒，其携带有1918流感病毒的八个基因节段的编码序列。例如，重组的西班牙流感病毒包含1918流感病毒的已知编码序列和与紧密相关病毒对应的非编码区。紧密相关病毒可以例如是H1N1甲型流感病毒，例如A/WSN/33(H1N1)病毒。
甲型流感病毒的基因组是分段的，包含反义ssRNA的8个节段。尽管人、猪、马和禽甲型流感病毒之间存在许多结构和遗传上的相似性，但跨越物种感染却很少见且效率低下。然而，单一宿主与多种不同的甲型流感病毒共同感染会导致分段基因组的重配(re-assortment)，从而产生可能具有大流行潜力的新菌株。
当以正常方式翻译时(即转录为互补的mRNA之后)，甲型流感病毒基因组的节段8编码两个蛋白(NS1和NEP)。在人甲型流感病毒中，节段8还按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码ORF。该ORF被称为NEG8，因为它是由所谓的节段8的负链编码的。20世纪上半叶分离出的几乎所有的人甲型流感病毒都具有长度为167个密码子的NEG8 ORF。167个密码子的NEG8 ORF在人甲型流感病毒中的保存期超过约50年，这表明167个密码子的NEG8 ORF赋予人甲型流感病毒选择优势。这一点由以下事实得到强调，即丢失167个密码子的NEG8 ORF的病毒不会在人群中存在超过几年。大约在20世纪中叶，发生了167个密码子的NEG8 ORF的TAG终止密码子向TAT(编码酪氨酸)的突变，从而产生了延长的216个密码子的NEG8 ORF。由于氨基酸密码的简并性，该突变对节段8编码的其他蛋白质没有影响。1947年后分离出的基本上所有的人甲型流感病毒都具有216个密码子的NEG8 ORF，表明所述ORF也赋予人甲型流感病毒选择优势。最近，在一些人甲型流感病毒中还发现了85个密码子的NEG8 ORF。在许多猪和禽甲型流感病毒中还分别观察到167个密码子和216个密码子的ORF。在人、禽、马和猪甲型流感病毒中还观察到其他长度的ORF(参见实施例5)。例如，在禽、类禽猪(avian-likeswine)和马甲型流感病毒中观察到93个密码子的ORF(或更罕见的是135个密码子的ORF)。在猪甲型流感病毒中已经观察到140个密码子的ORF和167个密码子的ORF。
赋予人甲型流感病毒选择优势(即增强其适应性)的保守的85、167个密码子或216密码子的NEG8 ORF的存在对新甲型流感病毒毒株的新兴具有重要意义。特别地，宿主与两种或更多种甲型流感病毒的共同感染会导致病毒基因组的重配。本质上，节段可以在病毒之间替换，从而产生具有基因组节段的新组合的病毒。例如，与病毒X和病毒Y共同感染会导致新病毒的产生，所述病毒具有例如来自病毒X的节段1至7和来自病毒Y的节段8。这是令人担忧的，因为具有216个密码子的NEG8 ORF的来自人甲型流感病毒的节段8会与来自禽甲型流感病毒(例如H5N1)、马甲型流感病毒或猪甲型流感病毒(例如H1N1)的节段重配。通常，禽甲型流感病毒不具有NEG8 ORF，并且在人类中具有有限的致病性和/或差的传播性。通过与人甲型流感病毒重配获得NEG8 ORF可以增强禽、马或猪甲型流感病毒在人类中的适应性，从而可能导致新的大流行菌株的发展。
此外，对来自猪、马或禽甲型流感病毒的节段8的分析表明，对于一些菌株，仅需微小的突变即可产生在人类中赋予病毒适应性的167个密码子或216个密码子的NEG8 ORF。例如，仅需从猪源的H1N1基因组节段8中去除2个终止密码子(每个通过单一核苷酸改变)，即可产生在人甲型流感病毒中发现的216个密码子的NEG8 ORF。仅需更改1个核苷酸即可获得历史上在人甲型流感病毒中发现的167个密码子的NEG8 ORF。
因此，很明显，需要针对甲型流感病毒感染有效的疫苗组合物。一方面，本发明的疫苗组合物是针对甲型流感病毒感染的疫苗组合物。优选地，疫苗组合物中包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由甲型流感病毒基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。因此，该ORF可以是NEG8 ORF。该ORF可以由节段8的全部或部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，该ORF可以由节段8的约1％至约99％按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，例如约2％至约98％、约3％至约97％、约5％至约95％、约10％至约90％、约15％至约85％、约20％至约80％、约25％至约75％、约30％至约70％、约40％至约60％、或者约50％。
如上所述，ORF可以是任何长度。例如，ORF的长度可以是约8个至约300个密码子，例如约9个至约290个、约10个至约280个、约11个至约275个、约12个至约270个、约13个至约260个、约14个至约250个、约15个至约240个、约16个至约230个、约17个至约225个、约18个至约220个、约19个至约210个、约20个至约200个、约25个至约190个、约30个至约180个、约35个至约175个、约40个至约170个、约45个至约160个、约50个至约150个、约55个至约140个、约60个至约130个、约65个至约125个、约70个至约120个、约75个至约110个、约80个至约100个、约85个至约95个、约167个至约216个或约90个。ORF的长度可以是至少8个密码子，例如至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个或至少275个。ORF的长度可以例如是至少31个、至少36个、至少37个、至少39个、至少40个、至少41个、至少45个、至少48个、至少49个、至少50个、至少53个、至少58个、至少60个、至少63个、至少73个、至少74个、至少80个、至少81个、至少84个、至少85个、至少87个、至少88个、至少89个、92个、93个、至少94个、至少105个、至少121个、至少135个、至少140个、至少167个、至少170个、至少178个、至少197个、至少216或至少246个密码子。ORF的长度可以例如是至少85个密码子。优选地，ORF的长度是至少167个密码子。优选地，ORF的长度是至少216个密码子。
在一些方面，ORF可以包含序列：
TTAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCTTGCTCCACTTCAAGCAATAGTTGTAAGGCTTGCATAAATGTTATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTATCTTCAGTCTATGTCTCACTTCTTCAATCAACCATCTTATTTCTTCAAACTTCTGACTTAATTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGGGAGTGGAGGTCTCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGTTTCAGAGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAACTGCATTTTTGACATCCTCATCAGTATGTCCTGGAAGAGAAGGCAATGGTGAAATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAGTATTAGAGTCTCCAGCCGGTCGAAAATCACACTGAAGTTCGCTTTCAGTATGATGTTCTTATCCATGATCGCCTGGTCCATTCTGATACAAAGAGAGCCTGCCACTTTCTGCTTGGGCATGAGCATGAACCAGTCCCTTGACATCTCCTCAAGAGTCATGTCAGTTAGGTAGCGCGAAGCAGGTACAGAGGCAATGGTCATTTTAAGTGCCTCATCGGATTCTTCCTTCAGAATCCGCTCCACTATCTGCTTTCCAGCACGGGTGGCTGTCTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCTGCCTCTTCCTCTTAGGGACTTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACCCAGTTCTTGGTCTGCAAACCGTTTGCGGACATGCCAAAGAAAGCAGTCTACCTGAAAGCTTGACACAGTGTTGGAATCCAT(SEQ ID NO:56)或SEQ ID NO:56的变体。
在一些方面，ORF可以包含序列：
TATCATTAAATAAGCTGAAATGAGAAAGTTCTTATCTCCTGTTCCACTTCAAACAGCAGTTGTAATGCTTGCATGAATGTTATTTGTTCAAAGCTATTTTCCGTTGTTTTTAGTCTGTGTCTCACTTCTTCAATCAGCCATCTTATCTCTTCAAACTTTTGACCTAGCTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGTAAGTGGAGGTCCCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGATTTTTAGAGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAATTGCATTTTTGACATCCTCAATAGTATGTCCTGGAAAAGAAGGCAATGGTGAGATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAATACTATGGTCTCTAGTCGGTCAAAAATCACACTGAAATTCGCTTTCAATATGATGTTTTTCTCCATGATTGCCTGGTCCATTCTGATGCAAAGAGGTCCTTCCACTTTCTGCTTGGGCATTAGCATGAACCAGTTTCTTGACAATTCCTCAATAGTCATGTCAGTTATGTATCGCGAAGCAGGTGTGGAGACCATGGTCATTTTAAGTGCCTCATCAGATTCTTCTTTCAGAATCTTTTCTACAATTTGCTTTCCAACATGGGTGGCTGCTTTGATGTCTAGACCGAGAGTATTGCCTCTTCCCCTTAGGGACCTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACTCAGTTCTTGGTCTACAACTTGTTTCCGGATATGCCAAAGAAAGCAATCTACCTGGAAACTTGACACAGTGTTGGAATCCATTATGT(SEQ ID NO:57)或SEQ ID NO:57的变体。
在SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57的核苷酸序列的整个长度上，基于核苷酸同一性，变体优选地与该序列至少50％相同。更优选地，基于核苷酸同一性，变体在整个序列上可以与SEQ ID NO:56或SEQ ID NO：57的核苷酸序列至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(更优选地至少95％、97％或99％)相同。在一段100个或更多个(例如125个、150个、175个或200个或更多个)连续的核苷酸中，可以至少有80％(例如至少85％、90％或95％)的核苷酸同一性。
如上所述，ORF在两种或更多种人甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种禽甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种马甲型流感病毒之间可以是保守的。ORF在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种猪甲型流感病毒之间可以是保守的。为了在两种或更多种甲型流感病毒之间保守，优选地，两种或更多种甲型流感病毒中的每一种的ORF在其整个序列上与其他甲型流感病毒中每一种的ORF具有至少50％(例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性。例如，如果每一种病毒的ORF之间有约75％(例如约70％至约80％，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约76％、约77％、约78％、或者约79％)的同一性，则所述ORF在两种或更多种甲型流感病毒之间可以是保守的。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSVYVSLLQSTILFLQTSDLIVLAIFRFCFGGSGGLPFSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSSVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSSIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:1)或其变体。SEQ ID NO：1是由SEQ ID NO：56的核苷酸序列编码的167个氨基酸序列。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:2)或其变体。SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：57的核苷酸序列编码的167个氨基酸序列。