CN113662953B - 阿糖腺苷在制备抗肿瘤化疗药物的耐药增敏剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了阿糖腺苷在制备抗肿瘤化疗药物的耐药增敏剂中的应用。本发明通过药物媒介将抗病毒药物阿糖腺苷与抗肿瘤药物吉西他滨组合，用于制备新型抗肿瘤组合药物，有效杀伤肿瘤细胞。其中阿糖腺苷是抗肿瘤药物的增敏剂或耐药逆转剂。本发明为有效治疗肿瘤提供新的途径和手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及阿糖腺苷在制备抗肿瘤化疗药物的耐药增敏剂中的应用。
背景技术
胰腺癌恶性程度很高，预后极差，死亡率接近发病率。虽然近几十年来胰腺癌的基础研究和临床诊治不断进步，但其预后并没有得到显著改善，总体5年生存率仍＜10％。根治性手术目前是治疗胰腺癌的最有效方法。但由于胰腺癌早期诊断困难，解剖位置特殊，手术切除率和术后年生存率均非常低下。化疗是胰腺癌综合治疗的重要手段，是手术以外最为有效的选择，对于术前、术后以及无法手术的患者均有重要意义。
吉西他滨(Gemcitabine)的出现使得胰腺癌化疗的临床疗效大有改观，是胰腺癌治疗的一线用药。吉西他滨分子式为C9H11F2N3O4，结构式如下式I所示。
式I
目前，对于需要辅助治疗的胰腺癌患者及失去手术机会的患者以吉西他滨为主的化疗成为首选治疗方案。但是吉西他滨也有很大的缺点，因为其在细胞内的半衰期比较短，所以必须大剂量的持续静脉给药才能维持有效的药用浓度，这种持续的给药会带来了很强的毒副作用，临床表现为水肿、骨髓抑制、肾毒性、胃肠道反应、流感样反应、过敏反应等。这种剂量限制性毒性大大的影响了其临床效用。此外，吉西他滨耐药被认为是大多数胰腺癌化疗效果差的主要原因，克服胰腺癌的吉西他滨耐药性对改善胰腺癌的临床疗效以及延长生存期至关重要。近年来多个临床试验将吉西他滨和其他药物联合治疗胰腺癌，但是效果仍不理想。因此，寻找联合吉西他滨达到更好治疗效果的药物，或保证疗效的情况下降低吉西他滨药用剂量及其毒副作用，改善胰腺癌的总体预后具有重要的临床意义。
阿糖腺苷(Vidarabine)化学名为9-β-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤，分子式为C10H13N5O4，结构式如下式II所示。
式II
阿糖腺苷是一种抗病毒类药物，通过干扰病毒DNA合成的早期阶段发挥作用，安全性高，已经应用于局部或全身抗病毒治疗中。临床上阿糖腺苷常用于治疗免疫抑制病人的带状疱疹和水痘感染，抑制乙肝病毒复制的作用等。目前，尚未有文献报道阿糖腺苷与其他化疗药物联合治疗实体肿瘤。
发明内容
本发明从2800多种小分子抑制剂中筛选出阿糖腺苷对吉西他滨具有显著的增敏效果。吉西他滨和阿糖腺苷都是已经临床应用的药物，两药联用有效杀伤吉西他滨耐药肿瘤细胞，将为临床有效逆转胰腺癌等吉西他滨耐药提供新的有效策略和治疗手段。
阿糖腺苷在制备抗肿瘤化疗药物的耐药增敏剂中的应用。优选的，抗肿瘤化疗药物针对的肿瘤为胰腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、卵巢癌或乳腺癌。更优选的，抗肿瘤化疗药物针对的肿瘤为吉西他滨耐药型肿瘤。优选的，抗肿瘤化疗药物为吉西他滨或其药用盐。优选的，使用时，将阿糖腺苷和抗肿瘤化疗药物联合用药。
本发明又公开了一种抗肿瘤药物组合物，包括抗肿瘤化疗药物和耐药增敏剂，所述耐药增敏剂为阿糖腺苷。优选的，抗肿瘤化疗药物针对的肿瘤为胰腺癌、肺癌、肝癌、胆管癌、卵巢癌或乳腺癌。更优选的，抗肿瘤化疗药物针对的肿瘤为吉西他滨耐药型肿瘤。优选的，抗肿瘤化疗药物为吉西他滨或其药用盐。优选的，使用时，将阿糖腺苷和抗肿瘤化疗药物联合用药。
