CN113677802A - 产生细菌来源的吲哚-3-丙酸的方法以及包含其的组合物 - Google Patents

Abstract

本文描述了经由细菌发酵产生吲哚‑3‑丙酸和其他吲哚衍生物的方法及其组合物。该方法包括将具有与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列的细菌产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)ATCC15579添加到液体发酵培养基中；在厌氧条件下于约36℃发酵；添加脱水剂；以及脱水以获得包含吲哚‑3‑丙酸和其他吲哚衍生物的发酵物粉末。

Description

产生细菌来源的吲哚-3-丙酸的方法以及包含其的组合物

技术领域

本文描述了产生细菌来源的吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的方法。本文还描述了包含吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的组合物，所述其他吲哚衍生物可有助于支持大脑健康和/或神经系统功能。

背景技术

遵循良好的营养实践可能具有挑战性。一些人寻求补充剂以提供额外的营养物质来改善他(她)们的健康与幸福，包括维持健康的大脑功能。大脑因高耗氧速率、高含量的多不饱和脂肪酸和局部高铁水平以及成比例的低抗氧化能力而特别易受氧化应激反应影响。已知氧化应激反应可导致神经形成减少和神经元死亡增多。已证实，认知损害与氧化应激反应有关，并且有效的抗氧化体系可保持老年人的认知功能。

吲哚-3-丙酸(“IPA”)是神经保护性抗氧化剂，其可改善人类的心境、认知和/或维持人类健康的大脑功能和神经系统。IPA由结肠中的肠道菌群生成，并且穿过肠上皮和血脑屏障进入大脑。在大脑中，已证实IPA起到作为抗氧化剂的保护作用，从而保护神经元的结构和功能。据信IPA的抗氧化特性可在促进大脑健康中起关键作用。众所周知的是，口服IPA可原位增大IPA水平(参见Kaufmann SHE，2018.“Indole propionic acid:a smallmolecule links between gut microbiota and tuberculosis”，Antimicrob AgentsChemother，第62卷，第e00389-18页；Niebler G，NCT01898884：“Safety and PharmacologyStudy of VP 20629 in Adults With Friedreich's Ataxia”，2018年)。

尽管越来越多的人认识到IPA对大脑健康的有益效果，但IPA仅以化学合成形式商业生产。然而，越来越多的消费者对产品成分(包括它们的来源)感兴趣，且更喜欢来自天然来源的补充剂。这些寻求天然营养来源的消费者可能不喜欢直接摄入化学合成的IPA。此外，除了IPA，其他吲哚衍生物诸如吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙烯酸和吲哚-3-乳酸也因提供积极的健康有益效果而出现。然而，化学合成形式的IPA仅递送纯IPA。

因此，需要一种提供吲哚衍生物的组合的天然来源的方法，以便促进大脑健康和/或神经系统功能，在该吲哚衍生物的组合中IPA是主要组分。

发明内容

本文描述了组合物，所述组合物包含：(a)发酵物，所述发酵物包含细菌来源的吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物；以及(b)赋形剂、载体和/或稀释剂。

本文描述了产生吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的方法，所述方法包括：(a)将具有与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列的细菌添加到液体发酵培养基中以形成细菌溶液；(b)在厌氧条件下于约36℃发酵所述细菌溶液；(c)添加脱水剂；以及(d)脱水以获得包含吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的发酵物粉末。

本文描述了组合物，所述组合物包含：发酵物，所述发酵物包含细菌来源的吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物；以及赋形剂、载体和/或稀释剂；其中所述发酵物通过包括以下步骤的方法获得：(a)将具有与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列的细菌添加到液体发酵培养基中以形成细菌溶液；(b)在厌氧条件下于约36℃发酵所述细菌溶液；(c)添加脱水剂；以及(d)脱水以获得所述发酵物。

本文描述了一种通过施用组合物向大脑递送抗氧化营养物质来促进大脑健康的方法，所述组合物包含：(a)发酵物，所述发酵物包含细菌来源的吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物；以及(b)赋形剂、载体和/或稀释剂。

具体实施方式

消费者正在寻找用IPA补充他(她)们的饮食以促进大脑和心理健康的有效且天然的方式。本文描述了通过细菌发酵产生IPA和其他吲哚衍生物的方法及其组合物。已发现，在色氨酸和其他组分诸如氨基酸、维生素和痕量金属的存在下的细菌发酵可产生天然来源的IPA和其他吲哚衍生物，其可干燥成发酵物粉末，而不会不利地影响IPA或其他吲哚衍生物的稳定性。如本文所用，“其他吲哚衍生物”是指色氨酸衍生的吲哚代谢物，包括吲哚-3-丙烯酸、吲哚-3-乳酸和吲哚-3-乙酸。

如本文所用，术语“施用”、“施予”和“施以”是指在可靠的医学实践中以提供治疗效果的方式向受试者递送组合物的任何方法。

如本文所用，“厌氧条件”是指排除氧气的存在(例如，小于约1ppm游离氧，优选地小于约0.1ppm游离氧，更优选地约0至约1ppm游离氧)的任何生长或营养条件。

如本文所用，缩写“CFU”(“菌落形成单位数”)是指通过琼脂板上的微生物计数表示的细菌细胞的数量，如本领域通常所理解的。

如本文所用，“发酵”是指微生物代谢原料的过程。

如本文所用，“发酵物”是指有或没有事先移除细菌而从发酵培养基中移除水后的分离固体。

术语“微生物”和“微生物体”在本文中可互换使用，均指细菌。术语“菌群”、“微生物群”和“微生物群体”在本文中可互换使用，并且可指生活在受试者身体上或身体内的微生物生态群落。菌群可存在于受试者的很多部分(如果不是大部分的话)之上或之中。菌群的栖息地的一些非限制性示例可包括：身体表面、体腔、体液、肠道、结肠、皮肤表面和毛孔、阴道腔、脐部区域、结膜区域、肠区域、胃、鼻腔和鼻道、胃肠道、泌尿生殖道、唾液、粘液和粪便。

如本文所用，术语“益生元”是指可影响受试者或宿主中微生物的生长和/或活性(例如，可允许菌群的组成和/或活性的特定变化)并且可赋予受试者健康有益效果的化学品和/或成分。

如本文所用，术语“益生菌”可意指一种或多种活微生物(例如，细菌或酵母)，该一种或多种活微生物在适当施用时可赋予受试者健康有益效果。如本文所用，“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸以及它们的片段或部分，并且是指基因组来源或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的并且表示有义链或反义链。核酸序列可由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶(A、T、C、G和U)以及修饰形式(例如N6-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶等)组成。

