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CN113939593A - 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治 - Google Patents

用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治 Download PDF

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CN113939593A
CN113939593A CN202080041720.6A CN202080041720A CN113939593A CN 113939593 A CN113939593 A CN 113939593A CN 202080041720 A CN202080041720 A CN 202080041720A CN 113939593 A CN113939593 A CN 113939593A
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editing
cells
inducible promoter
cell
grna
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田天
查尔斯·约翰逊
艾琳·斯宾德勒
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Inscripta Inc
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Abstract

本公开内容提供了用于以处治来自先前轮的编辑的编辑载体来进行活细胞的递归编辑的自动化多模块仪器和自动化方法。

Description

用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
相关案例
本国际PCT申请要求2019年6月6日提交的标题为“Curing for RecursiveNucleic Acid-Guided Cell Editing”的USSN 62/857,967的优先权。
发明领域
本公开内容涉及用于进行递归基因组编辑技术的自动化多模块仪器、组合物和方法。
发明背景
在以下讨论中，将出于背景和简介的目的描述某些物品和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的物品和方法不构成现有技术的权利。
对活细胞的基因组进行精确的、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近已经鉴定出允许操纵基因序列并从而操纵基因功能的各种核酸酶。核酸酶包括核酸指导的核酸酶和核酸酶融合体，其使研究人员能够在活细胞中产生永久性编辑。期望能够顺序地进行两轮至许多轮核酸指导的核酸酶编辑(例如，进行递归编辑)，但是在这样做时，还期望在用后续编辑核酸转化或转染细胞之前，从细胞清除或“处治(curing)”先前编辑的核酸。处治是一种消除先前的编辑载体的方法，包括消除编辑载体上包含的伴随gRNA和供体DNA序列(例如，编辑或CREATE盒)，以及编辑载体上包含的选择基因和其他序列。此外，消除来自先前轮的编辑的编辑载体允许新的编辑载体在细胞内繁殖，而不与先前的编辑载体竞争。
因此，在核酸指导的核酸酶基因编辑领域中，对于用于处治先前轮的编辑中使用的编辑载体的改进的方法、组合物、模块和仪器存在需求。本发明满足了此需求。
发明概述
提供本概述是为了以简化的形式介绍概念选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。本概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。从以下撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求书中限定的那些方面，所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是明显的。
本公开内容提供了用于在递归编辑方案中进行编辑载体的处治的组合物、自动化方法和多模块自动化仪器。
因此，在一些实施方案中，提供了一种在递归的核酸指导的核酸酶编辑期间处治细胞的方法，所述方法包括：设计和合成编辑盒的组，其中编辑盒的组包括一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对，其中每个编辑gRNA和供体DNA对处于第一诱导型启动子的控制下；将编辑盒组装到载体骨架中，从而形成编辑载体，其中载体骨架包含第一可选择标记(selectable marker)和处治靶序列；使选择的细胞成为电感受态，其中选择的细胞包含引擎载体(engine vector)，并且引擎载体包含处于第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA、处于第三诱导型启动子的控制下的核酸酶；和第二可选择标记；用第一组编辑载体转化选择的细胞以产生转化的细胞；经由第一可选择标记和第二可选择标记选择转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第二组编辑载体转化细胞以产生第二转化的细胞，其中第二组编辑载体包含具有处于第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第三可选择标记和处治靶序列。
在该实施方案的一些方面，第一诱导型启动子和第三诱导型启动子是相同的诱导型启动子，并且在一些方面，第一诱导型启动子和第三诱导型启动子是pL启动子，并且编辑载体或引擎载体包含在组成型启动子的控制下的c1857基因。
在一些方面，靶处治序列是pUC复制起点，而处治gRNA是反pUC起点gRNA。
在一些方面，第二诱导型启动子是pPhIF启动子。
在一些方面，方法还包括在第二转化步骤之后的另外步骤：经由第二可选择标记和第三可选择标记选择第二转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使诱导的细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治诱导的细胞中来自第二组编辑载体的编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第三组编辑载体转化细胞以产生第三转化的细胞，其中第三组编辑载体包含具有在第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第四可选择标记和处治靶序列。
在其他方面，方法在第三转化步骤之后还包括以下步骤：经由第二可选择标记和第四可选择标记选择第三转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使诱导的细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治诱导的细胞中来自第三组编辑载体的编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第四组编辑载体转化细胞以产生第四转化的细胞，其中第四组编辑载体包含具有在第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第五可选择标记和处治靶序列。
在一些方面，第一组编辑盒、第二组编辑盒、第三组编辑盒和第四组编辑盒各自包含编辑gRNA和供体DNA对的文库；并且在一些方面，编辑载体的文库各自包含至少1000个不同的编辑gRNA和供体DNA对。
其他实施方案提供了用于在递归的核酸指导的核酸酶编辑期间处治细胞的方法，所述方法包括：设计和合成编辑盒组，其中编辑盒组包含一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对，其中每个编辑gRNA和供体DNA对处于第一诱导型启动子的控制下；将编辑盒组装到载体骨架中，从而形成编辑载体，其中载体骨架包含第一选择性标记、处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA；使所选择的细胞成为电感受态，其中所选择的细胞包含引擎载体，并且引擎载体包含在第三诱导型启动子的控制下的核酸酶和第二可选择标记；用第一组编辑载体转化选择的细胞以产生转化的细胞；经由第一可选择标记和第二可选择标记选择转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第二组编辑载体转化细胞以产生第二转化的细胞，其中第二组编辑载体包含具有在第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第三可选择标记、处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA。
在该实施方案的一些方面，第一诱导型启动子和第三诱导型启动子是相同的诱导型启动子，并且在一些方面，第一诱导型启动子和第三诱导型启动子是pL启动子，并且编辑载体或引擎载体包含在组成型启动子的控制下的c1857基因。
在一些方面，靶处治序列是pUC复制起点，而处治gRNA是反pUC起点gRNA。
在一些方面，第二诱导型启动子是pPhIF启动子。
在该实施方案的一些方面，方法还包括在第二转化步骤之后的另外步骤：经由第二可选择标记和第三可选择标记选择第二转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使诱导的细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治诱导的细胞中来自第二组编辑载体的编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第三组编辑载体转化细胞以产生第三转化的细胞，其中第三组编辑载体包含具有在第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第四可选择标记、处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA。
在又另一个方面，方法在第三转化步骤之后还可以包括以下步骤：经由第二可选择标记和第四可选择标记选择第三转化的细胞；通过诱导第一诱导型启动子和第三诱导型启动子从而诱导一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在选择的细胞中诱导编辑；使诱导的细胞生长，直到细胞达到生长的稳定期；通过诱导第三诱导型启动子和第二诱导型启动子从而诱导核酸酶和处治gRNA的转录来处治诱导的细胞中来自第三组编辑载体的编辑载体；使细胞生长；使细胞成为电感受态；以及用第四组编辑载体转化细胞以产生第四转化的细胞，其中第四组编辑载体包含具有在第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第五可选择标记、处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA。
在任一方法的一些方面，方法还包括在转化步骤和诱导步骤之间，在SWIIN中使细胞单个化，并且其中选择、诱导、生长和处治步骤在SWIIN中进行。
在一些方面，第一组编辑盒、第二组编辑盒、第三组编辑盒和第四组编辑盒各自包含编辑gRNA和供体DNA对的文库；并且在一些方面，编辑载体的文库各自包含至少1000个不同的编辑gRNA和供体DNA对。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优点。
附图简述
从以下对说明性实施方案的详细描述，结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点，在附图中：
图1A是示出根据本公开内容的示例性处治方法的步骤的流程图。图1B是细胞的示例性生长曲线。图1C描绘了用于编辑载体的引擎载体处治的示例性质粒架构，并且图1D描绘了用于编辑载体的自处治(self-curing)的示例性质粒架构。图1E描绘了使用标准铺板方案的示例性递归方法。图1F描绘了使用图1E的标准铺板方案的示例性递归方法。图1G描绘了使用主体液体编辑方案(bulk liquid editing protocol)的示例性递归方法。图1H描绘了使用图1G的主体液体编辑方案的示例性递归方法。图1I描绘了使用固体壁分离装置的示例性递归方法。
图2A-图2C描绘了用于进行核酸指导的核酸酶编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器的三个不同视图。
图3A描绘了用于与本文并且关于图3B-图3D描述的细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一种实施方案。图3B图示了细胞生长模块壳体中旋转生长瓶的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长模块的剖视图。图3D图示了与LED、检测器和温度调节组件耦合的图3B的细胞生长模块。
图4A描绘了用于切向流过滤模块(例如，细胞生长和/或浓缩模块)中的渗余物(上图)和渗透物(中图)构件，以及组装成切向流组件(下图)的渗余物和渗透物构件。图4B描绘了切向流过滤模块的储库组件的两个侧面透视图。图4C-图4E描绘了示例性的顶部，其具有流体和气动端口以及适合于图4B所示的储库组件的密封垫。
图5A和图5B描绘了试剂筒的一种实施方案的结构和部件。图5C是示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的顶部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5D描绘了示例性流通式电穿孔装置的一种实施方案的底部透视图，该装置可以是试剂筒的一部分。图5E-图5G描绘了可用于诸如图2A-图2C中所示的多模块自动化细胞处理仪器中的FTEP装置的顶部透视图、横截面的顶部视图和横截面的侧面透视图。
图6A描绘了在固体壁装置中用于使细胞单个化(singulating)、编辑细胞和使细胞标准化的工作流程的简化图。图6B-图6D描绘了固体壁分离培养和标准化(SWIIN)模块的一种实施方案。图6E描绘了图6B-图6D中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括加热器和加热盖。
图7是包括用于递归细胞编辑的固体壁单个化/生长/编辑/标准化模块的示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图。
图8是可用于递归细胞编辑的示例性自动化多模块细胞处理仪器的替代实施方案的简化过程图。
图9是展示如本文描述的用于使EC23细胞培养物生长的2-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规细胞振荡器有效性的图。
图10是展示如本文描述的用于使EC23细胞培养物生长的3-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规细胞振荡器的有效性的图。
图11是展示如本文描述的用于使EC138细胞培养物生长的4-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规轨道细胞振荡器的有效性的图。
图12是展示如本文描述的用于使EC138细胞培养物生长的2-桨旋转生长瓶和细胞生长装置对比常规轨道细胞振荡器的有效性的图。
图13是展示采用如本文描述的细胞生长装置(其中使用了2-桨旋转生长瓶)实时监测EC138细胞培养物生长至OD600的图。
图14是展示采用如本文描述的细胞生长装置(其中使用了2-桨旋转生长瓶)实时监测s288c酵母细胞培养物生长至OD600的图。
图15A是绘制本文描述的细胞浓缩装置/模块中处理的大肠杆菌(E.coli)培养物的滤液电导率对过滤处理时间的曲线图。图15B是绘制本文描述的细胞浓缩装置/模块中处理的酵母培养物的滤液电导率对过滤处理时间的曲线图。
图16A是示出了使用本公开内容的装置和比较电穿孔装置(comparatorelectroporation device)对大肠杆菌进行电穿孔的结果的柱状图。图16B是示出了针对比较电穿孔装置基准化(benchmarked)的经由如本文描述的FTEP转化的大肠杆菌细胞的摄取、切割和编辑效率的柱状图。
图17是示出了使用本公开内容的FTEP装置和比较电穿孔方法对酿酒酵母(S.cerevisiae)进行电穿孔的结果的柱状图。
图18是显示经由用于增加活细胞中观察到的编辑的主体液体方法获得的编辑结果的图。
图19是比较标准铺板方案(SPP)获得的编辑百分比的图，并且在固体壁分离、诱导和标准化装置(SWIIN)中使用两种不同条件的重复样品：第一种用LB+阿拉伯糖；第二种用SOB，然后是SOB+阿拉伯糖。
图20A、图20B和图20C是在通过标准铺板方案、主体液体方案和SWIIN方案进行的引擎载体驱动的递归实验中测试编辑效率和处治效率的实验中获得的结果的图。
应当理解，附图不必按比例绘制，并且相同的附图标记是指相同的特征。
详细描述
除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合本文描述的方法、装置或仪器的一种实施方案描述的所有功能意在适用于本文描述的方法、装置和仪器的另外的实施方案。例如，除非特征或功能与替代实施方案不兼容，否则在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。
除非另外指出，本文描述的技术的实践可以采用分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和遗传工程技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如Green和Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual.4th,ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,(2014)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编著,(2017)；Neumann等人,Electroporation and Electrofusion in Cell Biology,Plenum Press,New York,1989；和Chang等人,Guide to Electroporation andElectrofusion,Academic Press,California(1992)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸指导的核酸酶技术可以见于以下：例如，Genome Editing andEngineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery,Appasani和Church(2018)；和CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier(2015)；两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
