CN113811543A - 刺激剂用于测定免疫细胞效力的用途 - Google Patents

Abstract

描述了一种测定免疫细胞的效力的方法。所述方法包含使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，植物凝集素(PHA))接触并检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量的步骤。还描述了用于测定免疫细胞效力的试剂盒。效力测定对于满足针对如免疫治疗性细胞等新型生物药剂的FDA要求来说非常重要。描述了使用强效免疫细胞作为免疫治疗性治疗的方法。

Description

刺激剂用于测定免疫细胞效力的用途

相关申请

本申请要求于2019年2月14日提交的美国临时申请第62/805,349号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及免疫疗法，并且更具体地涉及测试免疫细胞的效应子功能。

背景技术

免疫疗法通过激活或抑制免疫系统来治疗疾病。来源于免疫系统的细胞可以用于改善免疫功能和特性。近年来，免疫疗法尤其是在其有望治疗各种形式的癌症的方面备受研究人员、临床医生和制药公司的关注。免疫调节方案通常比现有药物具有更少的副作用，包含在治疗微生物疾病时产生耐药性的可能性更小。

常规的癌症治疗集中在利用化学疗法、外科手术和/或放射杀死或移除癌细胞。然而，治疗性免疫细胞领域正在迅速发展并且可以与常规治疗结合使用或在一些情况下代替常规治疗来治疗、预防或延迟癌症的发作。如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等免疫效应子细胞通过靶向在肿瘤细胞表面上表达的异常抗原天然地一起工作以保护身体免受癌症侵害。最近的癌症治疗发展集中在引导患者的免疫系统攻击和破坏肿瘤。正在使用各种策略或者正在对各种策略进行研究和测试。

过继性细胞转移(ACT)是将细胞转移到患者中并且已经示出抵抗肺癌、黑色素瘤和其它癌症的前景。这些细胞可以源自患者(自体)或源自另一个个体(同种异体)。同种异体疗法涉及从与接受细胞的患者分开的供体分离和扩增的细胞。可替代地，过继性细胞转移可以用于在体外培养自体提取的细胞并且对其进行扩增以用于以后的输血。例如，自体免疫增强疗法涉及提取受试者自身外周血源性自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、上皮细胞和其它相关免疫细胞，在体外对这些细胞进行扩增，并且然后将这些细胞重新输注到受试者体内。

在一些疗法中，细胞(例如，T细胞)在返回到同一患者之前在体外进行基因修饰和扩增。嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)涉及从受试者采集T细胞，并且然后用含有T细胞受体(TCR)基因拷贝的逆转录病毒感染T细胞。TCR基因专门用于识别肿瘤抗原(例如，嵌合抗原受体或CAR)。病毒将受体整合到T细胞的基因组中。对细胞进行非特异性地扩增和/或刺激。然后重新输注细胞并且产生针对肿瘤细胞的免疫应答。

随着首个CAR-T疗法的批准以及多家商业公司参与多个临床试验，此领域在商业上激增并且示出用于免疫疗法的前景。随着所述领域每隔一天的新临床试验的推进，对这些治疗性免疫细胞进行可靠且可再现的效力测试的需求自此一直在增长。测试免疫细胞的效应子功能的行业“黄金标准”是铬释放测定，此测定于20世纪60年代开发并且仍在使用中，即使存在由于使用放射性物质和由靶肿瘤细胞引起的变异性而引起的担忧。可用的替代方案是基于钙黄绿素的测定，所述测定仍然具有许多由于使用不同的肿瘤靶标以及钙黄绿素在肿瘤靶标的凋亡小体中的截留而引起的变异性。

还在开发不同的方式来目视地查看这些免疫细胞的效应子功能方面的其它努力，但这些方法仍然使用靶肿瘤细胞。用于检查免疫细胞的效应子功能的其它替代方法是检查由这些细胞产生的细胞因子，其中所有常规方法都使用靶肿瘤细胞诱导从免疫细胞产生细胞因子。由于肿瘤细胞类型之间的变异性，靶肿瘤细胞的使用增加了这些测试中的所有测试的生物变异性。而且，这些测定需要繁琐的设置，这会在这些测定中引入批效应。批效应由靶细胞条件、板加载中的人与人之间的变异性、板条件、各种试剂的变异性、读数变异性等引起。显然需要能够移除这些变异性中的所有变异性并且产生可靠且可再现的结果的免疫细胞效力测定。

评估免疫细胞疗法产品的质量需要可靠且可再现的效力测定。审批过程受到严格监管，并且为了获得批准，药品开发商将需要向监管机构提交大量有关药物产品的信息。这可以包含有关药物产品效力的信息和用于测定此效力的测定。根据FDA(21CFR610.10)的要求，应通过适当的测试来指示细胞疗法产品的效力，以示出这些治疗性免疫细胞示出效力的效应子功能，所述测试将是测量由这些免疫细胞产生的相关细胞因子。

发明内容

在附图和以下描述中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。根据说明书和附图并且根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。

在一方面，本文公开了测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，植物凝集素(PHA)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)/离子霉素、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和/或商陆丝裂素(PWM))接触并检测由所述免疫细胞产生的一个或多个细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase 3-like 1)、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量。在一方面，所述方法可以进一步包括将所产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用所述免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较。

本文还公开了根据任何前述方面所述的测定免疫细胞的效力的方法，其中使用免疫测定(例如，ELISA、细胞内细胞因子染色、ELISpot、流式细胞术、Luminex

定量PCR(包含但不限于qRT-PCR)和/或珠阵列)检测细胞因子的量。

在一方面，本文公开了根据任何前述方面所述的测定免疫细胞的效力的方法，其中所述免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触至少5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟、120分钟、150分钟、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、32小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、60天、61天、62天、3个月、4个月、5个月或6个月。

本文还公开了根据任何前述方面所述的测定免疫细胞的效力的方法，其中所述刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)以1.0μg/mL到1000μg/mL的浓度(包含但不限于5μg/mL到15μg/mL的浓度)提供。