术语“受试者”是指任何动物受试者，包括人、实验室动物、牲畜和家养宠物。

如本文所用，冠词“一个”和“一种”被理解为受权利要求书保护的或描述的一种或多种材料，例如，“活性成分”或“益生菌”。

组合物可含有、由或基本上由下列因素组成：本文所述的本发明的基本要素和限制，以及本文所述或可用于旨在供受试者使用或食用的组合物中的任何附加或任选成分、组分或限制。

产生IPA和其他吲哚衍生物的方法可包括以下步骤：

a.将能够产生IPA和其他吲哚衍生物的细菌添加到液体发酵培养基中以形成细菌溶液；

b.在厌氧条件下发酵所述细菌溶液以形成发酵的细菌溶液；

c.终止发酵；

d.任选地通过降低水含量(例如，通过反渗透、盘式干燥、微量过滤、纳米过滤、以及它们的组合)来浓缩细菌溶液；

e.添加脱水剂；以及

f.脱水以获得包含吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的发酵物粉末。

能够产生IPA和其他吲哚衍生物的细菌包括例如产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、尸毒梭状芽胞杆菌(Clostridium cadaveris)、粗体梭状芽胞杆菌(Clostridium boltae)、以及任何其他细菌，所述任何其他细菌具有与编码苯乳酸脱水酶基因簇(fldL、fldI和fldABC)的SEQ ID NO:1(表1)的核酸序列基本上同源的核酸序列。

表1—DNA序列

细菌包含与其他细菌具有特定程度的同源性或同一性的核酸序列。如本文所用，术语“同一性”、“同源性”和“同源”是指与其他核苷酸序列互补或共有相似性的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，相同序列)。与核酸序列部分互补(即“基本上同源”或“基本上相同”)的核苷酸序列是至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的序列。

在一些方面，细菌可包含的核酸序列与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％，至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同源性或同一性。

在一些方面，包含SEQ ID NO:1的核酸序列的细菌可以是益生菌或益生菌细菌。

细菌需要发酵培养基，在发酵培养基中发酵并产生IPA及其衍生物。发酵培养基可以是能够允许微生物生长和发酵的任何合适的培养基。在一些方面，发酵培养基可以是标准的氨基酸完全培养基。在一些方面，发酵培养基可包含水、氨基酸组合物、维生素、盐和矿物质。在一些方面，发酵培养基可包含水、氨基酸组合物、维生素、盐、碳水化合物和矿物质。

在一些方面，氨基酸组合物可包含一种或多种氨基酸。氨基酸的非限制性示例可包括谷氨酰胺、赖氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及它们的组合。氨基酸应包括适用于IPA产生的那些。可使用的氨基酸化合物的示例包括半胱氨酸盐酸盐、L-甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。氨基酸的量将根据期望产生的IPA的量而变化。在一些方面，发酵培养基可包含约8至约10,000μg/mL，另选地约10至约8,000μg/mL，另选地约25至约5,000μg/mL，另选地约50至约1,000μg/mL，另选地约100至约500μg/mL的氨基酸。

在一些方面，其他氨基酸与色氨酸的比率应大于1:1。据信，其他氨基酸应以大于色氨酸浓度的浓度存在，以便提高IPA和其他吲哚衍生物的收率。

在一些方面，发酵培养基可包含一种或多种盐。可将盐添加到发酵培养基中以改善细菌的活力和/或可增加IPA和其他吲哚衍生物的收率。盐的非限制性示例可包括碳酸钙、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、碳酸氢钠、以及它们的组合。添加到发酵培养基中的盐的量应足以获得改善活力和/或增加IPA及其衍生物收率的所需结果。在一些方面，发酵培养基可包含约10至约5,000mg/L，另选地约20至约1,000mg/L，另选地约50至约800mg/L，另选地约75至约500mg/L的盐。

在一些方面，发酵培养基可包含碳水化合物。碳水化合物可包括多糖、低聚糖、二糖、单糖以及它们的组合。合适的碳水化合物的非限制性示例可包括麦芽糖、阿拉伯树胶和葡萄糖。在一些方面，发酵培养基可包含约2至约40mM，另选地约5至约30mM，另选地约10至约25mM的碳水化合物。

在一些方面，发酵培养基可包含一种或多种维生素。维生素的非限制性示例可包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12以及它们的组合。在一些方面，发酵培养基可包含维生素溶液，诸如Wolfe's维生素溶液或维生素补充剂

MD-VS^TM(可从ATCC(Manassas，VA)商购获得)。

在一些方面，发酵培养基还可包含一种或多种痕量元素，诸如锌、锰和镍。在一些方面，发酵培养基可包含痕量元素溶液，诸如Wolfe’s矿物质溶液或痕量矿物质补充剂

MD-TMS^TM(可从ATCC(Manassas，VA)商购获得)。

发酵培养基可具有约5至约8，另选地约5.5至约7.5，另选地约6至约7的pH。不受理论的限制，据信可选择pH以增加IPA及其衍生物的收率。

发酵培养基可通过本领域已知的任何方法制备。

可将细菌厌氧添加到发酵培养基中以形成细菌溶液。添加到发酵培养基中的细菌的CFU数可根据所用细菌的类型和期望产生的IPA的量而变化。在一些方面，发酵可在介于1E3至约1E9CFU/mL之间，优选1E5至约1E8CFU/mL，更优选约1E8CFU/mL发酵培养基的初始细胞浓度下进行。

可将细菌溶液维持在允许细菌最佳生长的条件下。例如，细菌溶液可在厌氧条件下保持在约25℃至约45℃，优选约30℃至约40℃，更优选约36℃的温度下。

在一些方面，应允许细菌发酵足够的时间段以产生所需量的IPA及其衍生物。在一些方面，细菌溶液在厌氧条件下于约36℃温育约24至约48小时，另选地约2小时至约72小时，另选地约4小时至约48小时，另选地约8小时至约36小时，另选地约12小时至约36小时。

在一些方面，发酵可通过一个或多个工艺步骤结束，在一个或多个工艺步骤中使细菌失活或物理移除。可通过加热(通常在约65℃至约93℃之间的温度下加热30分钟至3小时)或通过用蛋白水解酶诸如木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶处理使细菌失活。作为另外一种选择，可将发酵的细菌溶液离心以形成细菌沉淀物和上清液，并可弃去细菌沉淀物，留下含有IPA和其他吲哚衍生物的上清液，可将该上清液脱水以形成发酵物。作为另外一种选择，可使发酵的细菌溶液通过膜过滤器以移除细菌。

在一些方面，溶液可在发酵之后均质化以便形成更均匀的产物。均质化的方法是本领域已知的，并且可例如通过均质化泵、剪切泵或共混机执行。优选的是，在发酵之后将溶液脱水。用于将溶液脱水的方法是本领域熟知的，并且可包括冷冻干燥、喷雾干燥、露天干燥、喷雾制粒和转鼓式干燥。优选的脱水方法是喷雾干燥或冷冻干燥。

