CN113444730A - 一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了基因转导干细胞筛选构建方法技术领域的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列为基础，利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，基于人体肝细胞采用多态分型的DNA片段转导，且先后采用hTERT和pLXSN双重载体进行载体转导，达到高效表达hTERT的pLXSN‑hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达klotho基因的干细胞的效果，在低溶度潮霉素双重筛选培养体系中，提高转导外源klotho基因的骨髓间充质干细胞的存活能力。
Description
技术领域
本发明涉及基因转导干细胞筛选构建方法技术领域，具体为一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法。
背景技术
原发性肝细胞性肝癌(简称肝癌，HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒是一种嗜肝DNA病毒，可引起各种急慢性肝炎、肝硬化等疾病，并与肝细胞癌的发生有非常密切的关系；另外，Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13q12，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成，Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，近年来，越来越多的研究发现klotho基因可以调节IGF、Wnt、TGF-βl、FGF等信号通路，参与氧化应激过程，并且与机体的免疫缺陷有关，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似抑癌基因的重要作用，因此可以利用klotho来作为肿瘤发生、分级的标志物以及作为靶点用于抗肿瘤的治疗。
目前已有的干细胞体外扩增技术方法大致可归为两类：第一类方法是在培养体系中外加不同组合的重组细胞生长因子，目的是利用细胞生长因子对干细胞增殖和分化进行适当的调控，这类技术方法能在一定程度上提高干细胞的扩增倍数，但如果组合中的细胞因子种类太少，就难以达到理想的扩增效果，而太多的话则会因为费用昂贵而难以在临床移植中应用；第二类是近几年来发展起来的方法，即用骨髓基质干细胞来模拟体内细胞生长和分化的环境，以促进其快速扩增和功能的激活，但在该方法中，由于骨髓基质干细胞中某些细胞因子(如TPO和FL)表达甚微，所以在扩增培养体系中仍需添加外源的细胞因子予以辅助，结合klotho基因在治疗肿瘤方面上的应用，将klotho基因整合人靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型，从而使干细胞获得无限增殖的能力，使之永生，使细胞永生化最常用的技术就是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体，通过各种方法来转染细胞来支持干细胞的体外扩增能力，为此，我们提出一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，转导干细胞方法的具体步骤为：
S1：以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，然后通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列，且DNA序列包含rs648202单核苷酸，然后对PCR扩增后的产物经限制性内切酶HaeIII进行酶切，同时通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型形成不同长度的DNA片段；
S2：从人体肝细胞中分离出mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，将多态分型的DNA片段与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-klotho片段后再克隆到pBluescript载体中，构建成IRES-klotho重组片段，然后，IRES-klotho重组片段再从pBluescript载体通过XhoI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；
S3：依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒的指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在二甲基二氮十一亚甲基聚甲溴化物的辅助下基于pLXSN载体对人体干细胞进行八个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导，由此可以构建高效表达外源hTERT基因的人体干细胞；
S4：采用低浓度的潮霉素进行双重筛选转导外源hTERT基因的人体干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的干细胞的存活能力。
S1步骤中核苷酸多肽分型具体为：CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp，CT基因型酶切后产生163bp、100bp和63bp三种长度的DNA片段，同时TT基因型酶切后产生100bp和63bp两种长度的DNA片段。
S2步骤中所用的pBluescript载体，人反转录病毒载体是采用pLXIN，能够获得高效表达klotho基因的pfl30表达载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列为基础，利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，通过检测T等位基因的有无判断个体是否对原发性肝细胞肝癌具有易感性，有利于原发性肝细胞肝癌易感人群的筛查和原发性肝细胞肝癌的预防，另外基于人体肝细胞采用多态分型的DNA片段转导，达到了一次性基因转导而获得干细胞同时高效表达外源性klotho基因和人体肝细胞的效果，降低了干细胞体外扩增培养的成本，有效提高了干细胞的体外自我更新、扩增和分化能力，且先后采用hTERT和pLXSN双重载体进行载体转导，达到高效表达hTERT的pLXSN-hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达klotho基因的干细胞的效果，在低溶度潮霉素双重筛选培养体系中，提高转导外源klotho基因的骨髓间充质干细胞的存活能力，提高了构建外源性表达klotho基因的干细胞的成功率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，转导干细胞方法的具体步骤为：
S1：以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，然后通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列，且DNA序列包含rs648202单核苷酸，然后对PCR扩增后的产物经限制性内切酶HaeIII进行酶切，同时通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型形成不同长度的DNA片段；
S2：从人体肝细胞中分离出mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，将多态分型的DNA片段与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-klotho片段后再克隆到pBluescript载体中，构建成IRES-klotho重组片段，然后，IRES-klotho重组片段再从pBluescript载体通过XhoI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；
