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CN113265337B - 一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用 - Google Patents

一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用 Download PDF

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CN113265337B CN202110670324.6A CN202110670324A CN113265337B CN 113265337 B CN113265337 B CN 113265337B CN 202110670324 A CN202110670324 A CN 202110670324A CN 113265337 B CN113265337 B CN 113265337B
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marine
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exopolysaccharide
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用，所述海洋杂色曲霉的保藏编号为GDMCC No:61106，其分类命名为Aspergillus versicolor SCAU141。本发明的海洋杂色曲霉分离培养方法易于操作，便于获取菌株，且其具有制备胞外多糖的能力，利用其制备胞外多糖方法简单，条件温和，所制得的胞外多糖具有显著的抗癌活性，对肺癌、肝癌、结肠腺癌等三种常见癌细胞的生长具有良好抑制效果，此外所制得的胞外多糖还具有良好的抑菌活性，尤其是对诺卡氏菌生长具有显著的抑制效果。因此，本发明中所制得的胞外多糖作为可抗癌和抑菌的微生态制剂，拥有良好的应用潜力和推广前景，可以为研发环境友好型海洋生物制剂提供科研参考依据。

Description

一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的，涉及一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用。
背景技术
如今，肿瘤是危及人类健康、生命安全的常见疾病之一。在科研和医疗领域，通常是采用一些化学药物被用于抑制癌细胞生长时，然而有部分癌症患者在使用化学药物后会产生耐药现象，致使抗癌效果降低。相比于化学药物，天然药物的毒副作用轻微、广谱、高效，因此有必要寻找和开发更多的天然药物来抑制癌细胞的生长。
当前发现的天然抗癌药物中，有一部分就是微生物的代谢产物，比如微生物胞外多糖，它是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物，对微生物的生长有重要意义。胞外多糖因具有安全无毒，理化性质独特，特异性优良的特别优势而得到大力研究和开发，一些研究表明胞外多糖还具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域，但由于目前微生物胞外多糖生产成本高、产量少等原因限制了其广泛的应用。
由于陆生微生物经过几十年的研发，发现新菌种和新的活性化合物的几率正在逐渐降低，因此在对具有生物活性的天然产物新来源的不断探索和研究过程中，海洋微生物因其数量多，能产生多种代谢产物，为了抵御海洋极端环境还能产生一些物质，因此认为海洋微生物能够弥补陆生微生物来源的不足。
而在海洋微生物中，海洋真菌正逐渐引起科研人员的广泛关注，海洋真菌种类很多，杂色曲霉就是其中之一。杂色曲霉的分生孢子头呈疏松的放射状，无色或者略黄。真菌作为生物界一个古老而重大的类群，在农业微生物、工业微生物以及医学微生物研究中占有重要地位。真菌在形态分化的同时伴随着复杂的生理变化和大量代谢产物的生成，从而使海洋真菌成为未来新天然药物开发的一大资源宝库。
综上所述，研发一株能产胞外多糖的海洋杂色曲霉及其分离培养方法实为必要。
发明内容
本发明所提供的一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用，主要用于解决目前一些化学药物被用于抗癌时，癌细胞容易出现耐药现象，而开发新的天然药物又存在来源不足的问题。本发明提供的海洋杂色曲霉具有产胞外多糖的能力，所得胞外多糖可以用于抑制包括肺癌、肝癌、结肠腺癌等多种癌细胞的生长，具有良好的开发和应用潜力。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一株可产胞外多糖的海洋杂色曲霉，其分离培养方法包括以下步骤：
S1.样品采集处理：采集南沙群岛石珊瑚(Scleractinia)3～5个样品，装入无菌无水的塑料袋中，在冷冻条件下尽快送到实验室，然后将石珊瑚样品用无菌海水冲洗三次，以除去松散附着的微生物，并取清洗后的样品15～20g，切成小块并用研钵研碎；