任选地，在脱水之前，发酵的细菌溶液中的残余水含量可通过例如反渗透、盘式干燥、微量过滤和/或纳米过滤的组合而显著降低。反渗透、盘式干燥、微量过滤和纳米过滤的方法可使用本领域熟知的方法和设备进行。

冷冻干燥可使用本领域熟知的方法进行。具体地讲，冷冻干燥过程可由热处理步骤和随后的干燥步骤组成。在热处理步骤中，可将小瓶在约20℃下保持约30分钟，然后在约0℃下保持约80分钟，然后在约-25℃下保持约60分钟。冷冻可在约-25℃(约-50℃的冷凝器)和约200毫托的真空下进行。在干燥步骤中，可将小瓶在约-25℃和约200毫托下保持总共约1800分钟，然后可将温度升至约4℃，并且将小瓶在约4℃和约200毫托下保持约60分钟。

喷雾干燥可使用本领域熟知的方法和设备进行。优选使用喷雾干燥器，诸如购自Büchi Labortechnik AG(Flawil,Switzerland)的Büchi Mini Spray Dryer B-191或等同物。喷雾干燥器可在入口温度为约185℃的情况下运行，并且供干燥器进料的泵的流速可被设定为实现约100℃的出口温度。喷雾干燥器单元可用双流体雾化器操作。喷雾器可将液体进料递送到干燥器中。气流速率可被设定为约35立方米/小时的体积流量。

在脱水之前，可将脱水剂添加到溶液中以有利于干燥和/或改善稳定性。在一些方面，脱水剂可以为冷冻保护剂，诸如肌醇、山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、玉米糖浆、DMSO、所有类型的淀粉和/或改性淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、麦芽糖或其他单糖和二糖以及它们的组合。脱水剂可以适于促进干燥的任何含量使用，例如约2至约10重量％，另选地约3至约8重量％，另选地约4至约6重量％。优选地，脱水剂为改性淀粉，诸如来源于蜡质玉米的

100改性食物淀粉(可从Ingredion(Westchester,IL)商购获得)。

可以将溶液脱水至残余水含量小于约15重量％，另选地小于约10重量％，另选地小于约5重量％。作为另外一种选择，并且尤其是当残余水含量大于约5重量％时，可包含附加试剂，该附加试剂将水活度降低至等于或小于约0.75，另选地等于或小于约0.7，另选地等于或小于约0.65，另选地等于或小于约0.55，另选地等于或小于约0.40的值。

在脱水之后，形成包含IPA及其衍生物的粉末发酵物，然后可将该粉末发酵物掺入剂型或适于施用的其他形式中。

本文还描述了一种包含发酵物和生理上、药学上或营养上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂的组合物，所述发酵物包含细菌来源的IPA和其他吲哚衍生物。在一些方面，该组合物可包含与细菌来源的IPA和其他吲哚衍生物组合的一种或多种细菌菌株或菌种。在一些方面，发酵物还可包含色氨酸。

组合物可包含发酵物。发酵物可通过上述方法获得。在一些方面，发酵物可包含IPA、其他吲哚衍生物和色氨酸。在一些方面，发酵物可任选地包含非活性细菌，该非活性细菌具有与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列；

在一些方面，组合物可包含约1mg至约2g、另选地约10mg至约1.5g、另选地约25mg至约1g的发酵物。在一些方面，组合物可包含约1mg至约500mg、另选地约15mg至约250mg、另选地约50mg至约150mg的发酵物。

在一个方面，组合物可包含约0.01％至约90％、另选地约0.1％至约85％、另选地约1％至约80％、另选地约2.5％至约75％、另选地约5％至约60％、另选地约10％至约50％、另选地约15％至约25％的发酵物，所有百分比均按组合物的重量计。

在一些方面，组合物可包含约1×E3CFU/g发酵物至约1×E13CFU/g发酵物的细菌。

在一些方面，组合物可包含约0.1mg至约20mg、另选地约1mg至约8mg、另选地约2mg至约6mg的IPA。在一些方面，组合物可包含约0.01％至约10％、另选地约1％至约8％、另选地约2％至约6％的IPA，所有百分比均按组合物的重量计。

在一些方面，组合物可包含约0.1mg/g至约20mg/g，另选地约1mg/g至约8mg/g，另选地约2mg/g至约6mg/g的IPA。

在一些方面，组合物可包含约0.01mg至约10mg、另选地约0.1mg至约8mg、另选地约1mg至约6mg的其他吲哚衍生物。在一些方面，组合物可包含约0.01％至约10％、另选地约1％至约8％、另选地约2％至约6％的其他吲哚衍生物，所有百分比均按组合物的重量计。

在一些方面，组合物可包含约0.01mg至约10mg、另选地约0.1mg至约8mg、另选地约1mg至约5mg的色氨酸。在一些方面，组合物可包含约0.1％至约10％、另选地约1％至约8％、另选地约2％至约5％的色氨酸，所有百分比均按组合物的重量计。

在一些方面，发酵物可包含约0.1mg/g至约0.5mg/g，优选0.2mg/g的色氨酸。

在一些方面，发酵物可包含葡萄糖。发酵物中存在的葡萄糖的量可取决于发酵反应何时终止(这继而将是细菌生长期的函数)和IPA收率。

在一些方面，组合物可包含一种或多种细菌。在一些方面，一种或多种细菌可为益生菌。合适的益生菌可包括双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、二乙酰乳酸链球菌(Streptococcus diacetylactis)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentii)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)以及它们的组合。

在一些方面，所述一种或多种细菌可包括产芽胞梭状芽胞杆菌(C.sporogenes)。在一些方面，产芽胞梭状芽胞杆菌可以是非活性的。

在一些方面，一种或多种细菌是婴儿双歧杆菌，特别是婴儿双歧杆菌35624。

在一些方面，组合物可包含赋形剂、载体和/或稀释剂。营养上可接受的赋形剂、载体或稀释剂包括但不限于适于供人类或动物食用的那些，以及标准用于食品行业的那些。典型的营养上可接受的赋形剂、载体或稀释剂是本领域技术人员所熟悉的。

在一些方面，用于本文所述的各种不同组合物的此类合适赋形剂的示例可见于由A Wade和P J Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”(第2版，1994年)。在一些方面，可接受的载体或稀释剂描述于例如“Remington's PharmaceuticalSciences”(Mack Publishing Co.，A.R.Gennaro编辑，1985年)中。此类合适的载体包括但不限于乳糖、甲基纤维素、硬脂酸镁等。此类合适的稀释剂包括但不限于水、乙醇和甘油。

