CN113092461B - 一种均相二维可视化/荧光分析方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法及应用。该方法包括以3'‑端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板以形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs，基于QDs选择性识别特性使体系引起对信号分子的信号变化得到循环肿瘤细胞的分析结果。本发明可实现基于QDs为信号分子的颜色和距离变化的二维可视化或荧光分析，在提高了检测的灵敏度和准确性的同时，为今后循环肿瘤细胞多维POCT分析奠定基础。

Description

一种均相二维可视化/荧光分析方法及应用

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维化/荧光分析方法及其应用。

背景技术

目前癌症患者一旦被确诊，基本上都是中晚期，治愈的可能性及5年生存率比较低。因此对于肿瘤的早发现，其检测技术是最为核心的。现有肿瘤医学检测方法有液体活检、影像学、病理学研究等。以上方法中，液体活检在肿瘤的早发现方面是最直接和有效地。活跃生长的肿瘤通常会向外周血中释放循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）。越来越多的证据表明，以CTCs作为液体活检标本，对于早发现、预测复发风险、评估治疗反应和指导治疗方案，实现真正的个体化医疗具有重要意义。CTCs数目是非常稀少的，在良性疾病患者体内和正常人体内没有，在早期癌症患者体内数目稀少，且在整个癌症发展过程中均可被检测到。因此，高灵敏的CTCs检测技术对于早期癌症患者的诊断具有重要意义。

现有医学检测机构对循环肿瘤细胞（CTCs）检测方法主要是基于叶酸受体（Folatereceptor, FR）识别的免疫磁珠富集纯化、靶向探针标记和荧光定量PCR（Polymerasechain reaction）三步方法。免疫磁珠富集纯化的作用是去除红细胞和绝大多数的白细胞，同时富集CTCs。靶向探针标记是使用特异性小分子探针对FR阳性细胞进行标记，用于后续定量。荧光定量PCR是利用特异性引物，结合Taqman探针和PCR技术，对FR特异性结合的小分子探针中的寡聚核苷酸进行定量，评估样品中FR细胞水平。

然而本申请人发现就靶向探针标记和荧光定量PCR步骤而言存在以下几个问题：1、以FR为标志物，部分细胞（如肺癌细胞）对FR的表达水平较低，造成其检测的覆盖面不全；2、使用叶酸和FR识别对，捕获CTCs以及使用磁珠辅助分离，过程为非均相，操作复杂且耗时，影响检测准确性；3、使用PCR技术，需要蛋白酶且为变温过程，需要成熟的仪器和专业操作人员；4、难以实现即时检验（point-of-care testing，POCT）以及可视化读取；5、成本较高，以华西医院为例单次收费在2000元以上，且仅仅可在大型医院内完成，难以在基层医院推广以及用于患者的自我监测。因此，针对现有技术存在的问题，需要提供一种简化现有肿瘤诊断流程和操作，缩短时间、降低成本且改善分析灵敏度的分析方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，以解决现有技术中对循环肿瘤细胞的检测方法覆盖面不全，难以实现即时检验及可视化读取的技术问题。

本发明的另一目的在于提供一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光分析方法的应用。

本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，包括以3'-端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；

基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，进而通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板，以形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs；加入QDs选择性识别体系中的Cu²⁺和Cu NPs或者Ag⁺和Ag NPs，以便使体系基于叶酸受体与3'-端修饰叶酸的核酸链的特异性结合而引起对信号分子Cu NPs、Ag NPs或QDs的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。

根据一种优选实施方式，所述信号分子为QDs，所述信号分子QDs的信号变化能够通过二维可视化颜色变化检测或荧光信号变化检测而得到。

根据一种优选实施方式，所述二维可视化颜色变化检测包括紫外灯下读取试管内溶液颜色；以及通过喷墨打印试纸读取试纸上的距离变化对循环肿瘤细胞进行定量分析。

根据一种优选实施方式，所述试纸上的距离变化包括随循环肿瘤细胞浓度的增加，喷墨打印试纸上的距离变化越长。

根据一种优选实施方式，所述信号分子为QDs，以QDs为信号分子时能够检测到低至0.03 fg/mL浓度的叶酸受体或者低至0.2 cells/mL浓度的循环肿瘤细胞。