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFARNYSLLSSIYVSLLQSTTLFLQTSDSIVLAIFRFCFGGSGGLLSSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSSVCPGREGTGEISPTIAPSSVKALSSIRVSNRSKIILKFAFSVMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:3)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSVCVSLLQSTILFLQTSDLIVPAISRFCFGVSCGLPFSLLLLQANLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSAVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMDQSLDISSRVMSVR(SEQ ID NO:4)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLFSICVSLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMSVR(SEQ ID NO:5)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLFSICASLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPYIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMSVR(SEQ ID NO:6)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF(SEQ ID NO:7)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFYFGVSGGLPFSSLLLQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPASVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSBRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF(SEQ ID NO:8)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLTVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLPQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMTFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SEQ ID NO:9)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLIVLAIYRFCFGVSGCLPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSVRYREAGAEAMVILSASSDFSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SEQ ID NO:10)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSQLFSVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:11)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPYIAPSSVKALSNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVISVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:12)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKTTLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALISRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:13)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFVQSYFQLFLICVSLLQLAILSLQTFDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTIVSSRSKITLKFAFNVMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:14)或其变体。
ORF可以编码多肽，所述多肽包含序列MLFVQSYFQLFLICVSPLQLAILSLQTSDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTASIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRPKITLKFAFNMIFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDSSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSIICFPAWVAALVSRPRVLPLPLRDL(SEQ ID NO:15)或其变体。
在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的整个长度上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列至少50％相同。更优选地，基于氨基酸同一性，变体在整个序列上可以与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(更优选地至少95％、97％或99％)相同。在一段100个或更多个(例如125个、150个、175个或200个或更多个)连续的氨基酸中，可以至少有80％(例如至少85％、90％或95％)的氨基酸同一性。
由ORF编码的多肽在两种或更多种人甲型流感病毒之间可以是保守的。多肽在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种禽甲型流感病毒之间可以是保守的。多肽在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种马甲型流感病毒之间可以是保守的。多肽在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种猪甲型流感病毒之间可以是保守的。为了在两种或更多种甲型流感病毒之间保守，优选地，由两种或更多种甲型流感病毒中的每一种的ORF编码的多肽在其整个序列上与由其他甲型流感病毒中每一种的ORF编码的多肽具有至少50％(例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性。例如，如果由每一种病毒的ORF编码的多肽之间有约75％(例如约70％至约80％，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约76％、约77％、约78％、或者约79％)的同一性，则所述多肽在两种或更多种甲型流感病毒之间可以是保守的。
来自多肽的CD8+T细胞表位在两种或更多种人甲型流感病毒之间可以是保守的。表位在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种禽甲型流感病毒之间可以是保守的。表位在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种马甲型流感病毒之间可以是保守的。表位在一种或多种人甲型流感病毒和一种或多种猪甲型流感病毒之间可以是保守的。为了在两种或更多种甲型流感病毒之间保守，优选地，由两种或更多种甲型流感病毒中的每一种的ORF编码的表位在其整个序列上与由其他甲型流感病毒中每一种的ORF编码的表位具有至少50％(例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)的同一性。例如，如果由每一种病毒的ORF编码的表位之间有约75％(例如约70％至约80％，例如约71％、约72％、约73％、约74％、约76％、约77％、约78％、或者约79％)的同一性，则所述表位在两种或更多种甲型流感病毒之间可以是保守的。
ORF、多肽和/或表位在人H1N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在人H5N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在人H3N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在人H2N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在人H7N7甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在人H7N9甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H1N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H5N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H3N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H2N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H7N7甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在禽H7N9甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H1N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H5N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H3N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H2N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H7N7甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在猪H7N9甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H1N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H5N1甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H3N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H2N2甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H7N7甲型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在马H7N9甲型流感病毒中可以是保守的。
ORF在单独的或以任何组合的以下病毒之间可以是保守的：(i)人H1N1甲型流感病毒、(ii)人H5N1甲型流感病毒、(iii)人H3N2甲型流感病毒、(iv)人H2N2甲型流感病毒、(v)人H7N7甲型流感病毒、(vi)人H7N9甲型流感病毒、(vii)禽H1N1甲型流感病毒、(viii)禽H5N1甲型流感病毒、(ix)禽H3N2甲型流感病毒、(x)禽H2N2甲型流感病毒、(xi)禽H7N7甲型流感病毒、(xii)禽H7N9甲型流感病毒、(xiii)猪H1N1甲型流感病毒、(xiv)猪H5N1甲型流感病毒、(xv)猪H3N2甲型流感病毒、(xvi)猪H2N2甲型流感病毒、(xvii)猪H7N7甲型流感病毒、(xviii)猪H7N9甲型流感病毒、(xix)马H1N1甲型流感病毒、(xx)马H5N1甲型流感病毒、(xxi)马H3N2甲型流感病毒、(xxii)马H2N2甲型流感病毒、(xxiii)马H7N7甲型流感病毒和/或(xxiv)马H7N9甲型流感病毒。
多肽在单独的或以任何组合的以下病毒之间可以是保守的：(i)人H1N1甲型流感病毒、(ii)人H5N1甲型流感病毒、(iii)人H3N2甲型流感病毒、(iv)人H2N2甲型流感病毒、(v)人H7N7甲型流感病毒、(vi)人H7N9甲型流感病毒、(vii)禽H1N1甲型流感病毒、(viii)禽H5N1甲型流感病毒、(ix)禽H3N2甲型流感病毒、(x)禽H2N2甲型流感病毒、(xi)禽H7N7甲型流感病毒、(xii)禽H7N9甲型流感病毒、(xiii)猪H1N1甲型流感病毒、(xiv)猪H5N1甲型流感病毒、(xv)猪H3N2甲型流感病毒、(xvi)猪H2N2甲型流感病毒、(xvii)猪H7N7甲型流感病毒、(xviii)猪H7N9甲型流感病毒、(xix)马H1N1甲型流感病毒、(xx)马H5N1甲型流感病毒、(xxi)马H3N2甲型流感病毒、(xxii)马H2N2甲型流感病毒、(xxiii)马H7N7甲型流感病毒和/或(xxiv)马H7N9甲型流感病毒。
表位在单独的或以任何组合的以下病毒之间可以是保守的：(i)人H1N1甲型流感病毒、(ii)人H5N1甲型流感病毒、(iii)人H3N2甲型流感病毒、(iv)人H2N2甲型流感病毒、(v)人H7N7甲型流感病毒、(vi)人H7N9甲型流感病毒、(vii)禽H1N1甲型流感病毒、(viii)禽H5N1甲型流感病毒、(ix)禽H3N2甲型流感病毒、(x)禽H2N2甲型流感病毒、(xi)禽H7N7甲型流感病毒、(xii)禽H7N9甲型流感病毒、(xiii)猪H1N1甲型流感病毒、(xiv)猪H5N1甲型流感病毒、(xv)猪H3N2甲型流感病毒、(xvi)猪H2N2甲型流感病毒、(xvii)猪H7N7甲型流感病毒、(xviii)猪H7N9甲型流感病毒、(xix)马H1N1甲型流感病毒、(xx)马H5N1甲型流感病毒、(xxi)马H3N2甲型流感病毒、(xxii)马H2N2甲型流感病毒、(xxiii)马H7N7甲型流感病毒和/或(xxiv)马H7N9甲型流感病毒。
在两种或更多种甲型流感病毒之间保守的表位可以允许疫苗组合物针对多种甲型流感病毒提供保护。例如，在施用于个体时，疫苗组合物可以诱导免疫反应，所述免疫反应对具有保守的表位的一些或全部甲型流感病毒的感染具有保护作用。以这种方式，单一疫苗组合物可以被用于预防或治疗多种甲型流感病毒的感染。这可能有助于克服与现有的甲型流感病毒疫苗相关的一些问题。特别地，靶向保守的表位可以避免频繁开发新疫苗来匹配感染人类的当前病毒血清型的需要。本发明的疫苗组合物可以被用于预防或治疗在季节中期出现的新型感染菌株，例如潜在的大流行菌株。本发明的疫苗组合物可以被用于预防或治疗由猪、马和/或禽甲型流感病毒的节段与人甲型流感病毒的节段8重配产生的菌株的感染。
一方面，CD8+T细胞表位可以存在于预测的ORF中，所述ORF在猪、马和/或禽甲型流感病毒(例如血清型H1N1的猪甲型流感病毒)中的长度为至少85个、至少167个或至少216个密码子。例如，如果节段8进行突变，则CD8+T细胞表位可以存在于长度为至少85个、至少167个或至少216个密码子的ORF中，所述ORF会出现在猪、马和/或禽甲型流感病毒中。例如，如果节段8中一个或多个核苷酸(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个核苷酸)替换为不同的核苷酸，则CD8+T细胞表位可以存在于长度为至少85个、至少167个或至少216个密码子的ORF中，所述ORF会出现在猪、马和/或禽甲型流感病毒中。替换为不同的核苷酸可以将由节段8按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码的终止密码子改变为编码氨基酸的密码子。例如，在UAG终止密码子中替换单一核苷酸可以产生编码氨基酸的UAU、UAC、，UUG、UCG、UGG、CAG、AAG或GAG密码子。