注意，除非上下文另外清楚指示，如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“细胞”是指一个或更多个细胞，并且提及“该系统”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤、方法和装置，等等。此外，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等，仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有出版物出于描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的装置、制剂和方法的目的通过引用并入。
在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，尚未描述本领域技术人员熟知的特征和程序。本文使用的术语意在具有如由本领域普通技术人员理解的平白且普通的含义。
如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'-TCGA-5’与核苷酸序列5'-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3'-TCGA-5'与核苷酸序列5'-TAGCTG-3'的区域是100％互补的。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。
如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸指导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(插入、缺失、取代)引入基因座(例如，靶基因组DNA序列或细胞靶序列)的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点周围的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“插入物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是基因组靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或插入。
如本文使用的，“富集”是指通过单个化，诱导编辑，并且使单个化的细胞生长成终末尺寸(terminal-sized)的集落(例如，集落生长的饱和或标准化)来富集编辑的细胞。
术语“指导核酸”或“指导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的指导序列和2)能够与核酸指导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。术语“编辑gRNA”是指用于编辑细胞中的靶序列(典型地是细胞内源的序列)的gRNA。术语“处治gRNA”是指用于靶向编辑载体上的处治靶序列的gRNA。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被比对。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数的函数。
“可操作地连接”是指其中如此描述的组分被配置为执行其通常功能的元件的布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列发挥指导编码序列的表达的功能，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。
如本文使用的，术语“蛋白”和“多肽”可互换地使用。蛋白可能完全由氨基酸组成，也可能不完全由氨基酸组成。
“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、指导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型的或诱导型的，并且在一些实施方案中，特别地在许多实施方案中，诸如本文所述的那些实施方案中，核酸指导的核酸酶编辑系统的至少一种组分的转录，以及通常核酸指导的核酸酶编辑系统的至少三种组分的转录，在诱导型启动子的控制下。
如本文使用的术语“可选择标记”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标记为本领域普通技术人员熟知的。可以采用可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、诺尔丝菌素、N-乙酰基转移酶、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、利福平、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，可选择标记包括但不限于糖类，诸如鼠李糖；人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可得荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可得荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性可选择标记)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因；人类多耐药性-1(MDR-1；通过增加的耐药性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；可通过Mab-FITC检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫司汀(carmustine)选择)；和胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文使用的“选择性培养基”是指向其中添加了选择可选择标记或针对可选择标记进行选择的化学化合物或生物部分的细胞生长培养基。
如本文使用的术语“特异性结合”包括两种分子例如工程化肽抗原和结合靶之间具有由以下解离常数表示的结合亲和力的相互作用：约10-7M、约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M、约10-13M、约10-14M或约10-15M。
术语“靶基因组DNA序列”、“细胞靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的期望使用核酸指导的核酸酶编辑系统对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。细胞靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。术语“处治靶序列”是指编辑载体中被裂解或切割以处治或清除编辑载体的序列。术语“靶序列”是指细胞靶序列和处治靶序列之一或二者。
术语“变体”可以指与参考多肽或多核苷酸不同但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体的氨基酸序列与另一参考多肽有差异。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列可以相差一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。多肽的变体可以是保守修饰的变体。取代的或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基(例如，非天然氨基酸)。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者它可以是未知的天然存在的变体。
“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。如本文使用的，短语“引擎载体”包含用于本公开内容的核酸指导的核酸酶系统和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌系统中，引擎载体还可以包含λRed重组工程(recombineering)系统或其等同物。引擎载体通常还包含可选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和gRNA编码序列，所述供体核酸包括对细胞靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在细胞靶序列中的PAM或间隔区(spacer)处结合。编辑载体还可以并且优选地的确包括可选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将引擎载体和编辑载体组合；即，所有编辑和选择元件都可以在单个载体上找到。此外，引擎载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程系统编码序列(如果存在)、供体核酸、一种或更多种指导核酸和一种或更多种可选择标记的控制序列。
核酸酶指导的基因组编辑
在优选的实施方案中，本文描述的自动化仪器进行递归的核酸酶指导的基因组编辑方法，用于将编辑引入细胞群体，其中来自先前轮的编辑的编辑载体在随后的编辑载体被引入细胞群体之前被处治(例如，清除)。编辑活细胞的最新发现涉及核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)编辑。与适当的合成的指导核酸在细胞中复合的核酸指导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。指导核酸有助于核酸指导的核酸酶识别和切割特定靶序列(细胞靶序列或处治靶序列)处的DNA。通过操纵指导核酸的核苷酸序列，核酸指导的核酸酶可以被编程为靶向任何用于裂解的DNA序列，只要适当的前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)在附近。在某些方面，核酸指导的核酸酶编辑系统可以使用组合起来发挥作为指导核酸的功能的两个分开的指导核酸分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面，指导核酸可以是包括crRNA序列和tracrRNA序列二者的单个指导核酸。
通常，指导核酸(例如，gRNA)可以与相容的核酸指导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶引导至靶序列。指导核酸可以是DNA或RNA；可选地，指导核酸可以包含DNA和RNA二者。在一些实施方案中，指导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在指导核酸包含RNA的情况下，gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以并且优选地的确驻留于编辑盒内，并且处于如下文描述的诱导型启动子的控制下。有关“CREATE”编辑盒的更多信息，参见USPN 9,982,278；USPN 10,266,849；USPN 10,240,167；USPN 10,351,877；USPN 10,364,442；USPN 10,435,715和USPN10,465,207以及USSN 16/551,517；USSN 16,773,618和USSN 16,773,712，其都通过引用并入本文。
指导核酸包含指导序列，其中指导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸指导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。指导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于序列比对的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，指导序列的长度是约或多于约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度为少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，指导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
在本发明的方法和组合物中，指导核酸作为待由质粒或载体表达的序列提供，并且包含指导序列和支架序列二者作为诱导型启动子的控制下的单一转录物。通过改变指导序列将指导核酸工程化成靶向期望的靶序列(细胞靶序列或处治靶序列)，使得指导序列与期望的靶序列互补，从而允许指导序列和靶序列之间的杂交。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由指导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于真核细胞的核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM或“垃圾”DNA(“junk”DNA))或编辑载体中的处治靶序列。在本说明书中，gRNA之一，即处治gRNA的靶序列，在编辑载体上。
编辑指导核酸可以是并且优选地是编码靶向细胞靶序列的供体核酸的编辑盒的一部分。可选地，编辑指导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码编辑指导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后将供体核酸插入例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码编辑指导核酸的序列。优选地，编码编辑指导核酸的序列和供体核酸一起位于合理设计的编辑盒中，并同时插入或组装到载体骨架中以产生编辑载体。在又其他实施方案中，编码指导核酸的序列和编码供体核酸的序列二者均包含在编辑盒中。
靶序列(细胞靶序列和处治靶序列二者)与前间区突变(PAM)相关，前间区突变(PAM)是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸指导的核酸酶的精确优选的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以是靶序列的5’或3’。核酸指导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性，改进靶位点识别保真度，降低靶位点识别保真度，或增加核酸指导的核酸酶的多功能性。
在某些实施方案中，细胞靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入细胞靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除细胞靶序列中的前间区突变(PAM)区，使细胞靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活。使细胞靶序列处的PAM失活排除了对该细胞靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶时。因此，具有期望的细胞靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以通过使用与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶来选择，所述合成的指导核酸与细胞靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的细胞靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。
核酸指导的核酸酶可以识别的靶序列(细胞靶序列和处治靶序列二者)的范围受将特定PAM定位于期望的靶序列附近的需要限制。因此，以基因组编辑必需的精度靶向编辑通常可能是困难的。已经发现，核酸酶可以非常好地识别一些PAM(例如，典型PAM(canonical PAM))，而不太好或较差地识别其他PAM(例如，非典型PAM)。因为本文公开的方法允许在未编辑的细胞的背景中鉴定编辑的细胞，所以方法允许在PAM未达最佳的情况下鉴定编辑的细胞；即，即使编辑效率非常低，本文用于鉴定编辑的细胞的方法也允许鉴定编辑的细胞。此外，因为编辑被更容易地鉴定，本发明的方法扩大了可以被编辑的靶序列的范围，包括与功能较弱的PAM相关的基因组编辑的细胞。
至于核酸指导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，编码核酸指导的核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞类型，诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。待采用的核酸指导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。本文描述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas 9、Cas 12/CpfI、MAD2或MAD7或其他MAD酶(MADzyme)以及其核酸酶融合体。核酸酶融合酶通常包含CRISPR核酸指导的核酸酶，该核酸酶被工程化以切割靶DNA中的一条DNA链，而不是进行双链切割，并且核酸酶部分与逆转录酶融合。有关切口酶和核酸酶融合编辑的更多信息，参见均于2020年1月11日提交的USSN 16/740,418；USSN 16/740,420和USSN 16/740,421。与指导核酸一样，核酸酶由载体(例如，引擎载体)上的DNA序列编码，并且处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，诱导型启动子可以与控制指导核酸的转录的诱导型启动子分开但相同；即，分开的诱导型启动子驱动核酸酶或核酸酶融合体和指导核酸序列的转录，但是这两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启动子(例如，二者都是pL启动子)。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动子可以与控制指导核酸的转录的诱导型启动子不同；即，例如，核酸酶可以处于pBAD诱导型启动子的控制下，并且指导核酸可以处于pL诱导型启动子的控制下。