药物赋形剂、载体或稀释剂的选择根据预期的给药途径和标准药物或营养实践来选择。在一些方面，除了赋形剂、载体或稀释剂之外，此类组合物还可包含附加成分。此类附加成分包括但不限于任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、防腐剂、染料、调味剂和/或悬浮剂。

合适的粘结剂的示例包括但不限于淀粉、明胶、以及天然糖。此类天然糖包括但不限于葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂，以及天然和/或合成树胶诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的示例包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。在一些方面，防腐剂、稳定剂、染料和调味剂也在组合物中提供。防腐剂的示例包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸、和对羟基苯甲酸的酯。在一些方面，悬浮剂也可存在于组合物中。

在一些方面，组合物可任选地包含一种或多种活性成分。活性成分的非限制性示例可包括维生素、矿物质、益生元、聚糖(例如，作为将限制特定细菌/病毒与肠壁结合的诱饵)、褪黑激素以及它们的组合。维生素的非限制性示例可包括维生素C、维生素D、维生素E、维生素K1、维生素K3、维生素B1、维生素B3、叶酸、维生素B12、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B7和泛酸(维生素B5)。矿物质的非限制性示例可包括钙、硒、镁、铁、碘化物、锌、铜、锰、铬、钼、β-胡萝卜素以及它们的组合。

如本文所用，术语“益生元”可为通用术语，是指可影响受试者或宿主中微生物的生长和/或活性(例如，可允许菌群的组成和/或活性的特定变化)并且可赋予受试者健康有益效果的化学品和/或成分。益生元包括但不限于络合碳水化合物、络合糖、抗性糊精、抗性淀粉、氨基酸、肽、营养化合物、生物素、聚右旋糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、菊粉、木质素、车前子、甲壳质、脱乙酰壳多糖、树胶(例如瓜尔胶)、高直链玉米淀粉(HAS)、纤维素、β-葡聚糖、半纤维素、乳果糖、甘露低聚糖、甘露寡糖(MOS)、富含低聚果糖的菊粉、低聚果糖、低聚右旋糖、塔格糖、反式低聚半乳糖、果胶和低聚木糖(XOS)。诸如这些的益生元底物改善细菌在体内的定植和存活。在一些方面，益生元例如在结肠中选择性地发酵。

在各个方面，益生元存在于食品(例如，阿拉伯树胶、瓜尔胶种子、糙米、米糠、大麦壳、菊苣根、洋姜、蒲公英叶、大蒜、韭葱、洋葱、芦笋、麦麸、燕麦麸、烘焙豆类、全小麦粉、香蕉)和母乳中。在一些方面，益生元以其他形式(例如，胶囊或饮食补充剂)施用。

取决于具体的活性成分，活性成分的含量可高于、低于和/或等于每日营养推荐量(“RDA”)。许多营养化合物的示例性RDA值在21CFR101中列出，并且另外的RDA值也由美国国家科学院医学研究所(Institute of Medicine of the National Academy of Science)公布。

在一些方面，活性成分以相对于组合物的总重量计约0.01重量％至约50重量％的量存在。在一些方面，活性成分可以约0.1重量％至约40重量％、另选地约1重量％至约30重量％、另选地约3重量％至约25重量％、另选地约5重量％至约20重量％的量存在。在一些方面，活性成分以约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％或50％的量存在。

组合物可任选地包含一种或多种草本成分。草本成分的非限制性示例可包括迷迭香(叶)、生姜、柠檬香脂、绿茶、圣罗勒、牛至、百里香、南非醉茄、假马齿苋以及它们的组合。在一些方面，组合物包含南非醉茄。在一些方面，草本成分可为全草本或植物部分、提取物、粉末、浓缩物或它们的组合。在一些方面，草本成分可为超临界提取物和/或水醇提取物。如本文所用，术语“超临界提取”是指其中可利用超临界流体从样品中提取疏水性化合物的技术。超临界流体的溶剂化能力随着压力和温度增加至其临界点以上而增强，从而产生用于分离疏水性分子的有效溶剂。在一些方面，可使用本领域技术人员已知的方法将草本成分发酵。特别合适的发酵方法在美国专利6,806,069中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文。发酵的草本成分可通过下列方式来制备：收集草本发酵液的上清液并通过本领域任何已知的方法诸如喷雾干燥将混合物干燥。培养基可含有选自以下物质的成分：研磨的有机大豆、酿酒酵母(有机酵母：活性和非活性的)、有机麦芽糖糊精、有机阿拉伯树胶、有机橘皮、有机柠檬皮、有机胡萝卜粉末、有机苜蓿粉末、乳酸杆菌(Lactobacilli)(嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、双叉乳杆菌(L.bifidus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus))和酶(灭活的)以及它们的组合。发酵的草本成分可含有来自培养基的所有或一些成分。

在一些方面，组合物可包含约0.1％至约10％、另选地约1％至约8％、另选地约2％至约6％的该一种或多种草本成分，所有百分比均按组合物的重量计。

在一些方面，组合物可基本上不含抑制IPA产生的维生素、矿物质和/或草本植物。在一些方面，组合物可基本上不含维生素B2、硒和/或维生素B6。如本文所用，“基本上不含”意指包含按组合物的重量计小于约0.1％、另选地小于约0.05％、另选地小于约0.01％、另选地小于约0.001％。

组合物可为本领域已知的任何剂型。剂型的一些非限制性示例可包括局部用剂型、胶囊、丸剂或片剂、软糖、软咀嚼剂、抛光咀嚼剂、小药囊、凝胶、液体、用于重构的散装粉末或由散装粉末制备的饮料等。在一些方面，可将组合物掺入食品和/或饮料的形式中。可掺有组合物的食品和饮料的非限制性示例可包括棒条、奶昔、果汁、饮料、冷冻食物产品、发酵食物产品和培养的乳制品(诸如酸奶、酸奶饮料、奶酪、乳酸菌饮料和开菲尔)。

在一些方面，组合物可为饮食补充剂或药物组合物的形式。如本文所用，术语“饮食补充剂”是指旨在补充食品和水的饮食的组合物，其中该饮食足以维持生命。

在一些方面，组合物可包含有效向受试者提供健康有益效果的量的该一种或多种益生菌和发酵物。在一些方面，有效量是治疗有效量。

在一些方面，组合物可被配制成使得存在于组合物中的该一种或多种细菌一旦被递送到目标栖息地(例如，肠道)就可复制。在一个非限制性示例中，组合物被配制成丸剂、粉末、胶囊、片剂、包肠溶衣剂型或包装，使得组合物具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个月的储存寿命。在一些方面，将其他组分添加到组合物中以有助于组合物的储存寿命。在一些方面，一种或多种细菌可以允许在非天然环境中存活的方式配制。例如，肠道原生的细菌可能不会在富氧环境中存活。为了克服这种限制，细菌可配制在可减少或消除暴露于氧气的丸剂或包装中。用以延长细菌的储存寿命的其他策略可包括使用其他微生物(例如，如果细菌聚生体包含组合物，由此一种或多种菌株有助于一种或多种菌株的存活)。

