CN113501878B

CN113501878B - 针对人tslp的多种抗体及其用途

Info

Publication number: CN113501878B
Application number: CN202110147687.1A
Authority: CN
Inventors: 张雪萍; 刘志刚; 周晓巍; 胡俊杰; 郝小勃; 刘玉兰
Original assignee: Chongqing Zhixiang Jintai Biopharmaceutical Co ltd; Genrix Shanghai Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chongqing Zhixiang Jintai Biopharmaceutical Co ltd; Genrix Shanghai Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: US20240132581A1; WO2022166072A1; CN113501878A; EP4289861A4; US20240228605A9; EP4289861A1

Abstract

本申请提供了抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的双特异性抗体、单克隆抗体及其用途。

Description

针对人TSLP的多种抗体及其用途

发明领域

本发明通常涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，本申请涉及抗人TSLP的双特异性抗体、单克隆抗体及其用途。

发明背景

人胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)也被称为IL-7样细胞因子¹，是IL-2细胞因子家族的一员。TSLP主要由胸腺、肺部、肠道和皮肤的上皮细胞分泌^2,3，其次是一些纤维母细胞、气道平滑肌内皮细胞、肥大细胞、单核细胞、粒细胞、树枝状细胞(DC)^4-14。TSLP的表达受到一些因子调控，如过敏原、前期促炎症因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-13)、Th2因子、创伤、机械损伤、细菌等^15-18。

TSLP的靶细胞共表达TSLP受体(Thymic stromal lymphopoietin receptor，TSLPR)和IL-7受体α链(IL-7Rα)¹⁹。TSLPR高亲和力结合TSLP别构激活TSLP，进而募集IL-7Rα形成TSLP-TSLPR-IL-7Rα三元复合物，传导信号。IL-7Rα与TSLP-TSLPR高亲和力结合，但与TSLP结合非常弱²⁰。

哮喘是一种以气道炎症为特征的慢性疾病，临床特征表现为反复发作的喘息、气促、胸闷和咳嗽等症状²¹。在全球范围内，大约有3亿人患有哮喘²²。近二十年来全球哮喘患病率大约每年以1％的速度递增。现有的治疗药物包括支气管扩张剂、糖皮质激素、两者的联合制剂(舒利迭、信必可)、白三烯调节剂、长效胆碱能受体拮抗剂(噻托溴胺)、IgE抗体等，都不能控制所有哮喘患者病情。

大量研究证明约2/3的严重哮喘表现为Th2类细胞因子过表达，TSLP是引起Th2类细胞因子过表达的一个重要因子。TSLP-TSLPR作用主要是通过JAK-STAT信号通路完成的²。研究认为TSLP的上调，会与DC细胞上的TSLPR结合引起JAK活化，招募转录因子STAT5，引起下游信号转导，最终导致DC细胞的活化。DC细胞活化表现出共刺激分子的表达上调(如CD80、CD40、CD86)和趋化因子的分泌(TARC/CCL17、MDC/CCL22和I-309/CCL1)，从而提供给Th0向Th2细胞分化的有利微环境，引导Th2细胞为主的炎症反应，且伴随因子(IL-4、IL-13、IL-5)释放^11,12,23,24。TSLP转基因鼠易受特异抗原诱导而发生哮喘,而TSLP受体敲除的小鼠症状则明显减轻²⁴。从哮喘和炎症的发生机制分析，抗细胞因子(IL-4、IL-13、IL-5)药物仅靶向于驱动哮喘炎症的特定炎性分子，只适合某些类型的重症哮喘患者即亚组患者，如嗜酸性粒细胞性哮喘。TSLP与IL4、IL5等靶点明显不同，TSLP在炎症级联反应的早期上游活动，可能适用于广泛的重症不受控哮喘患者。

研究人员对于靶向TSLP的药物进行了大量的探索和研究。在螨尘诱导的小鼠哮喘模型中抗TSLP单克隆抗体可有效阻断TSLP/TSLPR作用，逆转气道炎症，预防组织结构改变，降低气道高反应性(AHR)以及TGF-β1水平²⁵。在血清蛋白诱导小鼠哮喘模型中，抗TSLP单克隆抗体有效地降低了Th2类因子(IL-4、IL-5等)的表达²⁶。抗TSLP单克隆抗体的安全性在猴体内也得到充分证实。而且，全球范围内，唯一临床在研的抗TSLP单克隆抗体在早期临床中显示出良好的客观反应率，有效缓解受试患者的病症²⁷。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是一类人工抗体，其包含两个不同的抗原结合位点，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，现已成为抗体工程领域的研究热点，在疾病的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

新的抗TSLP抗体的开发和应用是本领域所需要的。因此，鉴于抗TSLP抗体具有广泛的适用性，基于临床需求，探索和研发新的抗TSLP的抗体具有重要的生物学和医学意义。

发明概述

第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)非重叠表位的第一结合片段和第二结合片段。

在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够阻断人TSLP与人TSLP受体(TSLPR)的结合，并且所述双特异性抗体能够阻断人IL-7受体α链(IL-7Rα)与人TSLP:TSLPR复合物的结合。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段和所述第二结合片段之一结合人TSLP的表位与IL-7Rα结合人TSLP的表位部分重叠。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段包含:

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段包含:

如SEQ ID NO:35所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:36所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:37所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者

所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者

所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。

在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段和所述第二结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段和所述第二结合片段具有相同的轻链可变区。

在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:38所示的重链，以及SEQ ID NO:39和40之一所示的轻链。

在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体包含SEQ ID NO:41所示的重链，以及SEQ ID NO:39和40之一所示的轻链。

第二方面，本申请提供了结合人TSLP的单克隆抗体，其包含

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

第三方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

第四方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单克隆抗体或第三方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗TSLP介导的疾病的药物中的用途。

附图简述

图1显示了ELISA分析抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1对TSLP与TSLPR结合的抑制作用。

图2显示了ELISA分析抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制Tezepelumab-mIgG2a与TSLP结合的能力。

图3显示化学发光法细胞活力测定分析抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用的能力。

图4显示ELISA分析抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的能力。

图5显示人源化抗人TSLP单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M1对TSLP与TSLPR结合的抑制作用。

图6显示化学发光法细胞活力测定分析抗人TSLP单克隆抗体及两个单克隆抗体联用抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用的能力。

图7显示ELISA分析抗人TSLP单克隆抗体及两个单克隆抗体联用抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的能力。

图8显示ELISA分析抗人TSLP双特异性抗体对TSLP与TSLPR结合的抑制作用。

图9显示化学发光法细胞活力测定分析抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用的能力。

图10显示ELISA分析抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的能力。

图11显示使用Biacore T200分析抗人TSLP抗体的结合表位。其中图A-D分别为使用H3B10-M1+L3E8-M7、H1A10+L3E8-M7、H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7双特异性抗体和Tezepelumab作为第一抗体进行分析的结果。

