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CN113249347B - 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产l-氨基酸的方法 Download PDF

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CN113249347B
CN113249347B CN202110794028.7A CN202110794028A CN113249347B CN 113249347 B CN113249347 B CN 113249347B CN 202110794028 A CN202110794028 A CN 202110794028A CN 113249347 B CN113249347 B CN 113249347B
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Abstract

本发明提供的丙酮酸脱氢酶突变体，其在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基础上，且其217位突变为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。所述突变体可以提高菌株L‑氨基酸的产量和转化率，且在提高产量的同时，没有抑制菌株的生长，为大规模生产L‑氨基酸提供了新的途径，具有较高的应用价值。

Description

丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产L-氨基酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丙酮酸脱氢酶的突变体，编码该突变体的多核苷酸，含有该突变体的宿主细胞，以及利用该突变体生产L-氨基酸的方法。
背景技术
丙酮酸脱氢酶多酶复合物（PDHC）是一组限速酶，在谷氨酸棒杆菌中，PDHC催化糖酵解过程产生的丙酮酸不可逆地氧化脱羧转化成乙酰辅酶A，将糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，是三羧酸循环的关键酶。PDHC由丙酮酸脱氢酶（E1p）、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（E2p）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3p）组成。酶具有无活性（磷酶化）和有活性（去磷酸化）两种形式，这一点与磷酸化酶不同。有多种别构调节剂调控二种酶形式的转换，并受激素活动影响。
其中，E1p酶由aceE基因编码。已有报道弱化AceE的表达可以提高棒杆菌L-氨基酸的产量。CN106715687A也报道了AceE 190-205位或415-440位的任一氨基酸突变可提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸的产量。目前，尚未有新的突变位点被报道。
发明内容
本发明根据对AceE结构预测的结果，对217位进行了饱和突变，发现部分突变体可显著宿主细胞L-赖氨酸的产量，在此基础上，完成本发明。
本发明的目的是提供一种新型的丙酮酸脱氢酶突变体，含有该突变体的宿主细胞，以及利用含有该突变体的宿主细胞生产L-赖氨酸的方法。
第一方面，本发明提供了一种新型的丙酮酸脱氢酶突变体，所述突变体为：
1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。
2）与SEQ ID NO:1同源性高于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的多肽，且在对应于SEQ ID NO:1的217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。
3）在SEQ ID NO:1所示多肽的两端添加、缺失一个或多个碱基，且在对应于SEQ IDNO:1的217位为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。优选地，在SEQ IDNO:1所示多肽的两端添加、缺失1、2、3、4、5、6个碱基。
第二方面，本发明提供了编码丙酮酸脱氢酶突变体的编码多核苷酸。
第三方面，本发明提供含所述的丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的表达盒。所述编码核苷酸与启动子可操作连接。
第四方面，本发明提供了含有丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的载体，尤其是表达载体。
第五方面，本发明提供了含有丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞包括但不限于埃希氏杆菌属(genus Escherichia)、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、普罗维登斯菌属(genusProvidencia)、肠道菌属(genus Enterobacteria)、沙门氏菌属(genus Salmonella)、链霉菌属(genus Streptomyces)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、短杆菌属(genusBrevibacterium)、棒状杆菌属（genus Corynebacterium）的微生物。可选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌。优选地，所述宿主细胞包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株。
第六方面，本发明提供所述的丙酮酸脱氢酶突变体或其编码核苷酸在生产L-氨基酸中的应用。优选地，所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸。
第七方面，本发明提供了一种生产L-氨基酸的方法，所述方法包括培养第五方面的宿主细胞使之生产L-氨基酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-氨基酸的步骤。
进一步地，所述L-氨基酸包括但不限于L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸；更优选地，所述L-氨基酸为L-赖氨酸。
本发明提供的丙酮酸脱氢酶突变体，可以提高菌株L-氨基酸的产量和转化率，且在提高产量的同时，没有抑制菌株的生长，为大规模生产L-氨基酸提供了新的策略。
具体实施方式
术语定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一（a）”或“一（an）”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然本发明的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