本发明经研究发现，抗病毒药物阿糖腺苷联合吉西他滨能够有效杀死耐药肿瘤细胞。体外实验选择5μM阿糖腺苷对胰腺癌吉西他滨耐药细胞株BxPC-GEM-20和CFAPC-1的细胞增殖只有较轻抑制作用。吉西他滨单药处理对BxPC-GEM-20细胞的半数致死量浓度(IC50)是234±16nM，而阿糖腺苷(5μM)联合吉西他滨，BxPC-GEM-20细胞对吉西他滨的IC50是8.3±2.6nM，其增敏系数是28.2左右。单用吉西他滨对CFAPC-1细胞的半数致死量(IC50)是68.9±5.1nM。而5μM阿糖腺苷与长春瑞滨联合用药后，吉西他滨对CFAPC-1细胞IC50是6.3±1.2nM，其增敏系数是10.9 左右。动物体内实验结果显示，15mg/kg对阿糖腺苷和25mg/kg吉西他滨单独作用对BxPC-GEM-20异植瘤的抑制率分别为18.9％和20.8％，而两者联合用药的抑制率是77.8％。这表明阿糖腺苷和吉西他滨联合用药，也可以显著增强吉西他滨体内杀伤BxPC-GEM-20异植瘤的作用。此外，本发明发现阿糖腺苷不影响BxPC-GEM-20对甲氨蝶呤、紫杉醇和长春瑞滨等化疗药物的敏感性，提示阿糖腺苷可能特异性增强吉西他滨损伤肿瘤细胞。
本发明通过药物媒介将抗病毒药物阿糖腺苷与抗肿瘤药物吉西他滨组合，用于制备新型抗肿瘤组合药物，有效杀伤肿瘤细胞。其中阿糖腺苷是抗肿瘤药物的增敏剂或耐药逆转剂。本发明为有效治疗肿瘤提供新的途径和手段。
附图说明
图1为胰腺癌耐药株BxPC-GEM-20筛选后的耐药性状检测图，其中A：细胞显微照片；B：MTT检测曲线图；C：IC50比较柱状图。
图2为阿糖腺苷对BxPC-GEM-20和CFAPC-1细胞毒性检测结果图。
图3为阿糖腺苷显著增强吉西他滨对BxPC-GEM-20细胞的体外杀伤作用。其中A：MTT检测曲线图；B：IC50比较柱状图；C：克隆形成比较图。
图4为阿糖腺苷显著增强吉西他滨对CFAPC-1细胞的体外杀伤作用。其中A：MTT检测曲线图；B：IC50比较柱状图；C：克隆形成比较图。
图5为阿糖腺苷显著增强吉西他滨对BxPC-GEM-20异体移植瘤的体内杀伤作用。其中A：治疗后BxPC-GEM-20异体移植瘤实物图；B：各治疗组BxPC-GEM-20异体移植瘤生长曲线图。C ：治疗后BxPC-GEM-20 异体移植瘤重量比较柱状图；
图6为阿糖腺苷分别联合紫杉醇(A)、甲氨蝶呤(B)和长春瑞滨(C) 等化疗药物作用BxPC-GEM-20细胞的MTT检测曲线图。
具体实施方式
实施例1
胰腺癌吉西他滨耐药细胞株BxPC-GEM-20的获取及耐药性状检测。
1、实验材料
原始细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-3。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，100mm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)， MTT(大连美仑)，DMSO(大连美仑)，盐酸吉西他滨(大连美仑)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。
2、实验方法
胰腺癌细胞株BxPC-3分布接种于10cm培养皿，培养24h，加入终浓度为2nM吉西他滨的培养液培养，直到细胞能在2nM吉西他滨培养液正常传代，换终浓度为5nM吉西他滨的培养液培养去除培养液；细胞能在5nM吉西他滨培养液正常传代，换终浓度为10nM吉西他滨的培养液培养去除培养液；细胞能在10nM吉西他滨培养液正常传代，换终浓度为 20nM吉西他滨的培养液培养。当细胞能在20nM吉西他滨培养液正常传代时，命名为BxPC-GEM-20细胞，即为耐药株细胞。
将亲代BxPC-3和耐药株BxPC-GEM-20细胞接种10cm培养皿，72h 后去培养液，0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml 浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每孔总细胞数为4000个；培养24h，加入吉西他滨(处理浓度为0、1、2、5、 10、20、50、100、200、500nM)处理72h，每孔加15μL的MTT(5mg/mL) 孵育3小时后去上清，加入0.2mL DMSO，酶标仪570nM波长检测OD 值，绘制药物处理后细胞活性曲线。
3、实验结果
结果如图1所示，BxPC-3和BxPC-GEM-20对吉西他滨的敏感性不同，处理72h后，亲代BxPC-3细胞的IC50是6.3±1.5nM，吉西他滨耐药株 BxPC-GEM-20的IC50是是92.7±34.5nM。这说明BxPC-GEM-20相对亲代BxPC-3细胞更加耐受吉西他滨，耐药系数大概为14.8倍。此外，委托中国典型培养物保藏中心对BxPC-3和BxPC-GEM-20进行STR测序，表明两者是同源的，没有其他细胞交叉污染。