在一些方面，组合物可被配制成可通过任何合适的途径施用给受试者的粉末、片剂、胶囊、包肠溶衣剂型(例如，用于递送到回肠/结肠)或丸剂。冻干制剂可在施用之前与盐水或其他溶液混合。

在一些方面，组合物被配制用于口服施用。在一些方面，组合物被配制成用于口服施用的粉末、片剂、胶囊、包肠溶衣剂型或丸剂。在一些方面，组合物被配制用于将细菌递送到受试者的回肠区域。在一些方面，组合物被配制用于将细菌递送到受试者的结肠区域(例如，上部结肠)。在一些方面，组合物被配制用于将细菌递送到受试者的回肠和结肠区域。

肠溶衣可保护口服制剂(例如片剂或胶囊)的内容物免受胃酸影响，并提供向回肠和/或上部结肠区域的递送。肠溶衣的非限制性示例包括pH敏感性聚合物(例如

FS30D)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(例如乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、聚乙酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、紫胶、偏苯三酸乙酸纤维素、藻酸钠、玉米醇溶蛋白、其他聚合物、脂肪酸、蜡、紫胶、塑料、以及植物纤维。在一些方面，肠溶衣由pH敏感性聚合物形成。在一些方面，肠溶衣由

FS30D形成。

在一些方面，肠溶衣可被设计成在任何合适的pH下溶解。在一些方面，肠溶衣被设计成在大于约pH 5.0的pH下，或在大于约pH 6.0的pH下，或在大于约pH 7.0的pH下溶解。在一些方面，肠溶衣被设计成在大于约pH 5.0至约pH 7.0的pH下溶解。在一些方面，肠溶衣被设计成在大于约pH5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pH下溶解。

本文提供的制剂可包括向组合物中添加一种或多种试剂以增强微生物制剂的稳定性和/或存活。稳定剂的非限制性示例可包括遗传因子、甘油、抗坏血酸、脱脂奶、乳糖、吐温、藻酸盐、黄原胶、角叉菜胶、甘露糖醇、棕榈油、聚-L-赖氨酸(POPL)以及它们的组合。

在一些方面，组合物可被配制成单位剂型，即含有单位剂量、或多剂量、或单位剂量亚单位的离散部分形式。例如，该一种或多种细菌在人类中的典型或常见的合适或有效剂量为约1×E3(1×E3＝1×10^3＝1×(10的3次幂))至约1×E13菌落形成单位(CFU)。在一些情况下，合适或有效剂量为约1×E6CFU至约1×E11CFU。在特定情况下，合适或有效剂量为约1×E7CFU至约1×E10CFU。在一些另外的方面，细菌的合适或有效剂量可为约1×E2CFU、1×E3CFU、1×E4CFU、1×E5CFU、1×E6CFU、1×E7CFU、1×E8CFU、1×E9CFU、1×E10CFU、1×E11CFU、1×E12CFU、1×E13CFU、1×E14CFU或1×E15CFU。

该组合物可每天施用一次。另选地，组合物可每天服用两次、另选地每天服用三次、另选地每天服用四次。组合物可随餐服用或空腹服用。组合物可在早晨、中午、下午、晚上或夜间服用。组合物可在每天的相同时间服用，或者服用组合物的时间可变化。使用者可施用一种剂型/剂量组合物，在另一个示例中两种剂型/剂量组合物，在另一个示例中三种剂型/剂量组合物，在另一个示例中四种剂型/剂量组合物，并且在另一个示例中多于四种剂型/剂量组合物。在一些方面，剂量为约0.1毫克(mg)、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1.0mg、约2.0mg、约3.0mg、约4.0mg、约5.0mg、约6.0mg、约7.0mg、约8.0mg、约9.0mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1克。在一些方面，剂量范围为约1mg至约500mg。

在一些方面，组合物可包含每剂量组合物约5至约10mg的IPA。通过药代动力学研究发现，约5mg至约10mg IPA的剂量可足以将血清中IPA水平增加至超过内源性基线值。

在一些方面，组合物可包含益生元，并且组合物的剂量可为约50mg至约5g、另选地约100mg至约4g、另选地约250mg至约2g。

在一些方面，相对于组合物的重量，组合物可包含量为约1×E3菌落形成单位(CFU)/克(g)至约1×E13CFU/g的一种或多种细菌。在一些方面，一种或多种细菌以约1×E5CFU/g至约1×E11CFU/g的量存在。在一些方面，一种或多种细菌以约1×E6CFU/g至约1×E10CFU/g的量存在。在一些方面，一种或多种细菌以约1×E8CFU/g至约1×E10CFU/g的量存在于组合物中。在一些方面，组合物包含以约1×E1CFU/g、约1×E2CFU/g、约1×E3CFU/g、约1×E4CFU/g、约1×E5CFU/g、约1×E6CFU/g、约1×E7CFU/g、约1×E8CFU/g、约1×E9CFU/g、约1×E10CFU/g、约1×E11CFU/g、约1×E12CFU/g、约1×E13CFU/g、约1×E14CFU/g或约1×E15CFU/g的量存在的一种或多种细菌。

适用于与本文所述的组合物一起使用的容器包括例如罐、广口瓶、瓶子、具有摇动器盖的瓶子、研磨机、小瓶、注射器、管、小袋、小药囊、袋、泡罩卡或折叠物。容器可由多种材料形成，该多种材料包括但不限于玻璃、塑料、聚合物、金属、合金、金属或合金箔、橡胶、硬纸板或纸材。容器还可包括密封剂，该密封剂可由适用于本领域的任何材料诸如树脂或聚合物形成。容器可包括防潮层和/或隔氧层以进一步增强益生菌在储存期间的活力。防潮层和隔氧层在制药和食品行业中是已知的。适用于本发明的阻隔层描述于授予Vadhar的美国专利6,716,499、授予Shah的美国专利6,524,720、授予Bonner等人的美国专利5,792,530和授予Bettie等人的美国专利4,977,004中。除了此类阻隔层之外或代替此类阻隔层，容器可包括氧气清除剂和/或干燥剂/吸收水分化合物。合适的氧气清除剂和干燥剂是本领域已知的，例如授予Yan等人的美国专利6,746,622、授予Ebner等人的美国专利6,387,461、授予Ebner等人的美国专利6,228,284以及授予Hekal的美国专利6,130,263。

本文还描述了提供一种或多种健康有益效果的方法，该方法包括使用者口服本发明的组合物。在一些方面，该一种或多种健康有益效果可选自促进大脑健康；促进大脑的健康老化；通过大脑健康促进情感健康；向大脑递送抗氧化营养物质；管理大脑中的氧化应激反应；减弱和/或维持大脑中的氧化应激反应或总抗氧化能力；通过递送抗氧化剂来保护神经元；以及上述有益效果的任何组合。在一些方面，该一种或多种健康有益效果可选自促进大脑健康；促进大脑的健康老化；向大脑递送抗氧化营养物质；管理大脑中的氧化应激反应；以及上述有益效果的任何组合。

本文还描述了增加对其有需要的受试者的胃肠道和/或血清中的IPA的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。

本文还描述了用于通过减少对其有需要的受试者的神经炎症和神经退行性变来优化健康神经系统的肠脑轴的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。

本文还描述了用于治疗、改善或预防患有疾病或处于患有疾病风险中的受试者的疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的组合物。在一些方面，疾病可以是肠疾病、代谢紊乱、炎性病症或免疫障碍。在一些方面，疾病可以是代谢综合征、胰岛素抗性、胰岛素敏感症、前驱糖尿病、糖尿病、焦虑症、抑郁症、自闭症、高血压、肠易激综合征、代谢异常、应激相关病症、神经疾病(诸如帕金森氏病)、炎性肠病(IBD)、克隆氏病、心脏病或神经系统紊乱(诸如多发性硬化症)。

实施例和数据

提供以下数据和实施例以帮助举例说明本文所述的发明。示例的组合物仅为了例证目的而给出并且不可被理解为是对本发明的限制，因为在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以有许多变型。除非另外指明，否则本文中所有份数、百分比和比率均按重量计。

IPA及其衍生物的产生

首先根据表2中的配方制备发酵培养基。

表2：发酵培养基1

成分	量/1L
		刃天青(0.01％w/v原液)	1.00ml
K2HPO4	2.00g
		KH2PO4	2.00g
MgCl26H2O	0.20g
		(NH4)2SO4	5.00g
NaHCO3(10％w/v原液)	25.00mL
		半胱氨酸盐酸盐(5％w/v原液)	10.00mL
L-甘氨酸	0.0751g
		L-缬氨酸	0.1172g
L-亮氨酸	0.1312g
		L-异亮氨酸	0.1312g
L-甲硫氨酸	0.1492g
		L-组氨酸	0.1552g
L-精氨酸	0.1742g
		L-苯丙氨酸	0.1652g
L-酪氨酸	0.1812g
		L-色氨酸	0.2042g
痕量元素溶液<sup>1</sup>	10.00mL
		维生素溶液<sup>2</sup>	10.00mL
软化水	适量

¹痕量矿物质补充剂

MD-TMS^TM(可从ATCC(Manassas,VA)商购获得)。

²维生素补充剂

MD-VS^TM(可从ATCC(Manassas,VA)商购获得)。

将除了氨基酸、痕量元素溶液和维生素溶液之外的所有成分混合，并且在搅拌下加热至121℃持续30-40分钟。使混合物冷却约10-20分钟，然后添加氨基酸、痕量元素溶液和维生素溶液。在添加氨基酸之前，通过将表2中列出的所有氨基酸溶解在冷却培养基的100mL等分试样中并过滤灭菌来制备氨基酸溶液。

产芽胞梭状芽胞杆菌ATCC15579(C.sporogenes)在10mL蛋白胨酵母葡萄糖(“PYG”)培养基(可从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)商购获得)中于36℃下厌氧生长24小时。将24小时培养物的10mL等分试样(大约1×E8CFU/mL)以10,0000×g离心5分钟。移除上清液，并将产芽胞梭状芽胞杆菌粒料重悬于10mL盐水中以洗涤细菌。然后将样品以10,000×g离心5分钟。移除上清液，并将产芽胞梭状芽胞杆菌粒料重悬于10mL盐水中以形成种菌制剂。

将100μl种菌制剂厌氧转移到10mL发酵培养基中，一式两份进行。制备后，将管转移到厌氧室中的36℃箱中保持24-28小时。温育后，将管从室中取出并以8,000×g离心10分钟。将上清液取出并通过0.2μm注射过滤器过滤到无菌玻璃管中。

然后，将上清液的3mL等分试样转移到冻干小瓶中。将5％食品级

100淀粉(可从Ingredion(Westchester,IL)商购获得)添加到小瓶中。然后将样品冻干。首先，在热处理步骤中，将小瓶在20℃下保持30分钟，然后在0℃下保持80分钟，然后在-25℃下保持60分钟。冷冻在-25℃(-50℃的冷凝器)和200毫托的真空下进行。接着，在干燥步骤中，将小瓶在-25℃和200mTorr下保持总共约1800至约1830分钟，然后将温度升至4℃，并且将小瓶在4℃和200mTorr下保持60分钟。冻干后，根据下文所述的IPA测量方法对发酵物粉末进行IPA分析测量。将发酵培养基中的150μM纯IPA用作对照。结果在下文的表3中。

表3.

组分	量(mg/g发酵物)	标准偏差
			吲哚-3-丙酸	0.308	0.011
吲哚-3-丙烯酸	0.002	0.000
			色氨酸	0.492	0.020
吲哚-3-乳酸	0.058	0.002

据发现，IPA及其衍生物可通过在限定的发酵培养基中的细菌发酵和上清液的冻干来产生。IPA、吲哚-3丙烯酸、吲哚-3-乳酸和色氨酸可在发酵物粉末中检测到。发现淀粉不抑制IPA的回收。

发酵培养基

在证明IPA和其他吲哚衍生物可通过细菌发酵产生的概念后(表3)，测试不同的发酵培养基以评估IPA和其他衍生物产量的水平是否可增加。发酵培养基A包含与添加了葡萄糖的培养基1相同的配方，发酵培养基B是与培养基A相同的配方，但包含色氨酸作为唯一的氨基酸，并且发酵培养基C包含与培养基1相同的配方，但具有10倍的氨基酸。根据表4中的配方制备发酵培养基A、B和C。将这些培养基与上表2中所述的发酵培养基1进行比较。

表4：发酵培养基

成分	培养基A	培养基B	培养基C
				刃天青(0.01％w/v原液)	1.00mL	1.00mL	1.00mL
K2HPO4	2.00g	2.00g	2.00g
				KH2PO4	2.00g	2.00g	2.00g
MgCl26H2O	0.20g	0.20g	0.20g
				(NH4)2SO4	5.00g	5.00g	5.00g
NaHCO3(10％w/v原液)	25.00mL	25.00mL	25.00mL
				半胱氨酸盐酸盐(5％w/v原液)	10.00mL	10.00mL	10.00mL
L-甘氨酸	0.0751g	0	0.7510g
				L-缬氨酸	0.1172g	0	1.1720g
L-亮氨酸	0.1312g	0	1.3120g
				L-异亮氨酸	0.1312g	0	1.3120g
L-甲硫氨酸	0.1492g	0	1.4920g
				L-组氨酸	0.1552g	0	1.5520g
L-精氨酸	0.1742g	0	1.7420g
				L-苯丙氨酸	0.1652g	0	1.6520g
L-酪氨酸	0.1812g	0	1.8120g
				L-色氨酸	0.2042g	0.2042g	2.0423g
痕量元素溶液<sup>1</sup>	10.00mL	10.00mL	10.00mL
				维生素溶液<sup>2</sup>	10.00mL	10.00mL	10.00mL
葡萄糖原液(500mM)	40mL	40.00mL	0
				软化水	适量	适量	适量

¹痕量矿物质补充剂

MD-TMS^TM(可从ATCC(Manassas,VA)商购获得)。

²维生素补充剂

MD-VS^TM(可从ATCC(Manassas,VA)商购获得)。

将除了氨基酸、葡萄糖原液、痕量元素溶液和维生素溶液之外的所有成分混合，并且在搅拌下加热至121℃并持续30-40分钟。使混合物冷却约10-20分钟，然后添加氨基酸、葡萄糖原液、痕量元素溶液和维生素溶液。在添加氨基酸之前，通过将表4中列出的所有氨基酸溶解在冷却培养基的100mL等分试样中并过滤灭菌来制备氨基酸溶液。

产芽胞梭状芽胞杆菌ATCC15579(C.sporogenes)在10mL蛋白胨酵母葡萄糖(“PYG”)培养基(可从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)商购获得)中于36℃下厌氧生长24小时。将24小时培养物的10mL等分试样(大约1×E8CFU/mL)以10,0000×g离心5分钟。移除上清液，并将产芽胞梭状芽胞杆菌粒料重悬于10mL盐水中以洗涤细菌。然后将样品以10,000×g离心5分钟。移除上清液，并将产芽胞梭状芽胞杆菌粒料重悬于10mL盐水中以形成种菌制剂。

将100μl种菌制剂厌氧转移到10mL发酵培养基中，一式两份进行。制备后，将管转移到厌氧室中的36℃箱中保持24-28小时。温育后，将管从室中取出并以8,000×g离心10分钟。将上清液取出并通过0.2μm注射过滤器过滤到无菌玻璃管中。然后根据下文所述的IPA测量方法对上清液进行IPA分析测量。结果在下文的表5中。

表5.

令人惊讶地发现，与不含葡萄糖的生长培养基(发酵培养基1)相比，向生长培养基(发酵培养基A)中添加葡萄糖可显著改善IPA收率。包含葡萄糖和色氨酸作为唯一氨基酸的生长培养基(发酵培养基B)降低IPA和衍生物收率。还发现，与发酵培养基1相比，增加氨基酸浓度(发酵培养基C)显著降低了IPA。

实施例

成分	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9
						重量％	重量％	重量％	重量％
发酵物	60.0	65.0	85.0	80.0
					微晶纤维素	30.0	9.0	14.0	10.0
麦芽糖糊精	9.0	25.0	0	9.0
					硬脂酸镁	1.0	1.0	1.0	1.0

实施例1-9可根据以下方法制备。

发酵培养基制备

可通过将表2中列出的除了氨基酸、痕量元素溶液和维生素溶液之外的所有成分混合来制备发酵培养基1。可通过在搅拌下加热至121℃持续30-40分钟来对培养基进行灭菌。然后可将培养基冷却约10-20分钟，然后添加氨基酸、痕量元素溶液和维生素溶液。在添加氨基酸之前，可通过将氨基酸溶解于冷却培养基的100mL等分试样中并过滤灭菌来制备氨基酸溶液。然后可将培养基在无菌条件下处理和储存直至使用。

作为另外一种选择，实施例1-9中的发酵物可使用发酵培养基A来制备。可通过将表4中列出的除了氨基酸、葡萄糖原液、痕量元素溶液和维生素溶液之外的所有成分混合来制备发酵培养基A。可通过在搅拌下加热至121℃持续30-40分钟来对培养基进行灭菌。然后可将培养基冷却约10-20分钟，然后添加氨基酸、葡萄糖原液、痕量元素溶液和维生素溶液。在添加氨基酸之前，可通过将氨基酸溶解于冷却培养基的100mL等分试样中并过滤灭菌来制备氨基酸溶液。然后可将培养基在无菌条件下处理和储存直至使用。

细菌制备

产芽胞梭状芽胞杆菌ATCC 15579(C.sporogenes)可在蛋白胨酵母葡萄糖(“PYG”)培养基(可从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)商购获得)中于36℃下厌氧生长。可将24小时培养物的等分试样(大约1xE8CFU/mL)离心以产生沉淀物。可移除上清液，并可将产芽胞梭状芽胞杆菌沉淀物重悬于盐水中以洗涤细菌。然后可将样品再次离心。可移除上清液，并将产芽胞梭状芽胞杆菌沉淀物重悬于盐水中以形成种菌制剂。

发酵物制备

产芽胞梭状芽胞杆菌种菌制剂可厌氧转移到发酵培养基中以形成细菌溶液。发酵可在适当尺寸的发酵罐中于36℃下进行，直到实现最大生长。

为了制备其中细菌被移除的发酵物，可将发酵的细菌溶液离心以移除细菌并可收集上清液。任选地，上清液可通过反渗透、盘式干燥、微量过滤和纳米过滤的组合以在干燥之前降低水含量。可将所得的浓缩液体与作为脱水剂的甘露糖醇和淀粉混合。然后可将上清液喷雾干燥以产生含有IPA的粉末状发酵物。另选地，可将上清液喷入液氮中以产生冷冻珠。可通过冻干将冷冻珠干燥，然后研磨来以产生含有IPA的粉末状发酵物。

为了制备含有细菌的发酵物，可通过加热或通过用蛋白水解酶处理使发酵的细菌溶液失活。可将所得的溶液与作为脱水剂的甘露糖醇和淀粉混合。然后可将溶液喷雾干燥以产生含有IPA的粉末状发酵物。另选地，可将溶液喷入液氮中以产生冷冻珠。可通过冻干将冷冻珠干燥，然后研磨来以产生含有IPA的粉末状发酵物。

