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CN113151219A - α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸 Download PDF

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CN113151219A
CN113151219A CN202110401850.2A CN202110401850A CN113151219A CN 113151219 A CN113151219 A CN 113151219A CN 202110401850 A CN202110401850 A CN 202110401850A CN 113151219 A CN113151219 A CN 113151219A
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CN
China
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seq
alpha
polynucleotide
sequence
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CN202110401850.2A
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G·科沃德-凯利
福山四郎
堤法子
绫部继一
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Original Assignee
Novozymes AS
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Abstract

本披露涉及具有α‑淀粉酶活性的的分离的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、核酸构建体、载体和包括这些多核苷酸的宿主细胞连同包括在乙醇生产工艺中生产这些多肽的方法以及使用这些多肽的方法。

Description

α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸
本申请是申请号为201380064656.3、申请日为2013年12月13日、发明名称为“α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸”的发明专利申请的分案申请。
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及α-淀粉酶、编码这些α-淀粉酶的多核苷酸、生产这些α-淀粉酶的方法、和使用这些α-淀粉酶的方法。在本披露的实施例中，生淀粉(raw starch)降解活性被改善。
相关技术说明
淀粉的酶降解是很多工业过程中的部分，这些工业过程包括酿造、葡萄糖或高果糖糖浆的生产以及饮用或燃料乙醇的生产。在天然的状态中，淀粉非常耐受很多酶的降解，并因此传统上通过一个对淀粉进行糊化的加热步骤来启动淀粉的工业酶降解，这使得淀粉对很多酶更加敏感。一些酶可以作用于未糊化的淀粉，并且通常被提及为具有生淀粉降解活性。这些酶的使用允许改善工艺，包括例如减少加工淀粉中的加热步骤。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖4葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)构成催化淀粉以及其他直链和支链1,4葡糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。α-淀粉酶已经用于各种不同的工业目的，包括淀粉液化、乙醇生产、纺织品脱浆、纺织品洗涤、纸张和纸浆工业中的淀粉改性、酿造和烘焙。
WO 2010/091221披露了一种来自土曲霉的具有α-淀粉酶活性的多肽。数据库UniProt XP002576027披露了来自Q0C881(土曲霉)基因组针对α-淀粉酶的核酸序列。
WO 2008/080093披露了α-淀粉酶和葡糖淀粉酶以及其在制造燃料中的用途。
在本领域中仍然需要改进的α-淀粉酶，包括具有生淀粉降解活性的α-淀粉酶。
发明概述
本发明涉及具有α-淀粉酶活性的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的成熟多肽的氨基酸序列或由其组成的多肽；
(b)一种包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的成熟多肽具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列杂交。在实施例中，本披露的多肽是分离的。
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
本发明另外涉及用一种编码本发明的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
在又另外的方面中，本发明涉及包括一种本发明的多肽的组合物，包括用于生产乙醇的组合物。
本发明还涉及使用一种本发明的多肽生产乙醇的方法。本发明还涉及使用一种本发明的多肽从未糊化的淀粉生产乙醇的方法。
定义
α-淀粉酶活性：在此将术语“α-淀粉酶活性”定义为一种催化包含三个或更多个(1,4)-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中的(1,4)-α-D-糖苷键的内切水解的活性。术语“α-淀粉酶活性”对应于在E.C.3.2.1.1中分类的酶。出于本发明的目的，根据“实例”部分所述的程序确定α-淀粉酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的本发明的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，一个片段包含了SEQ ID NO:2或6的至少497个氨基酸残基、至少526个氨基酸残基或至少555个氨基酸残基。在另一个方面，一个片段含有SEQ ID NO:4的至少528个氨基酸残基、至少559个氨基酸残基或至少590个氨基酸残基。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。例如，本发明的多肽可以按发酵液产物的形式用于工业应用中，即，本发明的多肽是用作工业应用(例如，乙醇生产)中产物的发酵液的组分。除本发明的多肽外，该发酵液产物将包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。该发酵液可以任选地经受一个或多个纯化(包括过滤)步骤，以除去或降低发酵过程中的再一个组分。因此，本发明的“分离的”多肽可以存在于此类发酵液产物中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基)。