实施例2
阿糖腺苷对BxPC-GEM-20和CFAPC-1细胞毒性检测，以选择无明显细胞毒性的安全浓度用于联合给药。
1、实验材料
细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-GEM-20和CFAPC-1(购买自中国典型微生物保藏中心)。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，100mm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)， MTT(大连美仑)，DMSO(大连美仑)，阿糖腺苷(大连美仑)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。
2、实验方法
胰腺癌细胞株BxPC-GEM-20和CFAPC-1分布接种于10cm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000 个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每孔总细胞数为4000个；培养24h，加入阿糖腺苷(处理浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μM)处理72h，每孔加15μL的MTT(5 mg/mL)孵育3小时后去上清，加入0.2mL DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。
3、实验结果
结果如图2所示，5μM的阿糖腺苷处理72h后，BxPC-GEM-20和 CFAPC-1细胞的存活率均大于80％。这说明阿糖腺苷低于5μM时，处理 72h对BxPC-GEM-20和CFAPC-1细胞没有明显的杀伤作用。本发明体外实验选择5μM的阿糖腺苷作为增敏剂的安全作用浓度，与吉西他滨联合用药，检测阿糖腺苷对吉西他滨的增敏作用。
实施例3
阿糖腺苷显著增强吉西他滨对BxPC-GEM-20细胞的杀伤作用。
1、实验材料
细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-GEM-20。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，60mm培养皿(Corning)，100mm培养皿(Corning)， 96孔板(BD)，MTT(sigma)，DMSO(大连美仑)，阿糖腺苷(大连美仑)，盐酸吉西他滨(大连美仑)，结晶紫染色液(碧云天)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪等。
2、实验方法
BxPC-GEM-20细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液； 0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，在96孔板的第2-11列，第2-7行区域分别每孔接种0.2ml单细胞悬液，每孔总细胞数为4000个；培养24h，96孔板的第2-11列有细胞的每孔都分别依次加入最终浓度为0、5、10、20、50、100、200、500、1000、 2000nM的吉西他滨，同时第5、6、7行有细胞的每孔都分别加入5μM的阿糖腺苷，共处理处理72h，每孔加15μL的MTT(5mg/mL)孵育3小时后去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值，绘制药物作用曲线，并计算半数致死量(IC50)。
BxPC-GEM-20细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液； 0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制1000个/ml浓度的单细胞悬液，分别接种5ml细胞悬液至4个6mm培养皿中，培养24小时后，按以下4种给药方式处理：1)对照，2)5μM阿糖腺苷单独处理，3)20nM吉西他滨单独处理，4)5μM阿糖腺苷和20nM吉西他滨联合处理。5天后去上清，进行结晶紫染色，并拍照比较。