本发明的术语“丙酮酸脱氢酶”指的是组成丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDHC)的酶中的一种，其参与丙酮酸转变为乙酰辅酶A。如本文所使用，丙酮酸脱氢酶不被具体限制，只要其具有相应的活性，并且其可以是衍生自棒状杆菌属——具体地，谷氨酸棒状杆菌——的微生物的丙酮酸脱氢酶，但是不限于此。例如，丙酮酸脱氢酶可以是SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的氨基酸序列。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的E1p蛋白可以由具有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的aceE基因编码，但是不限于此。另外，如果氨基酸序列与上述序列具有同源性并且与SEQ ID NO:1的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性，则具有缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列也应当属于本公开内容的范围是显而易见的。在本公开内容中，编码丙酮酸脱氢酶的任何多核苷酸序列可以属于本公开内容的范围。例如，多核苷酸序列可以是与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少75％，具体地至少80％，更具体地85％，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％或更高的同源性的多核苷酸序列。另外，基于密码子简并性或考虑生物体表达蛋白质优选的密码子，编码蛋白质的多核苷酸序列可以在不改变从编码区表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内具有编码区上的各种变体。
本发明的丙酮酸脱氢酶突变体可以包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，在对应于SEQ ID NO:1的217位氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个的多肽。
此外，本发明的丙酮酸脱氢酶突变体不仅可以包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，还可以包括与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的丙酮酸脱氢酶突变体，只要它们在对应于EQ ID NO:1的217位氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个，且其活性与野生型的丙酮酸脱氢酶活性相比大幅度减弱。显而易见的是，与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽具有基本上相同或相应生物学活性的氨基酸序列也应当属于本发明内容的范围，本领域技术人员均知道在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的基础上进行1个到几个碱基的取代、缺失、添加和置换，可以得到与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽具有基本上相同或相应生物学活性的氨基酸序列。
本发明的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
具体地，本发明的丙酮酸脱氢酶突变体的编码多核苷酸包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，且在其649-651位突变的多核苷酸。此外，本发明的多核苷酸还包括与SEQ IDNO:2所示多核苷酸具有75％或更高，具体地80％或更高，更具体地85％或更高，并且甚至更具体地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、和99％或更高的同源性的任何多核苷酸。
本发明的术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。一个部分与另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易可获得的计算机程序直接排列两个多核苷酸分子或两个多肽分子的序列信息来测定。计算机程序的实例可以包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLCbio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc.)等。另外，多核苷酸之间的同源性可以通过如下步骤来测定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶分解，然后对分解的片段进行大小测定。
本发明的术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的丙酮酸脱氢酶是指氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽。
本发明的术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、插入和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。
在一些实施方式中，本发明的“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。
本发明的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本发明的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含 i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
本发明的术语“宿主细胞”是指包含本发明的丙酮酸脱氢酶突变体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本发明的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙（CaCl2）沉淀法、微注射法、聚乙二醇（PEG）法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够包含本发明的丙酮酸脱氢酶突变体的细胞即可。在一些实施方式中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸、有机酸、生物基材料或药物化合物的微生物，可以包括埃希氏杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、肠道菌属(Enterobacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等的菌株，但不限于此。可选地，可以是具谷氨酸棒状杆菌。作为优选地，可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067及其衍生菌株等。示例地，所述衍生菌株可以是任何菌株，只要该菌株具有生产L-氨基酸的能力。
示例地，宿主细胞为生产赖氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产赖氨酸的宿主细胞，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的衍生菌株。此外，生产赖氨酸的宿主细胞也可以是具有赖氨酸生产能力的其他种类的菌株。
在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a. 编码乙醇脱氢酶的adhE基因；
b. 编码乙酸激酶的ackA基因；
c. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
d. 编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；
e. 编码甲酸转运蛋白的focA基因；
f. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