在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸-1至-21是信号肽的SignaIP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至585。
在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸-1至-21是信号肽的SignaIP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至622。
在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:6的氨基酸-1至-21是信号肽的SignaIP程序(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至607。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性””的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
发明详细说明
具有α-淀粉酶活性的多肽
在实施例中，本发明涉及新的α-淀粉酶序列。这些新的α-淀粉酶序列包括SEQ IDNO:2的成熟多肽、SEQ ID NO:4的成熟多肽和SEQ ID NO:6的成熟多肽。SEQ ID NO:2的成熟多肽还示出为SEQ ID NO:1的氨基酸序列(残基1-585)。SEQ ID NO:4的成熟多肽还示出为SEQ ID NO:3的氨基酸序列(残基1-622)。SEQ ID NO:6的成熟多肽示出为SEQ ID NO:5的氨基酸序列(残基1-607)。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。本发明的多肽优选地包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或是其具有α-淀粉酶的片段。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。本发明的多肽优选地包括或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或是其具有α-淀粉酶的片段。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。本发明的多肽优选地包括或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或是其具有α-淀粉酶的片段。
本发明涉及具有由一种多核苷酸编码的α-淀粉酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与编码SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽的核酸序列或(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列的全长互补体杂交。
在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，该分离的多肽由与EQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸所编码。
在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，这些变体在一个或多个(例如若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入该成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸。
这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入。保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
这些多肽的变体可以基于以成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的α-淀粉酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。在一个方面中，本发明涉及在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列的全长互补体杂交的多肽。
在另一个实施例中，本发明涉及一种多肽，该多肽与EQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或99％序列一致性。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞(细菌细胞)或真核细胞(如哺乳动物、昆虫、植物、真菌细胞)。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methodsin Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括：a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种宿主细胞，该宿主细胞包括编码可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多肽的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽的产生；并且(b)回收该多肽。
在一个优选的方面中，该细胞是曲霉属细胞，如臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在一种合适培养基中并且在允许该多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、进料分批发酵、或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。可替代地，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)的启动子(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年评(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)；或来自代谢库组织(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子；或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学(Science)244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。