S2.样品接种：将步骤S1中研碎的样品加入体积比为2:1的无菌海水和无菌砂土中并混合均匀，制成的匀浆用无菌海水进行10倍稀释后，量取0.1mL并接种到预先准备的琼脂板上，此步骤设立3个平行组；
S3.菌株分离培养：将接种后的琼脂板置于25～29℃环境下培养5～14天，直至能区分出真菌的形态学特征，根据其生物学特性的差异，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到相应的培养基上，继续于25～29℃环境下培养，得到真菌菌株；
S4.菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITS DNA基因，根据ITS DNA基因序列在微生物种属中的保守性，将所得菌株的ITS DNA基因提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号，从而进行鉴定，该菌株的ITS DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示(详见本发明文件的核苷酸序列表)。
然后将所得菌株的ITS DNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现本发明中所得的菌株与Aspergillus versicolor(KX527869)的ITS序列的相似度为99％，进而通过MEGA软件并采用Neighbor-Joining法对所得菌株的ITSDNA序列构建系统进化树。经鉴定分析，在系统进化树中该菌株的序列与杂色曲霉(Aspergillus versicolor)聚为一簇，进而说明本发明分离培养得到的菌株为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)的一个新的菌株。因此，将本发明中所得的菌株命名为：Aspergillus versicolor SCAU141。
本发明所提供的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)菌株已于2020年7月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:61106。
本发明的另一个目的在于公开上述的海洋杂色曲霉的应用，所述海洋杂色曲霉用于制备胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：
①将海洋杂色曲霉菌株接种于液体培养基中，在25～29℃、120～150rpm条件下培养发酵5～10天，得到海洋杂色曲霉发酵液；
②将步骤①所得的海洋杂色曲霉发酵液过滤除去菌体，收集滤液，减压浓缩，在浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，得到的混合液在低温条件下放置过夜；
③将步骤②所得的混合液进行离心，弃去上清液，底部沉淀物用蒸馏水溶解后，再用二分之一体积的sevage溶液除去蛋白质，并用截留分子量为3500Da的透析袋透析至外界的蒸馏水导电率不变，将透析袋中截留的液体冻干，得到多糖粗提物；
④将步骤③中得到的多糖粗提物通过DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析分离和葡聚糖G-25凝胶柱纯化后，冻干，即得具有抗癌和抑菌活性的胞外多糖。
其中，上述步骤①中的液体培养基的组成为：麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、甘露醇20g/L、谷氨酸钠10g/L、七水硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1g/L、酵母膏3g/L以及海盐30g/L，所述液体培养基的pH值为7.5。
进一步优选的，所述步骤①中的发酵温度为28℃，发酵时间为7天。
本发明再一个目的在于公开所述海洋杂色曲霉制得的胞外多糖在抑制癌细胞活性中的应用，所述癌细胞包括肺癌细胞、肝癌细胞或者结肠腺癌细胞。
本发明又一个目的在于公开所述海洋杂色曲霉制得的胞外多糖在抑制病原菌生长中的应用，所述病原菌包括诺卡氏菌。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
1.本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)分离培养方法易于操作，便于获取菌株，其原材料采集来源广，具有良好的应用价值；
2.本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)具有产胞外多糖的能力，利用其制备胞外多糖方法简单，条件温和，易于实现，所制得的胞外多糖具有显著的抗癌活性，对肺癌、肝癌、结肠腺癌等三种常见癌细胞的生长具有良好抑制效果；
3.本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制备的胞外多糖还具有良好的抑菌活性，尤其是对诺卡氏菌生长具有显著的抑制效果，因此，本发明中所制得的胞外多糖作为可抗癌和抑菌的微生态制剂，拥有良好的应用潜力和推广前景，可以为研发环境友好型海洋生物制剂提供科研参考依据。
