CN113463203B - 一种实现多重rna原位检测的原位测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法，利用特殊设计的核酸探针技术构建了原位测序文库，利用原位测序技术和荧光显微成像技术实现了高度多重的RNA原位检测；将完整标签序列放置于识别探针对的两条链上，与放置于整个标签放置于一端相比，缩短了测序位置与连接位置的平均距离，提高了信号强度和特异性。
Description
技术领域
本发明属于RNA原位表达分析技术领域，具体涉及一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法。
背景技术
空间转录组学是近年来新兴的基因表达分析技术，其是指一系列能够在空间上实现对基因进行定位和定量的分析的技术。目前的空间转录组学方法主要分为基于显微成像的方法以及基于测序的方法两大类。前者有原位测序技术、基于单分子荧光原位杂交的编码技术，后者则是一系列基于微阵列的引物编码寻址方法。
原位测序技术是一种依赖于新一代测序化学技术实现对多种基因表达进行原位分析的空间转录组学技术，可以分为全转录组原位测序与靶向原位测序，后者需要利用探针构建原位测序文库。该技术主要是通过在细胞或者组织中对来自单个RNA分子的信号进行多轮的测序，从而得到一串由不同颜色荧光编码的信号来检测不同的基因。以原位测序为代表的空间转录组学技术主要包括原位测序技术、荧光原位测序技术技术(FISSEQ)以及STARmap(spatially-resolved transcript amplicon readout mapping)技术。FISSEQ则不利用探针进行靶向检测，而是采取类似下一代测序技术的方法直接将RNA在原位逆转录为cDNA后环化扩增，接着直接在细胞内进行较长片段的原位测序化学，从而得到一系列的基因序列片段来实现多重RNA原位检测。原位测序和STARmap技术都是基于锁式探针进行目标短序列的捕获或者利用带标签的锁式探针对不同基因进行编码从而实现同时检测，该技术测序由于测序长度较短(4-6nt)，因此所能同时检测的目标基因比较有限(4的N次方种标签)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法。
本发明的技术方案如下：
一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据目标RNA上的靶序列设计至少一识别探针对；每一识别探针对由一上游识别探针和一下游识别探针组成，上游识别探针含有上游标签序列，下游识别探针含有下游标签序列，上游标签序列和下游标签序列组成一完整标签序列用于解读其对应的靶序列；
(2)将上述至少一识别探针对输送入细胞内，使其与上述目标RNA上的靶序列识别并杂交，其中上游识别探针的3’端与下游识别探针的5’端相互靠近，通过DNA连接酶相连形成至少一链状DNA分子；
(3)将步骤(2)所得的至少一链状DNA分子与DNA夹板序列杂交，使该至少一链状DNA分子的5‘端和3’端靠近，再通过DNA连接酶相连形成至少一环状DNA分子；
(4)以该至少一环状DNA分子为模板进行滚环扩增，获得扩增产物，即所述原位测序文库，通过原位测序技术可以对该原位测序文库中的不同的标签进行解码，获得每一扩增产物上的完整标签序列，进而得知不同扩增产物检测的目标RNA的种类，从而获得不同目标RNA的原位表达信息，实现多重RNA原位检测。
在本发明的一个优选实施方案中，所述目标RNA包括细胞本身的RNA和外源性基因在细胞内部表达的RNA。
在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为游离的待测细胞或组织内的细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述目标RNA包括细胞本身的RNA和外源性基因在细胞内部表达的RNA，所述细胞为游离的待测细胞或组织内的细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述目标RNA包括细胞本身的RNA和外源性基因在细胞内部表达的RNA，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为游离的待测细胞或组织内的细胞，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。
在本发明的一个优选实施方案中，所述目标RNA包括细胞本身的RNA和外源性基因在细胞内部表达的RNA，所述细胞为游离的待测细胞或组织内的细胞，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。
本发明的有益效果是：
1、本发明利用特殊设计的核酸探针技术构建了原位测序文库，利用原位测序技术和荧光显微成像技术实现了高度多重的RNA原位检测。
2、本发明将完整标签序列放置于识别探针对的两条链上，与放置于整个标签放置于一端相比，缩短了测序位置与连接位置的平均距离，提高了信号强度和特异性。
3、本发明将完整标签序列放置于识别探针对的两条链上，与放置于整个标签放置于一端相比，如果探针对错配，产生的错误标签可以被排除。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验原理图。
图2为本发明实施例1中的产生的原位测序文库用原位测序解码的原理图。
图3为本发明实施例1的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1结直肠癌石蜡组织切片为实验样品原位检测30种mRNA考察构建基因表达原位分析文库方法
本实施例的实验原理如图1所示，具体步骤如下：