根据一种优选实施方式，基于叶酸受体对核酸外切酶I的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链包括使3'-端修饰叶酸的核酸链在与叶酸受体进行特异性结合后抑制核酸外切酶I对其进行识别切割。

根据一种优选实施方式，其中，还包括通过核酸聚合酶或延伸酶选择性识别延伸3'-端OH的寡核苷酸，以实现循环肿瘤细胞内的生物标志物叶酸受体的特异性识别。

根据一种优选实施方式，所述核酸聚合酶或延伸酶包括TdT酶。

本发明还提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法的应用，所述应用包括将所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法应用于循环肿瘤细胞的检测设备中。

根据一种优选实施方式，所述检测设备包括检测试剂盒。

基于上述技术方案，本发明的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法至少具有如下技术效果：

本发明的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法通过以循环肿瘤细胞表面的叶酸受体为生物标志物，以3'-端修饰叶酸的核酸链作为循环肿瘤细胞表面叶酸受体的识别探针，与叶酸受体进行特异性结合；通过在核酸外切酶I和核酸聚合酶或延伸酶的辅助识别和延伸作用下，形成DNA模板Cu NPs或DNA模板Ag NPs，结合QDs的选择性识别特性，分别以Cu NPs、Ag NPs或QDs为信号分子，以便得到由于叶酸受体与叶酸的特异性结合所引起的体系内信号分子的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。本发明的分析方法可实现颜色和距离二维可视化或荧光分析，提高了检测灵敏度和准确性，简化了现有肿瘤诊断流程和操作，缩短了时间，降低了成本，为肿瘤医学诊断提供了更多选择，为癌症CTCs的多维POCT分析奠定了基础，同时为构建家庭便捷式可视化分析装置提供了理论指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是叶酸受体和肝癌SMMC-7721细胞二维可视化和荧光分析原理图；

图2是选择性识别延伸和识别切割现象的验证、纳米材料的表征和叶酸受体分析可行性结果图；

图3是叶酸受体分析条件优化图；

图4是选择性阳离子交换反应条件优化图；

图5是多模式下叶酸受体分析性能图；

图6是多模式肝癌SMMC-7721细胞分析性能。

实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例

本发明的分析方法是以叶酸受体FR为细胞标志物，通过识别FR进而间接实现对细胞的分析，本发明的方法包括以下几个现象：

（1）TdT酶选择性识别3'-端修饰与否的寡核酸链，如图1A所示，如寡核酸链可被TdT识别，则能够催化底物延伸核酸链，而修饰了小分子或者连接蛋白的核酸链无法被TdT酶识别延伸。

（2）外切酶I选择性识别切割3'-端修饰叶酸的核酸链，当结合上叶酸受体时，由于空间位阻的影响，抑制其对核酸链的切割，如图1B所示。

（3）QDs可以选择性识别Cu²⁺和聚T链模版Cu NPs，即Cu²⁺对QDs的淬灭作用强于CuNPs，如图1C内插图所示。

因此，在以上现象的基础之上，本发明的分析方法以叶酸受体为标志物，叶酸修饰的T30链为识别探针，Exo I和TdT酶辅助识别和延伸DNA链，结合聚T链模板Cu NPs，分别以Cu NPs和QDs为信号分子，构建了循环肿瘤细胞的均相二维可视化或荧光分析策略。同时利用QDs的强发光特性，结合喷墨打印试纸，实现了循环肿瘤细胞的颜色和距离读取二维可视化分析，其可为CTCs的POCT分析奠定技术，为临床癌症诊断提供更多选择。

