CN112741821A - 一种唾液酸纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种唾液酸纳米颗粒及其制备方法和应用，该唾液酸纳米颗粒采用聚苯乙烯马来酸酐共聚物为骨架，利用氨基化唾液酸与高分子上的酸酐基团发生反应，共价连接唾液酸到高分子骨架上，所得改造后的高分子物质在水溶液中超声处理，得到唾液酸纳米颗粒。该唾液酸纳米颗粒制得的鼻腔喷雾对黏膜组织的黏附作用能使唾液酸不易被鼻腔纤毛清除，延长唾液酸在鼻腔内的滞留时间，阻断流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等以细胞表面唾液酸为受体的病毒入侵，为呼吸道提供持久保护，降低病毒感染风险，并且其制备的鼻腔喷雾制剂安全无毒副作用，无异味，不改变正常的鼻黏液粘度。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种唾液酸纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
唾液酸(SA)是广泛存在于生物系统中的天然糖类化合物，它是以九碳糖神经氨酸为基本结构的一族衍生物的总称，共有50余种，广泛存在于生物体内细胞膜糖蛋白和脂蛋白中，并在生命体许多重要过程中发挥着重要的作用，参与细胞识别、生存、繁衍、生物膜流动、细胞内吞作用。
流感等呼吸道病毒主要是通过空气传播，经口鼻入侵人体，利用细胞表面唾液酸作为配体进行粘附和感染，因此阻断病毒与细胞表面唾液酸配体的结合可阻断病毒入侵，降低病毒感染。基于唾液酸糖缀合物的药物或游离唾液酸可以通过竞争性结合病毒血凝素(HA)来有效防止病毒与细胞表面的粘附，预防流感，因此，以唾液酸为主要成分的鼻腔喷雾有望成为流感预防的新选择。
然而，唾液酸鼻腔喷雾的应用存在剂量受限，唾液酸存在着易被黏液以及鼻粘膜纤毛清除等弊端。中国专利申请CN 11544379 A的唾液酸鼻腔给药制剂是以“复合物”的形式将唾液酸与磷脂结合起来，一方面利用磷脂降低鼻黏液粘度，进而减少鼻粘液对唾液酸的清除；另一方面利用磷脂的双亲性，使其疏水端与脂溶性的鼻粘膜连接，亲水端与药物中的游离唾液酸连接，从而使唾液酸紧密附着在鼻粘膜细胞表面，延长唾液酸在鼻粘膜上的停留时间，但该方法制备的唾液酸鼻腔给药制剂会改变正常的鼻黏液粘度、且气味不友好，患者依存性差。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种唾液酸纳米颗粒及其制备方法和应用。该唾液酸纳米颗对黏膜组织的黏附作用能使唾液酸不易被鼻腔纤毛清除，延长唾液酸在鼻腔内的滞留时间，提高药物的生物利用度，并且其制备的鼻腔喷雾制剂安全无毒副作用，无异味，不改变正常的鼻黏液粘度。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种唾液酸纳米颗粒，其结构式如下所示：
根据本发明实施例的唾液酸纳米颗粒，其平均粒径为95nm，经过试验，该唾液酸纳米颗对黏膜组织的黏附作用能使唾液酸不易被鼻腔纤毛清除，延长唾液酸在鼻腔内的滞留时间，从而提高药物的生物利用度；同时该唾液酸纳米颗粒鼻腔喷雾制剂安全无毒副作用，无异味，其渗透压与鼻分泌液大致相等，使其不改变正常的鼻黏液粘度。
在本发明的第二方面，本发明提出了上述唾液酸纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
(1)氨基化唾液酸与聚苯乙烯马来酸酐共聚物的酸酐基团反应，得到唾液酸高分子化合物；
(2)唾液酸高分子化合物在水溶液中超声处理1h，得到所述唾液酸纳米颗粒。
根据本发明实施例的唾液酸纳米颗粒的制备方法，其采用高分子聚苯乙烯马来酸酐共聚物为骨架，利用氨基化唾液酸与高分子骨架上的酸酐基团发生反应，共价连接唾液酸到高分子骨架上，所得改造后的高分子物质在水溶液中超声处理可通过官能团的亲疏水作用自组装成高分子纳米颗粒，即唾液酸纳米颗粒。