通过在疫苗组合物中包括免疫原性肽，所述免疫原性肽包含CD8+T细胞表位，所述表位存在于预测的ORF中，所述ORF在猪、马和/或禽甲型流感病毒中的长度为至少85个、至少167个或至少216个密码子，所述疫苗组合物针对潜在的甲型流感病毒大流行毒株的保护能力可以被提高。例如，这样做可以使疫苗组合物诱导针对猪、马或禽甲型流感病毒的保护性免疫反应，该病毒获得在人甲型流感病毒中发现并赋予在人类中的病毒适应性的85个密码子、167个密码子或216个密码子的NEG8 ORF。
NEG8肽
如实施例中列出的，本申请的发明人已经鉴定出许多肽，所述肽是(i)来自由ORF编码的多肽，所述ORF(NEG8 ORF)由人甲型流感病毒的节段8按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，以及(ii)由感染人甲型流感病毒的细胞上的MHC I类分子递呈。因此，本申请的发明人已经鉴定出由NEG8 ORF编码的许多CD8+T细胞表位。表位在下表1和2中列出。
Figure BDA0002899578950000311
表1
Figure BDA0002899578950000312
Figure BDA0002899578950000321
表2
疫苗组合物可以包含一种或多种在SEQ ID NO：5至41中列出的肽。例如，疫苗组合物可以包含任何组合的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、20种或更多种、21种或更多种、22种或更多种、23种或更多种、24种或更多种、25种或更多种、26种或更多种、27种或更多种、28种或更多种、29种或更多种、30种或更多种、31种或更多种、32种或更多种、33种或更多种、34种或更多种、35种或更多种、或者36种或更多种在SEQ ID NO：5至41中列出的肽。疫苗组合物可以包含所有在SEQ ID NO：5至41中列出的肽。
疫苗组合物可以例如包含一种或多种肽，每种肽由在SEQ ID NO：5至41中列出的肽之一组成。疫苗组合物可以例如包含一种或多种肽，每种肽包含在SEQ ID NO：5至41中列出的肽之一。肽(其包含在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽)可以包含在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽和在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽的N末端和/或C末端的许多其他氨基酸。例如，疫苗组合物可以包含肽，所述肽包含在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽和在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽的N末端的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、或者25个或更多个氨基酸。例如，疫苗组合物可以包含肽，所述肽包含在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽和在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽的C末端的一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、或者25个或更多个氨基酸。在SEQ ID NO：5至41之一中列出的肽的N末端和C末端的氨基酸数目可以是相同的或不同的。
由于NEG8 ORF在人甲型流感病毒之间高度保守，因此SEQ ID NO：5至41在人甲型流感病毒之间也应该保守。因此，包含一种或多种在SEQ ID NO：5至41中列出的肽的疫苗组合物可以具有与包含保守表位有关并如上所述的优点。
SEQ ID NO：5至41中的任何一个可以存在于预测的ORF中，所述ORF在猪、马和/或禽甲型流感病毒中长度为至少167个或至少216个密码子。因此，包含一种或多种在SEQ IDNO：5至41中列出的肽的疫苗组合物可以具有上述优点。
交叉保护性疫苗组合物
如上所述，NEG8 ORF在人甲型流感病毒中高度保守，并且还存在于禽、马和/或猪甲型流感病毒中。其他ssRNA病毒可能类似地具有ORF，所述ORF由其基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，并且在相同属或家族的病毒中保守。由ORF编码的多肽及所述多肽含有的CD8+T细胞表位也可以是保守的。
例如，ORF、多肽和/或表位在乙型流感病毒中可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在丙型流感病毒中可以是保守的。
ORF、多肽和/或表位在黄病毒(例如埃博拉病毒和/或马尔堡病毒)中可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在ZEBOV、BDBV、RESTV、SUDV和TAFV中的两个或更多个之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位马在尔堡病毒中可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在MARV和RAVV之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在埃博拉病毒和马尔堡病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在ZEBOV、BDBV、RESTV、SUDV和TAFV中的一个或多个和MARV和RAVV中的一个或多个之间可以是保守的。
ORF、多肽和/或表位在黄病毒之间可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒，以及圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津脑炎病毒、罗西奥脑炎病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒和Modoc病毒中的两种或更多种之间是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在寨卡病毒和登革热病毒之间，或者寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在寨卡病毒中可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒之间可以是保守的。ORF、多肽和/或表位在登革热病毒中可以是保守的。例如，ORF、多肽和/或表位在DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4中的两种或更多种之间可以是保守的。
如已经提到的，疫苗组合物中包括保守的表位可以赋予针对多种病毒种类、菌株或血清型的保护能力，从而在病毒属和/或家族内提供交叉保护。因此，单一疫苗组合物可以被用于赋予针对多种不同ssRNA病毒的保护。这提供了控制ssRNA病毒感染传播的经济有效的手段。疫苗组合物中包含保守的肽可以赋予针对新兴的ssRNA病毒毒株的保护能力，从而有助于长期控制感染。此外，当ssRNA病毒是黄病毒时，疫苗组合物中包括保守的表位可以有利地预防或最小化施用疫苗组合物后登革热病毒感染的抗体依赖性增强的发展。
与HLA超型的相互作用
疫苗组合物可以包含至少一种免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位并与至少两种不同的HLA超型相互作用，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。这使得疫苗组合物在更大比例的被施用疫苗组合物的个体中引起CD8+T细胞反应。这是因为疫苗组合物应该能够在与CD8+T细胞表位相互作用的HLA超型的所有个体中引起CD8+T细胞反应。疫苗组合物可以包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少十种、至少十五种、至少二十种免疫原性肽，每一种免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位并与至少两种不同的HLA超型相互作用，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。每种免疫原性肽可以与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每种免疫原性肽可以与任何组合的HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62中的两种或更多种或本领域已知的任何其他HLA超型相互作用。
疫苗组合物可以包含两种或更多种免疫原性肽，所述两种或更多种免疫原形肽中(i)每一种免疫原形肽包含来自多肽的不同CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，并且(ii)每一种免疫原形肽与不同的HLA超型相互作用。疫苗组合物中包含两种或更多种这种免疫原性肽使得疫苗组合物在更大比例的被施用疫苗组合物的个体中引起CD8+T细胞反应。这是因为疫苗组合物应该能够在与两种或更多种免疫原性肽中包含的CD8+T细胞表位中的一种相互作用的HLA超型的所有个体中引起CD8+T细胞反应。每个CD8+T细胞表位可以与HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62或本领域已知的任何其他HLA超型相互作用。包含这种CD8+T细胞表位的免疫原性肽的任何组合都是可能的。
CD8+T细胞表位
可以鉴定由ssRNA病毒感染的细胞递呈的CD8+T细胞表位，以便直接鉴定用于包含在疫苗组合物中的CD8+T细胞表位。这是一种有效且合乎逻辑的方法，可以单独使用，也可以用于确认通过MHC基序预测方法确定的潜在CD8+T细胞表位的实用性。
要进行该方法，将细胞感染ssRNA病毒，并在37℃左右的温度下培养72小时左右。培养后，收获细胞并洗涤。接下来，例如通过均质化并在含有1％NP40的缓冲液中冷冻/融化来裂解细胞。通过以2000rpm离心30分钟除去细胞碎片来使裂解物澄清。
然后，使用涂有W6/32(识别泛MHC I类分子的单克隆抗体)的蛋白A/G微珠(UltraLink Immobilized Protein A/G,pierce,Rockford,IL)，通过免疫亲和色谱法从裂解物中分离MHC/肽复合物。为了用抗体包被微珠，将微珠用低pH缓冲液洗涤，然后用PBS冲洗，在室温下与0.5mg抗体孵育2小时，并洗涤3次来除去未结合的抗体。对于免疫亲和色谱，将包被的微珠与裂解物在室温下连续摇动孵育2小时。然后通过以1000rpm离心5分钟将微珠与裂解物分离。通过添加pH 1.5的0.1％三氟乙酸(TFA)将结合的MHC复合物从微珠上洗脱下来。
接下来将洗脱液在85℃加热15分钟来使结合的肽与MHC分子解离。冷却至室温后，使用例如截留分子量为3kDa的膜过滤器(Millipore)通过离心将肽与抗体分离。使用真空离心将滤液浓缩，并重构至最终体积为100μl。纯化的肽混合物例如通过使用离线HPLC的C-18反相(RP)柱(例如4.6mm直径×150mm长度)分级分离。对于此步骤，流动相A可以是水中的2％乙腈(CAN)和0.1％甲酸(FA)，而流动相B可以是在水中的0.1％FA和90％CAN。
然后将含有肽的级分(fraction)从柱上洗脱，在真空下干燥，并通过质谱分析以鉴定级分的序列。然后可以针对所有数据库中的ssRNA病毒蛋白搜索获得的光谱数据，来鉴定与ssRNA病毒相关的肽序列。然后可以根据鉴定的序列制备合成肽，并进行质谱分析，以确认它们与含肽级分中的肽相同。
在这种方法中，任何类型的细胞都可以用任何类型的ssRNA病毒感染。ssRNA病毒在下文详细描述。细胞可以是抗原递呈细胞。细胞可以是肝癌细胞，例如HepG2细胞、EBV转化的淋巴母细胞B细胞(例如JY细胞)或淋巴母细胞(例如T2细胞)。
与MHC基序预测方法相比，ssRNA病毒感染的细胞所递呈的CD8+T细胞表位的直接鉴定是有利的。免疫表位数据库(IEDB；http://www.iedb.org)是通过基序预测方法而非功能方法生成的，并且包含许多预测的HLA特异性ssRNA病毒T细胞表位，包括一些具有高MHC结合评分和有限CTL表征的共享表位。由于ssRNA病毒感染的细胞可能会同时递呈显性和次显性(subdominant)表位，因此很难使用数据库来整理出天然存在的表位的显性层次(dominance hierarchies)。因此，仅从免疫表位数据库尚不清楚，当包含在疫苗组合物中时，预期哪些所列出的表位可以有效诱导CD8+T细胞应答。上文提出的直接鉴定方法提供了用于确认表位的效用的机制。
基于由ssRNA病毒感染的细胞所递呈的表位的疫苗组合物，优于基于病毒蛋白亚基或基序预测的表位的疫苗。免疫系统对蛋白质的加工可能会改变天然病毒表位。将疫苗组合物建立在被证明可被感染的细胞递呈的肽基础上，消除了这种不确定性，因为肽已经经过蛋白质加工。
CD4+T细胞表位
如上所述，本发明的疫苗组合物可以包含含有CD4+T细胞表位的免疫原性肽。疫苗组合物可以包含两个或更多个含有CD4+T细胞表位的免疫原性肽，例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个。CD4+T细胞表位是能够(i)由MHC II类分子递呈和(ii)被存在于CD4+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别的肽。优选地，TCR的识别导致CD4+T细胞的活化。CD4+T细胞活化可能导致增殖和/或细胞因子产生增加。
CD4+T细胞表位可以是ssRNA病毒CD4+T细胞表位。即，CD4+T细胞表位可以是由一种或多种ssRNA病毒(例如甲型流感病毒、登革热病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒或马尔堡病毒)表达的肽，其能够(i)由MHC II类分子递呈和(ii)被存在于CD4+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别。这样的肽在本领域是已知的。
CD4+T细胞表位可以是ssRNA病毒CD4+T细胞表位以外的CD4+T细胞表位。例如，CD4+T细胞可以由ssRNA病毒以外的生物表达。CD4+T细胞表位可以例如由破伤风梭菌(Clostriudium tetani)表达。例如，CD4+T细胞表位可以源自破伤风毒素。
