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CN113383072B - 酶法生产己糖 - Google Patents

酶法生产己糖 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过改进的酶促方法由糖类生产己糖的方法。改进方法使用比以前报道的酶具有更高活性的酶将淀粉或淀粉衍生物、纤维素或纤维素衍生物或蔗糖转化为葡萄糖6‑磷酸(G6P)中间体。

Description

酶法生产己糖
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月29日提交的美国申请号62/752,061和2019年6月5日提交的美国申请号62/857,543的优先权，这两篇申请均通过引用并入本发明。
技术领域
本发明涉及制备己糖单糖的方法。更具体地说，本发明提供了使用比以前报道的酶具有更高活性的酶来制备葡萄糖6-磷酸(G6P)中间体的改进方法。
背景技术
己糖是具有六个碳原子的单糖。己糖可以按官能团分类，其中己醛糖在1位具有醛基，而己酮糖在2位具有酮基。己醛糖(或醛糖)包括阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、古洛糖、半乳糖、艾杜糖、塔罗糖和甘露糖。己酮糖(或酮糖)包括阿洛酮糖(阿卢糖)、果糖、塔格糖和山梨糖。肌糖是不含醛基或酮糖基的己糖，其特征为碳环糖。
通过引用整体并入本发明的国际专利申请公开号WO2018/169957描述了通过酶促转化由糖类制备己糖的方法。通过引用整体并入本发明的国际专利申请公开号WO2017/059278和WO2018/004310描述了通过酶促转化由糖类制备塔格糖的方法。通过引用整体并入本发明的国际专利申请公开号WO2018/112139描述了通过酶促转化从糖类制备阿洛糖的方法。通过引用整体并入本发明的KR申请公开号KR20040098757A描述了通过酶促转化由糖类制备果糖6-磷酸的方法。通过引用整体并入本发明的CN申请公开号CN106148425B描述了通过酶促转化由糖类制备肌糖的方法。其中在每一种方法中，葡萄糖6-磷酸(G6P)都是酶促途径的中间体。
尽管高产率的酶法生产己糖得到了发展，但仍需要提供进一步改进的生产己糖的方法，例如，该方法可以以较低的酶使用量提供较高的产率。降低己糖生产成本具有巨大的工业和商业利益，并且这种减少涉及减少酶的用量、使用具有更高活性的酶以及使用更有效地将糖类转化为G6P中间体的酶组合。
发明内容
本发明一般涉及通过酶促转化由各种糖类原料制备己糖的改进方法。糖类可选自淀粉或淀粉衍生物、纤维素或纤维素衍生物或蔗糖。在本发明的改进方法中，如本发明所述，用于该方法步骤的酶比先前公开的用于制备己糖的酶具有更高的活性。
在本发明的一些由淀粉或淀粉衍生物酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括以下至少一种：a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中所述PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；b)由α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP包含与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和通过4-α-葡聚糖转移酶(4GT)催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中所述4GT包含与SEQID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些由纤维素或纤维素衍生物酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将G1P转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些由蔗糖酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括以下至少一种：a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和b)使用蔗糖磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)的步骤，其中所述蔗糖磷酸化酶包含与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些改进方法中，己糖选自阿洛糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖、阿卢糖、肌糖和塔格糖。本发明的一些改进方法还包括使用磷酸己糖磷酸酶使磷酸己糖去磷酸化的步骤。
在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤在单个反应容器中进行。在本发明的其他改进方法中，所述方法步骤在一个以上的反应容器中进行。在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤在无ATP、无NAD(P)(H)、约0.1mM至约150mM的磷酸盐浓度下进行，磷酸盐可循环利用，和/或磷酸己糖的去磷酸化的步骤涉及能量上有利的化学反应。在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤在以下方法条件中的至少一个下进行：在约37℃至约85℃的温度范围内、在约5.0至约8.0的pH范围内，或进行约0.5小时至约48小时。在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤作为连续反应进行。
附图说明
图1是将蔗糖转化为G6P的酶促途径的示意图。使用以下缩写：SP，磷酸蔗糖；和PGM，磷酸葡萄糖变位酶。本发明的改进方法包含以下改进中的一种或多种：SP包含与SEQID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，而PGM包含与SEQ IDNO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
图2是将淀粉衍生物—麦芽糊精转化为G6P的酶促途径的示意图。使用以下缩写：IA，异淀粉酶；PA，支链淀粉酶；αGP，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；4GT，4-葡聚糖转移酶；和PGM，磷酸葡萄糖变位酶。本发明的改进方法包含以下改进中的一种或多种：PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；αGP包含与SEQID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和4GT包含与SEQ IDNO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
图3是将纤维素转化为G6P的酶促途径的示意图。使用以下缩写：CDP，纤维糊精磷酸化酶；和PGM，磷酸葡萄糖变位酶。在本发明的改进方法中，PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
图4是将G6P转化为阿洛糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；P6PE，阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶；A6PI，阿洛糖6-磷酸异构酶；A6PP，阿洛糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图5是将G6P转化为甘露糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；PMI，磷酸甘露糖异构酶；和M6PP，甘露糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图6是将G6P转化为半乳糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸异构酶；Gal6PI，半乳糖6-磷酸异构酶；Gal6PP，半乳糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图7是将G6P转化为果糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PP，果糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图8是将G6P转化为阿卓糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；P6PE，阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶；Alt6PI，阿卓糖6-磷酸异构酶；Alt6PP，阿卓糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图9是将G6P转化为塔罗糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸差向异构酶；Tal6PI，塔罗糖6-磷酸异构酶；Tal6PP，塔罗糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图10是将G6P转化为山梨糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸差向异构酶；S6PE，山梨糖6-磷酸差向异构酶；S6PP，山梨糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图11是将G6P转化为古洛糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸差向异构酶；S6PE，山梨糖6-磷酸差向异构酶；Gul6PI，古洛糖6-磷酸异构酶；Gul6PP，古洛糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图12是将G6P转化为艾杜糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸差向异构酶；S6PE，山梨糖6-磷酸差向异构酶；l6PI，艾杜糖6-磷酸异构酶；16PP，艾杜糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图13是将G6P转化为塔格糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；F6PE，果糖6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图14是将G6P转化为肌糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：IPS，肌糖-磷酸合酶；IMP，肌糖单磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图15是将G6P转化为阿洛酮糖(阿卢糖)的酶促途径的示意图。使用以下缩写：PGI，磷酸葡糖异构酶；P6PE，阿洛酮糖差向异构酶；P6PP，阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶。对于用于根据本发明的改进方法的酶促途径，该途径与图1、2或3的途径相结合。
图16显示了基于形成将葡萄糖1-磷酸转化为另一己糖的吉布斯能量的中间体之间的反应吉布斯能量。
图17显示了麦芽糊精转化为G6P的HPLC色谱图。(短划线)0小时色谱图；(点划线)使用先前公开的αGP(Uniprot ID G4FEH8)和PGM(Uniprot ID Q68BJ6)处理30分钟；(实线)使用“改进”的具有更高活性的αGP(Uniprot ID D1B926)和更高活性的PGM(Uniprot IDA0A150LLZ1)处理30分钟。(1)空白和麦芽糊精，(2)G1P和G6P，(3)麦芽三糖，和(4)麦芽糖。
图18显示了蔗糖磷酸化酶活性的色谱图。顶部色谱图显示了使用Uniprot IDD9TT09(参比SP)与更高活性的SP(Uniprot ID F6BJS0)的反应作比较。短划线表示0小时的反应(蔗糖转化为果糖)，并且显示了在使用相同量的SP和其他酶时参比(实线)和更高活性SP(点划线)的2小时反应情况。在2小时，更高活性的SP产生的果糖量约为参比SP的150％。底部色谱图将Uniprot ID D9TT09(参比SP)与更高活性的Uniprot ID F6BJS0作比较。短划线表示0小时反应(蔗糖转化为果糖)，并且显示了在使用相同量的SP和其他酶时参比SP(实线)和更高活性SP(点划线)的6小时反应情况。在6小时(两个反应的最大产率)时，更高活性的SP产生的果糖量约为参比SP的130％。
图19是使用Uniprot ID A0A150LLZ1与更高活性的PGM相比的反应色谱图。色谱图显示了在与有限的PGM、过量的磷酸葡萄糖异构酶和过量的果糖6-磷酸磷酸酶孵育后，由葡萄糖1-磷酸制成的果糖产量水平。可以清楚地看到，使用同等量的所有其他PGM会使果糖产量提高，因此说明PGM活性增强，因为它是酶促过程的限制性酶。在图中，Uniprot IDA0A0P6YKY9＝实线；Uniprot ID E8N4Y6＝短划线；Uniprot ID R7RR04＝点划线；UniprotID A0A023DI95＝圆圈线；UniParc ID UPI0001D17AE3＝三角线；和Uniprot IDA0A150LLZ1＝方块线。因参比PGM Uniprot ID Q68BJ6的活性低很多(见表1)，故未显示。
具体实施方式
此处所述的发明提供了以高产率合成己糖且同时大大降低产物分离成本和己糖生产成本的酶促途径或方法。所述酶促方法一般涉及通过酶促转化由糖类制备己糖单糖的改进方法。提供了使用无细胞的酶混合物将糖类转化为己糖的无ATP的人工(非天然)酶促途径。与基于细胞的制备方法相反，本发明的酶促方法涉及无细胞制备己糖，由于消除了通常使底物/产物进出细胞速度减慢的细胞膜，因而具有相对高的反应速率。此外，该方法的最终产物不含富营养的发酵培养基/细胞代谢产物。所述糖类可选自淀粉或淀粉衍生物、纤维素或纤维素衍生物或蔗糖。在本发明的改进方法中，如此处所述，用于所述方法步骤的酶比先前公开的用于制备己糖的酶具有更高的活性。
在一个实施例中，本发明涉及使用具有更高活性的αGP、PGM和4GT中的至少一种代替先前公开的αGP、PGM和4GT，将淀粉及其衍生物转化为己糖的改进方法。参见国际专利申请公开WO2018/169957，其公开了源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Uniprot IDG4FEH8)的α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)；源自柯达热球菌(Thermococcus kodakaraensis)(Uniprot ID Q68BJ6)的磷酸葡萄糖变位酶(PGM)；和源自栖热球菌(Thermococcuslitoralis)(Uniprot ID O32462)的4-α-葡萄糖醇转移酶。在本发明的一些由淀粉或淀粉衍生物酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括以下至少一种：a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中所述PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和b)由α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中所述αGP包含与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和由4-α-葡聚糖转移酶(4GT)催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中所述4GT包含与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在本发明的改进方法中，所述方法包括：a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中所述PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；b)由α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中所述αGP包含与SEQ IDNO:10-13中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和由4-α-葡聚糖转移酶(4GT)催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中所述4GT包含与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明涉及使用具有更高活性的PGM代替源自柯达热球菌(Uniprot ID Q68BJ6)的PGM，将纤维素及其衍生物转化为己糖的改进方法。在本发明由纤维素或纤维素衍生物酶法生产己糖的一些改进方法中，所述改进包括由PGM催化将G1P转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中所述PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明涉及使用以下两项中的至少一项将蔗糖转化为己糖的改进方法：使用具有更高活性的SP代替先前公开的源自解热嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)的SP(Uniprot ID D9TT09)和使用具有更高活性的PGM代替源自柯达热球菌(Uniprot ID Q68BJ6)的PGM。在本发明的一些用于由蔗糖酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括以下至少一种：a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中PGM包含与SEQ IDNO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；b)使用蔗糖磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)的步骤，其中所述蔗糖磷酸化酶包含与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在本发明的改进方法中，所述方法包括a)由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸(G6P)的步骤，其中所述PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；b)使用蔗糖磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)的步骤，其中所述蔗糖磷酸化酶包含与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些改进方法中，己糖选自阿洛糖、甘露糖、半乳糖、果糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖、阿卢糖、肌糖和塔格糖。本发明的一些改进方法还包括使用磷酸己糖磷酸酶将磷酸己糖去磷酸化的步骤。
本发明的一些由淀粉或淀粉衍生物、纤维素或纤维素衍生物或蔗糖酶法生产己糖的改进方法包括由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化将葡萄糖1-磷酸(G1P)转化为葡萄糖6-磷酸的步骤(G6P)，其中，PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。优选PGM包含SEQ ID NO:2-8中的任何一个氨基酸序列。更优选PGM包含SEQID NO:8氨基酸序列。
磷酸葡萄糖变位酶(PGM)(EC 5.4.2.2)催化葡萄糖1-磷酸和葡萄糖6-磷酸的相互转化。在本发明由糖类生产己糖的的改进方法中，反应沿G6P的方向进行，然后进一步向下游处理，其中该方法中的最终酶促步骤是能量上有利的、不可逆的磷酸己糖去磷酸化的步骤。
在本发明的改进方法中，所述PGM相对于先前描述的源自柯达热球菌(Uniprot IDQ68BJ6)的PGM(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)具有更高的活性。本发明方法中使用的PGM的酶活性比源自柯达热球菌(Uniprot ID Q68BJ6)的PGM的活性提高至少10％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少2000％、至少2500％、至少3000％、至少3500％、至少4000％、至少4500％、至少5000％或至少5500％。
例如，如实例1所示，用于本发明方法的PGM比源自柯达热球菌(Uniprot IDQ68BJ6)的PGM具有改进的活性：源自嗜热脂肪地芽孢杆菌NUB3621(Geobacillusstearothermophilus NUB3621)(Uniprot ID A0A023CRS6)的PGM的酶活性提高约700％；源自衰弱钙杆菌(Caldibacillus debilis)(Uniprot ID A0A150LLZ1)的PGM的酶活性提高约1900％；源自嗜热葡糖芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)(UniParc IDUPI0001D17AE3)的PGM的酶活性提高约2100％；源自溶氧帕拉热芽孢杆菌NBRC 107762(Parageobacillus caldoxylosilyticus NBRC 107762)的PGM(Uniprot ID A0A023DI95)的PGM的酶活性提高约1980％；源自膨大热臂菌DSM8682(Thermobrachium celere DSM8682)(Uniprot ID R7RR04)的PGM的酶活性提高约5100％；源自嗜热厌氧菌(Anaerolineathermophila)(Uniprot ID E8N4Y6)的PGM的酶活性提高约5800％；源自达氏嗜热菌的(Thermanaerothrix daxensis)(Uniprot ID A0A0P6YKY9)的PGM的酶活性提高约6500％。以下实例向本领域技术人员提供了测定PGM活性的方案作为酶促过程的一部分，例如，涉及将酶与其底物一起孵育，然后通过HPLC测定反应物和产物或后续下游产物的数量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件(如缓冲液、pH、温度等)下进行。