附图说明
图1为基于本发明的海洋杂色曲霉的ITS DNA序列构建的系统进化树；
图2为本发明中制得的胞外多糖的的DEAE Fast Flow洗脱曲线；
图3为本发明中制得的胞外多糖的的G-25葡聚糖凝胶柱洗脱曲线；
图4为本发明中制得的胞外多糖的高效凝胶渗透色谱图；
图5为本发明中制得的胞外多糖的单糖组成离子色谱图；
图6为本发明中制得的胞外多糖的混标5ppm的离子色谱图；
图7为本发明中制得的胞外多糖的核磁共振氢谱、碳谱图；
图8为本发明中制得的胞外多糖的傅里叶变换红外光谱图；
图9为本发明中制得的胞外多糖对肺癌A549细胞的生长抑制实验结果图；
图10为本发明中制得的胞外多糖对肝癌Hep-G2细胞的生长抑制实验结果图；
图11为本发明中制得的胞外多糖对结肠癌HT-29细胞的生长抑制实验结果图；
图12为本发明中制得的胞外多糖的抑菌实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明而并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响，并且任何人在本发明权利要求范围内所做的修改仍在本发明权利要求保护范围之内。因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的材料、试剂等均为市售商品。
本发明的具体实施方式中，所用主要仪器和试剂/材料如表1和表2所示。
表1主要仪器
实验仪器 型号 生产厂家
高速冷冻离心机 Sorvall<sup>TM</sup>LYNX 美国贝克曼库尔特公司
冷冻干燥机 Scientz-30N Thermo Fisher Scientific
高效液相色谱泵 LC-10A Shimadzu
大型旋转蒸发仪 N-3010 日本东京理化
立式压力蒸汽灭菌锅 YXQ—30SII 上海博讯实业有限公司
离子色谱仪 ICS5000 Thermo Fisher
二氧化碳细胞培养箱 311 Thermo Fisher Scientific
傅立叶变换红外 Vector 33 德国Bruker公司
核磁共振波谱仪 Avance NEO 600W1z 瑞士Bruker Biospin AG公司
酶标仪 3020-707 Thermo Varioskan LUX
表2主要试剂/材料
Figure GDA0003164009850000061
实施例1：
通过本发明提供的方法分离培养海洋杂色曲霉菌株，具体操作步骤如下：
S1.样品采集处理：采集南沙群岛石珊瑚(Scleractinia)3～5个样品，装入无菌无水的塑料袋中，在冷冻条件下尽快送到实验室，然后将石珊瑚样品用无菌海水冲洗三次，以除去松散附着的微生物，并取清洗后的样品15～20g，切成体积约为1cm3的小块，并用研钵研碎；
S2.样品接种：将步骤S1中研碎的样品加入体积比为2:1的无菌海水和无菌砂土中并混合均匀，制成的匀浆用无菌海水进行10倍稀释后，量取0.1mL并接种到预先准备的琼脂板上，此步骤设立3个平行组；
S3.菌株分离培养：将接种后的琼脂板置于28℃环境下培养5～14天，直至能区分出真菌的形态学特征，根据其生物学特性的差异，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到相应的培养基上，继续于28℃环境下培养，得到真菌菌株；
S4.菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITS DNA基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；
根据ITS DNA基因序列在微生物种属中的保守性，把所得菌株的ITS DNA基因提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号，进而进行鉴定，该菌株的ITS DNA基因序列如SEQ IDNO.1所示(详见本发明附件的核苷酸序列表)。
然后将所得菌株的ITS DNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现本发明中所得的菌株与Aspergillus versicolor(KX527869)的ITS序列的相似度为99％，进而通过MEGA软件并采用Neighbor-Joining法对所得菌株的ITS DNA序列构建系统进化树，所得系统进化树如图1所示。
由图1分析可见，在系统进化树中该菌株的序列与杂色曲霉(Aspergillusversicolor)聚为一簇，进而说明本发明分离培养得到的菌株为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)的一个新的菌株。因此，将本发明中所得的菌株命名为：Aspergillusversicolor SCAU141。
实施例2：
通过本发明实施例1分离培养的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolorSCAU141)来制备胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：
