CN112946270A - 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 - Google Patents
用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112946270A CN112946270A CN202110117855.2A CN202110117855A CN112946270A CN 112946270 A CN112946270 A CN 112946270A CN 202110117855 A CN202110117855 A CN 202110117855A CN 112946270 A CN112946270 A CN 112946270A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- marker
- cell
- ptprc
- dapi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 209
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 64
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 101001116302 Homo sapiens Platelet endothelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 101500016899 Arabidopsis thaliana C-terminally encoded peptide 8 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 40
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 38
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 claims description 16
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 6
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 27
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 11
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 8
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 1
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101100381525 Mus musculus Bcl6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000037602 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 101100395211 Trichoderma harzianum his3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011500 cytoreductive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000014488 papillary tumor of the pineal region Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒。本发明包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，标志细胞为DAPI+/PTPRC‑/PECAM1+/CEP8≠2和/或DAPI+/PTPRC‑/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞。本发明能够有效区分良性肿瘤与恶性肿瘤，与传统的基于瘤标的方法相比，本发明的方法诊断价值更高。
Description
技术领域
本发明涉及诊断领域，具体地涉及用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒。
背景技术
生物机体内在各种因子的刺激下使细胞分裂活跃，细胞数量增多，产生各种疾病，称之为异常增生或异常增殖，包括良性的肿瘤和恶化后的癌症或恶性异常增殖。因此异常增殖的早期诊断对于异常增生的尽早及时干预至关重要。例如，卵巢癌(OC)属于一种恶性异常增殖，是第二大最常见的妇科癌症，其死亡人数比其他任何妇科恶性肿瘤都要多。由于缺乏有效的早期诊断方法，超过70％的病例被诊断为晚期。尽管进行了最佳的细胞减灭术和标准的铂类化学疗法，大多数患者仍无法治愈，70％以上的患者会在2-3年内复发。这些因素加在一起，导致5年生存率低于30％。早期诊断的困难和容易转移是死亡的主要原因。探索用于OC诊断和复发监测的生物标志物对于提高OC患者的存活率具有重要意义。