核酸指导的核酸酶系统的另一个组分是包含与细胞靶序列的同源性的供体核酸。在一些实施方案中，供体核酸与指导核酸在同一多核苷酸(例如，编辑载体或编辑盒)上，并且优选地(但不必然)处于与编辑gRNA相同的启动子的控制下(例如，驱动编辑gRNA和供体核酸二者的转录的单一启动子)。供体核酸被设计成用作与细胞靶序列同源重组的模板，该细胞靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸指导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与细胞靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与细胞靶序列重叠(互补)例如约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或更多个核苷酸。供体核酸包含位于供体核酸和细胞靶序列之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与细胞靶序列互补的区域)。供体核酸包含与细胞靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与细胞靶序列相比的插入、缺失、修饰或其任何组合。
同样，供体核酸优选地作为合理设计的编辑盒的一部分提供，该编辑盒被插入到编辑载体骨架中，其中编辑载体骨架可以包含驱动编辑gRNA和供体DNA的转录的启动子，并且还包含不同于包含在引擎载体上的可选择标记的可选择标记，以及在处治期间被切割或裂解的处治靶序列。此外，插入到编辑载体中的编辑gRNA/供体核酸合理设计的编辑盒可以有多于一个，例如两个、三个、四个或更多个(可选地，单个合理设计的编辑盒可以包含两个至若干个编辑gRNA/供体DNA对)，其中每个编辑gRNA在分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有gRNA/供体核酸对在单个启动子的控制下。在优选的实施方案中，驱动编辑gRNA和供体核酸(或驱动多于一个编辑gRNA/供体核酸对)的转录的启动子是诱导型启动子，并且驱动核酸酶或核酸酶融合体的转录的启动子也是诱导型启动子。在一些实施方案中并且优选地，核酸酶和编辑gRNA/供体DNA处在同一诱导型启动子的控制下。
诱导型编辑的优点在于，在启动编辑前，单个化的细胞可以生长几倍至许多倍的细胞倍增，这增加具有编辑的细胞将存活的可能性，因为由有效编辑(active editing)引起的双链切割对细胞有很大毒性。这种毒性既导致编辑的集落中的细胞死亡，也可能导致确实存活但必须在编辑后修复和恢复(recover)的编辑的细胞生长延滞。然而，在编辑的细胞具有恢复的机会后，编辑的细胞集落的尺寸最终会赶上未编辑的细胞集落的尺寸。然而，正是这种毒性在本文被利用来进行处治。
除了供体核酸之外，编辑盒可以包含并且优选地的确包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。
此外，如以上描述的，供体核酸可以包含除了相对于细胞靶序列的至少一个突变之外的一个或更多个PAM序列改变，所述改变使细胞靶序列中的PAM位点突变、缺失或失活。细胞靶序列中的PAM序列改变使PAM位点对核酸指导的核酸酶“免疫”，并且如果使用相同的核酸酶，保护细胞靶序列在随后的编辑轮中不被进一步编辑。
此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应细胞靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如编辑gRNA和供体核酸的全基因或全基因组文库的编辑gRNA和供体核酸的集合或文库。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。
此外，在一些实施方案中，编码核酸指导的核酸酶系统的组分的表达载体或盒还编码包含一个或更多个细胞核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的核酸指导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。
引擎载体和编辑载体包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如以上陈述的，驱动核酸指导的核酸酶编辑系统的一种或更多种组分的转录的启动子优选地是诱导型的。已经开发了用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中控制基因表达的许多基因调控控制系统，包括pL启动子(通过cI857阻遏物的热失活诱导)、pPhIF启动子(通过添加2,4二乙酰基间苯三酚(DAPG)诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic Acids Research,24:543-548(1996))以及其他。在本文描述的模块和仪器中使用的本发明方法中，优选的是，至少一种核酸指导的核酸酶编辑组分(例如核酸酶和/或gRNA)处于通过温度升高而被激活的启动子的控制下，因为这样的启动子允许启动子通过温度升高而被激活，并且通过温度降低而失去活性，从而“关闭”编辑过程。因此，在启动子通过温度降低而失去活性的情况下，细胞中的编辑可以被关闭，而无需更换培养基；去除例如培养基中用于诱导编辑的诱导型生化物质(inducible biochemical)。
处治
“处治”是其中载体(这里是先前轮的编辑中使用的编辑载体或最后一轮编辑后的引擎载体)从正被编辑的细胞消除的过程。处治可以通过以下方式完成：1)使用引擎或编辑载体上的处治gRNA裂解编辑载体，从而使编辑载体无功能；2)经由细胞生长稀释细胞群体中的编辑载体，也就是说，细胞在没有选择编辑载体的抗生素的培养基中经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞越少；或者3)通过利用编辑载体上的热敏感复制起点。本公开内容涉及转录位于编辑载体(“自处治”)或引擎载体(“引擎处治”)上的处治gRNA，以在递归编辑过程中的一轮编辑之后和下一轮编辑之前切割或裂解位于编辑载体中的处治靶序列中的基因座。
图1A是根据本公开内容的处治方法的流程图。在第一步，合成101合理设计的编辑盒的文库。特别有利于设计和合成编辑盒的方法和组合物描述于USPN 9,982,278；USPN10,266,849；USPN 10,240,167；USPN 10,351,877；USPN 10,364,442；USPN 10,435,715；和USPN 10,465,207以及USSN 16/551,517；USSN 16,773,618和USSN 16,773,712，所有这些通过引用并入本文。
设计和合成后，编辑盒被扩增、纯化并组装到载体骨架中104以产生编辑盒。许多方法可以用来组装编辑盒，包括Gibson
Figure BDA0003393730490000211
CPEC、SLIC、连接酶循环等。另外的组装方法包括酵母中的缺口修复(Bessa,Yeast,29(10):419-23(2012))、gateway克隆(Ohtsuka,Curr Pharm Biotechnol,10(2):244-51(2009)；Hartley等人的美国专利第5,888,732号；Hartley等人的美国专利第6,277,608号；和拓扑异构酶介导的克隆(Udo,PLoS One,10(9):e0139349(2015))；Chestnut等人的美国专利第6,916,632B2号。这些和其他核酸组装技术描述于例如Sands和Brent,Curr Protoc Mol Biol.,113:3.26.1-3.26.20(2016)；Casini等人,Nat Rev Mol Cell Biol.,(9):568-76(2015)；和Patron,Curr Opinion PlantBiol.,19:14-9(2014))。
除了制备编辑盒之外，使选择的细胞成为电感受态120用于转化。可编辑的细胞包括任何原核、古菌或真核细胞。例如，用于本说明性实施方案的原核细胞可以是革兰氏阳性菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或革兰氏阴性菌细胞，例如大肠杆菌细胞。用于说明性实施方案的自动化多模块细胞编辑仪器的真核细胞包括任何植物细胞和任何动物细胞，例如真菌细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、线虫细胞或哺乳动物细胞。
在使选择的细胞成为电感受态120后，细胞和编辑载体被组合，并且编辑载体被转化到(例如，电穿孔到)细胞中106。也可以同时用表达编辑核酸酶的单独的引擎载体转化细胞；可选地并且优选地，细胞可以已经用被配置为表达核酸酶的引擎载体转化；也就是说，细胞可以已经用引擎载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中。
转化意在包括各种本领域公认的用于将外源核酸序列(例如，DNA)引入靶细胞的技术，并且本文所用的术语“转化”包括所有转化和转染技术。这样的方法包括但不限于电穿孔、脂质体转染、光穿孔(optoporation)、注射、微沉淀、显微注射、脂质体、粒子轰击、声孔效应(sonoporation)、激光诱导穿孔、珠转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀或DEAE-葡聚糖介导的转染。也可以使用例如蔗糖或甘油洗涤来制备用于载体摄取的细胞。此外，可以使用利用机械和化学转染方法能力的混合技术，例如磁转染(magnetofection)，磁转染(magnetofection)是一种将化学转染与机械方法组合的转染方法。在另一个实例中，阳离子脂质可以与基因枪或电穿孔仪组合使用。用于转化或转染靶细胞的合适材料和方法可以见于例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th,ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2014。使用自动化多模块细胞处理仪器的本发明自动化方法利用流通式电穿孔，诸如图5C-图5G所示的示例性装置。
在转化后，允许细胞恢复并且进行选择108以选择用编辑载体转化的细胞，该编辑载体除了包含编辑盒之外还包含合适的可选择标记。如上所述，可以使用可药物选择的标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、诺尔丝菌素、N-乙酰基转移酶、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素和G418或其他可选择标记。
在选择适当转化的细胞后，通过诱导核酸酶和gRNA之一或二者(优选地二者)的转录，在细胞中诱导编辑110。核酸酶和gRNA之一或优选地二者的转录的诱导可以通过例如使用pL启动子系统来促进，其中pL启动子通过将培养基中细胞的温度升高至42℃持续例如1小时至许多小时来诱导，以诱导核酸酶和gRNA的表达用于切割和编辑。已经开发了用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中控制基因表达的许多基因调控控制系统，除了pL启动子以外，还包括pPhIF启动子(通过添加2,4二乙酰基间苯三酚(DAPG)诱导)、pBAD启动子(通过将阿拉伯糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他系统包括四环素控制的转录激活系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic Acids Research,24:543-548(1996))以及其他。
如上所述，本发明的组合物和方法优选地使用合理设计的编辑盒，诸如CREATE盒。每个编辑盒包含编辑gRNA、包含预期编辑和PAM或间隔区突变的供体DNA；因此，例如，双盒多重编辑盒包含第一编辑gRNA、第一编辑供体DNA、以及第一预期编辑和第一PAM或间隔区突变、以及至少第二编辑gRNA、至少第二供体DNA、以及至少第二预期编辑和第二PAM或间隔区突变。在一些实施方案中，单个启动子可以驱动第一编辑gRNA和第二编辑gRNA二者以及第一供体DNA和第二供体DNA二者的转录，并且在一些实施方案中，单独的启动子可以驱动第一编辑gRNA和第一供体DNA的转录，以及第二编辑gRNA和第二供体DNA的转录。此外，多重编辑盒可以包括编辑盒之间的核酸元件，例如引物序列、桥接寡核苷酸和允许多重编辑盒组装的其他“盒连接”序列元件。
编辑被诱导110后，细胞生长直到细胞进入(或接近进入)生长的稳定期112，随后通过激活驱动处治gRNA的转录的诱导型启动子和诱导驱动核酸酶的转录的诱导型启动子来诱导编辑载体的处治114。已经发现，如果编辑的细胞处于生长的稳定期，处治特别有效。在又一些方面，在诱导处治之前，细胞生长持续对数期的至少75％、对数期的80％、对数期的85％、对数期的90％、对数期的95％，或者处于生长的稳定期。关于图1C和图1D更详细地描述了用于诱导处治的示例性遗传和诱导组分。编辑载体被处治114后，允许细胞恢复和生长，并且然后使细胞再次成为电感受态116，准备用于另一轮编辑118。
图1B描绘了培养物中细胞的典型生长曲线150(光密度对比时间)。最初存在延滞期151，然后细胞进入对数期152，在对数期它们快速生长，并且最后细胞到达稳定期154，在稳定期细胞不再分裂。本发明的方法采用在时间点153或之后当细胞处于生长稳定期或接近稳定期时，诱导处治；即，细胞在至少60％进入对数生长期，或至少65％进入对数生长期，或至少70％进入对数生长期，或至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％进入对数生长期的时间点被诱导，以及在生长稳定期期间的任何时间被诱导。
图1C描绘了用于编辑载体的引擎处治的示例性质粒架构，其包括引擎载体(左边)和编辑载体(右边)；也就是说，靶向编辑载体上的处治靶序列的处治gRNA的序列位于引擎载体上。引擎载体包含在λRed重组工程系统的5’并驱动其的pBAD诱导型启动子。λRed重组工程系统作为细菌中双链断裂的“创可贴(band aid)”或修复系统起作用，并且在一些细菌物种中，必须存在λRed重组工程系统(或一些其他重组工程系统)以解决(resolve)编辑期间发生的双链断裂。然而，在酵母和其他真核细胞中，重组工程系统不是必需的。驱动λRed重组工程系统组分的转录的诱导型启动子(在这种情况下为pBAD，但可以使用其他诱导型启动子)最优选地是与驱动核酸酶和编辑gRNA的转录不同的诱导型启动子，因为优选地重组工程系统在核酸酶被诱导之前是有活性的。也就是说，优选地“创可贴”双链断裂修复机制在核酸酶开始切割细胞基因组之前是有活性的。
除了λRed重组工程系统之外，引擎载体还包含在λRed重组工程系统3’的复制起点(这里是SC101起点，其可以是温度敏感的，但不一定是温度敏感的)，随后是驱动处治gRNA的转录的SC101起点的3’的pPhIF诱导型启动子，在这种情况下，处治gRNA是使编辑载体上的pUC复制起点(例如，处治靶序列)失活的gRNA。接下来，处治gRNA序列的3’是驱动c1857阻遏物基因的转录的启动子(通常是组成型启动子)，该基因在30℃时主动阻遏pL启动子并在42℃时降解，从而激活pL启动子。c1857编码序列的3’是驱动抗生素抗性基因(这里是羧苄青霉素抗性基因)的转录的启动子(通常也是组成型启动子)，接着是驱动核酸酶MAD7的转录的pL诱导型启动子。
图1C右侧的编辑载体包含驱动编辑盒的转录的pL启动子，其中编辑盒包含编辑gRNA的编码序列和供体DNA序列(例如同源臂或“HA”)。供体DNA序列，除了包括细胞内源的核酸序列中的期望编辑的序列(例如，细胞靶序列)之外，通常还包含PAM改变序列，该PAM改变序列最常见的是在基因组中的细胞靶序列处使PAM失活的序列。编辑载体还包含驱动抗生素抗性基因(例如卡那霉素或氯霉素抗性基因)的转录的启动子(通常是组成型启动子)，随后是pUC复制起点。反pUC gRNA(例如，处治gRNA)的转录由引擎载体上的pPhIF诱导型启动子的控制，反pUC gRNA(例如，处治gRNA)包含使编辑载体上的pUC起点失活的gRNA(由图1C中的箭头和剪刀表示)。
图1D描绘了用于编辑载体的自处治的示例性质粒架构，其包括引擎载体(左边)和编辑载体(右边)；也就是说，靶向编辑载体上的处治靶序列的处治gRNA的序列位于编辑载体自身上。引擎载体包含在λred重组工程系统的5’并驱动其的pBAD诱导型启动子。如上所述，λRed重组工程系统作为细菌中双链断裂的“创可贴”或修复系统起作用。驱动λRed重组工程系统组分的转录的诱导型启动子(在这种情况下为pBAD，但可以使用其他诱导型启动子)最优选地是与驱动核酸酶和编辑gRNA的转录不同的诱导型启动子，因为优选地重组工程系统在核酸酶被诱导之前是有活性的。除了λRed重组工程系统之外，引擎载体还包含在λRed重组工程系统的3’的复制起点(此处为SC101起点，其可以是温度敏感的，但不一定是温度敏感的)，随后是驱动c1857阻遏物基因的转录的启动子(通常为组成型启动子)，该基因在30℃时主动阻遏pL启动子并且在42℃时降解，从而激活pL启动子。c1857编码序列的3’是驱动羧苄青霉素抗性基因的转录的启动子(通常也是组成型启动子)，接着是驱动核酸酶MAD7的转录的pL诱导型启动子。
