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CN113786492B - 一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途 - Google Patents

一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途 Download PDF

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CN113786492B CN202110932558.3A CN202110932558A CN113786492B CN 113786492 B CN113786492 B CN 113786492B CN 202110932558 A CN202110932558 A CN 202110932558A CN 113786492 B CN113786492 B CN 113786492B
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Abstract

本发明提供了一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途，属于药物递送系统技术领域。具体提供了一种细胞膜‑糖基聚合物，该聚合物是在式I所示结构的糖基聚合物外包裹了一层细胞膜。该聚合物具有良好的光动力效应，作为光敏剂具有良好的靶向作用，可以在肿瘤部位聚集，且光动力治疗效果好，对肿瘤细胞杀伤作用强。此外，该聚合物作为聚合物载体对于药物有优异的包载效果，载药量高；其包载肿瘤药物用于肿瘤治疗效果优异，应用前景优良。
Figure DDA0003211650020000011

Description

一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物递送系统技术领域，具体涉及一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途。
背景技术
癌(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤。数据显示，2020年全球新发癌症病例1929例，其中男性1006万例，女性923万例；2020年全球癌症死亡病例996万例，其中男性553万例，女性443万例。癌症发病率和死亡率高，已成为全球严重威胁人类健康的疾病之一，也是当前基础及临床研究的热点和难点之一。根据2020年最新数据显示，全球发病率前十的癌症分别是乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱癌。目前癌症的治疗方式主要包括手术、放疗、化疗和免疫治疗等。尽管这些治疗方式的前期治疗效果较好，但仍然存在肿瘤转移、易复发、机体损伤、免疫受损等问题。
近年来，光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)作为一种新兴的治疗方式。光动力治疗通过光敏剂在特定激光照射后产生的大量活性氧物质(Reactive oxygenspecies,ROS)来诱导肿瘤细胞凋亡并造成DNA损伤。PDT具有高选择性、低系统性毒副作用、可重复治疗和不易产生耐受等优点，越来越受到研究者的关注。然而，大多数PDT使用的光敏剂存在水溶性差、缺乏靶向性和ROS产率较低等问题，在肿瘤部位聚集不够，对肿瘤杀伤作用不强，在癌症治疗应用中受到限制。
如何提高光敏剂在肿瘤部位的聚集浓度，并增强PDT对肿瘤的杀伤作用，增强PDT对癌症治疗的效果，是目前癌症治疗中亟需解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种可用于光动力治疗的聚合物载体及其制备方法和用途。
本发明提供了一种细胞膜-糖基聚合物，它是在式I所示结构的糖基聚合物外包裹了一层细胞膜：
Figure BDA0003211650000000021
式I
其中，
(x+y+z):o:p:n:m的摩尔比为2.9:0.5:0.5:260:1；
R选自
Figure BDA0003211650000000022
或
Figure BDA0003211650000000023
进一步地，所述细胞膜为肿瘤细胞的细胞膜；
和/或，所述糖基聚合物由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-SH 100～500份、Maleimide-Ppa 1～100份；
所述Maleimide-Ppa的结构式为：
Figure BDA0003211650000000024
所述B-gala-SH由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-PySS 1000～1500份、二硫苏糖醇1000～1500份；
所述B-gala-PySS由如下重量配比的原料制备而成：MA-D-Galactosamine 1000～1500份、MA-PySS 100～200份、MA-GFLGKGLFG-MA 10～50份、MA-GFLGK-CTA 50～100份；
所述MA-D-Galactosamine的结构为
Figure BDA0003211650000000031
所述MA-PySS的结构为
Figure BDA0003211650000000032
所述MA-GFLGKGLFG-MA的结构为
Figure BDA0003211650000000033
所述MA-GFLGK-CTA的结构为
Figure BDA0003211650000000034
进一步地，所述糖基聚合物由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-SH 500份、Maleimide-Ppa 75份；
和/或，所述B-gala-SH由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-PySS 1300份、二硫苏糖醇1000份；
和/或，所述B-gala-PySS由如下重量配比的原料制备而成：MA-D-Galactosamine1446份、MA-PySS 100份、MA-GFLGKGLFG-MA 23.5份、MA-GFLGK-CTA 53份。
进一步地，所述细胞膜的制备方法包括如下步骤：
采用微型挤出器挤压细胞至细胞被破坏，离心，取含有细胞膜的上清液，即得；
优选地，所述细胞膜的制备方法包括如下步骤：
配制含有蛋白酶抑制剂的PBS细胞悬液，采用不含聚碳酸酯多孔膜的Avanit微型挤出器挤压细胞至细胞被破坏，离心，取含有细胞膜的上清液，即得。
进一步地，所述B-gala-SH的制备方法包括如下步骤：
将B-gala-PySS与二硫苏糖醇反应得到。
进一步地，所述B-gala-PySS的制备方法包括如下步骤：
将MA-D-Galactosamine、MA-PySS、MA-GFLGKGLFG-MA和MA-GFLGK-CTA溶于溶剂中，在引发剂作用下反应，冻干，即得；
优选地，所述溶剂为水和甲醇混合溶液；
和/或，所述反应前除氧；
和/或，所述反应为避光反应；
更优选地，所述水和甲醇体积比为1:4；
和/或，所述引发剂为VA044；