在一方面，本文公开了用于测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的试剂盒，所述试剂盒包括包含有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)和适合于免疫细胞的缓冲液的容器(例如，微量离心管)。在某一方面，所述试剂盒可以进一步包括用于使用所述试剂盒来刺激由免疫细胞产生细胞因子的说明书。

本文还公开了根据任何前述方面所述的用于测定免疫细胞的效力的试剂盒，其中所述刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)以1.0μg/mL到1000μg/mL的浓度(包含但不限于5μg/mL到15μg/mL的浓度)提供。

在一方面，本文公开了免疫疗法方法，所述免疫方法包括：a)对多个免疫细胞执行根据任何前述方面所述的测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法以测定每个免疫细胞的效力；b)根据检测到的细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量选择至少一个强效免疫细胞；以及c)向有需要的受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞作为免疫治疗剂。在一方面，所述方法可以进一步包括在测定所述免疫细胞的效力之前，从同种异体或自体供体提取所述多个免疫细胞。

本文还公开了根据任何前述方面所述的免疫疗法方法，所述免疫疗法方法进一步包括在递送治疗有效量的所述强效免疫细胞之前对所述至少一个强效免疫细胞进行扩增。

在一方面，本文公开了根据任何前述方面所述的免疫疗法方法，所述免疫疗法方法进一步包括引导所述多个免疫细胞或所述强效免疫细胞对指定抗原作出应答。在一方面，所述方法可以进一步包括修饰来源于外泌体的细胞系或修饰外泌体本身，以包含所关注免疫细胞作出应答的指定抗原(例如，添加CD19以专门测定非均相样品中CD19CAR T细胞的效力)。

本文还公开了根据任何前述方面所述的免疫疗法方法，所述免疫疗法方法进一步包括基因改变所述多个免疫细胞或所述强效免疫细胞以呈现嵌合抗原受体。

在一方面，本文公开了治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，所述方法包括：a)获得一个或多个免疫细胞(例如，从同种异体或自体供体获得的T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)；b)使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触；c)检测由所述免疫细胞产生的细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量；d)基于检测到的细胞因子的量选择至少一个强效免疫细胞；以及e)向所述受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞。在某一方面，所述方法可以进一步包括从自体或同种异体供体提取所述免疫细胞。

本文还公开了根据任何前述方面所述的治疗、抑制、减少、预防和/或改善癌症和/或转移的方法，所述方法进一步包括在递送治疗有效量的所述至少一个强效免疫细胞之前对所述至少一个强效免疫细胞进行扩增。

本文还公开了基于与细胞类型相关的细胞因子特征来测定至少一个免疫细胞或细胞群的身份(例如，区分Th1、Th2、Th3、Th9、Th17、效应记忆T(Tem)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、γδT细胞或调节性T(Treg)细胞、静息NK细胞、经扩增的NK细胞)的方法。

附图说明

图1提供了示出由K-562肿瘤细胞诱导的NK细胞细胞因子释放相对于由PHA诱导的NK细胞细胞因子释放(以微微克/百万个细胞/小时为单位)之间的相关性的绘图。

图2提供了示出了基于温育时间的结果分析的曲线图。

图3提供了示出了基于细胞数的结果分析的曲线图。

图4提供了示出了用mb-IL-21和TGF-β扩增的NK细胞的PHA测定结果的曲线图。

图5提供了示出了新鲜分离的NK细胞细胞因子释放(由PHA诱导)相对于由PHA诱导的经扩增的NK细胞细胞因子释放(以微微克/百万个细胞/小时为单位)之间的相关性的绘图。

图6提供了示出了在经扩增的(N＝18)和新鲜获得的(N＝10)NK细胞中在由PHA刺激1小时后NK细胞的细胞因子表达的绘图。

图7示出了在PHA刺激后在新鲜获得的NK细胞与经扩增的NK细胞之间表达的细胞因子的浓度的比较。

图8提供了示出了在基于IFN-γ和IL-2表达区分经扩增的NK细胞中的特异性和敏感性的绘图。

图9示出了可以基于IL-2上调和正五聚蛋白-3或壳多糖酶3样蛋白1下调来区分新鲜获得的NK细胞和经扩增的NK细胞。

图10示出了可以基于IFN-γ上调和正五聚蛋白-3或壳多糖酶3样蛋白1下调来区分新鲜获得的NK细胞和经扩增的NK细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种测定免疫细胞的效力的方法，所述方法包含使免疫细胞与有效量的刺激剂接触并检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量。虽然本公开是在癌症免疫疗法的上下文中给出的，但本文公开的概念和创新可以应用于针对其它疾病和病症的免疫疗法。例如，还可以使用本文公开的测定测试在针对自身免疫性疾病、炎性疾病或病症、病毒性疾病和/或细菌感染的免疫疗法中使用的免疫细胞的效力。

定义

为了清楚理解和便于参考，已经在此处编译了贯穿简要描述部分和申请的其余部分使用的术语表。术语中的一些术语在整个领域中是众所周知的并且为清楚起见在此进行定义，而术语中的一些术语是本申请所特有的，并且因此必须进行定义以正确理解申请。

如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一种/一个(a/an)”以及“所述(the)”包含复数对象，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“细胞”包含多种细胞，包含其混合物。在本文中使用复数形式的情况下，其通常包含单数形式。

在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包含从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施例。将进一步理解，所述范围中的每个范围的端点在相对于另一个端点以及独立于另一个端点两个方面都是显著的。通过端点叙述的数值范围包含归入所述范围内的所有数字(例如，1到5包含1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。还应当理解，本文公开了多个值，并且每个值在本文中还被公开为“约”为除了所述值本身之外的所述特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，如本领域的技术人员适当理解的，当公开的值“小于或等于”所述值时，还公开了“大于或等于所述值”以及所述值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，以多种不同的格式提供数据，并且此数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10与15之间。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

如本文所使用的，术语“包括”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应当意味着排除对组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体(如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)中排除痕量污染物。“由……组成(consisting of)”应当意味着排除多于痕量要素的其它成分和用于施用本发明的组合物的大量方法步骤。由这些过渡术语中的每个过渡术语定义的实施例在本发明的范围内。