①将海洋杂色曲霉菌株接种于液体培养基中(所用液体培养基的组成为：麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、甘露醇20g/L、谷氨酸钠10g/L、七水硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1g/L、酵母膏3g/L以及海盐30g/L，pH值为7.5)，在28℃、130rpm条件下培养发酵7天，得到海洋杂色曲霉发酵液；
②将步骤①所得的海洋杂色曲霉发酵液过滤除去菌体，收集滤液，减压浓缩，在浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，得到的混合液在低温条件下放置过夜；
③将步骤②所得的混合液进行离心，弃去上清液，底部沉淀物用蒸馏水溶解后，再用二分之一体积的sevage溶液除去蛋白质，并用截留分子量为3500Da的透析袋透析至外界的蒸馏水导电率不变，将透析袋中截留的液体冻干，得到多糖粗提物；
④将步骤③中得到的多糖粗提物通过DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析分离，每10mL为一个组分，再经过葡聚糖G-25凝胶柱纯化，每5mL一管，用苯酚硫酸法做多糖洗脱曲线(如图2～3所示)，产物冻干后，即得具有抗癌和抑菌活性的胞外多糖纯品。
为鉴定本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)所制备的胞外多糖的成分和结构，特对本发明实施例2制备的胞外多糖进行相对分子量、单糖组成、分子结构、特征基团进行测定和分析，各自对应的测定或分析方法如下：
1.相对分子量的测定：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对胞外多糖的分子量和纯度进行测定。精确称取胞外多糖样品和葡聚糖标准品，将胞外多糖样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm转速下离心10min，所得上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。
色谱分析的条件为：色谱柱采用BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相采用0.05M NaCl溶液，流速为0.6ml/min，柱温为40℃；进样量为20μl；检测器采用示差检测器RI-10A。得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1877x+12.021 R2＝0.9971；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.2001x+12.602 R2＝0.9947；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1856x+11.858 R2＝0.9941；
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出胞外多糖样品的相对分子量。
通过高效凝胶渗透色谱法测定分析结果分别如图4和表3所示，可见胞外多糖样品在44min左右出现信号峰，对应重均分子量为5135大小的化合物。
表3胞外多糖分子量测定结果
RT(min) lgMp lgMw lgMn Mp Mw Mn
44.435 3.7 3.7 3.6 4792 5135 4082
2.单糖组成的测定：通过离子色谱仪测定胞外多糖的单糖组成。基于糖类分子具有电化学活性及在强碱溶液中呈离子化状态，且糖类化合物为pKa＞11的弱酸，在高pH值的淋洗液中，它们会部分或全部以阴离子形式存在，根据不同糖类化合物的pKa的差异引起的离子交换作用的差异以及某些糖类与阴离子交换树脂之间的疏水性作用的不同，实现糖类化合物的高效阴离子交换分离，然后对糖分子结构中的羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电流实现检测。
具体测定方法为：取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液。取各单糖标准溶液精密配置5mg/L梯度浓度标准品作为Standard。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。精密称量10mg样品置于安瓿瓶中，加入3M TFA 10ml，120℃水解3h；准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取100uL加入900uL去离子水，12000rpm转速下离心5min，取上清进IC分析。
色谱柱采用DionexCarbopacTMPA20(3*150)；