另外，根据本发明上述实施例提出的唾液酸纳米颗粒的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，所述唾液酸为N-乙酰神经氨酸。
可选地，所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物的分子量为2000-20000。
可选地，所述氨基化唾液酸与所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物的质量比为1-2:0.4-1。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种鼻腔喷雾制剂，其包括上述的唾液酸纳米颗粒、肝素、海洋硫酸多糖和生理盐水。
可选地，所述唾液酸纳米颗粒的浓度为1-10mg/mL，所述肝素的浓度为0.05-0.2mg/mL，所述海洋硫酸多糖的浓度为0.1-0.5mg/mL。
可选地，所述海洋硫酸多糖为岩藻依聚糖或卡拉胶。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例1制备的唾液酸纳米颗粒的粒径分布图；
图2为根据本发明实施例2制备的唾液酸纳米颗粒的粒径分布图；
图3为根据本发明实施例3制备的唾液酸纳米颗粒的粒径分布图；
图4为根据本发明实施例制备的唾液酸纳米颗粒鼻腔喷雾制剂在大鼠鼻腔内滞留时间测定结果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
根据本发明实施例的唾液酸纳米颗粒，其制备包括：
1、取500-1000mg的平均分子量为2000-20000的聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PMSA，购买于sigma公司)溶解在10mL DMF中，然后加入200-500mg的氨基化唾液酸(SA，x＝0-4)，并加入0.5-1mL的三乙胺到上述反应液中，于室温下搅拌反应约12小时，再加入5-10mL饱和NaHCO3水溶液，于室温下搅拌0.5-1小时后即可收集反应液；收集反应液时用截留分子量为2000-20000的透析袋进行透析24小时，透析液为超纯水，中间换液4-5次。最后把透析袋中的溶液经冷冻干燥处理得到的固体物质即为唾液酸高分子化合物。
2、取10mg上述的唾液酸高分子化合物溶于10ml超纯水中，超声(40KHz，25℃)1h后得到1mg/ml的唾液酸纳米颗粒。
反应过程为：
其中，氨基化唾液酸的制备过程为：
以x＝2为例，氨基化唾液酸的合成步骤如下：
取乙酰化唾液酸(1)5g溶解在50mL无水二氯甲烷中，然后在零度条件下分别加入BF3.OEt2(6当量)、反应物2(2当量)，最后反应液在室温中搅拌过夜。然后浓缩反应液并纯化得到产物(2)2.5g。将产物(2)溶解在30mL DMF中，然后加入叠氮化钠(4当量)，反应于80摄氏度下搅拌8-10小时，反应液用乙酸乙酯和水萃取，收集乙酸乙酯相浓缩、纯化得到产品(3)2g。然后把产品(3)用20mL四氢呋喃溶解，并加入10mL水和氢氧化钠(3当量)，室温反应3小时，然后用2M盐酸调节反应液pH为6-7，浓缩反应液经纯化得到产物(4)1g。再用20mL甲醇溶解(4)，并加入三苯基膦(6当量)室温下反应12小时，然后用乙酸乙酯和水萃取反应液，收集水相浓缩得到产物(5)0.8g。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1唾液酸纳米颗粒的制备