“增加”可以指导致更大量的症状、疾病、组合物、病状或活动的任何变化。增加可以是病状、症状、活动、组合物以统计学显著量的任何个体、中值或平均增加。因此，增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的增加，只要增加是统计上显著的。

“减少”可以指导致更少量的症状、疾病、组合物、病状或活动的任何变化。当利用物质的基因产物的遗传输出相对于不利用所述物质的基因产物的输出较低时，所述物质还应被理解为减少基因的遗传输出。还例如，减少可以是病症症状的使得症状比先前观察到的更少的变化。减少可以是病状、症状、活动、组合物以统计学显著量的任何个体、中值或平均减少。因此，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的减少，只要减少是统计上显著的。

“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”和“抑制(inhibition)”意指减少活性、应答、病状、疾病或其它生物参数。这可以包含但不限于活性、应答、病状或疾病的完全消融。这还可以包含例如与天然或对照水平相比，活性、应答、病状或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减少量。

“减少(reduce)”或所述词语的其它形式(如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”)意指减少事件或特性(例如，肿瘤生长)。应当理解，这通常与某个标准或预期值有关，换言之它是相对的，但并不总是需要引用标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”意指相对于标准或对照减少肿瘤生长的速率。

“预防(prevent)”或所述词语的其它形式(如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”)意指阻止特定事件或特性，以稳定或延迟特定事件或特性的发展或进展，或最小化特定事件或特性发生的可能性。预防不需要与对照进行比较，因为其通常比例如减少更绝对。如本文所使用的，某物可以减少但不能预防，但减少的某物也可以预防。同样，某物可以预防但不能减少，但预防的某物也可以减少。应当理解，除非另外明确指出，否则在所使用的减少或预防的情况下，还明确公开了其它词语的使用。

术语“治疗有效”旨在对活性剂(如免疫治疗性细胞)的数量或量进行量化，这将实现减少疾病严重程度的目标，同时避免不良副作用，如通常与替代性疗法相关的副作用。治疗有效量可以以一剂或多剂施用。治疗有效的治疗包含改善受试者的生活质量的治疗，即使所述治疗本身并不改善疾病结果。

“有效量”通常意指提供期望的局部或全身效应的量，例如，有效刺激细胞因子形成，包含实现本申请中描述的具体期望效果的量。例如，有效量是足以实现有益的或期望的临床结果的量。

术语“受试者”是指作为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。在一方面，受试者可以是人、非人灵长类动物、牛、马、猪、犬或猫。受试者还可以是豚鼠、大鼠、仓鼠、兔、小鼠或鼹鼠。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医师)的治疗下的受试者。

术语“治疗上可接受的载体”意指可用于制备通常安全且无毒的组合物的载体或赋形剂并且包含兽医和/或人使用的可接受的载体。静脉内递送方法将利用生理平衡的治疗上可接受的载体(例如，在对于静脉内使用来说是安全的渗透水平和pH水平)。如本文所使用的，术语“治疗上可接受的载体”涵盖如标准载体中的任何载体，如盐水、林格氏(Ringers)、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、葡萄糖水溶液和如油/水或水/油乳剂等乳剂以及各种类型的润湿剂。如本文所使用的，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于治疗调配物中的其它材料。治疗上可接受的载体还可以包含防腐剂(包含冷冻防腐剂)，如将保持免疫细胞的活力和/或效力的那些防腐剂。如在说明书和权利要求中所使用，“治疗上可接受的载体”包含一种和多于一种此类载体两者。

术语“治疗”是指患者的医疗管理，旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病状或病症。此术语包含积极治疗，也就是说，治疗特异性针对疾病、病理病状或病症的改善，并且还包含病因治疗，也就是说，治疗针对相关疾病、病理病状或病症的病因的移除。另外，此术语包含姑息治疗，也就是说，设计治疗用于减轻症状而不是治愈疾病、病理病状或病症；预防治疗，也就是说，治疗针对将相关疾病、病理病状或病症的发展最小化或部分地或完全抑制其发展；和支持性治疗，也就是说，治疗用于补充针对相关疾病、病理病状或病症的改善的另一种特异性疗法。

对受试者的“施用”包含向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述途径包含口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠胃外、微动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入式储药器、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所使用的，“同时施用(concurrent administration)”、“组合施用”、“同时施用(simultaneous administration)”或“同时地施用”意指化合物在同一时间点施用或基本上一个紧接一个施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与所述化合物在同一时间点施用时所获得的结果难以区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如大于身体的50％)的途径(例如穿过进入循环系统或淋巴系统的入口)向受试者引入或递送药剂。相比之下，“局部施用”是指通过将药剂引入或递送到施用点的区域或紧邻施用点的区域并且不以治疗显著量全身性地引入药剂的途径向受试者引入或递送药剂。例如，局部施用的药剂可在施用点的局部附近容易地检测，但在受试者身体的远侧部分中不可检测或可检测到的量可忽略不计。施用包含自我施用和由他人施用。

如本文所使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和其语法变体包含施用组合物，旨在或目的是部分或完全预防、延迟、治愈(curing)、治愈(healing)、缓解、减轻(relieving)、改变、补救、改善、改进、稳定、减轻(mitigating)和/或减少一种或多种疾病或病状的强度或频率、疾病或病状的症状或疾病或病状的潜在病因。可以预防性地(preventively)、预防性地(prophylactically)、姑息性地或补救性地应用根据本发明的治疗。在癌症发作之前(例如，癌症的明显迹象之前)、在早期发作期间(例如，癌症的初始迹象和症状时)或在确定的癌症发展之后，向受试者施用预防性治疗。预防性施用可以在疾病或感染症状表现前数天到数年进行。

本文所公开的方法和试剂盒利用刺激剂。如本文所使用的，刺激剂可以是可以充当抗原和/或免疫原以刺激免疫细胞分泌细胞因子的任何分子、肽、多肽、蛋白质、凝集素和/或丝裂素。刺激剂包含但不限于植物凝集素(PHA)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)/离子霉素、伴刀豆球蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)和/或商陆丝裂素(PWM)、花生凝集素(PNA)、小麦胚芽凝集素和蓖麻毒蛋白。