流动相：A:H2O；B:15mM NaOH；C:15mM NaOH&100mM NaOAC；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；
检测器：电化学检测器；
混标溶剂峰：2.0min为氢氧化钠的峰，40min为乙酸钠的峰。
离子色谱分析结果如图5～6所示，可见在17min有峰出现，与标样对比发现，本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制备的胞外多糖是由葡萄糖这种单糖聚合成的大分子化合物。
3.胞外多糖的结构解析：采用核磁共振法测定分析胞外多糖的分子结构，用600μL氘水溶解多糖，放入负80度冰箱预冻24h，放入冻干机冻干后，再用600μL氘水溶解后转移到核磁管中，进行检测，结果如图7所示。
由图7所示，1H NMR(600MHz,D2O)δ5.70–5.18(m,3H)，4.98(dd,J＝11.9,7.7Hz,1H)，5.12–2.68(m,43H)，4.29–3.68(m,16H)，5.05–2.68(m,43H)，4.30–3.10(m,23H)，4.21–3.10(m,23H)，3.67–3.42(m,6H)。H谱有八个信号峰，1H NMR中化学位移在δ3.5-5.5ppm范围内通常为异头氢的信号，α构型糖的异头氢的化学位移一般大于5.0ppm，而β构型糖的一般小于5.0ppm。NMR结果显示该胞外多糖中既含有α构型糖残基也含有β构型糖残基。13C NMR中化学位移在δ95.0-110ppm范围内通常为异头碳的信号，从图7中可看到有八个信号峰。
4.特征基团的鉴定：通过红外光谱(FT-IR)在4000～400cm-1范围内对胞外多糖进行扫描，可以得到丰富的分子结构信息，从而能判断胞外多糖中的官能团、吡喃型或呋喃型单糖、α或β构型等。
具体测定方法为：精确称取100mg KBr粉末，充分研磨后用压片机压至透明片状，用傅立叶变换红外光谱仪在400～4000cm-1范围内扫描作为空白背景。称取干燥的胞外多糖样品1.3mg，加入100mg干燥的KBr粉末中混合均匀并研磨压片，用傅里叶变换红外光谱仪于4000～400cm-1范围内进行红外光谱分析，结果如图8所示。
由图8可见，β-D构型葡萄糖在767±8cm-1有吸收峰，α-(1→4)连接的葡聚糖在930cm-1左右有吸收峰，α构型多糖在844±8cm-1处有吸收峰，呋喃糖在850±6cm-1处有特征吸收峰，呋喃糖在1100～1010cm-1之间有两处吸收峰；2930cm-1处为CH2伸缩振动吸收峰。由此可见，本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制备的胞外多糖具有典型的多糖结构。
实验例1：
为验证本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制得的胞外多糖的抗癌效果，特以实施例2所制得的胞外多糖进行癌细胞生长抑制实验，为体现实验结果，胞外多糖的抑癌活性以发光法测得细胞ATP的吸光度为表征，因为ATP细胞活力测试液在96孔板中能灵敏地线性定量培养物中50至50000个活细胞，是一种快速有效且准确的检测方法。
胞外多糖的抑癌实验分别以肺癌A549细胞、肝癌Hep-G2细胞、结肠癌HT-29细胞为实验对象，实验方法如下：
1.实验中所用癌细胞的培养条件：
①肺癌A549细胞系的培养基：89％高糖DMEM+10％FBS+1％双抗；
②肝癌Hep-G2细胞系的培养基：89％MEM+10％FBS+1％双抗；
③结肠癌HT-29细胞系的培养基：89％高糖DMEM+10％FBS+1％双抗；
2.癌细胞生长抑制实验共设立3个实验组，分别为：
①实验组1：海洋杂色曲霉胞外多糖对人类肺癌A549细胞的生长抑制实验；
②实验组2：海洋杂色曲霉胞外多糖对人类肝癌Hep-G2细胞的生长抑制实验；
③实验组3：海洋杂色曲霉胞外多糖对人类结肠癌HT-29细胞的生长抑制实验。
实验步骤：各实验组均采用96孔板为实验基板，然后在各实验组的96孔板中每孔添加100微升培养基和相应的3×103癌细胞，铺板48小时后，在培养基中加入胞外多糖，胞外多糖作用于受试癌细胞24h后，采用与完全培养基等体积的ATP检测试剂测试癌细胞活力，振荡2min后静置10min，用酶标仪检测化学发光值，各组的实验结果分别如图9～11所示。
由图9～11可见，本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制得的胞外多糖具有抑制癌细胞生长的特征，对3种常见癌症细胞(包括人类肺癌细胞、人类肝癌细胞、人类结肠癌细胞)均能产生明显的抑制作用，尤其通过实验组1的结果可见，所制得的胞外多糖对肺癌A549细胞的抑制效果最为明显，且IC50值为1.877mg/mL。因此，本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制得的胞外多糖作为可抗癌的微生态制剂，拥有良好的应用潜力和推广前景。
实验例2：
为进一步验证本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制得的胞外多糖的抑菌效果，特以诺卡氏菌为实验对象，对所制得的胞外多糖进行抑菌实验。