目前根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术(Bio/Technology)10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。
组合物
本发明还涉及包含本发明的一种多肽的组合物。可以根据本领域已知的方法来制备此类多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。
该多肽组合物可以呈颗粒、微粒或粉末的形式。制备此类组合物的方法是本领域中熟知的。
该多肽组合物可以呈发酵液产物的形式。除本发明的多肽外，该发酵液产物将包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。该发酵液可以任选地经受一个或多个纯化(包括过滤)步骤，以除去或降低发酵过程中的再一个组分。
该多肽组合物可以另外包括一种酶，该酶选自下组，该组由以下各项组成：另一种α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)、植酸酶(E.C.3.1.2.28)和蛋白酶(E.C.3.4.)以及其组合(例如本发明的多肽和一种葡糖淀粉酶或本发明的多肽和一种葡糖淀粉酶和一种蛋白酶)。
在一个具体方面中，该多肽组合物另外包括一种葡糖淀粉酶。该多肽可以与商业葡糖淀粉酶(如由诺维信公司(Novozymes A/S)以SPIRIZYME FUEL供应的葡糖淀粉酶制剂)组合。该葡糖淀粉酶还可以来源于曲霉属的菌株(如黑曲霉)或来源于篮状菌属并且特别地来源于雷侧特纳斯篮状菌(Talaromyces leycettanus)(如在美国专利登记号32,153中所披露的葡糖淀粉酶)、杜邦篮状菌(Talaromyces duponti)和/或嗜热篮状菌(Talaromycesthermopiles)(如在美国专利号4,587,215中所披露的葡糖淀粉酶)并且更优选地来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的菌株。在一个方面中，该葡糖淀粉酶来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)菌株CBS 793.97和/或具有如披露于WO 99/28448中的SEQ ID NO:7的序列。在另一个方面中，该葡糖淀粉酶活性来源于栓菌属、优选瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株。另外的葡糖淀粉酶包括具有在WO 2006/069289中的SEQ IDNO:2的成熟多肽的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶还可以包括自大纹饰孢菌属(Pachykytospora)(优选纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)或保藏在DSMZ并给出号DSM 17105的大肠杆菌菌株的葡糖淀粉酶，并且包括具有WO 2006/069289中的SEQ IDNO:5的成熟多肽的成熟多肽的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。另外的葡糖淀粉酶包括与前述氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％同源的氨基酸序列的那些。
本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
用途
本发明还针对用于使用具有α-淀粉酶活性的多肽或其组合的方法。
本发明的多肽或组合物可以用于淀粉转换、淀粉至糖的转化和乙醇生产等中，例如液化和/或糖化一种糊化淀粉、颗粒状淀粉或部分糊化淀粉中。部分糊化的淀粉是一种在某种程度上被糊化的淀粉，即其中部分淀粉已不可逆地膨胀和糊化并且部分淀粉仍然以颗粒状状态存在。
本发明的多肽或组合物可以在用于在水性培养基中用本发明的多肽液化一种糊化淀粉、颗粒状淀粉或部分糊化的淀粉底物的方法中使用。
一种本发明的多肽的优选用途是在发酵方法中，以生产适合于通过发酵生物(优选酵母)转化为一种发酵产物的葡萄糖和/或麦芽糖。此类发酵方法包括用于生产燃料乙醇或饮用乙醇(可饮用的酒精)的方法、用于生产饮料的方法、用于生产以下各项所希望的有机化合物的方法：如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ内酯或异抗坏血酸钠；酮；氨基酸，如谷氨酸(单谷氨酸钠)，而且还有更复杂的化合物，如抗生素，如青霉素、四环素；酶；维生素，如核黄素、B12、β-胡萝卜素；激素，其难于合成地产生。
在一个优选的实施例中，本发明的多肽在包括发酵以从糊化淀粉中生产一种发酵产物(例如乙醇)的方法中使用。用于从糊化淀粉中通过发酵生产乙醇的此类方法包括：(i)用本发明的具有α-淀粉酶活性的多肽液化该糊化淀粉；(ii)糖化所获得的液化醪液；(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)中所获得的材料。任选地，该方法进一步包括回收该乙醇。糖化和发酵可以作为同时糖化和发酵方法(SSF方法)进行。
在另一个优选的实施例中，本发明的多肽在包括发酵以从未糊化(“生”)淀粉中生产一种发酵产物(例如乙醇)的方法中使用。用于从未糊化的含淀粉材料中通过发酵生产乙醇的此类方法包括：(i)将该未糊化淀粉与本发明的具有α-淀粉酶活性的多肽接触，以降解未糊化淀粉；(ii)糖化所获得的醪液；(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)中所获得的材料。任选地，该方法进一步包括回收该乙醇。糖化和发酵可以作为同时糖化和发酵方法(SSF方法)进行。
在本发明的方法中使用的含淀粉材料可以是任何含淀粉植物材料。优选的含淀粉材料选自下组，该组由以下各项组成：块茎、根和全谷物；以及其任何组合。在一个实施例中，该含淀粉材料是从谷物中获得。该含淀粉材料可以例如选自下组，该组由以下各项组成：玉米(玉蜀黍)、玉米穗(cob)、小麦、大麦、木薯、高梁、黑麦、高粱(milo)和马铃薯；或其任何组合。当该发酵产品是乙醇时，该含淀粉材料优选地是全谷物或至少主要是全谷物。该原材料还可以由以下项组成或包括以下项：来自淀粉加工的侧流。
在另外的实施例中，本发明的多肽还可以在以下各项中是有用的：通过用本发明的多肽处理纺织品织物或衣服的纺织品、织物或衣服脱浆中；在通过用本发明的多肽处理(并且任选地烘焙)面团来生产烘焙食品或面团中；作为一种成分用于通过用本发明的多肽处理造纸纸浆的洗涤剂和纸浆及纸张生产工艺中。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