CD4+T细胞表位可以是与所有II类HLA类型反应的CD4+T细胞表位，即所谓的“混杂(promiscuous)”表位。疫苗组合物中包含混杂表位可以提高疫苗组合物诱导针对免疫原性肽的免疫反应的能力，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。CD4+T细胞表位可以例如包含序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA(SEQ ID NO：54)和/或序列LQTMVKLFNRIKNNVAGGC(SEQ ID NO：55)。SEQ ID NO：54和55是源自破伤风毒素的混杂表位。
包含CD4+T细胞表位的肽可以是不同于免疫原性肽的肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，CD4+T表位可以被包含在疫苗组合物中的另外的肽中，即在不包含来自多肽的CD8+T细胞表位的肽中，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。如上所述，另外的肽可以包含一个或多个CD8+T细胞表位和/或一个或多个B细胞表位以及CD4+T细胞表位。
包含CD4+T细胞表位的肽可以是与免疫原性肽相同的肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。即，包含来自多肽的CD8+T细胞表位的免疫原性肽可以进一步包含CD4+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
当包含CD4+T细胞表位的肽还包含CD8+T细胞表位(例如来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码)时，CD8+表位可以嵌套在CD4+T细胞表位中。CD4+T细胞表位通常比CD8+T细胞表位长。因此，延伸CD8+T细胞表位的一个或两个末端可以产生更长的CD4+T细胞表位，其序列仍然包含CD8+T细胞表位。因此，CD4+T细胞表位可以包含在其N-末端或C-末端延伸的CD8+T细胞表位，例如来自多肽的CD8+T细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码(例如SEQ IDNO：5至41中列出的CD8+T细胞表位)。CD8+T细胞表位可以在其N末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。CD8+T细胞表位可以在其C末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。优选地，CD8+T细胞表位在N末端延伸3个氨基酸，并且在C末端延伸3个氨基酸。但是，CD8+T细胞表位不需要在每个末端延伸相同数量的氨基酸。
嵌套在CD4+T细胞表位中的CD8+T细胞表位可能能够产生强大的CTL反应。延伸的肽(CD4+T细胞表位)可能能够诱导T辅助细胞介导的细胞因子应答。因此，在疫苗组合物中包含含有CD8+T细胞表位和CD4+T细胞表位的ssRNA病毒可以使疫苗组合物诱导细胞毒性反应和辅助T细胞反应。
B细胞表位
本发明的疫苗组合物可以包含含有B细胞表位的免疫原性肽。疫苗组合物可以包含两个或更多个(例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个或二十个或更多个)包含B细胞表位的肽。B细胞表位是能够被存在于B细胞上的B细胞受体(BCR)识别的肽。优选地，被BCR识别导致B细胞的活化和/或成熟。B细胞活化可能导致增殖和/或抗体产生增加。
B细胞表位可以是ssRNA B细胞表位。即，B细胞表位可以是由一种或多种ssRNA病毒表达的并且能够被存在于B细胞上的B细胞受体(BCR)识别的肽。这样的肽是本领域已知的。
B细胞表位可以是线性表位，即由ssRNA病毒蛋白的特定区域的一级氨基酸序列定义的表位。或者，表位可以是构象表位，即由天然ssRNA病毒蛋白的构象结构定义的表位。在这种情况下，表位可以是连续的(即与抗体相互作用的成分在蛋白质上依次相邻)或不连续的(即与抗体相互作用的成分在蛋白质的不同部位上，但在折叠的天然蛋白质结构中彼此靠近)。
通常，B细胞表位的长度为约5至20个氨基酸，例如长度为6至19、7至18、8至17、9至16、10至15、11至14或12至13个氨基酸。
鉴定B细胞表位的方法在本领域中也是已知的。例如，表位作图法可以被用于鉴定B细胞表位。这些方法包括：结构方法，其中蛋白质的已知或模型结构被用于基于算法的方法中来预测表面表位；以及功能方法，其中可以定量完整蛋白质、蛋白质片段或肽与抗体的结合，例如使用酶联免疫吸附测定(ELISA)。也可以使用竞争作图抗原修饰或蛋白质片段化方法。
纳米颗粒
本发明的疫苗组合物中包含的任何免疫原性肽可以被连接至纳米颗粒。连接至纳米颗粒(例如金纳米颗粒)是有益的。
肽连接至纳米颗粒(例如金纳米颗粒)减少或消除了在疫苗组合物中包括病毒或佐剂的需要。纳米颗粒可以包含免疫“危险信号”，有助于有效诱导对肽的免疫反应。纳米颗粒可以诱导强烈的免疫反应所需的树突状细胞(DC)活化和成熟。纳米颗粒可以包含非自身组分，该非自身组分改善了纳米颗粒的吸收，从而改善了诸如抗原递呈细胞等细胞对肽的吸收。因此，肽连接至纳米颗粒可以增强抗原呈递细胞刺激病毒特异性T和/或B细胞的能力。连接至纳米颗粒还促进了疫苗组合物通过皮下、皮内、透皮和口服/颊部途径的递送，从而提供了施用的灵活性。
纳米颗粒是尺寸在1到100纳米(nm)之间的颗粒，可以被用作固定配体的基质。在本发明的疫苗组合物中，纳米颗粒的平均直径可以为1至100、20至90、30至80、40至70或50至60nm。优选地，纳米颗粒的平均直径为20至40nm。20至40nm的平均直径促进纳米颗粒被吸收到胞质溶胶中。可以使用本领域众所周知的技术(例如透射电子显微镜)来测量平均直径。
适用于递送抗原(例如免疫原性肽)的纳米颗粒是本领域已知的。用于生产此类纳米颗粒的方法也是已知的。
纳米颗粒可以例如是聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)、病毒样颗粒(VLP)或自组装蛋白。纳米颗粒优选为磷酸钙纳米颗粒、硅纳米颗粒或金纳米颗粒。
纳米颗粒可以是聚合物纳米颗粒。聚合物纳米颗粒可以包含一种或多种合成聚合物，例如聚(d,l-丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚(d,l-乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(g-谷氨酸)(g-PGA)m聚乙二醇(PEG)或聚苯乙烯。聚合物纳米颗粒可以包含一种或多种天然聚合物，例如多糖，例如支链淀粉、藻酸盐、菊粉和壳聚糖。使用聚合物纳米颗粒可以因可以包括在纳米颗粒中的聚合物的性质而是有利的。例如，天然和合成聚合物可以具有良好的生物相容性和生物降解性、无毒性质和/或被操纵成所需形状和大小的能力。聚合物纳米颗粒可以形成水凝胶纳米颗粒。水凝胶纳米颗粒是一种纳米尺寸的亲水三维聚合物网格类型的纳米颗粒。水凝胶纳米颗粒具有良好的性能，包括灵活的筛孔尺寸、大的多价结合表面积、高水含量和高抗原负载能力。诸如聚(L-乳酸)(PLA)、PLGA、PEG和多糖的聚合物都特别适用于形成水凝胶纳米颗粒。
纳米颗粒可以是无机纳米颗粒。通常，无机纳米颗粒具有刚性结构并且是不可生物降解的。然而，无机纳米颗粒可以是生物可降解的。无机纳米颗粒可以包含其中可以封装抗原的壳。无机纳米颗粒可以包含可以与抗原共价连接的核。核可以包括金属。例如，核可以包含金(Au)、银(Ag)或铜(Cu)原子。核可以由一种以上类型的原子形成。例如，核可以包括合金，例如Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd或Au/Ag/Cu/Pd的合金。核可以包含磷酸钙(CaP)。核可以包括半导体材料，例如硒化镉。
其他示例性的无机纳米颗粒包括碳纳米颗粒和二氧化硅基纳米颗粒。碳纳米颗粒具有良好的生物相容性，并且可以合成为纳米管和中孔球。基于二氧化硅的纳米颗粒(SiNP)具有生物相容性，且制备时结构参数可调来适合其治疗应用。
纳米颗粒可以是硅纳米颗粒，例如元素硅纳米颗粒。纳米颗粒可以是介孔的或具有蜂窝孔结构。优选地，纳米颗粒是具有蜂窝孔结构的元素硅颗粒。这样的纳米颗粒在本领域中是已知的，并且提供可调节和受控的药物负载、靶向和释放，其可以适应几乎任何负载物、施用途径、靶标或释放曲线。例如，这样的纳米颗粒可以增加其负载物的生物利用度，和/或改善口服活性物质的肠渗透性和吸收。纳米颗粒由于其多孔结构和大表面积而可以具有异常高的负载能力。取决于它们的物理性质，纳米颗粒可以在几天、几周或几个月内释放它们的负载物。由于硅是人体的天然成分，因此纳米颗粒可能不会引起免疫系统的反应。这对于纳米颗粒的体内安全性是有利的。
上述的任何SiNP都可以是可生物降解的或不可生物降解的。可生物降解的SiNP可能溶解为原硅酸(硅的可生物利用形式)。已显示原硅酸对骨骼、结缔组织、头发和皮肤的健康有益。
纳米颗粒可以是脂质体。脂质体通常由可生物降解的、无毒的磷脂形成，并且包含具有水性核的自组装磷脂双层壳。脂质体可以是包含单个磷脂双层的单层囊泡，也可以是包含由水层隔开的几个同心磷脂壳的多层囊泡。因此，脂质体可以被调整为将亲水性分子并入到水性核中或将疏水性分子并入磷脂双层中。脂质体可以将抗原包封在核中用于进行递送。脂质体可以将病毒包膜糖蛋白并入壳中来形成病毒体。许多基于脂质体的产品在本领域中已经建立并且被批准用于人类。
纳米颗粒可以是免疫刺激复合物(ISCOM)。ISCOM是笼状颗粒，通常由含胶体皂苷的胶束形成。ISCOM可以包含胆固醇、磷脂(例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱)和皂苷(例如来自树Quillaia saponaria的Quil A)。传统上，ISCOM被用于捕获病毒包膜蛋白，例如来自1型单纯疱疹病毒、乙型肝炎或流感病毒的包膜蛋白。
纳米颗粒可以是病毒样颗粒(VLP)。VLP是缺少感染性核酸的自组装纳米颗粒，其是由生物相容性衣壳蛋白自组装形成的。VLP的直径通常为约20至约150nm，例如约20至约40nm、约30至约140nm、约40至约130nm、约50至约120nm、约60至约110nm、约70至约100nm、或约80nm至约90nm。VLP有利地利用了进化出的病毒结构的力量，而自然地优化了它与免疫系统的相互作用。自然优化的纳米颗粒大小和重复的结构顺序意味着，即使在没有佐剂的情况下，VLP也会诱导有效的免疫反应。
纳米颗粒可以是自组装蛋白。例如，纳米颗粒可以包含铁蛋白。铁蛋白是一种可以自组装成近球形的10nm结构的蛋白质。纳米颗粒可以包含主穹隆蛋白(MVP)。96个MVP单元可以自组装成桶形的穹隆纳米粒，大小约为40nm宽和70nm长。
纳米颗粒可以是磷酸钙(CaP)纳米颗粒。CaP纳米颗粒可以包含核，所述核包含一个或多个(例如两个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、或500个或更多个)CaP分子。CaP纳米颗粒及其生产方法是本领域已知的。例如，可以通过在恒定混合下以预定比例混合钙和磷酸盐的无机盐溶液来产生CAP纳米颗粒的稳定的纳米悬浮液。
CaP纳米颗粒可以具有约80至约100nm(例如约82至约98nm、约84至约96nm、约86至约94nm或约88至约92nm)的平均粒度。在免疫细胞摄取和免疫反应方面，该粒径可能比其他较大粒径产生更好的性能。例如当在1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月或48个月的时期内测量时，粒度可以是稳定的(即没有显示出显著变化)。
CaP纳米颗粒可以与一种或多种抗原共同配制，所述抗原或吸附在纳米颗粒的表面上，或在颗粒合成过程中与CaP共沉淀。例如，可通过以下方法将肽(例如黄病毒肽)连接至CaP纳米颗粒：将肽溶解在DMSO中(例如，浓度约为10mg/ml)，加至CaP纳米颗粒与N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)(例如在0.093mol/L)和超纯水的悬浮液中，在室温下混合约4小时(例如1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时)。
疫苗组合物可以包含约0.15至约0.8％(例如0.2至约0.75％、0.25至约0.7％、0.3至约0.6％、0.35至约0.65％、0.4至约0.6％或0.45至约0.55％)的CaP纳米颗粒。优选地，疫苗组合物包含约0.3％的CaP纳米颗粒。
CaP纳米颗粒由于与人类硬组织(例如骨骼和牙齿)的化学相似性而具有高度的生物相容性。因此，有利地，CaP纳米颗粒在用于治疗应用时是无毒的。CaP纳米颗粒可以通过肌肉内、皮下、口服或吸入途径安全施用。CaP纳米颗粒也很容易在商业上合成。此外，CaP纳米颗粒可能与抗原的缓慢释放有关，这可能会增强对连接至纳米颗粒的肽的免疫反应的诱导。CaP纳米颗粒既可以被用作佐剂，也可以被用作药物递送载体。
纳米颗粒可以是金纳米颗粒。金纳米颗粒是本领域已知的，并且特别描述于WO2002/32404、WO2006/037979、WO2007/122388、WO2007/015105和WO2013/034726中。连接至每个肽的金纳米颗粒可以是在WO2002/32404、WO2006/037979、WO2007/122388、WO2007/015105和WO2013/034726中的任何一个中描述的金纳米颗粒。
金纳米颗粒包括包含金(Au)原子的核。核可以进一步包含一个或多个Fe、Cu或Gd原子。核可以由金合金形成，例如Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd。核的原子总数可以是100至500个原子，例如150至450、200至400或250至350个原子。金纳米颗粒可以具有1至100、20至90、30至80、40至70或50至60nm的平均直径。优选地，金纳米颗粒的平均直径为20至40nm。
纳米颗粒可以包括包覆有α-半乳糖和/或β-GlcNHAc的表面。例如，纳米颗粒可以包含被α-半乳糖和/或β-GlcNHAc钝化的表面。在这种情况下，纳米颗粒可以例如是包含核的纳米颗粒，所述核包含金属和/或半导体原子。例如，纳米颗粒可以是金纳米颗粒。Beta-GlcNHAc是一种细菌病原体相关分子模式(PAMP)，能够激活抗原递呈细胞。以这种方式，包含被β-GlcNHAc包覆或钝化的表面的纳米颗粒可以非特异性地刺激免疫反应。因此，免疫原性肽连接至这种纳米颗粒可以改善由向个体施用本发明的疫苗组合物引起的免疫反应。
除肽以外的一种或多种配体可以连接至纳米颗粒，其可以是上述纳米颗粒的任何类型。配体可以形成“冠状物(corona)”，这是可以部分或完全覆盖核的表面的层或涂层。冠状物可以被认为是围绕或部分围绕纳米颗粒核的有机层。冠状物可以提供或参与钝化纳米颗粒的核。因此，在某些情况下，冠状物可以是使核稳定的足够完整的涂层。冠状物可以促进本发明的纳米颗粒的溶解度(例如水溶性)。
