CN113283353B - 一种基于显微图像的类器官细胞计数方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于显微图像的类器官细胞计数方法及系统。该方法包括：采用光学显微镜将每个待计数类器官的孔板划分成多个视野区域进行扫描拍照；将同一孔板的所有类器官图像拼接成一张全景图；确定所有全景图中符合要求的类器官，然后计算每个类器官的宽度、高度、平均灰度信息，通过获得的每个类器官的宽度、高度、平均灰度和质量评估结果这四个参数构建四元组；将人工计算值和类器官属性信息输入深度学习模型进行迭代训练，构建两层全连接网络M，构建网络的损失函数δ，将获得的损失函数和迭代训练获得的细胞数预测模型送入GPU中再次进行迭代训练，直至损失函数δ小于给定阈值停止训练；利用训练好的深度学习模型对类器官进行自动细胞计数。

Description

一种基于显微图像的类器官细胞计数方法及系统

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于显微图像的类器官细胞计数方法及系统。

背景技术

类器官(Organoid)是在体外用3D培养技术对干细胞或器官祖细胞进行诱导分化形成的在结构和功能上都类似目标器官或组织的三维细胞复合体，其具有稳定的表型和遗传学特征，能够在体外长期培养，它在形成过程中再现了体内器官发生的两个事件，即同类细胞以黏附的方式分类聚集和空间特异性的细胞谱系定型。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧密的细胞间生物通信，细胞间相互影响、诱导、反馈，协作发育并形成具有功能的迷你器官或组织，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

细胞计数是细胞培养过程中最常见也是最基本的质控方法和评价手段。然而，现有的细胞计数方法都是基于细胞均匀分布于待测细胞悬液中，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。这些细胞计数方法的前提是需要将细胞分散均匀，而类器官是三维细胞复合体，大小不均一，且类器官附着生长于基质胶内，无法在不破坏类器官结构的情况下取样分析。因此，当前细胞计数方法不适用于类器官的细胞计数，也暂无其它用于类器官细胞计数的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种基于显微图像的类器官细胞计数方法及系统。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种基于显微图像的类器官细胞计数方法，包括以下步骤：

步骤1，采用光学显微镜将每个待计数类器官的孔板划分成多个视野区域进行扫描拍照；

步骤2，将同一孔板的所有类器官图像拼接成一张全景图，进而获得若干张全景图，用1、2、3、……i对这些全景图进行编号；

步骤3，确定所有全景图中符合要求的类器官，并为每个类器官编号，依次用X_i,1、X_i,2、X_i,3、......X_i,t表示，然后计算每个类器官的宽度、高度、平均灰度信息，其中宽度信息表示为

高度信息表示为

平均灰度信息表示为

进一步对每个类器官进行质量评估，质量评估结果表示为

通过获得的每个类器官的宽度、高度、平均灰度和质量评估结果这四个参数构建四元组

该四元组表示每一个类器官的属性信息；

步骤4，将人工计算值和类器官属性信息输入深度学习模型进行迭代训练，构建两层全连接网络M，将图像中所有表示类器官的四元组(F_i,t)送入网络M并输入每个类器官的预测值(Y’_i,t)，Y’_i,t由四元组(F_i,t)加权所得，四项加权系数分别为w₁、w₂、w₃、w₄，计算值作为标签(Y_i)，构建网络的损失函数δ，δ的计算公式如式I～III所示：