和/或，所述反应为40～50℃油浴反应10～12小时。
进一步地，所述的糖基聚合物的方法包括如下步骤：
(1)将B-gala-SH溶于水中，加入DMSO，配制成B-gala-SH/DMSO混合液；
(2)将Maleimide-Ppa溶于DMSO中，加入到B-gala-SH/DMSO混合液中反应；
(3)将步骤(2)的反应液纯化，即得；
优选地，
步骤(1)中，所述水和DMSO的体积比为1：(1～5)；
和/或，步骤(2)中，所述反应为室温下避光反应。
本发明还提供了一种制备前述的细胞膜-糖基聚合物的方法，它包括如下步骤：
将细胞膜与糖基聚合物水溶液混合，离心后即得；
优选地，所述混合后搅拌过夜，温度为0～4℃；
和/或，所述离心为20000g离心30min。
本发明还提供了前述的细胞膜-糖基聚合物在制备光敏剂的药物中的用途；
优选地，所述光敏剂是光动力治疗肿瘤的药物。
本发明还提供了前述的细胞膜-糖基聚合物在制备药物载体中的用途；
优选地，所述药物载体用于包载的药物为抗肿瘤药物；
更优选地，所述抗肿瘤药物为奥拉帕尼。
本发明还提供了一种药物，它是由前述的细胞膜-糖基聚合物为活性成分，或者前述的细胞膜-糖基聚合物为载体包载药物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；
优选地，所述包载的药物为抗肿瘤药物；
更优选地，所述包载的药物为奥拉帕尼。
本发明提供了一种细胞膜-糖基聚合物，该细胞膜-糖基聚合物克服了现有PDT光敏剂肿瘤部位聚集不够，对肿瘤杀伤作用不强的缺点，可以在肿瘤部位聚集，具有良好的靶向作用；其具有光动力效应，作为光敏剂用于光动力治疗ROS产生效率高，对肿瘤细胞杀伤作用强。同时，该细胞膜-糖基聚合物还可以作为给药系统包载药物，特别是肿瘤药物，如奥拉帕尼，用于肿瘤治疗，效果优异。本发明细胞膜-糖基聚合物用于制备治疗肿瘤的药物具有优良的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为组织蛋白酶B敏感的功能化链转移剂MA-GFLGK-CTA的结构式及其制备路线。
图2为组织蛋白酶B敏感的功能化交联剂MA-GFLGKGLFG-MA的结构式及其制备路线。
图3为Branched-GFLG-poly-D-galactosamine-S-Ppa(BSP)的合成路线及结构示意图。
图4为聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-PySS的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图5为聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-SH的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图6为聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-Ppa的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图7为细胞膜以及BSPO经细胞膜修饰后形成的CM-BSPO的TEM图片：a为细胞膜的TEM图片；b为BSPO经细胞膜修饰后形成的CM-BSPO的TEM图片。
图8为化合物Maleimide-hexyl-Ppa的结构式及其合成路线。
图9为聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图10为线性糖基聚合物光动力治疗体系的合成路线。
图11为聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-PySS的氢谱(溶剂为D2O)。
图12为聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-SH的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图13为聚合物Linear-poly D-galactosamine-S-Ppa的氢谱(溶剂为d6-DMSO)。
图14为基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系的合成路线。
图15为聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-PySS的氢谱(溶剂为D2O)。
图16为聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-SH的氢谱(溶剂为D2O)。
图17为聚合物Branched-GFLG-poly HPMA-S-Ppa的氢谱(溶剂为D2O)。
图18为BSP、BShP和LSP的化学结构式、自组装示意图及TEM结果(标尺：200nm)。
图19为BSP、BShP和LSP的DLS检测结果：a为粒径检测结果；b为zeta电位检测结果。
图20为BSP、BShP及LSP聚合物溶液中加入单线态氧荧光探针(SOSG)，随着激光照射时间的增加的荧光强度的变化情况。
图21为BSP、BShP和LSP的体外细胞毒性实验结果。
图22为BSP、LSP和BShP三组聚合物在肿瘤小鼠模型中分布图像及其肿瘤部位的荧光信号统计结果：a为分布图像；b为肿瘤部位的荧光信号统计结果。
图23为通过HPLC测量聚合物LSP、BSP、BShP及BHSP包载奥拉帕尼的含量，其含量通过标准曲线计算得到；HRMS结果表明包载的奥拉帕尼为原药，不影响其活性。
图24为不同时间点尾静脉注射不同聚合物后肿瘤部位聚集荧光强度结果图。
图25为尾静脉注射不同聚合物后肿瘤部位聚集荧光强度结果图。
图26为小鼠肿瘤模型的肿瘤治疗流程图。
图27为不同治疗方式各组小鼠肿瘤体积变化。
图28为不同处理后小鼠肿瘤体积变化汇总(***p<0.01)。
图29为不同处理组小鼠肿瘤抑瘤率。
图30为光照组各组肿瘤体积磁共振图像(红圈表示肿瘤)、肺部CT图像(白色箭头表示肺转移灶)和肺部组织标本(黑圈表示肺转移灶)。
图31为未光照组各组肿瘤体积磁共振图像(红圈表示肿瘤)、肺部CT图像(白色箭头表示肺转移灶)和肺部组织标本(黑圈表示肺转移灶)。
图32为不同处理组小鼠肺脏HE染色，红色箭头表示转移灶(标尺：200μm)。
图33为不同组处理后肿瘤CD31免疫组化染色(标尺：200μm)。
图34为不同组处理后肿瘤Ki-67免疫组化染色(标尺：200μm)。
图35为各组肿瘤Ki-67免疫组化染色统计分析(***p<0.01，ns无显著差异)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
鼠源4T1乳腺癌细胞株购自中国科学院细胞库(上海)，使用含1％双抗与10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养箱条件为5％CO2，95％空气，37℃，恒湿环境。所有动物实验均严格按照医院伦理委员会批准的动物研究指南进行。实验用雌性Balb/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。用4T1细胞建立皮下瘤肿瘤模型，并用于体内分布和成像研究。
实施例1、本发明糖基聚合物的制备