循环肿瘤血管内皮细胞被认为在PECAM1阳性的循环内皮细胞中的具有非整倍体核型的细胞，最新的研究表明，其可能在肿瘤新生血管和转移中起重要作用(LinPP.Aneuploid circulating tumor-derived endothelial cell(CTEC):a novelversatile player in tumor neovascularization and cancer metastasis.Cells2020；9:1539)。另外有研究表明，循环肿瘤血管内皮细胞可以作为潜在的肿瘤标志物，用于抗血管生成药物和某些肿瘤的免疫治疗效果的监测(Zhang L,Zhang X,Liu Y,et al.PD-L1(+)aneuploid circulating tumor endothelial cells exhibit resistance to thecheckpoint blockade immunotherapy in advanced NSCLC patients.Cancer Lett2020；469:355-366)。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于现有技术中的现状，本发明在深入研究后发现通过在从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定特定类型的细胞作为标志细胞可以有效地诊断体内恶性实体肿瘤。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，通过CEP8检测8号染色体是否为异倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述标志细胞的染色体为四倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述试剂包括DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，和可选的抗肿瘤标志分子抗体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述标志细胞为5μm以下。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，包括以下步骤：
(1)向富集液相中加入抗原修复缓冲液和染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；
(2)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；
(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-且染色体为二倍体的细胞，和/或选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-、肿瘤抗原阳性且染色体为异倍体的细胞作为候选细胞。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，进一步包括确认候选细胞大小的步骤。更优选，进一步包括选择5微米以下小细胞且染色体为四倍体的细胞作为标志细胞的步骤。
在某些实施方案中，本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞，其中第一标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPR C-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞，或其亚类，例如其中的四倍体小细胞亚类；第二标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1-且染色体为异倍体的细胞，优选染色体为三倍体和四倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述富集液相通过包括下述步骤的方法得到：
取从受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌，且当每5-7ml外周血中存在1个以上的标志细胞时，将受试者诊断为患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险高，当每5-7ml外周血中存在小于1个标志细胞时，将受试者诊断为未患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险低。
本发明的第二方面，提供一种体内恶性实体肿瘤的预后方法，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
根据本发明第二方面所述的预后方法，优选地，包括在第一样本和第二样本中分别测量标志细胞数量的步骤。其中第一样本对应于在施用药物前的第一时间点采集的受试者的富集液相，第二样本对应于在施用药物后的第二时间点采集的受试者的富集液相。优选地，进一步包括当第二样本中标志细胞的数量小于第一样本中标志细胞的数量时，表明预后效果好。反之，当第二样本中标志细胞的数量大于第一样本中标志细胞的数量时，表明预后不良。
本发明的第三方面，提供一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的试剂盒，其包含用于显示细胞表面或细胞内存在PTPRC和PECAM1的试剂、DAPI试剂和用于显示细胞染色体为异倍体的试剂，可选的进一步包含用于显示肿瘤标志物分子的试剂。
本发明的方法能够有效地诊断恶性实体肿瘤。与传统的基于瘤标的方法相比，本发明的方法诊断价值更高。
附图说明
图1为从卵巢癌外周血鉴定的候选细胞的图像。
图2为候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的差异分布。
图3为候选细胞不同倍体亚类的候选细胞的图像(SE-iFISH)。
图4-5为候选细胞不同倍体亚类在良性和恶性卵巢癌组间的差异分析(图4为散点图；图5为饼图，左侧的图标依次表示单倍体、三倍体、四倍体和五倍体)。
图6为候选细胞不同大小细胞亚类的图像(SE-iFISH)。
图7-8为不同大小细胞亚类的候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的差异分析(图7为散点图；图8为饼图)。
图9-11为不同大小的候选细胞的非整倍性分析(图9、10分别为大、小细胞亚类的候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的倍性分布的散点图；图11为不同倍性的染色体在不同大小的候选细胞中的比例，n表示检测到的细胞数，数据是以平均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图12为候选细胞的ROC曲线。
