CN113015811A

CN113015811A - 改善的核黄素生产

Info

Publication number: CN113015811A
Application number: CN201980074608.XA
Authority: CN
Inventors: 克里斯托弗·马克·法雷尔; 塞巴斯蒂安·埃里克·波托; 佐尔坦·普拉盖; 迈克尔·帕特里克·阿纳亚
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2021-06-22
Also published as: US20220010291A1; EA202191360A1; EP3880835A1; BR112021009177A2; WO2020099303A1; JP2022512708A; JP7497348B2; US12365885B2

Abstract

本发明涉及一种改进的用于使用包含具有吡哆醛磷酸酶活性的异源酶的经遗传工程改造的宿主细胞生产维生素B2的方法。使用所述经修饰的宿主细胞，可使核黄素生产的产率增加至少约5％。

Description

改善的核黄素生产

核黄素由所有植物和许多微生物合成，但不由高等动物产生。核黄素对基本代谢来说是必需的，因为它是碳水化合物的酶促氧化中所需的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体。在高等动物中，核黄素供应不足可导致脱发、皮肤炎症、视力减退和生长迟缓(growth failure)。

核黄素的生物合成始于鸟苷三磷酸(GTP)和核酮糖-5-磷酸。已知参与核黄素生物合成的基因来自多种来源，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、阿舒假囊酵母(Ereothecium ashbyii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、喇叭状假丝酵母(Candidaflareri)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(E.coli)(参见例如EP405370，EP1186664中的图2，或乌尔曼工业化学百科全书(Ullman's Encyclopedia ofIndustrial Chemistry)，第7版，2007，维生素章节)。

使用微生物(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株)建立工业生产工艺，需要对宿主菌株和/或工艺条件进行一些修改(参见例如Kil等人，Mol Gen Genet 233,483-486,1992；Mack等人，J.Bacteriol.,180:950-955,1998)。必须通过保持核酮糖-5-磷酸的细胞内浓度高于或尽可能接近3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶的饱和底物浓度，将进入和通过核黄素生物合成途径的代谢通量维持在高水平，3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶是一种用于核黄素生物合成途径的假定限速酶。

核黄素操纵子从rib启动子(P_rib)的转录由核糖开关控制，所述核糖开关包括位于rib操纵子的5'区中介于所述操纵子中的第一基因ribG的转录起始密码子与翻译起始密码子之间的具有近300个核苷酸的非翻译调控前导区。新生核黄素RNA的延长取决于是否存在FMN或FAD：在存在这些效应物的情况下，形成转录终止发夹(所谓的rib终止子)，其中在不存在这些效应物的情况下，所谓的抗终止子的形成导致了rib操纵子的通读转录。

因此，使用微生物建立工业工艺涉及具有若干瓶颈的高度复杂的多重酶促工艺，所述若干瓶颈为例如在整个过程中保持有效的直接代谢通量。

令人惊讶的是，我们现在发现一种已知来自维生素B6生物合成途径的特异性磷酸酶在核黄素的发酵生产中起重要作用，导致了至少约5％的产率增加。

具体地，本发明涉及一种产生核黄素的宿主细胞，例如包含(并且表达)核黄素生物合成基因的(重组)宿主细胞，特别是包含具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源酶的产生核黄素的芽孢杆菌属。

根据本发明，产生核黄素的宿主细胞可以是能够产生核黄素(即包含(并表达)核黄素生物合成基因)的任何合适的宿主细胞。优选地，核黄素生物合成基因来自芽孢杆菌属，特别是来自枯草芽孢杆菌，包括例如核黄素生物合成基因ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH。

如本文所定义的产生核黄素的宿主细胞中存在的具有吡哆醛磷酸酶[EC3.1.3.74]活性的异源酶可获自各种来源，例如动物、植物、微生物，所述微生物包括细菌或真菌，所述真菌包括酵母。在一个实施方式中，具有如本文所定义的活性的异源酶选自与SEQ ID NO:2具有至少约70％，例如75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％同一性的多肽，所述SEQ ID NO:2可以由根据SEQ ID NO:1的多核苷酸表达。

根据SEQ ID NO:2的多肽已经从草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)IFO 14782中分离出(参见UniProt登陆号A7BK78)。可用于如本文所定义的产生核黄素的宿主细胞中的与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的多肽的其他来源包括但不限于根瘤菌属(Rhizobia)菌株，例如中华根瘤菌属(Sinorhizobium sp.)RAC02、草木樨中华根瘤菌菌株USDA1021-ATCC 14580、豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(GenBank登录号WP_018068721)、草木樨中华根瘤菌BL225C(GenBank登录号AEG03018.1)或根据表4的根瘤菌属菌株。