纳米颗粒可以包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个配体。配体可以包括一种或多种肽、蛋白质结构域、核酸分子、脂质基团、碳水化合物基团、阴离子基团或阳离子基团、糖脂和/或糖蛋白。碳水化合物基团可以是多糖、寡糖或单糖基团(例如葡萄糖)。一种或多种配体可以是非自身组分，由于其与致病组分的相似性，使得纳米颗粒更可能被抗原呈递细胞吸收。例如，一种或多种配体可以包含碳水化合物部分(例如细菌碳水化合物部分)、表面活性剂部分和/或谷胱甘肽部分。示例性配体包括葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、谷胱甘肽、2'-硫代乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和2'-硫代乙基-D-吡喃葡萄糖苷。优选的配体包括糖缀合物，其形成糖纳米颗粒。
连接子可以促进配体与核的连接。连接子可以包含巯基、烷基、二醇基或肽基。例如，连接子可以包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。连接子可以包含能够共价连接至核的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团。可替代地，配体可以例如通过配体中包含的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团直接连接至核。
连接至纳米颗粒
免疫原性肽可以在其N端连接至纳米颗粒。通常，免疫原性肽可以连接至纳米颗粒的核，但连接至冠状物或配体上也是可能的。
肽可以例如通过使肽中的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团中的原子与纳米颗粒或其核中的原子共价键合而与纳米颗粒直接连接。
连接子可以被用于将肽连接至纳米颗粒。连接子可以包含能够共价连接至核中的原子的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团。例如，连接子可以包含硫醇基、烷基、二醇基或肽基。
连接子可以包含肽部分和非肽部分。肽部分可以包含序列X1X2Z1，其中X1是选自A和G的氨基酸；X2是选自A和G的氨基酸；Z1是选自Y和F的氨基酸。肽部分可以包含序列AAY或FLAAY。连接子的肽部分可以与肽的N-末端连接。连接子的非肽部分可以包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇，例如硫乙基(thioethyl group)或硫丙基(thiopropyl group)。
连接子可以是(i)HS-(CH2)2-CONH-AAY；(ii)HS-(CH2)2-CONH-LAAY；(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY；(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAY；(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY；以及(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY。在这种情况下，连接子的非肽部分的硫醇基将连接子连接至核。
用于将肽连接至纳米颗粒的其他合适的连接子是本领域已知的，并且可以被本领域技术人员容易地鉴定和实施。
如上文所解释，疫苗组合物可以包含多种免疫原性肽。当疫苗组合物包含多于一种的免疫原性肽时，两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种)的免疫原性肽可以连接至同一纳米颗粒。两种或更多种(例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种)的免疫原性肽可以分别连接至不同的纳米颗粒。免疫原性肽所连接的纳米颗粒可以是相同类型的纳米颗粒。例如，每种免疫原性肽可以连接至金纳米颗粒。每种免疫原性肽可以连接至CaP纳米颗粒。免疫原性肽所连接的纳米颗粒可以是不同类型的纳米颗粒。例如，一种免疫原性肽可以连接至金纳米颗粒，而另一种免疫原性肽可以连接至CaP纳米颗粒。
药物、方法和治疗用途
本发明提供了一种预防或治疗病毒感染的方法，所述方法包含将本发明的疫苗组合物施用于感染了或有风险感染ssRNA病毒的个体。本发明还提供了用于预防或治疗个体中ssRNA病毒感染的方法的本发明的疫苗组合物。
个体可以例如是人类。个体可以例如是猪、马或鸟。
ssRNA病毒感染可以是由人畜共患病毒引起的。ssRNA病毒感染可以是大流行病毒感染。
ssRNA病毒感染可以例如是正粘病毒感染。正粘病毒感染可以是例如流感病毒感染。流感病毒可以是甲型、乙型和/或丙型流感病毒。甲型流感病毒可以例如是血清型H1N1、H5N1、H7N9、H7N7、H2N2或H3N2。流感病毒可以是人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒或禽流感病毒。流感病毒可以是大流行流感病毒或潜在的大流行流感病毒。
ssRNA病毒感染可以是例如黄病毒感染。黄病毒感染可以是例如寨卡病毒感染、登革热病毒感染、西尼罗河病毒感染、黄热病病毒感染、圣路易斯脑炎病毒感染、日本脑炎病毒感染、墨累谷脑炎病毒感染、蜱传脑炎病毒感染、昆津脑炎病毒感染、罗西奥脑炎病毒感染、俄罗斯春夏脑炎病毒感染、Negeishi病毒感染、Kyasanur森林病毒感染、鄂木斯克出血热病毒感染、Powassan病毒感染、Louping Ill病毒感染、Rio Bravo病毒感染、Tyuleniy病毒感染、Ntaya病毒感染或Modoc病毒感染。寨卡病毒感染可以是例如非洲寨卡病毒感染或亚洲寨卡病毒感染。登革热病毒可以是例如DENV-1感染、DENV-2感染、DENV-3感染或DENV-4感染。
ssRNA病毒感染可以是例如丝状病毒感染。丝状病毒感染可以是例如埃博拉病毒感染或马尔堡病毒感染。埃博拉病毒感染可以是例如扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBOV)、苏丹型埃博拉病毒(SUDV)、雷斯顿型埃博拉病毒(RESTV)、泰伊森林埃博拉病毒(TAFV)或本迪布焦型埃博拉病毒(BDBV)感染。马尔堡病毒感染可以是例如马尔堡病毒(MARV)或拉温病毒(RAVV)感染。
疫苗组合物可以作为药物组合物提供。药物组合物优选包含药学上可接受的载体或稀释剂。可以使用任何合适的方法来配制该药物组合物。使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制细胞，可以通过药学领域中的常规方法进行。制剂的确切性质将取决于几个因素，包括要施用的细胞和所需的施用途径。合适类型的制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences,19th Edition,Mack Publishing Company,EasternPennsylvania,USA中有完整描述。
疫苗组合物或药物组合物可以通过任何途径施用。合适的途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、透皮和口服/颊途径。
组合物可以与生理上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，此类组合物被制备为肽和/或肽连接的纳米颗粒的液体悬浮液。可以将肽和/或肽连接的纳米颗粒与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。
另外，如果需要，药物组合物可以包含少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。
以与剂型相容的方式和治疗上有效的量施用肽或肽连接的纳米颗粒。施用量取决于要治疗的对象、要治疗的疾病以及对象的免疫系统的能力。所需施用的纳米颗粒的精确量可能取决于从业者的判断，并且可能是每个对象所特有的。
可以将任何合适数量的肽或肽连接的纳米颗粒施用于对象。例如，患者每千克可以施用至少或约0.2×106、0.25×106、0.5×106、1.5×106、4.0×106或5.0×106肽或肽连接的纳米颗粒。例如，可以施用至少或约105、106、107、108、109肽或肽连接的纳米颗粒。作为指导，要施用的肽或肽连接的纳米颗粒的数量可以为105至109个，优选为106至108。
方法
本发明提供一种鉴定免疫原性肽的方法，所述免疫原性肽包含来自开放阅读框ORF的CD8+T细胞表位，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，所述方法通过以下步骤进行：(a)鉴定ORF，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；(b)预测由ORF编码的多肽的序列；以及(c)评估结合MHC I类分子的肽是否包含存在于预测序列中的序列，从而鉴定包含CD8+T细胞表位的免疫原性肽。
免疫原性肽可以是上文讨论的任何免疫原性肽。CD8+T细胞表位可以是上文讨论的任何CD8+T细胞表位。ssRNA病毒可以是上文讨论的任何ssRNA病毒。优选地，ssRNA病毒是甲型流感病毒。
ORF可以是上文讨论的任何ORF。ORF可以例如是NEG8 ORF。在一些方面，ORF包括终止密码子。在这种情况下，预测序列的预测是基于：ORF被突变为编码氨基酸的密码子，并且肽包含存在于预测序列的一部分中的在突变的密码子的C末端的序列。
鉴定ORF的方法是本领域总所周知的，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。例如，可以通过分析与能够翻译的正义RNA相反方向的ssRNA病毒的基因组序列来鉴定ORF。如上所述，ORF是包含起始密码子和终止密码子的连续密码子序列。如果与能够翻译的正义RNA相反方向的ssRNA病毒的基因组序列包含这样一段密码子，则它可能包含ORF。
预测由ORF编码的多肽的序列的方法是本领域常规的。例如，在遗传密码的知识下，技术人员可以容易地从ORF中包含的密码子确定多肽的氨基酸序列。
评估结合MHC I类分子的肽是否包含存在于预测序列中的序列的方法也是已知的。例如，可以如上文“CD8+T细胞表位”部分所述来确定结合MHC I类分子的肽。简而言之，用ssRNA病毒感染细胞，进行培养，收获和洗涤。裂解细胞，然后通过免疫亲和层析从裂解物中分离出MHC/肽复合物。加热通过免疫亲和层析获得的MHC复合物，从而使结合的肽与MHC分子解离。纯化肽混合物并通过质谱分析来鉴定肽的序列。然后可以将肽的序列与预测序列进行比较，来确定肽是否包含存在于预测序列中的序列。换句话说，可以将预测序列与已知的或新的显示结合MHC I类分子的序列的序列进行比较。例如，如果在肽的一些(例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％)或全部长度上预测序列与肽之间存在同一性，则该肽可以包含存在于预测序列中的序列。基于氨基酸同一性，例如，在肽的一些或全部长度上，肽与预测序列之间至少有50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性)的同一性。
由于免疫原性肽包含CD8+T细胞表位，因此预期能够诱导CD8+T细胞反应。本发明的方法可以进一步包含一个或多个步骤，来帮助确认是否是这种情况。例如，该方法可以进一步包含：(d)将从感染了或之前感染过ssRNA病毒的个体获得的CD8+T细胞与肽接触；以及(e)体外测量对肽的免疫反应。换句话说，用免疫原性肽刺激从感染了或之前感染过ssRNA病毒的个体获得的CD8+T细胞，来确定CD8+T细胞群是否包含对免疫原性肽中包含的表位具有特异性的CD8+T细胞。用于体外测量免疫反应的方法是本领域众所周知的。例如，可以测量CD8+T细胞的增殖。可以测量IFNγ的产生，例如使用流式细胞术分析培养上清液中的IFNγ或研究细胞内IFNγ。可以使用流式细胞术测量脱颗粒的标志物CD107a的表达。
免疫原性肽
本发明提供一种免疫原性肽，其包含来自多肽的CD4+T细胞表位或B细胞表位，所述多肽由开放阅读框(ORF)编码，所述开放阅读框由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
CD4+T细胞表位是能够(i)由MHC II类分子递呈和(ii)被存在于CD4+T细胞上的T细胞受体(TCR)识别的肽。优选地，TCR的识别导致CD4+T细胞的活化。CD4+T细胞活化可以导致增殖和/或细胞因子产生增加。
B细胞表位是能够被存在于B细胞上的B细胞受体(BCR)识别的肽。优选地，BCR的识别导致B细胞的活化和/或成熟。B细胞活化可以导致增殖和/或抗体产生增加。
免疫原性肽可以被用于疫苗组合物中。以上关于疫苗组合物(该疫苗组合物包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+T细胞表位或B细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码)的任何方面的描述都可以等同地应用于疫苗组合物(该疫苗组合物包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD4+T细胞表位或B细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码)。包含免疫原性肽的疫苗组合物的施用可以诱导针对ssRNA病毒的保护性免疫反应。例如，疫苗组合物的施用可以诱导针对ssRNA病毒的CD4+T细胞反应。疫苗组合物的施用可以诱导针对ssRNA病毒的B细胞反应。以这种方式，可以诱导针对ssRNA病毒的体液免疫。
免疫原性肽可以被用于诊断ssRNA病毒感染的测定中。例如，免疫原性肽可以被用于检测针对ssRNA病毒的抗体，例如对免疫原性肽中包含的B细胞表位具有特异性的抗体。免疫原性肽可以被用于检测对ssRNA病毒具有特异性的B细胞，例如B细胞受体对免疫原性肽中包含的B细胞表位具有特异性的B细胞。免疫原性肽可以被用于检测对ssRNA病毒具有特异性的CD4+T细胞，例如对免疫原性肽中包含的CD4+T细胞表位具有特异性的CD4+T细胞。
鉴定大流行潜力
传统上，甲型流感病毒大流行与病毒的HA血清型的全球变化有关。然而，本申请的发明人已经注意到，一些甲型流感病毒的爆发与HA血清型的变化无关，而是与ORF的密码子长度的变化有关，所述ORF由甲型流感病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
因此，本发明提供一种确定甲型流感病毒的大流行潜力的方法，所述方法包含以下步骤：(i)鉴定第一ORF，所述第一ORF由甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；(ii)确定第一ORF中包含的密码子数量；以及(iii)将第一ORF中包含的密码子数量与第二ORF中包含的密码子数量进行比较，所述第二ORF由已知的大流行甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，其中第一ORF与第二ORF的密码子数量差异表示大流行潜力。
在本发明的上下文中，大流行潜力是指甲型流感病毒引起流感大流行的能力。当一种新的流感病毒在世界范围内出现并传播时，就会发生流感大流行。