图12显示抗体抗原复合物结构图。其中，左侧为TSLP抗原，右侧为H1A10+L3E8-M1Fab。

图13显示使用Biacore T200分析抗人TSLP抗体阻断人TSLPR结合人TSLP的结果。

图14显示使用Biacore T200分析抗人TSLP抗体阻断人IL-7Rα结合人TSLP：TSLPR复合物的结果。

序列说明

SEQ ID NO:1显示长版本人(homo sapiens)TSLP胞外区(hTSLP1-ECD)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2显示短版本人(homo sapiens)TSLP胞外区(hTSLP2-ECD)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示小鼠(mus musculus)TSLP胞外区(mTSLP-ECD)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4显示食蟹猴(Macaca fascicularis)TSLP胞外区(mfTSLP1-ECD)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5显示删除弗林蛋白酶识别位点的hTSLP1突变体(hTSLP1-m)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6显示删除弗林蛋白酶识别位点的hTSLP2突变体(hTSLP2-m)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7显示删除弗林蛋白酶识别位点的mfTSLP突变体(mfTSLP1-m)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8显示His标签(His)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9显示人(homo sapiens)IgG1抗体的Fc段(hFc)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10显示小鼠(mus musculus)IgG2a抗体的Fc段(mFc)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11显示人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12显示人(homo sapiens)IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13显示人(homo sapiens)IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14显示小鼠(mus musculus)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15显示小鼠(mus musculus)IgG2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18显示小鼠(mus musculus)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19显示小鼠(mus musculus)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20显示人源化抗体H1A10+L3E8-M1的重链可变区的氨基酸序列，其HCDR1-HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示。

SEQ ID NO:21显示人源化抗体H1A10+L3E8-M1的轻链可变区L3E8-M1的氨基酸序列，其LCDR1-LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。

SEQ ID NO:22显示抗人TSLP对照抗体Tezepelumab的重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:23显示抗人TSLP对照抗体Tezepelumab的轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO:24显示人源化重链突变体H3B10-M1的氨基酸序列，其HCDR1-HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示。

SEQ ID NO:25显示L3E8-M2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26显示L3E8-M3的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27显示L3E8-M4的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28显示突变体L3E8-M7的氨基酸序列，其LCDR1-LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。

SEQ ID NO:38显示H3B10-M1-IgG1m3-H的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39显示包含L3E8-M1轻链可变区的轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:40显示包含L3E8-M7轻链可变区的轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41显示H1A10-IgG1m3-K的氨基酸序列。

SEQ ID NO:42显示人(homo sapiens)TSLP受体胞外区(hTSLPR-ECD)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:43显示人(homo sapiens)IL-7受体α链胞外区(hIL-7Rα-ECD)的氨基酸序列。

发明详述

本申请的发明人对结合人TSLP的抗体药物进行了深入研发，并通过抗体工程技术得到了新的结合人TSLP的双特异性抗体和单克隆抗体。在本申请的多个方面，提供了新的结合人TSLP的双特异性抗体和单克隆抗体，编码所述双特异性抗体或单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化所述双特异性抗体或单克隆抗体的方法及所述双特异性抗体或单克隆抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体或单克隆抗体的可变区的序列，可构建全长的双特异性抗体分子或单克隆抗体分子作为药物在临床上用于预防或治疗TSLP介导的疾病。

除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

定义

如本文所用的术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、VHH抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

如本文所用的术语“双特异性抗体”是指同时具有两种抗原表位结合能力的抗体。两种抗原表位可以在不同抗原上，也可是在同一抗原上。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部可以为单链抗体(scfv)或者Fab片段。当针对给定的同一抗原的两个非重叠表位时，双特异性抗体的两个不同的结合部各自与一个Fc片段的N端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式：scfv+Fab片段、Fab片段+scfv、scfv+scfv和Fab片段+Fab片段。Fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient route to human bispecific IgG”,A.Margaret Merchant et al.,Nature Biotechnology,Volume 16,1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。此外，双特异性抗体的结构可以是结合抗原的第一个表位的抗体(例如天然抗体形式)从CH3区的C端延伸出(可以通过柔性连接子)能结合抗原的第二个表位的抗原结合部分。

如本文所用的术语“结合部分”或“结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani etal.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

对于一般抗体而言，抗原结合片段的实例包括但不限于:(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')₂片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；(5)(scFv)₂，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合；以及(6)VHH抗体形式。

在双特异性抗体构建中，“结合部分”包括但不限于Fab片段形式或单链抗体(scFv)形式。

如本文所用的术语“单链抗体(scFv,single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。

如本文所用的术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。

如本文所用的术语“第一重链恒定区”和“第二重链恒定区”均指“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语，是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、重链恒定区的CH2片段和CH3片段，并且参照人IgG1抗体的EU numbering确定。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段包含:

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段包含:

如SEQ ID NO:35所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:36所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:37所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段和所述第二结合片段均为Fab片段。

在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一结合片段和所述第二结合片段具有相同的轻链。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第一方面的一些实施方案中，所述第一结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一结合片段的轻链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一结合片段的轻链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一结合片段的轻链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第一方面的一些实施方案中，所述第二结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二结合片段的重链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二结合片段的轻链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二结合片段的轻链可变区的功能。

在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二结合片段的轻链可变区的功能。

第二方面，本申请提供了结合人TSLP的单克隆抗体，其包含

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者

所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:21或28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。

在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。

在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的重链可变区的功能。

在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。

在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。

在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:21或28所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单克隆抗体的轻链可变区的功能。

在第三方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗TSLP介导的疾病。

在第三方面的一些实施方案中，所述的TSLP介导的疾病选自:哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿、过敏性肺炎、特应性皮炎、鼻炎、克罗恩病、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。

在第三方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种:润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

在第三方面的一些实施方案中，可以将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

在第三方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于:口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

在第三方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

第四方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单克隆抗体、或第三方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗TSLP介导的疾病的药物中的用途。

在第四方面的一些实施方案中，所述的TSLP介导的疾病选自:哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿、过敏性肺炎、特应性皮炎、鼻炎、克罗恩病、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。

第五方面，本申请提供了预防或治疗TSLP介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单克隆抗体、或者第三方面所述的药物组合物。

在第五方面的一些实施方案中，所述的TSLP介导的疾病选自:哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿、过敏性肺炎、特应性皮炎、鼻炎、克罗恩病、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。

在其他方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。

本申请还提供包含编码第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在其他方面，本申请还提供产生第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸分子。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单克隆抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收双特异性抗体或单克隆抗体。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。

实施例

实施例1:重组蛋白的制备

制备抗TSLP抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括长版本的人TSLP胞外区(hTSLP1-ECD，SEQ ID NO:1)、短版本的人TSLP胞外区(hTSLP2-ECD，SEQ ID NO:2)、小鼠TSLP胞外区(mTSLP-ECD，SEQ ID NO:3)和食蟹猴TSLP胞外区(mfTSLP1-ECD，SEQ ID NO:4)。这些蛋白具有大量的翻译后修饰(如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为避免hTSLP1、hTSLP2和mfTSLP1中的弗林蛋白酶识别位点对TSLP蛋白活性的影响，分别构建删除弗林蛋白酶识别位点的hTSLP1突变体(hTSLP1-m，SEQ ID NO:5)、hTSLP2突变体(hTSLP2-m，SEQ ID NO:6)、mfTSLP1突变体(mfTSLP1-m，SEQ ID NO:7)。同时，在这些重组蛋白的C端添加了His标签(His，SEQID NO:8)或者人抗体IgG1的Fc段(hFc，SEQ ID NO:9)或者鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ IDNO:10)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:11)、人IgG2亚型(SEQ ID NO:12)、人IgG4亚型(SEQ ID NO:13)或者鼠IgG1亚型(SEQ ID NO:14)、鼠IgG2a亚型(SEQ ID NO:15)，轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:16)、人λ亚型(SEQ ID NO:17)或者鼠κ亚型(SEQ ID NO:18)、鼠λ亚型(SEQ IDNO:19)。

