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CN112813030A - 一种靶向fgfr4和dr5的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向fgfr4和dr5的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN112813030A
CN112813030A CN201911120424.0A CN201911120424A CN112813030A CN 112813030 A CN112813030 A CN 112813030A CN 201911120424 A CN201911120424 A CN 201911120424A CN 112813030 A CN112813030 A CN 112813030A
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fgfr4
amino acid
acid sequence
gly
car
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CN201911120424.0A
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许晨光
张宏玲
温丽联
黎琴子
刘婉
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Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
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Publication date
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Priority to PCT/CN2020/081368 priority patent/WO2021093251A1/zh
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Abstract

本发明提供了靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR‑FGFR4和靶向DR5的嵌合抗原受体CAR‑DR5，CAR‑FGFR4包括氨基端到羧基端顺次连接的靶向FGFR4单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区，CAR‑DR5包括氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区；靶向FGFR4的单链抗体包括以下中的至少一种：(a)如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL；(b)如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL。

Description

一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是全世界范围内第二大癌症死亡原因，己经严重威胁到了人们的健康和生活。临床中常见的肝癌治疗方法主要有手术切除、肝移植、化学药物治疗和放射治疗等。然而，由于肝癌早期病症不明显因而不易被检测，大部分病人确诊时己处于中晚期，失去手术治疗和肝移植的机会。实际治疗中约有90％的肝癌患者需要接受药物治疗。现有常用的抗肿瘤药物虽然可以有效延长患者生存期，但在临床应用中普遍存在选择性低、毒副作用大等问题。即便是靶向药物也存在长期使用后容易诱发肿瘤耐药性的问题。例如2007年批准的多激酶抑制剂索拉菲尼，但仅仅将总生存期提高3个月。由此可见，临床上为肝癌寻找安全有效的疗法依然是个难题。
死亡受体5(DR5)又名肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2(TRAIL-R2)，在多种肿瘤组织高表达，尤其是肺癌、乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、宫颈癌等，而在大多数正常细胞几乎不表达，成为理想的靶点。成纤维细胞生长因子受体家族有四个成员，FGFR1-4，其激酶域同源性高达74-92％。通过分析FGFR家族的结构发现在552号氨基酸上FGFR4与其他成员不同，FGFR4上是半胱氨酸，而其他成员在该位点是酪氨酸。可以尝试利用这半胱氨酸的特性来设计抑制剂，达到高选择性的靶向FGFR4。FGFR4在多种肿瘤中存在过表达，例如肝癌、乳腺癌、胃癌等。目前在制药产业领域，FGFR4的抑制剂H3B-6527已获得美国FDA授予的孤儿药资格。FGFR4选择性抑制剂基本都是基于Cys552的共价可逆或不可逆抑制剂，一旦这个位点突变很可能导致耐药情况的产生。
免疫细胞治疗是现有技术中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到清除恶性肿瘤细胞的目的而受到广泛的关注和研究。目前还未有同时靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备和研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4和靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，CAR-FGFR4专一性的靶向FGFR4，CAR-DR5专一性的靶向DR5，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持嵌合抗原受体T细胞的活力和杀伤力，并且对正常细胞不会造成损伤。本发明还提供了靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，包括靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4和靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-FGFR4的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FGFR4的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；
其中，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括以下中的至少一种：
(a)如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列。
在本发明中，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列，或所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列，或所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；和如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列。
在本发明中，如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL顺次连接形成具有靶向FGFR4的单链抗体，如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL顺次连接形成具有靶向FGFR4的单链抗体。
可选的，所述如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列和所述如SEQID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列通过第一连接肽连接。
可选的，所述如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列和所述如SEQID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列通过第二连接肽连接。
在本发明中，所述第一连接肽和所述第二连接肽用于连接单链抗体重链VH的氨基酸序列和单链抗体轻链VL的氨基酸序列，使所连接的单链抗体重链和轻链保持各自的空间构象，以维持整体单链抗体的功能和活性。在本发明中，所述第一连接肽和所述第二连接肽可以但不限于为以甘氨酸和丝氨酸为主构成的多肽序列，其中，甘氨酸的分子量最小，是侧链最短的氨基酸，可以增加侧链的柔韧性；丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可以增加肽链的亲水性。可选的，所述第一连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，所述第二连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明中，单链抗体重链VH、单链抗体轻链VL和连接肽linker的氨基酸序列从氨基酸端到羧基端的连接顺序为VH-linker-VL和/或VL-linker-VH。
也就是说，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括以下情况中的至少一种：
(i)从氨基酸端到羧基端依次包括：所述如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列、所述第一连接肽的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(ii)从氨基酸端到羧基端依次包括：所述如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列、所述第一连接肽的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列；