图1D右侧的编辑载体包含驱动编辑盒的转录的pL启动子，其中编辑盒包含编辑gRNA的编码序列和供体DNA序列(例如同源臂或“HA”)。供体DNA序列，除了包括细胞内源的核酸序列中期望的预期编辑的序列之外，还包含PAM改变序列，该PAM改变序列是在基因组中的细胞靶序列处使PAM失活的序列。编辑载体还包含在编辑盒的3’的pPhIF诱导型启动子，其中pPhIF启动子驱动处治gRNA的转录。如图1C所示，处治gRNA是使位于编辑载体上的pUC起点失活的gRNA；然而，在这个架构中，处治gRNA位于编辑载体上，因此编辑载体是“自处治的”。处治gRNA序列的3’是驱动抗生素抗性基因(例如卡那霉素或氯霉素抗性基因，这是不同于位于引擎载体上的抗生素抗性基因的抗生素抗性基因)的转录的启动子，通常是组成型启动子，随后是pUC复制起点。反pUC处治gRNA的转录由pPhIF诱导型启动子控制，反pUC处治gRNA包括通过使编辑载体上的pUC起点失活(例如，裂解或切割)来处治编辑载体的处治gRNA(在图1D中由箭头和剪刀表示)。因此，在图1D的系统中，因为处治gRNA(例如，反pUCpUC gRNA)从编辑载体转录并使编辑载体上的pUC复制起点失活，所以编辑载体自处治。
图1E描绘了使用标准铺板方案(SPP)的示例性递归方法160a，该标准铺板方案采用例如图1C或图1D中所示的示例性引擎载体和编辑载体。递归方法160a从感受态细胞162例如大肠杆菌细胞开始，其先前已经用表达核酸指导的核酸酶诸如MAD7和可选择标记诸如氯霉素抗性基因的引擎载体转化。在步骤163，感受态细胞用编辑载体的文库转化，其中编辑载体的文库中的每个编辑载体包含具有编码编辑gRNA的序列和供体DNA的编辑盒，并且每个编辑载体还包含抗生素抗性基因诸如赋予羧苄青霉素抗性的基因和处治靶序列。转化后，允许细胞在无抗生素的培养基中恢复164，并且然后在步骤165，如果需要，将细胞稀释，或者转移到含有例如氯霉素和例如羧苄青霉素的培养基中，以选择引擎载体和编辑载体二者。然后将细胞铺板166a于含有例如阿拉伯糖的固体培养基上，阿拉伯糖诱导由例如引擎载体(参见例如图1C和图1D)编码的λred重组系统。铺板后，允许细胞在例如30℃生长9小时，在42℃生长2小时，从而诱导驱动引擎载体上的核酸酶和编辑载体上的编辑盒(例如编辑gRNA和供体DNA)的转录的pL启动子，然后在30℃再生长至少9小时。
在步骤167，由转化的细胞形成的集落通过例如从培养基中刮下集落或通过挑选集落而从固体培养基取出，并且然后将收获的细胞置于培养基中、洗涤以除去羧苄青霉素，并重悬浮在含有氯霉素的培养基中(继续选择引擎载体)并允许生长直到细胞达到生长的稳定期或接近稳定期。再次，已经发现当诱导处治时，如果编辑的细胞处于生长的稳定期，处治特别有效。例如，在诱导处治之前，使细胞生长，直到它们已经生长了对数期的至少75％、对数期的80％、对数期的85％、对数期的90％、对数期的95％，或者处于生长的稳定期。
细胞中的编辑载体然后通过诱导切割编辑载体上的pUC复制起点的处治gRNA的转录来处治168。处治gRNA的诱导通过以下来实现：通过首先将培养物的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，并且其次通过添加2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)来诱导驱动反pUC gRNA的转录的pPhIF启动子。在42℃持续2小时后，将细胞培养物的温度降低至30℃，从而停止核酸酶的转录，并允许细胞恢复和生长另外6小时。核酸酶和反pUC gRNA的共表达允许靶向编辑载体上的pUC复制起点(例如，处治靶序列)。作为将培养物的温度升高到42℃并结合DAPG的添加的替代方案，人们可以通过将培养物的温度升高到42℃持续两小时来诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，然后将培养物的温度降低到30℃并添加DAPG来诱导反pUC gRNA的转录；也就是说，核酸酶和反pUC gRNA的诱导可以是依次的，而不是同时的。
在步骤169，用含有氯霉素的培养基洗涤细胞(再次选择包含引擎载体的细胞)，并允许细胞恢复。此时，编辑的细胞可以生长到例如OD＝0.5，再次成为电感受态170，并进行第二轮编辑171。
图1F描绘了使用图1E的标准铺板方案(SPP)的示例性递归编辑和处治方法。图1F描绘了改进的方案180的示例性标准铺板方案实施方案，用于使用诱导型启动子驱动编辑gRNA、核酸酶和处治gRNA的表达来进行核酸指导的核酸酶基因组编辑和处治。在图1F中，如同在图1E中，编辑载体182的文库或集合被引入183(例如，电穿孔)到培养的细胞184中，所述培养的细胞184已经包含在诱导型启动子的控制下的核酸酶的编码序列。如同图1E(并且如图1C和图1D中所描绘的)，核酸酶的编码序列被包含在已经转化到细胞中的具有可选择标记的“引擎载体”上，尽管在其他实施方案中，核酸酶的编码序列可以整合到细胞的基因组中。在又其他实施方案中，核酸酶的编码序列可以位于编辑载体(即，合二为一的引擎载体和编辑载体)上。
编辑载体182包含相对于具有PAM改变序列的细胞靶序列具有期望的预期编辑的供体DNA，在诱导型启动子的控制下的编辑gRNA的编码序列，以及可选择标记，PAM改变序列最常见的是在基因组中的靶位点处使PAM无效的序列。根据系统是引擎处治系统还是自处治系统，还存在在分别位于引擎载体或编辑载体上的诱导型启动子的控制下的处治gRNA的编码序列。
在细胞184已经用编辑载体转化后，细胞被铺板185在基底或板186上的选择性培养基上，以选择具有引擎载体和编辑载体二者的细胞。细胞在铺板之前被稀释，使得细胞基本上或大部分被单个化-分离到足以使它们和它们形成的集落与其他细胞集落分离-并且然后细胞在板或基底186上生长187，直到集落188开始形成。允许细胞在例如30℃生长例如2倍和300倍之间，或5倍和150倍之间，或10倍和50倍之间的倍增，建立克隆集落。细胞的这种初始生长是为了在集落中积累足够的克隆细胞，以从编辑的诱导存活。
在集落建立后，细胞基因组的切割和编辑通过以下来诱导：通过首先诱导驱动λRed重组工程系统的转录的启动子，并且其次通过诱导或激活驱动gRNA和核酸酶的启动子。驱动λ Red重组工程系统表达的诱导型启动子优选地不同于驱动gRNA和核酸酶的转录的诱导型启动子，并且优选地λRed重组工程系统在核酸酶和gRNA的诱导之前被诱导，因为λRed重组工程系统作为细菌中双链断裂的“创可贴”或修复系统起作用，并且在一些细菌物种中(但不在其他细胞类型诸如酵母或其他真核细胞中)必须存在以解决编辑期间发生的双链断裂。λRed重组工程系统可以在例如pBAD启动子的控制下。pBAD启动子通过向生长培养基添加阿拉伯糖来调控(诱导)。因此，如果在基底或板326的选择性培养基中含有阿拉伯糖，当细胞生长327时，λRed重组工程系统会被激活。至于编辑的诱导，如果gRNA和核酸酶的转录都在pL启动子的控制下，gRNA和核酸酶的转录通过以下来诱导：将温度升高至42℃持续例如半小时至两小时(或更长，取决于细胞类型)，这激活了pL诱导型启动子。在诱导切割和编辑以及两小时的42℃孵育后，温度回到30℃以允许细胞恢复并使pL启动子系统失效。
在细胞已经被编辑并且已经在30℃生长了几个小时后，然后通过例如将集落从基底或板上刮下将集落汇集189，以汇集190来自细胞集落的细胞。在汇集了集落后，处治191可以发生。如关于图1E所述，细胞中的编辑载体通过使细胞生长直到它们处于生长的稳定期或接近稳定期，并通过诱导切割编辑载体上的pUC复制起点的处治gRNA的转录来处治。反pUC gRNA的诱导通过以下来实现：通过首先将培养物的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，并且其次通过添加2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)来诱导驱动反pUC gRNA的转录的pPhIF启动子。在42℃持续2小时后，将细胞培养物的温度降低至30℃，并允许细胞恢复和生长另外6小时。核酸酶和反pUC gRNA的共表达允许靶向编辑载体上的pUC复制起点，从而产生编辑的细胞，其中已经处治192编辑载体。此外，使细胞生长也进行“被动”处治，其中因为将选择编辑载体的抗生素从培养基去除消除了对细胞的保留编辑载体的压力，编辑载体从生长的细胞群体“稀释”出来。最后，在步骤193，允许被编辑的细胞恢复，然后生长到例如OD＝0.5，并使得成为电感受态193，使得细胞194准备用于另一轮编辑。
图1G描绘了使用主体液体编辑方案的示例性递归方法160b。递归方法160b(如同递归方法160a一样)从感受态细胞162例如大肠杆菌细胞开始，其先前已经用表达核酸指导的核酸酶诸如MAD7和可选择标记诸如氯霉素抗性基因的引擎载体转化。在步骤163，感受态细胞用编辑载体的文库转化，其中编辑载体的文库中的每个编辑载体包含具有编码编辑gRNA的序列和供体DNA的编辑盒，并且每个编辑载体还包含抗生素抗性基因，诸如赋予对例如羧苄青霉素的抗性的基因，其中位于编辑载体上的抗生素抗性基因不同于位于引擎载体上的抗生素抗性基因。转化后，允许细胞在无抗生素的培养基中恢复164，并且然后在步骤165，如果需要，将细胞稀释，或者转移到含有氯霉素和羧苄青霉素的培养基中，以选择引擎载体和编辑载体二者。
在转移到用于主体液体编辑的较大液体体积166b之后，细胞生长过度(outgrown)；也就是说，细胞生长到饱和(参见图1B)。如同处治步骤，已经确定当细胞在诱导编辑之前已经生长到对数晚期或饱和时，主体液体培养物中的编辑是最佳的。同样，在诱导处治之前，细胞生长经过对数期的至少60％，或对数期的至少75％、对数期的80％、对数期的85％、对数期的90％、对数期的95％，或者处于生长的稳定期。因此，细胞生长过度，然后将阿拉伯糖添加到培养基中，诱导由例如引擎载体(参见例如图1C和图1D)编码的λRed重组系统。在λRed重组系统被诱导例如30分钟至1小时后，温度升高到42℃持续2小时，从而诱导驱动引擎载体上的核酸酶和编辑载体上的编辑盒的转录的pL启动子，并从而编辑。在42℃持续2小时后，细胞在30℃再生长至少9小时。
在步骤173，洗涤细胞以例如去除羧苄青霉素，并重悬浮在含有氯霉素的培养基中(继续选择引擎载体)，并且细胞可以生长另一个长度的时间以确保细胞处于生长的稳定期以用于处治。细胞中的编辑载体然后通过诱导切割编辑载体上的pUC复制起点的编辑gRNA的转录来处治168。反pUC gRNA的诱导通过以下来实现：通过首先将培养物的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，并且其次通过添加2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)来诱导驱动反pUC gRNA的转录的pPhIF启动子(参见例如，图1C和图1D中的引擎载体和编辑载体的载体架构)。在42℃持续2小时后，将细胞培养物的温度降低至30℃，并允许细胞恢复和生长另外6小时。核酸酶和反pUC gRNA的共表达允许靶向编辑载体上的pUC复制起点。在步骤169，用含有氯霉素的培养基洗涤细胞(再次选择包含引擎载体的细胞)，并允许细胞恢复。此时，编辑的细胞可以生长到适当的OD(例如OD＝0.5)，再次成为电感受态170，并进行第二轮编辑171。
图1H描绘了使用图1G的主体液体编辑方案的示例性递归方法。图1H描绘了用于进行核酸指导的核酸酶基因组编辑和处治的示例性方案1000。图1H描绘了图1G中示出的用于编辑细胞的方案160b。首先，将编辑载体1002的文库或集合(编辑载体各自包含编辑盒)引入1003(例如，电穿孔)培养的细胞1004，所述培养的细胞1004包含在诱导型启动子的控制下的核酸酶(例如，MAD7)的编码序列，所述编码序列被包含在已经转化到细胞中或已经整合到被转化的细胞的基因组中的引擎载体上(连同可选择标记)。编辑载体1002包含供体DNA，该供体DNA包含PAM或间隔区改变序列、在诱导型启动子的控制下的编辑gRNA的编码序列和可选择标记。根据系统是引擎处治系统还是自处治系统，在诱导型启动子的控制下的处治gRNA的编码序列分别位于引擎载体或编辑载体上。
在步骤1005，使细胞生长，直至它们达到稳定期，或接近稳定期。在细胞达到稳定期1006后，编辑被诱导1007(其中核酸酶和gRNA的转录被诱导)，并且培养物358中的细胞被编辑并然后允许从编辑中恢复。在一些实施方案中，编辑的诱导包括使主体液体培养物的温度升高至42℃，以激活驱动核酸酶、编辑gRNA和供体DNA转录的pL启动子。在恢复后，细胞被洗涤，并重悬浮在培养基中1009，并再次生长过度，使得细胞处于生长的稳定期或接近稳定期。细胞中的编辑载体然后通过诱导切割编辑载体上的pUC复制起点的处治gRNA的转录来处治1010。反pUC gRNA的诱导通过以下来实现：通过首先将培养物的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，并且其次通过添加2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)来诱导驱动反pUC gRNA的转录的pPhIF启动子(参见，图1C和图1D中的示例性引擎载体和编辑载体的载体架构)。
在42℃持续2小时后，将细胞培养物的温度降低至30℃，并允许细胞恢复和生长另外6小时。核酸酶和反pUC gRNA的共表达允许靶向编辑载体上的pUC复制起点。如上文所述，使细胞生长进一步进行“被动编辑”。在步骤1011，用含有氯霉素的培养基洗涤细胞(再次选择包含引擎载体的细胞)，并允许细胞恢复。此时，编辑的细胞可以再次成为电感受态1012，并进行第二轮编辑。
图1I描绘了使用固体壁分离装置的示例性递归方法160c。递归方法160c(如同递归方法160a和160b一样)从感受态细胞162例如大肠杆菌细胞开始，其先前已经用表达核酸指导的核酸酶诸如MAD7和可选择标记诸如氯霉素抗性基因的引擎载体转化。在步骤163，感受态细胞用编辑载体的文库转化，其中编辑载体的文库中的每个编辑载体包含具有编码编辑gRNA的序列和供体DNA的编辑盒，并且每个编辑载体还包含抗生素抗性基因，诸如赋予对羧苄青霉素的抗性的基因或不同于引擎载体上的抗生素抗性基因的其他抗生素抗性基因。在转化之后，允许细胞在无抗生素的培养基中恢复164，并且然后在步骤165，如果需要，将细胞稀释，并将其装载到固体壁单个化、诱导、分离和标准化装置(SWIIN，在下文结合图6B-图6E详细描述)166c上，在那里发生编辑过程。细胞以泊松分布或基本泊松分布(下文将详细描述)装载到SWIIN中，并在30℃生长约8-9小时。在初始生长阶段后，进行培养基交换，向培养基中加入阿拉伯糖以诱导由例如引擎载体(参见例如，图1C和图1D的示例性载体架构)编码的λRed重组系统。
在λRed重组系统被诱导例如30分钟至1小时后，SWIIN的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动引擎载体上的核酸酶和编辑载体上的编辑盒(编辑gRNA和供体DNA)的转录的pL启动子，并从而诱导编辑。在42℃持续2小时后，使细胞在30℃再生长至少9小时。
在步骤175，从SWIIN回收细胞并洗涤，以例如除去羧苄青霉素。然后将细胞重悬于含有氯霉素的培养基中(继续选择引擎载体)并生长过度，使得细胞处于对数晚期或稳定期。细胞中的编辑载体然后通过诱导切割编辑载体上的pUC复制起点的处治gRNA的转录来处治168。反pUC gRNA的诱导通过以下来实现：通过首先将培养物的温度升高至42℃持续2小时从而诱导驱动核酸酶的转录的pL启动子，并且其次通过交换培养基为添加有2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)的培养基来诱导驱动反pUC gRNA的转录的pPhIF启动子(参见图1C和图1D)。
在42℃持续2小时后，将细胞培养物的温度降低至30℃，并允许细胞恢复和生长6小时。核酸酶和反pUC gRNA的共表达允许靶向编辑载体上的pUC复制起点。在步骤169，用含有氯霉素的培养基洗涤细胞(再次选择包含引擎载体的细胞)，并允许细胞恢复和生长以成为电感受态。使细胞生长也进行“被动”处治，其中编辑载体从生长的细胞群体“稀释”出来，因为将选择编辑载体的抗生素从培养基去除消除了对细胞的保留编辑载体的压力。此时，编辑的细胞可以再次成为电感受态170，并进行第二轮编辑171。图6A描绘了该方法并且图6A的描述更详细地呈现了该方法。
进行包括处治的核酸指导的核酸酶编辑的自动化细胞编辑仪器和模块
自动化细胞编辑仪器
图2A描绘了例如为了活酵母细胞的靶向基因编辑进行示例性递归工作流程之一的示例性自动化多模块细胞处理仪器200。例如，仪器200可以并且优选地被设计为在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器200可以包括可重复使用组分和一次性组分的混合物，用于在细胞中进行自动化基因组裂解和/或编辑时进行各种集成的过程而无人工干预。图示了机架(gantry)202，机架202提供了自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统(致动器)向例如自动化(即，机器人)液体操作系统258提供XYZ轴运动控制，该自动化液体操作系统258包括例如空气置换移液器232，这允许多个模块之间的细胞处理而无人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器232由机架202移动，并且各种模块和试剂筒保持静止；然而，在其他实施方案中，液体操作系统258可以在各种模块和试剂筒移动时保持静止。
自动化多模块细胞处理仪器200中还包括试剂筒210，其包括储库212和转化模块230(例如，关于图5C-图5G详细描述的流通式电穿孔装置和关于图5A和图5B描述的示例性试剂筒)，以及洗涤储库206、细胞输入储库251和细胞输出储库253。洗涤储库206可以被配置成容纳大的管，例如洗涤溶液，或者在整个迭代过程中通常使用的溶液。尽管在图2A中，两个试剂筒210包括洗涤储库206，但是洗涤储库也可以被包括在洗涤筒中，其中试剂筒和洗涤筒是分开的筒。在这样的情况下，试剂筒210和洗涤筒204可以是相同的，除了插入其中的消耗品(包含在各种插入物中的试剂或其他组分)。
在一些实施方式中，试剂筒210是用于在自动化多模块细胞处理/编辑仪器200中使用的包含试剂和细胞的一次性套件。例如，在启动细胞处理前，使用者可以在自动化多模块细胞编辑仪器200的机箱(chassis)内打开和定位每个包含各种期望的插入物和试剂的试剂筒210。此外，每个试剂筒210可以插入机箱中的插座中，该插座具有适合于容纳在其中的试剂的不同温度区。
图2A中还图示了机器人液体操作系统258，包括机架202和空气置换移液器232。在一些实例中，机器人操作系统258可以包括自动化液体操作系统，诸如由Mannedorf,Switzerland的Tecan Group Ltd.、Reno,NV的Hamilton Company(参见，例如，WO2018015544A1)或Fort Collins,CO.的Beckman Coulter,Inc.(参见，例如，US20160018427A1)制造的那些。移液器吸头215可以设置在移液器转移吸头供应装置214中，用于与空气置换移液器232一起使用。