根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者hFc、mFc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。

His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。hFc和mFc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。

实施例2:基于固定轻链的TSLP小鼠免疫库的构建和筛选

为构建基于共同轻链的TSLP双特异性抗体，选取特定表位的抗TSLP单克隆抗体轻链可变区配合经过TSLP抗原体内亲和力成熟的小鼠重链可变区，利用常规分子生物学手段构建单链抗体(scFv)库，用于筛选针对不同表位的抗TSLP单克隆抗体。

利用hTSLP1-m-His重组蛋白作为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠后，收集脾细胞。使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司，CAT#DKW33-R0100)对小鼠脾脏淋巴细胞进行分离，利用细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，CAT#DP430)，对分离的淋巴细胞进行总RNA提取。以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo scientific，CAT#K1621)合成抗体的重链可变区。利用常规分子生物学手段，通过PCR扩增得到识别hTSLP1特定表位的单克隆抗体H1A10+L3E8-M1(参见中国专利申请第202010080450.1号中的人源化抗体H1A10+L3E8-M1，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示)轻链可变区和使用hTSLP1-m-His重组抗原免疫小鼠得到的小鼠重链可变区，然后利用重叠延伸PCR技术，构建单链抗体(scFv)，将编码制备的小鼠单链抗体的基因克隆至载体pADSCFV-S(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1)，构建scFv库。此抗体库的库容达到8.3E+07，正确率为65％。

参照文献(中国专利申请第201510097117.0号)，以实施例1制备的重组hTSLP1-m-his为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示:通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T.)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选构建的固定轻链小鼠免疫库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行三轮筛选，最终获得一株特异结合人TSLP的单链抗体分子S17C7+L3E8-M1。

实施例3:抗hTSLP鼠单克隆抗体的鉴定

利用常规分子生物学方法，将编码S17C7+L3E8-M1的轻可变区和重链可变区的核酸分子分别克隆至真核表达载体，制备表达全抗体。同时，参照美国专利US9284372B2制备人源抗TSLP单克隆抗体Tezepelumab作为阳性对照(重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)。

3.1重组抗TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1的亲和力分析

利用Biacore X100通过表面等离子共振技术测定抗TSLP抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、CM5芯片(BR100012)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗TSLP抗体至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，保证100RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hTSLP1-m-his设置一系列的浓度梯度(例如0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为3600s，以10μL/min注射3M的MgCl₂溶液30s对芯片表面进行再生。使用Biacore X100评估软件2.0.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(K_a)和解离速率(K_d)。以比率K_d/K_a计算解离平衡常数(K_D)。拟合结果如表1所示。

表1.重组抗人TSLP单克隆抗体结合hTSLP的亲和力常数

单克隆抗体	K<sub>a</sub>	K<sub>d</sub>	K<sub>D</sub>
				Tezepelumab	8.633E+6	1.278E-5	1.48E-12
S17C7+L3E8-M1	4.611E+6	8.699E-4	1.887E-10

3.2重组抗TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制TSLP与TSLPR的结合

使用重组抗原TSLPR-Fc包被96孔板(3μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％吐温20-3％牛奶在37℃封闭1小时。用固定浓度的hTSLP1-m-his(0.2μg/mL)对单克隆抗体S17C7+L3E8-M1及Tezepelumab进行梯度稀释，起始浓度100μg/mL，3倍梯度稀释，共10个浓度梯度，100μL/孔加入封闭好的96孔ELISA板中，37℃孵育1小时。使用PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，然后100μL/孔加入1:5000稀释的HRP-抗His标签鼠单克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0285M)，37℃孵育1小时。使用PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H₂SO₄终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。ELISA分析结果(图1)显示，S17C7+L3E8-M1可以完全抑制TSLP和TSLPR的结合，其抑制能力与Tezepelumab相当，IC₅₀值见表2。

表2.抗人TSLP单克隆抗体抑制TSLP与TSLPR结合的IC₅₀值

单克隆抗体	S17C7+L3E8-M1	Tezepelumab
			IC<sub>50</sub>(nM)	1.707	1.307

3.3重组抗TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1和Tezepelumab与TSLP结合的表位比较

使用重组蛋白hTSLP1-m-his包被于96孔板(1μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％吐温20-3％牛奶在37℃封闭1小时。然后用含有0.05μg/mL重组抗体Tezepelumab-mIgG2a的PBS-2％牛奶对Tezepelumab-IgG4和S17C7+L3E8-M1-IgG1m3进行梯度稀释，起始浓度为200μg/mL，3倍梯度稀释，共10个浓度梯度，100μL/孔加入封闭好的96孔ELISA板中，37℃孵育1小时。使用PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，然后100μL/孔加入1:5000稀释的HRP山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB2305)，37℃孵育1小时。使用PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H₂SO₄终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图2)显示，S17C7+L3E8-M1-IgG1m3可以完全抑制Tezepelumab-mIgG2a和TSLP的结合。IC₅₀值参见表3：S17C7+L3E8-M1-IgG1m3抑制Tezepelumab-mIgG2a结合TSLP的IC₅₀值为Tezepelumab-IgG4的2.2倍，这可能跟S17C7+L3E8-M1-IgG1m3结合TSLP的亲和力弱于Tezepelumab-IgG4(参见表1)有关。

表3.抗人TSLP单克隆抗体抑制Tezepelumab-mIgG2a与TSLP结合的IC₅₀值

单克隆抗体	S17C7+L3E8-M1-IgG1m3	Tezepelumab-IgG4
			IC<sub>50</sub>(nM)	3.223	1.467

3.4重组抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用

BAF3-TSLPR/IL-7Rα是一株TSLP受体高表达的稳转细胞株，且依赖mIL-3增殖。在没有mIL-3的条件下，TSLP可以有效促进BA/F3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖，通过该方法可评价抗人TSLP单克隆抗体抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用。实验中，使用去掉mIL-3的完全培养基对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞预培养两天。实验当天，离心重悬细胞至1×10⁶个/mL，50μL/孔加入96孔平底细胞培养板；重组抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1以及阳性对照抗体(Tezepelumab)都以终浓度60μg/mL起始，第二个浓度为30μg/mL，之后8个点均是5倍梯度稀释，稀释后的抗人TSLP单克隆抗体与终浓度是0.4ng/mL的hTSLP-m-his等体积预混30分钟，后与BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞混合孵育，总体积是150μL/孔。48小时后，使用Cell

化学发光法细胞活力测定试剂盒(Promega，Cat#G7570)，利用多功能酶标仪(Spectra

I3X)检测细胞增殖情况。以化学发光读值结果进行拟合分析，结果(图3)显示，抗人单克隆抗体S17C7+L3E8-M1以及阳性对照抗体Tezepelumab都可有效抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用。

3.5重组抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用

采集正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为:

1.年龄大于18周岁；

2.无HIV、HBV感染；

3.血常规检测正常；

4.非孕妇或哺乳期妇女。

使用Ficoll密度梯度离心法从健康人外周血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。

TSLP与树突细胞上的TSLPR结合，会引起树突细胞的活化，树突细胞活化表现出趋化因子(如TARC，又名CCL17)的分泌。通过检测TARC可有效评价重组抗TSLP抗体对TSLP的抑制作用。用含有10％(灭活)血清的R1640培养基重悬PBMC至2×10⁷个/mL，加入到96孔平底细胞培养板(50μL/孔)。重组抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1以及阳性对照抗体(Tezepelumab)都以终浓度0.5nM起始，2倍梯度稀释，共3个作用浓度。稀释后的重组抗人TSLP单克隆抗体与终浓度1ng/mL的hTSLP-m-his等体积预混30分钟，加入到细胞中混合，总体积是150μL/孔。设无TSLP对照(细胞)、无抗体对照(细胞+TSLP)、IgG1m3同型抗体对照(细胞+TSLP+IgG1m3)。于37℃、5％CO₂条件下孵育24小时。然后取上清，基于ELISA检测方法，使用人源抗体TARC匹配的ELISA抗体配对组(TARC Matched ELISA Antibody Pair Set，北京义翘神州科技有限公司，Cat#SEK10233)检测TARC，显色液为TMB高敏感度底物溶液(Biolegend，Cat#421501)，使用酶标仪(Biotek，Cat#ELX800)测定OD450光密度值。以读值结果进行分析，结果(图4)显示重组抗人TSLP单克隆抗体S17C7+L3E8-M1以及对照抗体Tezepelumab都可抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用。

实施例4:鼠抗人TSLP单克隆抗体的人源化改造及功能鉴定

抗人TSLP鼠单克隆抗体S17C7+L3E8-M1的重链人源化采用经典的框架移植策略(Jimmunol.169，1119-1125，2002)。将S17C7+L3E8-M1的重链可变区与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据多种因素选出，如:抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等。所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终得到人源化的重链突变体H3B10-M1(SEQ ID NO:24)。根据人源化抗体的氨基酸序列设计并合成抗体可变区基因，克隆至真核表达载体并配合轻链L3E8-M1表达全抗体H3B10-M1+L3E8-M1。

参照实施例3.1，使用Biacore X100对S17C7+L3E8-M1的人源化单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M1进行亲和力分析，结果如表4所示。

表4.人源化单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M1结合hTSLP的亲和力常数

单克隆抗体	K<sub>a</sub>	K<sub>d</sub>	K<sub>D</sub>
				S17C7+L3E8-M1	1.524E+7	1.767E-3	1.159E-10
H3B10-M1+L3E8-M1	1.782E+7	1.152E-3	6.464E-11

参照实施例3.2，ELISA分析人源化单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M1抑制TSLP与TSLPR结合的能力。ELISA分析结果(图5)显示：人源化单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M1可以完全抑制TSLP与TSLPR的结合，IC₅₀值参见表5。

表5.人源化抗体H3B10-M1+L3E8-M1抑制TSLP与TSLPR结合的IC₅₀值

单克隆抗体	S17C7+L3E8-M1	H3B10-M1+L3E8-M1
			IC<sub>50</sub>(nM)	2.288	1.787

实施例5：共同轻链L3E8-M1的优化和鉴定

5.1共同轻链L3E8-M1的改造

鼠抗体在人源化的过程中，框架区氨基酸的改变可能导致抗体构象改变，影响抗体的正常折叠和分泌，损害抗体的稳定性，进而影响抗体的表达。基于共同轻链L3E8-M1分别配合重链H1A10和H3B10-M1表达单克隆抗体，表达量相较于亲本序列L3E8显著降低，对比L3E8其他突变体的表达量(参见中国专利申请第202010080450.1号中的L3E8-M1：氨基酸序列为SEQ ID NO:21，L3E8-M2：氨基酸序列为SEQ ID NO:25，L3E8-M3：氨基酸序列为SEQ IDNO:26，L3E8-M4：氨基酸序列为SEQ ID NO:27)，在L3E8-M1可变区引入L78V和S80A突变，构建新突变体L3E8-M7(SEQ ID NO:28)。根据L3E8-M7的氨基酸序列，设计并合成抗体可变区基因，克隆至真核表达载体并配合H1A10和H3B10-M1重链分别表达全抗体。参照实施例1，对比不同轻链L3E8、L3E8-M1、L3E8-M7全抗体的表达量，L3E8-M7恢复至亲本L3E8的表达水平，明显优于L3E8-M1。

5.2人源化抗体H3B10-M1+L3E8-M7的亲和力分析

参考实施例3.1，使用Biacore X100对H3B10-M1+L3E8-M7进行亲和力分析，结果如表6所示。

表6.H3B10-M1+L3E8-M7结合hTSLP的亲和力常数

单克隆抗体	K<sub>a</sub>	K<sub>d</sub>	K<sub>D</sub>
				H3B10-M1+L3E8-M7	1.742E+7	1.056E-3	6.061E-11
H3B10-M1+L3E8-M1	1.782E+7	1.152E-3	6.464E-11
				H1A10+L3E8-M7	2.053E+6	2.131E-5	1.038E-11

5.3人源化抗体H3B10-M1+L3E8-M7抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用

参考实施例3.4处理BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞。实验当天，离心重悬细胞至1×10⁶个/mL，50μL/孔加入96孔平底细胞培养板；重组抗人TSLP单克隆抗体(H1A10+L3E8-M1、H1A10+L3E8-M7、H3B10-M1+L3E8-M1、H3B10-M1+L3E8-M7)以及阳性对照抗体(Tezepelumab)都以终浓度60μg/mL起始，第二个浓度为30μg/mL，之后8个点均是6倍梯度稀释。联用实验组(H1A10+L3E8-M1&H3B10-M1+L3E8-M1、H1A10+L3E8-M7&H3B10-M1+L3E8-M7)的剂量为各个单克隆抗体的一半。稀释后的抗人TSLP单克隆抗体与终浓度是0.4ng/mL的hTSLP-m-his等体积预混30分钟，后与BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞混合孵育，总体积是150μL/孔。48小时后，使用Cell

I3X)检测细胞增殖情况。以化学发光读值结果进行拟合分析，结果(图6)显示，轻链为L3E8-M7的单克隆抗体H1A10+L3E8-M7和H3B10-M1+L3E8-M7均有效抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用，且活性与轻链为L3E8-M1的单克隆抗体H1A10+L3E8-M1和H3B10-M1+L3E8-M1相当。联用实验组比单克隆抗体和阳性对照抗体Tezepelumab都有更显著的抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用。

5.4人源化抗体H3B10-M1+L3E8-M7抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用

参考实施例3.5获得PBMC细胞。实验当天，用含有10％(灭活)血清的R1640培养基重悬PBMC至2×10⁷个/mL，加入到96孔平底细胞培养板(50μL/孔)。抗人TSLP单克隆抗体(H1A10+L3E8-M1、H1A10+L3E8-M7、H3B10-M1+L3E8-M1、H3B10-M1+L3E8-M7)以及阳性对照抗体(Tezepelumab)都以终浓度0.25nM起始，2倍梯度稀释，共3个作用浓度。联用实验组(H1A10+L3E8-M1&H3B10-M1+L3E8-M1、H1A10+L3E8-M7&H3B10-M1+L3E8-M7)的剂量为各个单克隆抗体的一半。设无TSLP对照(细胞)、无抗体对照(细胞+1ng/mL TSLP)、IgG1m3同型抗体对照(细胞+1ng/mL TSLP+IgG1m3)。稀释后的重组抗人TSLP单克隆抗体与终浓度1ng/mL的hTSLP-m-his等体积预混30分钟，加入到细胞中混合，总体积是150μL/孔，于37℃、5％CO₂条件下孵育24小时。然后取上清，基于ELISA检测方法，使用人源抗体TARC匹配的ELISA抗体配对组(北京义翘神州科技有限公司，Cat#SEK10233)检测TARC，显色液为TMB高敏感度底物溶液(Biolegend，Cat#421501)，使用酶标仪(Biotek，Cat#ELX800)测定OD450光密度值。以读值结果进行分析，结果(图7)显示轻链为L3E8-M7的单克隆抗体H1A10+L3E8-M7、H3B10-M1+L3E8-M7均有效抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用，且活性与轻链为L3E8-M1的单克隆抗体H1A10+L3E8-M1、H3B10-M1+L3E8-M1相当。联用实验组比单克隆抗体和阳性对照抗体Tezepelumab更显著的抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用。

