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CN113740539A - 一种测定特异性生长因子的试剂盒 - Google Patents

一种测定特异性生长因子的试剂盒 Download PDF

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CN113740539A CN202110917705.XA CN202110917705A CN113740539A CN 113740539 A CN113740539 A CN 113740539A CN 202110917705 A CN202110917705 A CN 202110917705A CN 113740539 A CN113740539 A CN 113740539A
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organic solvent
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Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种测定特异性生长因子的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其中试剂R1包括缓冲液、表面活性剂1、表面活性剂2、无机盐以及有机溶剂，所述试剂R2包括缓冲液、显色剂以及防腐剂。本发明通过在检测试剂中添加一定量的有机溶剂(DMSO)，可以有效促进茚三酮显色反应的正向进行，以致显色反应接近完全反应。同时，通过添加表面活性剂和盐类的组合物，解决了添加有机溶剂后续的样本析出问题。通过以上的改进措施配合本发明的反应体系，有效提升了试剂盒的检测性能，包括精密度以及线性范围内对待测物的可计量性。

Description

一种测定特异性生长因子的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种测定特异性生长因子的试剂盒。
背景技术
特异性生长因子(Specific GrowthFanctor，SGF)是一类特殊的物质，包括糖类物质、氨基酸及其代谢产物，此类物质具有一种特性，当肿瘤产生时，血液中的特异性生长因子含量升高，能够刺激恶性肿瘤血管的生成，血管生成之后能够为肿瘤组织提供足够的营养，进而促进肿瘤的快速生长。特异性生长因子在肿瘤的早期会明显升高，临床上通过测定血清中特异性生长因子的含量，作为肿瘤早期发现、患者病情变化以及术后监测的有效参考依据。
目前已知的SGF检测手段有酶联免疫法(ELISA)以及普通化学法，其中酶联免疫法操作繁琐、反应时间长以及检测重复性不好，因此不利于在临床上广泛应用。普通化学法利用试剂盒内的混合液在37℃检测条件下与待测样品中的特异性生长因子(特定带氨基基团的糖脂、糖蛋白的代谢产物及游离α-氨基酸等物质)进行叠加偶连反应，反应产物又与试剂盒中的显色剂在同一反应条件下进行显色反应，形成蓝色产物，在波长570m处测定该显色产物的吸光度值，并通过标准浓度曲线及公式换算出待测样品中的特异性生长因子含量。由于试剂中显色剂茚三酮的显色反应为可逆反应，进行不完全，因此目前在临床上使用的检测试剂普遍存在可计量性差进而导致线性不合格的问题。
发明内容
发明人意外发现，通过在检测试剂中添加一定量的有机溶剂(DMSO)，可以有效促进茚三酮显色反应的正向进行，以致显色反应接近完全反应。同时，通过添加表面活性剂和盐类的组合物，解决了添加有机溶剂后续的样本析出问题。通过以上的改进措施配合本发明的反应体系，有效提升了试剂盒的检测性能，包括精密度以及线性范围内对待测物的可计量性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种测定特异性生长因子的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：所述试剂R1中包括缓冲液、表面活性剂1、无机盐以及有机溶剂。
优选地，所述试剂R2中包括缓冲液、显色剂以及防腐剂。
优选地，所述有机溶剂选自DMSO、DMF或甲醇中的至少一种，优选为DMSO。
优选地，所述有机溶剂的含量为200-600g/L，优选为400-600g/L。
优选地，所述试剂R1中还包括表面活性剂2；所述试剂R2中包括缓冲液、显色剂以及防腐剂。
优选地，所述表面活性剂1以及表面活性剂2选自Triton X-100、Triton X-305、Emulgen LS-114、Emulgen 709、Tween-20或Tween-80中两种，优选为Triton X-100以及Emulgen LS-114、Triton X-305以及Emulgen LS-114或Triton X-305以及Tween-20的组合；所述表面活性剂1的含量为5-20g/L，表面活性剂2的含量为0.1-1g/L。
优选地，所述试剂R1中缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris缓冲液或GOOD’S缓冲液中的至少一种，无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述试剂R2中缓冲液选自磷酸盐缓冲液、GOOD’S缓冲液或丁二酸缓冲液中的至少一种，显色剂为茚三酮，所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin 300中的至少一种；所述试剂R1中缓冲液的含量为50-150mM，无机盐的含量为1-5g/L；所述试剂R2中缓冲液的含量为30-50mM，显色剂的含量为10-100mM，防腐剂的含量为0.1-1g/L。
一种有效提升生化试剂检测性能的组合物，其特征在于，所述组合物包括：有机溶剂、表面活性剂1、表面活性剂2以及无机盐。
优选地，所述有机溶剂选自DMSO、DMF或甲醇中的至少一种，优选为DMSO；所述表面活性剂1以及表面活性剂2选自Triton X-100、Triton X-305、Emulgen LS-114、Emulgen709、Tween-20或Tween-80中两种，优选为Triton X-100以及Emulgen LS-114、Triton X-305以及Emulgen LS-114或Triton X-305以及Tween-20的组合；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种。
优选地，所述试剂为检测特异性生长因子试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明通过在检测试剂R1中添加一定量的有机溶剂(DMSO)，有效促进茚三酮显色反应的正向进行，以致显色反应接近完全反应，显著性的提升了在线性范围内检测试剂对待测物质的可计量性。同时，伴随着有机溶剂的加入，带来了样本析出以及检测精密度下降的问题，进而本发明通过在试剂R1中添加表面活性剂和盐类的组合物，解决了添加有机溶剂后续的样本析出以及精密度下降的问题，有效提升了试剂盒的检测性能。
附图说明
图1为本发明实施例3中A组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图2为本发明实施例3中B组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图3为本发明实施例3中C组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图4为本发明实施例4中A组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图5为本发明实施例4中B组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图6为本发明实施例4中C组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图7为本发明实施例4中D组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图8为本发明实施例4中E组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图9为本发明实施例4中F组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图10为本发明实施例4中G组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
图11为本发明实施例4中H组试剂盒样品理论浓度与检测值的线性关系图；
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1TSGF检测试剂盒的制备
本发明的特异性生长因子(TSGF)检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分。
1.试剂R1的制备
按照下述配方进行配制，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
Figure BDA0003205930420000041
2.试剂R2的制备
按照下述配方进行配制，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
Figure BDA0003205930420000042
实施例2试剂盒的使用方法
本实施例中，使用全自动生化分析仪(日立7180)配合本发明试剂盒进行样本检测。
(1)仪器参数设置
Figure BDA0003205930420000043
(2)测定方案
Figure BDA0003205930420000044
Figure BDA0003205930420000051
(3)计算方式
使用两点线性校准模式，以线性函数为计算模式，根据校准品的值与吸光度变化值作剂量/响应曲线，样品中特异性生长因子的含量可根据其吸光度变化值在剂量/响应曲线上计算出。
其中，本发明的检测原理为：试剂盒内的混合液在37℃检测条件下与待测样品中的特异性生长因子(特定带氨基基团的糖脂、糖蛋白的代谢产物及游离α-氨基酸等物质)进行叠加偶联反应，反应产物又与试剂盒中的显色剂在同一反应条件下进行显色反应，形成蓝色产物，在波长570nm处测定该显色产物的吸光度值，并通过标准浓度曲线及公式(TSGF临床浓度＝100-0.18TSGF当量浓度)换算出待测样品中的特异性生长因子含量。
实施例3试剂盒的性能测试
为验证本发明试剂盒的各项性能，共设置3组试剂盒进行性能验证：
A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；
B组：特异性生长因子测定试剂盒(化学法)(北京九强)；
C组：按照专利CN104515768B说明书实施例1所述方法得到的试剂盒。
其中C组试剂盒在制备过程中均采用实验室现有的试剂(即A组以及C组中涉及到相同的组分，例如显色剂茚三酮均采用同一厂家同批号产品)其中A组试剂盒按照实施例2所述的使用方法进行测试，B组按照其说明书进行测试，C组按照其实施例中的使用方法进行测试。
(1)准确度验证
使用三组试剂盒分别对临床赋值样本进行准确度测试，设2个重复，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，计算测定均值与靶值得相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表所示：
表1准确度验证
Figure BDA0003205930420000061
由上述实验结果可知，三组试剂盒测试值1与靶值1的相对偏差分别为0.21％、0.61％以及-2.12％，测试值2与靶值2的相对偏差分别为-0.25％、0.71％以及-1.13％。其中本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)检测准确度显著优于C组试剂盒。
(2)精密度验证
选取临床特异性生长因子低值样本、中值样本以及高值样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定10次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行精密度考察。检测结果如下表所示：
表2精密度验证
Figure BDA0003205930420000062
Figure BDA0003205930420000071
由上述实验结果可知，三组试剂盒在低值样本检测时的变异系数分别为0.59％、2.87％以及2.30％，中值样本检测时的变异系数分别为0.49％、0.53％以及1.91％，高值样本检测时的变异系数分别为0.58％、1.00％以及2.87％，实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)在检测低值样本、中值样本以及高值样本时的精密度优于对照试剂盒-1(B组)以及对照试剂盒-2(C组)。
(3)线性范围验证
选择临床超高值样本以及低值样本，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表3 A组试剂盒线性范围验证
H-L L-H 理论值 均值 相对偏差1 估计值 相对偏差2
H 283.94 282.72 283.33 283.33 0.00％ 282.81 0.18％
3/4H+1/4L 241.81 237.19 241.20 239.50 -0.71％ 240.58 -0.45％
1/2H+1/2L 198.5 201.08 199.08 199.79 0.36％ 198.35 0.72％
1/4H+3/4L 157.41 152.02 156.95 154.72 -1.42％ 156.12 -0.90％
1/8H+7/8L 133.9 134.61 135.89 134.26 -1.20％ 135.01 -0.56％
1/16H+15/16L 125.73 123.87 125.36 124.80 -0.44％ 124.45 0.28％
L 114.08 115.57 114.83 114.83 0.00％ 113.89
注：相对偏差1为均值与理论值的相对偏差，相对偏差2为均值与估计值的相对偏差。
表4 B组试剂盒线性范围验证
H-L L-H 理论值 均值 相对偏差1 估计值 相对偏差2
H 295.25 301.8 298.53 298.53 0.00％ 287.32 3.90％
3/4H+1/4L 220.15 231.96 240.60 226.06 -6.04％ 229.64 -1.56％
1/2H+1/2L 161.7 154.23 182.67 157.97 -13.52％ 171.95 -8.14％
1/4H+3/4L 107.54 106.52 124.74 107.03 -14.20％ 114.27 -6.34％
1/8H+7/8L 86.67 86.77 95.77 86.72 -9.45％ 85.43 1.51％
1/16H+15/16L 72.61 73.60 81.29 73.11 -10.07％ 71.01 2.95％
L 65.87 67.75 66.81 66.81 0.00％ 56.59
注：相对偏差1为均值与理论值的相对偏差，相对偏差2为均值与估计值的相对偏差。
表5 C组试剂盒线性范围验证
H-L L-H 理论值 均值 相对偏差1 估计值 相对偏差2
H 247.56 248.15 247.86 247.86 0.00％ 248.92 -0.43％
3/4H+1/4L 210.36 204.58 214.60 207.47 -3.32％ 216.04 -3.97％
1/2H+1/2L 195.5 201.08 181.34 198.29 9.35％ 183.15 8.26％
1/4H+3/4L 152.41 152.02 148.08 152.22 2.79％ 150.27 1.29％
1/8H+7/8L 126.9 132.61 131.45 129.76 -1.29％ 133.83 -3.04％
1/16H+15/16L 125.73 123.87 123.14 124.80 1.35％ 125.61 -0.64％
L 114.10 115.57 114.83 114.83 0.00％ 117.39
注：相对偏差1为均值与理论值的相对偏差，相对偏差2为均值与估计值的相对偏差。
由上述实验结果可知，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)在样本浓度为114-283mg/L线性范围内，检测值与理论值的相对偏差1以及检测值与估计值的相对偏差2均小于B组以及C组试剂盒。同时，将三组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析(如附图1-3所示)：A组试剂盒检测值与理论值的相关性显著优于B组以及C组，其中A组检测值与理论值的相关性R2为0.9997，B组R2为0.9893，C组为0.9783。实验结果说明本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)较B组以及C组试剂盒在线性范围内具有更好的线性相关性，也即具有更好的可计量性。
实施例4有机溶剂对试剂盒线性范围的影响
(1)为了验证在试剂R1中添加有机溶剂对试剂盒线性范围的影响，共设置4组试剂盒：
A组：本发明实施例2制备得到的试剂盒；
B组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中未添加有机溶剂；
C组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中添加的有机溶剂为DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；
D组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中添加的有机溶剂为甲醇；
选择临床超高值样本以及低值样本，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用上述四组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表6试剂盒线性范围验证
Figure BDA0003205930420000091
Figure BDA0003205930420000101
注：相对偏差1为均值与理论值的相对偏差。
由上述实验结果可知，A组、C组以及D组在检测线性范围内，其检测值与理论值的相对偏差均小于B组，且A组检测结果最优。同时，将4组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析(如附图4-7所示)：A组试检测值与理论值的相关性R2为0.9997，B组R2为0.9774，C组R2为0.9992，D组R2为0.9976。实验结果说明本发明通过在TSGF检测试剂盒试剂R1中添加有机溶剂(尤其是DMSO)，可以显著提升试剂盒线性范围内检测的可计量性。
(2)为了验证试剂R1中有机溶剂添加量对试剂盒线性范围的影响，共设置4组实验：
A组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中有机溶剂DMSO的含量为100g/L；
B组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中有机溶剂DMSO的添加量为200g/L；
C组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中有机溶剂DMSO的添加量为600g/L；
D组：所述试剂盒与实施例2试剂盒的区别仅在于，试剂R1中有机溶剂DMSO的添加量为1000g/L。
选择临床超高值样本以及低值样本，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用上述三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表7试剂盒线性范围验证
Figure BDA0003205930420000102
Figure BDA0003205930420000111
注：相对偏差1为均值与理论值的相对偏差。
将4组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析(如附图8-11所示)：A组试检测值与理论值的相关性R2为0.9887，B组R2为0.9971，C组R2为0.9996，D组R2为0.9960，实验结果说明本发明在试剂R1中添加200-600g/L有机溶剂，可以显著提升试剂盒线性范围内检测的可计量性。
实施例5表面活性剂及无机盐组合物对试剂盒精密度的影响
(1)表面活性剂及无机盐组合物对检测精密度的影响
为了验证在试剂R1中添加表面活性剂及无机盐组合物对试剂盒检测精密度的影响，本实施例中共设置8组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中是否添加表面活性剂1Triton X-100、表面活性剂2Tween-20以及无机盐NaCl，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述8组试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表8
Figure BDA0003205930420000112
Figure BDA0003205930420000121
注：“√”代表包含该组分；“×”代表未包含该组分。
实验结果表明，在试剂R1中同时添加表面活性剂1TritonX-100、表面活性剂2Tween-20以及无机盐NaCl时，试剂盒的检测精密度更高。
(2)表面活性剂及无机盐浓度的影响
为了验证在试剂R1中添加表面活性剂及无机盐组合物对试剂盒线性范围的影响，本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂1Triton X-100、表面活性剂2Tween-20以及无机盐NaCl浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表9
Figure BDA0003205930420000122
实验结果表明，在试剂R1中表面活性剂1的浓度范围为5-20g/L、表面活性剂2的浓度范围为0.1-1g/L以及无机盐的浓度范围为1-5g/L时，试剂盒的检测精密度更高。
(3)表面活性剂及无机盐种类的影响
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂1、表面活性剂2以及无机盐的种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表10
Figure BDA0003205930420000131
实验结果显示在试剂R1中表面活性剂1、表面活性剂2以及无机盐采用上述7种组合时，试剂盒的检测精密度都较高，尤其是在表面活性剂1为Triton X-100或者Triton X-305，表面活性剂2为LS-114或者Tween-20，无机盐为NaCl时，检测精密度最高。
综上所述，本发明通过在检测试剂R1中添加一定量的有机溶剂(DMSO)，可以有效促进茚三酮显色反应的正向进行，以致显色反应接近完全反应，显著性的提升了在线性范围内检测试剂对待测物的可计量性，同时，伴随着有机溶剂的加入，带来了样本析出以及检测精密度下降的问题。进而本发明通过在试剂R1中添加表面活性剂和盐类的组合物，解决了添加有机溶剂后续的样本析出以及精密度下降的问题，有效提升了试剂盒的检测性能。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。

Claims (10)

1.一种测定特异性生长因子的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：所述试剂R1中包括缓冲液、表面活性剂1、无机盐以及有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中包括缓冲液、显色剂以及防腐剂。
3.根据权利要求2所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于：所述有机溶剂选自DMSO、DMF或甲醇中的至少一种，优选为DMSO。
4.根据权利要求3所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于：所述有机溶剂的含量为200-600g/L，优选为400-600g/L。
5.根据权利要求4所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中还包括表面活性剂2；所述试剂R2中包括缓冲液、显色剂以及防腐剂。
6.根据权利要求5所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂1以及表面活性剂2选自Triton X-100、Triton X-305、Emulgen LS-114、Emulgen 709、Tween-20或Tween-80中两种，优选为TritonX-100以及Emulgen LS-114、Triton X-305以及Emulgen LS-114或Triton X-305以及Tween-20的组合；所述表面活性剂1的含量为5-20g/L，表面活性剂2的含量为0.1-1g/L。
7.根据权利要求5-6任一项所述的一种测定特异性生长因子的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris缓冲液或GOOD’S缓冲液中的至少一种，无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述试剂R2中缓冲液选自磷酸盐缓冲液、GOOD’S缓冲液或丁二酸缓冲液中的至少一种，显色剂为茚三酮，所述防腐剂选自叠氮钠或Proclin 300中的至少一种；所述试剂R1中缓冲液的含量为50-150mM，无机盐的含量为1-5g/L；所述试剂R2中缓冲液的含量为30-50mM，显色剂的含量为10-100mM，防腐剂的含量为0.1-1g/L。
8.一种有效提升生化试剂检测性能的组合物，其特征在于，所述组合物包括：有机溶剂、表面活性剂1、表面活性剂2以及无机盐。
9.根据权利要求8所述的一种有效提升生化试剂检测性能的组合物，其特征在于，所述有机溶剂选自DMSO、DMF或甲醇中的至少一种，优选为DMSO；所述表面活性剂1以及表面活性剂2选自Triton X-100、Triton X-305、Emulgen LS-114、Emulgen 709、Tween-20或Tween-80中两种，优选为TritonX-100以及Emulgen LS-114、Triton X-305以及Emulgen LS-114或Triton X-305以及Tween-20的组合；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种。
10.根据权利要求8-9所述的一种有效提升生化试剂检测性能的组合物，其特征在于，所述试剂为检测特异性生长因子试剂盒。
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