S3：依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒的指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在二甲基二氮十一亚甲基聚甲溴化物的辅助下基于pLXSN载体对人体干细胞进行八个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导，由此可以构建高效表达外源hTERT基因的人体干细胞；
S4：采用低浓度的潮霉素进行双重筛选转导外源hTERT基因的人体干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的干细胞的存活能力；
S1步骤中核苷酸多肽分型具体为：CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp，CT基因型酶切后产生163bp、100bp和63bp三种长度的DNA片段，同时TT基因型酶切后产生100bp和63bp两种长度的DNA片段；
S2步骤中所用的pBluescript载体，人反转录病毒载体是采用pLXIN，能够获得高效表达klotho基因的pfl30表达载体；
应用：原发性肝细胞相关的多态性位点的核酸序列，可构建对原发性肝细胞易感人群进行遗传筛选的试剂盒，将其作为药物设计的靶点，找出具有调节klotho基因表达的活性分子，从而促进新的抗肿瘤药物的发现，含有klotho基因的人体DNA片段通过载体进行重组，基于重组载体进行人体干细胞转导，促使klotho基因参与恶性增殖、凋亡、侵袭与转移等细胞活动相关的病理过程，因此本发明对今后深入探讨klotho与其他疾病的关系提供了经验和应用基础。
本发明采用通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列为基础，利用rs648202的T等位位点作为药物设计靶点进行药物的筛选，筛选出能够调节klotho基因表达水平的活性分子，通过检测T等位基因的有无判断个体是否对原发性肝细胞肝癌具有易感性，有利于原发性肝细胞肝癌易感人群的筛查和原发性肝细胞肝癌的预防，另外基于人体肝细胞采用多态分型的DNA片段转导，达到了一次性基因转导而获得干细胞同时高效表达外源性klotho基因和人体肝细胞的效果，降低了干细胞体外扩增培养的成本，有效提高了干细胞的体外自我更新、扩增和分化能力，且先后采用hTERT和pLXSN双重载体进行载体转导，达到高效表达hTERT的pLXSN-hTERT表达载体转导，达到了构建高效表达klotho基因的干细胞的效果，在低溶度潮霉素双重筛选培养体系中，提高转导外源klotho基因的骨髓间充质干细胞的存活能力，提高了构建外源性表达klotho基因的干细胞的成功率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：转导干细胞方法的具体步骤为：
S1：以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，然后通过PCR扩增得到klotho基因外显子4区的多态DNA序列，且DNA序列包含rs648202单核苷酸，然后对PCR扩增后的产物经限制性内切酶HaeIII进行酶切，同时通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型形成不同长度的DNA片段；
S2：从人体肝细胞中分离出mRNA，并通过反转录-聚合酶链反应技术合成相应的cDNA，将多态分型的DNA片段与内核糖体进入位点(IRES)序列连接形成IRES-klotho片段后再克隆到pBluescript载体中，构建成IRES-klotho重组片段，然后，IRES-klotho重组片段再从pBluescript载体通过XhoI酶切位点转移到反转录病毒载体pLXIN上，构建成pfl30表达载体；
S3：依据LipofectAMINE脂质体转导试剂盒的指导说明书，通过兼噬性包装细胞系PA317制备pLXSN-hTERT重组表达载体悬浮液后，在二甲基二氮十一亚甲基聚甲溴化物的辅助下基于pLXSN载体对人体干细胞进行八个小时的pLXSN-hTERT表达载体转导，由此可以构建高效表达外源hTERT基因的人体干细胞；
S4：采用低浓度的潮霉素进行双重筛选转导外源hTERT基因的人体干细胞的技术，提高转导外源hTERT基因的干细胞的存活能力。
2.根据权利要求1所述的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：S1步骤中核苷酸多肽分型具体为：CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp，CT基因型酶切后产生163bp、100bp和63bp三种长度的DNA片段，同时TT基因型酶切后产生100bp和63bp两种长度的DNA片段。
3.根据权利要求1所述的一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法，其特征在于：S2步骤中所用的pBluescript载体，人反转录病毒载体是采用pLXIN，能够获得高效表达klotho基因的pfl30表达载体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112921009A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-06-08 | 昆明市延安医院 | 一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用 |
Citations (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0126436D0 (en) * | 2001-11-03 | 2002-01-02 | Sequenom Inc | Detection of predispostion to osteoporosis |
| WO2004065561A2 (en) * | 2003-01-21 | 2004-08-05 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same |
| CN1706955A (zh) * | 2004-06-07 | 2005-12-14 | 成都康弘科技实业（集团）有限公司 | 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用 |
| US20060067890A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-03-30 | Oncolys Biopharma Inc. | Telomelysin/GFP-expressing recombinant virus |
| CN1818071A (zh) * | 2005-07-04 | 2006-08-16 | 浙江大学 | Tpo/fl基因转导骨髓间充质干细胞的方法 |
| CN101063150A (zh) * | 2007-04-24 | 2007-10-31 | 浙江大学 | 人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法 |
| CN101330830A (zh) * | 2005-10-18 | 2008-12-24 | 国家犹太医学研究中心 | 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法 |
| CN101353646A (zh) * | 2008-03-13 | 2009-01-28 | 首都医科大学北京神经科学研究所 | 端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法 |
| WO2009046738A1 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Curevac Gmbh | Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc) |
| CN101438158A (zh) * | 2006-03-06 | 2009-05-20 | 阿穆尼克斯股份有限公司 | 遗传包和其应用 |