δ＝||Y_i-Y′_i||²，I

式II中，Y’_i表示每张全景图中所有类器官细胞数预测值；式III中，w₁、w₂、w₃、w₄为加权系数；

步骤5，将获得的损失函数和迭代训练获得的细胞数预测模型送入图形处理器(GPU)中再次进行迭代训练，直至损失函数δ小于给定阈值停止训练；

步骤6，利用训练好的深度学习模型对类器官进行自动细胞计数。

进一步地，所述人工计算值通过细胞计数仪获得。

第二个方面，本发明提供一种基于显微图像的类器官细胞计数系统，包括：

显微图像获取装置，用于获取同一孔板中类器官的所有显微图像，并将同一孔板中类器官的所有显微图像拼接成全景图；

类器官细胞计数装置，与所述显微图像获取装置连接，所述类器官细胞计数装置包括类器官属性信息提取模块、类器官目标检测模块和计算模块；

所述类器官属性信息提取模块用于将所述全景图中满足条件的类器官进行属性信息提取；

所述类器官目标检测模块用于通过人工计算值和类器官属性信息训练类器官细胞计数模型及构建网络损失函数δ；

所述计算模块在基于所述类器官细胞计数模型的基础上对获取的显微图像中的类器官进行细胞计数；

通讯装置，用于将所述显微图像获取装置和所述类器官细胞计数装置通讯连接。

第三个方面，本发明提供上述类器官细胞计数方法及类器官细胞计数系统在类器官培养中的应用。

第四个方面，本发明提供一种类器官培养方法，包括以下步骤：

获取待培养组织；

采用本领域常规方法培养类器官；

培养过程中采用上述类器官细胞计数方法及类器官细胞计数系统进行类器官细胞计数。

本发明的有益效果为：本发明以可以直观反映类器官生长状态的影像为数据，直接快速便捷的获得显微图像中细胞数量，可为后续抗肿瘤药物筛选进行细胞数量归一化处理，减小因为细胞数量差异导致的误差；同时节约人力物力与时间成本，不会对计数类器官进行任何影响，有望成为类器官计数评价的质控标准。

附图说明

图1为本发明的基于显微图像的类器官细胞计数系统的操作原理图。

图2为本发明实施例1的类器官全景图。

图3为本发明实施例2的类器官全景图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明具体实施例提供一种基于显微图像的类器官细胞计数方法，包括以下步骤：

步骤1，采用光学显微镜将每个待计数类器官的孔板划分成多个视野区域进行扫描拍照；

步骤2，将同一孔板的所有类器官图像拼接成一张全景图，进而获得若干张全景图，用1、2、3、……i对这些全景图进行编号；

步骤3，确定所有全景图中符合要求的类器官，并为每个类器官编号，依次用X_i,1、X_i,2、X_i,3、......X_i,t表示，然后计算每个类器官的宽度、高度、平均灰度信息，其中宽度信息表示为

高度信息表示为

平均灰度信息表示为

进一步对每个类器官进行质量评估，质量评估结果表示为

通过获得的每个类器官的宽度、高度、平均灰度和质量评估结果这四个参数构建四元组

该四元组表示每一个类器官的属性信息；

步骤4，将通过细胞计数仪获得的人工计算值和类器官属性信息输入深度学习模型进行迭代训练，构建两层全连接网络M，将图像中所有表示类器官的四元组(F_i,t)送入网络M并输入每个类器官的预测值(Y’_i,t)，同时将人工计算值作为标签(Y_i)，构建网络的损失函数δ，δ的计算公式如式I和II所示：

δ＝||Y_i-Y′_i||²，I

式II中，Y’_i表示每张全景图中所有类器官细胞数预测值；式III中，w₁、w₂、w₃、w₄为加权系数。

步骤5，将获得的损失函数和迭代训练获得的细胞数预测模型送入图形处理器(GPU)中再次进行迭代训练，直至损失函数δ小于给定阈值停止训练；

步骤6，利用训练好的深度学习模型对类器官进行自动细胞计数。

本发明具体实施例还提供一种基于显微图像的类器官细胞计数系统，包括：

显微图像获取装置，用于获取同一孔板中类器官的所有显微图像，并将同一孔板中类器官的所有显微图像拼接成全景图；

类器官细胞计数装置，与所述显微图像获取装置连接，所述类器官细胞计数装置包括类器官属性信息提取模块、类器官目标检测模块和计算模块；

所述类器官属性信息提取模块用于将所述全景图中满足条件的类器官进行属性信息提取；

所述类器官目标检测模块用于通过人工计算值和类器官属性信息训练类器官细胞计数模型及构建网络损失函数δ；

所述计算模块在基于所述类器官细胞计数模型的基础上对获取的显微图像中的类器官进行细胞计数；

通讯装置，用于将所述显微图像获取装置和所述类器官细胞计数装置通讯连接。

本发明具体实施例还提供上述类器官细胞计数方法及类器官细胞计数系统在类器官培养中的应用。

实施例1

本实施例提供一种小鼠肝类器官培养方法，包括以下步骤：

获取待培养组织；

采用本领域常规方法培养类器官；

培养过程中采用上述类器官细胞计数方法及类器官细胞计数系统进行类器官细胞计数。操作原理如图1所示，图2提供了18幅由显微照片拼接的全景图，可得该样本类器官细胞总数，导出EXCEL数据表，如表1所示。