(一)石蜡组织预处理：
将石蜡组织切片在烘箱中于65℃下烤片30min，烤片后立即放入盛有二甲苯的染色缸中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min。从第二个盛有二甲苯的染色缸中取出载玻片，然后立即放入盛有无水乙醇的染色缸中浸泡2min，更换无水乙醇再浸泡2min。取出后将载玻片立即放入盛有95％乙醇的染色缸中浸泡2min，更换95％乙醇再浸泡2min。取出后将载玻片立即放入盛有85％乙醇的染色缸中浸泡2min，更换85％乙醇再浸泡2min。取出后将载玻片立即放入盛有70％乙醇的染色缸中浸泡2min，更换70％乙醇再浸泡2min。
从乙醇溶液中取出载玻片，浸泡于DEPC-H2O中5min，再浸泡于DEPC-PBS中2min，洗去残余的乙醇。将溶于DEPC-PBS中的4％PFA滴在载玻片上，完全覆盖组织样本，在室温下孵育10min后用DEPC-PBS洗去。将30mL的0.1M HCl置于染色缸中预热至37℃，加入0.1mg/mL胃蛋白酶30uL，混匀后立即将载玻片浸泡于其中，于37℃下孵育30min。取出载玻片后浸泡于DEPC-H2O中5min，再浸泡于DEPC-PBS中2min洗净。分别经梯度乙醇：70％、85％、100％脱水处理，各2min，于空气中晾干。最后用DEPC-PBS-Tween20洗三次后备用。
(二)原位核酸检测：
(1)双连接探针杂交：
在载玻片上滴加50μL含有终浓度为6x SSC、10％甲酰胺和0.1μM各条双连接探针的杂交混合液，37℃下孵育4h，使各识别探针对与相应基因的靶标序列充分杂交。
连接探针序列如下表所示：
(2)上述识别谈针对第一步连接：
用DEPC-PBS-Tween 20洗三次后，在样本中加入50μL含有终浓度为25％甘油、0.2μg/μL BSA、1×SplintR buffer(NEB)、0.1U/μL SplintR ligase(NEB)和1u/μL RiboLockRNA酶抑制剂(Thermo)的连接反应混合液，并于37℃下孵育30min。
(3)夹板引物杂交：
用DEPC-PBS-Tween 20洗三次后，在样本中加入50μL含有终浓度为6x SSC、10％甲酰胺和0.5μM夹板引物的杂交混合液，并于30℃下孵育30min。
上述夹板引物序列为：5’-ggctccactaaatagacgca-3’，SEQ ID NO.61。
(4)探针成环及滚环扩增：
用DEPC-PBS-Tween 20洗三次后，在样本中加入50μL含有终浓度为5％甘油、0.2μg/μL BSA、1×Phi29 polymerase buffer(Thermo)、1mM dNTPs、0.1U/μL T4 DNA ligase(Thermo)和1u/μL Phi29 DNA聚合酶(Thermo)的杂交混合液，于37℃下孵育6h或30℃下反应过夜。
(5)检测探针杂交和图像获取
将上述滚环扩增产物与一检测探针(5’-tgcgtctatttagtggagcc-3’，SEQ IDNO.62，5’端标记有Cy3)杂交，最后用DAPI进行细胞核染色，进行检测，具体的：将样本用DEPC-PBS-Tween 20洗三次后加入含有0.1μM检测探针、20％甲酰胺和2×SSC的反应混合液，37℃下孵育30min后，分别经梯度乙醇：70％、85％、100％脱水处理，各2min。空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold Antifade Mountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
(6)检测探针的洗脱
将上述拍照成像后的载玻片置入70％乙醇中孵育，洗去盖玻片和封片剂。之后在反应区加入终浓度为60％甲酰胺、0.1％Triton-X的洗脱缓冲液，在37℃下孵育10min，反复3次。最后将样本用DEPC-PBS-Tween 20洗三次。
(三)四轮原位核酸检测，具体原理如图2所示，具体如下：
(1)锚定引物杂交和荧光探针连接
在样本中加入50μL含有终浓度为0.2μM锚定引物、0.2μM各荧光探针、1×T4 DNAligase buffer、1mM ATP和0.1u/μL T4 DNA连接酶的测序反应混合液，于30℃下孵育1h。用DEPC-PBS-Tween 20洗三次后，空气晾干。最后加入含有0.5μg/mL DAPI的Gold AntifadeMountan封片剂(Fermantas)室温下孵育10min后进行荧光显微镜检测并拍照。
(2)荧光探针的洗脱
将上述拍照成像后的载玻片置入70％乙醇中孵育，洗去盖玻片和封片剂。之后在反应区加入终浓度为60％甲酰胺、0.1％Triton-X的洗脱缓冲液，在37℃下孵育10min，反复3次。最后将样本用DEPC-PBS-Tween 20洗三次。
(3)将步骤(1)和(2)再反复三次，上述锚定引物和荧光探针序列如下表所示：
| 序号 | 名称 | 序列 | 5′标记 | 3′标记 |
| SEQ ID NO.63 | Anchor primer-L | tgcgtctatttagtg | P | / |
| SEQ ID NO.64 | Anchor primer-R | ctatttagtggagcc | / | / |
| SEQ ID NO.65 | Seq-base1-A | ctatcnnan | Cy5 | / |
| SEQ ID NO.66 | Seq-base1-T | ctatcnntn | AF488 | / |
| SEQ ID NO.67 | Seq-base1-C | ctatcnncn | TXR | / |
| SEQ ID NO.68 | Seq-base1-G | ctatcnngn | Cy3 | / |