第一ORF可以包含任何核苷酸序列。第一ORF可以编码任何多肽序列。第二ORF可以包含任何核苷酸序列。第二ORF可以编码任何多肽序列。
第一ORF可以具有任何长度，即包括任何数量的密码子。第二ORF可以具有任何长度，即包括任何数量的密码子。上文讨论了示例性ORF长度。
第一和第二ORF的长度可以不同，可以是任意数量的密码子。例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、90个或更多个、或100个或更多个密码子的差异可以表示大流行潜力。
应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以适合于本领域的特定需求。还应理解，本文所用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。
另外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非内容中另有明确规定。因此，例如，提及“肽”包括“多个肽”，提及“纳米颗粒”包括两个或更多个这样的纳米颗粒等等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。
下列实施例说明本发明。
实施例1-CD8+T细胞表位的鉴定
细胞系
HepG2肝癌细胞从ATCC获得，并保存在DMEM:F12(Mediatech,Manassas,VA)中。培养基中添加了10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺(300mg/mL)、非必需氨基酸(1x浓度)、0.5mM丙酮酸钠、青霉素和链霉素(1x浓度，补充剂购自Mediatech)[完全培养基]。将细胞在含5％CO2的潮湿培养箱中保持在37℃。
制备用于MHC肽分析的样品
HepG2细胞生长到大约1E9个细胞。然后用PR8菌株甲型流感病毒感染这些细胞。1小时脉冲后，将病毒洗去，并将细胞在37℃下孵育72小时。此时，收获细胞并进行处理以进行MHC肽分析。
MHC I类结合肽的分离、纯化和分级分离
通过均质并在含有1.0％NP40的缓冲液中冷冻/融化来裂解感染的细胞。通过以2000rpm离心30分钟以除去细胞碎片来使裂解物澄清。通过使用W6/32抗体(识别泛MHC I类分子的单克隆抗体)包覆的蛋白A/G珠(UltraLink固定蛋白A/G，Pierce,Rockford,IL)通过免疫亲和色谱法分离MHC/肽复合物。用低pH缓冲液洗涤400μl蛋白A/G珠，然后用PBS冲洗。然后将微珠与0.5mg抗体在室温下孵育2小时。将标记的微珠洗涤三遍以除去未结合的抗体，并将抗体包覆的微珠添加至制备的细胞裂解物中。在室温下连续摇动孵育两小时后，通过以1000rpm离心5分钟将微珠与裂解液分离。通过加入0.1％三氟乙酸(TFA)，pH 1.5，从微珠上洗脱结合的MHC复合物。接下来，将洗脱液在85℃加热15分钟，从而使结合的肽与MHC分子解离。将溶液冷却至室温后，使用Amicon Ultra-3kDa分子量截留膜过滤器(Millipore)通过离心将肽与抗体分离。使用真空离心将滤液浓缩，并重构至最终体积为100μL。使用离线的终极3000HPLC(Dionex，Sunnyvale，CA)，并使用C-18反相(RP)柱(4.6mm直径×150mm长度)分离分级纯化的肽混合物。流动相A为在水中的2％乙腈(ACN)和0.1％甲酸(FA)，而流动相B为在水中的0.1％FA和90％ACN。然后，以200μL/min的流速从5％到80％的缓冲液B以80分钟的线性梯度从柱上洗脱肽。总共收集了35个级分，并在真空下干燥至6μL，用于LC/MS/MS分析。
质谱分析
使用LTQ(Thermo)和Orbitrap仪器与纳米版HPLC(Dionex)进行质谱实验。RP-HPLC纯化的肽级分分别注入LC-MS/MS系统中，来鉴定肽序列。作为在线样品净化步骤的一部分，首先使用300μm ID×5mm C18 RP捕集柱(Dionex，Sunnyvale CA)对肽进行浓缩，然后使用75μm ID×15cm C18 RP分析柱(Dionex，Sunnyvale CA)进行分离，在4％ACN/0.1％FA中以250nL/min的流速达到平衡。流动相A是在水中的2％ACN和0.1％FA，而流动相B是在水中的0.1％FA和90％ACN。以4％至50％B的梯度洗脱60分钟并以50％至80％的梯度洗脱90分钟，然后直接洗脱到质谱仪中。MS模式下的分子量范围为350Da至1500Da，MS/MS模式下的分子量范围为100Da至1500Da。使用数据依赖性(Data-Dependent)方法分析肽。使用ProteomeDiscoverer(Thermo)在甲型流感蛋白质数据库搜索获得的光谱数据，来解释数据并得出肽序列。将PR8感染的细胞中与MHC I类结合的肽序列记录在数据库中。
NEG8 ORF中MHC肽的鉴定
针对由NEG8 ORF编码的多肽序列(SEQ ID NO:2；MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL)搜索被发现与PR8感染的细胞中的MHC I类结合的肽数据库。发现NEG8多肽包含许多与甲型流感病毒感染的细胞中的MHC I类结合的肽。下表3示出了由NEG8 ORF编码的与甲型流感病毒感染的细胞中的MHC I类结合的肽。
Figure BDA0002899578950000521
表3
实施例2
使用合成肽质谱分析法确认由NEG8 ORF编码并被发现与甲型流感病毒感染的细胞中MHC I类结合的5种肽的身份。合成表3中所示的五种肽，并在如上所述的相同实验条件下进行LC-MS/MS分析。从甲型流感病毒感染的细胞中分离出的每种肽获得的光谱及其合成的类似物所获得的光谱，从而确认每种肽的序列。结果示于表4和图1至3。
Figure BDA0002899578950000522
Figure BDA0002899578950000531
Figure BDA0002899578950000541
表4
图1至3比较了合成肽与从感染细胞中分离得到的肽的质谱。在每个光谱中圈出一些典型的离子，来说明从感染细胞中分离出的肽与其合成的类似物的同一性。数据证实，NEG8 ORF编码的肽IAPSSVKALS、LMQRGPSTF和KITLKFAFNMM确实存在于甲型流感病毒感染的细胞中。
实施例3
由NEG8 ORF编码的多肽序列(SEQ ID NO:2；MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL)被用于搜索来源于流感病毒感染的细胞的T细胞表位的数据集。使用该搜索也鉴定了实施例1和2中所述的NEG8肽。进行搜索的目的是确定由NEG8 ORF编码的多肽中的任何NEG8肽或序列是否与任何其他甲型流感病毒蛋白共享。表5列出了来源于NEG8以外的甲型流感病毒蛋白的T细胞表位，其也包含在实施例1和2中鉴定的一种或多种NEG8肽或由NEG8 ORF编码的多肽中。由此，基于置信度水平、XCorr和片段质谱的表现可以鉴定许多被认为与甲型流感病毒感染的细胞中的MHC结合的NEG8肽。
Figure BDA0002899578950000551
Figure BDA0002899578950000561
Figure BDA0002899578950000571
表5：与其他流感蛋白共享的NEG8肽
实施例4
体外刺激CTL反应
在细胞因子混合物中用肽刺激健康(原始)人供体的外周血单核细胞(PBMC)来诱导抗原特异性CTL反应，所述肽由NEG8 ORF编码并显示出与甲型流感病毒感染的细胞中MHCI类结合。用合并的游离肽(FP)刺激PBMC，在不同的肽负载下总共刺激4次。
然后通过与未感染的、已感染的或载有肽的靶标共培养来分析这些被刺激的PBMC的抗原特异性反应。TAP缺陷细胞(T2)被用于装载肽，空白T2细胞被用作对照。通过流式细胞术分析活化的PBMC的干扰素γ(IFNγ)和CD107a脱颗粒标记物。
Dextramer研究
Dextramer试剂经过荧光标记，被用于检测细胞悬浮液和实体组织样品中的抗原特异性T细胞。MHC dextramer被添加至PBMC或脾细胞中。然后加入最适量的与相关的荧光染料结合的抗CD8抗体。也可以在此步骤中添加与其他相关荧光染料结合的其他抗体(例如抗CD3或抗CD4抗体)。然后使用流式细胞仪分析细胞。
体内CTL研究
通过皮下和皮内施用途径，以游离的合成肽或纳米颗粒-肽结合物(与或不与montanide-51佐剂混合)免疫转基因小鼠(每组5-6只小鼠)，每2周一次，共3次。最后一次加强免疫后7天，收集脾脏和引流淋巴结进行CTL分析。从淋巴器官制备单细胞悬液，并在培养物中用肽抗原刺激细胞7天。使用载有NEG8肽的T2细胞和甲型流感病毒感染的HepG2细胞作为靶标，在以下试验中测定了重新活化的T细胞的表位特异性CTL反应：通过ELISpot测定IFN-γ和颗粒酶B的产生；通过MAGPIX分析测定细胞因子的分泌；通过流式细胞术测定CD107a共表达。
过继转移实验
进行过继转移实验来研究在转基因小鼠体内产生的肽特异性CTL是否在SCID-Beige小鼠体内对甲型流感病毒感染的细胞具有细胞毒性作用。将感染的肝肿瘤悬液皮下注射或静脉内注射到SCID Beige小鼠中，然后单次或多次过继转移在转基因A2小鼠中产生的针对肽或肽-纳米颗粒构建体的肽特异性CTL。使用适当的对照。监测小鼠的存活。
实施例5
主要ORF长度随时间的变化
使用国际流感数据库来获得许多人甲型流感病毒的节段8的序列。分析反义基因组序列来确定每种病毒中NEG8 ORF的长度。通过确定反义序列中第一个终止密码子的位置来计算ORF长度。例如，NEG8序列在94位具有终止密码子的病毒的ORF长度为93个密码子。
图5显示了按收集年份和月份(X轴)分析的甲型流感病毒的数量(Y轴)。颜色编码表示存在于每个时间点收集的病毒中的ORF的长度。数据显示，从1918年至1947年，人甲型流感病毒中主要ORF长度为167个密码子。从1947年至2009年，主要是216个密码子的ORF。自2009年大流行流感以来，主要ORF长度为85个密码子。
ORF长度(按血清型)
还考虑了血清型与ORF长度之间的关系。图6按年份显示了ORF同一性。颜色编码显示每种标绘病毒的血清型。在1918年(西班牙流感-绿色)和1957年(亚洲流感-蓝色)之间，血清型H1N1的病毒中存在主要167个密码子的ORF。然后，直到1968年(HK流感-黄色)，在血清型H2N2的病毒中存在主要167个密码子的ORF，在那时，在血清型H3N2的病毒中存在主要167个密码子的ORF。在1976年167个密码子的ORF以俄罗斯流感(绿色)再次出现在H1N1血清型病毒中。结果在图7中得到了证实，该图按年绘制了167个密码子的ORF的同一性，并以颜色编码显示血清型。这些数据表明，尽管血清型和相关的群集效应(constellationeffect)发生了变化，但甲型流感病毒群体中的ORF长度仍然可以保持。
ORF长度(按物种)
图8显示了在不同物种的甲型流感病毒中普遍存在的ORF长度。在禽、类禽猪和马甲型流感病毒中观察到93个密码子的ORF(或更罕见的是135个密码子的ORF)。在猪型流感病毒中已观察到140个密码子的ORF和167个密码子的ORF。在马甲型流感病毒中，几乎是100％的时间NEG8 ORF长度为93个密码子。马甲型流感病毒永远不会包含长度为85、167或216个密码子的人长度的ORF。
序列表
<110> 埃默杰克斯疫苗控股有限公司
<120> 反向肽疫苗
<130> N412441WO
<150> US 62/673,647
<151> 2018-05-18
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
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100 105 110
Arg Val Ser Ser Arg Ser Lys Ile Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Met
115 120 125
Met Phe Phe Ser Met Ile Ala Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Met Ser Val Met Tyr Arg Glu Ala Gly Val Glu Ala Met
165 170 175
Val Ile Leu Ser Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Arg Ile Phe Ser Thr
180 185 190
Ile Cys Phe Pro Thr Trp Val Ala Ala Leu Met Ser Arg Pro Arg Val
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asp Leu
210 215
<210> 12
<211> 216
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 12
Met Leu Phe Ala Gln Asn Tyr Ser Gln Leu Phe Leu Val Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Gln Ser Ala Ile Leu Ser Leu Arg Thr Phe Asp Leu Ala Val
20 25 30
Leu Ala Ile Phe Arg Phe Cys Phe Gly Val Ser Gly Gly Pro Pro Phe
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Pro Gln Ala Asn Leu Cys Arg Phe Leu Glu Thr Arg
50 55 60
Thr Val Leu Ser Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Ile Ala
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ser Ser Ile Val Cys Pro Gly Lys Glu Gly Asn Gly Glu
85 90 95
Ile Ser Pro Tyr Ile Ala Pro Ser Ser Val Lys Ala Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Arg Val Ser Ser Arg Ser Lys Ile Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Met
115 120 125
Met Phe Phe Ser Met Ile Ala Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Ile Ser Val Met Tyr Arg Glu Ala Gly Val Glu Ala Met
165 170 175