图13为根据倍性和细胞大小分类的各亚组的ROC曲线。
图14为候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)动态变化的相关性。
图15为候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用在良性和恶性卵巢癌组中的总和。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于数量的百分数。
发明人发现在外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中，通过选择特定的抗原作为指标得到一组候选细胞。经进一步研究后发现直接将这些候选细胞作为指标并不能用于诊断实体肿瘤，但是当进一步进行选择，特别是选择其中的四倍体小细胞时可以有效地将恶性实体肿瘤与良性肿瘤区别开来。另外，本发明的方法更多的利用了直径5微米以下的细胞，这些小直径细胞对于诊断同样具有重要价值。而传统的从外周血分离循环肿瘤血管内皮细胞的方法不可避免地排除了部分小直径细胞。这对于细胞数量本身极少的循环肿瘤血管内皮细胞的检测而言是极为不利的。
本发明的“恶性实体肿瘤”是指体内细胞过度分裂产生的一类疾病的总称，其实例不特别限定，包括但不限于卵巢癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌等。本发明优选妇科癌症，特别是卵巢癌。
本发明的“标志细胞”是指可用作疾病诊断或判断依据或指标的细胞。本发明的标志细胞属于一类特定的循环肿瘤血管内皮细胞，其特别是指源自外周血的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TM S+/CEP8＝2细胞，即DAPI染色阳性，PTPRC为阴性和PECAM1为阳性的细胞或其亚类。在某些实施方案中，将染色体异常，特别是8号染色体为异倍体的细胞作为本发明的标志细胞。在某些实施方案中，本发明的标志细胞不仅存在染色体异倍体，而还需要染色体特别是8号染色体为多倍体，优选4倍体。需要说明的是，本发明的标记细胞大小同样不限定，可以是任意直径大小的细胞，只要其通过被DAPI染色阳性即可。在某些实施方案中，本发明的标志细胞特别地包含5微米直径以下的细胞，且此类直径的细胞占标志细胞总量的30％以上，优选35％以上。
在另外的实施方案中，本发明的标志细胞还可以使用上述标志细胞与另一标志细胞联用以用作疾病诊断或判断依据或指标的细胞，在这种情况下，本发明的本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞。第一标志细胞为前述的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞；第二标志细胞DAPI+/PTPRC-/PECAM1-细胞，且第二标志细胞的染色体为异倍体，优选染色体为三倍体和四倍体。
本发明的“富集液相”是指从外周血中去除占血液大部分的红细胞和白细胞后得到的候选细胞富集的混合液。由于是从外周血中仅去除作为杂质的红细胞和白细胞，而对于目标细胞并无损失。因此本发明的富集液相，也称作差相富集液相。富集液相的制备可通过已知方式进行。下文示例性说明了其制备过程。
本发明中，表示细胞数量或个数的数值一般为自然数，例如1、2、3、4、5等。在数量统计的情况下，例如多次计数或测量并统计平均值时，细胞数量可以用小数表示，例如1.5个，1.8个等。
本发明的第一方面，提供用于诊断机体内细胞异常增殖的方法，有时简称为“本发明的诊断方法”，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤。
本发明中，只要是能够显示标志细胞存在或其状态，则对于试剂不特别限定。试剂可以是一种试剂，也可以是多种试剂的组合。一般而言，本发明的试剂包括能够显示选自PECAM1和PTPRC组成的组的指示剂、DAPI和能够显示细胞染色体是否为异倍体的试剂。优选地，指示剂可包括能够显示颜色的部分和能够特异性与标志细胞内或标志细胞表面的特定成分结合的部分。优选地，两种部分之间通过例如共价健方式结合。能够显示颜色的部分可以是已知的着色剂、颜料、染料或荧光剂等。能够特异性与标志细胞内或标志细胞表面的特定成分结合的部分包括能够与核酸结合的物质，例如DNA探针或核酸的其他互补片段，还包括抗体、受体或配体，或者它们的修饰物或衍生物。
本发明的抗体包括多抗、单抗、嵌合抗体、纳米抗体、人源化抗体或者完全人类抗体。本发明的抗体还可以是单链抗体。本发明中，抗体的修饰物包括化学修饰物以及抗体和其他材料的偶联物。其中，化学修饰物的实例包括但不限于抗体的乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、交联环化、二硫键化、脱甲基化、共价交联、半胱氨酸化、焦谷氨酸化、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解和磷酸化等。其中，偶联物的实例包括但不限于与纳米高分子材料、磁珠等的偶联物。
在某些实施方案中，本发明的试剂包括抗体和与之偶联的可检测基团，例如荧光基团。本发明中，多种试剂的情况下，优选地，每种试剂的可检测基团不同。
在某些实施方案中，本发明的试剂还进一步包括用于显示肿瘤标记物的试剂。此类试剂可使用本领域已知的试剂，例如各种瘤标抗体，其实例包括但不限于针对CA125、HE4、PDL-1、methothelin、Kallikrein、osteopontin、claudin、TP53、c-myc、Bcl2、Bcl6、IgH、HER-2、MUC1、Folate Receptor、E-cadherin、N-cadherin、EpCAM、cytokeratin、vimentin、CD44、CD133、CD24、CD117的抗体等。本发明可以使用上述瘤标抗体中的一种或多种的组合。