3、实验结果
结果见图3A和3B所示，单用吉西他滨对BxPC-GEM-20细胞的半数致死量(IC50)是234±16nM。而5μM阿糖腺苷与长春瑞滨联合用药后，吉西他滨对BxPC-GEM-20细胞IC50是8.3±2.6nM，其逆转系数是28.2 左右。图3C所示，体外实验选择5μM阿糖腺苷和20nM吉西他滨单独处理对胰腺癌BxPC-GEM-20细胞的克隆形成几乎没有抑制作用，但两者联用胰腺癌BxPC-GEM-20细胞几乎无法形成克隆。这些数据证明5μM阿糖腺苷和20nM吉西他滨联合用药，可以显著增强吉西他滨对 BxPC-GEM-20细胞的杀伤作用。
实施例4
阿糖腺苷显著增强吉西他滨对CFAPC-1细胞的杀伤作用。
1、实验材料
细胞株：胰腺癌细胞株CFAPC-1。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，60mm培养皿(Corning)，100mm培养皿(Corning)， 96孔板(BD)，MTT(sigma)，DMSO(大连美仑)，阿糖腺苷(大连美仑)，盐酸吉西他滨(大连美仑)，结晶紫染色液(碧云天)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪等。
2、实验方法
CFAPC-1细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，在96孔板的第2-11列，第2-7行区域分别每孔接种0.2ml单细胞悬液，每孔总细胞数为4000个；培养24h，第2-11列有细胞的每孔都分别依次加入最终浓度为0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nM的吉西他滨，同时第5、6、7行有细胞的每孔都分别加入5μM的阿糖腺苷，共处理处理72h，每孔加15μL的MTT(5mg/mL)孵育3小时后去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值，绘制药物作用曲线，并计算半数致死量(IC50)。
CFAPC-1细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制1000个/ml浓度的单细胞悬液，分别接种5ml细胞悬液至4个6mm培养皿中，培养24小时后，按以下4种给药方式处理：1)对照，2)5μM阿糖腺苷单独处理，3)20nM吉西他滨单独处理，4)5μM阿糖腺苷和20nM吉西他滨联合处理。5天后去上清，进行结晶紫染色，并拍照比较。
3、实验结果
结果如图4A和4B所示，单用吉西他滨对CFAPC-1细胞的半数致死量(IC50)是68.9±5.1nM。而5μM阿糖腺苷与长春瑞滨联合用药后，吉西他滨对CFAPC-1细胞IC50是6.3±1.2nM，其逆转系数是10.9左右。如图4C所示，体外实验选择5μM阿糖腺苷和20nM吉西他滨单独处理对胰腺癌CFAPC-1细胞的克隆形成几乎没有抑制作用，但两者联用胰腺癌 CFAPC-1细胞几乎无法形成克隆。这些数据证明5μM阿糖腺苷和20nM 吉西他滨联合用药，可以显著增强吉西他滨对CFAPC-1细胞的杀伤作用。
实施例5
阿糖腺苷显著增强吉西他滨对BxPC-GEM-20细胞在体内的杀伤作用。
1、实验材料
细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-GEM-20。
实验动物：4-5周龄无胸腺裸鼠(浙江大学动物房)。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，100mm培养皿(Corning)，阿糖腺苷(大连美仑)，盐酸吉西他滨(大连美仑)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台等。
2、实验方法