包含核黄素生物合成基因的产生核黄素的宿主细胞，例如包含如本文所定义的具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源酶，特别是与SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的异源酶/多肽的微生物，特别是芽孢杆菌属，优选枯草芽孢杆菌，在本文中称为“经修饰的”或“重组的”宿主细胞。

如本文所用，“非修饰的”或“野生型”产生核黄素的宿主细胞是包含核黄素生物合成基因的细胞，例如微生物，特别是芽孢杆菌属，优选枯草芽孢杆菌，但所述细胞不包含(表达)具有如本文所定义的异源酶活性的酶。

如本文所用，术语“异源酶”涉及不是相应宿主细胞(即产生核黄素的宿主细胞)的内源酶的一种酶。为了在宿主细胞中表达，必须将编码所述酶的对应DNA引入合适的产生核黄素的宿主细胞，例如芽孢杆菌属中。因此，本发明涉及一种产生核黄素的宿主细胞，特别是芽孢杆菌属，优选枯草芽孢杆菌，其中编码具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的酶的多核苷酸已被引入所述宿主细胞，并且此外所述多核苷酸在所述宿主细胞中表达(并具有活性)。

编码如本文所定义的此类酶的DNA序列的引入可以例如经由通过转化、接合或转导将DNA序列添加或插入至宿主细胞的染色体中，或者可以将所述DNA序列引入复制质粒DNA上，即合适的表达载体上。所述添加或插入可以通过DNA重组发生，所述DNA重组也可能导致或可能不导致染色体DNA核苷酸的去除或缺失。将DNA序列引入宿主细胞(例如微生物)的方法，特别是通过位点特异性引入进行的方法，在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,N.Y.；和Ausubel等人(编辑)，1995，Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)中。术语“经修饰的”或“转化的”宿主细胞在本文中可互换使用。技术人员知道要用于生成如本文所定义的经修饰的宿主细胞的合适方法和/或表达载体。

根据本发明的一个实施方式，可以在如本文所定义的经修饰的宿主细胞中引入和表达如本文所定义的异源酶的一个或多个拷贝，例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个拷贝，优选具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的与SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的多肽，例如由根据SEQ ID NO:1的多核苷酸编码的多肽。编码如本文所定义并且根据本发明的一个方面的异源酶的多核苷酸可以处于强启动子和/或组成型启动子或诱导型启动子的控制下，或者可以被进一步修饰，例如通过编码所述异源酶的基因的突变，或者通过转录和/或翻译调节物的引入和/或遗传修饰，包括转录和/或翻译抑制剂的失活。这些技术是技术人员所已知的。

用于执行本发明的组成型启动子包括例如与原核核糖体结合位点(RBS)相关联的P_veg，所述RBS为例如枯草芽孢杆菌spoVG基因(例如分别对应于SEQ ID NO:3的1位至46位(ATG-71bp至ATG-26bp)和SEQ ID NO:3的55位至71位(ATG-17bp至ATG-1bp)的核苷酸)的RBS。另一种有用的强启动子是P_spo15。在如本文所定义的经修饰的宿主细胞中引入此类强启动子可导致与使用如本文所定义的非修饰的宿主细胞相比，核黄素产量增加至少50％、75％、100％、200％、250％、300％、350％、500％或甚至大于1000％。因此，在一个实施方式中，将如本文所定义的异源酶与特异性启动子，包括但不限于与RBS相关联的P_veg一起使用。

在一个实施方式中，经修饰的宿主细胞能够产生核黄素，其中与非修饰的宿主细胞相比，核黄素产率增加了至少约5％，例如至少约7％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％或更大。

在一个实施方式中，如本文所定义的经修饰的产生核黄素的宿主细胞中的(内源性)ribC基因的活性被降低或消除，特别是降低了至少约20％，优选例如至少约50％、60％、70％、80％、90％，最优选地其中ribC活性被消除，即降低至零活性。这可以通过例如敲除如本文所述的ribC基因或所述基因的部分来实现(参见例如US5837528)。

技术人员知道如何对此类宿主细胞进行遗传操纵或修饰，例如导致ribC活性降低或消除。这包括但不限于例如基因替换、基因扩增、基因破坏，使用质粒、病毒或其他载体进行转化、转染。

用于使宿主细胞产生更少或不产生ribC基因和/或蛋白质的拷贝而进行的修饰可包括使用弱启动子，或突变(例如插入、缺失或点突变)(如本文所述的)ribC基因(或其部分)，特别是其调控元件的。此外，ribC特异性活性的降低或消除可以通过使ribC与特异性抑制剂或与ribC特异性相互作用的其他物质接触来实现。本领域已知的这些方法可用于生成产生核黄素的宿主细胞，其中ribC的活性被降低或消除，并且所述ribC包含具有如本文所述的吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源多肽。