本发明中，鉴定标志细胞的方法不特别限定，优选包括实施免疫荧光染色的步骤和染色体荧光原位杂交的步骤。在示例性实施方案中，本发明的鉴定包括以下步骤：
(1)向所述富集液相中加入抗原修复缓冲液和染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；
(2)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；
(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC，染色体为二倍体或异倍体的细胞，将选择的细胞作为用于诊断的标志细胞。
可选地，本发明进一步包括(4)从外周血得到富集液相的步骤。
本发明中优选通过差相富集来进行富集。差相富集完全不依赖于肿瘤细胞表面标志物(如EpCAM)的表达，应用偶联抗人白细胞表面抗原的特殊单克隆抗体组合群的免疫磁微粒及用于分离血源性细胞的特殊离心介质快速高效去除肿瘤病人血液中的红细胞、白细胞及血浆蛋白，从而有效富集血液标本中的循环血管内皮细胞等。获取的肿瘤细胞既没有被磁珠所包裹，亦没有与任何抗肿瘤细胞表面标志物的抗体相结合，从而避免了激活细胞内的信号传导通路。与其它常规方法相比，差相富集方法中红细胞的去除避免了低渗裂解法的使用，从而对富集的肿瘤细胞的损伤降至最低，使得获取的靶细胞维持良好的自然状态及细胞形态。另外，采用差相富集方法还可避免基于细胞大小，例如微流控技术进行细胞筛选时遗漏大量小细胞的不足，特别是能够避免例如直径小于5μm以下的有效细胞的损失。
在示例性实施方案中，本发明的富集液相制备包括以下步骤：取从受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
本发明的诊断方法中，只要包括鉴定本发明所述的标志细胞的步骤，即在本发明的范围内。在优选的实施方案中，除了上述鉴定步骤之外，本发明的诊断方法还进一步包括判断步骤。
本发明中，判断步骤一般包括基于预先设定的阀值(本文中有时也称为“阈值”)来对鉴定步骤的结果进行分类，并由此确认诊断结果。本发明的阀值可以是标志细胞的数量。由于本发明的标志细胞为特定的循环肿瘤血管内皮细胞，在外周血中其含量极少。因此一般而言以5-7ml外周血，特别是6ml外周血内所检测到的标志细胞的数量作为标准。在示例性实施方案中，本发明的阀值一般为2个/6ml外周血以上，优选3个/6ml外周血以上。需要说明的是，本发明的标志细胞还可以进一步细化为不同亚类或亚组。在以标志细胞的亚类作为指标时，本发明的阀值的选择通常会不同。例如，当仅基于4倍体标志细胞进行判断时，此时的阀值为1个/6ml外周血以上，优选2个/6ml外周血以上。
本发明的第二方面，提供用于诊断机体内细胞异常增殖的试剂盒，其一般包含用于显示细胞表面或细胞内含有选自PTPRC和PECAM1的试剂、DAPI和用于显示细胞染色体为异倍体的试剂。可选地，本发明的试剂盒进一步包含用于显示肿瘤标志物的试剂。
实施例
一、患者及样本
招募的对象为2018年5月至2020年8月在北京大学人民医院收治的56名妇女。术前从高度怀疑为恶性肿瘤或明确诊断但未接受治疗的患者中收集外周血。术后病理证实了20例新诊断的原发性OC和36例卵巢良性肿瘤。根据赫尔辛基宣言，从所有患者获得书面知情同意书。该研究得到北京大学人民医院伦理委员会的批准，并根据赫尔辛基宣言的原则进行。
二、候选细胞的差相富集
将6ml外周血收集到装有ACD抗凝剂的试管中(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ，美国)，然后在室温下离心(200×g)15分钟以分离血浆。弃去棕红色沉淀物上方的上清液，将血细胞沉淀物用6ml CRC缓冲液稀释，然后在50mL离心管中轻轻加入3mL样品密度分离液中，然后以450×g离心7分钟。将含有WBCs和高于RBCs的肿瘤细胞的溶液收集到50ml试管中，然后，将300μL涂有抗白细胞单克隆抗体(抗PTPRC等)的磁珠添加到样品中，并在室温下摇动30分钟。使用50ml大小的磁选机(Cytelligen)去除与WBCs结合的免疫磁珠，然后洗涤非血源性细胞(包括肿瘤细胞和内皮细胞)并富集剩余的100μL CRC液体。样品适用于后续分析。
三、免疫染色和荧光原位杂交(iFISH)
向100μL富集的细胞溶液中加入2μL抗原修复缓冲液，轻轻混合并摇匀，然后在室温下静置10分钟。随后通过与淋巴细胞的荧光标记单克隆抗体(抗PTPRC-Alexa594)、内皮细胞的荧光标记单克隆抗体(抗PECAM1-Cy5)和OC肿瘤标志物(TM)的荧光标记单克隆抗体(抗CA125-Cy7、抗HE4-Alexa488)在室温下以1：200稀释孵育20分钟。将染色的细胞样品用CRC洗涤液洗涤并离心(500×g)5分钟，然后弃去上清液，剩下100μL。等体积的组织固定剂将这些细胞固定过夜。将样品包被在载玻片上，并用CEP 8探针进行原位杂交(美国AbbottMolecular，美国)。杂交条件是在76℃变性10min，在37℃杂交3h。借助于缓冲液，将盖玻片缓慢除去。清洁的载玻片用吹风机干燥。洗涤后，将样品用含有DAPI的固定介质(蓝色)固定。使用荧光显微镜收集鉴定出的肿瘤细胞的图像。
本发明标志细胞的判断标准：DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAP I+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2。具体地，PTPRC：染色阴性，与白细胞最明显的区别是没围绕细胞核的鲜明红色光环。CEP8：1体、3体、4体、≥5体。信号在红色或橙色通道下均很清晰。PECAM1：信号阳性，因PECAM1与血小板结合，因此绿光下有成簇点状染色，背景高低因人而异。DAPI：蓝色，圆或椭圆形。
四、数据处理