(iii)从氨基酸端到羧基端依次包括：所述如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列、所述第二连接肽的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(iiii)从氨基酸端到羧基端依次包括：所述如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列、所述第二连接肽的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列。
在本发明中，单链抗体轻链VL和单链抗体重链VH的先后位置关系不影响单链抗体的靶向性和活性。
可选的，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6-7所示的任一氨基酸序列。
在本发明中，所述靶向FGFR4的单链抗体的编码基因包括所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选的，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
在本发明中，所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
在本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向FGFR4的单链抗体与肿瘤上的FGFR4结合。
可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区。
在本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4。
可选的，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选的，所述跨膜区包括CD8跨膜区。
在本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。可选的，所述胞内信号区包括4-1BB信号区和CD3ζ信号区。
在本发明中，所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5中的铰链区、跨膜区和信号区可以相同，也可以不同，根据实际需要进行选择。
可选的，所述CAR-FGFR4的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FGFR4的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-FGFR4的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8-9所示的任一氨基酸序列。
在本发明中，靶向FGFR4的单链抗体中单链抗体重链VH和单链抗体轻链VL的连接顺序不影响CAR-FGFR4靶向性和活性，制得的CAR-FGFR4均具有靶向FGFR4的作用。
在本发明中，所述靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的编码基因包括所述靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
在本发明中，所述CAR-DR5的编码基因包括所述靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
在本发明中，所述靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞可以为带CAR-FGFR4和CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞(即，靶向FGFR4和DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞)，也可以为带CAR-FGFR4的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞的混合或为带CAR-FGFR4和CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞与带CAR-FGFR4的嵌合抗原受体T细胞和带CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种的混合。此时，嵌合抗原受体T细胞既可以识别表面表达有FGFR4抗原蛋白的肿瘤细胞，也可以识别表面表达有DR5抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有FGFR4抗原蛋白和DR5抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，能够有效避免肿瘤细胞出现免疫逃逸现象。
其中，当所述靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞为带CAR-FGFR4和CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，CAR-FGFR4和CAR-DR5的位置分布不作限定。可选的，所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5交替分布。所述CAR-FGFR4的单链抗体和所述CAR-DR5的单链抗体之间没有化学键相连，以确保更好的识别能力。
本发明第一方面提供的靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞可以专一性地靶向表达FGFR4的肿瘤细胞，在CAR-FGFR4与FGFR4结合后，T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤。
第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞中所述CAR-FGFR4和CAR-DR5的编码基因。
在本发明中，可以在同一重组载体含有所述CAR-FGFR4和CAR-DR5的编码基因，也可以在不同载体中分别含所述CAR-FGFR4和CAR-DR5的编码基因。
在本发明中，所述载体可以但不限于为基因传递载体。
可选的，所述载体为病毒载体和非病毒载体中的至少一种。
进一步的，所述非病毒载体包括质粒载体和噬菌体载体。具体的，所述质粒载体可以但不限于为真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等。当所述载体为微环DNA时，可以将插入靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的编码基因的重组微环DNA直接转染CD3阳性T淋巴细胞，制得靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞。
进一步的，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。更进一步的，所述病毒载体为慢病毒载体。
本发明第二方面提供的重组载体安全高效，可以稳定地实现将CAR-FGFR4和CAR-DR5的编码基因导入宿主细胞中或复制，并可以用于嵌合抗原受体T细胞的制备。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第二方面所述的重组载体。
可选的，当所述重组载体为重组病毒载体时，所述宿主细胞可以用于组装所述重组病毒载体，使其具有感染性。进一步的，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞或COS7细胞等，但不限于此。更进一步的，所述宿主细胞为HEK293T细胞。
可选的，当所述重组质粒为重组真核质粒载体、重组原核质粒载体和重组微环DNA时，所述宿主细胞为相应的真核宿主细胞或原核宿主细胞。
本发明第三方面提供的宿主细胞可以稳定保存具有靶向FGFR4和DR5的CAR-FGFR4和CAR-DR5的编码基因，有利于靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备。
第四方面，本发明提供了一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)提供靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的第一信号肽的编码基因、靶向FGFR4的单链抗体的编码基因、第一胞外铰链区的编码基因、第一跨膜区的编码基因、第一胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括以下中的至少一种：
(a)如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(2)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的第二信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、第二胞外铰链区的编码基因、第二跨膜区的编码基因、第二胞内信号区的编码基因；
(3)将所述CAR-FGFR4的编码基因到插入到第一基因传递载体中，得到第一重组基因传递载体，将所述CAR-DR5的编码基因到插入到第二基因传递载体中，得到第二重组基因传递载体；