可将含有IPA的粉末状发酵物称重并装载到粉末共混机诸如适当尺寸的“V”共混机中。可将微晶纤维素(USP)和麦芽糖糊精(USP)(如果配方中存在的话)分别筛分、称重并装载到粉末共混机中。可进行共混直至获得发酵物和赋形剂的均匀共混物，通常混合可进行100-500转。可将硬脂酸镁(USP)筛分并装载到粉末共混机中。硬脂酸镁可通过共混通常少于100转而掺入发酵物粉末中。

可将最终共混物装载到配备有胶囊抛光机的旋转封装器的粉末进料斗中。可将明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊装载到胶囊料斗中。胶囊可填充有最终共混物并进行抛光。另选地，可将最终共混物装载到配备有小袋密封器的小袋填充器中，并且可装载小袋材料。可填充并密封小袋。

IPA测量方法

通过向100μL样品中添加300μL MeOH使生物样品经受蛋白质沉淀。将样品涡旋并使用台式离心机诸如Beckman Coulter

X15R(转子SX4750A)或等同仪器以3000rpm离心10分钟，以将蛋白质和其他沉淀物制成粒料。将150μL上清液连同30μL 10ng/mL吲哚-3-丙酸-2,2-d2(IPA-d2)和150μL水转移到96孔深孔板中。对于其他基质(包括但不限于细菌细胞培养物滤液和发酵物)中的样品，用10％MeOH水溶液使样品经受1000倍稀释。将30μL 10ng/mL IPA-d2添加到300μL稀释样品中。分离/稀释的样品中的IPA和IPA-d2在Waters Atlantis T3柱(得自Waters Corp.(Milford,MA))或等同柱(2.1mm×50mm，3μm颗粒)上经受梯度高效液相色谱(HPLC)分析，0.1％甲酸水溶液作为流动相A，0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相B。通过串联质谱法在多反应监测(MRM)MS/MS条件(对于IPA来说，条件为m/z 190.1→130.0，对于IPA-d2来说，条件为m/z 192.1→130.0)下操作来实现检测和定量。使用在10％MeOH水溶液中制备的IPA校准标准物(STD)通过绘制每种标准物的应答(峰面积IPA/峰面积IPA-d2)对浓度构建回归曲线。由二次(1/x²)回归曲线通过内插法确定样品中IPA的浓度。

组合

1.一种产生吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的方法，所述方法包括：将具有与SEQID NO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列的细菌添加到液体发酵培养基中以形成细菌溶液；在厌氧条件下于36℃发酵所述细菌溶液；添加脱水剂；以及脱水以获得包含吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的发酵物粉末。

2.根据段落A所述的方法，所述方法还包括将发酵的细菌溶液离心以形成上清液和细菌沉淀物；将所述上清液取出；以及将脱水剂添加到所述上清液中。

3.根据段落A或B所述的方法，其中所述发酵物粉末包含0.1mg/g至20mg/g的吲哚-3-丙酸。

4.根据段落A至C中任一项所述的方法，其中所述发酵物粉末包含0.1mg/g至20mg/g的其他吲哚衍生物。

5.根据段落A至D中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基包含水、氨基酸组合物、盐、矿物质以及任选的碳水化合物。

6.根据段落A至E中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述脱水步骤之前均质化。

7.根据段落A至F中任一项所述的方法，其中所述脱水步骤为喷雾干燥。

8.根据段落A至G中任一项所述的方法，其中所述脱水步骤为冷冻干燥。

9.一种组合物，所述组合物包含：发酵物，所述发酵物包含细菌来源的吲哚-3-丙酸；以及赋形剂、载体和/或稀释剂。

10.根据段落I所述的组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计0.01至10％的吲哚-3-丙酸。

11.根据段落I或J所述的组合物，其中所述组合物还包含吲哚衍生物，所述吲哚衍生物选自吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙烯酸、吲哚-3-乳酸以及它们的组合。

12.根据段落I至K中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种选自以下的细菌：双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、二乙酰乳酸链球菌(Streptococcusdiacetylactis)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双叉乳杆菌(Lactobacillusbifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentii)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、尸毒梭状芽胞杆菌(Clostridium cadaveris)、粗体梭状芽胞杆菌(Clostridium boltae)以及它们的组合。

13.根据段落L所述的组合物，所述组合物包含1×E3菌落形成单位(CFU)至1×E11CFU的所述一种或多种细菌。

14.根据段落I至M中任一项所述的组合物，其中所述发酵物还包含色氨酸。

15.一种促进大脑健康的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用根据段落I所述的组合物。

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

本文所公开的作为范围端值的值不应被理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个数值范围均旨在表示所引用的值和所述范围内的任何实数包括整数。例如，公开为“1至10”的范围旨在表示“1、2、3、4、5、6、7、8、9和10”，并且公开为“1至2”的范围旨在表示“1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2”。

除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (15)

1.一种产生吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的方法，所述方法包括：将具有与SEQ IDNO:1的核酸序列具有至少80％同源性的核酸序列的细菌添加到液体发酵培养基中以形成细菌溶液；在厌氧条件下于36℃发酵所述细菌溶液；添加脱水剂；以及脱水以获得包含吲哚-3-丙酸和其他吲哚衍生物的发酵物粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将发酵的细菌溶液离心以形成上清液和细菌沉淀物；将所述上清液取出；以及将所述脱水剂添加到所述上清液中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述发酵物粉末包含0.1mg/g至20mg/g的吲哚-3-丙酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵物粉末包含0.1mg/g至20mg/g的其他吲哚衍生物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基包含水、氨基酸组合物、盐、矿物质以及任选的碳水化合物。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述脱水步骤之前均质化。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱水步骤为喷雾干燥。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱水步骤为冷冻干燥。

9.一种组合物，所述组合物包含：发酵物，所述发酵物包含细菌来源的吲哚-3-丙酸；以及赋形剂、载体和/或稀释剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计0.01至10％的吲哚-3-丙酸。

11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中所述组合物还包含吲哚衍生物，所述吲哚衍生物选自吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙烯酸、吲哚-3-乳酸以及它们的组合。

12.根据权利要求9至11所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种选自以下的细菌：双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、二乙酰乳酸链球菌(Streptococcusdiacetylactis)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、双叉乳杆菌(Lactobacillusbifidus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentii)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜热乳杆菌(Lactobacillus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、尸毒梭状芽胞杆菌(Clostridium cadaveris)、粗体梭状芽胞杆菌(Clostridium boltae)以及它们的组合。

13.根据权利要求12所述的组合物，所述组合物包含1×E3菌落形成单位(CFU)至1×E11 CFU的所述一种或多种细菌。

14.根据权利要求9至12所述的组合物，其中所述发酵物还包含色氨酸。

15.一种促进大脑健康的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用根据权利要求9所述的组合物。