g. 编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
h. 编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；
i. 编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
j. 编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；
h. 编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
在一些实施方式中，所述生产赖氨酸宿主细胞中还可以包括但不限于选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
b. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
c. 编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；
d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；
f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；
g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；
i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。
示例地，宿主细胞为生产苏氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞为在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶LysC的菌株。在另外一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞也可以是具有苏氨酸生产能力的其他种类的菌株。
在一些实施方式中，所述生产苏氨酸的宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a.编码苏氨酸操纵子的thrABC基因；
b.编码解除反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶的hom基因；
c.编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因；
d.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
e.编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因；
f.编码转酮酶的tkt基因；
g.编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因；
h.编码苏氨酸输出的thrE基因；
i.编码烯醇酶的eno基因。
示例地，宿主细胞为生产异亮氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞是通过用丙氨酸取代L-苏氨酸脱水酶ilvA基因第323位的氨基酸而产生L-异亮氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞也可以是具有异亮氨酸生产能力的其他种类的菌株。
示例地，宿主细胞为生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞是通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶失活而产生O-乙酰高丝氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞也可以是具有O-乙酰高丝氨酸生产能力的其他种类的菌株。
示例地，宿主细胞为生产蛋氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞是通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活而产生蛋氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞也可以是具有蛋氨酸生产能力的其他种类的菌株。
本发明的术语“L-氨基酸”指的是可以通过丙酮酸从不同碳源生产的所有L-氨基酸。更具体地，L-氨基酸可以包括L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸，并且甚至更具体地，L-赖氨酸或L-缬氨酸。
本发明的术语“培养”可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
除非在发明中另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例（虽然表示本发明的具体实施例）仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 （New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1. 编辑质粒pCas9gRNA-aceE217构建
本发明通过对AceE酶进行了深入分析，其中预测217位可能是影响其活性的位点，因此对该位点进行突变进行后续研究。随后，根据文献报道的Goldengate克隆方法(WANG,Yu, et al. Expanding targeting scope, editing window, and base transitioncapability of base editing in Corynebacterium glutamicum. Biotechnology andbioengineering, 2019，116：3016-3029)构建靶向aceE基因第217位氨基酸残基密码子的pCas9gRNA质粒，sgRNA的靶DNA结合区为CCAACTGTGTCCATGGGTCT。具体方法如下：将217-F/217-R进行变性退火，得到带有粘性末端的DNA双链产物，再与pCas9gRNA-ccdB质粒（参考CN112111469B）进行Goldengate克隆（NEB® Golden Gate组装试剂盒，#E1601），获得pCas9gRNA-aceE217质粒，该质粒表达Cas9蛋白和靶向定点突变区的sgRNA。上述质粒构建所用引物如表1所示。
本公开实施例中所用的引物见下表1：
Figure 173866DEST_PATH_IMAGE001
Figure 199591DEST_PATH_IMAGE002
Figure 620951DEST_PATH_IMAGE003
实施例2. 构建谷氨酸棒杆菌aceE基因第217位氨基酸密码子突变的突变体
由于野生型谷氨酸棒杆菌不能生产赖氨酸，而在谷氨酸棒杆菌引入lysC、pyc和hom的点突变之后都可以生产赖氨酸。本实施例以ATCC13032为出发菌株，首先构建一个产赖氨酸的菌株，即在谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株天冬氨酸激酶基因lysC引入了T311I点突变（解除酶的反馈抑制），在丙酮酸羧化激酶基因pyc引入P458S点突变（解除酶的反馈抑制），在高丝氨酸脱氢酶基因hom引入V59A点突变（弱化酶的活性），获得赖氨酸高产菌株AHP-3。