(4)对所述第一重组基因传递载体和所述第二重组基因传递载体进行包装，得到带CAR-FGFR4编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-DR5编码基因的第二重组慢病毒；
(5)将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞。
上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与单链抗体的编码基因的5’端相连，所述单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区的编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
在本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-FGFR4表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。
可选的，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列如本发明第二方面部分所述，这里不再赘述。
可选的，所述CAR-FGFR4的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向FGFR4的单链抗体的编码基因、CD8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
可选的，所述CAR-FGFR4的编码基因包括如SEQ ID NO：8-9所示的任一氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、CD8α铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因、4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
可选的，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
在本发明中，第一基因传递载体和第二基因传递载体可以相同，也可以不同，根据实际需要进行选择，所述CAR-FGFR4的编码基因和所述CAR-DR5的编码基因可以插入不同基因传递载体中，也可以插入相同基因传递载体，当插入相同基因传递载体时，对所述CAR-FGFR4的编码基因和所述CAR-DR5的编码基因的连接顺序不做限定。
在本发明中，所述CAR-FGFR4的编码基因插入到pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pCDH-EF1-MCS载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-FGFR4的编码基因插入到pCDH-EF1-MCS载体时，所述CAR-FGFR4的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pCDH-EF1-MCS载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
在本发明中，所述CAR-DR5的编码基因插入到pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pCDH-EF1-MCS载体的EF1α之后，以EF1α为启动子。所述CAR-DR5的编码基因插入到pCDH-EF1-MCS载体时，所述CAR-DR5的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pCDH-EF1-MCS载体中EcoRⅠ酶切位点相连。
在本发明中，对所述第一重组基因传递载体和所述第二重组基因传递载体进行包装时，可以分别进行包装，也可以同时进行包装。
可选的，对所述第一重组基因传递载体和所述第二重组基因传递载体进行包装，得到带CAR-FGFR4编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-DR5编码基因的第二重组慢病毒，包括：
将所述第一重组基因传递载体与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述第一重组慢病毒；以及将所述第二重组基因传递载体与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述第二重组慢病毒。
可选的，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，如逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，如单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，如B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。
重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。
重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。
为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。
可选的，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒的滴度比为1：(0.5-2)。
可选的，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。进一步的，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步的，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
具体的，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：向外周血单个核细胞中按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
可选的，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：
先将所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第二重组慢病毒进行转染；或先将所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再将所述第一重组慢病毒进行转染；或将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞。
可选的，所述靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞包括带所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者包括带所述CAR-FGFR4的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者包括带所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞与带所述CAR-FGFR4的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-DR5的嵌合抗原受体T细胞中的至少一种的混合。
当所述靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞为带所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5的双靶点嵌合抗原受体T细胞时，此时靶向性T淋巴细胞的表面具有两个独立的、未键合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肿瘤细胞上的FGFR4和DR5，对表达FGFR4和DR5中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，避免出现肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的或如第四方面所述的制备方法制得的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的重组载体或如第三方面所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
在应用中，给药方式可以但不限于为静脉注射、肿瘤原位注射、皮下注射等。具体应用时选择的剂量、次数等根据实际需要进行选择，对此不做限定。
所述应用具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞、第二方面所述的重组载体或第三方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
在本发明中，所述恶性肿瘤包括表达FGFR4和/或DR5的肿瘤，进一步的包括高表达FGFR4和/或DR5的肿瘤。可选的，所述恶性肿瘤包括肝癌、脑胶质瘤、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中的至少一种。本发明的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞可以高效识别并杀伤表达有FGFR4和/或DR5的癌细胞，尤其适用于肝癌细胞。
本发明的有益效果：