如本文所定义的经修饰的宿主细胞可携带进一步的修饰，例如过表达一种或多种核黄素生物合成基因，特别是ribA，或在宿主细胞中引入多个拷贝的rib操纵子，例如在枯草芽孢杆菌菌株RB50中实现(参见例如EP 405370)。与枯草芽孢杆菌RB50中的核黄素生产相比，通过以这种方式(即通过将rib基因融合至强启动子上)在遗传上改变微生物，核黄素产量可增加至少100％、200％、250％、500％或甚至大于750％。根据本发明的一个具体方面，携带如本文所定义的具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源酶，任选地与引入强启动子和/或多个拷贝的rib操纵子组合的微生物，可以通过以下方式进一步改变：经由核黄素生产增长的解耦，例如经由引入营养缺陷(例如对于例如生物素在EP1186664中所述)，和/或进一步与引入经修饰的转酮醇酶基因(如例如在WO2007051552中所述)组合，和/或进一步与使用经修饰的rib前导序列(如例如在WO2010052319中所述)组合。

可用作用于生产核黄素的宿主的根据本发明的特别优选的菌株是枯草芽孢杆菌。更优选的菌株是枯草芽孢杆菌RB50::[pRF69]_n，所述枯草芽孢杆菌含有多个(n个)拷贝(例如约5个至约20个拷贝)pRF69，所述pRF69编码用强启动子P_spo15修饰的rib操纵子，以增强rib基因的转录(参见例如EP405370和Perkins等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,22:8-18,1999，用于导致核黄素生产的菌株构建和培养条件)。

术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

序列同一性或序列同源性在本文中可互换使用。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列均可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：比对中对应位置(其显示两个序列中的相同氨基酸或相同核苷酸)的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸序列和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来执行此类搜索。可以用得分＝100、字长＝12的NBLAST程序来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用得分＝50、字长＝3的XBLAST程序来执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用GappedBLAST，如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

通过体外化学或酶促合成来产生如本文所述的“合成分子”，例如合成核酸或合成多肽。所述合成分子包括但不限于用所选宿主生物体的最佳密码子使用制备的变异核酸。

可以优选地根据WO2006077258和/或WO2008000632中所述的方法，包括密码子对优化方法，来优化合成核酸以供用于密码子使用。密码子对优化是这样的一种方法，在所述方法中，编码已经关于多肽的密码子使用(特别是所使用的密码子对)进行修饰的多肽的核苷酸序列，被优化以获得编码所述多肽的核苷酸序列的改善表达和/或所编码多肽的改进产生。密码子对被定义为编码序列中的一组两个紧接三联体(密码子)。本领域技术人员应知道，密码子使用需要根据宿主物种进行调整，可能导致相对于SEQ ID NO:2具有显著同源性偏差，但仍然编码根据本发明的多肽的变体。在一个实施方式中，本发明涉及在合适的产生核黄素的宿主细胞中异源表达的密码子优化的序列。适用于在枯草芽孢杆菌中表达的此类密码子优化的序列的示例在SEQ ID NO:4中示出。

如本文所用，术语“变体”或“突变体”可互换地使用。它们可以指多肽或多核苷酸。变体包括在相对于参考序列的一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。可以通过例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其他重组方法来产生变体。核酸的变异基因可以通过本领域已知的技术人工合成。

如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内(即在如本文所限定的宿主细胞内)或在合适的底物存在下的系统内执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文所定义的吡哆醛磷酸酶或核黄素生物合成酶的活性。评估如本文所定义的合适酶的能力的分析方法包括分离和纯化，这是本领域中已知的。

吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]比生物活性增加的测量可以如下方式进行：在对宿主细胞进行遗传操纵之前，测量所述酶的比活性并将其设定为100％。在宿主细胞的修饰/突变导致异源酶特异性活性之后执行相同的测量，即大于100％的活性，所述测量是本领域中已知的(如在Sarge S等人，Chembiochem.，2015年11月；16(17):2466中所述)。

关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。

如本文所用，术语“核黄素”还包括核黄素前体、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，以及它们的衍生物。核黄素前体和核黄素衍生物、FMN或FAD包括但不限于：2,5-二氨基-6-核糖基氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸(DRAPP)；5-氨基-6-核糖基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸；2,5-二氨基-6-核糖醇基氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮；6,7-二甲基-8-核糖醇基-二氧四氢蝶啶(DMRL)；和黄素蛋白。核黄素衍生物包括但不限于：核黄素-5-磷酸及其盐，例如核黄素-5-磷酸钠。