在一些实施方式中，试剂筒210的插入物或组件标记有机器可读标记(未示出)，诸如条形码，用于由机器人操作系统258识别。例如，机器人液体操作系统258可以扫描每个试剂筒210内的一个或更多个插入物以确认内容物。在其他实施方式中，机器可读标记可以标记在每个试剂筒210上，并且自动化多模块细胞编辑仪器200的处理系统(未示出，但参见图2B的元件237)可以基于机器可读标记鉴定存储材料地图。在图2A中图示的实施方案中，细胞生长模块包括细胞生长瓶218(下文结合图3A-图3D更详细描述)。另外看到的是TFF模块222(下文结合图4A-图4E进行了详细描述)。还图示了，作为图2A的自动化多模块细胞处理仪器200的一部分，在本文关于图6B-图6E描述的单个化模块240(例如，此处示出的固体壁分离、孵育和标准化装置(SWIIN装置))，由例如机器人液体处理系统258和空气置换移液管232提供服务。另外看到的是选择模块220。还注意三个散热器255的放置。
图2B是图2A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器200的内容物的简化展示。例如，基于筒的源材料(诸如在试剂筒210中)可以被定位于仪器200的平台(deck)上的指定区域中，以供空气置换移液管232获取(access)。多模块细胞处理仪器200的平台可以包括保护槽，使得从仪器200的任何模块溢出(spilling)、滴落或溢流(overflowing)的污染物容纳在保护槽的边缘(lip)内。还看到试剂筒210，其显示为设置有热组件211，热组件211可以产生适合不同区域的温度区。注意，一个试剂筒还包括流通式电穿孔装置230(FTEP)，由FTEP接口(例如歧管臂)和致动器231提供服务。还看到具有相邻热组件225的TFF模块222，其中TFF模块由TFF接口(例如歧管臂(manifold arm))和致动器233提供服务。热组件225、235和245包含热电装置，诸如Peltier装置，以及散热器、风扇和冷却器。旋转生长瓶218在生长模块234内，其中生长模块由两个热组件235提供服务。在220看到选择模块。还看到SWIIN模块240，其包括SWIIN筒241，其中SWIIN模块还包括热组件245、照明243(在该实施方案中为背光)、蒸发和冷凝控制249，并且其中SWIIN模块由SWIIN接口(例如，歧管臂)和致动器247提供服务。在该视图中还看到触摸屏显示器201、显示器致动器203、照明205(多模块细胞处理仪器200两侧各一个)和照相机239(多模块细胞处理仪器200两侧各一个照明装置)。最后，元件237包括电子器件，诸如电路控制板、高压放大器、电源和电源输入；以及气动器件(pneumatics)，诸如泵、阀和传感器。
图2C图示了用作自动化多模块细胞编辑仪器200的桌面版本的多模块细胞处理仪器200的前透视图。例如，机箱290可以具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英寸的深度。机箱290可以并且优选地被设计成容纳自动化细胞处理中使用的所有模块和一次性供应装置，并且在没有人工干预的情况下执行所需的所有过程；即，机箱290被配置成提供集成的、独立的自动化多模块细胞处理仪器。如图2C中图示的，机箱290包括触摸屏显示器201、冷却格栅264，冷却格栅264允许空气通过内部风扇(未示出)流动。触摸屏显示器向使用者提供关于自动化多模块细胞编辑仪器200的处理状态的信息，并接受来自使用者的输入用于进行细胞处理。在该实施方案中，机箱290由可调节的支脚270a、270b、270c和270d提升(支脚270a-270c在该图2C中示出)。例如，可调节的支脚270a-270d允许在机箱290下方的另外的气流。
在一些实施方式中，机箱290内部是关于图2A和图2B描述的大部分或全部部件，包括沿着机架布置的机器人液体处理系统、包括流通式电穿孔装置的试剂筒210、细胞生长模块234中的旋转生长瓶218、切向流过滤模块222、SWIIN模块240以及各种模块的接口和致动器。此外，机箱290容纳控制电路、液体操作管、气泵控制器、阀、传感器、热组件(例如，加热和冷却单元)和其他控制机构。有关多模块细胞编辑仪器的实例，参见USPN 10,253,316；USPN 10,329,559；USPN 10,323,242；USPN 10,421,959；USPN 10,465,185；USPN 10,519,437；USPN 10,584,333；和USPN 10,584,334；以及2020年1月23日提交的USSN 16/750,369；2020年3月18日提交的USSN 16/822,249；和2020年4月1日提交的USSN 16/837,985，其全部通过引用以其全文并入本文。
旋转细胞生长模块
图3A示出了与本文描述的细胞生长装置一起使用并在自动化多模块细胞处理仪器中使用的旋转生长瓶300的一种实施方案。旋转生长瓶300是光学透明的容器，具有用于接收液体培养基和细胞的开口端304、限定用于使细胞生长的主容器的中心瓶区306、限定至少一个光路310的锥形至收缩区(tapered-to-constricted region)318、封闭端316和驱动接合机构312。旋转生长瓶300具有中心纵轴320，瓶围绕该中心纵轴320旋转，并且光路310通常垂直于瓶的纵轴。第一光路310被定位于锥形至收缩区318的下收缩部分。任选地，旋转生长瓶300的一些实施方案在锥形至收缩区318的锥形区中具有第二光路308。该实施方案中的两个光路都被定位于旋转生长瓶的区中，该区不断地填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)并且不受生长瓶旋转速度的影响。第一光路310比第二光路308短，在瓶中细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程的较后期)允许OD值的灵敏测量，而第二光路308在瓶中细胞培养物的OD值处于低水平时(例如，在细胞生长过程的较早期)，允许OD值的灵敏测量。
驱动接合机构312与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施方案中，马达驱动驱动接合机构312，使得旋转生长瓶300仅在一个方向上旋转，并且在其他实施方案中，旋转生长瓶300在第一方向上旋转第一时间量或周期性，在第二方向(即，相对方向)上旋转第二时间量或周期性，并且该过程可以重复，使得旋转生长瓶300(和细胞培养物内容物)经历振荡运动。此外，使用者可以选择培养物是否经历振荡及用于其的周期性。第一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以是1秒、2秒、3秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或更多分钟。在另一种实施方案中，旋转生长瓶400可以在细胞生长的早期阶段以第一周期性(例如，每60秒)振荡，并且旋转生长瓶300可以然后在细胞生长的后期阶段以与第一周期性不同的第二周期性(例如，每一秒)振荡。
旋转生长瓶300可以是可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶是可消耗的。在一些实施方案中，旋转生长瓶是可消耗的，并且向使用者提供为预先填充有生长培养基，其中瓶在开口端304处用箔密封件密封。以这样的方式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以是用于与独立细胞生长装置或与作为自动化多模块细胞处理系统一部分的细胞生长模块一起使用的套件的一部分。为了将细胞引入到瓶中，使用者仅需要用移液器吸出期望体积的细胞，并且使用移液器吸头刺穿瓶的箔密封件。开口端304可以任选地包括延伸边缘302，以与细胞生长装置重叠并接合。在自动化系统中，旋转生长瓶300可以用条形码或其他标识手段加标签，该条形码或其他标识手段可以被作为自动化系统的一部分的扫描仪或照相机(未示出)读取。
旋转生长瓶300的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积可以有很大变化，但是旋转生长瓶300的体积必须足够大，以产生指定总数量的细胞。在实践中，旋转生长瓶300的体积范围可以为1-250mL、2-100mL、5-80mL、10-50mL或12-35mL。同样，细胞培养物(细胞+生长培养基)的体积应适当，以允许旋转生长瓶300中适当通气和混合。适当的通气促进了生长培养基内均匀的细胞呼吸。因此，细胞培养物的体积应是生长瓶体积的约5％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如，对于30mL的生长瓶，细胞培养物的体积会是约1.5mL至约26mL或6mL至约18mL。
旋转生长瓶300优选由生物相容的光学透明材料制成，或者包括一条或更多条光路的瓶的至少一部分是透明的。此外，制造旋转生长瓶的材料应能够冷却至约4℃或更低，并且加热至约55℃或更高，以适应基于温度的细胞测定和在低温的长期储存。此外，用于制造瓶的材料必须能够承受高达55℃的温度，而在旋转时不会变形。合适的材料包括环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜、聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施方案中，旋转生长瓶通过例如注射成型或挤压低成本地制造。
图3B是细胞生长装置330的一种实施方案的透视图。图3C描绘了来自图3B的细胞生长装置330的剖视图。在两幅图中，可见旋转生长瓶300被定位于主壳体336内，其中旋转生长瓶300的延伸边缘302在主壳体336上方延伸。此外，两幅图中都示出了端壳体352、下壳体332和凸缘334。凸缘334用于将细胞生长装置330附接至加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图3C描绘了另外的细节。在图3C中，上轴承342和下轴承340被示出定位于主壳体336中。上轴承342和下轴承340支持旋转生长瓶300的垂直装载。下壳体332容纳驱动马达338。图3C的细胞生长装置330包括两条光路：第一光路344和第二光路350。光路344对应于定位于旋转生长瓶300的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路310，并且光路350对应于旋转生长瓶316的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路308。光路310和308未在图3C中示出，但是可见于图3A中。除了光路344和340之外，还存在照亮一条或更多条光路的发射板348，以及在光穿过旋转生长瓶300中的细胞培养液后检测光的检测器板346。
马达338与驱动机构312接合，并用于使旋转生长培养瓶300旋转。在一些实施方案中，马达338是具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达，所述内置驱动控制器可以被设置为保持0RPM和约3000RPM之间的恒定每分钟转数(RPM)。可选地，可以使用其他马达类型，诸如步进(stepper)、伺服(servo)、刷式DC等。任选地，马达338还可以具有允许旋转方向反转的方向控制以及感测和报告实际RPM的转速计。马达由处理器(未示出)根据例如被编程到处理器中的标准方案和/或使用者输入进行控制，并且马达可以被配置成改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动，从而增强混合，例如以防止细胞团聚、增加通气和优化细胞呼吸。
细胞生长装置330的主壳体336、端壳体352和下壳体332可以由任何合适的稳健材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括塑料。这些结构或其部分可以通过各种技术产生，例如金属制造、注射成型、产生熔合的结构层，等等。尽管在一些实施方案中设想旋转生长瓶300是可重复使用的，但是优选地是可消耗的，细胞生长装置330的其他组件优选地是可重复使用的，并且发挥作为独立台式装置或者多模块细胞处理系统中的模块的功能。
细胞生长装置330的处理器(未示出)可以用待用作生长细胞培养物的“空白”或对照的信息编程。“空白”或对照是仅包含细胞生长培养基的容器，产生100％的透射率和0OD，而细胞样品会将光线偏转并且会具有较低的透射率百分比和较高的OD。随着细胞在培养基中生长并且变得更稠密，透射率会降低并且OD会增加。细胞生长装置330的处理器(未示出)可以被编程为使用与细胞培养中通常使用的生长培养基相称的空白的波长值(不论，例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、动物细胞、酵母细胞等)。可选地，第二分光光度计和容器可以包括在细胞生长装置330中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔读取空白。
图3D图示了作为组装的一部分的细胞生长装置330，包括与光源390、检测器392和热组件394耦合的图3B的细胞生长装置330。将旋转生长瓶300插入细胞生长装置中。光源390和检测器392的组件(例如，诸如，具有覆盖5-log的增益控制的光电二极管)与细胞生长设备的主壳体耦合。图示了容纳使旋转生长瓶300旋转的马达的下壳体332，以及将细胞生长装置330固定至组装的凸缘334之一。同样，图示的热组件394是Peltier装置或热电冷却器。在该实施方案中，热控制通过经由下壳体332的基部上的凸缘334将细胞生长装置330附接至热组件394并与热组件394电一体化来实现。热电冷却器能够将热量“泵”至接合处(junction)的任一侧，根据电流的方向冷却表面或加热表面。在一种实施方案中，使用热敏电阻测量主壳体的温度，并且然后通过标准的电子比例积分微分(PID)控制器回路，将旋转生长瓶300控制在约+/-0.5℃。
在使用时，通过刺穿箔密封件或膜，将细胞接种(细胞可以从例如自动化液体操作系统或由使用者移出)到旋转生长瓶300的预填充生长培养基中。细胞生长装置330的编程软件设置用于生长的控制温度，通常为30℃，然后缓慢启动旋转生长瓶300的旋转。细胞/生长培养基混合物由于离心力缓慢垂直向上移动至壁，允许旋转生长瓶300将混合物的大表面面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的时间间隔采取连续读取OD或OD测量。这些测量结果存储在内部存储器中，并且如果需要，软件将测量对比时间绘图，以展示生长曲线。如果需要增强混合，例如为了优化生长条件，可以改变瓶旋转的速度以引起液体的轴向进动，和/或可以以编程的间隔进行完全的方向改变。可以对生长监控编程，以在预先确定的OD时自动终止生长阶段，并且然后将混合物快速冷却至较低温度，以抑制进一步生长。
细胞生长装置330的一个应用是不断地测量生长细胞培养物的光密度。所描述的细胞生长装置的一个优点是光密度可以连续测量(动力学监测)或以特定时间间隔测量；例如每5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒或60秒，或者每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。虽然已经在测量生长细胞培养物的光密度(OD)的背景下描述了细胞生长装置330，然而鉴于本说明书的教导，本领域技术人员应理解，除了细胞培养物OD之外或者代替细胞培养物OD，可以测量其他细胞生长参数。如同上文关于固体壁装置或模块描述的细胞生长的任选测量，使用可见光、UV或近红外(NIR)光的光谱学允许监测细胞培养物中营养物和/或废物的浓度，并且可以进行其他光谱学测量；即，可以通过例如介电阻抗光谱学、可见荧光、荧光偏振或发光来测量其他光谱特性。此外，细胞生长装置330可以包括用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH、电导率等的另外的传感器。有关旋转生长瓶和细胞生长装置的另外详细信息，参见USPN 10,435,662；USPN 10,443,031；USPN 10,590,375和2020年2月3日提交的USSN 16/780,640。
细胞浓缩模块
如上文关于旋转生长瓶和细胞生长模块描述的，为了获得足够数量的用于转化或转染的细胞，细胞通常在适合感兴趣的细胞生长的培养基中生长至特定的光密度；然而，为了有效转化或转染，期望减少细胞体积，并通过缓冲液或培养基交换使细胞为感受态。因此，在细胞处理系统中期望用于以上列出的方法的一个子组件或模块是能够生长、进行缓冲液交换和/或浓缩细胞并使它们为感受态的模块或组件，从而可以用工程化或编辑细胞基因组所需的核酸转化或转染它们。
图4A示出了渗余物构件422(上图)、渗透物构件420(中图)和切向流组件410(下图)，切向流组件410包括渗余物构件422、膜424(未见于图4A中)和渗透物构件420(也未见于)。在图4A中，渗余物构件422包括切向流动通道402，该切向流动通道402具有蛇形构造，该蛇形构造从渗余物构件422的一个下角开始-具体地说，在渗余物端口428处-横穿并向上然后向下并横穿渗余物构件422，在第二渗余物端口428处终止于渗余物构件422的另一个下角。在渗余物构件422上还看到能量导向器491，该能量导向器491围绕膜或过滤器(未见于该图4A中)所处的区域，并且在通道402的区域之间相互交叉。在该实施方案中，能量导向器491通过渗透物/滤液构件420上的能量导向器部件491(在右侧)与渗余物构件422和渗透物/滤液构件420配合，并用于促进渗余物构件422与渗透物/滤液构件420的超声波焊接或结合。另外，可以看到埋头孔423，两个在渗余物构件422的底部，一个在渗余物构件422的顶部中间。埋头孔423用于将切向流组件410耦合到储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)。
渗透物/滤液构件420在图4A的中部可见，并且除了能量导向器491之外，渗透物/滤液构件420还包括用于每个底角处的渗余物端口428的通孔(其与渗余物构件422的底角处的渗余物端口428的通孔配合)，以及位于渗透物构件420的顶部和中心的切向流动通道402和两个渗透物/滤液端口426。该实施方案中的切向流动通道402结构具有蛇形构造和波状几何形状，尽管也可以使用其他几何形状。渗透物构件420还包括埋头孔423，与渗余物构件420上的埋头孔423一致。
在图4A的底部是切向流组件410，其包括在该图4A中看到的渗余物构件422和渗透物构件420。在该视图中，渗余物构件422在视图的“顶部”，膜(未见于组件的该视图中)将邻近渗余物构件422并在其下方，并且渗透物构件420(未见于组件的该视图中)邻近膜并在其下方。再次看到埋头孔423，其中渗余物构件422和渗透物构件420中的埋头孔一致并配置成与设置在储库组件(未见于图4A中，但参见图4B)上的埋头孔的螺纹或配合元件配合。