随后，利用基于单链重组的CRISPR/Cas9基因组编辑系统（基础质粒构建过程参考专利CN112111469A），对谷氨酸棒杆菌丙酮酸脱氢酶（aceE基因编码）217位点进行饱和突变。首先制备赖氨酸高产菌株AHP-3的感受态细胞，将重组辅助质粒pRecT质粒电转化至谷氨酸棒杆菌产L-赖氨酸菌株AHP-3，获得AHP-3-pRecT菌株。AHP-3-pRecT菌株采用文献报道的方法制备感受态细胞（Ruan Y, Zhu L, Li Q. Improving the electro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakening its cellwall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity. BiotechnolLett. 2015;37:2445-52.），得到AHP-3-pRecT感受态细胞。
为了对aceE基因217位的氨基酸位氨基酸密码子进行野生型以外的19种突变，设计了S217A、S217C、S217D、S217E、S217F、S217G、S217H、S217I、S217K、S217L、S217M、S217N、S217P、S217Q、S217R、S217T、S217V、S217W、S217Y的单链DNA（表1），用于突变体构建的重组模板。向上述制备获得的AHP-3-pRecT感受态细胞电转化1 μg pCas9gRNA-aceE217质粒和10 μg 的单链DNA，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布添加5 μg/mL 氯霉素、15 μg/mL卡那霉素和0.05 mM IPTG的TSB平板，培养2天，获得克隆。TSB培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01 mg/L；维生素B1，0.1 mg/L；MOPS，20 g/L。将上述获得的单克隆分别采用特异性引物S217-jd-F/aceE-jd-R（表1）进行菌落PCR鉴定，正确克隆进行测序确认，最终获得S217A、S217C、S217D、S217E、S217G、S217L、S217P、S217T和S217V 9种突变体，另外10种突变体未获得。
将上述获得的aceE基因第217位氨基酸密码子突变体菌株中的pRecT和pCas9gRNA-aceE217质粒丢失，具体过程如下：单克隆在无抗性的TSB液体培养基37℃过夜培养，再在无抗性的TSB固体培养基平板划单克隆，然后对长出的单克隆菌分别在3种固体平板（TSB+5 μg/mL氯霉素、TSB+15 μg/mL卡那霉素和TSB）上划线，30℃培养24 h，得到氯霉素和卡那霉素抗性平板不长，而TSB平板可以长的菌株，即为丢失两种质粒的突变菌株，分别命名为SCgL46至SCgL54，对应的突变体分别为S217A、S217C、S217D、S217E、S217G、S217L、S217P、S217T和S217V。
实施例3. 谷氨酸棒杆菌aceE基因217位突变对L-赖氨酸合成的影响
为了测试谷氨酸棒杆菌aceE基因第217位氨基酸突变对赖氨酸高产菌株产L-赖氨酸的影响，分别对SCgL46至SCgL54菌株进行发酵测试。以野生型AHP-3菌株作对照，发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；硫酸铵，20 g/L；尿素，5 g/L；KH2PO4，1 g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42 g/L；CaCl2，0.01 g/L；FeSO4·7H2O，0.01 g/L；MnSO4·H2O，0.01 g/L；ZnSO4·7H2O，0.001 g/L；CuSO4，0.0002 g/L；NiCl·6H2O，0.00002 g/L；MgSO4·7H2O，0.25 g/L；原儿茶酸，0.03 g/L；生物素，0.0002 g/L；维生素B1，0.0001 g/L；初始pH7.2。首先将菌株接种到TSB液体培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.1，30℃培养21 h，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测L-赖氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-赖氨酸的糖酸转化率。
结果如表2所示，突变体S217C、S217G、S217T和S217V的L-赖氨基酸产量都低于野生型对照菌株；而突变体S217A、S217D、S217E、S217L和S217P的L-赖氨基酸产量都高于野生型对照菌株。可见，这些氨基酸位点突变在L-赖氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。
表2
Figure 351010DEST_PATH_IMAGE004
。
序 列 表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 丙酮酸脱氢酶的突变体及其用于生产L-氨基酸的方法
<130> 2021-06-13
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 922
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum.
<400> 1
MADQAKLGGK PSDDSNFAMI RDGVASYLND SDPEETNEWM DSLDGLLQES SPERARYLML 60
RLLERASAKR VSLPPMTSTD YVNTIPTSME PEFPGDEEME KRYRRWIRWN AAIMVHRAQR 120
PGIGVGGHIS TYAGAAPLYE VGFNHFFRGK DHPGGGDQIF FQGHASPGMY ARAFMEGRLS 180
EDDLDGFRQE VSREQGGIPS YPHPHGMKDF WEFPTVSMGL GPMDAIYQAR FNRYLENRGI 240
KDTSDQHVWA FLGDGEMDEP ESRGLIQQAA LNNLDNLTFV VNCNLQRLDG PVRGNTKIIQ 300
ELESFFRGAG WSVIKVVWGR EWDELLEKDQ DGALVEIMNN TSDGDYQTFK ANDGAYVREH 360
FFGRDPRTAK LVENMTDEEI WKLPRGGHDY RKVYAAYKRA LETKDRPTVI LAHTIKGYGL 420
GHNFEGRNAT HQMKKLTLDD LKLFRDKQGI PITDEQLEKD PYLPPYYHPG EDAPEIKYMK 480
ERRAALGGYL PERRENYDPI QVPPLDKLRS VRKGSGKQQI ATTMATVRTF KELMRDKGLA 540
DRLVPIIPDE ARTFGLDSWF PTLKIYNPHG QNYVPVDHDL MLSYREAPEG QILHEGINEA 600
GSVASFIAAG TSYATHGKAM IPLYIFYSMF GFQRTGDSIW AAADQMARGF LLGATAGRTT 660
LTGEGLQHMD GHSPVLASTN EGVETYDPSF AYEIAHLVHR GIDRMYGPGK GEDVIYYITI 720
YNEPTPQPAE PEGLDVEGLH KGIYLYSRGE GTGHEANILA SGVGMQWALK AASILEADYG 780
VRANIYSATS WVNLARDGAA RNKAQLRNPG ADAGEAFVTT QLKQTSGPYV AVSDFSTDLP 840
NQIREWVPGD YTVLGADGFG FSDTRPAARR FFNIDAESIV VAVLNSLARE GKIDVSVAAQ 900
AAEKFKLDDP TSVSVDPNAP EE 922
<210> 2
<211> 2769
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum.