所有统计分析均使用SPSS 24.0版本(24.0版本；美国纽约IBM公司)和GraphPadPrism 7(GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉荷亚)。使用单向方差分析(ANOVA)和非配对t检验对两组之间的差异进行统计学分析，与三组独立数据之间的差异相同。使用Fisher精确检验法检测循环肿瘤血管内皮细胞阳性与临床病理特征的相关性。通过非参数受试者工作特性(ROC)曲线分析确定循环肿瘤血管内皮细胞的阈值，并使用最大的尤登指数(灵敏度+特异性-1)来确定临界值。分类数据以百分位数表示。使用人相关性分析来确定相关性。P值<0.05被认为具有统计学意义。
五、结果
CA125和HE4作为肿瘤标志物(TM)都已被证明在OC的临床诊断中具有重要价值。无论CA125阳性还是HE4阳性或双重阳性都被认为是TM阳性。本发明中选择以下标准的细胞作为候选细胞(本文有时简称为CTEC)，被表征为TM阳性且染色体为二倍体、没有PTPRC表达但有PECAM1表达的有核细胞，或者染色体为异倍体、没有PTPRC表达但有PECAM1表达的有核细胞。更具体地说，候选细胞被定义为：DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞(图1)。
1、在OC和对照组中候选细胞计数的分布
比较20例OC患者与36例诊断为卵巢良性肿瘤的候选细胞的计数。在OC组和良性组循环肿瘤候选细胞计数分别为180(平均9.0/6ml)和169(平均4.69/6ml)。尽管OC组中CTEC的计数高于良性组，但两组之间无统计学意义(P＝0.1652)(图2)。
2、候选细胞的CA125和HE4表达特征及Chr8异倍性
通过免疫荧光染色鉴定CA125和HE4在候选细胞的细胞膜和细胞质上的表达。通过荧光原位杂交检测候选细胞中Chr8的倍性。结果显示在表1中。在4例OC患者中检测到CA125阳性者6例(6/20，30.0％)，占少数(26/180，14.4％)。HE4阳性5例(5/20)，占25.0％，总计数11例(11/180)，占6.1％。
表1 20例卵巢癌患者中循环肿瘤血管内皮细胞的CA125和HE4表达特征及Chr8异倍性
无论是OC患者的阳性检出率，还是CA125+或HE4+候选细胞的总计数比例均较低。但是，在80％(16/20)的OC患者中发现具有Chr8非整倍性的候选细胞。此外，180个候选细胞均为非整倍体，TMs+候选细胞为二倍体。总的来说，TMs阳性候选细胞的数量不足，本研究中候选细胞的主要特征是Chr8非整倍体。
3、候选细胞的非整倍性亚型分析
在我们的研究中，大多数候选细胞表现出不同的Chr8非整倍性亚型，即单倍体、三倍体、四倍体和五倍体以上。图3显示了示例性候选细胞的图像。
由于在我们的研究中几乎未检测到单倍体候选细胞，因此未分析数据。整倍体候选细胞的分布如图4所示。图5显示了每个倍性的比例。其中，在良性肿瘤中单倍体占6.5％，三倍体占9.47％，四倍体占9.47％，五倍体及以上占74.56％；在卵巢癌中单倍体占1.11％，三倍体占9.44％，四倍体占8.89％，五倍体及以上占80.56％。整体上，五倍体及以上的候选细胞在良性或恶性肿瘤组中均占优势。
4、不同大小候选细胞的分布
候选细胞中小细胞(≤5μm)和大细胞(>5μm)的鉴定如图6所示。图7显示了OC组和良性组中小细胞和大细胞循环肿瘤血管内皮细胞的分布。图8显示良性组中小、大候选细胞分别为14.79％(25/169)和85.21％(144/169)，卵巢癌组中小、大候选细胞分别为14.44％和85.56％。癌组和良性组中循环肿瘤血管内皮细胞均以大细胞为主。
5、不同大小循环肿瘤血管内皮细胞的非整倍性分析
为了进一步了解循环肿瘤血管内皮细胞的各种亚型的重要性，将细胞大小、Chr8倍性和疾病都考虑在内，图9和图10显示了良性或OC组中小或大候选细胞的分布，四倍体细胞在小细胞之间有显著差异(P＝0.0003)。
图11显示了在良性或癌症组中不同大小的非整倍体细胞的比例。无论是良性患者还是癌症患者，三倍体细胞均是小细胞中的最高亚组，而五倍体以上细胞则是大细胞中的最高亚组。
6、候选细胞计数的临床价值
为了将OC患者与非恶性肿瘤区分开绘制了ROC曲线(如图12所示)，根据非整倍性或通过本发明的SE-iFISH方法测量的细胞大小确定候选细胞的灵敏度和特异性。根据约登指数选择最佳的临界值，具体阈值为1.5，AUC为0.616，灵敏度为80％，特异性为41.57％。
为了寻求更好的指标，接下来，用同样的方法确定了候选细胞亚类的阀值和灵敏度和特异性。结果表明，四倍体小细胞循环肿瘤血管内皮细胞阈值为0.5，AUC为0.675，灵敏度为35％，特异性为100％。根据倍性和细胞大小分类的各亚组的ROC曲线如图13所示，同时，这些指标在良性组和恶性组的分布差异有统计学意义。所选循环肿瘤血管内皮细胞亚组具有良好的临床诊断价值。
7、候选细胞+循环肿瘤细胞(CTC)计数的临床价值
本发明进一步探究了所选候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值。在联用的情况下，本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞。第一标志细胞为本发明的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞；第二标志细胞DAPI+/PTPRC-/PECAM1-细胞，且其染色体为异倍体。
候选细胞的差相富集、荧光原位杂交和数据处理按照前述方法进行，具体实验结果如下：
7.1循环肿瘤血管内皮细胞与循环肿瘤细胞(CTC)相关性研究
首先，确认了候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)的计数之间是否有关联。其相关性研究结果见图14所示，候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)之间存在中等相关性(r＝0.442，P＝0.001)，为了确定候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)组合的效用，我们计算了不同组中候选细胞和循环肿瘤细胞(CTC)的总和。结果如图15所示。
7.2候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值