膜或过滤器设置在渗余物和渗透物构件之间，其中流体可以流过膜，但是细胞不能，并因此被保留在设置在渗余物构件中的流动通道中。适用于TFF装置/模块的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤期间无污染并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸的那些。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至20μm。事实上，可用于TFF装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的非反应性材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维，或如在激光或电化学蚀刻的情况下的金属基材。
通道结构402的长度可以根据待生长的细胞培养物的类型和体积以及待浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构的长度通常为60mm至300mm，或70mm至200mm，或80mm至100mm。流动通道402的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或另一种具有大体上直边的形状，截面可以是约10μm至1000μm宽，或200μm至800μm宽，或300μm至700μm宽，或400μm至600μm宽；和约10μm至1000μm高，或200μm至800μm高，或300μm至700μm高，或400μm至600μm高。如果流动通道402的截面大体上是圆形、卵形或椭圆形的，则通道的半径可以是按水力半径约50μm至1000μm，或者按水力半径5μm至800μm，或者按水力半径200μm至700μm，或者按水力半径300μm至600μm宽，或者按水力半径约200μm至500μm。此外，渗余物422和渗透物420构件中的通道的体积可以根据每个构件中通道的深度而不同。
图4B示出了配置成与图4A中所见的切向流组件410一起使用的储库组件450的前透视图(上)和后透视图(下)。在前透视图中看到的(例如，“前”是储库组件450耦合到图4A中所看到的切向流组件410的一侧)是渗透物储库454任一侧上的渗余物储库452。还看到渗透物端口426、渗余物端口428和用于埋头孔423的三个螺纹或配合元件425(埋头孔423未见于图4B中)。埋头孔423的螺纹或配合元件425被配置成将切向流组件410(见于图4A中)配合或耦合到储库组件450。可选地或另外，紧固件、声波焊接或热融柱(heat stakes)可用于将切向流组件410配合或耦合到储库组件450。此外，看到覆盖储库组件450顶部的密封垫445。关于图4E详细描述密封垫445。在图4B的左侧是储库组件450的后部透视图，其中“后”是储库组件450的未耦合到切向流组件的一侧。看到渗余物储库452、渗透物储库454和密封垫445。
TFF装置可以由其中通道(和通道分支)可以被磨铣的任何稳健材料制成，包括不锈钢、硅、玻璃、铝或塑料，所述塑料包括环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。如果TFF装置/模块是一次性的，优选地它由塑料制成。在一些实施方案中，用于制造TFF装置/模块的材料是导热的，使得细胞培养物可以被加热或冷却至期望的温度。在某些实施方案中，TFF装置使用上文提及的适于这种大规模生产技术的材料通过以下形成：精密机械加工、激光加工、放电加工(用于金属装置)；湿法或干法蚀刻(用于硅装置)；干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光结构化(photostructuring)(用于玻璃装置)；或热成型、注射成型、热压花、或激光加工(用于塑料装置)。
图4C描绘了图4B所示的储库组件450的俯视图。图4D描绘了用于图4B所示的储库组件450的盖444，并且图4E描绘了在操作中设置在图4B所示的储库组件450的盖444上的密封垫445。图4C是储库组件450的俯视图，示出了两个渗余物储库452的顶部，一个在渗透物储库454的一侧。还看到凹槽432和流体通道434，凹槽432与气动端口(未示出)配合，流体通道434位于渗余物储库452的底部，流体通道434通过渗透物构件420和膜424(也未示出)中的渗余物端口的通孔将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。图4D描绘了被配置成设置在储库组件450顶部的盖444。盖444在渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的顶部具有圆形开孔。同样，在渗余物储库452的底部可以看到流体通道434，其中流体通道434将渗余物储库452与渗余物端口428(未示出)流体地耦合。还示出了用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。图4E描绘了密封垫445，该密封垫445被配置成设置在储库组件450的盖444上。可见用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个流体传输端口442。同样，示出了用于每个渗余物储库452和渗透物/滤液储库454的三个气动端口430。
用于细胞生长的总工作流程包括将待生长的细胞培养物装载到第一渗余物储库中，任选地使空气或合适的气体鼓泡通过细胞培养物，使细胞培养物通过或流经第一渗余物端口，然后切向通过TFF通道结构，同时通过渗透物端口406之一或二者收集培养基或缓冲液，通过第二渗余物端口404将细胞培养物收集到第二渗余物储库中，任选地向细胞培养物中添加另外的或不同的培养基，并任选地使空气或气体鼓泡通过细胞培养物，然后重复所述过程，全部同时连续地或以期望的间隔测量例如渗余物储库中细胞培养物的光密度。使用600nm发光二极管(LED)以编程的时间间隔完成光密度(OD)的测量，该发光二极管(LED)已经通过光学器件(optic)成列布置(columnated)到包含生长细胞的一个或更多个渗余物储库中。光继续通过收集光学器件到达检测系统，该检测系统由(数字)增益控制硅光电二极管组成。通常，光密度显示为光衰减器的功率传输因子(power transmissionfactor)的以10为底数的对数的绝对值：OD＝-log10(断电/通电)。由于OD是光学衰减的度量，即吸收、散射和反射的总和，TFF装置OD测量记录了总的功率传输，因此随着细胞生长和群体变得稠密，OD(信号损失)也会增加。OD系统针对OD标准进行预校准，这些值存储在可由测量程序访问的板载存储器中。
在通道结构中，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧(渗余物侧422)，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的滤液或渗透物侧(例如，渗透物构件420)。将空气或其他合适的气体鼓泡通过细胞培养物，既能通气又能混合培养物以促进细胞生长。在过程期间，在流过通道结构期间被去除的培养基通过渗透物/滤液端口406去除。可选地，细胞可以在鼓泡或搅拌下在一个储库中生长，而不使细胞从一个储库通过TFF通道到达另一个储库。
用于使用TFF装置/模块的细胞浓缩的总工作流程包括使细胞培养物或细胞样品切向流过通道结构。如同细胞生长过程，将流动通道分叉的膜将细胞保留在膜的一侧，并且允许不需要的培养基或缓冲液流动跨过膜进入装置的渗透物/滤液侧(例如，渗透物构件420)。在过程中，培养基或缓冲液中的固定体积的细胞被驱动通过装置，直至细胞样品被收集到一个渗余物端口404中，并且已经通过膜的培养基/缓冲液通过一个或两个渗透物/滤液端口406收集。所有类型的原核细胞和真核细胞-黏附细胞和非黏附细胞二者-均可以在TFF装置中生长。黏附细胞可以在悬浮在流过TFF装置的培养基中的珠或其他细胞支架上生长。
用于将细胞悬浮在细胞浓缩装置/模块中的培养基或缓冲液可以是用于被转化或转染的细胞类型的任何合适的培养基或缓冲液，诸如LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks、PBS和林格氏溶液，其中培养基可以作为试剂盒的一部分提供在试剂筒中。
在细胞生长和浓缩过程二者中，使细胞样品通过TFF装置并在一个渗余物端口404中收集细胞，同时在一个渗透物/滤液端口406中收集培养基，这被认为是细胞样品的“一次通过”。渗余物储库之间的转移“翻转”了培养物。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的渗余物端口和渗透物端口驻留于TFF装置/模块的同一端，流体连接被布置成使得渗余物和渗透物/滤液侧存在两个不同的流动层，但是如果渗余物端口404驻留于装置/模块的渗余物构件上(即，细胞被驱动通过膜上方的通道，并且滤液(培养基)通过膜下方的通道部分)，渗透物/滤液端口406会驻留于装置/模块的渗透物构件上，并且反之亦然(即，如果细胞样品被驱动通过膜下方的通道，滤液(培养基)通过膜上方的通道部分)。由于用于通过TFF装置的流动通道转移细胞培养物和流体的高压，重力的影响可以忽略不计。
在生长和浓缩过程的任一种“通过”结束时，细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集。为了起始另一次“通过”，细胞样品再次通过TFF装置，这次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通过渗余物端口404并进入渗余物储库(未示出)而被收集，该储库位于装置/模块与渗余物端口404相对的一端上，渗余物端口404在第一次通过期间用于收集细胞。同样地，在第二次通过时通过膜的培养基/缓冲液通过渗透物端口406或通过两个端口收集，所述渗透物端口406位于装置/模块与渗透物端口406相对的一端上，所述渗透物端口406在第一次通过期间用于收集滤液。重复使渗余物(浓缩的细胞样品)通过装置/模块的交替过程，直至细胞已经生长至期望的光密度，和/或浓缩到期望的体积，并且两个渗透物端口(即，如果存在多于一个)可以在通过期间打开以减少操作时间。此外，缓冲液交换可以通过以下实现：将期望的缓冲液(或新鲜培养基)添加至渗余物储库中的细胞样品，然后起始另一次“通过”，并且重复该过程，直至旧的培养基或缓冲液被稀释并过滤掉并且细胞驻留在新鲜培养基或缓冲液中。注意，缓冲液交换和细胞生长可以(并且通常确实)同时发生，并且缓冲液交换和细胞浓缩可以(并且通常确实)同时发生。关于TFF的进一步信息和替代实施方案，参见例如2020年2月22日提交的USSN 16/798,302。
核酸组装模块
本公开内容的自动化多模块细胞编辑仪器的某些实施方案任选地包括核酸组装模块。核酸组装模块被配置成接受和组装促进期望的基因组编辑事件所需的核酸。通常，术语“载体”是指能够将与其相连的期望的核酸转运到细胞中的核酸分子。载体包括但不限于为单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或更多个游离末端、没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他各种多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指可以诸如通过标准分子克隆技术将另外的DNA区段插入其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中来源于病毒的DNA或RNA序列存在于载体中用于包装成病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒，和腺病毒相关病毒)。病毒载体还包含用于转染到宿主细胞中的由病毒携带的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”或“编辑载体”。在重组DNA技术中具有实用性的常见表达栽体通常呈质粒的形式。另外的载体包括F粘粒、噬菌粒和合成染色体。
重组表达载体可以包含呈适于在宿主细胞中转录核酸，并且对于一些核酸序列，翻译和表达核酸的形式的核酸，这意味着重组表达载体包含一个或更多个调控元件，所述调控元件可以基于待被用于表达的宿主细胞来选择，所述调控元件被可操作地连接至待被表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”意在意指感兴趣的核苷酸序列以以下方式连接至一个或更多个调控元件：允许核苷酸序列的转录，并且对于一些核酸序列，允许核苷酸序列的翻译和表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。适当的重组和克隆方法已在美国公布第2004/0171156号中公开，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
调控元件被可操作地连接至可靶向核酸酶系统的一个或更多个元件，以驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的转录，并且对于一些核酸序列，驱动可靶向核酸酶系统的一个或更多个组分的翻译和表达。
此外，编码核酸指导的核酸酶的多核苷酸序列可以针对特定细胞诸如原核细胞或真核细胞中的表达被密码子优化。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。此外或可选地，载体可以包括可操作地连接至当被转录时形成指导RNA的多核苷酸序列的调控元件。
核酸组装模块可以被配置成以自动化方式进行许多种不同的核酸组装技术。可以在所公开的自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模块中进行的核酸组装技术包括但不限于使用限制性内切核酸酶的那些组装方法，包括PCR、BioBrick组装(USPN 9,361,427)、IIS型克隆(例如，GoldenGate组装，欧洲专利申请公布EP 2 395 087A1)和连接酶循环反应(de Kok,ACS Synth Biol.,3(2):97-106(2014)；Engler等人，PLoS One，3(11):e3647(2008)；和USPN 6,143,527)。在其他实施方案中，由所公开的自动化多模块细胞编辑仪器进行的核酸组装技术基于核酸的邻近部分之间的重叠，诸如Gibson
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CPEC、SLIC、连接酶循环等。另外的组装方法包括酵母中的缺口修复(Bessa,Yeast,29(10):419-23(2012))、gateway克隆(Ohtsuka,Curr Pharm Biotechnol,10(2):244-51(2009))；USPN 5,888,732；和USPN 6,277,608)和拓扑异构酶介导的克隆(Udo,PLoS One,10(9):e0139349(2015)；和美USPN6,916,632)。这些和其他核酸组装技术在例如Sands和Brent，CurrProtoc Mol Biol.，113:3.26.1-3.26.20(2016)中描述。
核酸组装模块根据自动化多模块细胞编辑仪器中使用的核酸组装类型进行温度控制。例如，当在核酸组装模块中使用PCR时，该模块包括热循环能力，允许温度在变性、退火和延伸步骤之间循环。当在核酸组装模块中使用单温度组装方法(例如等温组装方法)时，该模块提供达到并保持在优化所进行的特定组装过程的温度的能力。这些温度和维持这些温度的持续时间可以通过由脚本执行的一组预编程的参数确定，或者由使用者使用自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统手动控制。
在一种实施方案中，核酸组装模块是使用单一等温反应进行组装的模块。某些等温组装方法可以基于序列同一性同时组合多达15个核酸片段。在一些实施方案中，组装方法提供待组装的核酸，所述核酸包括与邻近核酸片段约20-40个碱基的重叠。片段与三种酶(外切核酸酶、聚合酶和连接酶)的混合物连同缓冲液组分混合。因为过程是等温的，并且可以使用单个反应容器以1步或2步法进行，等温组装反应非常适合在自动化多模块细胞编辑仪器中使用。1步法允许使用1步等温过程组装多达五个不同的片段。将片段和酶的主混合物组合，并且在50℃孵育多达1小时。为了产生具有多达15个片段的更复杂的构建体或为了掺入100bp至多达10kb的片段，通常使用2步，其中2步反应需要两次分开添加主混合物；一次用于外切核酸酶和退火步骤，并且第二次用于聚合酶和连接步骤。
细胞转化模块
图5A和图5B描绘了可用于本文描述的自动化多模块仪器的示例性试剂筒的一种实施方案的结构和部件。在图5A中，试剂筒500包括主体502，主体502具有储库504。一个储库504显示为空的，并且两个储库具有插入其中的单独的管(未示出)，具有单独的管盖505。此外，还示出了多排储库，其中插入了多排共同连接的大管503a和多排共同连接的小管503b。多排共同连接的管呈条状，外凸缘507在外凸缘的背面(未示出)与主体502中的凹槽509配合，从而将多排共同连接的管(503a和503b)固定到试剂筒500。还示出了试剂筒主体502的底座511。注意，主体502中的储库504的成状通常类似于插入这些储库504中的共同连接的管中的管。
图5B描绘了图5A中的试剂筒500，其具有一排共同连接的大管503a、一排共同连接的小管503b和一个大管560，其中盖505从试剂筒500的储库504取下(即，如上文描绘的)。同样，共同连接的管排呈条状，示出了单个的大管561，以及示出了单个的小管555。同样，共同连接的管的每个带包括外凸缘507，该外凸缘507在外凸缘的背面(未示出)与主体502中的凹槽509配合，以将多排共同连接的管(503a和503b)固定到试剂筒500。如图5A所示，试剂筒主体502包括底座511。试剂筒500可以由任何合适的材料制成，包括不锈钢、铝或塑料，包括聚氯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚砜和聚氨酯，以及这些和其他聚合物的共聚物。同样，如果试剂筒500是一次性的，它优选地由塑料制成。此外，在许多实施方案中，用于制造试剂筒的材料是导热的，因为试剂筒500可以接触加热或冷却试剂储库504中的试剂(包括共同连接的管中的试剂)的热装置(未示出)。在一些实施方案中，热装置是Peltier装置或热电冷却器。