贯穿本申请，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容特此通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述本所属领域的现状。对于文献中含有的在文献所依赖的句子中讨论的材料，所公开的参考文献也单独地和具体地通过引用并入本文。

免疫效力测定

在一方面，本发明提供了一种测定免疫细胞的效力的方法。所述方法包含使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触并检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量的步骤。例如，通过将刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、ConA、LPS和/或PWM)悬浮在细胞培养基中并且将免疫细胞暴露于细胞培养基，可以使免疫细胞与刺激剂接触。

在一些实施例中，所述方法包含将所产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用所述免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较的步骤。效力测定用于表征产品(即免疫细胞)以监测批次间一致性并且确保产品的稳定性，并且因此应该足够敏感以检测可能会影响产品的作用机制和功能的差异并且由此具有潜在的临床意义。所述测定还可以用作用于细胞介导的免疫疗法的预测性生物标志物或药效学测定。优选地，效力测定与产品的推定的生理/药理活性有最密切可能的关系。本文所描述的效力测定提供了在产品规格内测量效力值的能力；检测潜在临床意义的差异的高敏感度；与产品的作用机制和推定的生理/药理活性的密切关系。优选地，效力测定还满足以下次要标准：足够低的测定内和测定间变异(以获得支持产品规格所需的精确度)；足够的稳健性；并且适合高通量分析。在一些实施例中，所述测定用作临床测定，以量化T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞功能(诊断NK细胞免疫缺陷、用于监测免疫抑制剂或免疫激活剂有效性的生物标志物)。

如上所述，所公开的方法提供了测定免疫细胞的效力。如本文所定义的，免疫细胞是产生细胞因子的免疫系统的任何细胞(即产生细胞因子的免疫细胞)。产生细胞因子的免疫细胞的实例包含淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。淋巴细胞包含B细胞和T细胞两者(包含CD4和CD8 T细胞)。在一方面，免疫细胞可以包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞和/或CARNK。免疫细胞可以从细胞培养物获得或可以从受试者(例如，同种异体供体或自体供体)获得。

在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。T细胞在细胞介导的免疫中发挥核心作用并且可以通过细胞表面上T细胞受体的存在与其它淋巴细胞(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。T细胞的实例包含T辅助细胞(TH细胞)、细胞毒性T细胞(TC细胞)、记忆T细胞、调节性或“抑制性”T细胞和自然杀伤T细胞(NKT细胞，其与NK细胞不同并且识别糖脂抗原而不是由MHC分子呈现的肽。不同类型的T细胞在细胞因子产生模式上彼此不同)。T细胞可以是CD4或CD8 T细胞。另外，T细胞可以包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞。自然杀伤细胞是免疫系统的一种细胞毒性淋巴细胞。NK细胞对病毒感染的细胞提供快速应答并且对转化的细胞作出应答。通常，免疫细胞检测来自由感染的细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子呈现的病原体的肽，从而触发细胞因子释放，导致裂解或凋亡。然而，NK细胞是独特的，因为无论MHC分子上是否存在来自病原体的肽，NK细胞都能够识别受激细胞。NK细胞被命名为“自然杀手”是因为最初的想法是这些细胞不需要事先激活以杀死靶标。NK细胞是大颗粒淋巴细胞(LGL)并且已知在骨髓中分化和成熟，然后从骨髓进入循环中。在某一方面，NK细胞可以是CAR NK细胞。

因此，在一方面，本文公开了测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触并检测由所述免疫细胞产生的一个或多个细胞因子的量。在一方面，所述方法可以进一步包括将所产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用所述免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较。

所述测定包含在用刺激剂刺激免疫细胞之后检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量的步骤。如本文所使用的，术语“细胞因子”是指在细胞信号传导并且具体是可以由免疫细胞产生的免疫调节中很重要的小蛋白质(约5-20kDa)。细胞因子的实例包含趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。检测到的细胞因子可以包含已知由被评估的免疫细胞产生的细胞因子，或者检测可以涵盖更广泛的各个细胞因子，包含未知由免疫细胞产生的细胞因子。

在一些实施例中，被检测的细胞因子包含已知由T细胞或自然杀伤细胞产生的细胞因子。在一些实施例中，细胞因子包含已知由T细胞产生的那些细胞因子。T细胞包含Th1细胞和Th2细胞；Th1细胞主要产生干扰素(IFN)-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(TNF-α)和IL-2；Th2细胞产生白介素(IL)-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-22。由被刺激的自然杀伤细胞产生的细胞因子的实例包含IL-lα、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子(LIF)和趋化因子巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α(MIP-1α)、MIP-1β和RANTES。可用于测定免疫细胞的效力的其它细胞因子包含但不限于：B细胞活化因子/肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员13B(BAFF/TNFSF13B)、分化簇(CD)163(CD163)、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Ra、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、骨钙蛋白、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、正五聚蛋白-3(Pentraxin-3)、肿瘤坏死因子(TNF)-受体1(TNF-R1)、TNF-R2、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)或TNF相关的弱凋亡诱导因子(TWEAK)/TNF超家族成员12(TWEAK/TNFSF12)。因此，在一方面，本文公开了测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，植物凝集素(PHA)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)/离子霉素、伴刀豆球蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)和/或商陆丝裂素(PWM))接触并检测由所述免疫细胞产生的一个或多个细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、LIF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量。本文公开了测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触并检测由所述免疫细胞产生的一个或多个细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量。在一方面，所述方法可以进一步包括将所产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用所述免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较。在一些实施例中，对多个细胞因子的水平进行测定。在另外的实施例中，细胞因子选自由白介素-2、白介素-6和干扰素-γ组成的组。