化合物Maleimide-Ppa、MA-PySS和MA-D-galactosamine按文献1和文献2报道的方法合成。
文献1(Pan D,Zheng X,Zhang Q,et al.Dendronized-Polymer DisturbingCells'Stress Protection by Targeting Metabolism Leads to Tumor Vulnerability[J].Advanced Materials,2020,32:1907490.)报道了Maleimide-Ppa和MA-PySS的合成方法，具体合成路线如下：
Maleimide-Ppa：
Figure BDA0003211650000000061
MA-PySS：
Figure BDA0003211650000000062
文献2(Wartchow C A,Wang P,Bednarski M D,et al.Carbohydrate ProteaseConjugates:Stabilized Proteases for Peptide Synthesis[J].The Journal ofOrganic Chemistry,1995,60:2216-2226.)报道了MA-D-galactosamine的合成方法。
Maleimide-Ppa的结构为：
Figure BDA0003211650000000063
其中Ppa为光敏剂焦脱镁叶绿酸-a(Pyropheophorbide a)结构部分。MA-Pyss的结构为：
Figure BDA0003211650000000064
MA-D-galactosamine的结构为：
Figure BDA0003211650000000065
1、酶敏感的功能化链转移剂MA-GFLGK-CTA的制备
酶敏感的功能化链转移剂MA-GFLGK-CTA的合成路线如图1所示。MA-GFLGK-CTA按文献3报道的类似方法合成(文献3：Sun L,Li X,Wei X,et al.Stimuli-ResponsiveBiodegradable Hyperbranched Polymer–Gadolinium Conjugates as Efficient andBiocompatible Nanoscale Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents[J].ACSApplied Materials&Interfaces,2016,8:10499-10512.)。具体合成方法如下：
MA-GFLG-OH(4.6g，10mmol)、HOBt(1.49g，11mmol)与缩合剂HBTU(4.26g，11mmol)置于圆底烧瓶中，氮气保护，冰浴下加入超干的DMF(50mL)使其溶解。将DIPEA(6.7mL，40mmol)滴加到体系中反应0.5小时。称取H-Lys(OtBu)-Fmoc·HCl(4.62g，10mmol)加入到体系中，混合溶液在冰浴下反应0.5小时后回至室温反应10小时。加入450mL乙酸乙酯(EA)溶解，再依次用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×3)、1M稀盐酸(100mL×3)和饱和氯化钠溶液(100mL×3)洗涤，收集有机相，无水硫酸镁干燥后浓缩，4℃静置后析出晶状白色固体MA-GFLGK(OtBu)-NHFmoc(6.51g，7.51mmol，产率75.1％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，d6-DMSO，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝867.2[M+H]+。MALDI-HRMS:m/z＝889.4474[M+Na]+。
冰浴下，MA-GFLGK(OtBu)-NHFmoc(4.33g，5mmol)用40mL DCM/TFA(v:v＝1:9)的混合溶液溶解，回至室温反应。TLC监测，待反应完全后旋转蒸发除去溶剂，加入乙醚后析出白色固体粉末，得到的白色固体粉末用乙醚洗涤两次并干燥得产物MA-GFLGK(OH)-NHFmoc(3.61g，4.45mmol，产率89.0％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，d6-DMSO，δinppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝811.3[M+H]+，834.3[M+Na]+，MALDI-HRMS：m/z＝833.3842[M+Na]+。
以MA-GFLGK(OH)-NHFmoc为原料，采用固相多肽合成法，经以下步骤合成功能单体MA-GFLGK-CTA。MA-GFLGK(OH)-NHFmoc(1.62g，2mmol)与DIPEA(0.67mL，4mmol)溶于10mLDMF后加入氯三苯甲基氯树脂(5.0g，1.15mmol/g)反应2小时。将树脂移至聚丙烯管中，用DCM:MeOH:DIPEA(v:v:v＝17:2:1)(100mL)的混合溶液冲洗3次，再分别用DCM和DMF冲洗3次。Fmoc保护基团用50mL含20％哌啶的DMF处理三次后加入氰基戊酸二硫代苯甲酸(CTA-COOH，2.79g，10mmol)、DIC(1.26g，10mmol)和HOBt(1.35g，10mmol)，反应12小时。产物用TFE/DCM(v:v＝3:7)在室温下处理2小时并通过过滤除去树脂。将母液减压浓缩，溶于少许甲醇后加入到乙醚中沉淀纯化，再通过高效液相色谱进一步纯化，得到粉红色固体产物MA-GFLGK-CTA(892mg，1.05mmol，产率52.5％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，d6-DMSO，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝851.3[M+H]+。MALDI-HRMS：m/z＝848.3408[M-H]-，870.3181[M+Na-2H]-。
2、酶敏感的功能化交联剂MA-GFLGKGLFG-MA的制备
组织蛋白酶B敏感的功能化交联剂MA-GFLGKGLFG-MA合成路线如图2所示。MA-GFLGKGLFG-MA按文献3报道的类似方法合成(文献3：Sun L,Li X,Wei X,et al.Stimuli-Responsive Biodegradable Hyperbranched Polymer–Gadolinium Conjugates asEfficient and Biocompatible Nanoscale Magnetic Resonance Imaging ContrastAgents[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8:10499-10512.)。具体合成方法如下：