图5C和图5D分别是示例性FTEP装置550的顶部透视图和底部透视图，该装置可以是图5A和图5B中的试剂筒500的一部分(例如，其中的部件)，或者可以是独立的模块；即，不是试剂筒或其他模块的一部分。图5C描绘了FTEP装置550。FTEP装置550具有限定细胞样品入口552和细胞样品出口554的孔。图5D是图5C的FTEP装置550的底部透视图。在该视图中可以看到入口孔552和出口孔554。在图5D中还看到对应于孔552的入口562的底部、对应于出口孔554的出口564的底部、限定的流动通道566的底部以及流动通道566两侧上的两个电极568的底部。FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多道电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后从FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过，用于另一次电穿孔。此外，该过程可以重复一次至许多次。有关FTEP装置的更多信息，参见例如，USPN 10,435,713；USPN 10,443,074；USPN 10,323,258和USPN 10,508,288。此外，试剂筒的其他实施方案可以提供或容纳未被配置为FTEP装置的电穿孔装置，诸如在2018年8月22日提交的USSN 16/109,156中描述的那些。对于在本发明的自动化多模块细胞处理仪器中有用的试剂筒，参见例如USPN 10,376,889；USPN 10,406,525；USPN 10,576,474；和2020年1月22日提交的USSN 16/749,757；和2020年3月23日提交的USSN 16/827,222。
FTEP装置的另外细节在图5E-图5G中示出。注意，在图5E-图5G的FTEP装置中，电极被放置成使得第一电极被放置在流动通道的入口和狭窄区域之间，并且第二电极被放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。图5E示出了FTEP装置550的俯视平面图，该装置具有用于将含有细胞和外源物质的流体引入FTEP装置550的入口552和用于在电穿孔后从FTEP取出转化的细胞的出口554。电极568通过装置中的通道(未示出)引入。
图5F示出了从FTEP装置550的顶部的剖视图，其中入口552、出口554和电极568关于流动通道566定位。图5G示出了具有入口552和入口通道572以及出口554和出口通道574的FTEP装置550的侧面剖视图。电极568位于电极通道576中，使得它们与流动通道566流体连通，但不直接位于细胞穿过流动通道566的路径中。注意，第一电极放置在流动通道的入口和狭窄区域之间，并且第二电极放置在流动通道的狭窄区域和出口之间。在该装置的这一方面中，电极568位于电极通道576中，电极通道576通常垂直于流动通道566，使得包含细胞和外源物质的流体从入口通道572通过流动通道566流到出口通道574，并且在该过程中，流体流入电极通道576以与电极568接触。在这方面，入口通道、出口通道和电极通道都源自装置的同一平面侧。然而，在某些方面，电极可以从与入口通道和出口通道不同的FTEP装置的平面侧引入。
在本公开内容的FTEP装置中，转化的毒性水平产生电穿孔后大于30％的存活细胞，优选地转化后大于35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％的存活细胞，这取决于细胞类型和引入细胞的核酸。
FTEP装置的壳体可以由许多材料制成，这取决于FTEP装置是要重复使用、高压灭菌还是一次性使用，包括不锈钢、硅、玻璃、树脂、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。类似地，装置中通道的壁可以由任何合适的材料制成，包括硅酮、树脂、玻璃、玻璃纤维、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜和聚氨酯、这些和其他聚合物的共聚物。优选的材料包括结晶苯乙烯、环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)，这允许除了电极和例如底部密封膜(如果存在)之外，该装置可以通过注射成型整体形成。
本文描述的FTEP装置(或FTEP装置的部分)可以通过各种技术产生或制造，例如作为整个装置或通过产生熔合或以其他方式耦合的结构层。例如，对于金属FTEP装置，制造可以包括精密机械加工或激光加工；对于硅FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻；对于玻璃FTEP装置，制造可以包括干法或湿法蚀刻、喷粉(powderblasting)、喷砂或光结构化；以及对于塑料FTEP装置，制造可以包括热成型、注射成型、热压花或激光加工。
FTEP装置的部件可以单独制造并且然后组装，或者FTEP装置的某些部件(或者甚至除了电极之外的整个FTEP装置)可以作为单个实体制造(例如，使用3D打印)或模制(例如，使用注射成型)，在模制之后添加其他部件。例如，壳体和通道可以被制造或模制成单个实体，电极随后被添加以形成FTEP单元。可选地，FTEP装置也可以形成为两个或更多个平行层，例如，具有水平通道和过滤器的层、具有垂直通道的层以及具有入口端口和出口端口的层，这些层被单独制造和/或模制并在制造之后组装。
在特定方面，可以使用电路板作为基底来制造FTEP装置，其中电极、过滤器和/或流动通道以期望的配置形成在电路板上，并且包含例如一个或更多个入口和出口通道和/或流动通道的装置的剩余壳体作为单独的层形成，然后密封到电路板上。将壳体的顶部密封到电路板上提供了本公开内容的FTEP装置的不同元件的期望配置。此外，可以在单个基底上制造两个到许多个FTEP装置，然后彼此其后分离或者并行使用。在某些实施方案中，FTEP装置是可重复使用的，并且在某些实施方案中，FTEP装置是一次性的。在另外的实施方案中，FTEP装置可以是可高压灭菌的。
电极508可以由任何合适的金属形成，诸如铜、不锈钢、钛、铝、黄铜、银、铑、金或铂或石墨。一种优选的电极材料是合金303(UNS330300)奥氏体不锈钢。施加的电场可以破坏由金属(如铝)制成的电极。如果期望多次使用(即，非一次性)流通式FTEP装置，不同于一次性的一次使用流通式FTEP装置，电极板可以涂有对电化学腐蚀耐受的金属。导电涂层，如贵金属，例如金，可用于保护电极板。
如提及的，FTEP装置可以包括推拉气动装置，以允许多次(multi-pass)电穿孔程序；即，对于一次电穿孔，待电穿孔的细胞可以从入口被“拉”向出口，然后从流通式FTEP装置的出口端被“推”向入口端，以再次在电极之间通过，进行另一次电穿孔。这个过程可以重复一次到许多次。
根据待电穿孔的细胞类型(例如细菌、酵母、哺乳动物)和电极的配置，流动通道中电极之间的距离可以变化很大。例如，在流动通道宽度减小的情况下，流动通道可以变窄到10μm和5mm之间，或者25μm和3mm之间，或者50μm和2mm之间，或者75μm和1mm之间。流动通道中电极之间的距离可以在1mm和10mm之间，或者2mm和8mm之间，或者3mm和7mm之间，或者4mm和6mm之间。FTEP装置的总尺寸可以是3cm到15cm长，或4cm到12cm长，或4.5cm到10cm长。FTEP装置的总宽度可以是0.5cm到5cm，或者0.75cm到3cm，或者1cm到2.5cm，或者1cm到1.5cm。
流动通道变窄的区域足够宽，使得至少两个细胞可以适于并排在变窄的部分中。例如，典型的细菌细胞直径为1μm；因此，用于转化这样的细菌细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少2μm宽。在另一个实例中，如果哺乳动物细胞直径为约50μm，用于转化这样的哺乳动物细胞的FTEP装置的流动通道的变窄部分为至少100μm宽。即，FTEP装置的变窄部分不会物理扭曲或“挤压”被转化的细胞。
在FTEP装置的实施方案中，其中储库用于将细胞和外源物质引入FTEP装置，储库的体积范围为100μL至10mL，或500μL至75mL，或1mL至5mL。FTEP中的流量范围为每分钟0.1mL至5mL，或每分钟0.5mL至3mL，或每分钟1.0mL至2.5mL。FTEP装置中的压力范围为1-30psi，或2-10psi，或3-5psi。
为了避免电极之间的场强不同，电极应当平行排列。此外，电极的表面应当尽可能光滑，而无针孔或峰。具有1μm至10μm的粗糙度Rz的电极是优选的。在本发明的另一种实施方案中，流通式电穿孔装置包括至少一个另外的电极，该电极向FTEP装置施加地电位。流通式电穿孔装置(作为独立的仪器或作为自动化多模块系统中的模块)描述于，例如，USPN10,435,713；USPN 10,443,074；USPN 10,323,258和USPN10,508,288。
细胞单个化和富集装置
图6A描绘了固体壁装置6050和用于在固体壁装置中的微孔中使细胞单个化的工作流程。在图的(i)的左上方，描绘了具有微孔6052的固体壁装置6050。基底6050的部分6054在(ii)示出，还描绘了微孔6052。在(iii)，示出了固体壁装置6050的侧截面，并且已经装载了微孔6052，其中在该实施方案中已经发生了泊松装载(Poisson loading)或大致上泊松装载；即，每个微孔具有极少、一个细胞或不具有细胞。在(iv)，图示出了工作流程6040，其中具有微孔6052的基底6050显示出每个微孔具有一个细胞的微孔6056、微孔中没有细胞的微孔6057以及微孔中具有两个细胞的一个微孔6060。在步骤6051，允许微孔中的细胞倍增大约2-150倍以形成克隆集落(v)，然后允许进行编辑6053。
在编辑6053后，已经被编辑的细胞集落中的许多细胞由于由有效编辑引起的双链切割而死亡，并且对于确实存活但必须在编辑后修复和恢复的编辑的细胞存在生长延滞(微孔6058)，其中不经历编辑的细胞茁壮成长(微孔6059)(vi)。允许所有细胞继续生长以建立集落并且标准化，其中微孔6058中编辑的细胞的集落在尺寸和/或细胞数方面赶上没有经历编辑的微孔6059中的细胞(vii)。在细胞集落被标准化后，微孔中所有细胞的任一汇集6060就可以发生，在这种情况下，通过消除来自非编辑细胞和来自编辑的适应度效应的偏倚，针对编辑的细胞富集细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定和选择6061(例如“择优选取(cherry picked)”)生长缓慢的集落(例如微孔6058中的细胞)，产生甚至更为富集的编辑的细胞。
在使细胞生长时，所使用的培养基当然取决于被编辑的细胞类型例如细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于酵母细胞生长的培养基包括LB、SOC、TPD、YPG、YPAD、MEM和DMEM。
可用于执行图6A中描绘的方法的模块是固体壁分离、孵育和标准化(SWIIN)模块。图6B从分解顶部透视图描绘了SWIIN模块650的实施方案。在SWIIN模块650中，渗余物构件形成在SWIIN模块组件顶部的底端，并且渗透物构件形成在SWIIN模块组件底部的顶端。
图6B中的SWIIN模块650自上而下包括储库密封垫或盖658、渗余物构件604(其中渗余物流动通道不可见于该图6B中)、与过滤器(过滤器未见于图6B中)锻造的穿孔构件601、包括集成储库(渗透物储库652和渗余物储库654)的渗透物构件608、以及密封渗透物储库652和渗余物储库654底部的两个储库密封件662。可以看到渗透物通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由蛇形通道660a的凸起部分676限定，还可以看到超声波突出部(ultrasonic tabs)664设置在渗透物构件608的顶部。在该图6B中看不到在穿孔构件601上形成孔的穿孔；然而，看到容纳超声波突出部664的通孔666。此外，支持物670设置在SWIIN模块650的任一端，以支持SWIIN模块650，并将渗透物构件608和渗余物构件604提升到储库652和654上方，以使进入从渗透物储库到蛇形通道660a的流体路径或从渗余物储库到蛇形通道660b的流体路径(在该图6B中看不到这两个流体路径)的气泡或空气最小化。
在该图6B中，可以看出，设置在渗透物构件608顶部的蛇形通道660a在渗透物构件608的大部分长度以及渗透物构件608的大部分宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物储库652和渗余物储库654的部分之外。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分长度”意指渗余物构件或渗透物构件长度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件长度的约90％、85％、80％、75％或70％。如本文中关于渗余物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分宽度”意指渗余物构件或渗透物构件宽度的约95％，或渗余物构件或渗透物构件宽度的约90％、85％、80％、75％或70％。
在SWIIN模块的该实施方案中，穿孔构件包括通孔，以容纳设置在渗透物构件上的超声波突出部。因此，在该实施方案中，穿孔构件由316不锈钢制成，并且穿孔形成微孔的壁，而过滤器或膜用于形成微孔的底部。通常，穿孔(微孔)直径为约150μm-200μm，并且穿孔构件为约125μm深，导致微孔具有约2.5nl的体积，总共大约200,000个微孔。微孔之间的距离是中心至中心约279μm。虽然此处微孔具有约2.5nl的体积，但微孔的体积可以是1nl至25nl，或优选地2nl至10nl，并且甚至更优选地2nl至4nl。至于过滤器或膜，像前面描述的过滤器一样，适合使用的过滤器是耐溶剂的、在过滤期间无污染，并且能够保留感兴趣细胞的类型和尺寸。例如，为了保留小细胞类型，诸如细菌细胞，孔径可以低至0.10μm，然而对于其他细胞类型(例如，诸如对于哺乳动物细胞)，孔径可以高至10.0μm-20.0μm或更大。事实上，可用于细胞浓缩装置/模块中的孔径包括具有以下尺寸的过滤器：0.10μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以及更大。过滤器可以由任何合适的材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和乙酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙或玻璃纤维。
配合的蛇形通道的截面形状可以是圆形、椭圆形、卵形、方形、矩形、梯形或不规则的。如果是方形、矩形或具有大致直边的另一种形状，截面可以是约2mm到15mm宽，或者3mm到12mm宽，或者5mm到10mm宽。如果配合的蛇形通道的截面通常是圆形、卵形或椭圆形，通道的半径可以是以水力半径约3mm到20mm，或者以水力半径5mm到15mm，或者以水力半径8mm到12mm。
蛇形通道660a和660b可以具有大致相同的体积或不同的体积。例如，蛇形通道的每个“侧面”或部分660a、660b可以具有例如2mL的体积，或者渗透物构件608的蛇形通道660a可以具有2mL的体积，并且渗余物构件604的蛇形通道660b可以具有例如3mL的体积。蛇形通道中的流体体积范围可以是约2mL至约80mL、或约4mL至60mL、或5mL至40mL、或6mL至20mL(注意，这些体积适用于包括例如50-500K穿孔构件的SWIIN模块)。储库的体积范围可以是5mL至50mL、或7mL至40mL、或8mL至30mL或10mL至20mL，并且所有储库的体积可以相同或储库的体积可以不同(例如，渗透物储库的体积大于渗余物储库的体积)。
渗透物构件608和渗余物构件604的蛇形通道部分660a和660b分别为约200mm长、130mm宽和4mm厚，尽管在其他实施方案中，渗余物构件和渗透物构件的长度可为75mm至400mm，或长度为100mm至300mm，或长度为150mm至250mm；宽度为50mm至250mm，或宽度为75mm至200mm，或宽度为100mm至150mm；以及厚度为2mm至15mm，或厚度为4mm至10mm，或厚度为5mm至8mm。在一些实施方案中，渗余物(和渗透物)构件可以由PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))制成，或者可以使用其他材料，包括聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚砜、聚氨酯以及这些和其他聚合物的共聚物。优选地，至少渗余物构件由透明材料制成，使得细胞可以被可视化(例如，参见图6E及其描述)。例如，通过例如基于具有相差的空孔图像的密度变化测量，或者如果例如使用发色标记，诸如发色蛋白，来给细胞增加可区分的颜色，摄像机可以用于监测细胞生长。尽管也可以使用荧光细胞标记、荧光蛋白和化学发光细胞标记，但发色标记诸如blitzen blue、dreidel teal、virginiaviolet、vixen purple、prancer purple、tinsel purple、maccabee purple、donnermagenta、cupid pink、seraphina pink、scrooge orange和leor orange(ChromogenicProtein Paintbox，均可从ATUM(Newark,CA)获得)避免了使用荧光的需要。
因为渗余物构件优选地是透明的，所以SWIIN模块中的集落生长可以通过自动化装置，诸如JoVE(ScanLagTM system,Cambridge,MA)销售的装置进行监测(也参见Levin-Reisman等人,Nature Methods,7:737-39(2010))。可以使用自动化集落选取仪，诸如由例如TECAN(PickoloTM system,Mannedorf,Switzerland)；Hudson Inc.(RapidPickTM,Springfield,NJ)；Molecular Devices(QPix 400TM system,San Jose,CA)；以及SingerInstruments(PIXLTM system,Somerset,UK)销售的那些。
由于SWIIN模块的加热和冷却，冷凝物可能积聚在渗余物构件上，这可能干扰正在生长的细胞集落的精确可视化。SWIIN模块650的冷凝可以通过例如在SWIIN模块650的顶部(例如渗余物构件)上移动加热的空气，或者通过在渗余物构件604的至少蛇形通道部分660b上应用透明加热盖来控制。参见例如图6E及下文对其的描述。