测定包含检测由免疫细胞产生的细胞因子的量的步骤。本领域的技术人员已知用于检测细胞因子的广泛的各种方法，所述方法可以根据被检测的细胞因子而变化。在一些实施例中，一种或多种方法可以用于检测和/或量化多种不同细胞因子的存在。例如，可以通过使用特异性试剂盒或免疫测定来检测细胞因子。可以使用可从如Miltenyi Biotec^TM、路明克斯公司(Luminex)和Thermo Fisher Scientific^TM等商业供应商获得的试剂盒检测细胞因子。适合于检测细胞因子的试剂盒的实例是快速细胞因子检查器(CD4/CD8)试剂盒或MACSPlex细胞因子T/NK试剂盒，这些试剂盒可以检测由T细胞或NK细胞形成的细胞因子，这些试剂盒中的两者均由Miltenyi Biotec^TM出售。

在一些实施例中，细胞因子的量是使用免疫测定来检测的。免疫测定有许多不同的形式和变化。免疫测定可以以多个步骤运行，其中在测定的不同点添加和洗去或分离试剂。免疫测定包含非均相免疫测定(其包含多个步骤)和均相免疫测定(其涉及将试剂和样品简单地混合并进行物理测量)。免疫测定通常利用校准物，所述校准物是已知含有所讨论的分析物的溶液，并且所述分析物的浓度通常是已知的。将对真实样品的测定的应答与由校准物产生的测定的应答进行比较，使得能够按照样品中分析物的存在或浓度来解释信号强度。免疫测定的类型包含竞争性均相免疫测定、竞争性非均相免疫测定、一位点非竞争性免疫测定和双位点非竞争性免疫测定。免疫测定还包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、横向流动免疫测定、酶联免疫吸附点(ELIspot)测定、流式细胞术、细胞内细胞因子染色、抗体阵列测定和基于珠的测定、磁性免疫测定、放射免疫测定和定量PCR(包含但不限于qRT-PCR)。在一方面，测定包括Luminex

测定免疫细胞的效力的方法包含使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触的步骤。

应当理解并且在本文中考虑了免疫细胞必须暴露于刺激剂持续一段时间以被诱导产生细胞因子。在一方面，本文公开了测定免疫细胞的效力的方法，其中所述免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触至少5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟、120分钟、150分钟、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、30小时、32小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、45天、60天、61天、62天、3个月、4个月、5个月或6个月。

本文还公开了根据任何前述方面的测定免疫细胞的效力的方法，其中刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)以5μg/mL到1000μg/mL的浓度提供。在一方面，刺激剂的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、125μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、175μg/mL、180μg/mL、190μg/mL、200μg/mL、225μg/mL、250μg/mL、275μg/mL、300μg/mL、325μg/mL、350μg/mL、375μg/mL、400μg/mL、425μg/mL、450μg/mL、475μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、650μg/mL、700μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、850μg/mL、900μg/mL、950μg/mL或1000μg/mL。在一方面，刺激剂的浓度为约1μg/mL到100μg/mL、1μg/mL到50μg/mL、1μg/mL到15μg/mL或5μg/mL到15μg/mL。

在一方面，应当理解并且在本文中考虑了所产生的用于测定免疫细胞的效力的相同细胞因子还可以用于鉴定产生细胞因子的细胞。免疫细胞具有本领域公知的不同的表达谱。本文还公开了基于与细胞类型相关的细胞因子特征来测定至少一个免疫细胞或细胞群的身份(例如，区分Th1、Th2、Th3、Th9、Th17、效应记忆T(Tem)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、γδT细胞或调节性T(Treg)细胞、静息NK细胞、经扩增的NK细胞)的方法。因此，本文公开了鉴定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触并检测由所述免疫细胞产生的一个或多个细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量；其中基于所表达的细胞因子的谱揭示免疫细胞的身份。

用于评估免疫细胞效力的试剂盒

本发明的另一方面提供了一种用于测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的试剂盒，所述试剂盒包括包含有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)和适合于免疫细胞的缓冲液的容器。在一些实施例中，试剂盒中的刺激剂以5μg/mL到1000μg/mL的浓度提供。在一方面，刺激剂的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、55μg/mL、60μg/mL、65μg/mL、70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、125μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、175μg/mL、180μg/mL、190μg/mL、200μg/mL、225μg/mL、250μg/mL、275μg/mL、300μg/mL、325μg/mL、350μg/mL、375μg/mL、400μg/mL、425μg/mL、450μg/mL、475μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL、650μg/mL、700μg/mL、750μg/mL、800μg/mL、850μg/mL、900μg/mL、950μg/mL或1000μg/mL。在一方面，刺激剂的浓度为约1μg/mL到100μg/mL、1μg/mL到50μg/mL、1μg/mL到15μg/mL或5μg/mL到15μg/mL。在一些实施例中，容器是微量离心管(例如，Eppendorf微量离心管)。试剂盒还可以包含用于从受试者获得样品的工具，如用于获得包含一个或多个免疫细胞的样品的注射器。合适的缓冲液是RPMI。

试剂盒还可以包含进行免疫测定所需的组分，如固相，所述组合与用作夹心免疫测定形式的捕获抗体和/或检测抗体的抗体结合。固相可以是如磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、比色皿、膜、支架分子、石英晶体、膜、滤纸、圆盘或芯片等材料。试剂盒还可以包含可检测标记，所述可检测标记可以与或与如用作检测抗体的抗体等抗体缀合。可检测标记可以例如是直接标记，所述直接标记可以是酶、寡核苷酸、纳米颗粒化学发光团、荧光团、荧光猝灭剂、化学发光猝灭剂或生物素。测试试剂盒可以任选地包含检测标记所需的任何另外的试剂。

试剂盒可以进一步包含用于使用试剂盒来刺激由免疫细胞产生细胞因子以评估免疫细胞的效力的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于使用细胞因子的量来测定细胞的效力的说明书。试剂盒中包含的说明书可以附连到包装材料或者可以作为包装插入物包含。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但其不限于此。本公开考虑了能够存储此类说明书并且将其传送到最终用户的任何介质。此类介质包含但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所使用的，术语“说明书”可以包含提供说明书的互联网站点的地址。