实施例6：抗人TSLP双特异性抗体的制备和鉴定

6.1抗人TSLP双特异性抗体的制备

分别将编码抗人TSLP两个不同表位的单克隆抗体的重链可变区H1A10和H3B10-M1的核苷酸序列克隆至合适的真核表达载体，构建基于共同轻链L3E8-M7的异源二聚体。即将编码H1A10重链可变区的核苷酸序列克隆至融合有编码Knob突变的IgG1恒定区IgG1m3-K的核苷酸序列的真核表达载体，将编码H3B10-M1重链可变区的核苷酸序列克隆至含有编码Hole突变的IgG1恒定区IgG1m3-H核苷酸序列的真核表达载体，将编码共同轻链L3E8-M7可变区的核苷酸序列克隆至融合有编码人轻链恒定区CK的核苷酸序列的真核表达载体。

将构建的表达H1A10-IgG1m3-K、表达H3B10-M1-IgG1m3-H和表达L3E8-M7-CK的3个真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。培养上清中双特异性抗体用Protein A/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为BS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到目的蛋白。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。

6.2抗人TSLP双特异性抗体的亲和力分析

参考实施例3.1，使用Biacore X100分析抗人TSLP双特异性抗体(BsAb)分子及单克隆抗体分子结合人TSLP(hTSLP)和食蟹猴TSLP(mfTSLP)的亲和力，结果如表7和表8所示。

表7.抗人TSLP抗体结合hTSLP的亲和力常数

抗体	K<sub>a</sub>	K<sub>d</sub>	K<sub>D</sub>
				H3B10-M1+L3E8-M7	1.477E+7	1.176E-3	7.963E-11
H1A10+L3E8-M7	2.828E+6	3.999E-5	1.414E-11
				H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb	1.741E+7	1.118E-4	6.421E-12
H1A10×H3B10-M1+L3E8-M1 BsAb	1.618E+7	1.313E-4	8.115E-12

表8.抗人TSLP抗体结合mfTSLP的亲和力常数

抗体	K<sub>a</sub>	K<sub>d</sub>	K<sub>D</sub>
				H1A10+L3E8-M7	4.241E+6	1.205E-2	2.842E-9
H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb	7.132E+6	1.963E-2	2.753E-9
				H1A10×H3B10-M1+L3E8-M1 BsAb	1.004E+7	2.497E-2	2.487E-9

6.3抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP与TSLPR的结合

参照实施例3.2，ELISA水平分析抗TSLP双特异性抗体抑制TSLP与TSLPR结合的能力。ELISA分析结果(图8)显示：抗人TSLP双特异性抗体H1A10×H3B10-M1+L3E8-M1 BsAb、H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb抑制TSLP与TSLPR结合的能力与Tezepelumab基本相当，IC₅₀值见表9。

表9.抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP与TSLPR结合的IC₅₀值

6.4抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用

参考实施例5.3，使用Cell

化学发光法细胞活力测定试剂盒(Promega，Cat#G7570)检测细胞增殖情况，利用多功能酶标仪(Spectra

I3X)读值。结果(图9)显示：抗人TSLP双特异性抗体(H1A10×H3B10-M1+L3E8-M1 BsAb和H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7BsAb)比联用实验组(H1A10+L3E8-M1&H3B10-M1+L3E8-M1、H1A10+L3E8-M7&H3B10-M1+L3E8-M7)和阳性对照抗体Tezepelumab有更显著的抑制TSLP对BAF3-TSLPR/IL-7Rα细胞的增殖促进作用。

6.5抗人TSLP双特异性抗体抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用

参考实施例3.5获得PBMC细胞。实验当天，用含有10％(灭活)血清的R1640培养基重悬PBMC至2×10⁷个/mL，加入到96孔平底细胞培养板(50μL/孔)。抗人TSLP单克隆抗体H1A10+L3E8-M7、H3B10-M1+L3E8-M7，抗人TSLP双特异性抗体H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7BsAb以及阳性对照抗体(Tezepelumab)都以终浓度2.5μg/mL起始，前3个点4倍稀释，中间第4-6个点3倍稀释，第7-9个点5倍稀释。联用实验组(H1A10+L3E8-M7&H3B10-M1+L3E8-M7)的剂量为各个单克隆抗体的一半。设同型抗体对照IgG1m3。稀释后的抗人TSLP抗体与终浓度1ng/mL的hTSLP-m-his等体积预混30分钟，加入到细胞中混合，总体积是150μL/孔，于37℃、5％CO₂条件下孵育24小时。然后取上清，基于ELISA检测方法，使用人源抗体TARC匹配的ELISA抗体配对组(北京义翘神州科技有限公司，Cat#SEK10233)检测TARC，显色液为TMB高敏感度底物溶液(Biolegend，Cat#421501)，使用酶标仪(Biotek，Cat#ELX800)测定OD450光密度值。以读值结果进行拟合分析，结果(图10)显示双特异性抗体和联用实验组比单克隆抗体实验组和阳性对照抗体Tezepelumab更显著抑制TSLP刺激PBMC分泌TARC的作用。

实施例7：抗人TSLP双特异性抗体的双表位分析

7.1抗人TSLP双特异性抗体的双表位鉴定

利用Biacore T200通过表面等离子共振技术分析抗TSLP抗体的结合表位。

试剂耗材-氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、His试剂盒(28995056)、S系列CM5芯片(BR100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。

芯片偶连-依照氨基偶连试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗His抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约12000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。

表位分析-用1×HBS-EP稀释hTSLP1-m-His重组蛋白至2μg/mL，10μL/min注射12秒，保证约25RU的hTSLP1-m-His被抗His抗体捕获。用1×HBS-EP分别将抗人TSLP单克隆抗体H3B10-M1+L3E8-M7、H1A10+L3E8-M7、Tezepelumab及抗人TSLP双特异性抗体H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7(H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb)稀释至45μg/ml，利用Biacore T200的双注射模式依次进样不同抗体，即以30μL/min的流速将第一个抗体流经捕获有抗原hTSLP-m-His的芯片表面后，紧接着进样第二个抗体，每个抗体进样120秒。进样结束后以10μL/min注射1.7mM的甘氨酸-HCl 30s对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.0版，将hTSLP1-m-His的捕获水平报告点归零，然后使用GraphPad软件将RU值对时间(s)作图(连接线)。

表位分析结果显示：1)先进样H3B10-M1+L3E8-M7再进样Tezepelumab，检测不到Tezepelumab的结合信号(图11A，表10)；同样的，先进样Tezepelumab再进样H3B10-M1+L3E8-M7，检测不到H3B10-M1+L3E8-M7的结合信号(图11D，表10)，说明H3B10-M1+L3E8-M7结合TSLP表位和Tezepelumab结合TSLP表位重叠。2)先进样H3B10-M1+L3E8-M7再进样H1A10+L3E8-M7，结合信号出现明显叠加(图11A，表10)，先进样H1A10+L3E8-M7再进样H3B10-M1+L3E8-M7，结合信号出现明显叠加(图11B，表10)，说明H3B10-M1+L3E8-M7和H1A10+L3E8-M7识别TSLP表位不同。3)H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7双特异性抗体(H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb)结合TSLP后，H3B10-M1+L3E8-M7和H1A10+L3E8-M7都不能够再继续结合TSLP(图11C，表10)，说明H1A10×H3B10-M1双特异性抗体识别TSLP双表位。