α-淀粉酶活性的测定
1.Phadebas测定
将α-淀粉酶活性通过使用
Figure BDA0003020666960000331
片剂作为底物的方法测定。Phadebas片剂(
Figure BDA0003020666960000332
淀粉酶测试，由法玛西亚诊断(Pharmacia Diagnostic)供应)包含交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，其已与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。
对于每一单次测量，将一片剂悬浮于包含5ml 50mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mM CaCl2，用NaOH调节pH至感兴趣的值)的试管中。该测试在感兴趣的温度下在水浴中进行。将待测试的α-淀粉酶稀释在x ml的50mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液中。将1ml这个α-淀粉酶溶液添加到5ml 50mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液中。该淀粉通过α-淀粉酶水解给出可溶的蓝色片段。在620nm处用分光光度法测量所产生的蓝色溶液的吸光度，其是α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在10或15分钟的孵育(测试时间)后所测量的620nm吸光度是在620nm处在0.2到2.0吸光度单位的范围内。在这个吸光度范围内，在活性和吸光度之间有线性关系(朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律)。因此应调节酶的稀释以适合该标准。在指定的一组条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶将水解一定量的底物并会产生蓝色。将颜色强度在620nm处测量。在给定组的条件下，所测量的吸光度与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯的α-淀粉酶蛋白)成正比。
2.替代方法
通过使用PNP-G7底物的方法来确定α-淀粉酶活性。PNP-G7(它是对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷的缩写)是一种可以由内淀粉酶切割的一种嵌段寡聚糖。切割之后，可商购的试剂盒中所包括的α-葡萄糖苷酶降解该底物以释放游离的PNP分子，该PNP分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。包含PNP-G7底物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒可商购自罗氏公司(Roche)和其他公司。
为了制备试剂溶液，按照生产商的推荐将10ml的底物/缓冲溶液添加到50ml酶/缓冲溶液中。将20微升样品转移至96孔微量滴定板并且在25℃下孵育来进行该测定。添加200微升预平衡至25℃的试剂溶液。将该溶液混合并且预孵育1分钟并且在ELISA酶标仪中在OD405nm下在4分钟内每30秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的活性成正比例。
实例1
本发明的α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)是在生淀粉发酵测定中评价的并且与杂合α-淀粉酶(在WO 2006/069290描述为具有微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)催化结构域(SEQID NO:20)、黑曲霉接头(SEQ ID NO:72)和黑曲霉碳水化物结合结构域(SEQ ID NO:96))和土曲霉α-淀粉酶(在WO2010/091221中示为SEQ ID NO:2)两者相比较。
材料与方法
将大约405g黄色马齿型玉米(获得自谢尔罗克的鹰眼可再生能源公司(HawkeyeRenewables)，爱荷华州；内部研磨)添加至595g自来水中，并且将干固体(DS)水平确定为34.42％DS。将这个混合物用3ppm青霉素和1000ppm尿素进行补充。将该浆液用40％H2SO4调节至pH 4.5。将大约5g的这个浆液添加至15mL管中。向每个管中以0.0801mg EP/g DS加入纯化的DK193AMG(在WO 2006/069289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌(Trametescingulata)AMG)并且以0.0225mg EP/g DS加入α-淀粉酶。根据以下公式，实际酶剂量是基于每个管中的玉米浆液的精确重量：
Figure BDA0003020666960000351
将水添加至每个管中以使得总添加体积(酶+水)达到该醪液初始重量的2％。这个体积校正使得实验中的所有管达到相同的总百分比固体，从而使得处理之间的乙醇浓度直接可比。在酶和水添加后，将200μL的酵母繁殖物(0.024g弗曼迪斯乙醇红色酵母(Fermentis Ethanol Red yeast)，在32℃下在50mL过滤的液化玉米醪液和5.1μLSpirizyme Plus AMG中孵育过夜)添加至每个管中。
将管在一间经温度控制的房间中在32℃下进行孵育，并且每个处理进行6次重复发酵。将所有管在24和48小时进行涡旋。在24小时献出一个样品、48小时献出两个样品、并且70小时献出三个样品进行HPLC分析。该HPLC制备由以下各项组成：通过添加50μL的40％H2SO4终止反应，在1462xg下离心10min，并且通过0.45μm过滤器过滤。将样品储存在4℃。使用安捷伦(Agilent)TM1100HPLC系统与RI检测器相结合以确定乙醇和寡糖浓度。分离柱是BioRadTMAminex HPX-87H离子排斥柱(300mm x 7.8mm)。
在JMP(SAS,Cary,NC)中分析数据。基于F-检验(p<0.05)，去除异常值。用图基-克雷默HSD(Tukey-Kramer HSD)检验(p<0.05)将处理与对照相比较。
结果与讨论
如在表1所示，在这些实验条件下，本发明的α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)比杂合α-淀粉酶(WO 2006/069290)表现得更好，与杂合α-淀粉酶(WO2006/069290)相比，在70hr时间点处显示2.2％改善，并且还比土曲霉α-淀粉酶更好。
表1.