免疫疗法方法

可以在使用免疫细胞作为免疫治疗剂之前执行测定免疫细胞的效力的方法。例如，可以如上所述执行测定一个或多个免疫细胞的效力的方法，之后可以(基于检测到的细胞因子的量)选择至少一个强效免疫细胞并且可以将治疗有效量的强效免疫细胞作为免疫治疗剂递送到受试者。因此，在一方面，本文公开了免疫疗法方法，所述免疫方法包括：a)对多个免疫细胞执行如本文所公开的测定免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)的效力的方法以测定每个免疫细胞的效力；b)根据检测到的细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量选择至少一个强效免疫细胞；以及c)向有需要的受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞作为免疫治疗剂。在一方面，所述方法可以进一步包括在测定所述免疫细胞的效力之前，从同种异体或自体供体提取所述多个免疫细胞。

在一些实施例中，免疫细胞是免疫治疗性免疫细胞。免疫治疗性免疫细胞是可用于治疗如癌症等疾病的细胞。Becker等人,《癌症免疫学免疫疗法(CancerImmunol.Immunother)》65,477-484(2016)。已经描述了经扩增的NK细胞用于癌症治疗的用途。Rezvani等人,《免疫学前沿(Front Immunol)》,6,578(2015)。因为能够在免疫疗法期间施用大量免疫细胞是有帮助的，所以在一些实施例中，免疫细胞是经扩增的免疫细胞。经扩增的免疫细胞是离体生长以生长大量免疫细胞的细胞。在一些实施例中，经扩增的免疫细胞是可以容易地施用于受试者而不引起免疫应答的自体细胞。然而，在一些实施例中，经扩增的免疫细胞是同种异体免疫细胞，其中其固有的同种异体反应性可以是有益的。在另外的实施例中，经扩增的免疫细胞被基因工程化成包含嵌合抗原受体，以帮助免疫细胞靶向疾病组织。经扩增的免疫细胞的制备包含对免疫细胞进行激活和扩增。Koepsell等人,《输血(Transfusion)》,53(2):404-10(2013)。许多细胞因子(IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、I型IFN和TGF-β)已被证明可用于对免疫细胞进行激活和离体扩增。例如，在一些实施例中，被评估的NK细胞是经IL-21扩增的NK细胞。因此，在一方面，本文公开了免疫疗法方法，所述免疫疗法方法进一步包括在递送治疗有效量的所述强效免疫细胞之前对所述至少一个强效TGF免疫细胞进行扩增。

扩增是指NK细胞的离体增殖，使得NK细胞的群体增加。例如，可以从外周血单核细胞对NK细胞进行扩增。然而，NK细胞也可以从如造血干细胞或祖细胞等其它类型的细胞扩增。初始血细胞或干细胞可以从各种不同来源(如胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝)分离。扩增发生在细胞培养基中。合适的细胞培养基是本领域的技术人员已知的。经扩增的细胞可以作为细胞系提供，所述细胞系是可以维持在细胞培养物中的多个细胞。因此，在一方面，本文公开了免疫疗法方法，所述免疫疗法方法进一步包括在递送治疗有效量的所述强效免疫细胞之前对所述至少一个强效免疫细胞进行扩增。在一些方面，在执行测定免疫细胞的效力的方法之前，已经使用已知方法从受试者提取免疫细胞。可替代地，免疫细胞可以来源于细胞培养物的扩增。

在一些方面，引导免疫细胞对指定抗原(例如，CD19)作出应答。可以在测定免疫细胞的效力的方法之前或在测定免疫细胞的效力的方法之后引导免疫细胞作出应答。在一些实施例中，对免疫细胞进行遗传改变以对指定抗原作出应答。例如，抗原可以是肿瘤特异性抗原。在一些方面，免疫疗法方法包含(在测定免疫细胞的效力之前或之后)对免疫细胞进行遗传改变以呈现嵌合抗原受体。在一方面，所述方法可以进一步包括修饰来源于外泌体的细胞系或修饰外泌体本身，以包含所关注免疫细胞作出应答的指定抗原(例如，添加CD19以专门测定非均相样品中CD19 CAR T细胞的效力)。

如贯穿测定免疫细胞的效力的方法所指出的，所述方法可以用作过继性细胞转移治疗的一部分。可以使用治疗上可接受的载体向受试者递送强效免疫细胞。静脉内递送通常用于递送免疫治疗性细胞，但还可以考虑其它方法(例如，将移植物引导到身体的需要免疫疗法的局部区域)。

可以通过将由免疫细胞产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较来对治疗有效量进行测定。应当理解并且在本文中考虑了治疗有效量取决于被施用的免疫细胞、被治疗的受试者和所治疗的疾病、病症和/或病状。本领域的技术人员将知道待使用的对被治疗的受试者将是治疗有效的免疫细胞的适当剂量。

强效免疫细胞的治疗有效量涵盖多个强效免疫细胞。例如，在选择至少一个强效免疫细胞后，可以在体外对所选择的细胞进行扩增以产生多个强效免疫细胞。

接受强效免疫细胞的受试者可以是将受益于免疫疗法的任何受试者(例如，患有自身免疫性疾病、炎性疾病或病症、病毒性疾病和/或细菌感染的受试者)。在一些实施例中，受试者可以是癌症患者。在一些实施例中，受试者可以是处于高癌症发生风险、被诊断患有癌症、进行癌症治疗或在外科手术后从癌症中恢复的个体。在一些实施例中，强效免疫细胞可以作为预防剂递送到受试者，以预防、抑制或延迟癌症或转移的发作。

治疗疾病的方法

应当理解并且在本文中考虑了本文鉴定的强效免疫细胞可以用于治疗任何疾病或病症，其中过继性免疫疗法可以用于治疗包含但不限于自身免疫性疾病、炎性疾病或病症、病毒性疾病和/或细菌感染。因此，在一方面，本文公开了治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，所述方法包括：a)获得一个或多个免疫细胞(例如，从同种异体或自体供体获得的T细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、CAR T细胞和/或CAR NK细胞)；b)使免疫细胞与有效量的刺激剂(例如，PHA、PMA/离子霉素、Con A、LPS和/或PWM)接触；c)检测由所述免疫细胞产生的细胞因子(例如，IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、BAFF/TNFSF13B、CD163、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1、gp130、IFN-α2、IL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、MMP-1、骨钙蛋白、OPN、正五聚蛋白-3、TNF-R1、TNF-R2、TSLP、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、RANTES和/或TWEAK/TNFSF12)的量；d)基于检测到的细胞因子的量选择至少一个强效免疫细胞；以及e)向所述受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞。在某一方面，所述方法可以进一步包括从自体或同种异体供体提取所述免疫细胞。