取750mg的分子量为10000的聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PMSA)溶解在10mL DMF中，然后加入350mg的氨基化唾液酸(SA，x＝2)，并加入0.8mL的三乙胺到上述反应液中，于室温下搅拌反应12小时，再加入8mL饱和NaHCO3水溶液，于室温下搅拌1小时后即可收集反应液；收集反应液时用截留分子量为10000的透析袋进行透析24小时，透析液为超纯水，中间换液4-5次。最后把透析袋中的溶液经冷冻干燥处理得到的固体物质即为唾液酸高分子化合物。
取10mg上述的唾液酸高分子化合物溶于10ml超纯水中，超声(40KHz，25℃)1h后得到1mg/ml的唾液酸纳米颗粒。
利用动态光散射测定材料的粒径分布，结果如图1所示，结果显示所得唾液酸纳米颗粒的平均粒径为95nm。
实施例2唾液酸纳米颗粒的制备
取1000mg的分子量为5000的聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PMSA)溶解在10mL DMF中，然后加入500mg的氨基化唾液酸(SA，x＝4)，并加入0.5mL的三乙胺到上述反应液中，于室温下搅拌反应12小时，再加入10mL饱和NaHCO3水溶液，于室温下搅拌1小时后即可收集反应液；收集反应液时用截留分子量为5000的透析袋进行透析24小时，透析液为超纯水，中间换液4-5次。最后把透析袋中的溶液经冷冻干燥处理得到的固体物质即为唾液酸高分子化合物。
取10mg上述的唾液酸高分子化合物溶于10ml超纯水中，超声(40KHz，25℃)1h后得到1mg/ml的唾液酸纳米颗粒。
利用动态光散射测定材料的粒径分布，结果如图2所示，结果显示所得唾液酸纳米颗粒的平均粒径为98nm。
实施例3唾液酸纳米颗粒的制备
取500mg的分子量为20000的聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PMSA)溶解在10mL DMF中，然后加入200mg的氨基化唾液酸(SA，x＝4)，并加入1mL的三乙胺到上述反应液中，于室温下搅拌反应12小时，再加入10mL饱和NaHCO3水溶液，于室温下搅拌1小时后即可收集反应液；收集反应液时用截留分子量为20000的透析袋进行透析24小时，透析液为超纯水，中间换液4-5次。最后把透析袋中的溶液经冷冻干燥处理得到的固体物质即为唾液酸高分子化合物。
取10mg上述的唾液酸高分子化合物溶于10ml超纯水中，超声(40KHz，25℃)1h后得到1mg/ml的唾液酸纳米颗粒。
利用动态光散射测定材料的粒径分布，结果如图3所示，结果显示所得唾液酸纳米颗粒的平均粒径为102nm。
实施例4鼻腔喷雾制剂的制备
将上述实施例1制得的唾液酸纳米颗粒2mg/mL、肝素0.08mg/mL、岩藻依聚糖0.15mg/mL溶于250mL的生理盐水，调节pH至6.5-7.0，即制得预防病毒性呼吸道感染的鼻腔喷雾制剂。
实施例5鼻腔喷雾制剂的制备
将上述实施例2制得的唾液酸纳米颗粒2mg/mL、肝素0.08mg/mL、卡拉胶0.15mg/mL溶于250mL的生理盐水，调节pH至6.5-7.0，即制得预防病毒性呼吸道感染的鼻腔喷雾制剂。
实施例6鼻腔喷雾制剂的制备
将上述实施例3制得的唾液酸纳米颗粒2mg/mL、肝素0.08mg/mL、岩藻依聚糖0.15mg/mL溶于250mL的生理盐水，调节pH至6.5-7.0，即制得预防病毒性呼吸道感染的鼻腔喷雾制剂。
对比例1
将唾液酸2mg/mL、肝素0.08mg/mL、岩藻依聚糖0.15mg/mL溶于250mL的生理盐水，调节pH至6.5-7.0，即制得鼻腔喷雾制剂。
试验例1小鼠攻毒保护实验