1.2原理验证

在进行叶酸受体和循环肿瘤细胞分析之前，发明人对选择性识别延伸和识别切割现象进行了验证。如图2A所示，发明人选择了三条不同序列的核酸链，分别对其3'-端修饰叶酸，在TdT酶作用下以dTTP为底物延伸以上序列，最后监测不同序列引起的Cu NPs荧光信号变化。

结果发现，未修饰叶酸的核酸链引起的荧光信号明显高于修饰叶酸的核酸链，修饰叶酸的核酸链几乎未引起荧光信号的增加。发明人将以上现象称之为选择性识别延伸反应。

随后，利用Exo I酶识别切割修饰叶酸的核酸链，并在TdT酶催化下考察Exo I对核酸链的识别切割，以及叶酸受体对Exo I识别切割的抑制性。如图2B所示，选择修饰了叶酸的T30链和P1链，其与Exo I作用后加入TdT酶和dTTP时，均可生成聚T链，引起Cu NPs信号的增加，对比图2B-a和b。以上结果可得到Exo I可识别切割叶酸修饰的核酸链，且切割后的短链核酸可作为TdT的引物链。随后，向修饰了叶酸的T30链和P1链中加入不同浓度的FR时，可发现其可有效的抑制了Cu NPs的生成，即连接FR后，核酸链无法被Exo I识别切割，进而无引物链可供TdT酶催化延伸，对比图2B-c，d和b。发明人将这一现象称之为位阻调控的识别切割和延伸现象。

实施例2

本实施例提供了对叶酸受体FR进行分析的步骤及结果。

CdTe QDs是根据一锅法合成的：首先，将0.5 mmol CdCl₂和0.20 g的柠檬酸三钠溶解在50毫升的水中，向以上溶液中加入的52 μL巯基丙酸（MPA）。使用NaOH溶液，将以上混合物溶液pH调节至10.5。然后，将0.1 mmol Na₂TeO₃和50 mg KBH₄加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈红色，在紫外灯下呈现出强烈的红色荧光。最后，通过沉淀（使用正丙醇）和离心（11000 rpm, 30分钟）纯化CdTe QDs溶液。

将以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4 °C。

向EP管中加入1 μL 100 μM的T30-FA，50 μL不同浓度的FR，以及4 μL的10×Exo I缓冲液，于37 °C下反应30分钟。之后，加入0.3 μL Exo I酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后转入90 °C下反应10分钟将酶灭活。待自然冷却至室温时，加入4 μL的5×TdT缓冲液，1.5 μL 100 mM的dTTP底物和0.3 μL TdT酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后，转入75 °C下反应5分钟将酶灭活。最后，向以上溶液中加入50 μL的MOPs缓冲液，20 μL 18 mM的CuSO₄和20 μL 20 mM的抗坏血酸，反应5分钟后测Cu NPs的荧光信号。

向EP管中加入1 μL 100 μM的T30-FA，50 μL不同浓度的FR，以及4 μL的10×Exo I缓冲液，于37 °C下反应30分钟。之后，加入0.3 μL Exo I酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后转入90 °C下反应10分钟将酶灭活。待自然冷却至室温时，加入4 μL的5×TdT缓冲液，1.5 μL 100 mM的dTTP底物和0.3 μL TdT酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后，转入75 °C下反应5分钟将酶灭活。最后，向以上溶液中加入50 μL的MOPs缓冲液，20 μL 18 mM的CuSO₄和20 μL 20 mM的抗坏血酸，以形成聚T链模板Cu NPs，然后向以上溶液中加入2 μLMPA-CdTe QDs量子点原液，在室温下孵育7分钟完成选择性阳离子交换反应，其后监测溶液中QDs的荧光信号。

首先对体系内涉及的纳米材料进行表征。

图2C为Cu NPs的特征紫外可见吸收峰形图，由图2C可知，其在346 nm处表现出其特征吸收峰。图2D示出了所合成的Cu NPs的TEM图，图中显示合成的Cu NPs呈现类球状，粒径约为4 nm，如图2D所示。