应当理解并且在本文中考虑了能够在免疫疗法期间施用大量免疫细胞是有帮助的，在一些实施例中，免疫细胞是经扩增的免疫细胞。经扩增的免疫细胞是离体生长以生长大量免疫细胞的细胞。因此，本文公开了治疗、抑制、减少、预防和/或改善自身免疫性疾病、炎性疾病或病症、病毒性疾病、细菌感染、癌症和/或转移的方法，所述方法进一步包括在递送治疗有效量的所述至少一个强效免疫细胞之前对所述至少一个强效免疫细胞进行扩增。

应当理解并且在本文中考虑了所公开的治疗方法可以用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病或病状，包含但不限于癌症和转移。使用强效免疫细胞的所公开的方法可以用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌(head and neck cancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、成神经细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌(cervical cancer)、宫颈癌(cervical carcinoma)、乳腺癌以及上皮癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonary cancer)、食管癌、头颈癌(head andneck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结肠癌、直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。

可以使用所公开的方法治疗的自身免疫性疾病的实例包含但不限于：失弛症、急性播散性脑脊髓炎、急性运动性轴索神经病、艾迪生氏病(Addison's disease)、痛性肥胖症、成人斯提耳氏病(Adult Still's disease)、低丙种球蛋白血症、斑秃、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经机能障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴索和神经元神经病(AMAN)、巴洛病(Balódisease)、白塞病(Behcet'sdisease)、良性粘膜类天疱疮、毕克斯达夫脑干脑炎(Bickerstaff's encephalitis)、大疱性类天疱疮、卡斯特莱曼病(multicentric Castleman disease，CD)、乳糜泻、恰加斯病(Chagas disease)、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome，CSS)、嗜伊红细胞性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科干综合征(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯赛基病毒性心肌炎、CREST综合征、克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、1型糖尿病、盘状红斑狼疮、德雷斯勒氏综合征(Dressler's syndrome)、子宫内膜异位、附着点炎、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文斯综合征(Evans syndrome)、费尔蒂综合征(Felty syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑病(Hashimoto's encephalopathy)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、炎性肠病(IBD)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮性肾炎、狼疮性血管炎、慢性莱姆病、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren'sulcer)、穆哈-赫伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、奥德氏甲状腺炎(Ord's thyroiditis)、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕桑那格-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围性脑脊髓炎(Perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型、III型多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、银屑病、银屑病性关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性血管炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)、巩膜炎、硬皮病、舍格伦氏综合征(

syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、西登哈姆舞蹈病(Sydenham chorea)、交感性眼炎(SO)、系统性红斑性红斑狼疮、系统性硬皮病、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome，THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)和韦格纳氏肉芽肿(Wegener's granulomatosis)(或肉芽肿性多血管炎(GPA))。

包含以下实例以说明本发明的优选实施例。本领域的技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。

实例

本文所公开的测定旨在测试治疗性免疫细胞的效力，所述测定将解决当前标准方法存在的问题并且满足FDA要求。为了实现这一点，植物凝集素(PHA)被用作替代物来诱导免疫细胞中细胞因子的产生。PHA在临床环境中用于测试移植患者的免疫应答。使用PHA在治疗性免疫细胞中诱导细胞因子产生将从免疫细胞效力测定中去除生物变异性和批次变异性中的所有变异性。测定将消除在多个临床输注部位处测试治疗性免疫细胞的效力的完全操作研究实验室的需要并且将为此类测试提供更快的周转时间。作为FDA设定的效力测试要求的一部分，所述测定将提供用于测试治疗性免疫细胞的效应子功能的方法。

使用PHA作为刺激剂测试治疗性免疫细胞的效力

使用肿瘤细胞来测试治疗性免疫细胞的效应子功能已经成为标准实践。这些靶细胞为测定结果增加了生物变异性。而且，由于靶标条件、板设置、人与人之间的技术差异，此测定设置更加繁琐和复杂，从而增加了变异性。NK细胞的治疗应答通过PHA细胞因子测定与广泛使用的肿瘤细胞(K562)介导的细胞因子测定的比较。细胞因子的水平指示来自NK细胞的应答的效力。

图1示出了PHA诱导的细胞因子测定与标准K562诱导的细胞因子测定的相关性。图1中存在的异常值是通过使用肿瘤细胞引入的变异性的结果。在肿瘤细胞介导的测定中检测到更高的GM-CSF分泌(GC-CSF通常由肿瘤细胞分泌)。由于缺乏肿瘤细胞引入的变异性，这示出了PHA测定的明显优势。

图2示出了使用四小时温育对24小时温育(使用100万个NK细胞)获得的细胞因子水平的直方图。图3示出了使用少于100万个细胞和多于100万个细胞获得的细胞因子水平的直方图。对这些条件进行测试以对测定进行标准化。图4示出了用mb-IL-21和TGF-β扩增的NK细胞的PHA测定结果。图5示出了当由PHA诱导时供体免疫细胞与经扩增的治疗性NK细胞产物之间细胞因子谱的差异。