| CN101974488A (zh) * | 2010-06-21 | 2011-02-16 | 西北农林科技大学 | 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法 |
| CN102796820A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-11-28 | 黄曙 | 一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用 |
| CN103923942A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-07-16 | 扬州大学 | 一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用 |
| CN103952443A (zh) * | 2013-05-20 | 2014-07-30 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗 |
| CA2855402A1 (en) * | 2014-08-14 | 2016-02-14 | Ming Jian | The formulation (formula or the prescription of ingredients) of an age defying product, which is for anti-ageing/reverse of age and correcting age associated diseases through reactiving telomere enzyme |
| CN106659686A (zh) * | 2014-04-04 | 2017-05-10 | 拉姆医疗公司 | 用于治疗年龄相关病况的可吸入雷帕霉素制剂 |
| CN106662577A (zh) * | 2014-01-24 | 2017-05-10 | 恩格姆生物制药公司 | 结合蛋白及其使用方法 |
| CN107249576A (zh) * | 2014-10-07 | 2017-10-13 | 拉姆医疗公司 | 用于治疗肺高压的可吸入雷帕霉素制剂 |
| CN107557461A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-01-09 | 武汉赛云博生物科技有限公司 | 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法 |
| EP3305900A1 (en) * | 2005-12-01 | 2018-04-11 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries |
| CN108290941A (zh) * | 2015-09-23 | 2018-07-17 | 百时美施贵宝公司 | 快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白iii型结构域 |
| CN109030835A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-18 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法 |
| CN109097336A (zh) * | 2018-09-07 | 2018-12-28 | 深圳市新仑生物科技有限公司 | 一种干细胞外泌体、制备方法及应用 |
| CN109100514A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-28 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法 |
| CN109219663A (zh) * | 2016-06-02 | 2019-01-15 | 克洛索治疗有限公司 | 治疗性重组klotho蛋白及其组合物和方法 |
| CN109251896A (zh) * | 2018-08-13 | 2019-01-22 | 中山大学 | 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用 |
| US20190203212A1 (en) * | 2012-07-25 | 2019-07-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| US20190345224A1 (en) * | 2016-05-20 | 2019-11-14 | President And Fellows Of Harvard College | Gene Therapy Methods for Age-Related Diseases and Conditions |
| CN110499331A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法 |
| CN112695049A (zh) * | 2020-08-20 | 2021-04-23 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 修饰间充质干细胞的融合基因、质粒、修饰得到干细胞及制备方法 |
| CN113151442A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-23 | 苏州市立医院 | 55个常染色体基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用 |
-
2021
- 2021-03-17 CN CN202110288118.9A patent/CN113444730A/zh active Pending
Patent Citations (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0126436D0 (en) * | 2001-11-03 | 2002-01-02 | Sequenom Inc | Detection of predispostion to osteoporosis |
| EP2500437A2 (en) * | 2003-01-21 | 2012-09-19 | PTC Therapeutics, Inc. | Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same |
| WO2004065561A2 (en) * | 2003-01-21 | 2004-08-05 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods for identifying compounds that modulate untranslated region-dependent gene expression and methods of using same |
| CN1706955A (zh) * | 2004-06-07 | 2005-12-14 | 成都康弘科技实业（集团）有限公司 | 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用 |
| US20060067890A1 (en) * | 2004-09-29 | 2006-03-30 | Oncolys Biopharma Inc. | Telomelysin/GFP-expressing recombinant virus |
| CN1818071A (zh) * | 2005-07-04 | 2006-08-16 | 浙江大学 | Tpo/fl基因转导骨髓间充质干细胞的方法 |
| CN101330830A (zh) * | 2005-10-18 | 2008-12-24 | 国家犹太医学研究中心 | 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法 |
| EP3305900A1 (en) * | 2005-12-01 | 2018-04-11 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries |
| CN101438158A (zh) * | 2006-03-06 | 2009-05-20 | 阿穆尼克斯股份有限公司 | 遗传包和其应用 |
| CN101063150A (zh) * | 2007-04-24 | 2007-10-31 | 浙江大学 | 人端粒酶基因转导骨髓间充质干细胞的方法 |
| WO2009046738A1 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-16 | Curevac Gmbh | Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc) |
| CN101353646A (zh) * | 2008-03-13 | 2009-01-28 | 首都医科大学北京神经科学研究所 | 端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法 |
| CN101974488A (zh) * | 2010-06-21 | 2011-02-16 | 西北农林科技大学 | 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法 |
| US20190203212A1 (en) * | 2012-07-25 | 2019-07-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| CN102796820A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-11-28 | 黄曙 | 一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用 |
| CN103952443A (zh) * | 2013-05-20 | 2014-07-30 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗 |
| CN106662577A (zh) * | 2014-01-24 | 2017-05-10 | 恩格姆生物制药公司 | 结合蛋白及其使用方法 |
| CN106659686A (zh) * | 2014-04-04 | 2017-05-10 | 拉姆医疗公司 | 用于治疗年龄相关病况的可吸入雷帕霉素制剂 |
| CN103923942A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-07-16 | 扬州大学 | 一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用 |
| CA2855402A1 (en) * | 2014-08-14 | 2016-02-14 | Ming Jian | The formulation (formula or the prescription of ingredients) of an age defying product, which is for anti-ageing/reverse of age and correcting age associated diseases through reactiving telomere enzyme |
| CN107249576A (zh) * | 2014-10-07 | 2017-10-13 | 拉姆医疗公司 | 用于治疗肺高压的可吸入雷帕霉素制剂 |
| CN108290941A (zh) * | 2015-09-23 | 2018-07-17 | 百时美施贵宝公司 | 快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白iii型结构域 |
| US20190345224A1 (en) * | 2016-05-20 | 2019-11-14 | President And Fellows Of Harvard College | Gene Therapy Methods for Age-Related Diseases and Conditions |
| CN109219663A (zh) * | 2016-06-02 | 2019-01-15 | 克洛索治疗有限公司 | 治疗性重组klotho蛋白及其组合物和方法 |
| CN107557461A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-01-09 | 武汉赛云博生物科技有限公司 | 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法 |
| CN109251896A (zh) * | 2018-08-13 | 2019-01-22 | 中山大学 | 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用 |
| CN109030835A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-18 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法 |
| CN109100514A (zh) * | 2018-09-06 | 2018-12-28 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种分析非小细胞肺癌中Klotho相互作用蛋白的研究方法 |
| CN109097336A (zh) * | 2018-09-07 | 2018-12-28 | 深圳市新仑生物科技有限公司 | 一种干细胞外泌体、制备方法及应用 |
| CN110499331A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法 |
| CN112695049A (zh) * | 2020-08-20 | 2021-04-23 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 修饰间充质干细胞的融合基因、质粒、修饰得到干细胞及制备方法 |
| CN113151442A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-23 | 苏州市立医院 | 55个常染色体基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| JINYONG KIM 等: "Short hairpin RNA screen indicates that Klotho beta/FGF19 protein overcomes stasis in human colonic epithelial cells", 《J BIOL CHEM》 * |
| 乔梦楠: "间质细胞衰老诱导上皮细胞癌变的研究进展", 《人人健康》 * |
| 张军 等: "Klotho蛋白对高糖作用下人脐静脉血管内皮细胞凋亡和衰老的作用", 《广东医学》 * |
| 张艳芳 等: "Klotho基因对子宫颈鳞癌细胞恶性生物学行为的影响及相关机制", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 * |
| 李桂霞等: "抗衰老及抗肿瘤中药对端粒、端粒酶影响的研究进展", 《辽宁中医杂志》 * |
| 李秀全 等: "Klotho对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响", 《解剖学报》 * |
| 童坦君等: "衰老相关基因研究进展", 《现代实用医学》 * |
| 黄炜 等: "人骨髓间充质干细胞的衰老机制及其"永生化"技术", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112921009A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-06-08 | 昆明市延安医院 | 一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用 |
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