Val Ile Leu Ser Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Arg Ile Phe Ser Thr
180 185 190
Ile Cys Phe Pro Thr Trp Val Ala Ala Leu Met Ser Arg Pro Arg Val
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asp Leu
210 215
<210> 13
<211> 216
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 13
Met Leu Phe Ala Gln Asn Tyr Ser Gln Leu Phe Leu Val Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Gln Ser Ala Ile Leu Ser Leu Gln Thr Phe Asp Leu Ala Val
20 25 30
Leu Ala Ile Phe Arg Phe Cys Phe Gly Val Ser Gly Gly Pro Pro Phe
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Gln Ala Asn Leu Cys Arg Phe Leu Glu Thr Arg
50 55 60
Thr Val Leu Ser Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Ile Ala
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ser Ser Ile Val Cys Pro Gly Lys Glu Gly Asn Gly Glu
85 90 95
Ile Ser Pro Thr Ile Ala Pro Ser Ser Val Lys Ala Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Met Val Ser Ser Arg Ser Lys Thr Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Met
115 120 125
Met Phe Phe Ser Met Ile Ala Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Met Ser Val Met Tyr Arg Glu Ala Gly Val Glu Ala Met
165 170 175
Val Ile Leu Ser Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Arg Ile Phe Ser Thr
180 185 190
Ile Cys Phe Pro Thr Trp Val Ala Ala Leu Ile Ser Arg Pro Arg Val
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asp Leu
210 215
<210> 14
<211> 216
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 14
Met Leu Phe Val Gln Ser Tyr Phe Gln Leu Phe Leu Ile Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Gln Leu Ala Ile Leu Ser Leu Gln Thr Phe Asp Leu Ala Val
20 25 30
Leu Ala Ile Ser Arg Phe Cys Phe Gly Val Ser Gly Gly Pro Pro Phe
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Gln Ala Asn Leu Cys Arg Phe Leu Glu Thr Arg
50 55 60
Thr Val Leu Ser Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Ile Ala
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ser Ser Ile Val Cys Pro Gly Lys Glu Gly Asn Gly Glu
85 90 95
Ile Ser Pro Thr Ile Ala Pro Ser Ser Val Lys Ala Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ile Val Ser Ser Arg Ser Lys Ile Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Val
115 120 125
Met Phe Phe Ser Met Ile Ala Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Met Ser Val Met Tyr Arg Glu Ala Gly Val Glu Thr Met
165 170 175
Val Ile Leu Ser Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Arg Ile Phe Ser Thr
180 185 190
Ile Cys Phe Pro Thr Trp Val Ala Ala Leu Met Ser Arg Pro Arg Val
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asp Leu
210 215
<210> 15
<211> 216
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 15
Met Leu Phe Val Gln Ser Tyr Phe Gln Leu Phe Leu Ile Cys Val Ser
1 5 10 15
Pro Leu Gln Leu Ala Ile Leu Ser Leu Gln Thr Ser Asp Leu Ala Val
20 25 30
Leu Ala Ile Ser Arg Phe Cys Phe Gly Val Ser Gly Gly Pro Pro Phe
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Gln Ala Asn Leu Cys Arg Phe Leu Glu Thr Arg
50 55 60
Thr Val Leu Ser Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Ile Ala
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ala Ser Ile Val Cys Pro Gly Lys Glu Gly Asn Gly Glu
85 90 95
Ile Ser Pro Thr Ile Ala Pro Ser Ser Val Lys Ala Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Met Val Ser Ser Arg Pro Lys Ile Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Met
115 120 125
Ile Phe Phe Ser Met Ile Ala Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Ser Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Met Ser Val Met Tyr Arg Glu Ala Gly Val Glu Thr Met
165 170 175
Val Ile Leu Ser Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Arg Ile Phe Ser Ile
180 185 190
Ile Cys Phe Pro Ala Trp Val Ala Ala Leu Val Ser Arg Pro Arg Val
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Leu Arg Asp Leu
210 215
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 16
Trp Ser Ile Leu Met Gln Arg Gly Pro
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 17
Glu Ala Gly Val Glu Thr Met Val Ile Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 18
Ile Ala Pro Ser Ser Val Lys Ala Leu Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 19
Pro Met Arg Thr Pro Ile Ala Phe Leu
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 20
Ile Ser Met Asn Gln Phe Leu Asp Asn Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 21
Leu Met Gln Arg Gly Pro Ser Thr Phe
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 22
Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 23
Lys Ile Thr Leu Lys Phe Ala Phe Asn Met Met
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 24
Leu Val Cys Val Ser Leu Leu Gln Ser Ala Ile Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 25
Ala Phe Asn Met Met Phe Leu Ser Met
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 26
Ala Ile Leu Ser Leu Gln Thr Phe Asp
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 27
Asp Asn Ser Ser Ile Val Ile Ser Val
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 28
Ile Ala Trp Ser Ile Leu Ile Gln
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 29
Ile Val Met Ser Val Met Tyr Arg
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 30
Phe Leu Ile Cys Val Ser Pro Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 31
Gly Gly Leu Pro Phe Ser Leu Leu Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 32
Leu Phe Leu Ile Cys Val Ser Leu Leu
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 33
Ser Pro Leu Gln Leu Ala Ile Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 34
Ile Phe Arg Phe Cys Phe Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 35
Val Ala Ala Ser Met Phe Arg Pro
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 36
Leu Ser Leu Gln Thr Ser Asp Leu Ala
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 37
Ser Ile Arg Val Ser Asn Arg Ser
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 38
Phe Ser Val Met Phe Leu Ser Met
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 39
Ser Val Lys Ala Leu Ser Ser Ile
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 40
Ala Leu Met Ser Arg Pro Arg Val
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 41
Glu Gly Asn Gly Glu Ile Ser Pro Thr
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 42
Ala Phe Asn Met Met Phe Phe Ser
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 43
Pro Ala Ile Ser Arg Phe Cys Phe
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 44
Ala Phe Ser Val Met Phe Leu Ser Met
1 5
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 45
Leu Ile Gln Arg Gly Pro Ala Thr Phe Cys Leu
1 5 10
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 46
Leu Ile Gln Arg Gly Pro Ala Thr Phe