表1实施例1的类器官计数结果

实施例2

本实施例提供一种小鼠肺类器官培养方法，包括以下步骤：

获取待培养组织；

采用本领域常规方法培养类器官；

培养过程中采用上述类器官细胞计数方法及类器官细胞计数系统进行类器官细胞计数。操作原理如图1所示，图3提供了18幅由显微照片拼接的全景图，可得该样本类器官细胞总数，导出EXCEL数据表，如表2所示。

表2实施例2的类器官计数结果

对比例1

以实施例1方法获得AI预测细胞数后，进行类器官消化并以细胞计数仪计数，步骤如下：

1.将孔内培养基全部吸出，每孔加入1ml TrypLE并温和吹打至胶散，静置5min。

2. 1500Xg离心并弃去上清，以1ml培养基重悬。

3.取20uL混匀细胞的培养基加入20uL荧光染剂中，混匀后注入细胞计数板并放入细胞计数仪中计数，即得结果如表3所示：

表3对比例1的类器官计数结果

通过表1和3的数据可以看出，AI预测值和细胞计数仪测定值的误差不超过0.5个数量级，预测精度上佳。

对比例2

以实施例2方法获得AI预测细胞数后，进行类器官消化并以细胞计数仪计数，步骤如下：

1.将孔内培养基全部吸出，每孔加入1ml TrypLE并温和吹打至胶散，静置5min。

2. 1500Xg离心并弃去上清，以1ml培养基重悬。

3.取20uL混匀细胞的培养基加入20uL荧光染剂中，混匀后注入细胞计数板并放入细胞计数仪中计数，即得结果如下表所示：

表4对比例2的类器官计数结果

通过表2和4的数据可以看出，AI预测值和细胞计数仪测定值的误差不超过0.5个数量级，预测精度上佳。

综上，本发明通过能够直观反映类器官生长状态的影像为数据，直接快速便捷的获得显微图像中细胞数量，为后续抗肿瘤药物筛选进行细胞数量归一化处理，减小因为细胞数量差异导致的误差；同时节约人力物力与时间成本，不会对计数类器官进行任何影响。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种基于显微图像的类器官细胞计数方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，采用光学显微镜将每个待计数类器官的孔板划分成多个视野区域进行扫描拍照；

步骤2，将同一孔板的所有类器官图像拼接成一张全景图，进而获得若干张全景图，用1、2、3、……i对这些全景图进行编号；

步骤3，确定所有全景图中符合要求的类器官，并为每个类器官编号，依次用X_i,1、X_i,2、X_i,3、......X_i,t表示，然后计算每个类器官的宽度、高度、平均灰度信息，其中宽度信息表示为X_i ¹ _,t，高度信息表示为X_i ² _,t，平均灰度信息表示为X_i ³ _,t，进一步对每个类器官进行质量评估，质量评估结果表示为X_i ⁴ _,t，通过获得的每个类器官的宽度、高度、平均灰度和质量评估结果这四个参数构建四元组(F_i,t＝(X_i ¹ _,t,X_i ² _,t,X_i ³ _,t,X_i ⁴ _,t))，该四元组表示每一个类器官的属性信息；

步骤4，将通过细胞计数仪获得的人工计算值和类器官属性信息输入深度学习模型进行迭代训练，构建两层全连接网络M，将图像中所有表示类器官的四元组(F_i,t)送入网络M并输入每个类器官的预测值(Y’_i,t)，同时将人工计算值作为标签(Y_i)，构建网络的损失函数δ，δ的计算公式如式I～III所示：

δ＝||Y_i-Y′_i||²， I

式II中，Y’_i表示每张全景图中所有类器官细胞数预测值；式III中，w₁、w₂、w₃、w₄为加权系数；

步骤5，将获得的损失函数和迭代训练获得的细胞数预测模型送入GPU中再次进行迭代训练，直至损失函数δ小于给定阈值停止训练；

步骤6，利用训练好的深度学习模型对类器官进行自动细胞计数。

2.权利要求1所述的类器官细胞计数方法在类器官培养中的应用。

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