本发明提供了靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，专一性的靶向FGFR4和DR5，激活T细胞内的信号区，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，对表达FGFR4和DR5中一种或两种的肿瘤细胞均可以进行识别和杀伤，有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，提高了靶向识别的广度和宽度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力，能够自我复制繁殖，半衰期长，并形成记忆细胞，起到持续的靶向作用并且对正常细胞不会造成损伤。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pCDH-EF1-FGFR4-CAR重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的pCDH-EF1-DR5-CAR重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一
一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：
(1)制备靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的基因序列
提供SEQ ID NO：8-9所示的任一氨基酸序列对应的核苷酸序列(CAR-FGFR4的基因序列)，在其5’端添加如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列(信号肽的基因序列)。
(2)制备靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的基因序列
提供SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列(CAR-FGFR4的基因序列)，在其5’端添加如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列(信号肽的基因序列)。
(3)构建pCDH-EF1-FGFR4-CAR重组质粒和pCDH-EF1-DR5-CAR重组质粒
将步骤(1)的核苷酸序列插入到pCDH-EF1-MCS载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pCDH-EF1-MCS载体EF1α之后，以EF1α为启动子。上述核苷酸序列插入到pCDH-EF1-MCS载体时，在上述核苷酸序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pCDH-EF1-MCS载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pCDH-EF1-FGFR4-CAR重组质粒，如图1所示为pCDH-EF1-FGFR4-CAR重组质粒。
将步骤(2)的核苷酸序列插入到pCDH-EF1-MCS载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pCDH-EF1-MCS载体EF1α之后，以EF1α为启动子。上述核苷酸序列插入到pCDH-EF1-MCS载体时，在上述核苷酸序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pCDH-EF1-MCS载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pCDH-EF1-MCS载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pCDH-EF1-DR5-CAR重组质粒，如图2所示为pCDH-EF1-DR5-CAR重组质粒。
(4)重组慢病毒构建
将pCDH-EF1-FGFR4-CAR重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-FGFR4的第一重组慢病毒。
将pCDH-EF1-DR5-CAR重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-DR5的第二重组慢病毒。
(5)靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的带CAR-FGFR4的第一重组慢病毒和带CAR-DR5的第二重组慢病毒进行共同培养，带CAR-FGFR4的第一重组慢病毒和带CAR-DR5的第二重组慢病毒的滴度比为1:1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，制得靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
效果实施例
为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，进行如下效果实施例。
将经过本发明方法制得的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞(实验组)与靶向FGFR4嵌合抗原受体T细胞(对照组1)、靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞(对照组2)、T淋巴细胞(阴性对照组)的体外肿瘤杀伤效果进行比较，实体瘤细胞系Huh7作为空白对照组，具体的：在体外将效应细胞(靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞/靶向FGFR4嵌合抗原受体T细胞/靶向DR5的嵌合抗原受体T细胞/T淋巴细胞)与靶细胞(实体瘤细胞系Huh7)数量比为10:1、5:1、2.5:1、1.25:1和0.625:1比例，在37℃，5％CO2的细胞板中共培养，观察细胞贴壁情况，并评估其杀伤能力，结果表明，与对照组1、对照组2、阴性对照组相比，经过本发明所述的方法制备的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞具有优异的肿瘤杀伤力，且杀伤能力远远高于对照组1、对照组2以及阴性对照组，因此经本发明方法制备的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中具有非常可观的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Glu Lys Thr Ser Gly Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Glu
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His Phe Ser Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Glu Val Met Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ile Val Thr Val
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
<210> 5
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys
145 150 155 160
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu
180 185 190
Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 6
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Glu Lys Thr Ser Gly Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Glu Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly
165 170 175
Arg Ser Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu
195 200 205
Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
His Phe Ser Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile
<210> 7
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Glu Val Met Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ile Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val
130 135 140
Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
145 150 155 160
Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile
<210> 8
<211> 464
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Glu Lys Thr Ser Gly Tyr Val Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Glu Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Glu Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly
165 170 175
Arg Ser Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu
195 200 205
Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
His Phe Ser Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
245 250 255
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
260 265 270
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
275 280 285
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
290 295 300
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
305 310 315 320
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
325 330 335
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
340 345 350
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
355 360 365
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
370 375 380
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
385 390 395 400
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
405 410 415
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
420 425 430
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
435 440 445
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
<210> 9
<211> 465
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Glu Val Met Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys
85 90 95
Val Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ile Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val
130 135 140
Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
145 150 155 160
Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 10
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Cys
145 150 155 160
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
165 170 175
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Arg Ile Asn Tyr Met Pro Ser Leu
180 185 190
Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
305 310 315 320
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
325 330 335
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
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465
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20

Claims (10)

1.一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4和靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5，所述CAR-FGFR4的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向FGFR4的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向DR5的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；
其中，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括以下中的至少一种：
(a)如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述如SEQID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列通过第一连接肽连接，所述如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列和所述如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列通过第二连接肽连接。
3.如权利要求1所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述靶向DR5的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6-7所示的任一氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CAR-FGFR4的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8-9所示的任一氨基酸序列，所述CAR-DR5的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞中所述CAR-FGFR4和所述CAR-DR5的编码基因。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求6所述的重组载体。
8.一种靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的第一信号肽的编码基因、靶向FGFR4的单链抗体的编码基因、第一胞外铰链区的编码基因、第一跨膜区的编码基因、第一胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向FGFR4的单链抗体的氨基酸序列包括以下中的至少一种：
(a)如SEQ ID NO：1所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：2所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO：3所示的单链抗体重链VH的氨基酸序列以及如SEQ ID NO：4所示的单链抗体轻链VL的氨基酸序列；
(2)提供靶向DR5的嵌合抗原受体CAR-DR5的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的第二信号肽的编码基因、靶向DR5的单链抗体的编码基因、第二胞外铰链区的编码基因、第二跨膜区的编码基因、第二胞内信号区的编码基因；
(3)将所述CAR-FGFR4的编码基因到插入到第一基因传递载体中，得到第一重组基因传递载体，将所述CAR-DR5的编码基因到插入到第二基因传递载体中，得到第二重组基因传递载体；
(4)对所述第一重组基因传递载体和所述第二重组基因传递载体进行包装，得到带CAR-FGFR4编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-DR5编码基因的第二重组慢病毒；
(5)将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒按顺序地或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞。
9.如权利要求8所述的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-FGFR4的编码基因包括如SEQ ID NO：8-9所示的任一氨基酸序列对应的核苷酸序列，所述CAR-DR5的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
10.如权利要求1-5任一项所述或如权利要求8-9任一项所述的制备方法制得的靶向FGFR4和DR5的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求6所述的重组载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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