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 47
Ala Ile Leu Ser Leu Gln Thr Phe Asp
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 48
Ala Leu Ser Ser Ile Arg Val Ser Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 49
Phe Ser Met Met Leu Leu Ser Met Ile
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 50
Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Thr
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 51
Leu Ile Val Leu Ala Ile Tyr Arg Phe Cys
1 5 10
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 52
Ser Leu Arg Thr Phe Asp Leu Ala
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 53
Met Leu Phe Val Gln Ser Tyr Phe Gln
1 5
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌
<400> 54
Phe Lys Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn
1 5 10 15
Val Ala
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 破伤风梭菌
<400> 55
Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala
1 5 10 15
Gly Gly Cys
<210> 56
<211> 838
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 56
ttaaataagc tgaaacgaga aagttcttat ctcttgctcc acttcaagca atagttgtaa 60
ggcttgcata aatgttattt gctcaaaact attctctgtt atcttcagtc tatgtctcac 120
ttcttcaatc aaccatctta tttcttcaaa cttctgactt aattgttctc gccattttcc 180
gtttctgttt tggagggagt ggaggtctcc cattctcatt actgcttctc caagcgaatc 240
tctgtagagt ttcagagact cgaactgtgt tatcattcca ttcaagtcct ccgatgagga 300
ccccaactgc atttttgaca tcctcatcag tatgtcctgg aagagaaggc aatggtgaaa 360
tttcgccaac aattgctccc tcttcggtga aagcccttag tagtattaga gtctccagcc 420
ggtcgaaaat cacactgaag ttcgctttca gtatgatgtt cttatccatg atcgcctggt 480
ccattctgat acaaagagag cctgccactt tctgcttggg catgagcatg aaccagtccc 540
ttgacatctc ctcaagagtc atgtcagtta ggtagcgcga agcaggtaca gaggcaatgg 600
tcattttaag tgcctcatcg gattcttcct tcagaatccg ctccactatc tgctttccag 660
cacgggtggc tgtctcgatg tccagaccaa gagtgctgcc tcttcctctt agggacttct 720
gatctcggcg aagccgatca aggaatgggg catcacccag ttcttggtct gcaaaccgtt 780
tgcggacatg ccaaagaaag cagtctacct gaaagcttga cacagtgttg gaatccat 838
<210> 57
<211> 848
<212> DNA
<213> 甲型流感病毒
<400> 57
tatcattaaa taagctgaaa tgagaaagtt cttatctcct gttccacttc aaacagcagt 60
tgtaatgctt gcatgaatgt tatttgttca aagctatttt ccgttgtttt tagtctgtgt 120
ctcacttctt caatcagcca tcttatctct tcaaactttt gacctagctg ttctcgccat 180
tttccgtttc tgttttggag taagtggagg tcccccattc tcattactgc ttctccaagc 240
gaatctctgt agatttttag agactcgaac tgtgttatca ttccattcaa gtcctccgat 300
gaggacccca attgcatttt tgacatcctc aatagtatgt cctggaaaag aaggcaatgg 360
tgagatttcg ccaacaattg ctccctcttc ggtgaaagcc cttagtaata ctatggtctc 420
tagtcggtca aaaatcacac tgaaattcgc tttcaatatg atgtttttct ccatgattgc 480
ctggtccatt ctgatgcaaa gaggtccttc cactttctgc ttgggcatta gcatgaacca 540
gtttcttgac aattcctcaa tagtcatgtc agttatgtat cgcgaagcag gtgtggagac 600
catggtcatt ttaagtgcct catcagattc ttctttcaga atcttttcta caatttgctt 660
tccaacatgg gtggctgctt tgatgtctag accgagagta ttgcctcttc cccttaggga 720
cctctgatct cggcgaagcc gatcaaggaa tggggcatca ctcagttctt ggtctacaac 780
ttgtttccgg atatgccaaa gaaagcaatc tacctggaaa cttgacacag tgttggaatc 840
cattatgt 848
<210> 58
<211> 85
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<400> 58
Met Leu Phe Val Arg Asn Tyr Ser Leu Ser Leu Ser Ile Cys Ala Ala
1 5 10 15
Phe Leu Gln Leu Thr Thr Leu Phe Pro Gln Ile Ser Val Pro Ile Ala
20 25 30
Leu Ala Thr Phe His Phe Cys Ser Gly Gly Ser Glu Gly Leu Pro Phe
35 40 45
Ser Ser Gln Phe Leu Gln Ala Asn Leu Cys Ile Phe Ser Glu Thr Arg
50 55 60
Thr Val Leu Pro Phe His Ser Ser Pro Pro Met Arg Thr Pro Thr Ala
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ser Ser
85

Claims (36)

1.一种疫苗组合物，其包含免疫原性肽，所述免疫原性肽包含来自多肽的CD8+ T细胞表位，所述多肽由开放阅读框（ORF）编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其包含两种或更多种免疫原性肽。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其包含两种或更多种免疫原性肽，每种免疫原性肽包含来自多肽的不同的CD8+ T细胞表位，所述多肽由开放阅读框（ORF）编码，所述开放阅读框由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
4.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其包含至少一种与至少两种不同的HLA超型相互作用的免疫原性肽。
5.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述多肽增强ssRNA病毒在人类中的适应性。
6.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其中所述ssRNA病毒是反义ssRNA病毒，并且所述ORF是反义的。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述反义ssRNA病毒是正粘病毒。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述正粘病毒是流感病毒。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述ORF由甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分编码。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述ORF的长度为至少85个密码子。
12.根据权利要求10或11所述的疫苗组合物，其中所述ORF的长度为至少167个密码子。
13.根据权利要求10至12的任一项所述的疫苗组合物，其中所述ORF的长度为至少216个密码子。
14.根据权利要求12或13所述的疫苗组合物，其中所述甲型流感病毒是西班牙流感病毒或重组的西班牙流感病毒。
15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述ORF包含SEQ ID NO. 56的序列或其变体，或者SEQ ID NO: 57的序列或其变体。
16.根据权利要求9至15的任一项所述的疫苗组合物，其中所述CD8+ T细胞表位在人甲型流感病毒之间是保守的。
17.根据权利要求9至16的任一项所述的疫苗组合物，其中所述CD8+ T细胞表位在人甲型流感病毒和猪、马和/或禽甲型流感病毒之间是保守的。
18.根据权利要求9至17的任一项所述的疫苗组合物，其中所述CD8+ T细胞表位存在于猪、马和/或禽甲型流感病毒中的长度为至少85个、至少167个或至少216个密码子的预测的ORF中。
19.根据权利要求17或18所述的疫苗组合物，其中猪甲型流感病毒是H1N1血清型。
20.根据前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物，其包含一种或多种在SEQ ID NO:16至53中列出的肽。
21.根据权利要求1至6的任一项所述的疫苗组合物，其中所述ssRNA病毒是丝状病毒。
22.根据权利要求21所述的疫苗组合物，其中所述丝状病毒是埃博拉病毒或马尔堡病毒。
23.根据权利要求1至5的任一项所述的疫苗组合物，其中所述ssRNA病毒是正义ssRNA病毒，并且所述ORF是反义的。
24.根据权利要求23所述的疫苗组合物，其中所述ssRNA病毒是黄病毒。
25.根据权利要求24所述的疫苗组合物，其中所述黄病毒是登革热病毒或寨卡病毒。
26.一种预防或治疗病毒感染的方法，其包含将前述权利要求的任一项所述的疫苗组合物施用于感染了ssRNA病毒或有风险感染ssRNA病毒的个体。
27.权利要求1至25的任一项所述的疫苗组合物，其用于预防或治疗个体中的病毒感染的方法。
28.根据权利要求26所述的方法或根据权利要求27所述的特定用途的疫苗组合物，其中所述病毒感染是由人畜共患病毒引起的。
29.根据权利要求26或28所述的方法或根据权利要求27或28所述的特定用途的疫苗组合物，其中所述个体是人。
30.根据权利要求26所述的方法或根据权利要求27所述的特定用途的疫苗组合物，其中所述病毒感染是大流行性病毒感染。
31.一种鉴定免疫原性肽的方法，所述免疫原性肽包含来自ORF的CD8+ T细胞表位，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，所述方法通过以下步骤进行：
（a）鉴定ORF，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；
（b）预测由所述ORF编码的多肽的序列；以及
（c）评估结合MHC I类分子的肽是否包含存在于预测序列中的序列，
从而鉴定包含CD8+ T细胞表位的免疫原性肽。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述ORF包含终止密码子，所述预测序列的预测是基于：所述终止密码子被突变为编码氨基酸的密码子，并且所述肽包含存在于预测序列的一部分中的在突变的密码子的C末端的序列。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其进一步包含：
（d）将从感染了ssRNA病毒或之前感染过ssRNA病毒的个体获得的CD8+ T细胞与肽接触；以及
（e）体外测量对所述肽的免疫反应。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述免疫反应通过确定干扰素γ（IFNγ）的产生在体外测量。
35.一种免疫原性肽，其包含来自多肽的CD4+ T细胞表位或B细胞表位，所述多肽由ORF编码，所述ORF由ssRNA病毒的基因组的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码。
36.一种确定甲型流感病毒的大流行潜力的方法，所述方法包括以下步骤：
（i）鉴定第一ORF，所述第一ORF由甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码；
（ii）确定所述第一ORF中包含的密码子的数量；以及
（iii）将所述第一ORF中包含的密码子的数量与第二ORF中包含的密码子的数量进行比较，所述第二ORF由已知的大流行甲型流感病毒的基因组的节段8的至少一部分按照与能够翻译的正义RNA相反的方向编码，
其中所述第一ORF与所述第二ORF的密码子数量差异表示大流行潜力。
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