表10.第一抗体进样后的第二抗体结合量(RU)

7.2抗人TSLP抗体的结合表位分析

抗人TSLP单克隆抗体H1A10+L3E8-M1的TSLP结合表位分析。为了研究人源化单克隆抗体H1A10+L3E8-M1与人TSLP的结合表位，利用CHO细胞制备重组的H1A10+L3E8-M1 Fab以及重组的人TSLP，形成H1A10+L3E8-M1 Fab-TSLP复合物，在0.2M甲酸钠、20％PEG3350条件下形成复合物晶体，对复合物晶体进行X射线衍射实验，收集到分辨率

的数据。并通过分子置换法解析了TSLP抗原抗体复合物的晶体结构，H1A10+L3E8-M1 Fab-TSLP复合物结构模型中轻重链密度和抗原的电子密度清晰，R-work和R-free的值分别为0.198和0.260。

TSLP与H1A10+L3E8-M1 Fab的相互作用面积约为

其中TSLP与重链的相互作用面积约为

与轻链的相互作用面积约为

相互作用主要涉及TSLP的第41-53位氨基酸和第95-114位氨基酸两段螺旋，而抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链可变区的LCDR1、LCDR3参与了对TSLP的识别(图12)。重链参与TSLP结合的重点氨基酸位点为：N31、Q50、D57、Y101、G104、D55、D57；轻链参与TSLP结合的重点氨基酸位点：N33、Y92、Y95。H1A10+L3E8-M1 Fab与TSLP相互作用方式包括氢键、盐键、范德华力以及疏水相互作用(见表11)。

表11.参与H1A10+L3E8-M1 Fab-hTSLP结合的氨基酸残基

IL-7R与TSLP相互作用主要涉及TSLP的第41-49位氨基酸和第97-109位氨基酸两段螺旋²⁸，H1A10+L3E8-M1结合的TSLP表位主要集中在TSLP的第41-53位氨基酸和第95-114位氨基酸，H1A10+L3E8-M1和IL-7R结合TSLP的表位有交叉，H1A10-L3E8-M1抑制TSLP与IL-7R结合。L3E8-M1进行两个点突变成为L3E8-M7，突变位点为L79V和S81A，这两个位点是结构堆积的一部分，空间距离CDR比较远；这些突变位置氨基酸不参与与TSLP的结合，也不影响与TSLP结合的关键氨基酸，理论上可以推测L3E8-M7与TSLP的作用和L3E8-M1与TSLP的一致，即H1A10+L3E8-M7和H1A10+L3E8-M1与TSLP的作用一致。

Tezepelumab与TSLP相互作用主要涉及TSLP的第65-78位氨基酸和第150-153位氨基酸；TSLPR与TSLP相互作用主要涉及TSLP的第60-69位氨基酸和第142-152位氨基酸以及第153-158位氨基酸²⁸，即Tezepelumab结合TSLP的表位与TSLPR结合TSLP的表位有交叉。7.1中的各种单克隆抗体和双特异性抗体的表位分析数据显示H3B10-M1+L3E8-M7结合TSLP的表位和Tezepelumab重叠，可以推测H3B10-M1+L3E8-M7结合TSLP的表位与TSLPR结合TSLP的表位交叉。

实施例8：抗人TSLP抗体阻断人TSLP:TSLPR:IL-7Rα复合物形成TSLP首先和细胞表面TSLPR结合形成二元复合物，然后募集IL-7Rα形成TSLP:TSLPR:IL-7Rα三元复合物后传导下游信号通路。TSLP可以高亲和力结合TSLPR(K_D＝32nM)，TSLP和IL-7Rα相互作用微弱，但IL-7Rα可以高亲和力结合TSLP:TSLPR复合物(K_D＝29nM)²⁸。功能性抗TSLP抗体主要通过以下两种方式阻断TSLP:TSLPR:IL-7Rα三元复合物的形成而发挥功能：i)阻断TSLPR结合TSLP，ii)阻断IL-7Rα结合TSLP:TSLPR二元复合物。

试剂耗材

氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、鼠抗体捕获试剂盒(BR100838)、S系列CM5芯片(BR100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。

芯片偶联

依照氨基偶连试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗鼠Fc(mFc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/分注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。

8.1抗人TSLP抗体阻断人TSLPR结合人TSLP

参照实施例1表达人TSLP受体胞外区(hTSLPR-ECD，SEQ ID NO:42)。用1×HBS-EP缓冲液稀释hTSLP1-m-mFc重组蛋白至2μg/mL，10μL/min注射12s，约80RU的hTSLP1-m-mFc被抗mFc抗体捕获。用1×HBS-EP缓冲液将抗hTSLP抗体(H3B10-M1+L3E8-M7、H1A10+L3E8-M7和H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb)稀释至50μg/mL，将hTSLPR稀释至100μg/mL，利用BiacoreT200的双注射模式依次进样两种分子，即以30μL/分的流速将抗TSLP抗体(第一分析物)流经捕获有抗原hTSLP1-m-mFc重组蛋白的芯片表面后，紧接着进样同一抗体或者hTSLPR-ECD(第二分析物)，每个分子进样90s。进样结束后以10μL/分注射10mM pH 1.7的甘氨酸-HCl30s对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.0版，将双基线的Y坐标轴报告点归零，然后使用GraphPad软件将RU值对时间(s)作图。

图13A为使用Biacore T200进行蛋白阻断分析的基本原理。结果显示：1)单独进样hTSLPR-ECD，hTSLPR-ECD的结合量为68.1RU(图13B和表12)；2)先进样H3B10-M1+L3E8-M7再进样hTSLPR-ECD，检测不到hTSLPR-ECD的结合信号(图13C和表12)，说明H3B10-M1+L3E8-M7阻断了hTSLPR-ECD和hTSLP1-m-mFc重组蛋白的结合；3)先进样H1A10+L3E8-M7再进样hTSLPR-ECD，hTSLPR-ECD的结合信号和单独进样hTSLPR-ECD相似(图13D和表12)，说明H1A10+L3E8-M7不能阻断hTSLPR-ECD和hTSLP1-m-mFc重组蛋白的结合；4)H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb结合hTSLP1-m-mFc重组蛋白后，hTSLPR-ECD不能够再继续结合hTSLP1-m-mFc重组蛋白(图13E和表12)，说明H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb能够阻断hTSLPR-ECD和hTSLP1-m-mFc重组蛋白的结合。

表12.抗hTSLP抗体进样后hTSLPR-ECD的结合量(RU)

	hTSLPR-ECD结合量
		缓冲液	68.1
H3B10-M1+L3E8-M7	-6
		H1A10+L3E8-M7	59.1
H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb	-1.7