在对候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值的研究中，根据约登指数选择最佳的临界值，最终阈值为11.5，AUC为0.65，灵敏度为60％，特异性为72.22％。
进一步地，候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的ROC曲线如图12所示。这些指标在良性组和恶性组的分布差异有统计学意义。所选候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用具有潜在的临床诊断价值。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
2.根据权利要求1所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，通过CEP8检测8号染色体是否为异倍体。
3.根据权利要求1所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，所述试剂包括DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，和可选的抗肿瘤标志分子抗体。
4.根据权利要求1所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌。
5.根据权利要求1所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，所述标志细胞包括5μm以下的小细胞。
6.根据权利要求5所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向富集液相中加入抗原修复缓冲液和染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；
(2)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；
(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-且染色体为异倍体的细胞，和/或选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-、肿瘤抗原阳性且染色体为二倍体的细胞作为候选细胞。
7.根据权利要求6所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，所述富集液相通过包括下述步骤的方法得到：
取从受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
8.根据权利要求6所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其特征在于，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌，且当每5-7ml外周血中存在1个以上的标志细胞时，将受试者诊断为患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险高，当每5-7ml外周血中存在小于1个标志细胞时，将受试者诊断为未患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险低。
9.一种体内恶性实体肿瘤的预后方法，其特征在于，包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
10.一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的试剂盒，其特征在于，包含用于显示细胞表面或细胞内存在PTPRC和PECAM1的试剂、DAPI试剂和用于显示细胞染色体为异倍体的试剂，进一步包含用于显示肿瘤标志物分子的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110117855.2A CN112946270B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110117855.2A CN112946270B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112946270A true CN112946270A (zh) | 2021-06-11 |
| CN112946270B CN112946270B (zh) | 2023-03-17 |
Family
ID=76238577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110117855.2A Active CN112946270B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112946270B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109439732A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-08 | 迈迪速能医学技术（天津）有限公司 | 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒 |
-
2021
- 2021-01-28 CN CN202110117855.2A patent/CN112946270B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109439732A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-08 | 迈迪速能医学技术（天津）有限公司 | 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 杨卓;张玉娟;陈倩;付静轩;崔巍;: "循环肿瘤细胞检测及其特性" * |