本发明改进方法中使用的PGM的实例包括但不限于以下蛋白质：源自嗜热脂肪地芽孢杆菌NUB3621(Uniprot ID A0A023CRS6)的PGM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；源自衰弱钙杆菌(Uniprot ID A0A150LLZ1)的PGM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；源自嗜热葡糖芽孢杆菌(UniParc ID UPI0001D17AE3)的PGM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；源自溶氧帕拉热芽孢杆菌NBRC 107762(Uniprot ID A0A023DI95)的PGM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；源自膨大热臂菌DSM8682(Uniprot ID R7RR04)的PGM，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；源自嗜热厌氧菌(Uniprot ID E8N4Y6)的PGM，其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示；和源自达氏嗜热菌(Uniprot ID A0A0P6YKY9)的PGM，其氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，以及包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的PGM。
本发明改进方法中使用的PGM通常是α-D-磷酸己糖突变酶超家族(IPR005841)的一部分，并且包含形成酶的活性位点的四个结构域。前三个结构域由αβ核心组成，第四个结构域包含TATA盒结合蛋白样折叠(Mehra-Chaudhary et al.Proteins 79(4):1215-29,2011)。第一结构域向活性位点(SEQ ID NO:3的Ser147)贡献了用于磷酸基转移的保守丝氨酸残基。第二结构域向活性位点(SEQ ID NO:3的Asp306，Asp308和Asp310)贡献了保守的Mg2+结合残基。第三结构域向活性位点(SEQ ID NO:3的Glu406和Ser408)贡献了底物特异性的保守残基。第四结构域向活性位点(SEQ ID NO:3的Arg538)贡献了用于磷酸盐结合的保守残基。另外，带正电的残基(Lys/Arg)是保守的，在SEQ ID NO:3的Lys420的催化中起作用。保守残基引用自Lee et al.FEBS J 280(11):2622-32,2013and Levin et al.ProteinEngineering,Design and Selection12(9):737-746,1999。
本发明的一些由本发明的淀粉或淀粉衍生物生产己糖的改进方法，包括由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP包含与SEQ ID NO:10-13中任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。优选αGP包含SEQ ID NO:10-13中的任一个氨基酸序列。更优选αGP包含SEQ ID NO:11氨基酸序列。
α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶(αGP)(EC 2.4.1.1)对麦芽低聚糖进行磷酸分解，产生G1P。淀粉磷酸化酶还催化逆反应，即糖基单元从G1P转移到α-1,4-D-葡聚糖链的非还原端，释放出磷酸盐。通常，寡糖链的聚合度为4及以上。在本发明由淀粉衍生物生产己糖的的改进方法中，反应沿G1P方向进行，然后在下游进一步处理，其中该方法中的最终酶促步骤是能量上有利的、不可逆的磷酸己糖去磷酸化的步骤。
在本发明的改进方法中，相对于先前描述的源自海栖热袍菌(Uniprot IDG4FEH8)的α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)(其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)，所述αGP具有更高的活性。优选本发明方法中使用的αGP的酶活性比源自海栖热袍菌(Uniprot ID G4FEH8)的αGP的活性提高至少10％、至少50％、至少100％、至少150％或至少200％。例如，如实例2中所示，源自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Uniprot ID Q5SJ42)的αGP的酶活性比源自海栖热袍菌(Uniprot ID G4FEH8)的αGP的酶活性提高约71％；源自栖热菌属sp.CCB_US3_UF1(Thermus sp.CCB_US3_UF1)(Uniprot ID G8NCC0)的αGP的酶活性比源自海栖热袍菌(Uniprot ID G4FEH8)的αGP的酶活性提高约186％；源自假乙醇热厌氧菌菌株ATCC33223(Thermoanaerobacter pseudethanolicus strain ATCC 33223)(Uniprot IDB0K7V8)的αGP的酶活性比源自海栖热袍菌(Uniprot ID G4FEH8)的αGP的酶活性提高约128％；源自热厌氧氨腐菌菌株ATCC 49978(Thermanaerovibrio acidaminovorans strainATCC49978)(Uniprot ID D1B926)的αGP的酶活性比源自海栖热袍菌(Uniprot ID G4FEH8)的αGP的酶活性提高约111％。以下实例为本领域技术人员提供了测定αGP活性的方案作为酶促方法的一部分，例如，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过分光光度法和HPLC测定反应物和产物或随后的下游产物的数量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件(如缓冲液、pH、温度等)下进行。
本发明改进方法中使用的αGP的实例包括但不限于以下蛋白质：源自嗜热栖热菌(Uniprot ID Q5SJ42)的αGP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；源自栖热菌属sp.CCB_US3_UF1(Uniprot ID G8NCC0)的αGP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；源自假乙醇热厌氧菌菌株ATCC 33223(Uniprot ID B0K7V8)的αGP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；源自热厌氧氨腐菌菌株ATCC 49978(Uniprot ID D1B926)的αGP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；以及与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的αGP。
本发明改进方法中使用的α-葡聚糖磷酸化酶通常是糖基转移酶家族35(IPR000811)的一部分，并且包含“α-葡聚糖磷酸化酶”结构域(IPR011834)。一些αGP具有用于PLP结合、PLP稳定化和磷酸结合的保守残基。例如，在Uniprot ID D1B926(SEQ ID NO:13)中，Lys585对于PLP结合而言是保守的；Arg484和Thr581对PLP稳定化是保守的；Gly110、Arg485和Lys490的磷酸结合是保守的(保守残基引用自Watson et al.The EMBO JournalVol.16No.1pp.1–14,1997)。
在本发明由淀粉衍生物生产己糖的一些改进方法中，所述改进包括使用4-α-葡聚糖转移酶(4GT)将淀粉衍生物转糖基化的步骤，其中4GT包含与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。优选4GT包含SEQ ID NO:15-17中的任一个氨基酸序列。更优选αGP包含SEQ ID NO:17氨基酸序列。
4-α-葡聚糖转移酶(4GT)(EC 2.4.1.25)催化麦芽低聚糖的转糖基化，产生各种长度的麦芽低聚糖和葡萄糖。麦芽糖和葡萄糖可以作为转移反应中的受体。
本发明用于生产己糖的一些方法包括将磷酸己糖转化为己糖的在能量上有利的去磷酸化步骤。在这些方法中，特别是当在单个反应容器中进行时，将磷酸盐再循环并用于该方法的上游，如αGP催化将淀粉糊精转化为G1P的催化反应中。然而，αGP对聚合度(DP)小于4的淀粉糊精的反应活性不高。在本发明的此类方法中，将4GT添加至反应中以提高总产率。4GT转糖基化淀粉糊精，使得如DP小于4的麦芽三糖被转化为可被αGP降解的长链淀粉糊精。如果没有4GT，则麦芽三糖将作为该方法的最终产物积累，而不是再循环到更长链的淀粉糊精中，从而再次参与该方法以提高产量。4GT在使用αGP将淀粉糊精充分降解以产生大量的麦芽三糖的情况下可提高产量。这得益于在能量上有利的去磷酸化步骤和磷酸盐循环。
在本发明的改进方法中，相对于先前描述的源自栖热球菌(Uniprot ID O32462)的4-α-葡聚糖转移酶(4GT)(其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)，所述4GT具有更高的活性。优选地，用于本发明方法中的4GT的酶活性比源自栖热球菌的4GT(Uniprot ID O32462)的活性提高至少10％、至少50％、至少100％、至少150％或至少200％。例如，如实例3所示，源自深海栖热菌属DSM 14977(Oceithermus profundus DSM 14977)(Uniprot ID E4U8S9)的4GT的酶活性比源自栖热球菌(Uniprot ID O32462)的4GT的酶活性提高约128％；源自席氏嗜热菌菌株ATCC 700542(Meiothermus silvanus strain ATCC 700542)(Uniprot IDD7BF07)的4GT的酶活性比源自栖热球菌(Uniprot ID O32462)的4GT的酶活性提高约212％；源自嗜热厌氧菌菌株DSM 14523(Anaerolinea thermophila strain DSM 14523)(Uniprot ID E8MXP8)的4GT的酶活性比源自栖热球菌(Uniprot ID O32462)的4GT的酶活性提高约184％。以下实例为本领域技术人员提供了测定4GT活性的方案作为酶促方法的一部分，例如，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过分光光度法和HPLC测定反应物和产物或随后的下游产物的数量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件(如缓冲液、pH、温度等)下进行。
本发明改进方法中使用的4GT的实例包括但不限于以下蛋白质：源自深海栖热菌属DSM 14977(Uniprot ID E4U8S9)的4GT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；源自席氏嗜热菌菌株ATCC 700542(Uniprot ID D7BF07)的4GT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；源自嗜热厌氧菌菌株DSM 14523(Uniprot ID E8MXP8)的4GT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；以及与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的4GT。
本发明改进方法中使用的4-葡聚糖转移酶通常是糖苷转移酶超家族(IPR017853)—更具体地讲是糖苷水解酶家族77(IPR003385)的一部分。通常，4-葡聚糖转移酶含有(β/α)8-桶状催化结构域，其中活性位点在β桶-链的C-末端。活性位点包含一个保守的催化三聚体。在SEQ ID NO:17中，这些保守残基对应Asp298(亲核体)、Glu345(质子供体)和Asp398(过渡态稳定剂)。本发明改进方法中使用的4GT还含有与底物结合相关的保守残基。例如，在SEQ ID NO:17中，这些保守残基对应Tyr60、Asp218、Arg296和His397。参见Przylas et al.Journal of Molecular Biology 296(3):873–886,2000。
在一些由蔗糖酶法生产己糖的改进方法中，所述改进包括由蔗糖磷酸化酶催化将蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸(G1P)的步骤，其中所述蔗糖磷酸化酶包含与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。优选SP包含SEQ ID NO:19-25中的任一个氨基酸序列。更优选SP包含SEQ ID NO:21氨基酸序列。
蔗糖磷酸化酶(EC:2.4.1.7)催化由蔗糖和无机磷酸盐到果糖和G1P的转化。在本发明由蔗糖生产己糖的改进方法中，反应沿G1P方向进行，然后进一步向下游处理，其中该方法中的最终酶促步骤是能量上有利的、不可逆的磷酸己糖去磷酸化的步骤。
在本发明的改进方法中，相对于先前描述的源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot IDD9TT09)的SP(其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)，所述SP具有更高的活性。优选地，本发明方法中使用的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施例中，本发明方法中使用的SP提高了己糖，尤其是果糖的最大产率。例如，在实例4中显示了几种具有较高活性的SP。源自嗜热厌氧菌sp.PSU-2(Thermoanaerobacterium sp.PSU-2)(Uniprot ID A0A1X2FWC2)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧细菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高11％，果糖的最大产率提高9％。源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot IDL0IL15)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧细菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高50％，果糖的最大产率提高1％。源自木聚糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)(Uniprot ID F6BJS0)的SP的酶活性比解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot IDD9TT09)的SP的活性提高49％，果糖的最大产率提高32％。源自嗜热杆菌sp.ZCTH02-B1(Thermobacillus sp.ZCTH02-B1)(Uniprot ID A0A1Y3Q6Q6)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧杆菌的SP的活性提高50％，果糖的最大产率提高3％。源自青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(Uniprot ID Q84HQ2)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高31％，果糖的最大产率提高37％。源自嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)(Uniprot ID A0A388NK91)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高22％，果糖的最大产率提高19％。源自蒂皮氏芽孢杆菌(Tepidibacillus decaturensis)(Uniprot ID A0A135L6L9)的SP的酶活性比源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot ID D9TT09)的SP的活性提高44％，果糖的最大产率提高9％。最大产率的增加在商业过程中非常重要，并且评论了每种SP可实现的最大果糖产率。据推测，影响因素包括果糖对蔗糖磷酸化酶的产物抑制，逆反应的速率—更广泛地讲，果糖的形成与反应后期果糖的降解之间的平衡。
以下实施例向本领域技术人员提供了测定SP活性的方案作为酶促过程的一部分，例如，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过HPLC测定反应物和产物或随后的下游产物的数量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件如(缓冲液、pH、温度等)下进行。
本发明改进方法中使用的SP的实例包括但不限于以下蛋白质：源自嗜热厌氧菌sp.PSU-2(Uniprot ID A0A1X2FWC2)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；源自解热嗜热厌氧杆菌(Uniprot ID L0IL15)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；源自木聚糖热厌氧杆菌(Uniprot ID F6BJS0)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；源自嗜热杆菌sp.ZCTH02-B1(Uniprot ID A0A1Y3Q6Q6)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；源自青春双歧杆菌(Uniprot ID Q84HQ2)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；源自嗜热类芽孢杆菌(Uniprot ID A0A388NK91)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；源自蒂皮氏芽孢杆菌(Uniprot ID A0A135L6L9)的SP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；以及与SEQ IDNO:19-25中的任一个序列具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的SP。
本发明改进方法中使用的SP通常是糖苷水解酶超家族(IPR017853)—更具体地讲是蔗糖磷酸化酶家族(IPR022527)的一部分，并且包含糖基水解酶家族13的催化结构域(IPR006047)。糖基水解酶结构域由(β/α)8桶组成，是催化结构域。总的蔗糖磷酸化酶由四个结构域组成：N端结构域、糖基水解酶结构域、B结构域(由糖基结构域中的大环形成)和C端结构域(D,van den Broek LA,Mirza O,Kastrup JS,Voragen AG,Gajhede M,Skov LK(February 2004)."Crystal structure of sucrose phosphorylase fromBifidobacterium adolescentis".Biochemistry.43(5):1156-62.doi:10.1021/bi0356395.PMID 14756551.)。通过对已充分研究的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)(Uniprot Q59495)蔗糖磷酸化酶的序列比对，发现催化残基Asp196(Schwarz A,Nidetzky B(July 2006)."Asp-196-->Ala mutant of Leuconostocmesenteroides sucrose phosphorylase exhibits altered stereochemical courseand kinetic mechanism of glucosyl transfer to and from phosphate".FEBSLetters.580(16):3905-10.doi:10.1016/j.febslet.2006.06.020.PMID 16797542.)、Glu237(Schwarz A,Brecker L,Nidetzky B(May 2007)."Acid-base catalysis inLeuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase probed by site-directedmutagenesis and detailed kinetic comparison of wild-type and Glu237-->Glnmutant enzymes".The Biochemical Journal.403(3):441-9.doi:10.1042/BJ20070042.PMC 1876375.PMID 17233628.)和Asp 295(Mueller M,Nidetzky B(April2007)."The role of Asp-295in the catalytic mechanism of Leuconostocmesenteroides sucrose phosphorylase probed with site-directed mutagenesis".FEBS Letters.581(7):1403-8.doi:10.1016/j.febslet.2007.02.060.PMID 17350620.)具有保守性。
淀粉是自然界中使用最广泛的能量存储化合物，并且大部分存储在植物种子中。天然淀粉包含直链淀粉和支链淀粉。淀粉衍生物的实例包括直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽糖、果糖和葡萄糖。淀粉的衍生物可以通过淀粉的酶促水解或淀粉的酸水解来制备。具体地说，淀粉的酶促水解可以通过水解α-1,6-糖苷键的异淀粉酶(IA，EC.3.2.1.68)、水解α-1,6-糖苷的支链淀粉酶(PA，EC.3.2.1.41)、或可裂解α-1,4-糖苷键的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)来催化或增强。玉米淀粉包含许多阻碍αGP作用的支链。异淀粉酶可用于淀粉脱支，产生直链淀粉糊精。异淀粉酶预处理的淀粉可使最终产品中的F6P浓度更高。异淀粉酶和支链淀粉酶裂解α-1,6-糖苷键，从而可以通过α-葡聚糖磷酸化酶更彻底地降解淀粉。α-淀粉酶可裂解α-1,4-糖苷键，因此α-淀粉酶用于将淀粉降解为片段，从而更快地转化为己糖并提高溶解度。
纤维素是最丰富的生物资源，并且是植物细胞壁的主要成分。非食品木质纤维素生物质包含纤维素、半纤维素和木质素以及其他次要成分。可以通过一系列处理来制备纯纤维素，包括Avicel(微晶纤维素)、再生无定形纤维素、细菌纤维素、滤纸等。部分水解的纤维素底物包括聚合度大于7的水不溶性纤维糊精、聚合度为3-6的水溶性纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖和果糖。纤维素衍生物的实例包括预处理的生物质、再生无定形纤维素、纤维糊精、纤维二糖、果糖和葡萄糖。此外，纤维素衍生物可以通过纤维素的酶促水解来制备，该酶促水解由纤维素酶混合物、酸或生物质的预处理催化。在本发明的一些方法中，G1P是通过纤维素磷酸化酶从纤维素产生的。在本发明的一些方法中，G1P是由纤维糊精、纤维二糖和游离磷酸盐在纤维糊精磷酸化酶(CDP)和纤维二糖磷酸化酶(CBP)的催化下产生的。
在本发明的一些改进方法中，己糖选自阿洛糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖、阿卢糖、肌糖和塔格糖。己糖是具有六个碳原子的单糖。己糖可以按官能团分类，其中己醛糖在1位具有醛基，而己酮糖在2位具有酮基。己醛糖(或醛糖)包括阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、古洛糖、半乳糖、乳糖、塔罗糖和甘露糖。己酮糖(或酮糖)包括阿洛酮糖(阿卢糖)、果糖、塔格糖和山梨糖。肌糖既没有醛基也没有酮糖基，以碳环己糖为特征。本发明的改进方法可将淀粉及其衍生物转化为己糖，所述己糖选自阿洛糖、甘露糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、塔罗糖、山梨糖、果糖、塔格糖、阿卢糖、肌糖和乳糖。因此，本发明的一些实施例涉及生产这些己糖的改进方法。
在本发明生产己糖的改进方法中，包括使用磷酸己糖磷酸酶使磷酸己糖去磷酸化的附加步骤。在本发明生产己糖的一些改进方法中，所述方法步骤在单个反应容器中进行。在本发明的其他改进方法中，所述方法步骤在一个以上的单个反应容器中进行。在一些改进方法中，所述方法步骤在无ATP、无NAD(P)(H)、约0.1mM至约150mM的磷酸盐浓度下进行，磷酸盐可再循环，和/或将磷酸己糖去磷酸化的步骤涉及能量上有利的化学反应。在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤在以下方法条件中的至少一个下进行：在约37℃至约85℃的温度范围内，在约5.0至约8.0的pH范围内，或进行约0.5小时至约48小时。在本发明的一些改进方法中，所述方法步骤作为连续反应进行。
在本发明制备己糖的一些方法中，包括使用磷酸己糖磷酸酶使磷酸己糖去磷酸化的附加步骤。在本发明的方法中，使用的磷酸酶对磷酸己糖具有特异性。例如，通过阿洛糖6-磷酸磷酸酶将阿洛糖6-磷酸转化为阿洛糖；通过甘露糖6-磷酸磷酸酶将甘露糖6-磷酸转化为甘露糖；通过半乳糖6-磷酸磷酸酶将半乳糖6-磷酸转化为半乳糖；通过果糖6-磷酸磷酸酶将果糖6-磷酸转化为果糖；通过阿卓糖6-磷酸磷酸酶将阿卓糖6-磷酸转化为阿卓糖；通过塔罗糖6-磷酸磷酸酶将塔罗糖6-磷酸转化为塔罗糖；通过山梨糖6-磷酸磷酸酶将山梨糖6-磷酸转化为山梨糖；通过果糖6-磷酸磷酸酶将果糖6-磷酸被转化为果糖；通过塔格糖6-磷酸磷酸酶将塔格糖6-磷酸转化为塔格糖；通过阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶将阿洛酮糖6-磷酸转化为阿洛酮糖；通过肌糖单磷酸酶将肌糖3-磷酸转化为肌糖；和通过艾杜糖6-磷酸磷酸酶将艾杜糖6-磷酸转化为艾杜糖。此处所述特异性是指对指定的己糖具有比其他己糖更高的比活性。例如，与如山梨糖6-磷酸或塔罗糖6-磷酸相比，阿洛糖6-磷酸磷酸酶对阿洛糖6-磷酸具有更高的比活性。在本发明的方法中，与该方法中的其他磷酸己糖中间体相比，磷酸己糖磷酸酶对指定的磷酸己糖具有更高的活性。作为说明性实例，在将麦芽糊精转化为阿洛糖的方法中，与该方法中的其他磷酸己糖中间体(如G1P、G6P、F6P和阿洛酮糖6-磷酸)相比，阿洛糖6-磷酸磷酸酶对阿洛糖6-磷酸具有更高的活性(见图2和图4)。
糖醇可以由本发明改进方法生产的各种己糖制备。例如，可以制备甘露糖醇和山梨糖醇，目前在医学和食品工业中具有商业利益。这些改进的酶促方法中的的酮糖或醛糖产物可以使用还原剂(如氢气或硼氢化钠)还原为糖醇形式。优选如先前在美国专利号6,570,043B2、US8,816,068B2或US5,466,795A中所述，将氢气作为还原剂。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及生产阿洛糖。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化的步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自以下一个或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由阿洛酮糖6-磷酸-3-差向异构酶(P6PE)催化将F6P转化为阿洛酮糖6-磷酸(P6P)；由阿洛糖6-磷酸异构酶(A6PI)催化将P6P转化为阿洛糖6-磷酸(A6P)；和由阿洛糖6-磷酸磷酸酶(A6PP)催化将A6P转化为阿洛糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及甘露糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，改进选自下述一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由甘露糖6-磷酸异构酶(M6PI)或磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶(PGPMI)催化将F6P转化为甘露糖6-磷酸(M6P)；和由甘露糖6-磷酸磷酸酶(M6PP)催化将M6P转化为甘露糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及半乳糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由果糖6-磷酸4-表异构酶(F6PE)催化将F6P转化为塔格糖6-磷酸(T6P)；由半乳糖6-磷酸异构酶(Gal6PI)催化将T6P转化为6-磷酸半乳糖(Gal6P)；并由半乳糖6-磷酸磷酸酶(Gal6PP)催化将Gal6P转化为半乳糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及果糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)和由果糖6-磷酸磷酸酶(F6PP)催化将F6P转化为果糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及阿卓糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由P6PE催化将F6P转化为P6P；由阿卓糖6-磷酸异构酶(Alt6PI)催化将P6P转化为阿卓糖6-磷酸(Alt6P)；和由阿卓糖6-磷酸磷酸酶(Alt6PP)催化将生成的Alt6P转化为阿卓糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及塔罗糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由F6PE催化将F6P转化为T6P；由塔罗糖6-磷酸异构酶(Tal6PI)催化将T6P转化为塔罗糖6-磷酸(Tal6P)；和由塔罗糖6-磷酸磷酸酶(Tal6PP)催化将Tal6P转化为塔罗糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及山梨糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由F6PE催化将F6P转化为T6P；由山梨糖6-磷酸差向异构酶(S6PE)催化将T6P转化为山梨糖6-磷酸(S6P)；和由山梨糖6-磷酸磷酸酶(S6PP)将S6P转化为山梨糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及古洛糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由F6PE催化将F6P转化为T6P；由古洛糖6-磷酸异构酶(Gul6PI)催化将S6P转化为古洛糖6-磷酸(Gul6P)；和由古洛糖6-磷酸磷酸酶(Gul6PP)将Gul6P转化为古洛糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及生产艾杜糖。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由F6PE催化将F6P转化为T6P；由山梨糖6-磷酸差向异构酶(S6PE)催化将T6P转化为山梨糖6-磷酸(S6P)；由艾杜糖6-磷酸异构酶(I6PI)催化将S6P转化为艾杜糖6-磷酸(I6P)；和由艾杜糖6-磷酸磷酸酶(I6PP)催化将I6P转化为艾杜糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及塔格糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由果糖6-磷酸差向异构酶(F6PE)催化将F6P转化为塔格糖6-磷酸(T6P)；由塔格糖6-磷酸磷酸酶(T6PP)催化将T6P转化为塔格糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及阿洛酮糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；由阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶(P6PE)催化将F6P转化为阿洛酮糖6-磷酸(P6P)；由阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶(P6PP)催化将P6P转化为阿洛酮糖的步骤。
在一个实施例中，本发明的改进方法涉及肌糖的生产。当淀粉或淀粉衍生物为起始原料时，所述改进选自下列一个或多个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；b)由αGP催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中αGP与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和c)由4GT催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中4GT与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当纤维素或纤维素衍生物为起始原料时，所述改进是由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。当以蔗糖为起始原料时，所述改进选自下列一个步骤或两个步骤：a)由PGM催化将G1P转化为G6P的步骤，其中PGM与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％的序列同一性；和b)由SP催化将蔗糖转化为G1P的步骤，其中SP与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％的序列同一性。所述方法进一步包括使用肌糖磷酸合酶将G6P转化为肌糖3-磷酸(I3P)和使用肌糖单磷酸酶将I3P转化为肌糖的步骤。在另一个实施例中，本发明的改进方法涉及由蔗糖生产肌糖。
图1显示了将蔗糖转化为G6P中间体的酶促途径。本发明的改进方法包含以下改进中的一种或多种：SP包含与SEQ ID NO:19-25中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，而PGM包含与SEQ ID NO:2-8中任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在本发明的优选方法中，SP包含SEQ ID NO:19-25中的任一个氨基酸序列，而PGM包含SEQ ID NO:2-8中的任一个氨基酸序列。在更优选的方法中，SP包含SEQ ID NO:21氨基酸序列，而PGM包含SEQ ID NO:8氨基酸序列。
图2是将淀粉衍生物麦芽糊精转化为G6P中间体的酶促途径示意图。使用以下缩写：IA，异淀粉酶；PA，支链淀粉酶；αGP，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；4GT，4-葡聚糖转移酶；和PGM，磷酸葡萄糖变位酶。本发明的改进方法包含以下改进中的一种或多种：PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；αGP包含与SEQ ID NO:10-13中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和4GT包含与SEQ ID NO:15-17中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在本发明的优选方法中，PGM包含SEQ ID NO:2-8中的任一个氨基酸序列，αGP包含SEQ ID NO:10-13中的任一个氨基酸序列，而4GT包含SEQ ID NO:15-17中的任一个氨基酸序列。在本发明更优选的方法中，PGM包含SEQ ID NO:8氨基酸序列，αGP包含SEQ ID NO:11氨基酸序列，而4GT包含SEQ ID NO:17氨基酸序列。
图3显示了将纤维素转化为G6P中间体的酶促途径。在本发明的改进方法中，PGM包含与SEQ ID NO:2-8中的任一个序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。优选PGM包含SEQ ID NO:2-8中的任一个氨基酸序列。更优选PGM包含SEQ ID NO:8氨基酸序列。在本发明的一些生产己糖的改进方法中，一个或多个方法步骤在单个反应容器中进行。在本发明的其他改进方法中，所述方法步骤在一个以上的反应容器中进行。然后，由磷酸己糖去磷酸化产生的磷酸根离子可以在由淀粉衍生物转化为G1P的过程步骤中进行再循环，尤其是当所有方法步骤都在单个生物反应器或反应容器中进行时。再循环磷酸盐的能力使得能够使用非化学计量用量的磷酸盐，从而保持较低的反应磷酸盐浓度。这虽然影响了本方法的整体途径和整体速率，但并未限制单个酶的活性，并能保持己糖制备方法的整体效率。
在本发明用于生产己糖的改进方法中，所述方法步骤在无ATP、无NAD(P)(H)、0.1mM至约150mM的磷酸盐浓度下进行，磷酸盐可再循环，和/或磷酸己糖的去磷酸化步骤涉及能量上有利的化学反应。在本发明的改进方法中，所述方法步骤是在以下至少一种方法条件下进行的：在约37℃至约85℃的温度范围内，在约5.0至约8.0的pH范围内或进行约0.5小时至约48小时，或作为连续方法。
例如，每个方法中的反应磷酸盐浓度可以在约0mM至约300mM、约0.1mM至约150mM、约1mM至约50mM的范围内，优选约5mM至约50mM，或更优选约10mM至约50mM。例如，每个方法中的反应磷酸盐浓度可以为约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM或约55mM。磷酸盐浓度低，导致总磷酸盐用量较低，降低了生产成本，并因此降低了脱除磷酸盐的成本。这还可以防止高浓度的游离磷酸盐对磷酸酶或其他酶的抑制，并减少磷酸盐污染的可能性。
此外，本发明公开的每个方法都可以在不添加ATP作为磷酸盐来源，即不含ATP的情况下进行。每个方法还可以在不添加NAD(P)(H)，即不含NAD(P)(H)的情况下进行。
本领域所知的任何合适的生物相容性缓冲剂都可用于本发明的每种方法中，例如HEPES、PBS、BIS-TRIS、MOPS、DIPSO、三羟甲基氨基甲烷等。本发明方法中反应缓冲液的pH值可以在5.0-8.0的范围内。更优选地，反应缓冲液的pH可以在约6.0至约7.3的范围内。例如，反应缓冲液的pH可以是6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3。
反应缓冲液还可包含二价金属阳离子。在一些方法中，所述步骤在二价金属阳离子的存在下进行，所述二价金属阳离子选自由Mg 2+、Zn 2+、Ca 2+、Co 2+、Mn2+及其组合组成的组。如本领域所知，可以使用合适的盐来引入所需的金属阳离子。
在本发明的每个方法中，所述方法步骤可以在37-85℃的反应温度范围内进行。更优选地，所述步骤可以在约40℃至约80℃的温度下进行。例如，所述温度可以是大约40℃、大约45℃、大约50℃、大约55℃、大约60℃、大约65℃、大约70℃、大约75℃、大约80℃、或大约85℃。优选地，反应温度为约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃或约65℃。更优选地，反应温度为约50℃至约55℃。
对于本发明的一些改进方法，反应时间可以根据需要在约0.5小时至约48小时的范围内调节。例如，反应时间可以是约1小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时、约42小时、约44小时、约46小时或约48小时。更优选地，反应时间为约24小时。
所述方法还可以作为连续过程在一个或多个反应器中进行，没有时间限制。例如，在连续过程中，将麦芽糊精溶液泵入通过固定化酶床，当溶液离开一个或多个柱进行下游处理时，其速率应使其完全转化为塔格糖。例如，可以将200g/L的麦芽糊精泵入通过填充固定化酶的柱(如保持在50℃的温度)，这样当麦芽糊精离开柱时，可获得最大的塔格糖产量。与间歇处理方法相比，此方法可提供更高的体积生产率。这限制了产物与柱接触的时间和反应条件，减少了产物降解的机会(例如，潜在的羟甲基糠醛的形成)。它还提高了生产的自动化程度，从而减少了操作费用。
本发明各步骤中使用的酶可以采取可溶、固定化、组装、包埋或聚集蛋白质的形式。如本领域中所知，这些酶可以被吸附在通常用于改善功能性的不溶性有机或无机载体上。这些载体包括聚合物载体，如琼脂糖、甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯或葡聚糖以及无机载体，如玻璃、金属或碳基材料。这些材料通常具有较大的表面体积比和特殊的表面，从而促进固定化酶的附着和活性。这些酶可以通过共价、离子或疏水相互作用固定在这些固体载体上。这些酶也可以通过基因工程相互作用固定，如共价融合到对固体载体具有亲和力的另一种蛋白质或肽序列(通常是多组氨酸序列)上。这些酶可以直接固定在表面或表面涂层上，也可以固定在表面或表面涂层上已经存在的其他蛋白质上。这些酶可以全部固定在一种载体上，也可以固定在单独的载体上，或固定在两种载体的组合上(例如，每种载体两种酶，然后将那些载体混合在一起)。这些不同酶可以均匀混合或以规定的层混合，以优化连续反应器中的转化量。例如，反应器开始可具有aGP层以确保高的G1P初始增加量。酶可以全部固定在一种载体上、单个载体上或成组固定。这些酶可以均匀混合或以规定的层或区域混合以优化转化量。
由于对整个反应非常有利的平衡常数，本发明的每个方法都可以实现高产率。从理论上讲，如果原料完全转化为磷酸化的中间体，则产率可以达到高达99％。
本发明的方法使用低成本的起始原料，并通过降低与原料和产物分离有关的成本而降低了生产成本。淀粉及其衍生物是比乳糖之类便宜的原料。当由乳糖产生己糖时，葡萄糖和其他己糖通过色谱法分离，从而会导致更高的生产成本。而且，通过磷酸酶进行的己糖去磷酸化的步骤是不可逆的磷酸酶反应，与原料无关。因此，生产己糖的产率非常高，同时有效地使随后的产物分离成本最小化。
本发明的方法使得己糖容易回收，并且使分离成本最小化。在本发明的一些优选方法中，所需己糖的回收无需色谱分离即可进行。在连续反应中生产己糖之后，使产物通过微滤、离子交换(先阳离子然后阴离子，可能混合床进行精细纯化)、浓缩、结晶、晶体分离和干燥。由于己糖的产率高，因此结晶步骤是纯化己糖所需的全部步骤。为了在结晶之前进一步纯化己糖，可以采用纳滤技术消除结晶过程中存在酶的风险，并去除可能与己糖共结晶或限制母液(麦芽糊精、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖等)再循环的任何未转化的糊精。
本发明的改进方法还包括由蔗糖、淀粉或淀粉衍生物或纤维素或纤维素衍生物生产G6P。本发明方法生产的G6P可通过本领域所知技术(如色谱法)进行分离和纯化。
实施例
以下实施例描述了使用较高活性的酶的改进方法。
材料和方法
除非另有说明，所有化学品，包括葡萄糖1-磷酸、氯化镁、麦芽糊精DE 4-7、磷酸钠(磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)均为试剂级或更高级，购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)或Fisher Fisher(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。麦芽三糖购自Carbosynth(英国伯克郡)。大肠杆菌BL21(DE3)(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)被用作重组蛋白表达的宿主细胞。包含50mg L-1卡那霉素的ZYM-5052培养基用于大肠杆菌细胞生长和重组蛋白表达。
重组酶的生产和纯化
将带有蛋白质表达质粒(pET28a)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株与100mL含有50mg L-1卡那霉素的ZYM-5052培养基在1L锥形瓶中孵育。使细胞在30℃下以220rpm转速旋转震动生长16-24小时。通过在12℃下离心，并用含有300mM NaCl的20mM HEPES(pH 7.5)或5mM咪唑(镍纯化)洗涤一次，收集细胞。将细胞沉淀重悬于相同的缓冲液中，并通过超声溶解。离心后，通过标准方法纯化上清液中的靶蛋白。用Profinity IMAC含镍树脂(Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)在前述缓冲液中使用递增的咪唑梯度纯化His标记的蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测重组蛋白的纯度。
实例1.使用更高活性的PGM的改进方法。
分离并分析各种磷酸葡萄糖变位酶(PGM)，以在多步酶促反应中将G1P转化为G6P。每种PGM的相对活性以以下方式测定。制备50mM HEPES(pH 7.2)、5mM MgCl2、50mM葡萄糖1-磷酸、0.02g/L PGM、0.1g/L PGI和0.1g/L F6PP的反应溶液，并在50℃下孵育30分钟。反应通过用Vivaspin 2浓缩器(10,000MWCO)过滤酶来终止。使用Hi-Plex H+色谱柱和折射率检测器评估果糖产物。在65℃下将样品在5mM H2SO4中以0.6mL/min的速度运行15.5分钟。用30分钟制备的果糖量来确定每种PGM在酶促过程中的相对效率。使用果糖峰面积和峰高增加的平均值来确定增加的活性。
图19是显示各种PGM活性的色谱图。色谱图显示了在采用各种PGM、过量的磷酸葡萄糖异构酶和过量的果糖6-磷酸磷酸酶孵育后，由葡萄糖1-磷酸制备的果糖数量。PGM是级联反应的限制性酶。表1显示，相对于先前公开的源自柯达热球菌的PGM(Uniprot IDQ68BJ6)，本发明改进方法中使用的PGM具有改善的活性。参见国际专利申请公开WO2017/059278。
表1：PGM的相对活性
实例2.使用更高活性的αGP的改进方法。
以下列方式测定每种αGP的相对活性。制备200μL反应液，其中包含25mM磷酸钠(pH7.2)、5mM MgCl2、20g/L麦芽糊精DE 4-7、9μgαGP和0.1g/L PGM，并在50℃下孵育。在不同的时间点将样品与1.5mM NAD+和3U/mL葡萄糖6-磷酸脱氢酶混合。每个时间点在340nm处的吸光度用于获得反应速率。该速率用于确定每种αGP的比活性，以比较相对活性。
表2显示，相对于先前公开的源自海栖热袍菌的αGP(Uniprot ID G4FEH8)，本发明改进方法中使用的αGP具有改善的活性。参见国际专利申请公开WO2017/059278。
表2：αGP的相对活性
实例3.使用更高活性的4GT的改进方法。
以下列方式测定每种4GT的相对活性。制备200μL反应液，其中包含50mM磷酸钠(pH7.2)、5mM MgCl2、20g/L麦芽三糖和9μg 4GT，并在50℃下孵育。在不同的时间点将样品与1.5mM NAD+、1mM ATP、1U/mL己糖激酶和1U/mL葡萄糖6-磷酸脱氢酶混合。每个时间点在340nm处的吸光度用于获得反应速率。该速率用于确定每种4GT的比活性，以比较相对活性。
表3显示，相对于先前公开的源自栖热球菌的4GT(Uniprot ID O32462)，本发明改进方法中使用的4GT具有改善的活性。参见国际专利申请公开WO2018/169957。
表3：4GT的相对活性
实例4.使用更高活性的SP的改进方法。
分离并分析推测与Uniprot ID D9TT09(Verhaeghe et al.The quest for athermostable sucrose phosphorylase reveals sucrose 6'-phosphate phosphorylaseas a novel specificity.Appl Microbiol Biotechnol.2014Aug；98(16):7027-37)同源的各种蔗糖磷酸化酶，以将蔗糖转化为葡萄糖6-磷酸。
以下列方式测定每种SP的相对效率。制备25mM磷酸钠(pH 7.2)、5mM MgCl2、200g/L蔗糖、0.15g/L SP、0.1g/L PGM、0.1g/L PGI和0.3g/L F6PP的反应溶液，并在50℃下孵育。在0小时、2小时、6小时和8小时取样。反应通过用Vivaspin 2浓缩器(10,000MWCO)过滤酶来终止。使用Supel Cogel Pb色谱柱和折射率检测器评估果糖产物。将样品在80℃的超纯水中以0.6mL/min的速度运行25分钟。用2小时制备的果糖数量确定每个SP的相对活性。6小时制备的果糖数量(在8小时时完成验证)显示了每种SP可达到的最大产率的差异。
还研究了对蔗糖完全转化为果糖的影响。在相对于参比(下表)测试的八种酶中，有七种显示出比Uniprot ID D9TT09更高的活性，一种在由蔗糖制成果糖时显示出出乎意料的优势。图18显示了蔗糖磷酸化酶活性的色谱图，将Uniprot ID D9TT09(参比SP)与Uniprot ID F6BJS0进行了比较。在2小时时，较高活性的SP产生的果糖量约为参比SP的150％。底部色谱图比较了Uniprot ID D9TT09(参比SP)和Uniprot ID F6BJS0的最大产率。在6小时(两个反应的最大产率)时，较高活性的SP产生的果糖量约为参比SP的130％。有趣的是，相对产率并不与相对活性直接相关。据推测，影响因素包括果糖对蔗糖磷酸化酶的产物抑制、逆反应的速率 —更广泛地讲是果糖的形成与反应后期果糖的降解之间的平衡。源自达氏嗜热菌(Thermanaerothrix daxensis)(Uniprot IDA0A0N8GPZ6)的比较SP具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，其与先前公开的SP相比，显示出较低的相对活性和较低的果糖最大产率。
表4：SP的相对活性和可达到的产率
实例5.改进的G6P酶法生产。
为了使酶活性的改善直观化，使用先前公开的αGP(Uniprot ID G4FEH8)和PGM(Uniprot ID Q68BJ6)进行了麦芽糊精向G6P的转化，并与使用较高活性的αGP(Uniprot IDD1B926)和PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1)的方法进行了比较。将含有20g/L麦芽糊精DE 5、50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)、5mM MgCl2、0.05g/LαGP和0.005g/L PGM的200μL反应混合物在50℃下孵育30分钟。反应通过使用Vivaspin2浓缩器(30,000MWCO)过滤酶来终止，并使用Agilent Hi-Plex H柱和折射率检测器通过HPLC(Agilent 1100系列)进行分析。在65℃下将样品在5mM H2SO4中以0.6mL/min的速度运行15.5分钟。由于空白、麦芽糊精和G6P的峰挨得太近，无法对任何单独的成分可靠地进行定量，因此结果没有定量(图17)，但是用αGP(Uniprot ID D1B926)和PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1)酶明显产生了更多的G6P。
序列表
<110> 博努莫斯股份有限公司
<120> 酶法生产己糖
<130> 146.0010-WO00
<150> 62/752,061
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<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 柯达热球菌
<400> 1
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Val Tyr Phe Gly Val Lys Gly Glu Ser Leu Ser Asp Ser Glu Ala Lys
545 550 555 560
Leu Gln Gln Leu Ser Asp Thr Val Met Glu Arg Val Arg Gly Phe Leu
565 570 575
Asn Thr Ala Ser Pro Phe Gln Pro
580
<210> 5
<211> 582
<212> PRT
<213> 溶氧帕拉热芽孢杆菌 NBRC 107762
<400> 5
Met Asp Trp Lys Ser Lys Tyr Glu Gln Trp Met Ala Tyr Glu Gln Leu
1 5 10 15
Asp Gly Glu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Asp Arg Gln Asp Asp Leu Lys
20 25 30
Trp Val Glu Asp Gly Phe Tyr Lys Asn Leu Glu Phe Gly Thr Gly Gly
35 40 45
Met Arg Gly Glu Ile Gly Pro Gly Thr Asn Arg Met Asn Ile Tyr Thr
50 55 60
Val Arg Lys Ala Ser Glu Gly Leu Ala Arg Tyr Ile Glu Ser Phe Gly
65 70 75 80
Glu Glu Ala Lys Lys Arg Gly Val Val Ile Ala Tyr Asp Ser Arg His
85 90 95
Lys Ser Arg Asp Phe Ala Met Glu Ala Ala Lys Thr Leu Ala Thr His
100 105 110
Gly Ile Gln Thr Tyr Val Phe Asp Glu Leu Arg Pro Thr Pro Glu Leu
115 120 125
Ser Phe Ala Val Arg Tyr Leu Gln Ala Phe Ser Gly Ile Val Ile Thr
130 135 140
Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Glu
145 150 155 160
Asp Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asp Thr Ala Asp Ala Val Ile Arg Tyr
165 170 175
Val Asn Glu Val Ala Asn Glu Leu Asp Ile His Val Glu Asp Glu Ala
180 185 190
Ile Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Gln Ile Ile Gly Glu Glu Val Asp
195 200 205
Asn Ala Tyr Ile Asp Ala Val Lys Thr Ile Ser Leu Gln Pro Lys Leu
210 215 220
Ala Glu Glu Val Asp Ile Asn Ile Val Phe Thr Pro Leu His Gly Thr
225 230 235 240
Ser Asn Lys Pro Val Arg Arg Ala Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Arg Asn
245 250 255
Val Phe Val Val Lys Glu Gln Glu Gln Pro Asp Pro Asn Phe Ser Thr
260 265 270
Val Ala Ser Pro Asn Pro Glu Glu His Ala Ala Phe Ala Leu Ala Ile
275 280 285
Glu Leu Gly Lys Lys Val Asn Ala Asp Leu Leu Ile Ala Thr Asp Pro
290 295 300
Asp Ala Asp Arg Leu Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Gln Gly Glu Tyr
305 310 315 320
Val Val Leu Thr Gly Asn Gln Thr Gly Ala Leu Leu Leu His Tyr Leu
325 330 335
Leu Ser Gln Arg Lys Glu Lys Glu Ile Leu Pro Glu Asn Gly Val Val
340 345 350
Leu Lys Thr Ile Val Thr Ser Glu Phe Gly Arg Ala Ile Ala Gln Ser
355 360 365
Phe Gly Leu Glu Thr Val Asp Thr Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly
370 375 380
Glu Lys Ile Lys Glu Tyr Glu Gln Thr Gly Gln Tyr Thr Phe Gln Phe
385 390 395 400
Gly Tyr Glu Glu Ser Tyr Gly Tyr Leu Ile Gly Asp Phe Val Arg Asp
405 410 415
Lys Asp Ala Val Gln Ala Ala Val Leu Ala Ala Glu Val Cys Ala Phe
420 425 430
Tyr Lys Lys Gln Gly Met Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Ile His Leu Phe
435 440 445
Asp Arg Tyr Gly Tyr Tyr Arg Glu Gly Gln Gln Ser Leu Thr Leu Lys
450 455 460
Gly Lys Glu Gly Ala Glu Thr Ile Gln Ala Ile Leu Thr Ser Phe Arg
465 470 475 480
Asn Glu Pro Pro Thr Glu Val Asp Gly Lys Arg Val Thr Val Ile Glu
485 490 495
Asp Tyr Lys Thr Lys Glu Arg Ile His Thr Leu Thr Gly Glu Lys Thr
500 505 510
Val Ile Thr Leu Pro Thr Ser Asn Val Leu Lys Tyr Val Leu Glu Asp
515 520 525
Asp Ser Trp Phe Cys Leu Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys
530 535 540
Val Tyr Phe Gly Val Lys Gly Lys Ser Leu Ala Asp Ser Glu Glu Lys
545 550 555 560
Leu Asn Arg Leu Ser Asn Glu Val Met Lys Arg Val His Asp Leu Leu
565 570 575
Arg Thr Ala Ser Leu Ser
580
<210> 6
<211> 567
<212> PRT
<213> 膨大热臂菌 DSM 8682
<400> 6
Met Glu Tyr Met Ser Met Tyr Lys Arg Trp Leu Glu Phe Asp Glu Glu
1 5 10 15
Thr Arg Arg Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Lys Glu Ile Met Glu Arg
20 25 30
Phe Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gly Thr Gly Gly Leu Arg Gly Ile Ile
35 40 45
Gly Ala Gly Thr Asn Arg Met Asn Val Tyr Thr Val Arg Lys Ala Thr
50 55 60
Gln Gly Leu Ala Asn Phe Ile Leu Lys Gln Asn Ile Glu Asn Pro Ser
65 70 75 80
Val Ala Ile Ala Tyr Asp Ser Arg Lys Tyr Ser Asp Val Phe Ala Lys
85 90 95
Glu Ala Ala Leu Val Leu Asn Ala Ser Gly Ile Lys Thr Tyr Ile Tyr
100 105 110
Asp Glu Leu Lys Pro Thr Pro Met Leu Ser Tyr Ala Val Arg His Met
115 120 125
Lys Ala Thr Ala Gly Ile Val Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Lys Glu
130 135 140
Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Trp Ser Asp Gly Gly Gln Val Thr Glu
145 150 155 160
Glu Leu Ala Glu Gly Ile Leu Asn Glu Ile Lys Asn Val Asp Tyr Ser
165 170 175
Asp Ile Lys Arg Met Asp Tyr Asp Glu Ala Ile Glu Lys Gly Leu Phe
180 185 190
Asn Phe Met Pro Lys Glu Val Glu Asp Thr Tyr Val Lys Leu Val Lys
195 200 205
Gly Leu Thr Val Asn Lys Glu Leu Val Glu Lys Met Lys Asp Lys Val
210 215 220
Lys Val Ile Tyr Thr Pro Leu His Gly Thr Gly Asn Lys Pro Val Arg
225 230 235 240
Arg Val Leu Glu Glu Leu Gly Tyr Lys Asn Val Tyr Val Val Lys Glu
245 250 255
Gln Glu Asn Pro Asp Pro Ala Phe Ser Thr Val Lys Tyr Pro Asn Pro
260 265 270
Glu Glu Ser Glu Val Phe Thr Arg Ala Met Glu Met Ala Arg Glu Leu
275 280 285
Asp Ala Asp Val Ile Ile Gly Thr Asp Pro Asp Cys Asp Arg Val Gly
290 295 300
Val Val Val Lys Asn Ser Glu Gly Asn Tyr Val Val Leu Thr Gly Asn
305 310 315 320
Gln Thr Gly Ala Leu Leu Thr His Tyr Met Leu Glu Asn Leu Lys Ala
325 330 335
Thr Asn Thr Ile Pro Lys Asn Pro Val Val Ile Lys Thr Ile Val Thr
340 345 350
Thr Glu Phe Ala Arg Ala Ile Cys Lys Asp Tyr Gly Val Glu Ile Leu
355 360 365
Asp Val Leu Thr Gly Phe Lys Tyr Ile Gly Glu Lys Ile Lys Glu Phe
370 375 380
Glu Ile Asn Gly Asp Met Asn Phe Ile Leu Gly Phe Glu Glu Ser Tyr
385 390 395 400
Gly Tyr Leu Ala Gly Thr Phe Val Arg Asp Lys Asp Ala Val Ile Ala
405 410 415
Ser Met Leu Ile Val Glu Met Val Cys Tyr Tyr Lys Asp Arg Gly Met
420 425 430
Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Met Glu Leu Tyr Asn Lys Tyr Gly Phe Tyr
435 440 445
Lys Glu Asp Leu Val Ser Ile Thr Leu Lys Gly Ile Glu Gly Ser Glu
450 455 460
Lys Ile Lys Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asn Pro Pro Lys Lys
465 470 475 480
Val Ala Asp Leu Ser Val Lys Leu Val Lys Asp Tyr Lys Met Ser Val
485 490 495
Thr Lys Asn Val Val Ser Gly Glu Glu Glu Val Ile Glu Leu Pro Lys
500 505 510
Ser Asn Val Ile Gln Leu Val Leu Glu Asp Gly Ser Val Ile Thr Ala
515 520 525
Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys Phe Tyr Phe Met Thr Lys
530 535 540
Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ala Glu Glu Asn Ile Lys Arg Phe Lys Glu
545 550 555 560
Glu Ile Leu Lys Met Ala Glu
565
<210> 7
<211> 473
<212> PRT
<213> 嗜热厌氧菌
<400> 7
Met Ser His Thr Ile Arg Phe Gly Thr Asp Gly Trp Arg Gly Val Ile
1 5 10 15
Ala Glu Asp Tyr Thr Phe Ala Asn Val Arg Cys Ala Thr Gln Gly Tyr
20 25 30
Ala Ser Tyr Met Ile Arg His Gly Lys Ala Gly Ala Thr Phe Val Ile
35 40 45
Gly His Asp Lys Arg Phe His Ser Glu Asn Phe Ala Leu Ala Ala Ala
50 55 60
Glu Val Met Ala Gly Asn Gly Leu Lys Val Leu Leu Thr Asp Gly Ala
65 70 75 80
Thr Pro Thr Pro Val Ile Ala Phe Ser Val Val His His Lys Ala Ala
85 90 95
Gly Ala Ile Asn Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Thr Asp Asn Gly
100 105 110
Phe Lys Val Arg Asn Glu Phe Gly Gly Ala Ile Asp Pro Glu Gly Leu
115 120 125
Lys Glu Ile Glu Ser Leu Ile Pro Glu Asp Glu Ser Glu Val Lys Arg
130 135 140
Met Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ala Lys Gly Leu Ile Gln Arg Phe Asp
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ala Tyr Ile Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Asp Val Glu
165 170 175
Pro Ile Lys Gln Ala Gly Leu Lys Ile Val Val Asp Cys Met Trp Gly
180 185 190
Asn Gly Ala Gly Trp Phe Pro Arg Ile Leu Ser Gly Gly Lys Thr Glu
195 200 205
Ile Ile Glu Ile His Asn Glu Arg Asn Pro Ile Phe Pro Glu Met Lys
210 215 220
Arg Pro Glu Pro Ile Pro Pro Asn Ile Asn Val Gly Leu Lys Lys Thr
225 230 235 240
Val Asp Ser Gly Ala Asp Val Leu Leu Ile Thr Asp Gly Asp Ala Asp
245 250 255
Arg Val Gly Val Gly Asp Glu Lys Gly Asn Phe Ile Asn Gln Leu Gln
260 265 270
Val Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Glu Val Arg Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ile Val Lys Thr Leu Ser Thr Thr Ser Met Leu Glu Lys Leu
290 295 300
Gly Lys Met Tyr Asn Ile Pro Val Tyr Glu Thr Gly Val Gly Phe Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Pro Lys Met Leu Glu Thr Asn Ala Met Ile Gly Gly Glu
325 330 335
Glu Ser Gly Gly Tyr Ala Phe Arg Gly Asn Val Pro Glu Arg Asp Gly
340 345 350
Ile Leu Ala Gly Leu Tyr Ile Leu Asp Met Met Val Lys Leu Gln Arg
355 360 365
Lys Pro Ser Glu Leu Ile Asp Leu Leu Phe Ser Lys Val Gly Pro His
370 375 380
Phe Tyr Asp Arg Ile Asp Arg Thr Phe Thr Gly Glu Arg Ser Ala Arg
385 390 395 400
Glu Gln Ala Ile Leu Ala Ala Asn Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu Lys
405 410 415
Val Thr Gly Leu Asn Thr Thr Asp Gly Phe Lys Phe Ser Leu Glu Asp
420 425 430
Gly Gly Trp Leu Leu Ile Arg Phe Ser Gly Thr Glu Pro Ile Met Arg
435 440 445
Val Tyr Cys Glu Thr Thr His Lys Asp Arg Val Pro Tyr Ile Leu Lys
450 455 460
Asp Gly Leu Lys Ile Ala Gly Leu Glu
465 470
<210> 8
<211> 473
<212> PRT
<213> 达氏嗜热菌
<400> 8
Met Gly His Lys Ile Met Phe Gly Thr Asp Gly Trp Arg Gly Val Ile
1 5 10 15
Ala Glu Asp Tyr Thr Phe Asp Asn Val Arg Arg Cys Ala Gln Gly Phe
20 25 30
Ala His Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Tyr Lys Asp Glu Trp Val Val Val
35 40 45
Gly Tyr Asp Lys Arg Phe His Ser Glu Asn Phe Ala Gln Ala Ala Ala
50 55 60
Glu Val Leu Cys Gly Asn Gly Phe Arg Val Tyr Leu Thr Asp Lys Ala
65 70 75 80
Thr Pro Thr Pro Val Ile Ala Tyr Ala Val Val Glu Arg Lys Ala Ile
85 90 95
Gly Ala Val Asn Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Thr Asp Asn Gly
100 105 110
Phe Lys Val Arg Asp Ala Ser Gly Gly Ala Ile Asp Pro Glu Gly Leu
115 120 125
Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ile Pro Asp Glu Met Ser Ala Val Lys Arg
130 135 140
Met Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ala Gln Gly Arg Leu Val Arg Phe Asp
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ala Tyr Ile Glu His Leu Lys Ser Leu Ile Asp Leu Gln
165 170 175
Pro Ile Arg Asp Ala Gly Leu Lys Ile Val Val Asp Ala Met Trp Gly
180 185 190
Asn Gly Ala Gly Trp Phe Pro Arg Leu Leu Ala Gly Gly Lys Thr Glu
195 200 205
Val Tyr Glu Ile His Asn Thr Arg Asn Pro Ile Phe Pro Glu Met Lys
210 215 220
Arg Pro Glu Pro Ile Pro Pro Asn Ile Asp Val Gly Leu Arg Thr Thr
225 230 235 240
Val Glu Arg Arg Ala Asp Val Leu Val Val Thr Asp Gly Asp Ala Asp
245 250 255
Arg Val Gly Ile Gly Asp Glu His Gly Arg Phe Val Asn Gln Leu Gln
260 265 270
Val Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Tyr Leu Leu Glu Val Arg Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Pro Ile Ile Lys Thr Leu Ser Thr Thr Ser Met Leu Glu Lys Leu
290 295 300
Gly Glu Ile Tyr Gly Val Pro Val Tyr Glu Thr Gly Val Gly Phe Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Pro Lys Phe Leu Glu Thr Asn Ala Leu Ile Gly Gly Glu
325 330 335
Glu Ser Gly Gly Tyr Ala Phe Arg Gly Asn Val Pro Glu Arg Asp Gly
340 345 350
Ile Leu Ala Gly Leu Tyr Phe Leu Asp Met Met Val Arg Leu Asn Arg
355 360 365
Lys Pro Ser Gln Leu Leu Glu Leu Leu Phe Ser Lys Val Gly Pro His
370 375 380
Tyr Tyr Asp Arg Val Asp Arg Gln Phe Thr Gly Asp Arg Lys Thr Arg
385 390 395 400
Glu Glu Met Ile Leu Asn Ala Asn Pro His Thr Ile Gly Gly Leu Lys
405 410 415
Val Val Gly Leu Asn Thr Leu Asp Gly Phe Lys Phe Leu Leu Glu Asp
420 425 430
Gly Gly Trp Met Leu Ile Arg Phe Ser Gly Thr Glu Pro Ile Ile Arg
435 440 445
Val Tyr Cys Glu Thr Thr His Pro Asp Arg Val Gln Pro Ile Leu Gln
450 455 460
Asp Gly Leu Arg Ile Ala Gly Leu Ala
465 470
<210> 9
<211> 822
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<400> 9
Met Leu Glu Lys Leu Pro Glu Asn Leu Lys Glu Leu Glu Ser Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg
20 25 30
Met Ile Asp Ser Glu Lys Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile
35 40 45
Leu Arg Glu Val Ser Lys Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Glu
50 55 60
Asp Phe Ile Ala Leu Tyr Glu Leu Thr Leu Glu Arg Phe Thr Asp Tyr
65 70 75 80
Met Glu Arg Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp
85 90 95
Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys
115 120 125
Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Tyr
130 135 140
Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Ser Asp Gly Arg Gln Ile
145 150 155 160
Glu Ile Phe Pro Glu Tyr Asp Ile Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Leu
165 170 175
Arg Asp Glu Asp Gly Asn Gln Val Ile Val Glu Val Pro Ile Asp Asn
180 185 190
Asp Thr Val Lys Ala Arg Val Phe Glu Val Gln Val Gly Arg Val Lys
195 200 205
Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asp Phe Glu Glu Asn Glu Asp Arg Phe Arg
210 215 220
Lys Ile Cys Asp Tyr Leu Tyr Asn Pro Glu Pro Asp Val Arg Val Ser
225 230 235 240
Gln Glu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Gly Met Lys Leu Leu Lys Thr Leu
245 250 255
Lys Ile Lys Pro Gly Val Ile His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe
260 265 270
Ser Ser Leu Glu Arg Ile Lys Ser Tyr Met Glu Glu Gly Tyr Ser Phe
275 280 285
Thr Glu Ala Leu Glu Ile Val Arg Gln Thr Thr Val Phe Thr Thr His
290 295 300
Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Phe Val Glu
305 310 315 320
Lys Lys Leu Thr Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Ser Lys Glu Leu Leu
325 330 335
Met Asn Leu Gly Lys Asp Glu Asp Gly Asn Phe Asn Met Thr Tyr Leu
340 345 350
Ala Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ile Asn Gly Val Ser Lys Leu His Ala
355 360 365
Asp Val Ser Arg Arg Met Phe Lys Asn Val Trp Lys Gly Val Pro Val
370 375 380
Glu Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr Asn Gly Val His Met Gly Thr
385 390 395 400
Trp Ile Asn Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Leu Gly Arg
405 410 415
Val Trp Arg Glu His Thr Asp Leu Glu Gly Ile Trp Tyr Gly Val Asp
420 425 430
Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys
435 440 445
Arg Phe Ile Asp Tyr Ile Arg Glu Ser Ile Lys Arg Arg Asn Glu Arg
450 455 460
Leu Gly Ile Asn Glu Pro Leu Pro Glu Ile Ser Glu Asn Val Leu Ile
465 470 475 480
Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu
485 490 495
Phe Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Arg Ile Val Asn Asn Ser Glu Arg
500 505 510
Pro Val Tyr Ile Val Tyr Ala Gly Lys Ala His Pro Arg Asp Glu Gly
515 520 525
Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Ile Tyr Glu Val Ser Gln Met Pro Asp
530 535 540
Phe Lys Asn Lys Ile Ile Val Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Met Ala
545 550 555 560
Arg Leu Met Val Ser Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg
565 570 575
Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Ala Asn Gly
580 585 590
Val Leu Asn Ala Ser Val Tyr Asp Gly Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn
595 600 605
Gly Arg Asn Gly Trp Val Ile Gly Asp Glu Ser Val Leu Pro Glu Thr
610 615 620
Glu Ala Asp Asp Pro Lys Asp Ala Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Leu Glu
625 630 635 640
Asn Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Glu Asn Arg Glu Lys Trp Ile Phe
645 650 655
Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Val Ala Pro Lys Phe Ser Thr Thr
660 665 670
Arg Met Leu Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Ile Lys Gly Leu Val
675 680 685
Asn Arg Glu Trp Leu Glu Arg Arg Glu Asn Val Glu Lys Ile Gly Ala
690 695 700
Trp Lys Glu Arg Ile Leu Lys Asn Trp Glu Asn Val Ser Ile Glu Arg
705 710 715 720
Ile Val Leu Glu Asp Ser Lys Ser Val Glu Val Thr Val Lys Leu Gly
725 730 735
Asp Leu Thr Pro Asn Asp Val Ile Val Glu Leu Val Ala Gly Arg Gly
740 745 750
Glu Gly Met Glu Asp Leu Glu Val Trp Lys Val Ile His Ile Arg Arg
755 760 765
Tyr Arg Lys Glu Asn Asp Leu Phe Val Tyr Thr Tyr Thr Asn Gly Val
770 775 780
Leu Gly His Leu Gly Ser Pro Gly Trp Phe Tyr Ala Val Arg Val Ile
785 790 795 800
Pro Tyr His Pro Arg Leu Pro Ile Lys Phe Leu Pro Glu Val Pro Val
805 810 815
Val Trp Lys Lys Val Leu
820
<210> 10
<211> 819
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<220>
<221> 各个_特征
<222> (745)..(745)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 10
Met Asn Val Leu Gly Arg Ile Thr Ala Met Pro Asp Leu Pro Glu Pro
1 5 10 15
Leu Glu Gly Leu Lys Glu Ile Ala Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Asn
20 25 30
Pro Glu Ala Ala Glu Leu Phe Gln Glu Leu Asp Pro Ala Leu Trp Lys
35 40 45
Arg Phe Arg Gly Asn Pro Val Lys Leu Leu Leu Glu Leu Asp Pro Ala
50 55 60
Arg Leu Glu Ala Leu Ser Ala Ser Gly Tyr Ala Ala Arg Val Gln Ala
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Ala Arg Arg Thr Lys Arg
85 90 95
Gly Pro Leu Val Ala Tyr Phe Ser Ala Glu Tyr Gly Phe His Ser Ser
100 105 110
Leu Pro Ile Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Val Leu Ala Gly Asp His Val
115 120 125
Lys Ala Ala Ser Asp Leu Gly Leu Asn Leu Val Gly Val Gly Leu Phe
130 135 140
Tyr His Glu Gly Tyr Phe His Gln Arg Leu Ser Pro Glu Gly Glu Gln
145 150 155 160
Val Glu Val Tyr Glu Pro Leu Arg Pro Glu Glu Leu Pro Leu Val Pro
165 170 175
Val Gln Asp Ala Glu Gly Arg Pro Val Arg Val Ala Val Glu Phe Pro
180 185 190
Gly Arg Leu Val His Val Gly Gly Tyr Arg Val Gln Val Gly Ala Val
195 200 205
Pro Val Tyr Leu Leu Thr Thr Asp Leu Pro Glu Asn Ala Pro Glu Asp
210 215 220
Arg Gln Ile Thr Ala Arg Leu Tyr Ala Ala Gly Leu Glu Ala Arg Ile
225 230 235 240
Gln Gln Glu Leu Val Leu Gly Leu Gly Gly Val Arg Phe Leu Arg Ala
245 250 255
Leu Gly Leu Ala Pro Ala Phe Phe His Met Asn Glu Gly His Ser Ala
260 265 270
Phe Leu Gly Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Val Ala Glu Gly Tyr Pro
275 280 285
Phe Arg Glu Ala Leu Glu Leu Ala Arg Ala Ser Ala Leu Phe Thr Thr
290 295 300
His Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Val Phe Pro Leu Asp Leu Val
305 310 315 320
Asp Arg Tyr Leu Gly Gly Phe Trp Glu Lys Leu Gly Val Asp Arg Asp
325 330 335
Thr Phe Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Lys Pro Trp Gly Pro Val Phe
340 345 350
Ser Met Ser Asn Leu Ala Leu Arg Thr Ala Ala Gln Ala Asn Gly Val
355 360 365
Ser Arg Leu His Gly Glu Val Ser Arg Asn Met Phe Arg His Leu Trp
370 375 380
Pro Gly Leu Leu Ala Glu Glu Val Pro Ile Gly His Val Thr Asn Gly
385 390 395 400
Val His Thr Trp Thr Phe Leu His Pro Arg Leu Arg Arg His Tyr Ala
405 410 415
Glu Val Phe Gly Pro Glu Trp Val Glu Arg Pro Glu Asp Pro Glu Thr
420 425 430
Trp Arg Val Glu Gly Leu Gly Glu Ala Phe Trp Arg Ile Arg Gln Asp
435 440 445
Leu Lys Leu Phe Leu Val Arg Glu Val Arg Gln Arg Leu Tyr Glu Gln
450 455 460
Arg Arg Arg Asn Gly Glu Gly Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Glu Lys
465 470 475 480
Ala Leu Asp Pro Glu Ala Leu Thr Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala
485 490 495
Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu Phe Lys Asp Pro Glu Arg Leu Leu
500 505 510
Arg Ile Leu Lys Gly Pro Tyr Pro Val Gln Phe Val Phe Ala Gly Lys
515 520 525
Ala His Pro Lys Asp Glu Ala Gly Lys Ala Tyr Leu Gln Glu Leu Val
530 535 540
Ser Lys Ile Arg Glu Tyr Gly Leu Glu Asp Arg Met Val Val Leu Glu
545 550 555 560
Asp Tyr Asp Met Tyr Leu Ala Arg Val Leu Thr His Gly Ser Asp Val
565 570 575
Trp Leu Asn Thr Pro Arg Arg Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly
580 585 590
Met Lys Ala Ala Leu Asn Gly Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Asp Gly
595 600 605
Trp Trp Ala Glu Ala Tyr Asn Gly Lys Asn Gly Phe Ala Ile Gly Asp
610 615 620
Glu Arg Val Tyr Glu Ser Glu Glu Ala Gln Asp Val Ala Asp Ala Gln
625 630 635 640
Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Glu Ser Glu Val Ile Pro Leu Phe Tyr Ala
645 650 655
Lys Gly Leu Glu Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Met Ser Met Val His Glu
660 665 670
Ser Leu Arg Thr Val Gly Pro Tyr Phe Ser Ala Gly Arg Met Val Arg
675 680 685
Asp Tyr Leu Ala Leu Tyr Glu Arg Gly Ala Leu Trp Glu Lys Glu Ala
690 695 700
Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Ala Phe Ala Glu Ala Leu Pro Ala
705 710 715 720
Phe His Ala Leu Gly Val Arg Pro Glu Val Pro Gly Asp Leu Thr Leu
725 730 735
Asn Gly Gly Arg Leu Glu Val Gly Xaa Val Leu Glu Gly Glu Val Pro
740 745 750
Glu Gly Leu Arg Pro His Leu Arg Val Gln Leu Val Val Arg Arg Leu
755 760 765
Gly Gly Gly Leu Glu Val Val Asp Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Arg
770 775 780
Tyr Arg Thr Ala Phe Arg Pro Thr Arg Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Gly
785 790 795 800
Leu Arg Leu Ala Leu Leu His Pro Val Thr Gly Arg Val Glu Trp Val
805 810 815
Arg Trp Ala
<210> 11
<211> 809
<212> PRT
<213> 栖热菌属 sp. CCB_US3_UF1
<400> 11
Met Pro Leu Leu Pro Glu Pro Leu Ser Gly Leu Lys Glu Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Asn Leu Trp Trp Ser Trp Asn Pro Glu Ala Ala Glu Leu Phe Gln Glu
20 25 30
Ile Asp Pro Ser Leu Trp Lys Arg Phe Arg Gly Asn Pro Val Lys Leu
35 40 45
Leu Leu Glu Ala Asp Pro Gly Arg Leu Glu Gly Leu Ala Ala Thr Ser
50 55 60
Tyr Pro Ala Arg Val Gly Ala Val Val Glu Ala Leu Arg Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Arg Glu Glu Lys Gln Gly Pro Leu Val Ala Tyr Phe Ser Ala
85 90 95
Glu Tyr Gly Phe His Ser Ser Leu Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly
100 105 110
Val Leu Ala Gly Asp His Val Lys Ala Ala Ser Asp Leu Gly Leu Asn
115 120 125
Leu Val Gly Val Gly Ile Phe Tyr His Glu Gly Tyr Phe His Gln Arg
130 135 140
Leu Ser Pro Glu Gly Val Gln Val Glu Val Tyr Glu Thr Leu His Pro
145 150 155 160
Glu Glu Leu Pro Leu Tyr Pro Val Gln Asp Arg Glu Gly Arg Pro Leu
165 170 175
Arg Val Gly Val Glu Phe Pro Gly Arg Thr Leu Trp Leu Ser Ala Tyr
180 185 190
Arg Val Gln Val Gly Ala Val Pro Val Tyr Leu Leu Thr Ala Asn Leu
195 200 205
Pro Glu Asn Thr Pro Glu Asp Arg Ala Ile Thr Ala Arg Leu Tyr Ala
210 215 220
Pro Gly Leu Glu Met Arg Ile Gln Gln Glu Leu Val Leu Gly Leu Gly
225 230 235 240
Gly Val Arg Leu Leu Arg Ala Leu Gly Leu Ala Pro Glu Val Phe His
245 250 255
Met Asn Glu Gly His Ser Ala Phe Leu Gly Leu Glu Arg Val Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ala Glu Gly His Pro Phe Pro Val Ala Leu Glu Leu Ala Arg
275 280 285
Ala Gly Ala Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp
290 295 300
Ala Phe Pro Leu Glu Leu Val Glu Arg Tyr Leu Gly Gly Phe Trp Glu
305 310 315 320
Arg Met Gly Thr Asp Arg Glu Thr Phe Leu Ser Leu Gly Leu Glu Glu
325 330 335
Lys Pro Trp Gly Lys Val Phe Ser Met Ser Asn Leu Ala Leu Arg Thr
340 345 350
Ser Ala Gln Ala Asn Gly Val Ser Arg Leu His Gly Glu Val Ser Arg
355 360 365
Glu Met Phe His His Leu Trp Pro Gly Phe Leu Arg Glu Glu Val Pro
370 375 380
Ile Gly His Val Thr Asn Gly Val His Thr Trp Thr Phe Leu His Pro
385 390 395 400
Arg Leu Arg Arg His Tyr Ala Glu Val Phe Gly Pro Glu Trp Arg Lys
405 410 415
Arg Pro Glu Asp Pro Glu Thr Trp Lys Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu
420 425 430
Phe Trp Gln Ile His Lys Asp Leu Arg Ala Glu Leu Val Arg Glu Val
435 440 445
Arg Thr Arg Leu Tyr Glu Gln Arg Arg Arg Asn Gly Glu Ser Pro Ser
450 455 460
Arg Leu Arg Glu Ala Glu Lys Val Leu Asp Pro Glu Ala Leu Thr Ile
465 470 475 480
Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu Phe
485 490 495
Lys Asp Pro Glu Arg Leu Arg Arg Leu Leu His Gly His Tyr Pro Ile
500 505 510
Gln Phe Val Phe Ala Gly Lys Ala His Pro Lys Asp Glu Pro Gly Lys
515 520 525
Ala Tyr Leu Gln Glu Leu Phe Ala Lys Ile Arg Glu Tyr Gly Leu Glu
530 535 540
Asp Arg Met Val Val Leu Glu Asp Tyr Asp Met Tyr Leu Ala Arg Val
545 550 555 560
Leu Val His Gly Ser Asp Val Trp Leu Asn Thr Pro Arg Arg Pro Met
565 570 575
Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Leu Asn Gly Ala Leu
580 585 590
Asn Leu Ser Val Leu Asp Gly Trp Trp Ala Glu Ala Tyr Asn Gly Lys
595 600 605
Asn Gly Phe Ala Ile Gly Asp Glu Arg Val Tyr Glu Ser Glu Glu Ala
610 615 620
Gln Asp Met Ala Asp Ala Gln Ala Leu Tyr Asp Val Leu Glu Phe Glu
625 630 635 640
Val Leu Pro Leu Phe Tyr Ala Lys Gly Pro Glu Gly Tyr Ser Ser Gly
645 650 655
Trp Leu Ser Met Val His Glu Ser Leu Arg Thr Val Gly Pro Arg Tyr
660 665 670
Ser Ala Ala Arg Met Val Gly Asp Tyr Leu Glu Ile Tyr Arg Arg Gly
675 680 685
Gly Ala Trp Ala Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Glu Ala Leu Ala Ala
690 695 700
Phe His Gln Ala Leu Pro Ala Leu Gln Gly Val Thr Leu Arg Ala Gln
705 710 715 720
Val Pro Gly Asp Leu Thr Leu Asn Gly Val Pro Met Arg Val Arg Ala
725 730 735
Phe Leu Glu Gly Glu Val Pro Glu Ala Leu Arg Pro Phe Leu Glu Val
740 745 750
Gln Leu Val Val Arg Arg Ser Ser Gly His Leu Glu Val Val Pro Met
755 760 765
Arg Pro Gly Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Tyr Arg Pro Ser Arg Pro
770 775 780
Gly Ser Tyr Ala Tyr Gly Val Arg Leu Ala Leu Arg His Pro Ile Thr
785 790 795 800
Gly His Val Ala Trp Val Arg Trp Ala
805
<210> 12
<211> 541
<212> PRT
<213> 假乙醇热厌氧菌菌株 ATCC 33223
<400> 12
Met Gly Asn Glu Lys Leu Pro Arg Val Ala Tyr Phe Cys Met Glu Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Gln Ser Asp Phe Lys Leu Tyr Ala Gly Gly Leu Gly Ile Leu
20 25 30
Ala Gly Asp His Leu Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gly Met Pro Leu Val
35 40 45
Gly Ile Gly Ile Leu Trp Lys Gln Gly Tyr Thr Glu Gln His Ile Gly
50 55 60
Glu Asp Gly Tyr Pro Tyr Asp Ala Tyr Arg Asn Tyr Thr Arg Lys Tyr
65 70 75 80
Asp Phe Leu Lys Asp Thr Gly Val Lys Val Lys Val Lys Ile Arg Asn
85 90 95
Arg Asn Val Tyr Cys Lys Val Trp Leu Ile Asp Asn Phe Asp Asn Ala
100 105 110
Pro Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asp Ile Pro Glu Asn Gly Asp Arg Trp
115 120 125
Ile Thr Gly Gln Leu Tyr Gly Trp Phe Gly Glu Glu Arg Val Ala Gln
130 135 140
Glu Ile Val Leu Gly Ile Gly Gly Val Arg Ala Leu Arg Ala Leu Gly
145 150 155 160
Ile Asp Val Asp Val Tyr His Phe Asn Glu Gly His Ala Val Leu Ala
165 170 175
Ala Ile Glu Leu Ile Arg Glu Lys Met Glu Asn Gln Asn Met Ser Phe
180 185 190
Glu Glu Ala Trp Lys Ala Thr Arg Glu Glu Val Val Phe Thr Thr His
195 200 205
Thr Pro Val Lys Glu Gly Asn Glu Ser His Asp Leu Glu Leu Leu Met
210 215 220
Tyr Met Gly Ala Asn Asn Gly Leu Ser Ile Glu Gln Met Ala Gln Ile
225 230 235 240
Gly Gly Val Pro Phe Asn Met Thr Val Ala Gly Leu Arg Leu Ser Arg
245 250 255
Ile Ala Asn Gly Val Ser Lys Leu His Gly Gln Thr Ala Asn Lys Met
260 265 270
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275 280 285
Ile Asp Arg Asn Thr Trp Val Asp Lys Arg Ile Ile Glu Ala Tyr Asn
290 295 300
Lys Gly Glu Gly Leu Leu Glu Thr His Asn Ile Leu Lys Gln Glu Leu
305 310 315 320
Ile Asp Phe Val Tyr Gln Arg Thr Gly Val Lys Leu Asp Ala Asp Lys
325 330 335
Leu Leu Ile Gly Phe Ser Arg Arg Ala Ala Pro Tyr Lys Arg Ser Asp
340 345 350
Leu Ile Phe Thr Asn Asp Glu Val Ile Gly Asp Tyr Leu Arg Ser Lys
355 360 365
Lys Ile Gln Met Val Phe Ser Gly Lys Gly His Pro Leu Asp Asp Val
370 375 380
Gly Lys Lys Ile Val Ala Lys Leu Ile Glu Met Thr Lys Lys Tyr Pro
385 390 395 400
Glu Ser Val Val Phe Leu Glu Asp Tyr Asp Met Thr Ile Gly Lys Met
405 410 415
Leu Thr Arg Gly Thr Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Leu
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Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Met Asn Gly Val Leu
435 440 445
Asn Leu Ser Ile Leu Asp Gly Trp Trp Ala Glu Ala Cys Ile Asp Gly
450 455 460
Val Asn Gly Trp Gln Phe Gly Asp Gly Phe Glu Ser Asp Asn Ile Glu
465 470 475 480
Glu Leu Asp Lys His Asp Leu Glu Ala Leu Tyr Asp Val Leu Leu Asn
485 490 495
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500 505 510
Met Arg Glu Ser Ile Arg Thr Thr Tyr Glu Ala Phe Ser Ala Asn Arg
515 520 525
Met Leu Lys Glu Tyr Tyr Asp Leu Met Tyr Thr Lys Lys
530 535 540
<210> 13
<211> 578
<212> PRT
<213> 热厌氧氨腐菌菌株 ATCC 49978
<400> 13
Met Thr Ile Met Thr Tyr Gly Asp Asn Ile Gly Asn Ser Met Leu Lys
1 5 10 15
Thr Leu Glu His Asp Pro Val Phe Arg Ser Val Ala Tyr Phe Ser Met
20 25 30
Glu Ile Ala Ile Arg Pro Glu Ile Pro Thr Tyr Ser Gly Gly Leu Gly
35 40 45
Val Leu Ala Gly Asp Ile Ile Lys Ser Ala Ala Asp Leu Gly Val Pro
50 55 60
Met Ala Ala Val Thr Leu Leu Tyr Arg Lys Gly Tyr Phe Ile Gln His
65 70 75 80
Val Asp Gln Glu Gly Tyr Gln Arg Glu Ser Pro Val Glu Trp Lys Pro
85 90 95
Glu Glu Tyr Leu Thr Leu Leu Pro Asn Glu Ile Ser Val Met Leu Glu
100 105 110
Gly Arg Pro Val Lys Val Arg Ala Trp Val Tyr Asp Tyr Val Gly Gln
115 120 125
Ser Gly Tyr Pro Leu Pro Ile Tyr Phe Leu Asp Thr Asp Phe Glu Ser
130 135 140
Asn Ala Pro Ala Asp Arg Asn Leu Thr Trp His Leu Tyr Gly Gly Asp
145 150 155 160
Gln Arg Tyr Arg Leu Cys Gln Glu Leu Ile Leu Gly Val Gly Gly Leu
165 170 175
Arg Met Leu Arg Asp Leu Gly Tyr Arg Asn Ile Lys Thr Phe His Leu
180 185 190
Asn Glu Gly His Ala Gly Phe Ile Thr Leu Glu Leu Leu Arg Glu Gln
195 200 205
Gly Tyr Glu Asp Tyr Asp Lys Ile Arg Asp Lys Val Ile Phe Thr Thr
210 215 220
His Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp His Phe Ser Tyr Glu Leu Ile
225 230 235 240
Asp Lys Val Met Asp Pro Val Phe Val His His Ile Lys Arg Met Met
245 250 255
Gly Pro Glu Gly Val Ser Met Thr Glu Leu Gly Leu Arg Tyr Ser Arg
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Thr Trp Thr Cys Pro Gly Phe Ala Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala
305 310 315 320
Gly Trp Arg Asn Asp Pro Ser Arg Leu Ile Gln Ala Leu Gln Leu Pro
325 330 335
Asp Glu Glu Val Trp Lys Ala His Gln Ala Ala Lys Met Lys Leu Leu
340 345 350
Ala Arg Val Leu Glu Glu Thr Gly Arg Glu Leu Asp Ala Asp Val Leu
355 360 365
Thr Ile Gly Phe Ala Arg Arg Ala Ala Ala Tyr Lys Arg Ala Asp Leu
370 375 380
Leu Phe Ser Asp Val Lys Arg Leu Ile Asp Val Cys Ser Gly Gln Val
385 390 395 400
Gln Phe Ile Phe Ala Gly Lys Ala His Pro His Asp Glu Pro Gly Lys
405 410 415
Ala Met Ile Lys Arg Ile His Gln Met Ala Lys Glu Ile Gly Ser Ala
420 425 430
Val Pro Ile Val Phe Leu Glu Asn Tyr Asp Met Ser Leu Ala Ser Leu
435 440 445
Leu Thr Ser Gly Val Asp Leu Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Arg
450 455 460
Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Cys Thr His Asn Gly Val Met
465 470 475 480
Asn Phe Ser Val Leu Asp Gly Trp Trp Ile Glu Gly Trp Val Glu Asp
485 490 495
Val Thr Gly Trp Ser Ile Gly Pro Asp Pro Glu Glu Ala Glu Leu Val
500 505 510
Glu Tyr Asp Glu Met Gln Asp Ala Met Asp Leu Tyr Asn Lys Leu Glu
515 520 525
Asp Lys Val Ile Pro Thr Tyr Tyr Gln His Arg Glu Lys Trp Ile Trp
530 535 540
Met Met Lys His Ala Ile Ala Leu Asn Ala Ser Tyr Phe Asn Thr His
545 550 555 560
Arg Val Val Lys Glu Tyr Cys Glu Lys Ala Tyr Gly Val Val Phe Arg
565 570 575
Gly Leu
<210> 14
<211> 659