8.2抗人TSLP抗体阻断人IL-7Rα结合人TSLP:TSLPR复合物

参照实施例1表达人IL-7Rα胞外区(hIL-7Rα-ECD，SEQ ID NO:43)。用1×HBS-EP缓冲液分别稀释hTSLP1-m-mFc和hTSLPR-ECD重组蛋白至2μg/mL和100μg/mL，依次进样hTSLP1-m-mFc 12s，hTSLPR-ECD 60s，在CM5芯片表面形成hTSLP:hTSLPR复合物。用1×HBS-EP将抗hTSLP抗体(H3B10-M1+L3E8-M7、H1A10+L3E8-M7和H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb)稀释至50μg/mL，将hIL-7Rα-ECD稀释至200μg/mL，利用Biacore T200的双注射模式依次进样两种分子，即以30μL/min的流速将抗hTSLP抗体流经捕获有hTSLP:hTSLPR复合物的芯片表面后，紧接着进样hIL-7Rα-ECD，每个分子进样60s。进样结束后以10μL/分注射10mM pH1.7的甘氨酸-HCl 30s对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.0版，将双基线的Y坐标轴报告点归零，然后使用GraphPad软件将RU值对时间(s)作图。

结果显示：1)单独进样hIL-7Rα-ECD，hIL-7Rα-ECD结合hTSLP:hTSLPR复合物的响应值为36.2RU(图14A和表13)；2)先进样H3B10-M1+L3E8-M7再进样hIL-7Rα-ECD，hIL-7Rα-ECD的结合信号和单独进样hIL-7Rα-ECD相似(图14B和表13)，说明H3B10-M1+L3E8-M7不阻断hIL-7Rα-ECD和hTSLP:hTSLPR复合物的结合；3)先进样H1A10+L3E8-M7再进样hIL-7Rα-ECD，几乎检测不到hIL-7Rα-ECD的结合信号(图14C和表13)，说明H1A10+L3E8-M7可以阻断hIL-7Rα-ECD结合hTSLP:hTSLPR复合物；4)H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb结合hTSLP后，hIL-7Rα-ECD不能够结合hTSLP:hTSLPR复合物(图14D和表13)，说明H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb能够阻断hIL-7Rα-ECD和hTSLP:hTSLPR复合物的结合。

表13.抗TSLP抗体进样后hIL-7Rα-ECD的结合量(RU)

	hIL-7Rα-ECD结合量
		缓冲液	36.2
H3B10-M1+L3E8-M7	36.5
		H1A10+L3E8-M7	1.7
H1A10×H3B10-M1+L3E8-M7 BsAb	3.1

上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述，但是，在不脱离本申请的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进，由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。

参考文献

1.Leonard,W.J.(2002)TSLP is now revealed to be an important regulatorof DC-mediated control of TH2-based human allergic responses,identifying apotentially new species-specific function for this cytokine.Nat Immunol 3,605-607.

2.Liu,Y.J.,Soumelis,V.,Watanabe,N.,et al.(2007)TSLP:an epithelialcell cytokine that regulates T cell differentiation by conditioning dendriticcell maturation.Annual Review of Immunology 25,93-219.

3.Ziegler,S.F.,Artis,D.(2010)Sensing the outside world:TSLP regulatesbarrier immunity.Nat Immunol 11,289-293.

4.Allakhverdi,Z.,Comeau,M.R.,Jessup,H.K.,et al.(2009)Thymic stromallymphopoietin as a mediator of crosstalk between bronchial smooth muscle andmast cells.Journal of Allergy and Clinical Immunology 123,958-960.

5.Allakhverdi,Z.,Comeau,M.R.,Jessup,H.K.,et al.(2007)Thymic stromallymphopoietin is released by human epithelial cells in response to microbes,trauma,or inflammation and potently activates mast cells.J Exp Med 204,253-258.

6.Lee,H.C.,Ziegler,S.F.(2007)Inducible expression of the proallergiccytokine thymic stromal lymphopoietin in airway epithelial cells iscontrolled by NFκB.Proceedings of the National Academy of Sciences 104,914-919.

7.Ying,S.,O"Connor,B.,Ratoff,J.,et al.(2005)Expression and cellularprovenance of thymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients withsevere asthma and chronic obstructive pulmonary disease.Journal of Allergyand Clinical Immunology 115,S9.

8.Gounni,A.S.(2007)Constitutive and inducible thymic stromallymphopoietin expression in human airway smooth muscle cells:role in chronicobstructive pulmonary disease.American Journal of Physiology Lung Cellular&Molecular Physiology 293,375-382.

9.Ying,S.,O"Connor,B.,Ratoff,J.,et al.(2005).Thymic stromallymphopoietin expression is increased in asthmatic airways and correlateswith expression of th2-attracting chemokines and disease severity.The Journalof Immunology 174,8183-8190.

10.Kashyap,M.,Rochman,Y.,Spolski,R.,Samsel,L.,et al.(2011)Thymicstromal lymphopoietin is produced by dendritic cells.The Journal ofImmunology 187(3),13-24.

11.Soumelis,V.,Reche,P.A.,Kanzler,H.,et al.(2002)Human epithelialcells trigger dendritic cell mediator allergic inflammation by producingTSLP.Nat Immunol 3,673-680.

12.Watanabe,N.,Hanabuchi,S.,Soumelis,V.,et al.(2004)Human thymicstromal lymphopoietin promotes dendritic cell-mediated CD4+T cell homeostaticexpansion.Nat Immunol 5,426-434.

13.Moon,P.D.,Choi,I.H.,Kim,H.M.(2011)Naringenin suppresses theproduction of thymic stromal lymphopoietin through the blockade of RIP2 andcaspase-1signal cascade in mast cells.European Journal of Pharmacology 671,128-132.

14.Barton,G.M.,Farr,A.G.,et al.(2008)A mechanism for the initiationof allergen-induced T helper type 2responses.Nature Immunology 9(3),310-318.

15.He R,Geha,R.S.(2010)Thymic stromal lymphopoietin.Ann NY Acad Sci1183,13-24.

16.Oyoshi,M.K.,Larson,R.P.,Ziegler,S.F.,et al.(2010)Mechanical injurypolarizes skin dendritic cells to elicit a T(H)2response by inducingcutaneous thymic stromal lymphopoietin expression.Journal of Allergy&ClinicalImmunology 126，976-984；e975.

17.Hai yan Tu,Xin Chen,Jing Li.(2007)Signal transduction inrespiratory syncytial virus infection-induced thymic stromal lymphopoietinexpression in human epithelial cells.Journal of Southern Medical University27(10),1581-1583.

18.Medoff,B.D.,Landry,A.L.,Wittbold,K.A.,et al.(2009)CARMA3 mediateslysophoshatidic acid-stimulated cytokine secretion by bronchial epithelialcells.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2009(40),286-294.

19.Park,L.S.,Martin,U.,Garka,K.,et al.(2000)Cloning of the murinethymic stromal lymphopoietin(TSLP)receptor:formation of a functionalheteromeric complex requires interleukin 7 receptor.The Journal ofExperimental Medicine 192,659–670.

20.Kenneth Verstraete,Frank Peelman,Harald Braun,et al.(2017)Structure and antagonism of the receptor complex mediated by human TSLP inallergy and asthma.Nature Communications 8,14937.

21.GINA Report,Global Strategy for Asthma Management andPrevention.Available from:http://www.ginasthma.com.

22.von Bülow,Anna,Kriegbaum,M.,Backer,V.,et al.(2014)The prevalenceof severe asthma and low asthma control among Danish adults.The Journal ofAllergy and Clinical Immunology:In Practice 2(6),759-673.

23.Reche,P.A.,Soumelis,V.M.,Gorman.D.M.,et al.(2001)Human thyroidstromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells.The Journal ofImmunology 167,336-343.

24.Zhou,B.,Comeau,M.R.,De,S.T.,et al.(2005)Thymic stromallymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice.NatImmunol 6,1047-1053.

25.Zhuang gui Chen,Tian tuo Zhang,Hong tao Li,et al.(2013)Neutralization of TSLP inhibits airway remodeling in a murine model ofallergic asthma induced by chronic exposure to house dust mite.PLoS One 8,e51268.

26.He,R.,Oyoshi,M.K.,Garibyan,L.,et al.(2008).TSLP acts oninfiltrating effector T cells to drive allergic skin inflammation.Proc NatlAcad Sci USA 105(33),11875-11880.

27.Corren,J.,Parnes,J.R.,Wang,L.,et al.(2017)Tezepelumab in Adultswith Uncontrolled Asthma.New England Journal of Medicine 377(10),936-946.

28.Verstraete K,Peelman F,Braun H,et al.2017.Structure and antagonismof the receptor complex mediated by human TSLP in allergy and asthma.NatCommun[J],8:14937.

序列表

<110> 北京智仁美博生物科技有限公司

智翔（上海）医药科技有限公司

重庆智翔金泰生物制药有限公司

<120> 针对人TSLP的多种抗体及其用途

<160> 43

<170> CNIPASequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser

20 25 30

Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu

35 40 45

Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met

85 90 95

Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln

100 105 110

Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu

115 120 125

Lys Gln Gln

130

<210> 2

<211> 63

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

20 25 30

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu

35 40 45

Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

50 55 60

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 3

Tyr Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Thr Ser Ile Thr Lys Ile Tyr Cys

1 5 10 15

Asn Ile Ile Phe His Asp Leu Thr Gly Asp Leu Lys Gly Ala Lys Phe

20 25 30

Glu Gln Ile Glu Asp Cys Glu Ser Lys Pro Ala Cys Leu Leu Lys Ile

35 40 45

Glu Tyr Tyr Thr Leu Asn Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ser Leu Pro Asp

50 55 60

Lys Thr Phe Ala Arg Arg Thr Arg Glu Ala Leu Asn Asp His Cys Pro

65 70 75 80

Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Arg Asn Asp Gly Thr Gln Glu Met Ala Gln

85 90 95

Glu Val Gln Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile Leu Arg Leu

100 105 110

Trp Tyr Ser Phe Met Gln Ser Pro Glu

115 120

<210> 4

<211> 131

<212> PRT

<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)

<400> 4

Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Gln Lys Ile Glu Ala Asp Tyr Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser

20 25 30

Thr Asp Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu

35 40 45

Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Pro Arg Cys Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Arg Lys Thr Lys Ala Thr Leu Ala Leu

65 70 75 80

Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met

85 90 95

Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln

100 105 110

Val Ser Gln Leu Leu Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ile Arg Thr Leu Leu

115 120 125

Lys Lys Gln

130

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser

20 25 30

Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu

35 40 45

Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met

85 90 95

Lys Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln

100 105 110

Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

115 120 125

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Val Thr

20 25 30

Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg

35 40 45

Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

50 55

<210> 7

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Tyr Asp Phe Thr Asn Cys Asp Phe Gln Lys Ile Glu Ala Asp Tyr Leu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Ser Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser

20 25 30

Thr Asp Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu

35 40 45

Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Pro Arg Cys Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Arg Lys Thr Lys Ala Thr Leu Ala Leu

65 70 75 80

Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met

85 90 95

Lys Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu Leu

100 105 110

Gly Leu Trp Arg Arg Phe Ile Arg Thr Leu Leu Lys Lys Gln

115 120 125

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His His His His His His

1 5

<210> 9

<211> 232

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 10

<211> 232

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 10

Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile

20 25 30

Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val

50 55 60

Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp

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Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln

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Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

115 120 125

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu

145 150 155 160

Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr

165 170 175

Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr

195 200 205

Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

210 215 220

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

225 230

<210> 11

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 12

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 13

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 14

<211> 324

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 14

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

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Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

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Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

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Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

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Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

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Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

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Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

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Ser Pro Gly Lys

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<211> 330

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 15

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

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Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

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Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

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Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

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Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

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<210> 16

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<210> 17

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

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Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

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<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 18

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Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

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Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

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<211> 106

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 19

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Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

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Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Asp Tyr Asp Gln Lys Phe Gln

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

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<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu

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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

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Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Trp Ser Glu Gly Gly Thr Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Lys

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Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

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Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp

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Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 40

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

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Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp

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Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 41

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Asp Tyr Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Gly Tyr Tyr Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 42

<211> 209

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

Gln Gly Gly Ala Ala Glu Gly Val Gln Ile Gln Ile Ile Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Leu Glu Thr Val Gln Val Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr

20 25 30

Asn Leu Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gln

35 40 45

Cys Thr Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu

50 55 60

Asp Ala Glu Gln Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly

65 70 75 80

Thr His Pro Val Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Val Tyr Tyr Leu Lys

85 90 95

Pro Ser Ser Pro Lys His Val Arg Phe Ser Trp His Gln Asp Ala Val

100 105 110

Thr Val Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Val

115 120 125

Gln Tyr Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gln Ser Lys Gln Glu Asn

130 135 140

Thr Cys Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser

145 150 155 160

Phe Trp Val Arg Val Lys Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr

165 170 175

Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys Trp Gln Arg Gly Glu Ile

180 185 190

Arg Asp Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser

195 200 205

Lys

<210> 43

<211> 219

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp

1 5 10 15

Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln

20 25 30

His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn

35 40 45

Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn

50 55 60

Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu

65 70 75 80

Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu

85 90 95

Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro

100 105 110

Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val

115 120 125

Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met

130 135 140

His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His

145 150 155 160

Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln

165 170 175

Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr

180 185 190

Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr

195 200 205

Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp

210 215

Claims

1.双特异性抗体，其包含结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)非重叠表位的第一结合片段和第二结合片段，其中

所述第一结合片段包含:

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；以及

所述第二结合片段包含:

如SEQ ID NO:35所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:36所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:37所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中

所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。

6.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中

所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中，

所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；

抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。

7.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中

所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；

抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。

8.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中

所述第一结合片段和所述第二结合片段的形式独立地选自单链抗体(scFv)或者Fab片段。

9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述第一结合片段和所述第二结合片段均为Fab片段。

10.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一结合片段和所述第二结合片段具有相同的轻链可变区。

11.如权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述第一结合片段和所述第二结合片段包含相同的轻链。

12.如权利要求1所述的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:38所示的重链，以及SEQ IDNO:39所示的轻链。

13.如权利要求1所述的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:38所示的重链，以及SEQ IDNO:40所示的轻链。

14.如权利要求1所述的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:41所示的重链，以及SEQ IDNO:39所示的轻链。

15.如权利要求1所述的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:41所示的重链，以及SEQ IDNO:40所示的轻链。

16.结合人TSLP的单克隆抗体，其包含

如SEQ ID NO:29所示的HCDR1，

如SEQ ID NO:30所示的HCDR2，

如SEQ ID NO:31所示的HCDR3，

如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，

如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，和

如SEQ ID NO:34所示的LCDR3；

其中，HCDR和LCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。

17.如权利要求16所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者

18.药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗体、或者权利要求16或17所述的单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

19.权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗体、权利要求16或17所述的单克隆抗体、或者权利要求18所述的药物组合物在制备用于预防或治疗TSLP介导的疾病的药物中的用途，其中所述TSLP介导的疾病选自:哮喘、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿、过敏性肺炎、特应性皮炎、鼻炎、克罗恩病、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。