从图2E可看出合成的QDs在600 nm处表现出特征吸收峰。图2F和图2G示出了合成的QDs分散均匀，呈现类球状，粒径约为4 nm，且具有晶格结构。当加入Cu²⁺至QDs溶液中时，QDs呈现出明显的团聚，生成CuTe，即Cu²⁺与QDs间发生了阳离子交换反应，如图2H所示。

然后，使用DNA凝胶电泳实验和荧光实验对FR分析的可行性进行了验证。如图2I所示，在TdT酶作用下，T30链被延伸生成了聚T链（对比条带1和3）；T30-FA在Exo I和TdT酶作用下，也可生成聚T链，且向以上溶液中加入不同浓度FR（0.10 fg/mL和1 ng/mL）时，聚T链的生成显著被抑制（对比条带4-6）。使用Cu NPs作为信号分子的荧光实验也表现出与电泳实验相近的结果。此外，当使用QDs为信号分子时，可发现QDs可轻松区分Cu²⁺和Cu NPs（图2J-f至h）。且值得注意的是，以上选择性识别现象可通过颜色和距离的方式进行裸眼读取，如图2J内插图所示。对QDs和Cu NPs为信号分子时，初步实验结果表明QDs的引入可改善分析灵敏度（对比图2J内不同信号分子）。

2.5 FR分析条件的优化

在验证实验可行性后，对实验内涉及到的实验条件进行了考察。如图3所示，图3A可知，对于叶酸和叶酸受体识别结合反应30分钟完成。从图3B可知，当0.3 μL的Exo I（20U/μL）时，可获得最大的荧光信号。从图3C可知，Exo I识别切割T30-FA反应可在30分钟时获得最大荧光信号差值。从图3D可知，当0.3 μL的TdT（20 U/μL）时，可获得最大的荧光信号。从图3E可知，当1.5 μL的dTTP（100 mM）时，可获得最大的荧光信号差值。从图3F可知，TdT识别延伸反应在30分钟时获得最大荧光信号差值。从图3G和图3H可知，Cu²⁺浓度在18 mM时，AA浓度在20 mM时或者最大荧光信号差值。从图3I可知，聚T链Cu NPs的生成可在5分钟内完成。

随后对QDs加入后的阳离子交换反应条件进行了优化，如图4所示。图4A可知，QDs体积为2 μL时，可获得最大的荧光信号差值；图4B可知，QDs加入后空白和目标溶液的荧光信号均在降低，且在7分钟时均保持稳定，可获得最大的荧光信号差值。

2.6 FR分析性能的考察

对分别以Cu NPs和QDs为信号分子时FR的分析灵敏度进行考察，结果如图5所示。

如图5A，当使用Cu NPs为信号分子时，随着FR浓度的增加，体系溶液荧光信号在逐渐降低。对比且拟合数据可发现荧光信号与1-100 fg/mL浓度范围内FR浓度的对数呈现良好的线性关系，检测限为0.25 fg/mL（基于三倍信噪比，图5B）。

鉴于Cu NPs的颜色亦可在紫外灯下裸眼，发明人对Cu NPs作为信号分子时，可视化颜色读取性能进行了考察。如图5C所示，随着FR浓度增加，溶液颜色在变浅，且裸眼可区分1 fg/mL和0.1 fg/mL浓度，只是溶液颜色相对较弱。

随后，将QDs的选择性识别反应引入，考察其对FR分析性能的改善，以及二维可视化分析的可行性。如图5D所示，在紫外灯下，对试管内溶液颜色进行对比，可发现裸眼可区分0.1 fg/mL和0.01 fg/mL浓度，且颜色变化明显，强于Cu NPs作为信号分子时。如图5E，当采用喷墨打印方式，将QDs作为信号分子时，随着FR浓度增加，试纸条上溶液移动的距离在明显延长，其主要是由于FR越多，剩下的Cu²⁺越多。试纸条分析灵敏度与颜色读取时相近，均可识别0.1 fg/mL级别FR，但是试纸条颜色变化更加明显，且其不受检测人员个体差异的影响（如色盲，或者色弱）。