| 赛特: "人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒说明书", 《人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒说明书》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112946270B (zh) | 2023-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feng et al. | Circulating tumor cells in the early detection of human cancers | |
| CN104094116B (zh) | 在哺乳动物个体中检测5t4阳性循环肿瘤细胞的方法和诊断5t4阳性癌症的方法 | |
| JP6485759B2 (ja) | 末梢循環腫瘍細胞単位の悪性度の検出方法及びそのキット | |
| US20120309018A1 (en) | Cancer detection markers | |
| JP2014521958A (ja) | 胸腔内液若しくは漿液と関連する腫瘍細胞の特徴づけによる癌の診断方法 | |
| Lei et al. | Combined detection of aneuploid circulating tumor‐derived endothelial cells and circulating tumor cells may improve diagnosis of early stage non‐small‐cell lung cancer | |
| US11701657B2 (en) | Column-based device for retrieval of rare cells based on size, and uses thereof | |
| Choesmel et al. | Enrichment methods to detect bone marrow micrometastases in breast carcinoma patients: clinical relevance | |
| CN108572255B (zh) | 检测pd-l1+循环肿瘤细胞的试剂在筛选癌症风险个体以及在癌症患者预后中的应用 | |
| JP2018534595A (ja) | 疾患の不均一性を特徴づけるための転移性疾患における、循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）の単一細胞ゲノムプロファイリング | |
| Balic et al. | Micrometastasis: detection methods and clinical importance | |
| CN111830249A (zh) | 用于纯化分离及分析非典型循环肿瘤细胞的方法的用途及非典型循环肿瘤细胞的用途 | |
| Pusztaszeri et al. | Ancillary studies for salivary gland cytology | |
| Weihrauch et al. | Immunomagnetic enrichment and detection of isolated tumor cells in bone marrow of patients with epithelial malignancies | |
| Mayado et al. | Detection of circulating tumor cells in blood of pancreatic ductal adenocarcinoma patients | |
| AU2003260389B2 (en) | Method for the immunocytological or molecular detection of disseminated tumor cells in a body fluid and kit that is suitable therefor | |
| Yokohama et al. | TCL1A gene involvement in T-cell prolymphocytic leukemia in Japanese patients | |
| CN112946270B (zh) | 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 | |
| JP5371778B2 (ja) | 白血病細胞の検出方法 | |
| CN112946271A (zh) | 用于诊断受试者体内恶性异常增生的方法和试剂盒 | |
| Xie et al. | Detection of circulating rare cells benefitted the diagnosis of malignant solitary pulmonary nodules | |
| Niu | Monitoring and Targeting Metastasis Through Circulating Tumor Cells: From Molecular Profiling to Natural Killer Cell-Based Therapeutics | |
| Patkar et al. | Oncological Hematopathology | |
| Venkataraman et al. | Immunohistochemistry for the Hematopathology Laboratory | |
| WO2025076241A1 (en) | Methods for detecting cancer in a subject |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |