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CN113423691A - 肽结合剂 - Google Patents

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CN113423691A
CN113423691A CN201980091302.5A CN201980091302A CN113423691A CN 113423691 A CN113423691 A CN 113423691A CN 201980091302 A CN201980091302 A CN 201980091302A CN 113423691 A CN113423691 A CN 113423691A
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sulfonamide
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insulin
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N·拉凯尔曼
S·居斯雷根
M·威尔
T·勃姆
加雷亚 A·维拉尔
M·波德斯科瓦
L·比亚利
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Sanofi SA
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Abstract

本发明涉及一种式(A)的磺酰胺；一种包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物；一种用于制备包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的方法；一种包含含有式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的药物组合物；并且涉及所述缀合物作为药剂的用途。

Description

肽结合剂
本文提供了通式(A)的磺酰胺；包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物；用于制备包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的方法；包含含有式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物的药物组合物；以及所述缀合物作为药剂的用途。
胰腺的胰岛素释放与血糖浓度严格相关。血糖水平升高(诸如饭后发生)通过相应的胰岛素(一种降血糖激素)分泌增加迅速补偿。在空腹状态下，血浆胰岛素水平降至基础值，这足以保证连续向胰岛素敏感的器官和组织供应葡萄糖并且在夜间保持低的肝葡萄糖产生。糖尿病是一种血糖的这种严格调控受到干扰的代谢障碍。
糖尿病的特征在于胰腺的胰岛素产生减少/丧失和/或无法使用胰岛素。因此，血糖水平控制不充分并且因此升高。无初始症状的持续数年的血糖水平升高是相当大的健康风险。在美国进行的大规模DCCT研究(The Diabetes Control and Complications TrialResearch Group(1993)N.Engl.J.Med.329，977-986)清楚地证明，长期升高的血糖水平是糖尿病晚期并发症(诸如在某些情况下表现为视网膜病变、肾病变或神经病变并且导致失明、肾衰竭和肢体缺失的微血管和大血管损伤)的发展的主要原因。此外，糖尿病伴随着升高的心血管疾病风险。
在世界范围内，在2016年，大约4.22亿人患有1型和2型糖尿病。糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病。在1型糖尿病患者中，没有身体本身产生的胰岛素可用。因此，由于无法治愈，对于1型糖尿病来说，缺乏内分泌胰岛素分泌的替代方法是当前唯一可能的疗法。受影响的人终身依赖胰岛素注射，通常来说，每天多次。与1型糖尿病相比，2型糖尿病基本没有胰岛素缺乏，但是在大量病例中，尤其是在晚期，用胰岛素(任选地与口服抗糖尿病药组合)治疗被认为是最有利的疗法形式。
当前糖尿病疗法的目标主要是将血糖尽可能接近地保持在生理范围内。当前的疗法建议包括用口服抗糖尿病药物、GLP-1受体激动剂治疗以及最终用胰岛素治疗。
人胰岛素是51个氨基酸的多肽，其由2条氨基酸链构成：具有21个氨基酸的A链和具有30个氨基酸的B链。所述链借助2个二硫桥彼此连接(链间(interchenar)二硫桥在Cys(A7)与Cys(B7)之间和Cys(A20)与Cys(B19)之间)。另外，一个链内(intrachenar)二硫桥存在于Cys(A6)与Cys(A11)之间。多年来，一直采用胰岛素制剂用于糖尿病疗法。此时不仅使用人胰岛素，而且最近也使用胰岛素衍生物和类似物。
鉴于与每天注射或重复的每天注射相关的问题和不适，正在不断努力寻找具有延长的作用曲线的胰岛素制剂-目标是每周一次的给药方案。
本文提供了式(A)的磺酰胺
Figure BDA0003196566540000021
如本文所用，术语“胰岛素的类似物”和“胰岛素类似物”是指具有这样的分子结构的多肽，所述分子结构可以通过缺失和/或交换在天然存在的胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基而在形式上衍生自天然存在的胰岛素的结构(例如人胰岛素的结构)。所添加和/或交换的氨基酸残基可以是可编码氨基酸残基或其他天然存在的残基或纯合成的氨基酸残基。胰岛素类似物的例子包括但不限于以下：
(i).“门冬胰岛素”是其中作为脯氨酸的氨基酸B28(即人胰岛素的B链中的28号氨基酸)被天冬氨酸替代的人胰岛素。门冬胰岛素是一种短效胰岛素。
(ii).“赖脯胰岛素”是其中B链的C末端上的倒数第二个赖氨酸和脯氨酸残基互换的人胰岛素(人胰岛素：ProB28LysB29；赖脯胰岛素：LysB28ProB29)。赖脯胰岛素是一种短效胰岛素。
(iii).“赖谷胰岛素”与人胰岛素的不同之处在于位置B3处的氨基酸天冬酰胺被赖氨酸替代，并且位置B29中的赖氨酸被谷氨酸替代。赖谷胰岛素是一种短效胰岛素。
(iv).“甘精胰岛素”与人胰岛素的不同之处在于位置A21处的天冬酰胺被甘氨酸替代，并且B链在羧基末端延伸了两个精氨酸。甘精胰岛素是一种长效胰岛素。
如本文所用，术语“胰岛素缀合物”与“胰岛素的衍生物”和“胰岛素衍生物”同义-所述术语是指具有可以从形式上衍生自天然存在的胰岛素的结构(例如，人胰岛素的结构)的分子结构的多肽，其中一个或多个有机取代基(例如脂肪酸)与一个或多个氨基酸结合。所述一个或多个有机取代基旨在与血清蛋白(像白蛋白)相互作用，并且在本文中称为“结合剂”或“结合分子”。任选地，天然存在的胰岛素中存在的一个或多个氨基酸可以已经被缺失和/或被其他氨基酸(包括不可编码氨基酸)替代，或者已经将氨基酸(包括不可编码的)添加到天然存在的胰岛素中。胰岛素缀合物的例子包括但不限于以下：
(i).“地特胰岛素”，其与人胰岛素的不同之处在于位置B30处的氨基酸苏氨酸被缺失，并且脂肪酸残基(肉豆蔻酸)与位置B29中的赖氨酸的ε氨基官能团附接。地特胰岛素是一种长效胰岛素。
(ii).“德谷胰岛素”，其与人胰岛素的不同之处在于位置B30处的氨基酸苏氨酸被缺失，并且十六烷二酸经由γ-L-谷氨酰基接头与氨基酸赖氨酸B29缀合。德谷胰岛素是一种长效胰岛素。
如本文所用，术语“速效胰岛素”是指这样的胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物，其中胰岛素介导的作用在5至15分钟内开始并且持续有活性3至4小时。速效胰岛素的例子包括但不限于以下：(i).门冬胰岛素；(ii).赖脯胰岛素和(iii).赖谷胰岛素。
如本文所用，术语“长效胰岛素”是指这样的胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物，其中胰岛素介导的作用在0.5至2小时内开始并且持续有活性约或超过24小时。速效胰岛素的例子包括但不限于以下：(i).甘精胰岛素；(ii).地特胰岛素和(iii).德谷胰岛素。
本文提供了血清白蛋白结合部分，其当与肽偶联时导致肽的药效学和/或药代动力学特性改善，例如血液和/或血浆中的药代动力学半衰期延长和/或作用曲线延长(即血糖水平降低延长)。
出乎意料地是，发现可以使用特定的磺酰胺来提供此类肽缀合物，所述磺酰胺可以用于肽缀合物。所得的肽缀合物展现有利的在血液和/或血浆中的半衰期和延长的作用曲线。可以显示，与未缀合的肽相比，所得的肽缀合物具有增加的药代动力学半衰期(t1/2)以及增加的平均滞留时间(MRT)。此外，相对于未缀合的肽，所述肽缀合物具有显著延长的体内作用持续时间。
因此，本文提供了式(A)的磺酰胺
Figure BDA0003196566540000041
其中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU[1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐]或HBTU[3-[双(二甲基氨基)甲基鎓基]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐])、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基。
在一些实施方案中，排除s是1、p是零、n是零、A是氧原子并且t是1的组合。在一些实施方案中，s是零，其中剩余的残基和指示符号具有如上针对式(A)所指示的含义。
例如，R1的卤化的C1至C3烷基和/或R2的卤化的C1至C3烷基是部分卤化的或全卤化的。在一些实施方案中，R1的卤化的C1至C3烷基和/或R2的卤化的C1至C3烷基是全卤化的。
如本文所用，术语“式(A)的磺酰胺”包括式(A)的磺酰胺、其药学上可接受的盐和所有药学上可接受的同位素标记的式(A)的磺酰胺，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但是原子质量或质量数不同于在自然界中占主导的原子质量或质量数的原子替代。这同样适用于式(A)的磺酰胺的所有子类型，即适用于如以下所详述的式(A-1)至(A-5)的磺酰胺，以及它们各自的子结构，例如式(A-1-1)的磺酰胺。也就是说，术语“式(A-…)的磺酰胺”(其中(A-…)表示如以下所详述的式(A-1)至(A-5)的磺酰胺以及它们的子结构的编号)包括化合物本身、其药学上可接受的盐和所有药学上可接受的同位素标记的化合物。
式(A)的磺酰胺的药学上可接受的盐是碱盐。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。例子包括铝、精氨酸、苯乍生、钙、胆碱、二乙胺、双(2-羟基乙基)胺(二乙醇胺)、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、2-氨基乙醇(乙醇胺)、钾、钠、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(tris或氨丁三醇)和锌盐。关于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(Wiley-VCH，2002)。
式(A)的磺酰胺及其药学上可接受的盐可以以非溶剂化的形式和溶剂化的形式存在。术语“溶剂化物”在本文中用于描述包含式(A)的磺酰胺或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如，乙醇)的分子复合物。当所述溶剂是水时，采用术语“水合物”。
适于包括在式(A)的磺酰胺中的同位素的例子包括以下的同位素：氢(诸如2H和3H)、碳(诸如11C、13C和14C)、氯(诸如36Cl)、氟(诸如18F)、碘(诸如123I和125I)、氮(诸如13N和15N)、氧(诸如15O、17O和18O)和硫(诸如35S)。
某些同位素标记的式(A)的磺酰胺(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物的组织分布研究。鉴于其易于掺入和现成的检测手段，放射性同位素氚(即3H)和碳14(即14C)对于此目的是特别有用的。
用较重的同位素诸如氘(即2H)取代可以提供某些治疗优势，这是因为代谢稳定性更高，例如体内半衰期增加或剂量需求减少。
用正电子发射同位素(诸如11C、18F、15O和13N)取代可以用于正电子发射断层扫描(PET)研究而用于检查底物受体占有率。
同位素标记的式(A)的磺酰胺通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术来制备。
根据本发明的药学上可接受的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以是同位素取代(例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO)的那些溶剂化物。
为了鉴定合适的结合剂分子，其当与肽(诸如胰岛素)结合时能够改善血浆中的半衰期并且延长作用曲线，基于用血清白蛋白柱(即具有固定的血清白蛋白的柱)的亲和色谱法建立了系统。
根据以下公式计算结合剂(样品)的净保留时间：
净保留时间＝保留时间样品-保留时间t0标记
式(A)的磺酰胺具有从9至19范围内(例如从9.5至18范围内)的净保留，并且因此被认为是用于肽缀合物(诸如胰岛素缀合物)的有用结合剂。
根据一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-1)
Figure BDA0003196566540000061
其中：
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子并且是例如氟原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
R1表示选自氢原子和卤素原子的至少一个残基，其中所述卤素原子是例如氟或氯原子；
R2表示选自氢原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基，其中所述C1至C3烷基是例如甲基，并且所述卤化的C1至C3烷基是例如全卤化的诸如三氟甲基；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；
其中如果p是零，则m是从5至15范围内的整数，或者如果p是1，则m是从7至15范围内的整数。
在所述磺酰胺的一个实施方案中，R1和R2是氢原子。
在所述磺酰胺的一个实施方案中，X表示氮原子。
根据所述磺酰胺的另一个实施方案，式(A)的HOOC-(CH2)m-(O)s-(E)p-(CH2)n-(A)t-基团或式(A-1)的HOOC-(CH2)m-(E)p-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据所述磺酰胺的另一个实施方案，如果p是1，则HOOC-(CH2)m-(O)s-基团和-(CH2)n-(A)t-基团位于式(A)的(E)p上的间位或对位，或者HOOC-(CH2)m-基团和-O-位于式(A-1)的(E)p上的间位或对位。
根据所述磺酰胺的另一个实施方案，q是零。
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-1-1)
Figure BDA0003196566540000071
其中X是氮原子或-CH-基团，例如氮原子；m是从7至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1，例如零；Hal是选自氟、氯、溴和碘原子的卤素原子，例如氟原子；Rx是氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-1-1a)
Figure BDA0003196566540000072
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-1-2)
Figure BDA0003196566540000073
其中X是氮原子或-CH-基团，例如氮原子；m是从5至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1，例如零；Rx是氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且HOOC-(CH2)m-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-1-2a)
Figure BDA0003196566540000081
或式(A-1-2b)
Figure BDA0003196566540000082
或式(A-1-2c)
Figure BDA0003196566540000083
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-2)
Figure BDA0003196566540000084
其中
X表示氮原子或-CH-基团；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且
m是从5至17范围内，例如从11至17范围内的整数。
根据式(A-2)的磺酰胺的一个实施方案，HOOC-(CH2)m-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-3)
Figure BDA0003196566540000085
其中
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且
m是从5至17范围内的整数，例如11。
根据式(A-3)的磺酰胺的一个实施方案，HOOC-(CH2)m-O-基团和-(CH2)2-基团位于式(A-3)的(E)上的对位，并且HOOC-(CH2)m-O-(E)-(CH2)2-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-4)
Figure BDA0003196566540000091
其中
A是-OCH2-基团或-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且
m是从5至17范围内，例如从9至13范围内的整数。
根据式(A-4)的磺酰胺的一个实施方案，HOOC-(CH2)m-基团和-A-基团位于式(A-4)的(E)上的对位，并且-A-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
根据另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(A-5)
Figure BDA0003196566540000092
其中
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且
m是从5至17范围内，例如从7至9范围内的整数。
根据式(A-5)的磺酰胺的一个实施方案，HOOC-(CH2)m-基团和-(CH2)2-基团位于式(A-5)的(E)上的对位，并且HOOC-(CH2)mE)-(CH2)2-O--基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
缀合物
本文提供了包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物
Figure BDA0003196566540000101
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分或所述诊断化合物共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述活性药物成分的或所述诊断化合物的合适的官能团(例如，与所述活性药物成分的或所述诊断化合物的氨基或羟基)共价结合。
例如，所述活性药物成分是肽，其中所述肽和式(I)的磺酰胺例如通过例如在式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述肽的氨基之间形成的酰胺键连接。毋庸置疑的是，在酰胺键的情况下，羧基“a”在所述缀合物中以羰基-C(＝O)-存在，如以下所示，其中所有的残基E、A、R1、R2、X以及指示符号m、s、p、n、t、r和q具有如上针对式(I)所指示的含义，并且NH----基团已经是肽的氨基的剩余部分：
Figure BDA0003196566540000111
在一些实施方案中，对于式(I)的磺酰胺，排除s是1、p是零、n是零、A是氧原子并且t是1的组合。在一些实施方案中，s是零，其中剩余的残基和指示符号具有如上针对式(I)所指示的含义。
在一些实施方案中，式(I)的磺酰胺的R1的卤化的C1至C3烷基和/或R2的卤化的C1至C3烷基是部分卤化的或全卤化的。在一些实施方案中，式(I)的磺酰胺的R1的卤化的C1至C3烷基和/或R2的卤化的C1至C3烷基是全卤化的。
如以上已经讨论的，出乎意料地发现，所述缀合物展现有利的在血液和/或血浆中的半衰期和延长的作用曲线，这已经例如在临床前动物模型中得到证实。
如本文所用，术语“包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物”包括缀合物本身、其药学上可接受的盐和所有药学上可接受的同位素标记的缀合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但是原子质量或质量数不同于在自然界中占主导的原子质量或质量数的原子替代。这同样适用于所述缀合物的所有子类型，即适用于如以下所详述的包含式(I-1)至(I-5)的磺酰胺的缀合物，以及它们的子结构，例如包含式(I-1-1)的磺酰胺的缀合物。这同样适用于式(I)的磺酰胺的所有子类型，即适用于如以下所详述的式(I-1)至(I-5)的磺酰胺，以及它们各自的子结构，例如式(I-1-1)的磺酰胺。也就是说，术语“包含式(I-…)的磺酰胺的缀合物”(其中(I-…)表示如以下所详述的式(I-1)至(I-5)的磺酰胺以及它们的子结构的编号)包括缀合物本身、其药学上可接受的盐和所有药学上可接受的同位素标记的化合物。
所述缀合物的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱盐。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。例子包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双氢萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐、1,5-萘二磺酸盐和昔萘酸盐(xinafoate)。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。例子包括铝、精氨酸、苯乍生、钙、胆碱、二乙胺、双(2-羟基乙基)胺(二乙醇胺)、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、2-氨基乙醇(乙醇胺)、钾、钠、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(tris或氨丁三醇)和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。关于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties，Selection,and Use(Wiley-VCH,2002)。
所述缀合物及其药学上可接受的盐可以以非溶剂化的形式和溶剂化的形式存在。术语“溶剂化物”在本文中用于描述包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如，乙醇)的分子复合物。当所述溶剂是水时，采用术语“水合物”。
适于包括在所述缀合物中的同位素的例子包括以下的同位素：氢(诸如2H和3H)、碳(诸如11C、13C和14C)、氯(诸如36Cl)、氟(诸如18F)、碘(诸如123I和125I)、氮(诸如13N和15N)、氧(诸如15O、17O和18O)和硫(诸如35S)。
某些同位素标记的缀合物(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物的组织分布研究。鉴于其易于掺入和现成的检测手段，放射性同位素氚(即3H)和碳14(即14C)对于此目的是特别有用的。
用较重的同位素诸如氘(即2H)取代可以提供某些治疗优势，这是因为代谢稳定性更高，例如体内半衰期增加或剂量需求减少。
用正电子发射同位素(诸如11C、18F、15O和13N)取代可以用于正电子发射断层扫描(PET)研究而用于检查底物受体占有率。
同位素标记的缀合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术来制备。
根据本发明的药学上可接受的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以是同位素取代(例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO)的那些溶剂化物。
如本文所用，术语“活性药物成分”(API)包括提供某种药理学作用并且用于治疗或预防病症的任何药物活性化学或生物化合物及其任何药学上可接受的盐及其任何混合物。如本文所用，术语“活性药物成分”、“活性剂”、“活性成分”、“活性物质”和“药物”旨在为同义词，即具有相同含义。
在一个实施方案中，所述活性药物成分选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病引起的或与之相关的并发症的药剂和用于治疗和/或预防由肥胖症引起的或与之相关的并发症和障碍的药剂。这些活性药物成分的例子是：胰岛素、磺酰脲类、双胍类、美格列脲类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、修饰脂质代谢的化合物诸如抗高血脂剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于细胞的ATP依赖性钾通道的药剂；消胆胺、考来替泊、氯贝特、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、那格列奈、瑞格列奈；阻滞剂诸如阿普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔和美托洛尔、ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂诸如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、阿曲普利、喹那普利和雷米普利、钙通道阻滞剂诸如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地尔硫卓和维拉帕米、以及a-阻滞剂诸如多沙唑嗪、乌拉地尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因苯丙胺调节转录肽)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、PYY2激动剂、PYY4激动剂、混合PPY2/PYY4激动剂、MC4(黑皮素4)激动剂、促食欲素拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿促皮素激动剂、3激动剂、MSH(黑素细胞刺激激素)激动剂、MCH(黑素细胞浓缩激素)拮抗剂、CCK(胆囊收缩素)激动剂、5-羟色胺重摄取抑制剂、5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、混合5-羟色胺和去甲肾上腺素能化合物、5HT(5-羟色胺)激动剂、铃蟾素激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭、多普瑞辛)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节剂、TR激动剂；组胺H3拮抗剂、激动剂或拮抗剂的胃抑制性多肽(GIP类似物)、促胃液素和促胃液素类似物。在一个实施方案中，所述活性药物成分选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病引起的或与之相关的并发症的药剂和用于治疗和/或预防由肥胖症引起的或与之相关的并发症和障碍的药剂。这些活性药物成分的例子是：胰岛素、磺酰脲类、双胍类、美格列脲类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝酶的抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、修饰脂质代谢的化合物诸如抗高血脂剂如HMG CoA抑制剂(他汀类)、胃抑制性多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于细胞的ATP依赖性钾通道的药剂；消胆胺、考来替泊、氯贝特、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、那格列奈、瑞格列奈；-阻滞剂诸如阿普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔和美托洛尔、ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂诸如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、阿曲普利、喹那普利和雷米普利、钙通道阻滞剂诸如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地尔硫卓和维拉帕米、以及a-阻滞剂诸如多沙唑嗪、乌拉地尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因苯丙胺调节转录肽)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、PYY2激动剂、PYY4激动剂、混合PPY2/PYY4激动剂、MC4(黑皮素4)激动剂、促食欲素拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿促皮素激动剂、3激动剂、MSH(黑素细胞刺激激素)激动剂、MCH(黑素细胞浓缩激素)拮抗剂、CCK(胆囊收缩素)激动剂、5-羟色胺重摄取抑制剂、5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、混合5-羟色胺和去甲肾上腺素能化合物、5HT(5-羟色胺)激动剂、铃蟾素激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭、多普瑞辛)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节剂、TR激动剂；组胺H3拮抗剂、激动剂或拮抗剂的胃抑制性多肽(GIP类似物)、促胃液素和促胃液素类似物。
在一个实施方案中，所述活性药物成分是治疗活性肽，其中所述肽包含至少2个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含至少10个氨基酸或至少20个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过1000个氨基酸，诸如不超过500个氨基酸，例如不超过100个氨基酸。
在所述缀合物的一个实施方案中，所述活性药物成分是抗糖尿病剂，诸如肽。在一些实施方案中，所述肽是GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1激动剂；双GLP-1受体/胰高血糖素受体激动剂；人FGF21、FGF21类似物、FGF21衍生物；胰岛素(例如人胰岛素)、胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述活性药物成分选自胰岛素、胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物(例如GLP(-1)激动剂)。在所述缀合物的一个实施方案中，所述活性药物成分选自胰岛素、胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物(例如GLP(-1)激动剂)。
如本文所用，术语“GLP-1类似物”是指具有这样的分子结构的多肽，所述分子结构可以通过缺失和/或交换在天然存在的GLP-1中存在的至少一个氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基而在形式上衍生自天然存在的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的结构(例如人GLP-1的结构)。所添加和/或交换的氨基酸残基可以是可编码氨基酸残基或其他天然存在的残基或纯合成的氨基酸残基。
如本文所用，术语“GLP(-1)激动剂”是指这样的GLP(-1)类似物，其活化胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1受体)。GLP(-1)激动剂的例子包括但不限于以下：利西拉肽、艾塞那肽/毒蜥外泌肽-4、索马鲁肽、他司鲁肽(taspoglutide)、阿必鲁肽、度拉鲁肽(dulaglutide)。
利西拉肽具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
艾塞那肽具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
索马鲁肽-与Lys(20)偶联的白蛋白结合剂具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEAc-AEEAc-γ-Glu-17-羧基十七酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
度拉鲁肽(经由肽接头与fc片段偶联的GLP1(7-37))具有以下氨基酸序列(SEQ IDNO:4)：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
如本文所用，术语“FGF-21”意指“成纤维细胞生长因子21”。FGF-21化合物可以是人FGF-21、FGF-21的类似物(称为“FGF-21类似物”)或FGF-21的衍生物(称为“FGF-21衍生物”)。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述活性药物成分是胰岛素或胰岛素类似物，例如人胰岛素类似物，其中所述肽的与式(I)的磺酰胺共价结合的氨基是所述胰岛素或胰岛素类似物中存在的赖氨酸的ε氨基或者是所述胰岛素或胰岛素类似物的B链的N末端氨基。例如，所述胰岛素或胰岛素类似物在A链和/或B链中具有一个赖氨酸。在一些实施方案中，所述胰岛素或胰岛素类似物在A链和在B链中具有一个赖氨酸。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述肽的与式(I)的磺酰胺共价结合的氨基是人胰岛素或人胰岛素类似物(例如人胰岛素类似物)的B链的位置B26至B29(例如B29)处存在的赖氨酸的ε氨基。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述诊断化合物是造影剂，诸如放射造影剂。在一些实施方案中，所述造影剂是基于钆或碘的磁共振成像(MRI)造影剂。在一些实施方案中，所述造影剂是钆喷替酸二葡甲胺、钆特酸葡甲胺、钆贝酸二葡甲胺、钆特醇、钆双胺、钆弗塞胺、钆塞酸二钠、泛影酸或泛影酸盐(例如泛影酸的葡甲胺盐、钠盐和/或赖氨酸盐)、碘海醇(5-[乙酰基(2,3-二羟基丙基)氨基]-1-N,3-N-双(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘代苯-1,3-二甲酰胺)、碘帕醇(1-N,3-N-双(1,3-二羟基丙-2-基)-5-[[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基]-2，4,6-三碘代苯-1,3-二甲酰胺)、碘普胺(1-N,3-N-双(2,3-二羟基丙基)-2,4，6-三碘代-5-[(2-甲氧基乙酰基)氨基]-3-N-甲基苯-1,3-二甲酰胺)或碘克沙醇(ioxidanol)(5-[乙酰基-[3-[乙酰基-[3,5-双(2,3-二羟基丙基氨基甲酰基)-2，4，6-三碘代-苯基]氨基]-2-羟基-丙基]氨基]-N,N′-双(2,3-二羟基丙基)-2，4,6-三碘代-苯-1，3-二甲酰胺)。在一些实施方案中，所述造影剂选自钆喷替酸二葡甲胺、钆特酸葡甲胺、钆贝酸二葡甲胺、钆特醇、钆双胺、钆弗塞胺、钆塞酸二钠、泛影酸或泛影酸盐(例如泛影酸的葡甲胺盐、钠盐和/或赖氨酸盐)、碘海醇(5-[乙酰基(2，3-二羟基丙基)氨基]-1-N，3-N-双(2，3-二羟基丙基)-2，4，6-三碘代苯-1，3-二甲酰胺)、碘帕醇(1-N，3-N-双(1，3-二羟基丙-2-基)-5-[[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基]-2，4,6-三碘代苯-1,3-二甲酰胺)、碘普胺(1-N,3-N-双(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘代-5-[(2-甲氧基乙酰基)氨基]-3-N-甲基苯-1，3-二甲酰胺)或碘克沙醇(5-[乙酰基-[3-[乙酰基-[3,5-双(2,3-二羟基丙基氨基甲酰基)-2，4,6-三碘代-苯基]氨基]-2-羟基-丙基]氨基]-N，N′-双(2,3-二羟基丙基)-2,4,6-三碘代-苯-1,3-二甲酰胺)。
如以上所讨论的，式(I)的磺酰胺与所述诊断化合物共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述诊断化合物的合适的官能团共价结合。合适的官能团可以是例如所述诊断化合物的氨基(伯或仲)或羟基。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-1)
Figure BDA0003196566540000171
其中：
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子并且是例如氟原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
R1表示选自氢原子和卤素原子的至少一个残基，其中所述卤素原子是例如氟或氯原子；
R2表示选自氢原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基，其中所述C1至C3烷基是例如甲基，并且所述卤化的C1至C3烷基是例如全卤化的诸如三氟甲基；
其中如果p是零，则m是从5至15范围内的整数，或者如果p是1，则m是从7至15范围内的整数。
在所述缀合物的一个实施方案中，所述磺酰胺的残基R1和R2是氢原子。
在所述缀合物的一个实施方案中，所述磺酰胺的残基X表示氮原子。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺的式(I)的HOOC-(CH2)m-(O)s-(E)p-(CH2)n-(A)t-基团或式(I-1)的HOOC-(CH2)m-(E)p-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据所述缀合物的另一个实施方案，如果p是1，则HOOC-(CH2)m-(O)s-基团和-(CH2)n-(A)t-基团位于所述磺酰胺的式(I)的(E)p上的间位或对位，或者HOOC-(CH2)m-基团和-O-位于式(I-1)的(E)p上的间位或对位。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺的指示符号q是零。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-1-1)
Figure BDA0003196566540000181
其中X是氮原子或-CH-基团，例如氮原子；m是从7至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1，例如零；Hal是选自氟、氯、溴和碘原子的卤素原子，例如氟原子；并且HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-1-1a)
Figure BDA0003196566540000182
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-1-2)
Figure BDA0003196566540000183
其中X是氮原子或-CH-基团，例如氮原子；m是从5至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1，例如零；并且HOOC-(CH2)m-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据所述缀合物的一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-1-2a)
Figure BDA0003196566540000191
或式(I-1-2b)
Figure BDA0003196566540000192
或式(I-1-2c)
Figure BDA0003196566540000193
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-2)
Figure BDA0003196566540000194
其中
X表示氮原子或-CH-基团；并且
m是从5至17范围内，例如从11至17范围内的整数。
根据所述缀合物的一个实施方案，式(I-2)的磺酰胺的HOOC-(CH2)m-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-3)
Figure BDA0003196566540000195
其中
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数，例如11。
根据所述缀合物的一个实施方案，式(I-3)的磺酰胺的HOOC-(CH2)m-O-基团和-(CH2)2-基团位于式(I-3)的(E)上的对位，并且HOOC-(CH2)m-O-(E)-(CH2)2-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-4)
Figure BDA0003196566540000201
其中
A是OCH2-基团或-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内，例如从9至13范围内的整数。
根据所述缀合物的一个实施方案，式(I-4)的磺酰胺的HOOC-(CH2)m-基团和-A-基团位于式(I-4)的(E)上的对位，并且-A-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
根据所述缀合物的另一个实施方案，所述磺酰胺具有式(I-5)
Figure BDA0003196566540000202
其中
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内，例如从7至9范围内的整数。
根据所述缀合物的一个实施方案，式(I-5)的磺酰胺的HOOC-(CH2)m基团和-(CH2)2-基团位于式(I-5)的(E)上的对位，并且HOOC-(CH2)m(E)-(CH2)2-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的对位。
缀合物的制备方法
本文提供了用于制备包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的方法
Figure BDA0003196566540000211
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述活性药物成分的氨基共价结合；
(a)提供式(Aa)的磺酰胺
Figure BDA0003196566540000212
其中X、Y、A、E、R1、R2和指示符号m、n、p、q、r、s、t具有如以上关于式(I)所定义的含义，Rx是氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基，并且R3是保护基团或氢原子，任选地氢原子；
和具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分；
(b)使式(Aa)的磺酰胺与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分在适于形成在式(Aa)的磺酰胺的游离或活化的(任选地活化的)羧基“a”与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分的氨基之间的酰胺键的条件下反应；
(c)任选地去除一个或两个保护基团，例如去除两个保护基团。
在所述方法的一些实施方案中，对于式(I)的磺酰胺以及对于式(Aa)的磺酰胺，排除s是1、p是零、n是零、A是氧原子并且t是1的组合。在一些实施方案中，对于式(I)的磺酰胺以及对于式(Aa)的磺酰胺，s是零，其中剩余的残基和指示符号分别具有如上针对式(I)和(Aa)所指示的含义。
本文提供了用于制备包含式(I)的磺酰胺和诊断化合物的缀合物的方法，其中根据以上针对与所述活性药物成分键合所述的方法，所述诊断化合物用合适的官能团与式(Aa)的磺酰胺的游离或活化的(任选地活化的)羧基“a”共价结合。
还可以通过包括以下的方法来制备如上文所述的缀合物：
a)提供式(Aa)的磺酰胺，其中Rx表示活化基团(Rx＝活化基团)；
b)提供活性药物成分的水溶液，其中所述水溶液任选地包含醇；
c)使b)的水溶液与a)的式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)接触；以及
d)使式(Aa)的磺酰胺与所述活性药物成分反应，从而获得包含所述磺酰胺和所述活性药物成分的缀合物的溶液，其中所述磺酰胺与所述活性药物成分共价结合。
在此方法中，所述活性药物成分任选地是具有游离氨基的胰岛素多肽，任选地各自具有游离氨基的如上文所述的胰岛素类似物或其前体，其中所述胰岛素类似物的前体包含另外的接头肽，所述接头肽具有至少两个氨基酸的长度或从2至30个氨基酸范围内的长度或从4至9个氨基酸范围内的长度。在此方法中，a)中提供的水溶液具有从9至12范围内或从9.5至11.5范围内或从10至11范围内的pH值，其中所述pH值是根据ASTM E 70:2007用pH敏感的玻璃电极确定的；其中所述pH值任选地通过添加碱在相应范围内进行调节，任选地选自以下的碱：选自碱性氢氧化物(氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾)、烷基胺及其两种或更多种的混合物；任选地选自叔烷基胺N(C1-C5烷基)3、伯烷基胺H2N-C(C1-C5烷基)3及其两种或更多种的混合物，其中所述叔胺的和所述伯胺的C1-C5烷基各自独立地选自支链或直链的C1-C5烷基并且其中每个C1-C5烷基具有至少一个选自氢原子、羟基和羧基的取代基；任选地选自叔烷基胺N(C1-C3烷基)3、伯烷基胺H2N-C(C1-C3烷基)3及其两种或更多种的混合物，其中所述叔胺的和所述伯胺的C1-C3烷基各自独立地选自支链或直链的C1-C3烷基并且其中每个C1-C3烷基具有至少一个选自氢原子、羟基和羧基的取代基；任选地选自N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、三甲胺、三(羟基甲基)氨基甲烷及其两种或更多种的混合物；其中所述碱任选地至少包括三乙胺。
在此方法的一个变型中，进行根据步骤c)的使b)的水溶液与a)的式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)接触，其中将a)的式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)作为式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)的溶液添加到b)的水溶液中，其中式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)的溶液任选地是有机溶液，任选地包含式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)和极性非质子有机溶剂(任选地在标准条件(T：20℃-25℃，p：1013毫巴)下具有从1至5范围内或从2至4范围内的辛醇-水分配系数(KOW)；任选地选自四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺及其两种或更多种的混合物；或选自四氢呋喃、乙腈及四氢呋喃和乙腈的混合物的极性非质子有机溶剂)的溶液。
在此方法的一个变型中，进行根据步骤c)的使b)的水溶液与a)的式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)接触，其中将a)的式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)以固体形式或至少部分呈结晶形式或至少90重量％呈结晶形式添加到b)的水溶液中。
在此方法中，步骤d)任选地包括：d.1)使式(Aa)的磺酰胺(Rx＝活化基团)与所述胰岛素类似物的前体在从9至12范围内或从9.5至11.5范围内或从10至11范围内的pH下反应，从而获得包含式(I)的磺酰胺和所述胰岛素类似物的前体的前缀合物，其中式(I)的磺酰胺与所述胰岛素类似物的前体通过在式(I)的磺酰胺的-C(＝O)-O(R)与所述胰岛素类似物的前体的氨基之间形成的酰胺键C(＝O)-NH-共价结合；d.2)任选地在低于9的范围内的pH下或在7至9范围内的pH下酶促消化根据d.1)获得的前缀合物的胰岛素类似物的前体，从而获得包含式(I)的磺酰胺和所述胰岛素类似物的缀合物的溶液。所述方法任选地包括：e)从d)或d.2)中获得的溶液中分离式(I)的磺酰胺和所述胰岛素类似物的缀合物。
在此方法中，式(Aa)的磺酰胺的活化基团Rx任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基。
在此方法的一个变型中，根据b)的胰岛素类似物的前体的水溶液包含醇，所述醇选自C1-C4一元醇及其两种或更多种的混合物，或选自甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇及其两种或更多种的混合物，或选自乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇及其两种或更多种的混合物。任选地，所述醇以从0.0001至35体积％范围内或从0.001至30体积％范围内或从0.01至25体积％范围内或从0.1至20体积％范围内的量存在于所述水溶液中，各自基于水和醇的总体积。在此方法中，根据d.2)的酶促消化包括使用至少一种选自以下的酶：胰蛋白酶、TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶)及其两种或更多种的混合物。在此方法中，所述胰岛素类似物是如上文所述的胰岛素类似物。在此方法中，式(I)的磺酰胺通过分别在式(I)的磺酰胺的-C(＝O)-O(R3)与所述胰岛素类似物及其前体的游离氨基之间形成的酰胺键C(＝O)-NH-分别与所述胰岛素类似物及其前体共价结合，其中所述胰岛素类似物及其前体的游离氨基分别任选地是分别包含在所述胰岛素类似物及其前体中的赖氨酸(或末端赖氨酸，或分别存在于所述胰岛素类似物及其前体的C末端的赖氨酸，或存在于B链的C末端的赖氨酸)的氨基。
本文提供了从如上所述的方法获得或可获得的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物。
本文提供了包含药学或诊断有效量的如上所述的缀合物的药物组合物，所述缀合物包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物。
本文提供了如上所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作药剂。
一个实施方案涉及如上所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作用于治疗选自妊娠期糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症的疾病和/或用于降低血糖水平的药剂。
本文提供了治疗患有选自妊娠期糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症的疾病和/或需要降低血糖水平的患者的方法；所述方法包括施用治疗有效量的如上所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物。
本文提供了如上所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物用于制造治疗选自妊娠期糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症的疾病用和/或降低血糖水平用的药剂的用途。
本文提供了如上所述的包含式(I)的磺酰胺和诊断化合物的缀合物，其用作诊断剂。
本文提供了在患者中诊断疾病(例如选自心血管疾病和癌症的疾病)或用于确定患者患上疾病(例如选自心血管疾病和癌症的疾病)的风险的方法，所述方法包括施用诊断有效量的如上所述的包含式(I)的磺酰胺和诊断化合物的缀合物。
本文提供了如上所述的包含式(I)的磺酰胺和诊断化合物的缀合物用于制造诊断疾病(例如选自心血管疾病和癌症的疾病)用的诊断剂的用途。
本发明通过以下实施方案和实施方案的组合进一步说明，如通过各自的从属和反向引用所指示的。特别地，应注意的是，在提及实施方案的范围的每种情况下，例如在诸如“根据实施方案1至4中任一项所述的……”的术语的上下文中，此范围内的每个实施方案均旨在为技术人员明确地公开，即技术人员将此术语的措辞理解为与“根据实施方案1、2、3和4中任一项所述的……”同义。
1.一种式(A)的磺酰胺
Figure BDA0003196566540000251
其中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基。
2.根据实施方案1所述的磺酰胺，其具有式(A-1)
Figure BDA0003196566540000261
其中：
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
R1表示选自氢原子和卤素原子的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且
其中如果p是零，则m是从5至15范围内的整数，或者如果p是1，则m是从7至15范围内的整数。
3.根据实施方案1或2所述的磺酰胺，其中R1和R2是氢原子。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的磺酰胺，其中X表示氮原子。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的磺酰胺，其中式(A)的HOOC-(CH2)m-(O)s-(E)p-(CH2)n-(A)t-基团或式(A-1)的HOOC-(CH2)m-(E)p-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的磺酰胺，其中如果p是1，则HOOC-(CH2)m-(O)s-基团和-(CH2)n-(A)t-基团位于式(A)的(E)p上的间位或对位，或者HOOC-(CH2)m-基团和-O-位于式(A-1)的(E)p上的间位或对位。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的磺酰胺，其中q是零。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-1)
Figure BDA0003196566540000271
其中X是氮原子或-CH-基团；m是从7至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1；Hal是选自氟、氯、溴和碘原子的卤素原子；Rx表示氢原子或活化基团，任选地选自7-氮杂苯并三唑(任选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx任选地是N-琥珀酰亚胺基；并且HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-1a)
Figure BDA0003196566540000272
10.根据实施方案1至7中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-2)
Figure BDA0003196566540000273
其中X是氮原子或-CH-基团；m是从5至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1；并且HOOC-(CH2)m-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
11.根据实施方案1至7或10中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-2a)
Figure BDA0003196566540000274
或
式(A-1-2b)
Figure BDA0003196566540000281
或
式(A-1-2c)
Figure BDA0003196566540000282
12.一种缀合物，其包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物
Figure BDA0003196566540000283
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子，优选地氟原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分或所述诊断化合物共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述药物活性剂的或所述诊断化合物的合适的官能团共价结合。
13.根据实施方案12所述的缀合物，其中所述活性药物成分选自胰岛素、胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物。
14.根据实施方案12或13所述的缀合物，其中所述活性药物成分是胰岛素或胰岛素类似物，其中所述肽的与式(I)的磺酰胺共价结合的氨基是所述胰岛素或胰岛素类似物中存在的赖氨酸的ε氨基或者是所述胰岛素或胰岛素类似物的B链的N末端氨基。
15.根据实施方案14所述的缀合物，其中所述肽的与式(I)的磺酰胺共价结合的氨基是人胰岛素或人胰岛素类似物的B链的位置B26至B29处存在的赖氨酸的ε氨基。
16.一种用于制备包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的方法
Figure BDA0003196566540000291
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子，优选地氟原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述活性药物成分的氨基共价结合；
所述方法包括：
(a)提供式(Aa)的磺酰胺
Figure BDA0003196566540000301
其中X、Y、A、E、R1、R2和指示符号m、n、p、q、r、s、t具有如实施方案1中所定义的含义，Rx是氢原子或活化基团，优选地选自7-氮杂苯并三唑(优选地衍生自HATU或HBTU)、4-硝基苯和N-琥珀酰亚胺基的活化基团，其中Rx优选地是N-琥珀酰亚胺基；并且R3是保护基团或氢原子，优选地氢原子；和具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分；
(b)使式(Aa)的磺酰胺与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分在适于形成在式(Aa)的磺酰胺的游离或活化的(优选地活化的)羧基“a”与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分的氨基之间的酰胺键的条件下反应；
(c)任选地去除一个或两个保护基团。
17.一种从根据实施方案16所述的方法获得或可获得的缀合物，其包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分。
18.一种药物组合物，其包含药学或诊断有效量的根据实施方案12至15中任一项所述的或根据实施方案17所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分或诊断化合物的缀合物。
19.根据实施方案12至15中任一项所述的或根据实施方案17所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作药剂。
20.根据实施方案12至15中任一项所述的或根据实施方案17所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作用于治疗选自妊娠期糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症的疾病和/或用于降低血糖水平的药剂。
21.根据实施方案12至15中任一项所述的包含式(I)的磺酰胺和诊断化合物的缀合物，其用作诊断剂。
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例
1.所使用的缩写列表：
Ac 乙酰基
Boc 叔丁基氧基羰基
DCM 二氯甲烷
DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EA 乙酸乙酯
HMPA 六甲基磷酰胺
HPLC 高效液相色谱法
LC 液相色谱法
LCMS 液相色谱法/质谱法
MeCN MeCN
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
PE 石油醚
RP 反相
RT 室温(25℃)
TEA 三乙胺
TEMPO 2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物
TFA 三氟乙酸
TFAA 三氟乙酸酐
TMS 三甲基甲硅烷基
Ts 甲苯磺酰基
TSTU O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N,N-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
下面描述了适于制备式(A)的化合物的通用方法。通过不同的化学方法来制备式I的化合物。以下方法中(尤其是方案中)提及的基团和指示符号具有针对式(I)所指示的上述含义，除非它们另外明确定义。
2.式(A)的化合物的通用合成
从相应的中间体I开始合成式(A)的化合物(方案1)。在用TSTU活化后，使中间体I与氨基酸(4)(步骤3)或化合物(2)(步骤2)偶联以分别得到(3)和(6)。在步骤3中利用烷基酯(R＝烷基)的情况下，实现用LiOH进行皂化。将羧酸(6)和(7)二者均用TSTU活化并且与(2)偶联以得到(3)。为了完成式(I)的化合物的合成，将(3)的叔丁酯在最终步骤7中通过用CF3CO2H处理进行裂解。中间体I的合成示于方案2中。
Figure BDA0003196566540000321
2.1中间体I的通用合成
如方案2所示合成中间体I。在K2CO3的存在下，从溴化物I或甲苯磺酸酯I开始，实现中间体III的烷基化(步骤8)。可替代地，在一系列反应之后分离(8)，所述反应开始于炔烃I和中间体II的Sonogashira反应(步骤11)，然后在分别由钯和铂催化的氢气氛下氢化所得的(11)(步骤12)。然后将(8)与2-氯吡啶(9)在钯催化的反应中缩合(步骤9)或与2-氯嘧啶(10)热缩合(步骤10)。在两种情况下，随后将烷基酯用LiOH水解以获得所需的中间体I。
Figure BDA0003196566540000341
2.2中间体II的通用合成
如方案3所示，在苯酚(13)和醇(12)的Mitsunobu反应(步骤13)之后分离中间体II。可替代地，在K2CO3的存在下，经由苯酚(13)(步骤14)或苯酚(15)(步骤15)的烷基化合成中间体II。合适的烷基化剂分别为(14)和(16)。氟化物(18)与苯酚(17)的亲核芳族取代也产生了中间体II(步骤16)。
Figure BDA0003196566540000351
方案3
2.3中间体III的通用合成
如方案4所述的在线性反应序列后获得中间体III。从炔烃(20)用溴化物(19)的烷基化开始，分离受TMS保护的炔烃(21)。在使用NaOH的碱性条件下使(21)脱保护。随后分离的炔烃(22)与相应的芳族卤化物(23)的Sonogashira反应(步骤19)产生了(24)。(24)的合适的保护基团是例如乙酰基(PG＝Ac)，其在用NaOH处理后被裂解(步骤20)。将最后的氢化步骤21在H2气氛下通过钯或铂催化以提供所需的中间体III。
Figure BDA0003196566540000361
2.4炔烃I和溴化物I的通用合成
如方案5所示合成起始材料溴化物I和炔烃I。对于炔烃I，利用两种不同的合成途径。在醇(29)的氧化(在催化量的TEMPO的存在下通过NaOCl和NaClO2的混合物实现所提及的氧化(步骤24))后或通过溴化物(26)的烷基化/脱保护序列分离羧酸(28)。对于烷基化，使用试剂(20)。然后将分离的产物(27)用NaOH处理以裂解TMS保护基团。在用(CF3CO)2O活化并且与叔丁醇反应后，实现作为叔丁酯的羧酸(28)的必要保护以获得所需的炔烃I。
对于溴化物I的合成，使用如针对(29)转化为炔烃I所述的相似的序列(步骤24和25)。醇(30)的氧化和所得的羧酸(31)的随后保护产生了所需的溴化物I。
甲苯磺酸酯I可以通过醇(33)的甲苯磺酸化合成(步骤29)。在羧酸(32)的还原之后分离(33)，将所述羧酸原位转移到混合酸酐中并且随后用NaBH4还原(步骤28)。
Figure BDA0003196566540000371
方案5
2.5根据方案5合成炔烃I和溴化物I的例子
Figure BDA0003196566540000381
2.5.1 12-溴十二烷酸的合成
Figure BDA0003196566540000382
向12-溴-十二-1-醇(20g，75.4mmol)和TEMPO(5.9g，37.7mmol)在CH3CN(400ml)和pH 4缓冲溶液(60ml)中的溶液中同时添加NaClO2(37.5g，414.8mmol)在H2O(60ml)中的溶液和NaOCl(28g，37.7mmol)的10％溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EA(1200ml)稀释，用水(1000ml)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空下浓缩以得到呈黄色固体的所需的产物12-溴十二烷酸(20g，71.6mmol，产率95％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.96(s,1H),3.52(t,J＝6.6Hz,2H),2.18(t,J＝7.2Hz,2H),1.85–1.72(m,2H),1.55–1.43(m,2H),1.37(s,2H),1.21(d,J＝32.6Hz,12H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000391
2.5.2 14-(三甲基甲硅烷基)十四-13-炔酸的合成
Figure BDA0003196566540000392
在N2下在-78℃下向乙炔基-三甲基-硅烷(63.3g，644.7mmol)在THF(300ml)中的混合物中添加n-BuLi(在己烷中的2.5M)(258ml，644.7mmol)，在10min后，添加HMPA(115.5g，644.7mmol)并且将混合物温热至0℃持续30min。然后添加在THF(300ml)中的12-溴十二烷酸(30g，107.45mmol)。然后将混合物在室温下搅拌过夜。在0℃下将水(1200ml)缓慢添加到混合物中，然后将pH值用HCl水溶液调节至3，用EA(800ml)萃取。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空下浓缩以得到呈棕色油状物并且用于下一步骤的粗产物14-(三甲基甲硅烷基)十四-13-炔酸(35g)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000393
2.5.3十四-13-炔酸的合成
Figure BDA0003196566540000394
向14-(三甲基甲硅烷基)十四-13-炔酸(35g，107.45mmol)在H2O(150ml)和THF(150ml)中的混合物中添加NaOH(8.6g，214.9mmol)。然后将混合物在室温下搅拌3h。然后将pH值用HCl水溶液调节至4，用EA(300ml*2)萃取。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空下浓缩。将粗品通过硅胶色谱法(PE:EA＝4:1)纯化以得到呈黄色固体的所需的产物十四-13-炔酸(23g，102.5mmol，2个步骤的产率：95％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.96(s,1H),2.73(s,1H),2.17(dd,J＝16.3,8.9Hz,4H),1.51–1.21(m,18H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000401
2.5.4癸-9-炔酸的合成
Figure BDA0003196566540000402
向癸-9-炔-1-醇(15g，97.4mmol)和TEMPO(7.6g，48.7mmol)在CH3CN(300ml)和pH4缓冲溶液(75ml)中的溶液中同时添加NaClO2(48.2g，536mmol)和NaOCl(36.0g，48.7mmol)的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用EA(900ml)稀释，用水(900ml)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空下浓缩。将粗品通过硅胶色谱法(PE/EA ＝1/1)纯化以得到呈无色油状物的所需的癸-9-炔酸(20g，粗品)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.36(t,J＝7.3Hz,2H),2.18(td,J＝6.9,2.3Hz,2H),1.93(t,J＝2.3Hz,1H),1.72–1.59(m,2H),1.54(td，J＝14.1，7.2Hz，2H)，1.48–1.30(m，6H)ppm。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000403
2.5.5十四-13-炔酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000404
向十四-13-炔酸(23g，102.5mmol)在t-BuOH(200ml)中的混合物中添加(Boc)2O(33.6g，153.8mmol)和DMAP(3.7g，30.7mmol)。然后将混合物在室温下搅拌过夜。将溶剂在真空下去除。将水(400ml)添加到混合物中，并且用EA(400ml)萃取。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(PE:EA＝30:1)纯化以得到呈黄色液体的所需的产物十四-13-炔酸叔丁酯(23.5g，83.8mmol，82％产率)。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.72(s,1H),2.15(d,J＝8.4Hz,4H),1.49–1.21(m，27H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000411
2.5.6 6-溴己酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000412
将6-溴己酸(6.0g，31mmol)、TFAA(26.0g，124mmol)添加到THF(60ml)中，将混合物在室温下反应1h。然后将叔丁醇(30ml)添加到混合物中，并且在室温下搅拌16h。然后将反应混合物的pH用NaHCO3溶液调节至pH＝8，将混合物用EA(150ml*3)萃取，经Na2SO4干燥，浓缩以得到目标化合物6-溴己酸叔丁酯(7.6g，30.4mmol，98％产率)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ3.52(t,J＝6.6Hz,2H),2.20(dd,J＝15.0,7.8Hz,2H),1.85–1.74(m,2H),1.52(ddd，J＝19.3，10.9，5.7Hz,2H),1.44–1.32(m,9H)。
2.5.6甲苯磺酸酯I的合成
Figure BDA0003196566540000413
2.5.7 18-羟基十八烷酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000414
向18-叔丁氧基-18-氧代-十八烷酸(5g，13.5mmol)在THF(150ml)中的溶液中添加N-甲基吗啉(1638mg，16.5mmol)。将混合物冷却至-25℃，然后逐滴添加氯甲酸乙酯(1277mg，13.5mmol)。将混合物在-25℃下搅拌20分钟并且将固体通过过滤去除。在0℃下将溶液小心添加到NaBH4(770mg，20.25mmol)在水(15mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时。将THF在真空下去除并且将水相用EA(3x50mL)萃取。将合并的有机相经MgS04干燥并且在真空下浓缩以得到呈白色固体的18-羟基十八烷酸叔丁酯(4.7g，99.8％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.63(t，J＝6.6Hz,2H),2.19(t，J＝7.5Hz，2H)，1.57(dd，J＝13.0,6.5Hz,4H),1.43(d,J＝3.9Hz,9H)，1.38–1.20(m，27H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000421
2.5.8 18-(对甲苯基磺酰基氧基)十八烷酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000422
向18-羟基十八烷酸叔丁酯(4700mg，13.2mmol)和TsCl(2508mg，13.2mmol)在DCM(100mL)中的溶液中添加TEA(400mg，39.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加水(50mL)，并且用DCM(50mL*2)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将粗品通过硅胶柱(EA/正己烷＝1:20)纯化以得到18-(对甲苯基磺酰基氧基)十八烷酸叔丁酯(4.5g，67％产率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d，J＝8.2Hz，2H)，7.34(d，J＝8.1Hz，2H)，4.02(t，J＝6.5Hz，2H)，2.45(s，3H)，2.20(t，J＝7.5Hz，2H)，1.69–1.57(m，4H)，1.44(s，9H)，1.25(t，J＝12.1Hz，24H)。
Figure BDA0003196566540000423
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000424
2.6根据方案4合成中间体III的例子
Figure BDA0003196566540000431
2.6.1 4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000432
将4-溴苯磺酰胺(61g，260mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(38.2g，0.09mol)、四(三苯基膦)钯(7.5g，6.5mmol)和碘化铜(2.5g，13mmol)在三乙胺(500ml)中的混合物在氮气氛下加热至80℃持续8h。将混合物在真空中浓缩并且用EA(300ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并且在减压下浓缩。将粗品通过硅胶色谱法(用在PE中的70％DCM洗脱)纯化以得到4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯磺酰胺(50g，75％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：90％(214nm)；质量：在1.98min处发现峰254.0(M+H)+。
2.6.2 4-乙炔基苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000433
将4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯磺酰胺(40g，158mmol)、K2CO3(2.2g，15.8mmol)和甲醇(400ml)在室温下搅拌12h。在反应完成(通过LCMS监测)后，用水(200ml)稀释，并且用EA(2x200ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并且在减压下浓缩。将粗品通过硅胶色谱法(用在PE中的100％DCM洗脱)纯化以得到4-乙炔基苯磺酰胺(22g，77％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：90％(214nm)；质量：在1.65min处发现峰182.1(M+H)+。
2.6.3乙酸4-((4-氨磺酰基苯基)乙炔基)苯酯的合成
Figure BDA0003196566540000441
向4-乙炔基苯磺酰胺(15g，83mmol)在DMF(150ml)中的混合物中添加Pd(PPh3)2Cl2(5.8g，8.3mmol)、CuI(1.6g，8.3mmol)、Et3N(25g，249mmol)和(4-碘苯基)乙酸酯(27g，103mmol)。将烧瓶排空并且用N2回填。然后将混合物在室温下搅拌过夜。将水(200ml)添加到混合物中，吸滤并且在空气中干燥提供呈棕色固体的乙酸4-((4-氨磺酰基苯基)乙炔基)苯酯(18g，70％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：90％(214nm)；质量：在1.88min处发现峰338(M+Na)+。
2.6.4 4-((4-羟基苯基)乙炔基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000442
在0℃下向乙酸4-((4-氨磺酰基苯基)乙炔基)苯酯(18g，57mmol)在THF(60ml)、MeOH(60ml)和H2O(30ml)中的溶液中添加NaOH(4.5g，114mmol)。将混合物在室温下搅拌2h。在反应完成(通过LCMS监测)后，将溶液用EA(50ml)稀释并且用水(20ml)和饱和的NaCl水溶液洗涤后，经MgSO4干燥。将滤液在真空中浓缩以提供粗产物。将粗产物用DCM浆化。吸滤并且在空气中干燥提供呈棕色固体的4-((4-羟基苯基)乙炔基)苯磺酰胺(10.9g，70％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：95％(214nm)；质量：在1.75min处发现峰296.1(M+Na)+。
2.6.5 4-(4-羟基苯乙基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000451
向4-((4-羟基苯基)乙炔基)苯磺酰胺(10.9g，40mmol)在40ml的THF和40ml的MeOH中的溶液中添加PtO2(1g)。将反应混合物在H2下在室温下搅拌24h。在反应完成(通过LCMS监测)后，然后将混合物过滤。将滤液在真空中浓缩以提供4-(4-羟基苯乙基)苯磺酰胺(9.5g，86％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：100％(214nm)；质量：在1.67min处发现峰278.1(M+H)+。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(s,1H),7.71(d,J＝8.3Hz,2H),7.38(d,J＝8.3Hz,2H),7.26(s,2H),7.00(d,J＝8.4Hz,2H),6.72–6.60(m，2H)，2.96–2.84(dd，J＝9.2，6.2Hz，2H)，2.77(dd，J＝9.2，6.3Hz，2H)。
2.7根据方案3合成中间体II的例子
2.7.1 4-(3-溴-4-氟苯氧基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000452
将3-溴-4-氟-苯酚(12.8g，66.8mmol)、4-氟苯磺酰胺(9.00g，51.4mmol)和K2CO3(14.2g，103mmol)在NMP(50ml)中的混合物在190℃下搅拌5h。将反应混合物用EA(500ml)稀释，用水(50ml)、盐水(50ml*3)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(用PE/EA＝3/1洗脱)纯化以得到呈白色固体的4-(3-溴-4-氟苯氧基)苯磺酰胺(10.8g，31.3mmol，61％产率)。
LC-质谱方法：流动相：A＝2.5mM TFA/H2O，B＝2.5mM TFA/MeCN；梯度：B＝在1.0min内10％-95％；流速：1.5ml/min；柱：Xbridge-C18，30×4.6mm，2.5um。LC(所需的产物)纯度：88％(214nm)；质量：在1.74min处发现峰368.0(M+Na)+。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000453
2.7.2 4-(4-溴苯乙氧基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000461
在0℃下向2-(4-溴苯基)乙醇(10g，49.8mmol)、4-羟基苯磺酰胺(8.6g，49.8mmol)和PPh3(14.3g，54.795mmol)在干THF(200ml)中的溶液中逐滴添加DIAD(11.1g，54.7mmol)。允许伴随搅拌将反应温热至室温持续20h。将溶剂在减压下去除并且将残余物溶解于EA(200ml)中并且然后用水(50ml)和盐水(50ml)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥。在过滤后，将溶剂在减压下去除并且将残余物通过柱色谱法(硅胶，用在PE中从0至40％的EA洗脱)纯化以获得39％产率的4-(4-溴苯乙氧基)苯磺酰胺(6.8g，呈白色固体)。
LC-质谱方法：流动相：H2O(0.01％TFA)(A)/MeCN(0.01％TFA)(B)；梯度：5％B持续0.2min，在1.3min内增加至95％B；流速：1.8ml/min；柱：SunFire，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：95％(214nm)；质量：在2.08min处发现峰356(M+H)+
2.7.3合成方案：4-((4-碘苯氧基)甲基)苯磺酰胺
Figure BDA0003196566540000462
2.7.4 4-(溴甲基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000463
将4-(溴甲基)苯磺酰氯(7g，26mmol)在THF(80ml)中的溶液冷却至0℃，向其中添加28％氨水(6.5ml)并且将混合物在室温下搅拌2h。将反应溶液浓缩并且添加乙酸乙酯(200ml)。将有机层分离，干燥并且浓缩。不经进一步纯化直接使用粗4-(溴甲基)苯磺酰胺。(5.5g，86％)
LC-质谱方法：流动相：A ＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：2.0ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：90％(214nm)；质量：在1.64min处发现峰250.1(M+H)+。
2.7.5 4-((4-碘苯氧基)甲基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000471
向4-(溴甲基)苯磺酰胺(5.5g，22mmol)在DMF(50ml)中的混合物中添加Cs2CO3(10.7g，33mmol)和4-碘苯酚(6g，27.5mmol)。然后将混合物在室温下搅拌12h。将水(200ml)添加到混合物中，将所得的固体过滤，并且然后用Et2O(50ml)浆化；吸滤并且在空气中干燥提供呈白色固体的所需的产物(5.5g，65％)。
LC-质谱方法：方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：1.8ml/min；柱：Xbridge-C18，50x4.6mm，3.5um。LC纯度：80％(214nm)；质量：在1.98min处发现峰389.7(M+H)+。
2.7.6 4-(4-溴苄氧基)苯磺酰胺的合成
Figure BDA0003196566540000472
向1-溴-4-(溴甲基)苯(6.5g，26mmol)在DMF(50ml)中的混合物中添加K2CO3(5.5g，40mmol)和4-羟基苯磺酰胺(4.5g，26mmol)。然后将混合物在50℃下搅拌2h。将水(200ml)添加到混合物中，将固体过滤。然后将固体用PE:EA ＝1:2(50ml)浆化，吸滤并且在空气中干燥提供呈白色固体的所需的产物。(5.3g，60％)。
LC-质谱方法：方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：1.8ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：80％(214nm)；质量：在1.81min处发现峰364(M+Na)+。
2.8根据方案2合成中间体I的例子
2.8.1 12-(4-氨磺酰基苯氧基)十二烷酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000481
将12-溴十二烷酸叔丁酯(6g，18mmol)、4-羟基苯磺酰胺(3g，18mmol)和K2CO3(5g，36mmol)在DMF(50ml)中的混合物加热至50℃并且搅拌4h。然后添加水(300ml)。将所得的沉淀物收集并且干燥以得到粗12-(4-氨磺酰基苯氧基)十二烷酸叔丁酯，将其用EA/PE(1/5，100ml)浆化，以得到7g(93％)的12-(4-氨磺酰基苯氧基)十二烷酸酯：
LC-质谱方法：流动相：A：水(0.01％TFA)，B：MeCN(0.01％TFA)。梯度：5％B持续0.2min，在1.3min内增加至95％B，95％B持续1.5min，在0.01min内回至5％B；流速：1.8ml/min；柱：Sunfire，50*4.6mm，3.5um；柱温：50℃。LC-MS纯度：100％(214nm)；质量：在2.23min处发现峰450.2(M+Na)+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(t，J＝14.8Hz，2H)，6.96(d，J＝8.8Hz,2H),4.89(s,2H),4.03(dt,J＝13.0，6.6Hz，2H),2.20(t,J＝7.5Hz,2H),1.73-1.80(m,2H),1.50-1.57(m,2H),1.40-1.48(m，11H)，1.37–1.19(m，12H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000482
Figure BDA0003196566540000491
合成方案：14-(4-氨磺酰基苯基)十四烷酸酯的合成
Figure BDA0003196566540000492
2.8.2 14-(4-氨磺酰基苯基)十四-13-炔酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000493
向4-溴苯磺酰胺(1.6g，6.8mmol)在DMF(20ml)中的混合物中添加Pd(PPh3)2Cl2(0.47g，0.68mmol)、CuI(0.13g，0.68mmol)、Et3N(2g，20.33mmol)和十四-13-炔酸叔丁酯(2.2g，7.8mmol)。将烧瓶排空并且用N2回填。然后将混合物在70℃下搅拌4h。将水(80ml)添加到混合物中，通过EA(80ml*2)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，在真空下浓缩。将粗品通过硅胶色谱法(PE:EA＝4:1)纯化以得到呈黄色固体的14-(4-氨磺酰基苯基)十四-13-炔酸叔丁酯(2.2g，5.05mmol，产率：76％)。
LC-质谱方法：方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：1.8ml/min；柱：Xbridge-C18，50x4.6mm，3.5um。LC纯度：98％(214nm)；质量：在2.37min处发现峰458(M+H)+。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000501
Figure BDA0003196566540000511
2.8.3 14-(4-氨磺酰基苯基)十四烷酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000512
向14-(4-氨磺酰基苯基)十四-13-炔酸叔丁酯(2.2g，5.05mmol)在THF(30ml)中的混合物中添加PtO2(0.23g，1.01mmol)。将烧瓶排空并且用H2回填。然后将混合物在室温下搅拌过夜。过滤，在真空下浓缩以得到呈灰色固体的14-(4-氨磺酰基苯基)十四烷酸酯(2g，4.55mmol，产率：90％)。
LC-质谱方法：流动相：A＝10mM TFA/H2O，B＝MeCN；梯度：B＝在1.5min内5％-95％；流速：1.8ml/min；柱：Xbridge-C18，50×4.6mm，3.5um。LC纯度：93％(214nm)；质量：在2.44min处发现峰462(M+H)+。
1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.72(d，J＝8.1Hz,2H),7.37(d，J＝8.1Hz,2H)，7.26(s，2H)，2.63(t,J＝7.6Hz,2H),2.16(t,J＝7.3Hz,2H),1.57(s,2H),1.51–1.43(m,2H),1.38(s，9H)，1.25(d,J＝14.5Hz,18H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000521
Figure BDA0003196566540000531
2.8.4 2-[[4-[3-(12-叔丁氧基-12-氧代-十二基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-甲酸的合成
Figure BDA0003196566540000532
将12-[2-氟-5-(4-氨磺酰基苯氧基)苯基]十二烷酸叔丁酯(300mg，575μmol)、2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(112mg，603μmol)和Cs2CO3(656mg，2.01mmol)在MeCN(6ml)中的混合物加热至60℃并且搅拌3h(TLC控制)。将反应混合物不经进一步纯化而用于下一皂化步骤中。
将悬浮液用二噁烷(6ml)稀释，并且添加LiOH(37mg，1.56mmol)在水(6ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌16h，并且添加另外的LiOH(37mg，1.56mmol)。将总的混合物在室温下搅拌36h。将悬浮液倒入柠檬酸的水溶液(10％，50ml)中。将悬浮液过滤并且将滤饼用水洗涤并且在真空中干燥。获得呈白色固体的标题化合物2-[[4-[3-(12-叔丁氧基-12-氧代-十二基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-甲酸(350mg，定量)。
1H NMR(400.23MHz，DMSO-d6)δppm 12.2(bs,2H),8.89(s,2H),7.99(d,J＝8.93Hz，2H)，7.21(t,J＝9.17Hz,1H),7.05(m,4H),2.58(br t,J＝7.46Hz,2H),2.15(t,J＝7.27Hz,2H),1.53(m,2H),1.47(m,2H),1.38(s,9H),1.26-1.22(m,14H)。
如果在倒入柠檬酸水溶液后所需的产物没有沉淀，则将水层用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。使用MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂，使粗产物经受柱色谱法。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000541
Figure BDA0003196566540000551
Figure BDA0003196566540000561
Figure BDA0003196566540000571
2.8.5 6-[[4-[3-(12-叔丁氧基-12-氧代-十二基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基-氨基]吡啶-3-甲酸的合成
Figure BDA0003196566540000572
将12-[2-氟-5-(4-氨磺酰基苯氧基)苯基]十二烷酸叔丁酯(300mg，575μmol)、6-氯烟酸甲酯(102mg，603μmol)、Cs2CO3(468mg，1.44mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(26mg，29μmol)和4,5-双(二苯基-膦基)-9,9-二甲基呫吨(“xantphos”，17mg，29μmol)在二噁烷(6ml)中的混合物在氩气氛下加热至80℃持续3h(TLC控制)。将反应混合物不经进一步纯化而用于下一皂化步骤中。
将悬浮液用二噁烷(6ml)稀释，并且添加LiOH(37mg，1.56mmol)在水(6ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌16h，并且添加另外的LiOH(37mg，1.56mmol)。将总的混合物在室温下搅拌36h。将悬浮液倒入柠檬酸的水溶液(10％，50ml)中。将悬浮液过滤并且将滤饼用水洗涤并且在真空中干燥。获得呈白色固体的标题化合物6-[[4-[3-(12-叔丁氧基-12-氧代-十二基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基-氨基]吡啶-3-甲酸(350mg，定量)。
1H NMR(400.23MHz,DMSO-d6)δppm 12.5(br s,1H),8.54(br s,1H),8.11(dd,J＝8.93,2.20Hz,1H),7.91(br d,J＝8.68Hz,2H),7.80(m，1H),7.19(m,2H),7.04(m,4H),2.58(br t,J＝7.46Hz,2H),2.15(t,J＝7.27Hz,2H),1.48(m，4H),1.38(s,9H),1.26-1.22(m,14H)。
如果在倒入柠檬酸水溶液后所需的产物没有沉淀，则将水层用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。使用MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂，使粗产物经受柱色谱法。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000581
Figure BDA0003196566540000591
Figure BDA0003196566540000601
2.9根据方案1合成具有式I的化合物的例子
2.9.1 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]吡啶-3-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸的合成
Figure BDA0003196566540000611
将6-[[4-[3-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]吡啶-3-甲酸(169mg，251μmol)、TSTU(80mg，264μmol)和DIPEA(132μl，97mg，1.25mmol)在6ml的THF中的混合物在室温下搅拌16h。在16h后，将溶剂在减压下去除并且添加[2-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(85mg，277μmol)在6ml无水EtOH中的溶液并且将混合物在室温下搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除，将所得的残余物溶解于CH2Cl2中并且用10％KHSO4水溶液洗涤。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将粗产物通过RP HPLC纯化以得到2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]吡啶-3-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(106mg，44％)。
1H NMR(400.23MHz，DMSO-d6)δppm 12.29(br s,1H),8.52(m,2H),8.09(dd,J＝8.93,2.32Hz,1H),7.89(d,J＝8.80Hz,2H),7.61(br t,J＝5.69Hz,1H)，7.18(m,2H),7.03(m,4H),4.01(s,2H),3.86(s，2H),3.20–3.68(m,16H),2.58(br t,J＝7.52Hz,2H),2.15(t,J＝7.27Hz,2H),1.49(m,4H),1.38(s,9H),1.25(m,18H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000621
Figure BDA0003196566540000631
Figure BDA0003196566540000641
Figure BDA0003196566540000651
Figure BDA0003196566540000661
Figure BDA0003196566540000671
Figure BDA0003196566540000681
Figure BDA0003196566540000691
Figure BDA0003196566540000701
Figure BDA0003196566540000711
2.9.2 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[6-[[5-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]己酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸的合成
Figure BDA0003196566540000721
将5-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-甲酸(500mg，825μmol)、TSTU(310mg，1.0mmol)和DIPEA(360μl，266mg，2.06mmol)在6ml的THF中的混合物在室温下搅拌16h。在16h后，将溶剂在减压下去除并且添加6-氨基己酸(130mg，990μmol)和DIPEA(360μl，266mg，2.06mmol)在6ml无水EtOH中的溶液并且将混合物在室温下搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除，将所得的残余物溶解于CH2Cl2中并且用10％KHSO4水溶液洗涤。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将900mg的获得的粗6-[[5-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]己酸不经进一步纯化而用于下一步骤。
将6-[[5-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]己酸(900mg粗品，65％纯度，814μmol)、TSTU(306mg，1.02mmol)和DIPEA(355μl，262mg，2.03mmol)在6ml的THF中的混合物在室温下搅拌16h。在16h后，将溶剂在减压下去除并且添加2-[2-[2-[[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(301mg，976μmol)和DIPEA(355μl，262mg，2.03mmol)在6ml无水EtOH中的溶液并且将混合物在室温下搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除，将所得的残余物溶解于CH2Cl2中并且用10％KHSO4水溶液洗涤。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将粗产物通过RP HPLC纯化以得到2-[2-[2-[[2-[2-[2-[6-[[5-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]己酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(78mg，10％)。
1H NMR(400.23MHz,DMSO-d6)δppm 12.29(br s,1H),8.82(s,2H),8.47(br s,1H)，7.90(d,J＝8.93Hz，2H)，7.79(t，J＝5.50Hz,1H),7.63(t,J＝5.75Hz,1H),7.07(d,J＝8.93Hz,2H),4.01(m,4H)，3.87(s,2H)，3.20–3.68(m,18H),2.15(t,J＝7.27Hz，2H),2.05(t,J＝7.34Hz,2H)，1.70(m,2H),1.48(m，6H),1.38(s,9H),1.25(m,24H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000731
2.10(2)的掺入
2.10.1 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸的合成
Figure BDA0003196566540000741
2.10.2 14-[4-[4-[[5-[(3-甲氧基-3-氧代-丙基)氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]苯基]十四烷酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003196566540000742
将5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-甲酸(1.0g，764μmol)、TSTU(241mg，803μmol)和DIPEA(494mg，3.82mmol)在10ml的THF中的溶液在室温下搅拌16h。添加另外的TSTU(80mg，267μmol)并且在室温下继续搅拌2h。添加3-氨基丙酸甲酯盐酸盐(117mg，841μmol)并且在室温下继续搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除，将所得的残余物溶解于CH2Cl2中并且用10％KHSO4水溶液洗涤。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将粗产物通过RP制备型HPLC纯化以得到14-[4-[4-[[5-[(3-甲氧基-3-氧代-丙基)氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]苯基]十四烷酸酯(235mg，42％)。
1H NMR(400.23MHz,DMSO-d6)δppm 12.11(br s,1H)，8.84(s,2H)，8.66(t,J＝5.44Hz,1H),7.98(d,J＝8.93Hz,2H)，7.26(d，J＝8.44Hz,2H),7.04(m,4H),3.60(s，3H),3.46(m,2H),2.57(m,4H)，2.15(t，J＝7.27Hz，2H)，1.56(m，2H),1.46(m，2H)，1.38(s，9H)，1.29(m,18H)。
2.10.3 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸的合成
Figure BDA0003196566540000751
将14-[4-[4-[[5-[(3-甲氧基-3-氧代-丙基)氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]苯基]十四烷酸酯(235mg，318μmol)、LiOH(38mg，1.59mmol)、THF(5ml)和H2O(5ml)的混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物用HCl(2.0M)酸化至大约pH＝1.0并且用CH2Cl2萃取。将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩以得到呈白色固体的3-[[5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]丙酸(207mg，89％产率)，将其不经进一步纯化而用于下一反应。
将3-[[5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]丙酸(207mg，285μmol)、TSTU(90mg，300μmol)和DIPEA(150μl，110mg，850μmol)在6ml的THF中的混合物在室温下搅拌1h。在1h后，将溶剂在减压下去除并且添加2-[2-[2-[[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(97mg，314μmol)和DIPEA(150μl，110mg，850μmol)在6ml无水EtOH中的溶液并且将混合物在室温下搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除，将所得的残余物溶解于CH2Cl2中并且用10％KHSO4水溶液洗涤。将有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩。将粗产物通过RPHPLC纯化以得到2-[2-[2-[[2-[2-[2-[3-[[5-[[4-[4-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(163mg，56％)。
1H NMR(400.23MHz,DMSO-d6)δppm 12.11(br s，2H)，8.84(s,2H),8.61(t,J＝5.62Hz，1H)，7.97(m,3H)，7.62(t，J＝5.56Hz，1H)，7.26(d，J＝8.44Hz,2H),7.04(m,4H)，4.01(s，2H),3.86(s,2H)，3.20–3.60(m,18H)，2.58(m,2H),2.34(t,J＝7.03Hz,2H),2.15(t,J＝7.27Hz，2H),1.56(m,2H),1.46(m,2H),1.38(s,9H),1.29(m,18H)。
2.11脱保护
14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]-2-吡啶基]氨磺酰基]苯氧基]-2-氟-苯基]十四烷酸的合成
Figure BDA0003196566540000761
将2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[6-[[4-[3-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]吡啶-3-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸(20mg，21μmol)溶解于DCM(3.0ml)中并且在室温下添加TFA(0.5ml)。在室温下继续搅拌16h。将挥发性组分在减压下去除并且将所得的残余物溶解于DCM中并且重新蒸发两次。将粗产物通过RP制备型HPLC纯化。获得呈无色固体的标题化合物1914-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]-2-吡啶基]氨磺酰基]苯氧基]-2-氟-苯基]十四烷酸(19mg，21μmol，定量)。
1H NMR(400.23MHz,DMSO-d6)δppm 12.19(br s,1H),8.51(m,2H),8.09(dd,J＝8.93,2.32Hz，1H),7.89(d,J＝8.93Hz,2H),7.61(br t,J＝5.56Hz，1H),7.20(t,J＝8.93Hz,1H),7.15(d,J＝8.19Hz,1H),7.03(m,4H),4.01(s,2H),3.86(s,2H),3.20–3.68(m,16H),2.58(br t,J＝7.52Hz,2H),2.17(t,J＝7.34Hz,2H),1.49(m,4H),1.25(m,18H)。
相应地合成了以下化合物：
Figure BDA0003196566540000771
Figure BDA0003196566540000781
Figure BDA0003196566540000791
Figure BDA0003196566540000801
Figure BDA0003196566540000811
Figure BDA0003196566540000821
Figure BDA0003196566540000831
Figure BDA0003196566540000841
Figure BDA0003196566540000851
Figure BDA0003196566540000861
3.胰岛素和缀合物合成
3.1人胰岛素
人胰岛素的A和B链的氨基酸序列是：
A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:5)
B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:6)
Cys(A6)与Cys(A11)之间存在一个链内二硫桥，Cys(A7)与Cys(B7)之间和Cys(A20)与Cys(B19)之间存在两个链间二硫桥。
3.2胰岛素类似物1
胰岛素类似物1是基于具有位置A14、B16、B25中的突变和位置B30处的氨基酸的去除的人胰岛素：
Glu(A14)：人胰岛素的A链的位置14处的氨基酸(Y，酪氨酸，Tyr)被谷氨酸(E，Glu)取代，
His(B16)：人胰岛素的B链的位置16处的氨基酸(Y，酪氨酸，Tyr)被组氨酸(H，His)取代，
His(B25)：人胰岛素的B链的位置25处的氨基酸(F，苯丙氨酸，Phe)被组氨酸(H，His)取代，
Des(B30)：人胰岛素的B链的位置30处的氨基酸被缺失。
胰岛素类似物1关于A和B链的完整氨基酸序列是：
A链：GIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO:7)
B链：FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPK-(SEQ ID NO:8)
一个链内二硫桥和两个链间二硫桥与人胰岛素一致。
3.3具有人胰岛素的缀合物/[16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸]Lys(B29)-胰岛素的合成
从根据3.1的人胰岛素和来自实施例2.9的2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸制备缀合物：
16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸酯的合成：
向296mg的2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸在9ml DMF中的溶液中添加92.7μl三乙胺、106mg TSTU和痕量DMAP。将溶液搅拌一小时。
添加100ml二氯甲烷并且将所得的溶液用50ml盐水洗涤三次。将有机层分离，用硫酸钠干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗产物吸收于11ml二氯甲烷和5.5ml三氟乙酸中并且在5℃下储存过夜。
将溶液浓缩。然后，将粗产物溶解于30ml二氯甲烷中三次并且蒸发。将固体材料悬浮于5ml甲基叔丁基醚中，将醚滗析。将残余物在真空中干燥并且不经进一步纯化而使用。
将480mg胰岛素的溶液悬浮于25ml水中并且然后添加0.45ml三乙胺。向澄清溶液中添加25ml MeCN并且然后添加0.9ml(在DMF中的45.89mM)16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸酯。将溶液在室温下搅拌3小时。将反应在氯化钠磷酸盐缓冲液中用waters UPLC H-class在214nm下进行分析。Waters BEH300 10cm。保留时间胰岛素：3.85min。保留时间胰岛素缀合物：6.46min。将产物用
Figure BDA0003196566540000881
avant 25通过HPLC进行分析。Kinetex 5μm C18 100A 250x21.2mm。柱体积(CV)88ml。
柱体积(CV)88ml。
溶剂A：在水中的0.5％乙酸
溶剂B：在水中的0.5乙酸/MeCN 2:8
梯度：在14CV内95％A5％B至40％A60％B
将反应在氯化钠磷酸盐缓冲液中用Waters UPLC H-class在214nm下进行分析。Waters BEH300 10cm。保留时间胰岛素缀合物：6.419min。将溶液冻干并且得到所需的产物。93mg，34％产率。质谱：6629.6g/mol。
3.4具有胰岛素类似物1的缀合物
用来自实施例2.9的结合剂分子制备根据3.2的胰岛素类似物1的缀合物：
结合剂5：16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸；
叔丁酯：
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸
结合剂8：14-[5-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]-2-氟-苯基]十四烷酸；叔丁酯：
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[5-[[4-[3-(14-叔丁氧基-14-氧代-十四基)-4-氟-苯氧基]苯基]磺酰基氨基]嘧啶-2-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸
结合剂50：16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]-2-氯-苯氧基]十六烷酸；叔丁酯：
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)-3-氯-苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸
结合剂54：16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯基]十六烷酸；和叔丁酯：
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸
3.4.1Glu(A14)His(B16)His(B25)[16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-(羧基甲基氧基)乙氧基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸]Lys(B29)Des(B30)-胰岛素的合成
如下在赖氨酸B29的ε-氨基与呈其叔丁酯形式的结合剂2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[[4-(16-叔丁氧基-16-氧代-十六氧基)苯基]磺酰基氨基]嘧啶-5-羰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酸的活化的乙酸残基之间形成酰胺键：
将400mg的胰岛素类似物1(根据实施例3.2的Glu(A14)His(B16)His(B25)Des(B30)-胰岛素)的溶液悬浮于20ml水中并且然后添加0.4ml三乙胺。向澄清溶液中添加20mlDMF并且然后添加5ml(在DMF中的17.04mM)16-[4-[[5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基甲酰基]嘧啶-2-基]氨磺酰基]苯氧基]十六烷酸叔丁酯。将溶液在室温下搅拌2小时。将反应在氯化钠磷酸盐缓冲液中用Waters UPLC H-class在214nm下进行分析。
Waters BEH300 10cm。
保留时间胰岛素：2.643min。
保留时间胰岛素缀合物：6.224min。
将产物用
Figure BDA0003196566540000902
avant 25通过HPLC纯化。
Kinetex 5μm C18 100A 250x21.2mm。柱体积(CV)88ml。
溶剂A：在水中的0.5％乙酸
溶剂B：在水中的0.5％乙酸/MeCN 4:6
梯度：在10CV内80％A 20％B至20％A 80％B
在将产物冻干后，将粉末溶解于2ml三氟乙酸中。在一小时后，将溶液用稀碳酸氢钠中和。将产物用
Figure BDA0003196566540000903
avant 25通过HPLC纯化。Kinetex 5μmC18 100A 250x21.2mm。柱体积(CV)88ml。
溶剂A：在水中的0.5％乙酸
溶剂B：在水中的0.5％乙酸/MeCN 4:6
梯度：在8CV内70％A 30％B至30％A 70％B
将反应在氯化钠磷酸盐缓冲液中用waters UPLC H-class在214nm进行分析。
Waters BEH300 10cm。
保留时间胰岛素缀合物：5.121min。
将溶液冻干并且得到所需的产物。
63mg，14％产率。
质谱：6453.9g/mol。
相应地制备了结合剂8、50和54与胰岛素类似物1的缀合物。
4.分析数据
4.1液相色谱法质谱法(LCMS)分析
Figure BDA0003196566540000901
Figure BDA0003196566540000911
4.2部分中的表1示出了分离的结合剂的LCMS分析结果。
4.2白蛋白结合分析
仪器：Waters Alliance 2795/Waters PDA 2996或配备有Waters Acquity光电二极管阵列检测器的Waters H-Class UPLC
软件：Waters Empower 3
柱：
Figure BDA0003196566540000913
HSA50x4mm；5μm粒度
Chiraltech订单号：HSA：34712
洗脱剂A：pH＝7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)
Gibco PBS pH 7.4(10x)磷酸盐缓冲盐水500ml；订单号：70011-036(500ml)
洗脱剂B：异丙醇
Fisher订单号：A461-1(1L)
梯度：
Figure BDA0003196566540000912
Figure BDA0003196566540000921
柱温：25℃
流速：1.0ml/min
检测：λ＝220nm
注射体积：20μL
样品浓度：·对于胰岛素样品，在PBS中的1mg/ml胰岛素溶液
·对于分离的结合剂样品(250μM，在800Da分子量下0.2mg/ml)，5μL的10mM DMSO储液(将DMSO蒸发并且重新溶解于200μL异丙醇/水1:1v/v中)
t0标记 在水中的硝酸钠(NaNO3)溶液，0.05mg/ml
从1mg/ml储液水溶液(Fluka订单号：74246-100ML)稀释
报告值 样品的净保留时间：样品保留时间-t0标记保留时间
i)对于根据实施例3.3和3.4的胰岛素缀合物，在配备有Waters光电二极管阵列检测器2996的Waters Alliance分离模块2695或配备有Waters Acquity光电二极管阵列检测器的Waters H-Class UPLC上进行亲和色谱法，并且ii)对于根据实施例2.11的分离的结合剂，在配备有Waters光电二极管阵列检测器2996的Waters Alliance分离模块2795上或配备有Waters Acquity光电二极管阵列检测器的Waters H-Class UPLC上进行亲和色谱法。
Waters Empower 3作为数据处理软件用于所有测量。
具有固定的人血清白蛋白的柱(50x4mm；5μm粒度)购自Chiralpak并且用于分离。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Gibco并且用作洗脱剂A，异丙醇购自Fisher并且用作洗脱剂B。
下面示出了以1.0ml/min的流量应用的梯度：
Figure BDA0003196566540000922
Figure BDA0003196566540000931
在LC运行过程中将具有固定的血清白蛋白的柱保持在25℃下，在220nm处进行UV检测，并且注射体积是20μL。
根据以下报告样品的净保留时间：
净保留时间＝样品保留时间-t0标记保留时间
表1示出了分离的结合剂的白蛋白结合结果以及来自4.1部分的LCMS数据。
如下定义表1中使用的缩写：
NRT：在具有固定的人血清白蛋白的柱上的净保留时间
LCMS：液相色谱法质谱法
MSM：质谱方法
OIM：观察到的离子质量
OIT：观察到的离子类型
IM：电离方法
LCRT：液相色谱法保留时间
LCM：液相色谱方法
Figure BDA0003196566540000941
Figure BDA0003196566540000951
Figure BDA0003196566540000961
Figure BDA0003196566540000971
Figure BDA0003196566540000981
Figure BDA0003196566540000991
Figure BDA0003196566540001001
Figure BDA0003196566540001011
Figure BDA0003196566540001021
Figure BDA0003196566540001031
Figure BDA0003196566540001041
Figure BDA0003196566540001051
Figure BDA0003196566540001061
Figure BDA0003196566540001071
Figure BDA0003196566540001081
5胰岛素受体结合亲和力
如Hartmann等(Effect of the long-acting insulin analogues glargine anddegludec on cardiomyocyte cell signaling and function.CardiovascDiabetol.2016；15:96)所述确定表2中所列的胰岛素、胰岛素类似物1和相应缀合物的胰岛素受体结合亲和力。如前所述(Sommerfeld等,PLoS One.2010；5(3):e9540)进行了嵌入胰岛素受体的质膜(M-IR)的分离和竞争结合实验。简言之，收集过表达IR的CHO细胞并且将其重新悬浮于冰冷的2.25STM缓冲液(2.25M蔗糖，5mM Tris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)中并且使用Dounce均质器破坏然后进行超声处理。将匀浆用0.8STM缓冲液(0.8M蔗糖，5mM Tris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)覆盖并且在100,000g下超速离心90min。收集界面处的质膜并且将其用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将最终的沉淀重新悬浮于稀释缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，完全蛋白酶抑制剂)中并且用Dounce均质器再次均质化。在96孔微孔板中的结合缓冲液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.1％BSA，完全蛋白酶抑制剂，调节至pH 7.8)中进行竞争结合实验。在每个孔中，将2μg分离的膜与0.25mg麦胚凝集素聚乙烯基甲苯聚乙烯亚胺临近闪烁测定(SPA)珠一起孵育。在室温(23℃)下在12h内添加恒定浓度的[125I]标记的人胰岛素(100pM)和各种浓度的相应未标记的胰岛素(0.001-1000nM)。在微孔板闪烁计数器(Wallac Microbeta，德国弗莱堡)中在平衡下测量放射性。
表2中所描绘的类似物相对于人胰岛素的胰岛素受体结合亲和力包括以下范围：A(≥40％)；B(<20％)。缀合物人胰岛素+5号结合剂属于A类，而所有其他的缀合物和胰岛素类似物1分类在B类下。
表2
相对于人胰岛素的胰岛素受体B结合亲和力
结合剂编号 骨架 体外胰岛素受体B活化
5 人胰岛素 A
5 胰岛素类似物1 B
8 胰岛素类似物1 B
50 胰岛素类似物1 B
54 胰岛素类似物1 B
--- 胰岛素类似物1 B
6.体内测试-药代动力学作用的评价
使用健康的血糖正常的哥廷根小型猪(年龄8-11个月，体重约12-18kg)来评价非常长效的胰岛素类似物在动物中的药效学和药代动力学作用。将猪饲养在标准的动物屋舍条件下，并且每天喂食一次，随意饮用自来水。在禁食过夜后，将猪用单次皮下注射含有安慰剂配制品、胰岛素或胰岛素类似物或相应缀合物的溶液进行处理。测试了纯人胰岛素和纯胰岛素类似物1以及5号结合剂与人胰岛素的缀合物和结合剂5、50和54与胰岛素类似物1的缀合物。
经由预先植入的中心静脉导管进行血液采集，以用于确定K-EDTA血浆的血糖、药代动力学和另外的生物标记物。在测试物品施用之前开始采血(基线)，并且每天重复1-4次，直到研究结束。在研究过程中，在当天最后一次采血后喂食动物。定期处理所有动物，并且在处理当天至少记录两次临床体征，并且在研究的剩余持续时间内每天记录一次。仔细监测动物的低血糖症的任何临床体征，包括行为、皮毛、尿液和粪便排泄、体孔状况和任何疾病体征。在严重低血糖症的情况下，允许研究人员提供食物，或者如果无法摄入食物，则静脉内(i.v.)输注葡萄糖溶液。在最后一次采血后，将动物运回非GLP动物饲养设施。
为了确定药代动力学参数，使用以下实验条件。
6.1材料与化学品
MeCN(hyperSolv chromanorm)、二甲基亚砜(uvasol)、2-丙醇、甲醇(hyperSolvchromanorm)、水(hyperSolv chromanorm)、甲酸(98％-100％)购自Merck(德国达姆施塔特)。分析物和合适的内参获自Sanofi。空白血浆(K2-EDTA作为抗凝剂)获自Seralab(英国西萨塞克斯)。
6.2测试化合物和内标的储液和工作溶液
以1mg/ml的浓度在MeCN/水/甲酸(50:50:1，v/v/v)中制备测试化合物及其内标的储液。分别以100μg/ml和1250ng/ml的浓度在相同的溶剂中制备测试化合物和相应的内标的工作溶液。
6.3血浆样品制备
将25μl份的血浆与10μl的内标工作溶液(1250ng/ml)加入1.5ml Eppendorf管中。在密封并且混合后，添加75μl的MeCN/甲醇(80:20，v/v)并且将样品涡旋5s并且在大约5℃和3000g下涡旋10min。然后，将75μl的上清液转移到含有75μl的水的自动进样瓶中。将小瓶密封，混合并且进行分析。
6.4LC-MS/MS分析
在Agilent 1290系列HPLC(德国瓦尔德布龙)结合ABSciex QqQ API 4000质谱仪(德国达姆施塔特)上进行完整胰岛素的LC-MS/MS分析。LC配备有在40℃下运行的AerisPEPTIDE XB-C18分析柱(100x2.1mm，粒度3.6μm，Phenomenex)。流动相A包括水/甲酸/DMSO(100:0.1:1，v/v/v)，并且流动相B包括MeCN/甲酸/DMSO(100:0.1:1，v/v/v)。通过将2％B的初始条件保持0.5min开始HPLC程序，然后应用在7.5分钟内2％B至90％B的梯度，并且将柱重新平衡2分钟。流速为600μl/min并且将40μl的体积注射到系统中。质谱仪在5500V的离子喷雾电压下以正离子模式运行，并且优化了去簇电压以有效分离5倍质子化的分子。质谱仪以正离子模式运行，并且优化了MS化合物的特定参数以获得最佳灵敏性。将氮气用作碰撞气体。
药代动力学(PK)参数半衰期(t1/2)和平均滞留时间(MRT)示于表3中。
对于人胰岛素，给出了在慢性糖尿病尤卡坦小型猪中获得的文献MRT值(Lin,S.；Chen,L.-L.H.；Chien,Y.W.The journal of pharmacology and experimentaltherapeutics,1998,286，959-966)。根据Tozer和Rowland的教科书ClinicalPharmacokinetics Concepts and applications，第3版(出版商Li ppincott Williams&Wilkins)，1995-第II-6节已经使用公式t1/2*1.44将所列的t1/2计算为近似值。
正如可以看出的，胰岛素衍生物(此处是人胰岛素或胰岛素类似物1)与本发明的结合剂的缀合对所得缀合物的PK(药代动力学)特性具有显著影响，导致在所有情况下t1/2和MRT增加。
Figure BDA0003196566540001121
Figure BDA0003196566540001131
几种胰岛素和缀合物的药效学作用示于图1和2中，即描绘了在皮下施用后对血糖的影响。数据证明，分别相对于胰岛素类似物1和人胰岛素(观察到在测试剂量下其作用持续时间低于24h)，所测试的所有胰岛素-结合剂缀合物的作用持续时间都显著延长(＞48h)。对于具有降低的胰岛素受体结合亲和力的测试胰岛素缀合物，所选择的体内剂量高于相应的亲本胰岛素的剂量，所述亲本胰岛素未在更高剂量下进行测试以避免低血糖效应。
附图说明
图1示出了在(哥廷根)小型猪(12-18kg，n＝3)中皮下应用胰岛素类似物1分别与50号结合剂和54号结合剂的缀合物后的降血糖作用。以(18nmol/kg)的剂量测试了两种化合物。
图2示出了在(哥廷根)小型猪(19-20kg，n＝3)中分别皮下应用胰岛素和胰岛素缀合物后的降血糖作用：人胰岛素+5号结合剂(18nmol/kg)、人胰岛素(3nmol/kg)、胰岛素类似物1+5号结合剂(18nmol/kg)、胰岛素类似物1(3nmol/kg)。
引用文献
-S.；Chen,L.-L.H.；Chien,Y.W.The journal of pharmacology andexperimental therapeutics,1998，286,959-966.
-Clinical Pharmacokinetics Concepts and applications by Tozer andRowland,第3版(Publisher Lippincott Williams&Wilkins),1995-Section II-6).
-Hartmann等,Effect of the long-acting insulin analogues glargine anddegludec on cardiomyocyte cell signaling and function,CardiovascDiabetol.2016；15:96.
-Sommerfeld等,PLoS One.2010；5(3):e9540.
-Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use byStahl and Wermuth(Wiley-VCH，2002).
序列表
<110> 赛诺菲(Sanofi)
<120> 肽结合剂
<130> DE2018/058
<150> EP 18 306 657.0
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 658.8
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 659.6
<151> 2018-12-11
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利西拉肽
<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 艾塞那肽
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 索马鲁肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aib
<400> 3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 度拉鲁肽
<400> 4
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人胰岛素, A链
<400> 5
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人胰岛素, B链
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物1 , A链
<400> 7
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物1 , B链
<400> 8
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25

Claims (14)

1.一种式(A)的磺酰胺
Figure FDA0003196566530000011
其中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
Rx表示氢原子或活化基团。
2.根据权利要求1所述的磺酰胺，其具有式(A-1)
Figure FDA0003196566530000012
其中：
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
R1表示选自氢原子和卤素原子的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
Rx表示氢原子或活化基团；并且
其中如果p是零，则m是从5至15范围内的整数，或者如果p是1，则m是从7至15范围内的整数。
3.根据权利要求1或2所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-1)
Figure FDA0003196566530000021
其中X是氮原子或-CH-基团；m是从7至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1；Hal是选自氟、氯、溴和碘原子的卤素原子；Rx表示氢原子或活化基团；并且HOOC-(CH2)m-C6H3Hal-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-1a)
Figure FDA0003196566530000022
5.根据权利要求1或2所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-2)
Figure FDA0003196566530000023
其中X是氮原子或-CH-基团；m是从5至15范围内的整数；r是从1至6范围内的整数；q是零或1；并且HOOC-(CH2)m-O-基团位于苯环Ph上相对于-S(O)2-基团的间位或对位。
6.根据权利要求1至2或5中任一项所述的磺酰胺，其中所述磺酰胺具有式(A-1-2a)
Figure FDA0003196566530000031
或
式(A-1-2b)
Figure FDA0003196566530000032
或
式(A-1-2c)
Figure FDA0003196566530000033
7.一种缀合物，其包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分
Figure FDA0003196566530000034
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述药物活性剂的氨基共价结合。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述活性药物成分选自胰岛素、胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类似物。
9.根据权利要求7或8所述的缀合物，其中所述活性药物成分是胰岛素或胰岛素类似物，其中所述肽的与式(I)的磺酰胺共价结合的氨基是所述胰岛素或胰岛素类似物中存在的赖氨酸的ε氨基或者是所述胰岛素或胰岛素类似物的B链的N末端氨基。
10.一种用于制备包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物的方法
Figure FDA0003196566530000041
其中在式(I)的磺酰胺中：
A选自氧原子、-CH2CH2-基团、-OCH2-基团和-CH2O-基团；
E表示-C6H3R-基团，其中R是氢原子或卤素原子，其中所述卤素原子选自氟、氯、溴和碘原子；
X表示氮原子或-CH-基团；
m是从5至17范围内的整数；
n是零或从1至3范围内的整数；
p是零或1；
q是零或1；
r是从1至6范围内的整数；
s是零或1；
t是零或1；
R1表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
R2表示选自氢原子、卤素原子、C1至C3烷基和卤化的C1至C3烷基的至少一个残基；
其中式(I)的磺酰胺与所述活性药物成分共价结合，其中式(I)的磺酰胺的末端羧基“a”与所述活性药物成分的氨基共价结合；
所述方法包括：
提供式(Aa)的磺酰胺
Figure FDA0003196566530000051
其中X、Y、A、E、R1、R2和指示符号m、n、p、q、r、s、t具有如权利要求1中所定义的含义，Rx是氢原子或活化基团；并且R3是保护基团或氢原子；和具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分；
使式(Aa)的磺酰胺与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分在适于形成在式(Aa)的磺酰胺的游离或活化的羧基“a”与具有受保护的或未受保护的C末端的活性药物成分的氨基之间的酰胺键的条件下反应；
任选地去除一个或两个保护基团。
11.一种从根据权利要求10所述的方法获得或可获得的缀合物，其包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分。
12.一种药物组合物，其包含药学有效量的根据权利要求7至9中任一项所述的或根据权利要求11所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物。
13.根据权利要求7至9中任一项所述的或根据权利要求11所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作药剂。
14.根据权利要求7至9中任一项所述的或根据权利要求11所述的包含式(I)的磺酰胺和活性药物成分的缀合物，其用作用于治疗选自妊娠期糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症的疾病和/或用于降低血糖水平的药剂。
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