术语“核黄素”和“维生素B2”在本文中可互换使用。参与核黄素生物合成的基因和用于核黄素发酵生产的方法(特别是使用芽孢杆菌菌株的发酵生产的方法)是已知的(参见例如EP405370，或乌尔曼工业化学百科全书(Ullman's Encyclopedia of IndustrialChemistry)，第7版，2007，维生素章节)。这些方法也可施用以使用如本文所述经修饰的宿主细胞，特别是例如芽孢杆菌属来生产核黄素。

本发明还涉及一种用于生产核黄素的方法，其中在允许从给定底物生产核黄素的条件下在水性培养基中孵育产生核黄素的宿主细胞，例如如本文所定义的经修饰的宿主细胞。通过在用于生产核黄素的方法中使用所述经修饰的宿主细胞，与用非修饰的宿主细胞生产的核黄素相比，产率可增加至少约5％，例如至少约7％、8％、10％、15％、20％、30％、40％、50％或更多。

在本发明的方法，即如上所述的用于生产核黄素的方法中，若干底物可用作碳源。特别合适的碳源可选自由3个、5个或6个碳原子组成的化合物，例如右旋葡萄糖、甘油、浓汁(thick juice)、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖。优选地，碳源是右旋葡萄糖。与上述方法相关的术语“碳源”、“底物”和“生产底物”在本文中可互换使用。

用于使用如本文所定义的经修饰的宿主细胞的上述方法的如本文所用的培养基可以是用于生产核黄素的任何合适的培养基。通常，所述培养基是包含例如盐、底物和一定pH的水性培养基。其中底物转化为核黄素的培养基也被称为生产培养基。在WO2004113510中描述了用于生产核黄素的合适培养基的示例(VF-培养基)，所述培养基对芽孢杆菌属特别有用，并且可用于本发明的目的。

如本文所用的“发酵”或“生产”或“发酵过程”可以是使用本领域技术人员已知的培养基、条件和工序的生长细胞的使用，或者在已经通过使用本领域技术人员已知的培养基、条件和工序培养非生长的所谓静息细胞后，在合适的条件下所述非生长的所谓静息细胞的使用，以用于将合适的底物转化为核黄素。

所产生的核黄素可以通过任何合适的手段从细胞中回收。回收意味着例如可以从生产培养基中分离出所述产生的核黄素。任选地，因此产生的发酵产物可进一步加工，例如纯化。

与使用如本文所定义的经修饰的产生核黄素的宿主细胞的上述方法相关，在一个方面中，生长步骤可以在水性培养基，即补充有用于在需氧条件下正常生长的适当营养物的生长培养基中执行。培养可以例如以分批、补料分批、半连续或连续模式进行，其中补料分批或半连续模式是优选的。详细的发酵方法是技术人员已知的，或者以其他方式在例如EP405370中描述。

要用于根据本发明的方法的培养时段可以根据例如要用的宿主、pH、温度和营养培养基而变化，并且可以例如为约10小时至约10天，优选约4天至约7天，更优选约2天至约6天，具体取决于微生物。本领域的技术人员将知道要结合本发明使用的合适微生物的最佳培养条件。

培养可以例如在约7.0，优选在约6至约8，更优选约6.5至7.5的pH下进行。用于进行培养的合适温度范围可以是例如约13℃至约70℃，优选约30℃至约39℃，更优选约35℃至约39℃，最优选约36℃至约39℃。用于生长的培养基通常可含有如可同化碳源的营养物，例如右旋葡萄糖、甘油、浓汁、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖；和可消化的氮源，例如有机物质，例如蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浆和/或面包酵母。各种无机物质也可用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。此外，生长培养基通常可含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。使用上述工序获得的细胞随后可以在如上所述的基本上相同的模式、温度和pH条件下，在存在例如如上所述的底物的情况下进一步孵育，这样所述细胞将这些底物转化为所需的目标发酵产物。孵育可以在富氮培养基中进行，所述富氮培养基含有例如有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浆；或者无机氮源，例如硝酸盐和铵盐，在这种情况下细胞将能够在产生所需的发酵产物的同时进一步生长。或者，孵育可以在贫氮培养基中进行，在这种情况下，细胞将基本上不生长，并且将处于静息细胞模式或生物转化模式下。在所有情况下，孵育培养基也可含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。根据宿主细胞，本领域的技术人员将知道要施用哪些条件。