随后，将以上溶液放入荧光仪中检测，对其荧光信号对比和拟合，可发现荧光信号与0.1-10 fg/mL浓度范围内FR呈现良好的线性关系，其检测限为0.03 fg/mL，相比于CuNPs为信号分子时，提高了10倍，如图5F和5G所示。

在该体系下对FR分析的选择性进行了考察，如图5H和I所示，高浓度（100 fg/mL、100 fM、0.1 mU/L）的血清内共存潜在干扰蛋白引起的QDs荧光信号的改变与空白溶液相近，几乎可以忽略。然而，低浓度的FR（1和10 fg/mL）引起了明显的荧光信号降低。即该体系具有良好的目标选择性，其主要是源于叶酸和叶酸受体间高特异性识别结合作用。

本实施例以肝癌SMMC-7721细胞为例进行了循环肿瘤细胞分析性能的考察。

CdTe QDs是根据一锅法合成的：首先，将0.5 mmol CdCl₂和0.20 g的柠檬酸三钠溶解在50毫升的水中，向以上溶液中加入的52μL巯基丙酸（MPA）。使用NaOH溶液，将以上混合物溶液pH调节至10.5。然后，将0.1 mmol Na₂TeO₃和50 mg KBH₄加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈红色，在紫外灯下呈现出强烈的红色荧光。最后，通过沉淀（使用正丙醇）和离心（11000 rpm, 30分钟）纯化CdTe QDs溶液。

将以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4 °C。

3.2 以聚T链模板CuNPs为信号分子。

向EP管中加入1 μL 100 μM的T30-FA，50 μL不同浓度的SMMC-7721细胞，以及4 μL的10×Exo I缓冲液，于37 °C下反应30分钟。之后，加入0.3 μL Exo I酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后转入90 °C下反应10分钟将酶灭活。待自然冷却至室温时，加入4 μL的5×TdT缓冲液，1.5 μL 100 mM的dTTP底物和0.3 μL TdT酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后，转入75 °C下反应5分钟将酶灭活。最后，向以上溶液中加入50 μL的MOPs缓冲液，20 μL18 mM的CuSO₄和20 μL 20 mM的抗坏血酸，反应5分钟后测Cu NPs的荧光信号。

向EP管中加入1 μL 100 μM的T30-FA，50 μL不同浓度的SMMC-7721细胞，以及4 μL的10×Exo I缓冲液，于37 °C下反应30分钟。之后，加入0.3 μL Exo I酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后转入90 °C下反应10分钟将酶灭活。待自然冷却至室温时，加入4 μL的5×TdT缓冲液，1.5 μL 100 mM的dTTP底物和0.3 μL TdT酶（20 U/μL），于37 °C下反应30分钟后，转入75 °C下反应5分钟将酶灭活。最后，向以上溶液中加入50 μL的MOPs缓冲液，20 μL18 mM的CuSO₄和20 μL 20 mM的抗坏血酸，以形成聚T链模板Cu NPs，然后向以上溶液中加入2 μL MPA-CdTe QDs量子点原液，在室温下孵育7分钟完成选择性阳离子交换反应，其后监测溶液中QDs的荧光信号。

3.4 SMMC-7721细胞分析性能考察。

首先考察Cu NPs为信号分子时分析灵敏度。如图6A所示，随着细胞浓度的增加，溶液荧光信号在逐渐降低。在100-10⁵ cells/mL浓度范围内，细胞浓度的对数与荧光信号呈现良好线性关系，其检测限为30 cells/mL，如图6B所示。随后，将以上溶液在紫外灯下观察其颜色变化，如图6C所示，溶液颜色相对较弱，对比下可发现100 cells/mL溶液颜色相比10cells/mL溶液较浅些，即以Cu NPs为信号分子时裸眼可识别100 cells/mL浓度级别。