BxPC-GEM-20接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液； 0.25％胰酶消化，用生理盐水收集细胞，并调节浓度至1×107/ml，将细胞注入无胸腺裸鼠双侧腋下。注入后1天，随机分为4组，采用不同的治疗方案：(1)空白对照组(CTL组)；(2)单独使用阿糖腺苷，15mg/kg，尾静脉注射(VDB组)；(3)单用吉西他滨组，按照25mg/kg，尾静脉注射(GEM组)；(4)阿糖腺苷与吉西他滨联合用，尾静脉注射(V+G 组)。每3天重复一次，共6个周期。每3天测量肿瘤直径(宽度和长度) 和小鼠体重，直到动物被处死。动物处死后，切除肿瘤组织并称重。
3、实验结果
结果见图5，体内实验15mg/kg阿糖腺苷和25mg/kg的吉西他滨对 BxPC-GEM-20异植瘤生长的抑制作用有限。其中25mg/kg吉西他滨单独作用对BxPC-GEM-20异植瘤的抑制率为20.8％，而15mg/kg阿糖腺苷和 25mg/kg的吉西他滨联合用药的抑制率是77.8％。这些数据证明阿糖腺苷和吉西他滨联合用药，可以显著增强吉西他滨对BxPC-GEM-20异植瘤的体内杀伤作用。
实施例6
阿糖腺苷不能显著增强紫杉醇、甲氨蝶呤、长春瑞滨对 BxPC-GEM-20细胞的杀伤作用。
1、实验材料
细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-GEM-20。
试剂耗材：RPMI-1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(Hyclone)，100mm培养皿(Corning)，96孔板(BD)，MTT (sigma)，DMSO(上海国药)，阿糖腺苷(大连美仑)，紫杉醇(大连美仑)，甲氨蝶呤(大连美仑)，长春瑞滨(大连美仑)。
仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。
2、实验方法
BxPC-GEM-20细胞接种于100mm培养皿，培养72h，去除培养液； 0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，在96孔板的第2-11列，第2-7行区域分别每孔接种0.2ml单细胞悬液，每孔总细胞数为4000个；培养24h，第2-11列有细胞的每孔都分别依次加入最终浓度为0、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100nM的紫杉醇，或者最终浓度为0、1、5、10、20、50、100、200、500nM的甲氨蝶呤，或者最终浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50nM的长春瑞滨，同时第5、6、7行有细胞的每孔都分别加入5μM的阿糖腺苷，共处理处理72h，每孔加15μL的MTT(5mg/mL)孵育3小时后去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值，绘制药物作用曲线，并计算半数致死量(IC50)。
3、实验结果
结果如图6所示，5μM的阿糖腺苷分别与紫杉醇、甲氨蝶呤、长春瑞滨等化疗药联用，并不能有效增强紫杉醇、甲氨蝶呤和长春瑞滨等药物对胰腺癌细胞BxPC-GEM-20的杀伤作用。通过计算半数致死量发现，单用紫杉醇、甲氨蝶呤、长春瑞滨对BxPC-GEM-20细胞的半数致死量 (IC50)分别是11±1.3nM，176±19.4nM，9.6±1.3nM。紫杉醇、甲氨蝶呤、长春瑞滨与阿糖腺苷联合用药后对BxPC-GEM-20细胞的半数致死量 (IC50)分别是13.9±1.9nM，146.4±9.3nM，8.9±1.7nM。这些数据证明5 μM的阿糖腺苷分别与紫杉醇、甲氨蝶呤、长春瑞滨等化疗药联用，不能显著降低IC50浓度，无法有效增强这三种化疗药物对BxPC-GEM-20细胞的杀伤作用。
Claims (1)
1.阿糖腺苷在制备抗肿瘤化疗药物的耐药增敏剂中的应用，抗肿瘤化疗药物针对的肿瘤为吉西他滨耐药型胰腺癌，抗肿瘤化疗药物为吉西他滨或其药用盐，使用时，将阿糖腺苷和抗肿瘤化疗药物联合用药。
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