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<400> 14
Met Glu Arg Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu
1 5 10 15
Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Asn Arg Ser Tyr Arg
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35 40 45
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50 55 60
Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Ser Leu Ile Lys Arg Gly Gln Leu Glu Ile
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Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala Ala Ile Pro Lys Glu
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100 105 110
Gly Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro
115 120 125
Glu Leu Val Lys Ser Leu Arg Glu Ala Gly Ile Glu Tyr Val Val Val
130 135 140
Asp Asp Tyr His Phe Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Phe
145 150 155 160
Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Thr Val Phe Pro
165 170 175
Ile Asp Glu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Lys Lys
180 185 190
Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys Val
195 200 205
Ala Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Val Trp Pro Gly Thr
210 215 220
Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Ala
225 230 235 240
Ile Thr Ser Asn Glu Lys Ile Asn Leu Met Thr Tyr Ser Glu Tyr Leu
245 250 255
Ser Lys Phe Thr Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Tyr
260 265 270
Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Lys Leu Phe
275 280 285
Val Glu Phe Val Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Glu Lys Tyr
290 295 300
Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe Phe Phe Lys Tyr
305 310 315 320
Pro Glu Ser Asn Phe Met His Lys Arg Met Leu Met Val Ser Lys Ala
325 330 335
Val Arg Asp Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ala Gln Cys
340 345 350
Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Val Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Pro His
355 360 365
Leu Arg Arg Thr Val Trp Glu Asn Ile Ile Lys Ala Gln Arg Tyr Leu
370 375 380
Lys Pro Glu Asn Lys Ile Leu Asp Val Asp Phe Asp Gly Arg Ala Glu
385 390 395 400
Ile Met Val Glu Asn Asp Gly Phe Ile Ala Thr Ile Lys Pro His Tyr
405 410 415
Gly Gly Ser Ile Phe Glu Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Val Asn Tyr
420 425 430
Asn Asp Val Leu Pro Arg Arg Trp Glu His Tyr His Glu Val Pro Glu
435 440 445
Ala Thr Lys Pro Glu Lys Glu Ser Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ile His
450 455 460
Glu Leu Gly Lys Gln Ile Pro Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Tyr
465 470 475 480
Asp Trp Gln Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asp His Phe Ile Lys Pro Glu
485 490 495
Glu Thr Leu Asp Asn Tyr Arg Leu Val Lys Tyr His Glu Leu Gly Asp
500 505 510
Phe Val Asn Gln Pro Tyr Glu Tyr Glu Met Ile Glu Asn Gly Val Lys
515 520 525
Leu Trp Arg Glu Gly Gly Val Tyr Ala Glu Glu Lys Ile Pro Ala Arg
530 535 540
Val Glu Lys Lys Ile Glu Leu Thr Glu Asp Gly Phe Ile Ala Lys Tyr
545 550 555 560
Arg Val Leu Leu Glu Lys Pro Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Val Glu Ile
565 570 575
Asn Leu Ala Val His Ser Val Met Glu Lys Pro Glu Glu Phe Glu Ala
580 585 590
Lys Glu Phe Glu Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Gly Lys Val Arg Ile
595 600 605
Glu Leu Asp Lys Ala Ala Lys Val Trp Lys Phe Pro Ile Lys Thr Leu
610 615 620
Ser Gln Ser Glu Ala Gly Trp Asp Phe Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr
625 630 635 640
Thr Met Leu Phe Pro Ile Glu Lys Glu Leu Glu Phe Thr Val Arg Phe
645 650 655
Arg Glu Leu
<210> 15
<211> 503
<212> PRT
<213> 深海栖热菌属 DSM 14977
<400> 15
Met Glu Leu Pro Arg Ser Phe Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Phe
1 5 10 15
Pro Gly Pro Tyr Pro Ile Gly Asn Leu Gly Asp Glu Ala Arg Ser Phe
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Leu Asp Trp Leu Ala Ala Thr Gly Ala Arg Trp Trp Gln Val Leu Pro
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Leu Gly Pro Thr Gly Phe Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ala Phe Ser Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Pro Arg Arg Leu Val Ala Arg
65 70 75 80
Gly Trp Leu Glu Ala Ala Asp Pro Pro Glu Ser Pro Pro Asp Arg Val
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100 105 110
Tyr Ala Gly Phe Arg Ala Arg Ala Thr Arg Glu Asp Thr His Ala Leu
115 120 125
Ala Val Phe Glu Arg Glu His Ala Asp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu
130 135 140
Phe Met Ala Leu Lys Gly Glu His Gly Gly Ala Pro Trp Trp Ser Trp
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Pro Glu Pro Leu Lys Arg Arg Asp Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Arg
165 170 175
Glu Arg Leu Ala Glu Glu Ala Ala Phe Gln Arg Trp Thr Gln Trp Val
180 185 190
Phe Phe Ser Gln Trp Arg Ala Leu Ala Asn Ala Ala His Asp Leu Gly
195 200 205
Leu Gly Ile Val Gly Asp Met Pro Ile Phe Val Ala His Asp Ser Ala
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225 230 235 240
Pro Val Ala Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Pro Thr Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asp Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Ala
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Val Pro Ala Gly Ala Pro Thr Ala Glu His Gly Arg Trp Glu Lys Ala
305 310 315 320
Pro Gly Glu Ala Phe Phe Arg Lys Val Glu Ala Thr Phe Gly Ser Val
325 330 335
Pro Ile Leu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ile Thr Pro Glu Val Glu Ala
340 345 350
Leu Arg Asp Arg Phe Gly Leu Pro Gly Met Lys Val Leu Gln Phe Ala
355 360 365
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Gly Trp Cys Glu His Ala Pro Asp Ala Glu Leu Asp Phe Met Arg Arg
405 410 415
Tyr Leu Glu Gly Arg Gly Ile Ala Cys Arg Gly Cys Gln Asp Ala Pro
420 425 430
Trp Ala Leu Ile Glu Leu Ala Leu Gln Ser Arg Cys Arg Met Ala Val
435 440 445
Phe Pro Leu Gln Asp Pro Leu Glu Leu Gly Ser Glu Ala Arg Met Asn
450 455 460
Phe Pro Ser Arg Pro Glu Gly Asn Trp Ala Trp Arg Tyr Ser Thr Arg
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Asp Leu Thr His Gly Leu Ala Glu Arg Leu Arg Gly Leu Ala Glu Arg
485 490 495
Tyr Ala Arg Leu Arg Arg Gly
500
<210> 16
<211> 500
<212> PRT
<213> 席氏嗜热菌菌株ATCC 700542
<400> 16
Met Asp Ile Pro Arg Ser Phe Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser Phe
1 5 10 15
Pro Gly Arg Trp Gly Ile Gly Thr Leu Gly Ala Glu Ala Arg Arg Phe
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Val Asp Trp Leu Ala Ser Thr Gly Ala His Trp Trp Gln Val Leu Pro
35 40 45
Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Ser Ala
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Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Ile Asp Pro Asp Ile Leu Ile Glu Lys
65 70 75 80
Gly Trp Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Ala Tyr Pro Pro His Lys Val
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100 105 110
Tyr Asp Gly Phe Val Gly Arg Gly Lys Pro Glu Asp Leu Glu Ala Phe
115 120 125
Ala Arg Tyr Arg Gln Gln Glu Ala Asp Trp Leu Glu Asp Tyr Ala Leu
130 135 140
Phe Met Ala Leu Lys His Ser Phe Gly Gly Arg Pro Trp Asn Glu Trp
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Thr Ala Pro Leu Arg Arg Arg Glu Pro Ala Ala Leu Glu Gln Ala Arg
165 170 175
Lys Glu Tyr Ala Asp Glu Ile Gly Phe His Ala Trp Thr Gln Trp Val
180 185 190
Phe Phe Gln Gln Trp Gly Asp Leu Arg Asn Tyr Ala His Ala Arg Gly
195 200 205
Ile Lys Leu Ile Gly Asp Met Pro Ile Phe Leu Ala Tyr Asp Ser Ser
210 215 220
Asp Val Trp Ala Asn Pro Gln Tyr Phe Tyr Leu Asp Ala Glu Gly Leu
225 230 235 240
Pro Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe Ser Glu Thr Gly
245 250 255
Gln Leu Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Glu Val Met Gln Ala Glu
260 265 270
Gly Phe Gly Trp Trp Ile His Arg Ile Lys Lys Ser Leu Glu Ala Cys
275 280 285
Glu Leu Val Arg Ile Asp His Phe Arg Gly Phe Glu Ala Tyr Trp Glu
290 295 300
Val Pro Phe Gly Glu Pro Thr Ala Val Lys Gly Arg Trp Val Lys Ala
305 310 315 320
Pro Gly Lys Glu Leu Phe Gln Ala Val Arg Ala Ala Leu Gly Asp Ala
325 330 335
Ala Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Val Ile Thr Pro Glu Val Glu Glu
340 345 350
Leu Arg Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Met Lys Ile Leu Gln Phe Ala
355 360 365
Phe Ser Asp Glu Thr Asn Pro Phe Leu Pro His Asn Tyr Pro Glu Ser
370 375 380
Gly Asn Val Ile Val Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp Thr Thr Ile
385 390 395 400
Gly Trp Tyr Gln Thr Ala Pro Lys Glu Glu Leu Ala Phe Met Asp Lys
405 410 415
Tyr Leu Glu Gln Tyr Gly Leu Lys Ile Glu Lys Pro Glu Asp Ala Pro
420 425 430
Trp Val Leu Ala Glu Leu Gly Phe Arg Ser Arg Ala Lys Leu Val Ile
435 440 445
Leu Pro Leu Gln Asp Val Leu Arg Leu Gly Pro Glu Ala Arg Met Asn
450 455 460
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465 470 475 480
Asp Leu Thr Pro Glu Leu Ala Leu His Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser
485 490 495
Ser Asp Arg Leu
500
<210> 17
<211> 511
<212> PRT
<213> 嗜热厌氧菌菌株 DSM 14523
<400> 17
Met Ser Leu Phe Lys Arg Ala Ser Gly Ile Leu Leu His Pro Thr Ser
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Asp Gly Ile Gly Asp Leu Gly Pro Glu Ala Tyr Arg
20 25 30
Trp Val Asn Phe Leu Ala Glu Ser Gly Cys Ser Leu Trp Gln Ile Leu
35 40 45
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50 55 60
Ala Phe Ala Gly Asn Pro Tyr Leu Val Ser Pro Ala Leu Leu Leu Asp
65 70 75 80
Glu Gly Leu Leu Thr Ser Glu Asp Leu Ala Asp Arg Pro Glu Phe Pro
85 90 95
Ala Ser Arg Val Asp Tyr Gly Pro Val Ile Gln Trp Lys Leu Thr Leu
100 105 110
Leu Asp Arg Ala Tyr Val Arg Phe Lys Arg Ser Thr Ser Gln Lys Arg
115 120 125
Lys Ala Ala Phe Glu Ala Phe Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Leu Leu
130 135 140
Asp Phe Ser Leu Phe Met Ala Ile Lys Glu Ala His Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Trp Asp Tyr Trp Pro Glu Pro Leu Arg Lys Arg Asp Pro Glu Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Phe His Arg Ala His Glu Val Asp Val Glu Arg His Ser Phe
180 185 190
Arg Gln Phe Leu Phe Phe Arg Gln Trp Gln Ala Leu Arg Gln Tyr Ala
195 200 205
His Glu Lys Gly Val Gln Ile Ile Gly Asp Val Pro Ile Phe Val Ala
210 215 220
Tyr Asp Ser Ala Asp Val Trp Ser His Pro Asp Leu Phe Tyr Leu Asp
225 230 235 240
Glu Thr Gly Lys Pro Thr Val Val Ala Gly Val Pro Pro Asp Tyr Phe
245 250 255
Ser Ala Thr Gly Gln Leu Trp Gly Asn Pro Leu Tyr Arg Trp Asp Tyr
260 265 270
His Arg Glu Thr Gly Phe Ala Trp Trp Leu Glu Arg Leu Lys Ala Thr
275 280 285
Phe Ala Met Val Asp Ile Val Arg Leu Asp His Phe Arg Gly Phe Ala
290 295 300
Gly Tyr Trp Glu Val Pro Tyr Gly Met Pro Thr Ala Glu Lys Gly Arg
305 310 315 320
Trp Val Pro Gly Pro Gly Ile Ala Leu Phe Glu Ala Ile Arg Asn Ala