处理(70hr) 乙醇产率
发明(SEQ ID NO:2) 102.21％
WO 2006/069290的杂合α-淀粉酶 100.00％
土曲霉 96.68％
实例2
材料与方法
将大约405g黄色马齿型玉米(获得自谢尔罗克的鹰眼可再生能源公司(HawkeyeRenewables)，爱荷华州；内部研磨)添加至595g自来水中，并且将干固体(DS)水平确定为34.42％DS。将这个混合物用3ppm青霉素和1000ppm尿素进行补充。将该浆液用40％H2SO4调节至pH 4.5。将大约5g的这个浆液添加至15mL管中。向每个管中以0.0623mg EP/g DS加入纯化的DK193AMG并且以0.0175mg EP/g DS加入α-淀粉酶。根据以下公式，实际酶剂量是基于每个管中的玉米浆液的精确重量：
Figure BDA0003020666960000361
将水添加至每个管中以使得总添加体积(酶+水)达到该醪液初始重量的2％。这个体积校正使得实验中的所有管达到相同的总百分比固体，从而使得处理之间的乙醇浓度直接可比。在酶和水添加后，将200μL的酵母繁殖物(0.024g弗曼迪斯乙醇红色酵母(Fermentis Ethanol Red yeast)，在32℃下在50mL过滤的液化玉米醪液和5.1μLSpirizyme Plus AMG中孵育过夜)添加至每个管中。
将管在一间经温度控制的房间中在32℃下进行孵育，并且每个处理进行6次重复发酵。将所有管在24和48小时进行涡旋。在24小时献出一个样品、48小时献出两个样品、并且70小时献出三个样品进行HPLC分析。该HPLC制备由以下各项组成：通过添加50μL的40％H2SO4终止反应，在1462xg下离心10min，并且通过0.45μm过滤器过滤。将样品储存在4℃。使用安捷伦(Agilent)TM1100HPLC系统与RI检测器相结合以确定乙醇和寡糖浓度。分离柱是BioRadTMAminex HPX-87H离子排斥柱(300mm x 7.8mm)。
在JMP(SAS,Cary,NC)中分析数据。基于F-检验(p<0.05)，去除异常值。用图基-克雷默HSD(Tukey-Kramer HSD)检验(p<0.05)将处理与对照相比较。
结果与讨论
如在表2中所示，在这些实验条件下，本发明的α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)比土曲霉α-淀粉酶表现更好，在70hr时间点处显示1.5％改善。其他α-淀粉酶(SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6)也比土曲霉α-淀粉酶表现更好。
表2.
处理(70hr) 乙醇产率
发明(SEQ ID NO:2) 101.5％
发明(SEQ ID NO:4) 101.1％
发明(SEQ ID NO:6) 100.3％
土曲霉 100.0％
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Claims (20)

1.一种具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的成熟多肽的氨基酸序列的多肽；
(b)一种包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的成熟多肽具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽；
(c)一种由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列杂交；以及
(e)(a)、(b)或(c)的多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽是一种包括以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的成熟多肽具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
3.如权利要求1所述的多肽，该多肽是一种由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。
4.如权利要求1所述的多肽，一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列杂交。
5.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2的残基1-585或由SEQ ID NO:1编码的成熟多肽或由其组成。
6.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:4的残基1-622或由SEQ ID NO:3编码的成熟多肽或由其组成。
7.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:6的残基1-607或由SEQ ID NO:5编码的成熟多肽或由其组成。
8.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码如权利要求1-7中任一项所述的多肽。
9.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求8所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
10.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求8所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
11.一种产生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求10所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
12.用一种编码如权利要求1-7中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
13.一种产生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养如权利要求12所述的转基因植物或植物细胞；并且
(b)回收该多肽。
14.一种用于生产发酵产品的方法，该方法包括：
(a)用如权利要求1-7中任一项所述的多肽处理一种含淀粉材料；
(b)使用一种发酵生物发酵(a)的该材料，以生产一种发酵产品。
15.如权利要求14所述的方法，其中(a)包括(i)用如权利要求1-7中任一项所述的多肽液化该糊化淀粉，并且(ii)使用一种葡糖淀粉酶糖化所获得的液化醪液。
16.如权利要求14所述的方法，其中该发酵产品选自下组，该组由以下各项组成：燃料乙醇、便携式酒精、饮料、或有机化合物。
17.如权利要求14所述的方法，该方法包括回收该发酵产品。
18.一种用于生产发酵产品的方法，该方法包括：
(a)用一种如权利要求1-7中任一项所述的α-淀粉酶在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下处理一种含淀粉材料；并且
(b)使用一种发酵生物发酵该经处理的淀粉材料，以生产一种发酵产品。
19.如权利要求18所述的方法，其中步骤(a)和(b)是依序地或同时地进行。
20.如权利要求18所述的方法，其中该发酵产品是燃料乙醇。
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