诺卡氏菌(Nocardia)在分类学上属于细菌域(Bacteria)，厚壁菌门(Firmicutes)放线菌纲(Actinomycetales)，诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，诺卡氏菌属(Nocardia)。诺卡氏菌是一种抗酸性或部分抗酸、兼性厌氧菌的革兰氏阳性菌，是一种人畜共患致病菌，特征为组织化脓、坏死或形成脓肿，能够感染人类、马、牛、猪、猫、狗、鼠和鱼等。由于现今在养殖和疾病治疗方面抗生素的使用广泛，而耐药菌的感染以及抗生素残留也危害着人类和动物健康，在经济上造成巨大损失，且多种抗生素如青霉素、复方新诺明、恩诺沙星等都对诺卡氏菌无抑菌效果。
胞外多糖的抑菌实验具体实施方法如下：
1.抑菌实验设置实验组和对照组1～3，各组的实验条件如下：
①实验组：采用本发明实施例2制得的胞外多糖作为抑菌药物；
②对照组1：采用复方新诺明(抗生素)作为抑菌药物；
③对照组2：采用恩诺沙星(抗生素)作为抑菌药物；
④对照组3：采用青霉素(抗生素)作为抑菌药物；
且实验组和对照组1～3各设置两个平行组。
2.实验方法：
①使用打孔器将定量滤纸做成直径为0.5mm的纸片，灭菌待用；
②用DMSO或无菌水配制抑菌药液，并以步骤①制作的纸片为基材，制作载药量为25μg的药敏纸片，待药敏纸片完全干燥后，放入灭菌离心管中备用；
③配制一定浓度的诺卡氏菌菌液，然后取1mL菌液加入到TSB琼脂培养基中，摇匀，倒板；
④静置1h，待平板凝固后用已灭菌的镊子取出事先准备好的药敏纸片，稍微按压药敏纸片使之与培养基充分紧贴；
⑤诺卡氏菌生长缓慢，放置药敏纸片后，在24～33℃条件下培养，每隔24h观察平板直至有抑菌圈出现，测量并记录抑菌圈直径。
实验组和对照组1～3的抑菌实验结果如图12所示，可见载有胞外多糖的药敏纸片周围产生8.5mm的抑菌圈，而载有青霉素、复方新诺明、恩诺沙星等抗生素的药敏纸片周围均未产生抑菌圈，从而说明本发明的海洋杂色曲霉(Aspergillus versicolor SCAU141)制得的胞外多糖具有抑制诺卡氏菌生长的特性，该胞外多糖作为可抑菌的微生态制剂，拥有良好的应用潜力和推广前景。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施例予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株海洋杂色曲霉及其分离培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctttctgga gtgagggctg cctccgggcg cccacctccc cccgtgaata cctaacactg 60
ttgcttcggc ggggaacccc ctcgggggcg agccgccggg gactactgaa cttcatgcct 120
gagagtgatg cagtctgagt ctgaatataa aatcagtcaa aactttcaac aatggatctc 180
ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg aactgcgata agtaatgtga attgcagaat 240
tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca ttgcgccccc tggcattccg gggggcatgc 300
ctgtccgagc gtcattgctg cccatcaagc ccggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccccc 360
ccgggggacg ggcccgaaag gcagcggcgg caccgtgtcc ggtcctcgag cgtatggggc 420
tttgtcaccc gctcgactag ggccggccgg gcgccagccg acgtctccaa ccatttttct 480
tcaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga 540
ggaa 544

Claims (5)

1.一株海洋杂色曲霉（Aspergillus versicolor）的胞外多糖在制备抑制诺卡氏菌的试剂中的应用，其特征在于，所述海洋杂色曲霉的保藏编号为GDMCC No:61106，其分类命名为Aspergillus versicolor SCAU141；
Aspergillus versicolor SCAU141的分离培养方法，包括以下步骤：
S1 .样品采集处理：采集石珊瑚样品，装入无菌无水的塑料袋中，在冷冻条件下送到实验室，然后将石珊瑚样品用无菌海水冲洗，以除去松散附着的微生物，并取适量清洗后的样品，切小块并研碎；
S2 .样品接种：将步骤S1中研碎的样品加入体积比为2:1的无菌海水和无菌砂土中并混合均匀，制成的匀浆用无菌海水进行10倍稀释后，量取适量并接种到琼脂板上；