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Leu Gly Gly Leu Pro Ile Ile Ala Glu Asp Leu Gly Glu Ile Thr Pro
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Asn Tyr Val Gln Asn Cys Val Ala Tyr Thr Gly Thr His Asp Asn Asp
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<400> 18
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340 345 350
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<211> 488
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<400> 19
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<212> PRT
<213> 解热嗜热厌氧杆菌
<400> 20
Met Ala Leu Asn Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu
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Gly Gly Asp Leu Lys Thr Leu Asn Asp Val Leu Glu Lys Tyr Phe Ser
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<211> 488
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<213> 木聚糖热厌氧杆菌
<400> 21
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Gly Gly Asp Leu Lys Thr Leu Asn Asp Val Leu Glu Lys Tyr Phe Ser
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Leu Phe Val Pro Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala
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Ile Asn Arg His Asn Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Glu Gln Ala Val Arg
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<210> 23
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<213> 青春双歧杆菌
<400> 23
Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp
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Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly
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Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys
130 135 140
Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln
145 150 155 160
Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser
165 170 175
Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp
180 185 190
Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr
195 200 205
Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys
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Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln
225 230 235 240
Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro
245 250 255
Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala
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Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Asp Thr
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<210> 24
<211> 480
<212> PRT
<213> 嗜热类芽孢杆菌
<400> 24
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Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Pro Arg Ala Pro Tyr Val Glu Val Thr
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Phe Lys Asp Gly Ser Thr Glu Lys Val Trp Cys Thr Phe Asp Glu Gln
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Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Thr Asp Thr Thr Lys Lys Phe Ile Arg
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Asp Asn Leu Thr Phe Leu Ala Gln Lys Gly Ala Ser Ile Ile Arg Leu
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Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Asn Lys Lys Ile Gly Thr Asn Cys Phe Phe
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Ser Pro Ser Gly Ile Thr Val Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser
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Ile Gln Leu Lys Ile Ala Glu Gln Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala
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Leu Pro Met Leu Val Leu His Ala Leu Tyr Ser Gly Gln Val His Arg
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Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Leu Leu Ser
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Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp Ile Glu Leu
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465 470 475 480
<210> 25
<211> 489
<212> PRT
<213> 蒂皮氏芽孢杆菌
<400> 25
Met Asn Val Lys Asn Gln Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly Asn Leu Lys Asn Leu His His Val Leu Leu Lys Tyr Phe Val
20 25 30
Asp Ile Phe Lys Gly Gly Val His Ile Leu Pro Pro Tyr Pro Ser Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asn Tyr Leu Glu Ile Asp Pro Arg
50 55 60
Phe Gly Thr Trp Ala Asp Ile Lys Ala Ile Gly Glu Asn Phe Asp Val
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
Lys Gln Leu Leu Thr Ser Phe Phe Gln Asn Phe Lys Gln Gln Asn Val
180 185 190
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195 200 205
Thr Ser Cys Phe Phe Val Glu Pro Asp Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Trp
210 215 220
Met Arg Glu Ile Ala Asp Ser Met Glu Ile Glu Leu Leu Pro Glu Val
225 230 235 240
His Ala His Tyr Ser Ile Gln Tyr Lys Leu Ala Glu His Gly Phe Trp
245 250 255
Ile Tyr Asp Phe Ile Leu Pro Tyr Arg Ile Leu Asp Ala Leu Val Asn
260 265 270
Lys Ser Ser Lys Asp Leu Leu Asp Tyr Leu Lys Asn Arg Pro His Lys
275 280 285
Gln Val Thr Met Leu Asp Cys His Asp Gly Ile Pro Val Lys Pro Asp
290 295 300
Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Lys Glu Ala Arg Lys Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Cys Leu Glu Arg Gly Ser Asn Leu Ser Leu Ile Leu Ser His Glu His
325 330 335
Lys Asp Lys Asp Gly Phe Asp Val His Gln Ile Arg Cys Ser Tyr Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Asn Arg Asp Asp Asp Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Ile
355 360 365
Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu
370 375 380
Ala Gly Glu Asn Asp Met Glu Gly Val Lys Lys Thr Gly Glu Gly Arg
385 390 395 400
Glu Ile Asn Arg His Asn Phe Ser Leu Asp Glu Ile Glu His Ser Leu
405 410 415
Asn Lys Lys Val Val Gln Arg Leu Leu Gln Leu Ile Arg Phe Arg Asn
420 425 430
Glu Tyr Asp Ala Phe Asn Gly Glu Phe Lys Val Leu Asp Ser Ala Gln
435 440 445
Asp Glu Ile Arg Leu Ser Trp Gln Lys Glu Glu Lys Arg Cys Thr Leu
450 455 460
Gln Ile Asp Leu Lys Thr Asn Lys Ser Val Ile Glu Tyr Val Asp Glu
465 470 475 480
Lys Asp Gly Glu Ile Pro Tyr Phe Ile
485
<210> 26
<211> 504
<212> PRT
<213> 达氏嗜热菌
<400> 26
Met Lys Asn Gln Val Gln Leu Ile Thr Tyr Val Asp Arg Leu Gly Ser
1 5 10 15
Gly Asn Ile Lys Thr Leu His Gln Leu Leu Arg Gly Pro Leu Ala Gly
20 25 30
Leu Phe Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Tyr Tyr Pro Ile Lys Gly
35 40 45
Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Arg Val Asp Pro Cys
50 55 60
Leu Gly Ser Trp Glu Asp Ile Arg Ala Leu Gly Gln Asp Val Asp Leu
65 70 75 80
Met Ala Asp Leu Ile Val Asn His Ile Ser Ser Ser Ser Pro Gln Phe
85 90 95
Leu Asp Tyr Leu Glu Lys Gly Asp Asp Ser Ile Tyr Lys Asp Leu Phe
100 105 110
Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Ala Asp Leu
115 120 125
Leu Thr Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Ser Tyr Ile Thr
130 135 140
Leu Lys Asn Gly Gln Lys Arg Leu Leu Trp Thr Thr Phe Ser Arg Gln
145 150 155 160
Gln Ile Asp Ile Asn Val Leu His Pro Met Gly Arg Glu Tyr Leu His
165 170 175
Ser Val Leu Arg Thr Leu His Glu Asn Gly Ile Arg Met Val Arg Leu
180 185 190
Asp Ala Val Gly Tyr Ala Val Lys Lys Ala Gly Thr Thr Cys Phe Met
195 200 205
Ile Pro Glu Thr Phe Asp Phe Ile Glu Asn Leu Thr His Gln Ala Gln
210 215 220
Glu Leu Gly Met Glu Val Leu Val Glu Ile His Ser His Tyr Arg Lys
225 230 235 240
Gln Ile Glu Ile Ala Arg Gln Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu
245 250 255
Pro Pro Leu Val Leu His Ala Ile Phe Asn Arg Thr Ala Tyr Tyr Leu
260 265 270
Lys Gln Trp Leu Ser Ile Ser Pro Arg Asn Ala Ile Thr Val Leu Asp
275 280 285
Thr His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ala Asp Ser Ser Asp
290 295 300
Pro Gln Asn Tyr Pro Gly Leu Ile Pro Pro Glu Glu Leu Glu Ala Leu
305 310 315 320
Val Glu Gln Ile His Leu Asn Ser Asn Gly Gln Ser Arg Leu Ala Ser
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Cys Thr Phe
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu Gly Arg Asn Asp Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Arg Ala
355 360 365
Ile Gln Phe Phe Ser Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu
370 375 380
Leu Ala Gly Glu Asn Asp Met Asp Leu Leu Ala Arg Thr Gly Val Gly
385 390 395 400
Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Ala Gln Ala
405 410 415
Ile Gln Arg Pro Val Val Gln Ser Leu Phe Arg Leu Ile Arg Phe Arg
420 425 430
Asn Gln His Pro Ala Phe Asn Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ser Pro
435 440 445
Asp Ser Arg Leu Ile Leu Arg Trp Asp Asn Gly Ala Ala Trp Ala Val
450 455 460
Leu Glu Val Asp Phe Ala Ala Gly Thr Phe Ser Ile Ser Gly Ser Pro
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Glu Pro Ile Glu Ala Leu Pro Gly Ala His Pro Asp
485 490 495
Asn Arg Tyr Gly Gly Ile Ala Thr
500

Claims (17)

1.一种由淀粉或淀粉衍生物酶法生产己糖的改进方法，其中所述改进方法包括：
a）由磷酸葡萄糖变位酶（PGM）催化将葡萄糖1-磷酸（G1P）转化为葡萄糖6-磷酸（G6P）的步骤，其中所述PGM具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列；
所述方法步骤在以下方法条件中进行：
在1 mM至50 mM的磷酸盐浓度下；
在50°C至55°C的温度范围内；和
在7.0至8.0的pH范围内。
2.根据权利要求1所述的改进方法，进一步包括：
b）由α-葡聚糖磷酸化酶（αGP）催化将淀粉衍生物转化为G1P的步骤，其中所述αGP具有如SEQ ID NO: 11、10、12和13所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的改进方法，进一步包括：
c）由4-α-葡聚糖转移酶（4GT）催化的淀粉衍生物的转糖基化步骤，其中所述4GT具有如SEQ ID NO: 17、15和16所示的氨基酸序列。
4. 一种由纤维素或纤维素衍生物酶法生产己糖的改进方法，其中所述改进方法包括由磷酸葡萄糖变位酶（PGM）催化将G1P转化为葡萄糖6-磷酸（G6P）的步骤，其中所述PGM具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列；
所述方法步骤在以下方法条件中进行：
在1 mM至50 mM的磷酸盐浓度下；
在50°C至55°C的温度范围内；和
在7.0至8.0的pH范围内。
5.一种由蔗糖酶法生产己糖的改进方法，其中所述改进方法包括：
a）由磷酸葡萄糖变位酶（PGM）催化将葡萄糖1-磷酸（G1P）转化为葡萄糖6-磷酸（G6P）的步骤，其中所述PGM具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列；
所述方法步骤在以下方法条件中进行：
在1 mM至50 mM的磷酸盐浓度下；
在50°C至55°C的温度范围内；和
在7.0至8.0的pH范围内，和
b）使用蔗糖磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸（G1P）的步骤。
6. 根据权利要求5所述的改进方法，其中所述蔗糖磷酸化酶具有如SEQ ID NO: 23、19-22和24-25所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的改进方法，其中所述己糖选自由阿洛糖、甘露糖、半乳糖、果糖、阿卓糖、塔罗糖、山梨糖、古洛糖、艾杜糖、阿卢糖、肌糖和塔格糖组成的组。
8.根据权利要求1所述的改进方法，其中所述淀粉衍生物选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽三糖、麦芽糖和麦芽糊精组成的组。
9.根据权利要求7所述的改进方法，进一步包括使用磷酸己糖磷酸酶使磷酸己糖去磷酸化的步骤。
10.根据权利要求9所述的改进方法，其中所述方法步骤在单个反应容器中进行。
11.根据权利要求10所述的改进方法，其中所述方法步骤在无ATP、无NAD(P)(H)下进行，磷酸盐可循环利用，和/或磷酸己糖的去磷酸化的步骤涉及能量上有利的化学反应。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的改进方法，其中所述方法步骤在以下方法条件中进行：
进行0.5小时至48小时，或作为连续反应。
13.根据权利要求7所述的改进方法，进一步包括将己糖还原成其糖醇的步骤。
14. 根据权利要求2所述的改进方法，其中在所述改进方法中，所述αGP的活性比源自海栖热袍菌的Uniprot ID G4FEH8的αGP的活性高至少10%。
15. 根据权利要求3所述的改进方法，其中在所述改进方法中，所述4GT的活性比源自栖热球菌的Uniprot ID O32462的4GT的活性高至少10%。
16. 根据权利要求5所述的改进方法，其中在所述改进方法中，所述蔗糖磷酸化酶的活性比源自解热嗜热厌氧杆菌的Uniprot ID D9TT09的蔗糖磷酸化酶的活性高至少10%。
17. 根据权利要求5所述的改进方法，其中在所述改进方法中，所述蔗糖磷酸化酶的可达到的产率比源自解热嗜热厌氧杆菌的Uniprot ID D9TT09的蔗糖磷酸化酶的可达到的产率高至少10%。
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