<400> 2
atggccgatc aagcaaaact tggtggcaag ccctcggatg actctaactt cgcgatgatc 60
cgcgatggcg tggcatctta tttgaacgac tcagatccgg aggagaccaa cgagtggatg 120
gattcactcg acggattact ccaggagtct tctccagaac gtgctcgtta cctcatgctt 180
cgtttgcttg agcgtgcatc tgcaaagcgc gtatctcttc ccccaatgac gtcaaccgac 240
tacgtcaaca ccattccaac ctctatggaa cctgaattcc caggcgatga ggaaatggag 300
aagcgttacc gtcgttggat tcgctggaac gcagccatca tggttcaccg cgctcagcga 360
ccaggcatcg gcgtcggcgg acacatttcc acttacgcag gcgcagcccc tctgtacgaa 420
gttggcttca accacttctt ccgcggcaag gatcacccag gcggcggcga ccagatcttc 480
ttccagggcc acgcatcacc aggtatgtac gcacgtgcat tcatggaggg tcgcctttct 540
gaagacgatc tcgatggctt ccgtcaggaa gtttcccgtg agcagggtgg cattccgtcc 600
taccctcacc cacacggtat gaaggacttc tgggagttcc caactgtgtc catgggtctt 660
ggcccaatgg atgccattta ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc 720
aaggacacct ctgaccagca cgtctgggcc ttccttggcg acggcgaaat ggacgagcca 780
gaatcacgtg gtctcatcca gcaggctgca ctgaacaacc tggacaacct gaccttcgtg 840
gttaactgca acctgcagcg tctcgacgga cctgtccgcg gtaacaccaa gatcatccag 900
gaactcgagt ccttcttccg tggcgcaggc tggtctgtga tcaaggttgt ttggggtcgc 960
gagtgggatg aacttctgga gaaggaccag gatggtgcac ttgttgagat catgaacaac 1020
acctccgatg gtgactacca gaccttcaag gctaacgacg gcgcatatgt tcgtgagcac 1080
ttcttcggac gtgacccacg caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc 1140
tggaagcttc cacgtggcgg ccacgattac cgcaaggttt acgcagccta caagcgagct 1200
cttgagacca aggatcgccc aaccgtcatc cttgctcaca ccattaaggg ctacggactc 1260
ggccacaact tcgaaggccg taacgcaacc caccagatga agaagctgac gcttgatgat 1320
ctgaagttgt tccgcgacaa gcagggcatc ccaatcaccg atgagcagct ggagaaggat 1380
ccttaccttc ctccttacta ccacccaggt gaagacgctc ctgaaatcaa gtacatgaag 1440
gaacgtcgcg cagcgctcgg tggctacctg ccagagcgtc gtgagaacta cgatccaatt 1500
caggttccac cactggataa gcttcgctct gtccgtaagg gctccggcaa gcagcagatc 1560
gctaccacca tggcgactgt tcgtaccttc aaggaactga tgcgcgataa gggcttggct 1620
gatcgccttg tcccaatcat tcctgatgag gcacgtacct tcggtcttga ctcttggttc 1680
ccaaccttga agatctacaa cccgcacggt cagaactacg tgcctgttga ccacgacctg 1740
atgctctcct accgtgaggc acctgaagga cagatcctgc acgaaggcat caacgaggct 1800
ggttccgtgg catcgttcat cgctgcgggt acctcctacg ccacccacgg caaggccatg 1860
attccgctgt acatcttcta ctcgatgttc ggattccagc gcaccggtga ctccatctgg 1920
gcagcagccg atcagatggc acgtggcttc ctcttgggcg ctaccgcagg tcgcaccacc 1980
ctgaccggtg aaggcctcca gcacatggat ggacactccc ctgtcttggc ttccaccaac 2040
gagggtgtcg agacctacga cccatccttt gcgtacgaga tcgcacacct ggttcaccgt 2100
ggcatcgacc gcatgtacgg cccaggcaag ggtgaagatg ttatctacta catcaccatc 2160
tacaacgagc caaccccaca gccagctgag ccagaaggac tggacgtaga aggcctgcac 2220
aagggcatct acctctactc ccgcggtgaa ggcaccggcc atgaggcaaa catcttggct 2280
tccggtgttg gtatgcagtg ggctctcaag gctgcatcca tccttgaggc tgactacgga 2340
gttcgtgcca acatttactc cgctacttct tgggttaact tggctcgcga tggcgctgct 2400
cgtaacaagg cacagctgcg caacccaggt gcagatgctg gcgaggcatt cgtaaccacc 2460
cagctgaagc agacctccgg cccatacgtt gcagtgtctg acttctccac tgatctgcca 2520
aaccagatcc gtgaatgggt cccaggcgac tacaccgttc tcggtgcaga tggcttcggt 2580
ttctctgata cccgcccagc tgctcgtcgc ttcttcaaca tcgacgctga gtccattgtt 2640
gttgcagtgc tgaactccct ggcacgcgaa ggcaagatcg acgtctccgt tgctgctcag 2700
gctgctgaga agttcaagtt ggatgatcct acgagtgttt ccgtagatcc aaacgctcct 2760
gaggaataa 2769
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcaccaact gtgtccatgg gtct 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaacagaccc atggacacag ttgg 24
<210> 5
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg gcaatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 6
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg tgcatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 7
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg gatatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 8
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg gaaatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 9
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg ttcatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 10