S3 .菌株分离培养：将接种后的琼脂板置于25～29℃环境下培养5～14天，直至能区分出真菌的形态学特征，根据其生物学特性的差异，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到相应的培养基上，继续于25～29℃环境下培养，得到海洋杂色曲霉菌株；
S4 .菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITSDNA基因，对PCR产物纯化并测序，然后根据ITSDNA基因序列对菌株进行鉴定；
Aspergillus versicolor SCAU141海洋杂色曲霉用于制备胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：
①将海洋杂色曲霉菌株接种于液体培养基中，在25～29℃、120～150rpm条件下培养发酵5～10天，得到海洋杂色曲霉发酵液；
②将步骤①所得的海洋杂色曲霉发酵液过滤除去菌体，收集滤液，减压浓缩，在浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，得到的混合液在低温条件下放置过夜；
③将步骤②所得的混合液进行离心，弃去上清液，底部沉淀物用蒸馏水溶解后，采用sevage方法除去溶液中的蛋白质，并用透析袋透析至外界的蒸馏水导电率不变，将透析袋中截留物冻干，得到多糖粗提物；
④将步骤③中得到的多糖粗提物通过DEAE FastFlow阴离子交换柱层析分离和葡聚糖G-25凝胶柱纯化后，冻干，即得具有活性的胞外多糖；
Aspergillus versicolor SCAU141海洋杂色曲霉制得的胞外多糖在抑制病原菌生长中的应用；所述病原菌为诺卡氏菌。
2.根据权利要求1所述的海洋杂色曲霉的胞外多糖在抑制诺卡氏菌的应用，其特征在于，所述海洋杂色曲霉的ITSDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的海洋杂色曲霉的胞外多糖在抑制诺卡氏菌的应用，其特征在于，所述步骤①中的液体培养基的组成为：麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、甘露醇20g/L、谷氨酸钠10g/L、七水硫酸镁0.3g/ L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1g/L、酵母膏3g/L以及海盐30g/L，所述液体培养基的pH值为 7.5。
4.根据权利要求1所述的海洋杂色曲霉的胞外多糖在抑制诺卡氏菌的应用，其特征在于，所述步骤①中的发酵温度为28℃，发酵时间为7天。
5.一株海洋杂色曲霉（Aspergillus versicolor）的胞外多糖在制备抑制肺癌细胞生长的试剂中的应用，其特征在于，所述海洋杂色曲霉的保藏编号为GDMCC No:61106，其分类命名为Aspergillus versicolor SCAU141；
Aspergillus versicolor SCAU141的分离培养方法，包括以下步骤：
S1 .样品采集处理：采集石珊瑚样品，装入无菌无水的塑料袋中，在冷冻条件下送到实验室，然后将石珊瑚样品用无菌海水冲洗，以除去松散附着的微生物，并取适量清洗后的样品，切小块并研碎；
S2 .样品接种：将步骤S1中研碎的样品加入体积比为2:1的无菌海水和无菌砂土中并混合均匀，制成的匀浆用无菌海水进行10倍稀释后，量取适量并接种到琼脂板上；
S3 .菌株分离培养：将接种后的琼脂板置于25～29℃环境下培养5～14天，直至能区分出真菌的形态学特征，根据其生物学特性的差异，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到相应的培养基上，继续于25～29℃环境下培养，得到海洋杂色曲霉菌株；
S4 .菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITSDNA基因，对PCR产物纯化并测序，然后根据ITSDNA基因序列对菌株进行鉴定；
Aspergillus versicolor SCAU141海洋杂色曲霉用于制备胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：
①将海洋杂色曲霉菌株接种于液体培养基中，在25～29℃、120～150rpm条件下培养发酵5～10天，得到海洋杂色曲霉发酵液；
②将步骤①所得的海洋杂色曲霉发酵液过滤除去菌体，收集滤液，减压浓缩，在浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，得到的混合液在低温条件下放置过夜；
③将步骤②所得的混合液进行离心，弃去上清液，底部沉淀物用蒸馏水溶解后，采用sevage方法除去溶液中的蛋白质，并用透析袋透析至外界的蒸馏水导电率不变，将透析袋中截留物冻干，得到多糖粗提物；
④将步骤③中得到的多糖粗提物通过DEAE FastFlow阴离子交换柱层析分离和葡聚糖G-25凝胶柱纯化后，冻干，即得具有活性的胞外多糖。
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