在确定用于测定的最佳细胞数(10⁶)后，用PHA刺激新鲜外周血NK细胞(N＝10)和经扩增的NK细胞(N＝18)的多个供体以产生细胞因子，并且1小时后评估上清液中的细胞因子。大多数细胞因子的表达在两种类型的NK细胞之间是类似的，但与NK细胞功能相关的若干细胞因子和趋化因子响应于刺激而进行高度差异性表达(图6)。接下来，在用PHA刺激1小时后测量新鲜的和经扩增的NK细胞中6种细胞因子的表达。与经扩增的NK细胞相比，正五聚蛋白-3(平均值1,062对7)、IL-8(平均值821对11)和壳多糖酶3样蛋白1(平均值620对7)在新鲜的NK细胞中高度过表达，并且与新鲜的NK细胞相比，IFN-γ(平均值15对105)、IL-2(平均值3对141)和CD30(平均值9对156)在经扩增的NK细胞中高度过表达(图7)。仅在过表达的基础上，表达10pg/mL的IFN-γ和IL-2两者的截止值在区分经扩增的NK细胞与新鲜的外周血NK细胞时具有94％特异性(16/17)和89％敏感性(16/18)(图8)。使用(上调)IL-2连同下调细胞因子(正五聚蛋白-3或壳多糖酶3样蛋白1)一起对区分经扩增的NK细胞和新鲜外周血NK细胞具有100％的敏感性和特异性，其中对于新鲜细胞，表达比率(下调：IL-2)为>1，而对于经扩增的细胞为<1(图9)。使用(上调)IFNg连同下调细胞因子(正五聚蛋白-3或壳多糖酶3样蛋白1)一起在区分经扩增的NK细胞和新鲜外周血NK细胞方面95％有效。多种上调细胞因子和下调细胞因子的组合可以用于增加限定类型的敏感性和特异性(图10)。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与所公开的本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文所引用的出版物和其所引用的材料通过引用具体并入。然而，应当理解，被称为通过引用并入本文的任何专利、出版物或其它公开材料仅在所并入材料与本公开中阐述的现有定义、声明或其它公开材料不冲突的程度上全部或部分并入。如此，并且在必要的程度上，如本文中明确阐述的公开内容取代通过引用并入的任何冲突资料。被称为通过引用并入本文但与本文阐述的现有定义、声明或其它公开材料冲突的任何材料或其部分将仅在所述所并入材料与现有公开材料之间不产生冲突的程度上并入。

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效形式。尽管已经参考特定实施例和实施方案描述了本发明，但应当理解，在不脱离本发明的范围或其发明构思的情况下，可以进行各种改变和另外的变化并且可以用等效物取代本发明的要素。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可以做出许多修改以使特定情况或装置适应本发明的教导。此类等效物旨在被以下权利要求所涵盖。本发明旨在不受限于本文所公开的特定实施方案，而是本发明将包含落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。

Claims (25)

1.一种测定免疫细胞的效力的方法，所述方法包括使免疫细胞与有效量的刺激剂接触并检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：将所产生的细胞因子的量与在免疫疗法中使用所述免疫细胞所需的细胞因子效力水平进行比较的步骤。

3.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中对多个细胞因子的量进行测定。

4.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞或CAR NK细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述NK细胞是IL-21扩增的NK细胞。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述刺激剂包括植物凝集素(PHA)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)/离子霉素、伴刀豆球蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)和/或商陆丝裂素(PWM)。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中细胞因子的量是使用免疫测定来检测的。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述细胞因子选自包括以下的组：白介素(IL)-2(IL-2)、IL-6、干扰素(IFN)-γ(IFN-γ)、B细胞活化因子/肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员13B(BAFF/TNFSF13B)、TNF-α、分化簇(CD)163(CD163)、CD30/TNFRSF8、壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase 3-like 1)、gp130、IFN-a2、IL-6Ra、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-20、IL-22、IL-26、IL-29/IFN-l1、IL-32、IL-34、IL-35、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、骨钙蛋白、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、正五聚蛋白-3(Pentraxin-3)、肿瘤坏死因子(TNF)-受体1(TNF-R1)、TNF-R2、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子(LIF)以及趋化因子巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α(MIP-1α)、MIP-1β、RANTES和/或TNF相关的弱凋亡诱导因子(TWEAK)/TNF超家族成员12(TWEAK/TNFSF12)。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞与有效量的所述刺激剂接触至少4小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述刺激剂以5μg/mL到15μg/mL的浓度提供。

12.一种用于测定免疫细胞的效力的试剂盒，所述试剂盒包括包含有效量的刺激剂和适合于免疫细胞的缓冲液的容器。

13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述刺激剂以5μg/mL到15μg/mL的浓度提供。

14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述容器是Eppendorf微量离心管。

15.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于使用所述试剂盒来刺激由免疫细胞产生细胞因子的说明书。

16.一种免疫疗法方法，其包括：

a.对多个免疫细胞执行根据权利要求1到14中任一项所述的方法以测定每个免疫细胞的效力；

b.基于检测到的细胞因子的量选择至少一个强效免疫细胞；以及

c.向有需要的受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞作为免疫治疗剂。

17.根据权利要求15所述的免疫疗法方法，其进一步包括：在测定所述免疫细胞的效力之前，从同种异体或自体供体提取所述多个免疫细胞。

18.根据权利要求15所述的免疫疗法方法，其进一步包括：在递送治疗有效量的所述强效免疫细胞之前扩增所述至少一个强效免疫细胞。

19.根据权利要求15所述的免疫疗法方法，其进一步包括：引导所述多个免疫细胞或所述强效免疫细胞对指定抗原作出应答。

20.根据权利要求18所述的免疫疗法方法，其进一步包括：基因改变所述多个免疫细胞或所述强效免疫细胞以呈现嵌合抗原受体。

21.一种治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，所述方法包括：

a.获得一个或多个免疫细胞；

b.使免疫细胞与有效量的刺激剂接触；

c.检测由所述免疫细胞产生的细胞因子的量；

d.基于检测到的细胞因子的量选择至少一个强效免疫细胞；以及

e.向所述受试者施用治疗有效量的所述强效免疫细胞。

22.根据权利要求20所述的治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，其中所述一个或多个免疫细胞是从同种异体或自体供体获得的。

23.根据权利要求20所述的治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，所述方法进一步包括从同种异体或自体供体提取所述多个免疫细胞。

24.根据权利要求20到22中任一项所述的治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞或CAR NK细胞。

25.根据权利要求20到23中任一项所述的治疗、抑制、减少、预防和/或改善受试者的癌症和/或转移的方法，所述方法进一步包括在递送治疗有效量的所述至少一个强效免疫细胞之前扩增所述至少一个强效免疫细胞。

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