术语“产量”或“生产率”是本领域公认的，并且包括在给定时间和给定发酵体积内形成的核黄素的浓度(例如，kg产物/小时/升)。术语“生产效率”包括要达到特定生产水平所需的时间(例如，细胞达到特定发酵产物输出速率耗费了多处的时间)。术语“产率”是本领域公认的，并且包括碳源转化为产物(即，核黄素)的效率。这通常写成例如kg产物/kg碳源。“增加化合物的产率和/或产量/生产率”是指在给定的时间量内，在给定的培养量下，所述化合物的回收分子或有用回收分子的量增加。

用于测定核黄素的产率/生产率的分析方法是本领域中已知的。此类方法可包括但不限于HPLC或使用指示剂菌株(参见例如Bretzel等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22,19-26,1999)。

说明书附图

图1：枯草芽孢杆菌菌株谱系的示意图。

图2：在pdxP基因存在(即BS9646或BS8638)或不存在(BS9645或BS4905)的情况下，以％为单位的核黄素生产产率(y轴)。有关更多细节，请参见实施例4(表3)。

以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容，特别是EP405370、WO2007051552、US5837528、WO2006077258、WO2008000632、WO2017036903、WO2010052319、WO2004113510和EP1186664的内容，据此以引用方式并入。

实施例

实施例1：通用方法、菌株和质粒

除非另有说明，否则WO2017036903中公开了所有培养基和通用方法。表1列出了所用的枯草芽孢杆菌菌株的基因型。

为了从枯草芽孢杆菌中分离出质粒DNA，按照制造商的建议使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒(Qiagen)。通过从10ml在补充有氨苄青霉素(最终100μg/ml)的VY中的培养物离心收获细胞，并在37℃下以250rpm孵育直至OD_600nm为约0.8-1.2。向裂解缓冲液中补充溶菌酶(1mg/ml的最终浓度)，以在37℃下降解枯草芽孢杆菌细胞壁10分钟。

为了通过PCR扩增DNA，将0.1μg来自草木樨中华根瘤菌或枯草芽孢杆菌的染色体DNA用于50μl反应体积中，所述反应体积含有25μl的2X Phusion高保真PCR主混合物(NewEngland Biolabs)、1μl相应的引物(表2)。以29个循环的三个连续步骤执行PCR反应：(i)在95℃下进行变性步骤30秒；(ii)在55℃下进行退火步骤30秒；(iii)在72℃下进行延伸步骤1分钟/kb。PCR循环之前是在95℃下进行变性步骤2分钟。

为了用SPP1噬菌体裂解物转导枯草芽孢杆菌，通过在3ml VY培养基中接种供体菌株的单个菌落来制备供体裂解物。将培养物在转鼓中在37℃孵育过夜。在第二天，将100μl的预培养物与100μl的新鲜VY和30μl的SPP1噬菌体裂解物混合。在水浴中在37℃孵育15分钟后，加入4ml补充有CaCl₂(最终5mM)的新鲜VY。将经感染的培养物在转鼓中在37℃孵育4小时。将裂解的培养物离心，并将上清液过滤灭菌。将所得供体裂解物在+4℃下储存以供进一步使用。通过在3ml VY培养基中接种供体菌株的单个菌落来制备受体菌株。将培养物在转鼓中在37℃孵育过夜。在第二天，用500μl的预培养物接种10ml新鲜的VY培养基，并在37℃下以250rpm孵育至OD_600nm为约0.8-1.2。然后用10μl或100μl的供体裂解物感染900μl的培养物。向培养物中加入9ml补充有MgSO₄(最终10mM)的新鲜VY。在水浴中在37℃下孵育30分钟后，通过离心(10分钟，3500rpm)收获细胞，在150μl的1X SS中悬浮，并铺在选择性琼脂培养基上，之后在37℃下孵育1天。

深孔微量滴定板(MTP)中核黄素产量的测定以如下方式执行：从3ml含有选择性抗生素(在合适的情况下)的VY培养基中的单个菌落制备过夜培养物。将预培养物在39℃，80％湿度下以550rpm孵育。在第二天，用起始OD_600nm为约0.05的预培养物接种3ml的RSM。将MTP中的培养物一式三份，用透气封条(breath seal)盖住孔。将MTP在39℃，80％湿度下以550rpm孵育48小时。用20μl的4M NaOH溶液处理250μl的48小时培养物，以溶解核黄素晶体(以300rpm振荡1分钟)。加入230μl的pH 6.8的1M磷酸钾缓冲液(在300rpm下振荡1分钟)。使用具有四元泵、自动进样器、紫外检测器和荧光检测器的Agilent 1100系列HPLC系统，通过HPLC测定核黄素。使用Supelcosil LC-8DB(150mm×4.6mm×5um)实现分离。最佳柱温为20℃。流动相是在15分钟内从100％0.1M乙酸至50/50 0.1M乙酸/甲醇的梯度，每次运行共33分钟。流率为1.0ml/min，并且注射体积设定为5μl。监测紫外信号，并将其用于检测。校准范围为0.1μg/ml至500μg/ml。此外，通过使用二元泵、自动进样器、紫外检测器和折射率检测器的Waters HPLC系统来分析培养液中葡萄糖的潜在累积。在CAPCELL PAK NH2 UG80柱(4.6mm×250mm，5μm；Shiseido)上实现分离。最佳柱温是40℃。流动相是比率为65:35的乙腈和去离子水的混合物。流率为1.0ml/min，并且将注射体积设定为5μl或10μl。监测折射率信号，并将其用于检测。每种化合物的校准范围为0.3mg/ml至3mg/ml。