将QDs作为信号分子时，其可视化分析颜色显著增强，对比可发现裸眼可区分空白和5 cells/mL细胞引入的溶液颜色变化，如图6D，其灵敏度相比于Cu NPs为信号分子时提高了近两个数量级。同时将喷墨打印试纸条插入以上溶液中，通过读取距离变化实现对CTCs的定量分析。如图6E所示，随着细胞浓度增加，试纸条上距离变化越长，且裸眼可区分空白溶液和1 cells/mL细胞引起的距离变化，其与颜色读取灵敏度相近。最后，使用荧光仪对以上溶液中QDs的荧光信号进行监测，如图6F和图6G所示，随着细胞浓度增加，溶液荧光信号在逐渐降低，在1-100 cells/mL浓度范围内，细胞浓度的对数与荧光信号呈现良好线性，其分析检测限为0.2 cells/mL，该灵敏度较Cu NPs为信号分子时提高了近两个数量级，其主要归功于QDs的阳离子交换反应信号放大。

因此本发明所提供的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，以FR为生物标志物，结合端基保护及位阻调控酶识别切割和延伸现象，以及选择性阳离子交换反应的高灵敏、准确、均相、低成本和简单二维可视化和荧光循环肿瘤细胞的分析方法被成功构建，可为今后临床转化奠定基础，且二维可视化特性为肿瘤CTCs的POCT分析提供了可能。

本发明还提供了一种通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法的应用，所述应用包括将所述的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法应用于循环肿瘤细胞的检测设备中。所述检测设备包括检测试剂盒。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，包括以3'-端修饰叶酸的核酸链为识别探针对循环肿瘤细胞表面的生物标志物叶酸受体进行选择性识别结合；

基于叶酸受体引起的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链，进而通过核酸聚合酶或延伸酶催化延伸被切割的叶酸修饰的核酸链形成核酸链模板，以形成DNA模板Cu NPs；加入QDs选择性识别体系中的Cu²⁺和Cu NPs，以便使体系基于叶酸受体与3'-端修饰叶酸的核酸链的特异性结合而引起对信号分子Cu NPs或QDs的信号变化进而得到循环肿瘤细胞的分析结果。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述信号分子为QDs，所述信号分子QDs的信号变化能够通过二维可视化颜色变化检测或荧光信号变化检测而得到。

3.根据权利要求2所述的非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述二维可视化颜色变化检测包括紫外灯下读取试管内溶液颜色；以及通过喷墨打印试纸读取试纸上的距离变化对循环肿瘤细胞进行定量分析。

4.根据权利要求3所述的非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述试纸上的距离变化包括随循环肿瘤细胞浓度的增加，喷墨打印试纸上的距离变化越长。

5.根据权利要求1所述的非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述信号分子为QDs，以QDs为信号分子时能够检测到低至0.03 fg/mL浓度的叶酸受体或者低至0.2 cells/mL浓度的循环肿瘤细胞。

6.根据权利要求1所述的非诊断目的的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，基于叶酸受体对核酸外切酶I的位阻调控使核酸外切酶I选择性识别并切割未结合叶酸受体的叶酸修饰的核酸链包括使3'-端修饰叶酸的核酸链在与叶酸受体进行特异性结合后抑制核酸外切酶I对其进行识别切割。

7.根据权利要求1所述的非诊断目的的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，其中，还包括通过核酸聚合酶或延伸酶选择性识别延伸3'-端OH的寡核苷酸，以实现循环肿瘤细胞内的生物标志物叶酸受体的特异性识别。

8.根据权利要求1或7所述的非诊断目的的选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞的均相二维可视化/荧光分析方法，其特征在于，所述核酸聚合酶或延伸酶包括TdT酶。

9.一种非诊断目的的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1至8任一项所述的通过选择性识别叶酸受体的循环肿瘤细胞均相二维可视化/荧光分析方法应用于循环肿瘤细胞的检测设备中。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测设备包括检测试剂盒。