| SEQ ID NO.69 | Seq-base2-A | ctatcnnna | Cy5 | / |
| SEQ ID NO.70 | Seq-base2-T | ctatcnnnt | AF488 | / |
| SEQ ID NO.71 | Seq-base2-C | ctatcnnnc | TXR | / |
| SEQ ID NO.72 | Seq-base2-G | ctatcnnng | Cy3 | / |
| SEQ ID NO.73 | Seq-base3-A | annnctatc | P | Cy5 |
| SEQ ID NO.74 | Seq-base3-T | tnnnctatc | P | AF488 |
| SEQ ID NO.75 | Seq-base3-C | cnnnctatc | P | TXR |
| SEQ ID NO.76 | Seq-base3-G | gnnnctatc | P | Cy3 |
| SEQ ID NO.77 | Seq-base4-A | nannctatc | P | Cy5 |
| SEQ ID NO.78 | Seq-base4-T | ntnnctatc | P | AF488 |
| SEQ ID NO.79 | Seq-base4-C | ncnnctatc | P | TXR |
| SEQ ID NO.80 | Seq-base4-G | ngnnctatc | P | Cy3 |
上述序列n为a、t、c、g中的任一种。
(4)基因的解析
综合四轮测序的信号，每个信号点得到四轮的颜色顺序，对应之前设计的探针上的碱基顺序可以得知该点为何种基因的信号，如图3所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法
<160> 80
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtccaatgt ccagccttcc tatctccttg cgtctatt 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagtggagcc ctctctatcc ttagccgctc ccggagga 38
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<211> 38
<212> DNA
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<210> 4
<211> 38
<212> DNA
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<400> 4
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<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
<211> 39
<212> DNA
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<400> 6
tagtggagcc atctctatcc ttaagctaga gcttacctt 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Claims (1)
1.一种多重RNA原位检测方法，所述方法用于非诊断或非治疗目的，所述方法以结直肠癌石蜡组织切片作为实验样品、以30种目标mRNA作为RNA原位检测的对象，其特征在于：包括如下步骤：
(1)根据所述30种目标mRNA上的靶序列设计三十组识别探针对；每一组识别探针对由一上游识别探针和一下游识别探针组成，上游识别探针含有上游标签序列，下游识别探针含有下游标签序列，上游标签序列和下游标签序列组成一完整标签序列用于解读其对应的靶序列，所述识别探针对的信息如下表所示：
(2)将步骤(1)所得的三十组识别探针对输送入所述结直肠癌石蜡组织切片的细胞内，使其与目标RNA上的靶序列识别并杂交，其中上游识别探针的3’端与下游识别探针的5’端相互靠近，通过能够以RNA为模板连接DNA的DNA连接酶相连形成相应的链状DNA分子，所述能够以RNA为模板连接DNA的DNA连接酶为Splint R连接酶；
(3)将步骤(2)所得的链状DNA分子与如SEQ ID NO.61所示的DNA夹板序列杂交，使相应的链状DNA分子的5’端和3’端靠近、然后通过DNA连接酶相连形成相应的环状DNA分子；
(4)以步骤(3)所得的环状DNA分子为模板，用T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶进行滚环扩增，获得扩增产物，即为原位测序文库；
(5)通过四轮原位核酸检测对所述原位测序文库中的不同的标签进行解码，获得每一扩增产物上的完整标签序列，进而得知不同扩增产物检测的目标RNA的种类，获得不同目标RNA的原位表达信息，实现多重RNA原位检测；所述四轮原位核酸检测包括如下步骤：
a)锚定引物杂交和荧光探针连接；锚定引物和荧光探针的信息如下表所示，表中的n为a、t、c、g中的任一种：
；
b)荧光探针的洗脱；
c)将步骤a和b再反复三次；
d)基因的解析：综合四轮测序的信号，每个信号点得到四轮的颜色顺序，对应之前设计的探针上的碱基顺序得知该点为何种基因的信号。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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