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg ggcatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 11
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg cacatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 12
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg atcatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg aagatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 14
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg ctgatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 15
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg atgatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 16
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg aacatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 17
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg ccaatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 18
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg cagatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 19
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg cgcatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 20
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg accatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 21
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg gtgatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 22
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg tggatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 23
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cccacacggt atgaaggact tctgggagtt cccaactgtg tacatgggtc ttggcccaat 60
ggatgccatt taccaggcac gtt 83
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gggagttccc aactgtggca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gggagttccc aactgtgtgc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gggagttccc aactgtggat 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gggagttccc aactgtggaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gggagttccc aactgtgttc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gggagttccc aactgtgggc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gggagttccc aactgtgcac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gggagttccc aactgtgatc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gggagttccc aactgtgaag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gggagttccc aactgtgctg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gggagttccc aactgtgatg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gggagttccc aactgtgaac 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gggagttccc aactgtgcca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gggagttccc aactgtgcag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gggagttccc aactgtgcgc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gggagttccc aactgtgacc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gggagttccc aactgtggtg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gggagttccc aactgtgtgg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gggagttccc aactgtgtac 20
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
caaggcgatc agccaagc 18
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ccaacctcta tggaacctga attcc 25

Claims (9)

1.一种丙酮酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在如SEQ ID NO:1基础上，第217位突变为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一个。
2.如权利要求1所述丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸。
3.含有如权利要求2所述的丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的表达盒。
4.含有如权利要求2所述的丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的载体。
5.含有如权利要求4所述的载体，其特征在于，是表达载体。
6.含有如权利要求2所述的丙酮酸脱氢酶突变体的编码核苷酸的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是谷氨酸棒状杆菌的微生物。
7.含有如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的出发菌株是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或者谷氨酸棒杆菌ATCC 14067。
8.如权利要求1所述的丙酮酸脱氢酶突变体或其编码核苷酸在生产L-氨基酸中的应用；其中，所述L-氨基酸选自L-赖氨酸。
9.一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，包括培养如权利要求6或7所述的宿主细胞使之生产L-氨基酸，进一步包括从培养基中分离提取或回收L-氨基酸的步骤；其中，所述L-氨基酸选自L-赖氨酸。
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