取12g的雌性昆明小鼠140只，随机分为7组，20只/组，5组实验组，2组对照组。实验组1小鼠每天鼻腔滴入实施例4制得的鼻腔喷雾制剂50μL，连续给药1周。实验组4小鼠每天鼻腔滴入实施例2制得的鼻腔喷雾制剂50μL，连续给药2周。实验组3小鼠每天鼻腔滴入实施例5制得的鼻腔喷雾制剂50μL，连续给药1周。实验组4小鼠每天鼻腔滴入实施例6制得的鼻腔喷雾制剂50μL，连续给药1周。实验组5小鼠每天鼻腔滴入对比例1制得的鼻腔喷雾制剂50μL，连续给药1周。实验组1-5随后从鼻腔滴入50μL LD50剂量的A/PR/8/34病毒攻击，攻毒后再用50μL对应实验组的鼻腔喷雾制剂连续鼻腔给药3天。对照组1是小鼠每天鼻腔滴入生理盐水50μL，连续给药1周。对照组2是小鼠每天鼻腔滴入生理盐水50μL，连续给药2周。
结果如表1所示，采用本申请制备的预防病毒性呼吸道感染的粒鼻腔喷雾制剂对流感病毒感染具有良好的预防和治疗作用。
表1小鼠存活率
| 分组 | 存活率 |
| 实验组1 | 85％ |
| 对照组1 | 55％ |
| 实验组2 | 90％ |
| 对照组2 | 45％ |
| 实验组3 | 90％ |
| 实验组4 | 80％ |
| 实验组5 | 90％ |
试验例2唾液酸含量的测定
将实施例4-6和对比例1中唾液酸用荧光染料Cy5.5标记，取24只SD大鼠，麻醉后，随机分为4组，6只/组。实验组1大鼠鼻腔滴入对比例1制得的鼻腔喷雾制剂100μL，实验组2大鼠鼻腔滴入实施例4制得的鼻腔喷雾制剂100μL，实验组3大鼠鼻腔滴入实施例5制得的鼻腔喷雾制剂100μL，实验组4大鼠鼻腔滴入实施例6制得的鼻腔喷雾制剂100μL。
鼻腔给药后立即用小动物活体成像系统检测SD大鼠鼻腔荧光强度，之后每20min检测一次，直至无荧光检测；
结果如图4所示，游离唾液酸制备的鼻腔喷雾制剂在大鼠鼻腔内滞留时间较短，施用20分钟后仅残留10％左右，40分钟内被全部清除；本申请制备的唾液酸纳米颗粒鼻腔喷雾制剂在大鼠鼻腔内滞留时间较游离唾液酸明显延长，施用后约2h才被完全清除，实验组2、3、4组在大鼠鼻腔内的滞留时间大致相同。
综上，根据本发明实施例的唾液酸纳米颗粒，其对黏膜组织的黏附作用能使唾液酸不易被鼻腔纤毛清除，延长唾液酸在鼻腔内的滞留时间，从而提高药物的生物利用度；同时该唾液酸纳米颗粒鼻腔喷雾制剂安全无毒副作用，无异味，其渗透压与鼻分泌液大致相等，使其不改变正常的鼻黏液粘度。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种唾液酸纳米颗粒，其特征在于，其结构式如下所示：
2.一种如权利要求1所述唾液酸纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)氨基化唾液酸与聚苯乙烯马来酸酐共聚物的酸酐基团反应，得到唾液酸高分子化合物；
(2)唾液酸高分子化合物在水溶液中超声处理1h，得到所述唾液酸纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述唾液酸为N-乙酰神经氨酸。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物的分子量为2000-20000。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨基化唾液酸与所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物的质量比为1-2:0.4-1。
6.一种鼻腔喷雾制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的唾液酸纳米颗粒、肝素、海洋硫酸多糖和生理盐水。
7.如权利要求6所述的鼻腔喷雾制剂，其特征在于，所述唾液酸纳米颗粒的浓度为1-10mg/mL，所述肝素的浓度为0.05-0.2mg/mL，所述海洋硫酸多糖的浓度为0.1-0.5mg/mL。
8.如权利要求6所述的鼻腔喷雾制剂，其特征在于，所述海洋硫酸多糖为岩藻依聚糖或卡拉胶。
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