表1：枯草芽孢杆菌菌株。

实施例2：在复制载体中克隆草木樨中华根瘤菌pdxP并插入枯草芽孢杆菌宿主中

通过使用引物P1(SEQ ID NO:5)和P2(SEQ ID NO:6)的PCR扩增来自草木樨中华根瘤菌菌株IFO14782(SEQ ID NO:1)的pdxP基因。这些寡核苷酸分别具有BamHI(GGATTC)和NheI(GCTAGC)限制性位点。将所得的0.8kb片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。将纯化的PCR产物在WO2008000632中所述的pBHA12大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭载体的多克隆位点中的BamHI和NheI处克隆。该载体允许在源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的amyQ基因的启动子控制下表达pdxP基因。在枯草芽孢杆菌的克隆和转化工序期间，将大肠杆菌用作中间宿主。首先在TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)中进行连接混合物的转化。分离出几个大肠杆菌氨苄青霉素抗性菌落，并使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)提取重组质粒pBV213L(参见图1)。菌株枯草芽孢杆菌BS168-SP1是Marburg菌株168(Germany)的色氨酸原养型衍生物，所述色氨酸原养型衍生物是通过用来自菌株枯草芽孢杆菌ATCC 6051的未突变的trpC基因替换trpC2突变而生成的。在WO2017036903中详细描述了BS168-SP1的构建。BS168-SP1是关于核黄素过量生产的幼稚菌株(naive strain)。在下一步中，通过感受态细胞转化在菌株BS168-SP1中转化10μl的质粒pBHA12(WO2008000632)或10μl的质粒pBV213L，从而在TBAB平板上选择卡那霉素抗性克隆(最终浓度10μg/ml)。所得的菌株BS9645和BS9646被证实分别具有空载体pBHA12(BS9645)或带有草木樨中华根瘤菌pdxP基因的重组载体pBV213L(BS9646)。显示编码序列的起始密码子的核苷酸序列列于表2中，参考序列表中的SEQ ID NO:。

表2.从草木樨中华根瘤菌中分离出的pdxP的核苷酸序列和针对在枯草芽孢杆菌中表达而进行密码子优化的pdxP的核苷酸序列(pdxP*)。编码序列的起始密码子是加下划线的。有关更多细节，请参见文本和序列列表。

实施例3：在过量产生核黄素的枯草芽孢杆菌宿主的染色体中插入草木樨中华根瘤菌pdxP

将密码子优化的pdxP基因(SEQ ID NO:4)—与天然基因编码相同的蛋白质—插入BS168-SP1受体菌株的染色体中的amyE基因座中。使用突出端延伸拼接(SOEing)PCR生成携带pdxP*基因的DNA片段，所述DNA片段侧接有amyE-5'和amyE-3'DNA序列，允许通过双重杂交稳定插入BS168-SP1染色体中。具有提供对氯霉素的抗生素抗性的氯霉素乙酰转移酶(E.C 2.3.1.28)基因的基因模块，也被插入到amy-E3'侧翼与pdxP*基因之间，在与pdxP*相反的取向上。首先，执行单独PCR以扩增以下：(i)使用引物对P3(SEQ ID NO:7)和P4(SEQ IDNO:8)从pDG1662质粒(Bacillus Genetic Stock Center,The Ohio State University,USA；GenBank U46197)扩增1.9kb的DNA区域，所述DNA区域带有amyE-3'侧翼和氯霉素盒；(ii)使用引物对P5(SEQ ID NO:9)和P6(SEQ ID NO:10)扩增带有pdxP*基因的0.9kb DNA区域。合成地制备由枯草芽孢杆菌veg启动子和枯草芽孢杆菌spoVG RBS(SEQ ID NO:3)驱动表达的草木樨中华根瘤菌IFO14782 pdxP*编码序列(SEQ ID NO:4)，并在由Genscript,Piscataway,NJ,USA提供的载体pJET 1.2(Thermo Fisher Scientific)中克隆。将该重组载体用作PCR的模板；(iii)使用引物对P7(SEQ ID NO:11)和P8(SEQ ID NO:12)从pDG1662质粒扩增带有amyE-5'侧翼的0.5kb的DNA区域。将三种PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。由于有重叠的DNA区域，它们被使用引物对P3和P8装配在3.2kb的SOEing PCR片段中。将所得的SOEing PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中提取。然后将1μg用于转化感受态枯草芽孢杆菌BS168-SP1。在含有5μg/ml的氯霉素的TBAB平板上选择氯霉素抗性(CmR)菌落。通过使用碘染色的淀粉水解测试证实了pdxP*在BS168-SP1的染色体amyE基因(α-淀粉酶)中的插入。PCR也证实了所得菌株BS9502的正确基因型。然后根据上述方法用SPP1噬菌体执行在过量产生核黄素的枯草芽孢杆菌菌株BS4905(在WO2017036903中描述)的染色体amyE基因座中插入pdxP*基因，其中将BS9502的裂解物用于转导菌株枯草芽孢杆菌BS4905。在含有5μg/ml氯霉素的TBAB平板上选择CmR菌落。通过使用碘染色的淀粉水解测试证实了pdxP*在BS168-SP1的染色体amyE基因(α-淀粉酶)中的插入。PCR也证实了所得菌株BS8638的正确基因型。