BocNH-GFLG-OH(2.46g，5mmol)、HOBt(743mg，5.5mmol)和HBTU(2.13g，5.5mmol)置于圆底烧瓶，并在氮气保护下加入20mL超干DMF。冰浴下加入DIPEA(3.35mL，20mmol)反应0.5小时。向体系中加入H-Lys(OCH3)-OH·2HCl(583mg，2.5mmol)后回至室温反应20小时。将反应液加入到250mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液(20mL×3)、1M稀盐酸(20mL×3)和饱和氯化钠溶液(20mL×3)洗涤，收集有机相，无水硫酸镁干燥后浓缩，置于4℃结晶得到白色固体产物BocNH-GFLGKGLFG-NHBoc(1.62g，1.46mmol，产率58.4％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝1109.4[M+H]+，MALDI-HRMS：m/z＝1131.6045[M+Na]+。
将BocNH-GFLGKGLFG-NHBoc(1.33g，1.2mmol)置于氮气保护的圆底烧瓶中，冰浴下加入25mL DCM/TFA(v:v＝1:1)混合溶液，回至室温反应12小时后旋去溶剂，加入无水乙醚两次后抽干得到白色的固体中间产物，将其溶于100mL H2O/ACN(v:v＝4:1)的混合溶液中，冰浴下滴加1M的NaOH溶液调节pH至7-8，然后将甲基丙烯酰氯(0.3mL，3mmol)溶于乙腈(ACN)后滴加到体系中，与此同时缓慢滴加1M的NaOH溶液使体系维持在pH＝10，冰浴下反应1小时后置于室温反应4小时，将反应液加入200mL乙酸乙酯中，用1M的稀盐酸调节pH至2-3，水相用EA萃取三次合并有机相用氯化钠溶液(20mL×3)洗涤，最后用无水硫酸镁干燥后浓缩，所得浓缩液置于4℃结晶得到白色固体产物MA-GFLGKGLFG-MA(700mg，0.68mmol，产率56.7％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝516.3[M+2H]2+，1031.4[M+H]+。MALDI-HRMS：m/z＝1031.5506[M+H]+，1053.5377[M+Na]+，1029.5364[M-H]-。
3、可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的构建与制备
可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的合成路线如图3所示。具体合成方法如下：
单体MA-D-Galactosamine(1446mg，4.63mmol)、MA-PySS(100mg，0.39mmol)、交联剂MA-GFLGKGLFG-MA(23.5mg，22.8μmol)、链转移剂MA-GFLGK-CTA(53.0mg，62.4μmol)与引发剂VA044(6.7mg，20.8μmol)溶于H2O/CH3OH(7.2mL，1:4，v/v)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-PySS(B-gala-PySS，1480mg，产率91.2％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-PySS(B-gala-PySS)的氢谱如图4所示。
将1300mg B-gala-PySS溶于10mL水溶液，加入1000mg二硫苏糖醇(DTT)处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Branched-GFLG-poly D-galactosamine-SH(B-gala-SH，1150mg，产率88.5％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly D-galactosamine-SH(B-gala-SH)的氢谱如图5所示。
Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-Ppa(BSP)按如下方法制备：500mg B-gala-SH溶于5mL RO H2O后加入10mL DMSO配制成B-gala-SH/DMSO混合液，75mgMaleimide-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-gala-SH/DMSO混合液中将得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(504mg，产率87.7％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(10000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BSP，420mg)。聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-Ppa(BSP)的氢谱如图6所示。
BSP的氨基酸分析结果如表1所示。
表1.糖基支化/交联聚合物BSP的氨基酸分析结果
Figure BDA0003211650000000081
一般而言，聚合物载体在生物体内有效代谢的肾阈值约为50kDa，因而需要保证降解后的聚合物主链分子量低于这一水平。研究发现，本发明糖基聚合物材料能在酶作用下迅速降解，4小时后的降解产物(Mn＝32.4×103,Mw＝46.7×103,PDI＝1.44)有着较好的均一性，其分子量低于肾阈值。
实施例2、BSP包载药物奥拉帕尼的制备
通过透析法制备，称取300mg BSP溶于5mL去离子水并加入10mL DMSO。30mg奥拉帕尼(Olaparib)溶于2mL DMSO后滴加到含有BSP的H2O/DMSO混合溶液。避光搅拌过夜，将反应液透析(3.5kDa MWCO)2天去除DMSO溶剂，然后用水相滤膜处理后冻干，得到包载奥拉帕尼的聚合物，聚合物命名为BSPO(O代表olaparib)。
实施例3、本发明细胞膜-糖基聚合物的制备
将正常培养的4T1细胞(贴壁密度80～90％)刮下收集到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过离心(700g×7min)收集细胞沉淀。再将其在含有蛋白酶抑制剂混合物的PBS中重悬。用不含聚碳酸酯多孔膜的Avanit微型挤出器挤压20次使得细胞被完全破坏。将所得的溶液依次低温离心分离(1000g×15min，3000g×15min，10000g×30min；4℃)，取含有细胞膜的上清液(细胞膜的TEM结果如图7a所示)。将上清液与含BSPO的水溶液混合搅拌过夜(4℃)后离心收集(20000g×30min)，所得沉淀即为目标产物，命名为CM-BSPO，重悬后用TEM观察其形貌，如图7b所示，能够明显的观察到糖基聚合物外围的细胞膜结构，表明细胞膜的成功包裹。
对照例1、Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的制备
1、功能化光敏剂Maleimide-hexyl-Ppa的制备
功能化光敏剂的合成路线如图8所示。
称取马来酰亚胺丙酸(Maleimide-COOH，1.17g，6.9mmol)和缩合剂HATU(3.74g，9.85mmol)溶于10mL DMF，冰浴下加入DIEA(3.2mL，18.3mmol)反应5分钟后再将N-Boc-1,6-己二胺盐酸盐(1.80g，8.3mmol)加入体系反应2小时。将50mL饱和碳酸氢钠溶液和30mL DCM加入到反应液中，收集有机相并将水相用DCM萃取三次，合并有机相并用饱和碳酸氢钠溶液、稀盐酸和饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸镁干燥后去除溶剂得到黄色固体粗产物。过柱纯化(CH3OH:DCM＝1:20，v/v)后用高效液相色谱进一步分离纯化，得到无色液体产物Maleimide-hexyl-NHBoc(1.66g，产率65.4％)。1H NMR(400MHz，δin ppm)，13C NMR(100MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝368.3m/z[M+H]+，390.2m/z[M+Na]+。MALDI-HRMS：m/z＝390.2000[M+Na]+。
在0℃下，将Maleimide-hexyl-NHBoc(220mg，0.60mmol)溶于10mL DCM中后加入10mL TFA，反应过夜后除去溶剂，残留物通过无水乙醚处理得到固体粉末。将上步所得的固体粉末、焦脱镁叶绿酸a(270mg，0.50mmol)与缩合剂HATU(285mg，0.75mmol)溶于DCM中并加入DIEA(0.23mL，1.33mmol)，反应液在室温下反应1.5小时后旋去溶剂，过柱纯化(DCM:CH3OH＝30:1-20:1，v/v)得到黑色固体粉末Maleimide-hexyl-Ppa(237mg，产率50.5％)。1HNMR(400MHz，δin ppm)，LC-MS(ES+)：m/z＝784.4m/z[M+H]+。MALDI-HRMS：m/z＝806.3995[M+H]+，m/z＝822.3678[M+K]+。
2、Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的制备
Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)按如下方法制备：500mg B-gala-SH溶于5mL RO H2O后加入10mL DMSO配制成B-gala-SH/DMSO混合液，80mgMaleimide-hexyl-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-gala-SH/DMSO混合液中得到墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(520mg，产率89.7％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(9000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BShP，450mg)。聚合物Branched-GFLG-poly D-galactosamine-S-hexyl-Ppa(BShP)的氢谱如图9所示。
对照例2、线性糖基聚合物光动力治疗体系的制备
线性糖基聚合物光动力治疗体系的合成路线如图10所示：
作为对照，设计合成了线性糖基聚合物光动力治疗体系。单体MA-D-Galactosamine(722mg，2.31mmol)、MA-PySS(50mg，0.20mmol)、链转移剂4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(CTA，5.3mg，19.0μmol)与引发剂VA044(2.1mg，6.5μmol)溶于H2O/CH3OH(3.5mL，1:4，v/v)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Linear-poly D-galactosamine-PySS(L-gala-PySS：725mg，产率93.3％)。聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-PySS的氢谱如图11所示。
将620mg L-gala-PySS溶于10mL水溶液，加入600mg DTT处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Linear-poly D-galactosamine-SH(L-gala-SH，560mg，产率93.3％)。聚合物前体Linear-poly D-galactosamine-SH的氢谱如图12所示。
Linear-poly D-galactosamine-S-Ppa(LSP)的制备与可降解的支化/交联糖基聚合物光动力治疗体系的制备方法类似：500mgL-gala-SH溶于5mL RO H2O后加入10mL DMSO配制成L-gala-SH/DMSO混合液，80mg Maleimide-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到L-gala-SH/DMSO混合液中得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(512mg，产率88.3％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL乙腈中出现大量沉淀，离心(10000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(LSP，496mg)。聚合物Linear-poly D-galactosamine-S-Ppa(LSP)的氢谱如图13所示。
对照例3、基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系的制备
作为糖基材料的对照，设计合成了基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系。基于HPMA的可降解支化/交联聚合物光动力治疗体系的合成路线如图14所示。
具体合成方法如下：
单体HPMA(722mg，5.04mmol)、MA-PySS(50mg，0.20mmol)、交联剂MA-GFLGKGLFG-MA(11.8mg，11.4μmol)、链转移剂MA-GFLGK-CTA(26.5mg，31.2μmol)与引发剂VA044(3.4mg，10.4μmol)溶于H2O/CH3OH(3.6mL，1:4)的混合溶液中，将聚合瓶避光置于冰浴中并通氩气鼓泡除氧45分钟后将其密闭，避光置于45℃油浴反应12小时，用液氮淬灭反应后将反应液低温透析冻干，得淡红色固体Branched-GFLG-poly HPMA-PySS(B-HPMA-PySS，740mg，产率91.2％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-PySS的氢谱如图15所示。
将640mg B-HPMA-PySS溶于10mL水溶液中，加入1000mgDTT处理过夜后透析(4℃，MWCO 3.5KDa)2天，样品用水相滤头处理后冻干得到白色固体粉末Branched-GFLG-polyHPMA-SH(B-HPMA-SH，600mg，产率93.8％)。聚合物前体Branched-GFLG-poly HPMA-SH的氢谱如图16所示。
Branched-GFLG-poly-HPMA-S-Ppa(BHSP)的制备如下：500mg B-HPMA-SH溶于5mLRO H2O后加入10mL DMSO配制成B-HPMA-SH/DMSO混合液，80mg Maleimide-hexyl-Ppa溶于2mL DMSO后搅拌下滴加到B-HPMA-SH/DMSO混合液中得到的墨绿色溶液，于室温环境避光反应过夜后透析(避光，MWCO 3.5KDa)2天除去DMSO，离心(7000rpm×5min)后取上清液经水相滤头(0.45μm)过滤，滤液冻干得黑绿色固体粗品(500mg，产率86.2％)。将粗品用2mL水溶解后滴加到200mL丙酮中出现大量沉淀，离心(9000rpm×5min)处理后收集固体残留物并重复处理纯化三次，得到的固体再次溶于20mL去离子水后冻干得产物(BHSP，460mg)。聚合物Branched-GFLG-poly HPMA-S-Ppa(BHSP)的氢谱如图17所示。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果：
试验例1、糖基聚合物的表征
1、糖基聚合物的粒径与电位测定
称取BSP、BShP、LSP，纯水溶解稀释至终浓度为1.0mg/mL，使用粒度仪表征样品粒径和Zata电位(每次测量重复三次)，最终数据使用GraphPad Prism软件进行分析。同时将浓度为200μg/mL的样品滴加到铜网上自然风干，使用透射电镜观察粒径大小与形貌。
通过透射电镜观察到各组材料的形貌如图18所示。BShP的组装体呈十分均匀的圆形纳米粒；相较而言BSP形成的纳米粒则并不是太规则，但也能观察到类似圆形的形貌；而不具有支化/交联结构的LSP则呈松散的丝状分布，没有聚集形成特殊形貌。
如图19所示：通过DLS测得BSP、BShP和LSP的粒径分别约为238nm、164nm和374nm，即BShP形成的粒子最为致密，BSP却相对松散但仍保持纳米粒子形态。三组材料的Zeta电位分别为-16.81mV、-19.23mV和-21.97mV，均为电负性。
2、糖基聚合物的体外ROS产生测定
将BSP、BShP和LSP溶解稀释至光敏剂焦脱镁叶绿酸-a(Pyropheophorbide a,Ppa)浓度为5.0μg/mL，同时加入SOSG检测试剂至终浓度为2.5μM。吸取各组溶液100μL至96孔板，并设3个复孔，随后用660nm激光进行辐照(功率密度：10mW/cm2，持续时间：15min)。在0.5、1、1.5、2、3、5、10、15min时间点用多功能酶标仪测定荧光强度(激发波长为490nm，发射波长为525nm)并记录各样品在525nm波长处的荧光强度。用PBS作为空白对照。
Ppa能吸收特定波长光子而从基态跃迁到激发态，随后将吸收的能量转移到附近的氧气分子产生单线态氧。Ppa经光照激发产生的ROS可以通过试剂盒检测。其中，单线态氧荧光探针(Singlet oxygen sensor green,SOSG)是一种对单线态氧具有高度选择性的检测试剂，该指示剂最初具有弱蓝色荧光，与单线态氧作用后会发出与荧光素相似的绿色荧光(最大激发/发射波长约为504/525nm)，绿色荧光强弱与产生的ROS量成正相关。如图20所示，在吸收660nm激发能量后，BSP所产生的荧光强度最强，LSP次之，BShP最弱，且BSP荧光强度显著高于LPS和BShP。说明BSP体外ROS产生的量和效率更高，而BShP和LSP的ROS产生效率则相对较低。进一步说明BSP对肿瘤有更好的杀伤作用。
3、糖基聚合物体外IC50值测定
将4T1细胞按5×104个/每孔的细胞浓度接种于96孔板中，待细胞贴壁(约孵育12小时)后吸弃培养基，加入用培养基配制的含BSP、LSP和BShP的梯度浓度(Ppa浓度：50、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.01μg/mL)溶液后继续孵育6小时，孵育完成后分别给予2J/cm2剂量光照，再孵育12小时后根据试剂盒说明书使用CCK8试剂，通过酶标仪检测450nm左右吸光度。使用GraphPad Prism(vison 8.0)软件对测定结果进行作图分析。
通过体外细胞实验进行了IC50值的比较(图21)。在同样的Ppa浓度梯度、光照剂量以及培养条件下，三组聚合物IC50值分别为BSP 0.25μg/mL，LSP 0.91μg/mL，BShP 4.8μg/mL，说明BSP肿瘤细胞杀伤效果最强。
4、糖基聚合物体内肿瘤部位信号检测
1×106个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)侧腹部，待肿瘤生长到直径约5mm左右开始进行实验。将小鼠随机分为3组(每组5只)，分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的不同组材料(BSP、BShP和LSP)。于注射完成不同时间点(5min、30min、1h、3h、6h、12h和24h)通过活体荧光成像系统观察肿瘤部位荧光信号，并通过数据分析系统处理数据并分析。
结果表明，BSP材料在注射后肿瘤部位荧光强度逐渐升高，6小时左右达到最高，并且在各个时间点的肿瘤部位荧光强度均远高于LSP和BShP组(图22)。
在同样Ppa浓度下，BSP无论是体外ROS的产生量、对肿瘤细胞的毒性作用和在肿瘤组织聚集度均高于LSP和BShP，这保证了光动力治疗的效果。BSP可作为光敏剂，用于光动力治疗肿瘤具有优异的效果。
试验例2、糖基聚合物包载奥拉帕尼及其表征
1、聚合物包载奥拉帕尼
聚合物包载奥拉帕尼通过透析法制备，称取300mg LSP、BSP、BShP及BHSP分别溶于5mL去离子水并加入10mL DMSO，得到含有材料的H2O/DMSO混合溶液。30mg奥拉帕尼(Olaparib)溶于2mL DMSO后滴加到含有材料的H2O/DMSO混合溶液。避光搅拌过夜，将反应液透析(3.5kDa MWCO)2天去除DMSO溶剂，然后用水相滤膜处理后冻干，得到包载奥拉帕尼的聚合物，聚合物依次命名为LSPO、BSPO、BShPO和BHSPO(O代表olaparib)。
2、奥拉帕尼包载量的测定
LSP、BSP、BShP和BHSP对于奥拉帕尼的包载量通过HPLC结果计算。载药量(wt％)＝(包载的药物的质量/聚合物与包载药物的总质量)×100％。将各组材料分别用流动相溶解后超声，并将有机相滤头处理后的滤液进行HPLC检测。色谱柱型号为(Column name:Shim-pack GLST，C18，5μm.Size:250×4.6mm I.D.)，测试柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，样品浓度约为100μg/mL，检测器选择为UV light(276nm)，流动相为CH3OH/H2O(v:v＝1:1)的混合溶液。
结果如表2所示。BSP聚合物的包载量最高，达到4.03％；BShP的包载量为2.17％，差于BSP。相较而言，对照材料LSP和BHSP无法有效包载小分子药物，其包载量分别仅为0.33％和0.13％。说明BSP“合适”的组装堆叠形态能够包载更多的小分子药物。通过HPLC收集包载的小分子药物进行检测，HRMS结果表明olaparib仍然为活性原药(图23)。
表2.各组聚合物的Ppa含量及对应Olaparib的包载量
Figure BDA0003211650000000111
试验例3、细胞膜-糖基聚合物的效果研究
本研究采用方差分析(Analysis of variance，简称ANOVA)进行多重比较的统计学分析，***表示p<0.01具有非常显著差异，**表示p<0.05具有显著差异，ns表示无显著性差异。
一、肿瘤部位聚集活体荧光检测
1、试验方法
将1×106个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)背部，待肿瘤生长到体积约50mm3左右开始进行实验。将肿瘤模型小鼠随机分为4组，每组5只，分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的不同组材料(游离Ppa、实施例1制备的BSP、实施例2制备的BSPO和实施例3制备的CM-BSPO)。注射完成后，于不同时间点(1小时、4小时、8小时、1天、2天、4天和7天)通过活体荧光成像系统(IVIS，PerkinElmer，美国)观察肿瘤部位荧光信号，并通过数据分析系统处理数据并分析。
2、试验结果
如图24所示，游离Ppa注射进入小鼠体内后约4小时观察到最高的荧光信号强度，随后时间点内肿瘤部位的荧光信号强度逐渐降低，大约在2天后基本不能观察到肿瘤部位的荧光信号。小分子光敏剂游离Ppa分子量约为548，能在体内经肾脏代谢快速排出体外；同时由于没有纳米结构和尺寸，无法通过被动靶向在肿瘤部位有效聚集，所以观察到荧光信号快速降低并消失。BSP和BSPO组注射到小鼠体内后，其在肿瘤组织的荧光信号在前8小时内逐步增强而后开始缓慢降低，但在第7天仍然能够检测到较高的荧光信号，说明BSP、BSPO能够在小鼠肿瘤部位聚集并有效滞留。相比与BSP和BSPO，表面包裹了肿瘤细胞膜的CM-BSPO在小鼠肿瘤部位的荧光信号在前几小时内明显更高，且这一高荧光强度信号的持续时间更长。通过荧光信号半定量并做信号变化曲线图(如图25)发现，游离Ppa的信号变化曲线比较陡峭，在4小时后迅速下降直至消失，而BSP和BSPO组信号持续到1天左右才开始缓慢下降，7天后仍然能够检测到荧光信号。CM-BSPO组在各个时间点的信号强度都比BSP和BSPO高，说明其在肿瘤部位的聚集更加明显。与游离Ppa相比，聚合物给药系统的体内代谢时间明显延长，这不仅增加了光敏剂和奥拉帕尼在肿瘤部位的聚集强度，也延长了光动力治疗的窗口期，有效提高了肿瘤光动力治疗和奥拉帕尼联合应用的作用时间。
二、小鼠肿瘤模型体内抗肿瘤治疗
1、试验方法
小鼠肿瘤模型的肿瘤治疗流程图如图26所示。将1×106个4T1细胞接种于Balb/c小鼠(20克，6-8周龄)背部，待肿瘤生长到体积约50mm3左右(约7天)开始进行实验。将肿瘤模型小鼠随机分为10组，每组5只：
光照组(+L)共5组，分为：CM-BSPO+L、BSPO+L、BSP+L、Ppa+L和Saline+L；
未光照组(-L)共5组，分为：CM-BSPO-L、BSPO-L、BSP-L、Ppa-L和Saline-L。
分别经尾静脉注射Ppa浓度为5mg/kg的BSP、BSPO、CM-BSPO和生理盐水。注射完成后12小时，光照组用660nm激光器进行光照，光照剂量为2J/cm2，每隔2天进行一次光动力治疗，共进行3次，治疗过程中测量监测肿瘤体积。
①MRI、CT等影像手段检测肿瘤治疗效果
进行光动力治疗的同时，通过磁共振成像(MRI)来测量肿瘤的大小。肿瘤部位的MR图像通过7T MRI扫描仪获取。MRI序列的参数如下：TR＝100ms，TE＝2.5ms，FOV：40mm×40mm，矩阵：256×256，扫描时间＝128s。同时治疗20天后，通过Micro-CT仪器进行小鼠胸部扫描，以观察肿瘤在小鼠双肺中的转移情况。
②肿瘤组织切片HE染色及免疫组化染色
治疗结束后(实验第19天)，小鼠安乐死后收集肺脏和肿瘤组织，多聚甲醛(4％溶于pH 7.4的PBS)固定24小时后，石蜡包埋并切片。肺脏经HE染色后拍照获取图像。肿瘤组织经过处理后进行CD31和Ki67免疫组化染色，拍照获取图像。
2、试验结果
(1)肿瘤体积
不同治疗组每只老鼠肿瘤体积变化如图27所示，光照组(+L)分为：CM-BSPO+L、BSPO+L、BSP+L、Ppa+L和Saline+L；同样，未光照组(-L)分为：CM-BSPO-L、BSPO-L、BSP-L、Ppa-L和Saline-L。将不同治疗组小鼠肿瘤体积进行统计，如图28所示，未进行光照治疗和只进行光照的生理盐水组、Ppa组小鼠肿瘤体积没有显著差异(ns)，均远远大于进行光照治疗的CM-BSPO、BSPO和BSP组，且在观察期间肿瘤大小随时间增加而增大。未进行光照的各组，其中CM-BSPO、BSPO和BSP组虽然在肿瘤部位有大量的Ppa聚集，但是没有光照不能产生ROS杀伤肿瘤细胞，所以没有明显的抗肿瘤效果。进行光照治疗各组中，生理盐水组没有Ppa作为光敏剂同样无法产生ROS杀伤肿瘤细胞，没有明显的抗肿瘤效果。游离Ppa在肿瘤部位的滞留时间仅有几小时，给药后24小时进行光照，余留在肿瘤部位的游离Ppa量不足以产生大量的ROS杀死肿瘤细胞。聚合物Ppa相比于游离Ppa在肿瘤体内的聚集时间相对更长，提供的治疗窗口期更长，明显提升了肿瘤的治疗效果。
实验结果显示，BSP+L、BSPO+L和CM-BSPO+L组Ppa在肿瘤部位高度聚集，加上光照可以产生大量的ROS，从而杀伤肿瘤细胞。体积监测发现小鼠肿瘤体积明显更小，治疗期间肿瘤的体积增加并不明显。包载奥拉帕尼的BSPO+L组，奥拉帕尼可以增强肿瘤细胞的DNA损伤，从而增加杀伤肿瘤细胞的作用，因此肿瘤体积相比于BSP组有明显减小，具有统计学差异(p<0.01，n＝5)。表面包裹细胞膜的CM-BSPO+L由于肿瘤部位的聚集度增加，细胞摄取量增多，因而也明显提高了治疗效果，在整个治疗期间肿瘤体积没有明显增加，同时与BSPO+L组相比，治疗后肿瘤体积有明显的统计学差异。
(2)抑瘤率
将其他组与生理盐水未加光照组比较，可以计算出肿瘤治疗的抑瘤率，如图29所示，抑瘤率高低依次为：CM-BSPO+L 87.66％，BSPO+L 81.34％，BSP+L 69.55％，Ppa+L36.99％，Saline+L 26.18％，其余各未光照组的抑瘤率仅为12％左右。由此可以看出CM-BSPO加光照的治疗效果最明显。
(3)磁共振成像
治疗过程中通过磁共振成像手段每隔一周进行肿瘤扫描，即治疗的第1天、第7天、第14天和第19天进行磁共振扫描，结果如图30和图31。磁共振图像反映出同样的治疗效果。BSP+L、BSPO+L和CM-BSPO+L组肿瘤体积显著减小。在治疗的第19天，对各治疗组小鼠进行了肺部CT扫描，观察小鼠肺部转移情况，同时将肺组织取出进行组织拍摄和HE染色。
图30和图31中CT扫描结果显示CM-BSPO+L和BSPO+L组小鼠没有观察到肺部有明确的转移灶，标本组织肉眼观察同样没有观察到异常组织。而其他各组中，CT肺部图像均可以观察到一个或多个高密度孤立结节，大体标本观察可以看到结节状突起；并且HE染色(图32)可以观察到深染变大的细胞核，细胞形态与周围正常肺组织有异质性。
(4)免疫组化染色
肿瘤组织切片进行CD31免疫组化染色，观察肿瘤部位血管分布，如图33所示，肿瘤治疗效果明显的CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L肿瘤内CD31表达量较其他组更低，说明肿瘤治疗效果更好，肿瘤内新生血管较少。
同时也进行Ki-67免疫组化染色，观察肿瘤内细胞增殖情况，如图34所示。半定量统计分析结果如图35所示，CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L三组之间肿瘤内Ki-67表达量没有显著差异，且均低于Ppa+L和Saline+L组，具有统计学差异。说明CM-BSPO+L、BSPO+L和BSP+L三组肿瘤细胞内增殖受到抑制，其治疗效果要优于其他各对照组。
上述试验结果表明：本发明制备的糖基聚合物，特别是细胞膜-糖基聚合物具有良好的光动力效应，可作为光敏剂用于光动力治疗，且对肿瘤的杀伤效果优良。同时，该糖基聚合物作为药物载体效果好，载药量高，且载药后治疗效果进一步增强。
综上，本发明提供了一种细胞膜-糖基聚合物，该细胞膜-糖基聚合物克服了现有PDT光敏剂肿瘤部位聚集不够，对肿瘤杀伤作用不强的缺点，可以在肿瘤部位聚集，具有良好的靶向作用；其具有光动力效应，作为光敏剂用于光动力治疗ROS产生效率高，对肿瘤细胞杀伤作用强。同时，该细胞膜-糖基聚合物还可以作为给药系统包载药物，特别是肿瘤药物，如奥拉帕尼，用于肿瘤治疗，效果优异。本发明细胞膜-糖基聚合物用于制备治疗肿瘤的药物具有优良的应用前景。

Claims (19)

1.一种细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：它是在式I所示结构的糖基聚合物外包裹了一层细胞膜：
Figure QLYQS_1
其中，
(x+y+z):o:p:n:m的摩尔比为2.9:0.5:0.5:260:1；
R选自
Figure QLYQS_2
2.根据权利要求1所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：所述细胞膜为肿瘤细胞的细胞膜；
和/或，所述糖基聚合物由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-SH 100～500份、Maleimide-Ppa 1～100份；
所述Maleimide-Ppa的结构式为：
Figure QLYQS_3
所述B-gala-SH由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-PySS 1000～1500份、二硫苏糖醇1000～1500份；
所述B-gala-PySS由如下重量配比的原料制备而成：MA-D-Galactosamine 1000～1500份、MA-PySS 100～200份、MA-GFLGKGLFG-MA 10～50份、MA-GFLGK-CTA 50～100份；
所述MA-D-Galactosamine的结构为
Figure QLYQS_4
所述MA-PySS的结构为
Figure QLYQS_5
所述MA-GFLGKGLFG-MA的结构为
Figure QLYQS_6
所述MA-GFLGK-CTA的结构为
Figure QLYQS_7
3.根据权利要求2所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：所述糖基聚合物由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-SH 500份、Maleimide-Ppa 75份；
和/或，所述B-gala-SH由如下重量配比的原料制备而成：B-gala-PySS 1300份、二硫苏糖醇1000份；
和/或，所述B-gala-PySS由如下重量配比的原料制备而成：MA-D-Galactosamine 1446份、MA-PySS 100份、MA-GFLGKGLFG-MA 23.5份、MA-GFLGK-CTA 53份。
4.根据权利要求2所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：所述细胞膜的制备方法包括如下步骤：
采用微型挤出器挤压细胞至细胞被破坏，离心，取含有细胞膜的上清液，即得；
和/或，所述B-gala-SH的制备方法包括如下步骤：
将B-gala-PySS与二硫苏糖醇反应得到。
5.根据权利要求2或3所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：所述B-gala-PySS的制备方法包括如下步骤：
将MA-D-Galactosamine、MA-PySS、MA-GFLGKGLFG-MA和MA-GFLGK-CTA溶于溶剂中，在引发剂作用下反应，冻干，即得。
6.根据权利要求5所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：
所述溶剂为水和甲醇混合溶液；
和/或，所述反应前除氧；
和/或，所述反应为避光反应。
7.根据权利要求6所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：
所述水和甲醇体积比为1:4；
和/或，所述引发剂为VA044；
和/或，所述反应为40～50℃油浴反应10～12小时。
8.根据权利要求2或3所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：所述的糖基聚合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将B-gala-SH溶于水中，加入DMSO，配制成B-gala-SH/DMSO混合液；
(2)将Maleimide-Ppa溶于DMSO中，加入到B-gala-SH/DMSO混合液中反应；
(3)将步骤(2)的反应液纯化，即得。
9.根据权利要求8所述的细胞膜-糖基聚合物，其特征在于：
步骤(1)中，所述水和DMSO的体积比为1：(1～5)；
和/或，步骤(2)中，所述反应为室温下避光反应。
10.一种制备权利要求1～9任一项所述的细胞膜-糖基聚合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
将细胞膜与糖基聚合物水溶液混合，离心后即得。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述混合后搅拌过夜，温度为0～4℃；
和/或，所述离心为20000g离心30min。
12.权利要求1～9任一项所述的细胞膜-糖基聚合物在制备光敏剂的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述光敏剂是光动力治疗肿瘤的药物。
14.权利要求1～9任一项所述的细胞膜-糖基聚合物在制备药物载体中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述药物载体用于包载的药物为抗肿瘤药物。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述抗肿瘤药物为奥拉帕尼。
17.一种药物，其特征在于：它是由权利要求1～9任一项所述的细胞膜-糖基聚合物为活性成分，或者权利要求1～9任一项所述的细胞膜-糖基聚合物为载体包载药物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
18.根据权利要求17所述的药物，其特征在于：所述包载的药物为抗肿瘤药物。
19.根据权利要求18所述的药物，其特征在于：所述包载的药物为奥拉帕尼。
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