实施例4：在存在/不存在pdxP基因的情况下的核黄素生产测定

将pdxP基因在菌株BS9646中的复制载体上(参见实施例2)并通过在菌株BS8638中的染色体插入(参见实施例3)过表达。如上所述，从深孔微量滴定板中含有RSM的培养物进行核黄素产量的测定。结果如表3所示。

表3：用具有如所示的不同基因型的各种枯草芽孢杆菌菌株进行核黄素生产。菌株枯草芽孢杆菌BS9645和BS9646共享相同的基因型背景(pdxP插入除外)，菌株枯草芽孢杆菌BS4905和BS8638共享相同的基因型背景(pdxP插入除外)。有关更多说明，请参见文本。

BS9646的核黄素生产产率与其直接亲本BS9645相比提高了至少18000％(参见图2A)。由于在BS9645的培养物中无法检测到核黄素，因此将BS9646与我们的HPLC核黄素测定法的检测限(0.003g/100g葡萄糖)进行比较。在核黄素过量生产菌株背景下执行实验，核黄素生产产率与其直接亲本相比提高了14.5％(BS8638对比BS4902)(参见表3和图2B)。这些结果表明了在枯草芽孢杆菌的基于野生型的菌株(非过量生产菌株背景)和核黄素过量生产菌株背景两者中，pdxP基因表达对核黄素生产都有积极影响。

实施例5：pdxP同源物的鉴定和克隆

使用来自草木樨中华根瘤菌的PdxP进行的同源性搜索，揭示了来自其他根瘤菌属菌株的若干pdxP同源物(参见表4)。

表4.各种根瘤菌属物种内PdxP蛋白序列的同源性(同一性％)。

将同源物克隆到产生核黄素的宿主，例如如上所述的枯草芽孢杆菌中，之后进行如在实施例4中所述的核黄素生产测定。

当使用pdxP同源物时，在核黄素过量生产菌株背景下，核黄素的产率可增加至少5％至20％，即相当于于表3中所示的数量。

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司（DSM IP Assets B.V.）

<120> 改善的核黄素生产

<130> 33286案

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 776

<212> DNA

<213> 草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 1

atggccaatc gggtcgcagg tgaacaaacc gttttgcttc gcaagccggc cgtgtcataa 60

acccgcccat gaagaagctc gaccgcatgc cgacccacgc cgaattcgcc catgtcaccg 120

actgggtctt cgacctcgac aacacgctct atccgcatca cgtcaatctg ttctcacaga 180

tcgaccgcaa catgacggcc tatgttgccg aactcctgtc gctggagcct gcggaggcga 240

agaagctgca gaaggaatac taccgcgacc acggcaccac gcttcagggc ctgatgcttc 300

atcacggcat cgatcccaat gatttcctcg aaagagccca cgccatcgac tatagcgtgg 360

tgccggccga tccggcgctc ggcgaggcga tcaaggcgct gcccggacgc aagttcatct 420

tcaccaacgg cagcgtcgcc catgcggaga tgaccgcgcg ggcgctcggc attctcgagc 480

atttcaacga catcttcgac atcgtcgccg ccggcttcat accgaagccc gccggcgaca 540

cctacgacaa gttcatgggc cttcaccgca tcgacacggc gaatgcggtg atgttcgagg 600

atctgccgcg caacctggtc gtccctaagg cgctcggcat gaagacggtg ctgctcgtgc 660

cgcgcaatct cgaatacgag ttcgccgagg cctgggaaac gtcgagcgac gcggacgatc 720

agatcgacta cgtcacggaa gacctggcgg gtttcctgcg cagtgtgatt gtttaa 776

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 2

Met Ala Asn Arg Val Ala Gly Glu Gln Thr Val Leu Leu Arg Lys Ala

1 5 10 15

Gly Arg Val Ile Asn Pro Pro Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr

20 25 30

His Ala Glu Phe Ala His Val Thr Asp Trp Val Phe Asp Leu Asp Asn

35 40 45

Thr Leu Tyr Pro His His Val Asn Leu Phe Ser Gln Ile Asp Arg Asn

50 55 60

Met Thr Ala Tyr Val Ala Glu Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Glu Ala

65 70 75 80

Lys Lys Leu Gln Lys Glu Tyr Tyr Arg Asp His Gly Thr Thr Leu Gln

85 90 95

Gly Leu Met Leu His His Gly Ile Asp Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg

100 105 110

Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly

115 120 125

Glu Ala Ile Lys Ala Leu Pro Gly Arg Lys Phe Ile Phe Thr Asn Gly

130 135 140

Ser Val Ala His Ala Glu Met Thr Ala Arg Ala Leu Gly Ile Leu Glu

145 150 155 160

His Phe Asn Asp Ile Phe Asp Ile Val Ala Ala Gly Phe Ile Pro Lys

165 170 175

Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Asp Lys Phe Met Gly Leu His Arg Ile Asp

180 185 190

Thr Ala Asn Ala Val Met Phe Glu Asp Leu Pro Arg Asn Leu Val Val

195 200 205

Pro Lys Ala Leu Gly Met Lys Thr Val Leu Leu Val Pro Arg Asn Leu

210 215 220

Glu Tyr Glu Phe Ala Glu Ala Trp Glu Thr Ser Ser Asp Ala Asp Asp

225 230 235 240

Gln Ile Asp Tyr Val Thr Glu Asp Leu Ala Gly Phe Leu Arg Ser Val

245 250 255

Ile Val

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

Claims

1.一种产生核黄素的宿主细胞，所述产生核黄素的宿主细胞包含核黄素生物合成基因(rib操纵子)和具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源酶。

2.根据权利要求1所述的产生核黄素的宿主细胞，所述产生核黄素的宿主细胞包含来自芽孢杆菌属(Bacillus)的核黄素生物合成基因。

3.根据权利要求1或2所述的产生核黄素的宿主细胞，所述产生核黄素的宿主细胞包含与SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的多肽。

4.根据权利要求3所述的产生核黄素的宿主细胞，所述产生核黄素的宿主细胞表达编码与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的产生核黄素的宿主细胞，其中所述异源酶选自细菌，优选根瘤菌属(Rhizobia)，更优选中华根瘤菌属(Sinorhizobium)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的产生核黄素的宿主细胞，其中所述内源性ribC基因的活性已经降低。

7.根据前述权利要求中任一项所述的生产核黄素的宿主细胞，其中与使用不表达编码与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸的宿主细胞的核黄素产量相比，从给定碳源的核黄素产率增加了至少约5％。

8.根据前述权利要求中任一项所述的产生核黄素的宿主细胞，所述产生核黄素的宿主细胞选自芽孢杆菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、乳球菌属(Lactococcus)或链霉菌属(Streptomyces)，优选选自由以下项组成的组：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

9.一种用于生产核黄素的方法，其中将根据前述权利要求中任一项所述的生产核黄素的宿主细胞在允许从给定底物生产核黄素的条件下在水性培养基中孵育。

10.根据权利要求9所述的方法，其中与宿主细胞不表达编码与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸的方法相比，核黄素的产率增加了至少5％。

11.根据权利要求9或10所述的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据权利要求1至7中任一项所述的产生核黄素的宿主细胞，

(b)在允许从给定底物生产核黄素的条件下，在水性培养基中孵育所述宿主细胞，以及任选地

(c)从所述培养基中分离和纯化所述核黄素。

12.与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的多肽或根据权利要求1至8中任一项所述的产生核黄素的宿主细胞在生产核黄素的方法中的用途。

13.一种生产核黄素的宿主细胞，所述生产核黄素的宿主细胞包含核黄素生物合成基因(rib操纵子)和具有吡哆醛磷酸酶[EC 3.1.3.74]活性的异源酶，所述生产核黄素的宿主细胞用于生产核黄素的方法中。