在SWIIN模块650中，细胞和培养基-在适于穿孔构件的微孔中细胞的泊松或大致泊松分布的稀释度-从渗余物构件604中的端口流入蛇形通道660b，并且细胞在微孔中沉淀，同时培养基穿过过滤器进入渗透物构件608中的蛇形通道660a。由于细胞不能穿过过滤器603，细胞被保留在穿孔构件601的微孔中。合适的培养基可以通过渗透物端口611引入渗透物构件608。培养基向上流过过滤器603，以滋养穿孔构件601的微孔(穿孔)中的细胞。此外，缓冲液交换可以通过循环培养基通过渗余物和渗透物构件来实现。在操作中，细胞被沉积到微孔中，生长初始的例如2-100倍增，编辑可以通过例如将SWIIN的温度升高到42℃以诱导温度诱导型启动子来诱导，或者通过从渗透物构件中去除生长培养基并用包含诱导诱导型启动子的化学组分的培养基替换生长培养基来诱导。
在编辑已经发生后，可以降低SWIIN的温度，或者可以去除诱导培养基并用缺乏化学组分的新鲜培养基代替，从而使诱导型启动子失活。然后，细胞在SWIIN模块650中继续生长，直到微孔中细胞集落的生长被标准化。对于标准化方案，在集落被标准化后，通过向渗透物构件蛇形通道660a施加并从而向过滤器603施加流体或空气压力(或二者)，将集落从微孔中冲洗出来并汇集。可选地，如果期望择优选取，监测微孔中细胞集落的生长，并直接选择生长缓慢的集落；或者，快速生长的集落被消除。
图6C是具有渗余物和穿孔构件的SWIIN模块的部分横截面的顶部透视图。在该图6C中，可以看到，蛇形通道660a设置在渗透物构件608的顶部，由凸起部分676限定，并且在渗透物构件608的大部分长度和宽度上横穿渗透物构件608，除了不横穿渗透物构件608的包括渗透物和渗余物储库的部分之外(注意，只能看到一个渗余物储库652)。从左向右移动，储库密封垫658设置在渗余物构件604的集成储库盖678(盖未见于该图6C中)上。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。在最左端还有支持物670。可以看到设置在渗透物储库652下方的两个储库密封件662中的一个。除了渗余物构件在横截面中，穿孔构件601和过滤器603(过滤器603未见于该图6C中)也是横截面。注意，在SWIIN模块650的右端和限定蛇形通道660a的通道转弯的凸起部分676上设置有多个超声波突出部664，包括延伸穿过穿孔构件601的通孔666的超声波突出部664。在渗透物构件608的末端远端储库652、654处也有支持物670。
图6D是组装的SWIIIN模块650的侧面透视图，从右至左包括设置在渗余物构件604的集成储库盖678(未示出)上的储库密封垫658。密封垫658可以由橡胶、硅酮、丁腈橡胶、聚四氟乙烯、诸如聚三氟氯乙烯的塑料聚合物或其他柔性可压缩材料制成。密封垫658包括储库进入孔632a、632b、632c和632d，以及气动端口633a、633b、633c和633d。渗透物构件608的支持物670也在最左端。此外，可以看到渗透物储库652以及一个储库密封件662。在最右端是第二支持物670。
在大多数实施方式中，期望对生长在SWIIN的孔中的细胞集落进行成像，例如，以监测细胞生长和装置性能二者，并且成像对于择优选取实施方式是必要的。实时监测SWIIN中的细胞生长需要背光、渗余物板(顶板)冷凝管理和系统级温度控制、气流和热管理方法。在一些实施方式中，成像采用具有足够分辨率的照相机或CCD器件，以能够对单个孔成像。例如，在一些配置中，使用具有9像素间距的相机(即，每个孔的中心到中心有9个像素)。在一些实施方式中，处理图像可以利用灰度读取图像，从低到高对每个像素进行评级，其中没有细胞的孔会是最亮的(由于来自背光的完全或接近完全的光透射)，并且具有细胞的孔会是暗的(由于细胞阻挡来自背光的光透射)。在处理图像之后，进行阈值处理(thresholding)以确定哪些像素会被识别为(called)“亮”或“暗”，进行斑点寻找以找到亮像素并将它们排列成块，并且然后将斑点排列在对应于斑点的六边形像素网格上。在布置后，通过例如观察斑点中间的一个或更多个像素、在随机或预设位置观察若干个至许多像素、或者对斑点中的X个像素取平均值来提取每个孔的强度度量。此外，可以减去背景强度。阈值处理再次用于将每个孔识别为阳性(例如，含有细胞)或阴性(例如，孔中没有细胞)。成像信息可以若干方式使用，包括在监测细胞生长的时间点拍摄图像。监测细胞生长可用于，例如，去除快速生长细胞的“松饼顶部(muffin tops)”，然后去除所有细胞或如上文描述地以“轮”去除细胞，或从特定孔中回收细胞(例如，缓慢生长的细胞集落)；可选地，可以鉴定包含快速生长细胞的孔，并且可以将覆盖快速生长细胞集落的UV区域投射(或用快门光栅化)到SWIIN上，以照射或抑制这些细胞的生长。成像也可用于确保蛇形通道660中的适当流体流动。
图6E描绘了图6B-图6D中的SWIIN模块的实施方案，所述SWIIN模块还包括热管理系统，该热管理系统包括加热器和加热盖。加热器盖促进成像所需的冷凝管理。组件698包括截面中纵向可见的SWIIN模块650，其中可以看到一个渗透物储库652。盖694紧邻SWIIN模块650上方设置，并且背光680紧邻SWIIN模块650下方设置，这允许成像。在背光和SWIIN模块的下方和附近是绝缘体682，其设置在散热器684上。在该图6E中，散热器的散热片在页面的外面。此外，还有轴流风扇686和散热器688，以及两个热电冷却器692，和控制气动器件、热电冷却器、风扇、电磁阀等的控制器690。箭头表示进入单元的冷空气和从单元移除的热空气。应注意，加热控制允许许多不同类型的细胞以及例如对温度敏感的细胞株的生长，并且允许使用温度敏感的启动子。温度控制允许调整方案以解决转化效率、细胞生长和生存力的差异。关于固体壁分离孵育和标准化装置的更多细节，参见USPN 10,533,152；USPN10,550,363；USPN 10,532,324；USPN 10,625,212；USPN 10,633,626和USPN 10,633,627；和2019年11月25日提交的USSN 16/693,630；2020年3月18日提交的USSN 16/823,269；2020年3月16日提交的USSN 16/82,292；2020年3月16日提交的USSN 16/820,324；和2019年11月15日提交的16/686,066。
自动化多模块酵母细胞处理仪器的使用
图7图示了多模块细胞处理仪器的一种实施方案。该实施方案描绘了对细胞群体进行递归基因编辑的示例性系统。细胞处理仪器700可以包括壳体726、用于存储待转化或转染的细胞的储库712和细胞生长模块(包括例如旋转生长瓶)704。将待转化的细胞从储库转移至细胞生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者将细胞转移至细胞浓缩模块706，在细胞浓缩模块706处细胞经历缓冲液交换并被赋予电感受态，并且细胞的体积可以显著减低。在将细胞浓缩至适当的体积后，细胞被转移至电穿孔装置708。除了用于储存细胞的储库712之外，多模块细胞处理仪器还包括用于储存预组装有编辑寡核苷酸盒的载体的储库722。将预组装的核酸载体转移至电穿孔装置708，该电穿孔装置708已经包含生长至靶OD的细胞培养物。在电穿孔装置708中，将核酸电穿孔到细胞中。电穿孔后，将细胞转移到任选的恢复模块710中，在恢复模块710处细胞在转化后短暂恢复。
在恢复后，可以将细胞转移至储存模块712，在储存模块712处可以将细胞储存在例如4℃以供后续处理，或者可以将细胞稀释并转移至选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化(SWIIN)模块720。在SWIIN 720中，排列细胞使得每个微孔平均存在一个细胞。排列的细胞可以在选择培养基中，以选择已经用一个或更多个编辑载体转化或转染的细胞。在单个化后，细胞通过2-50倍倍增生长并建立集落。在集落建立后，通过提供诱导编辑的条件(例如温度、添加诱导或阻遏化学物质)诱导编辑。在启动编辑并允许继续进行后，允许细胞在微孔中生长至终末尺寸(例如集落的标准化)，并且然后处理细胞至处治来自该轮的编辑载体的条件。在处治后，细胞可以从微孔中冲洗出来并汇集，然后转移到储存(或恢复)单元712，或者可以转移回生长模块704进行另一轮编辑。在汇集和转移到生长模块之间，通常存在一个或更多个另外的步骤，诸如细胞恢复、培养基交换(使细胞为电感受态)、细胞浓缩(通常通过例如过滤与培养基交换同时进行)。注意，选择/单个化/生长/诱导/编辑/标准化和编辑模块可以是相同的模块，其中所有过程都在例如固体壁装置中进行，或者选择和/或稀释可以在分开的容器中发生，然后将细胞转移至固体壁单个化/生长/诱导/编辑/标准化/编辑模块(固体壁装置)。类似地，细胞可以在标准化后汇集，转移到单独的容器中，并在单独的容器中处治。作为在例如固体壁装置中单个化的替代方案，如上文关于上文的图1G和图1H描述的，可以使转化的细胞在主体液体中生长并且编辑可以在主体液体中诱导。在推定编辑的细胞被汇集后，它们可以经历另一轮编辑，另一轮编辑开始于生长、细胞浓缩和处理以赋予电感受态，以及经由电穿孔模块708通过另一编辑盒中的另一供体核酸转化。
在电穿孔装置708中，选自第一轮编辑的细胞被第二组编辑寡核苷酸(或其他类型的寡核苷酸)转化，并且重复该循环，直至细胞已经被期望数量的例如编辑盒转化和编辑。图7中例示的多模块细胞处理仪器由处理器724控制(处理器724被配置成基于使用者输入来操作仪器)或者由包括与试剂筒相关的至少一个脚本在内的一个或更多个脚本来控制。处理器724可以控制各个过程的定时、持续时间和温度，试剂的分配以及仪器700的各个模块的其他操作。例如，脚本或处理器可以控制细胞、试剂、载体和编辑寡核苷酸的分配；哪些编辑寡核苷酸用于细胞编辑且按什么顺序；恢复和表达模块中使用的时间、温度和其他条件，细胞生长模块中读取OD的波长，细胞生长到的靶OD，以及细胞达到靶OD的靶时间。此外，处理器可以被编程为通知使用者(例如，经由应用)自动化多模块细胞处理仪器中细胞的进展。
鉴于本公开内容，对于本领域普通技术人员来说明显的是，所描述的过程可以是递归和多重化的；即，细胞可以经历关于图7描述的工作流程，然后所得到的编辑的培养物可以经历另一轮(或若干轮或许多轮)使用不同编辑载体的另外的编辑(例如递归编辑)。例如，来自第一轮编辑的细胞可以被稀释，并且由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体B组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体C组合，由编辑载体A编辑的编辑细胞的等分试样可以与编辑载体D组合，等等，用于第二轮编辑。在第二轮后，可以使每个双重编辑的细胞的等分试样经历第三轮编辑，其中，例如，将AB编辑的、AC编辑的、AD编辑的细胞各自的等分试样与另外的编辑载体(诸如编辑载体X、Y和Z)组合。即，双重编辑的细胞AB可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的编辑细胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；并且双重编辑细胞AD可以与载体X、Y和Z组合并且由载体X、Y和Z编辑，以产生三重编辑的细胞ADX、ADY和ADZ，等等。在该过程中，可以执行许多编辑的排列和组合，产生非常多样的细胞群体和细胞文库。
在任何递归过程中，“处治”先前的引擎载体和编辑载体(或者单个载体系统中的单个引擎+编辑载体)都是有利的。“处治”是一个过程，其中在前一轮编辑中使用的一个或更多个载体从转化的细胞消除，如上文关于图1A-图1I详细描述的。处治可以通过以下完成：例如使用处治质粒裂解一个或更多个载体从而使编辑载体和/或引擎载体(或单个的、合二为一的载体)无功能；经由细胞生长稀释细胞群体中的载体(即细胞经历的生长周期越多，保留编辑载体或引擎载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑载体或引擎载体(或合二为一的引擎载体+编辑载体)上的热敏感复制起点。用于处治的条件取决于用于处治的机制；即，在这个实例中，处治质粒如何裂解编辑质粒和/或引擎载体。
图8是示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施方案的简化框图，所述仪器包括如上文关于图1G和图1H描述的用于诱导编辑和富集编辑的细胞的主体液体生长模块。细胞处理仪器800可以包括壳体826、待转化或转染的细胞的储库802和生长模块(细胞生长装置)804。将待转化的细胞从储库转移至生长模块进行培养，直至细胞达到靶OD。在细胞达到靶OD后，生长模块可以冷却或冷冻细胞以供后续处理，或者细胞可以转移至细胞浓缩模块830，在细胞浓缩模块830处细胞被赋予电感受态并浓缩至细胞转化的最佳体积。在浓缩后，然后将细胞转移至电穿孔装置808(例如，转化/转染模块)。用于在多模块细胞处理仪器中使用的在自动化多模块细胞处理仪器中使用的示例性电穿孔装置包括流通式电穿孔装置。
除了用于储存细胞的储库之外，系统800可以包括用于储存编辑盒的储库816和用于储存表达载体骨架的储库818。将编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架二者均从试剂筒转移至核酸组装模块828，在核酸组装模块828处编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。组装的核酸可以转移到任选的纯化模块822中，用于脱盐和/或制备用于转化的组装的核酸所需的其他纯化和/或浓缩程序。可选地，预组装的核酸，例如编辑载体，可以储存在储库816或818中。在由纯化模块822进行的过程完成后，组装的核酸被转移至例如电穿孔装置808，该电穿孔装置808已经包含生长至靶OD并且经由过滤模块830被赋予电感受态的细胞培养物。在电穿孔装置808中，组装的核酸被引入细胞。电穿孔后，细胞被转移到合二为一的恢复/选择模块810。关于多模块细胞编辑仪器的实例，参见USPN 10,253,316；USPN 10,329,559；USPN 10,323,242；USPN 10,421,959；USPN 10,465,185；USPN 10,519,437；USPN 10,584,333；USPN 10,584,334和2019年5月14日提交的USSN 16/412,195；2020年1月23日提交的USSN 16/750,369；2020年3月18日提交的USSN 16/822,249；和2020年4月1日提交的USSN16/837,985，这些都通过引用以其全文并入本文。
在恢复和任选的选择后，将细胞转移至生长、诱导和编辑模块(主体液体培养物)840。允许细胞生长直至细胞达到稳定生长期(或接近稳定生长期)，然后通过诱导核酸酶和gRNA之一或二者的转录来诱导编辑。在一些实施方案中，通过处于诱导型启动子的控制下的核酸酶和gRNA之一或二者的转录来诱导编辑。在一些实施方案中，诱导型启动子是pL启动子，其中启动子通过温度升高而被激活，并通过温度降低而“失活”。
恢复、选择、生长、诱导、编辑和储存模块可以全部是分开的，可以如图8中示出的排列和组合，或者可以以其他配置排列或组合。在某些实施方案中，恢复和选择在一个模块中进行，并且生长、编辑和再生长在分开的模块中进行。可选地，恢复、选择、生长、编辑和再生长在单个模块中进行。
在细胞被编辑和再生长(例如，从编辑中恢复)后，细胞可以被储存在例如储存模块812中，在储存模块812中细胞可以保持在例如4℃，直至细胞用于另一轮编辑。多模块细胞处理仪器由处理器824控制，处理器842被配置成基于使用者输入、如由一个或更多个脚本指导或作为使用者输入或脚本的组合来操作仪器。处理器824可以控制系统800的各个模块的定时、持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器824可以在转化后使细胞冷却，直至编辑是期望的，此时温度可以升高至有利于基因组编辑和细胞生长的温度。处理器可以用使用者可以从中选择的标准协议参数来编程，使用者可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂筒相关的一个或更多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。此外，处理器可以通知使用者(例如，经由智能电话或其他装置的应用)细胞已经达到靶OD，以及向使用者更新多模块系统中的各个模块中的细胞的进展。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意在限制本发明人视作其发明的范围，它们也不意在代表或隐含下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域的技术人员应理解，可以对具体方面中所示的本发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在所有方面中被认为是说明性的而非限制性的。
实施例I：细胞生长模块中的生长
针对摇动5ml管的常规细胞振荡器和摇动125ml带挡板烧瓶的轨道振荡器测试如本文描述的细胞生长装置的一种实施方案，以评价细菌和酵母细胞中的细胞生长。此外，使用本文关于图3A-图3D描述的细胞生长装置的实施方案实时监测细菌细胞培养物和酵母细胞培养物的生长。
在第一实例中，使用如本文描述的细胞生长装置，使LB中20ml的EC23细胞(大肠杆菌细胞)在35ml的具有2桨配置的旋转生长瓶中在30℃生长。使旋转生长瓶以600rpm旋转并且每1秒振荡一次(即改变旋转方向)。并行地，使5ml的在LB中的EC23细胞在5ml管中在30℃生长，并且以750rpm振荡。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)定期测量OD600。结果在图9中示出。旋转生长瓶/细胞生长装置使细胞在略微超过4小时内生长至OD600 2.6，表现比细胞振荡器更好。在相同的条件(体积、细胞、振荡)进行另一个实验，唯一的不同是细胞生长装置采用了3桨旋转生长瓶，并且结果示于图10中。同样，旋转生长瓶/细胞生长装置使细胞生长至OD600 1.9，表现比细胞振荡器更好。
进行了另外两个实验，这次将旋转生长瓶/细胞生长装置与带挡板的烧瓶和轨道振荡器进行比较。在一个实验中，使20ml的在LB中的EC138细胞(大肠杆菌细胞)在35ml的具有4桨配置的旋转生长瓶中在30℃生长。使旋转生长瓶以600rpm旋转并且每1秒振荡一次(即，改变旋转方向)。并行地，使用轨道振荡器，使20ml的在LB中的EC138细胞在125ml带挡板的烧瓶中在30℃生长。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)定期测量OD600。结果示于图11中，展示出旋转生长瓶/细胞生长装置使细胞生长至OD600 1.0，表现与轨道振荡器一样好。在第二个实验中，使用如本文描述的细胞生长装置，使20ml的在LB中的EC138细胞(大肠杆菌细胞)在35ml的具有2桨配置的旋转生长瓶中在30℃生长。使旋转生长瓶以600rpm旋转并且每1秒振荡一次(即改变旋转方向)。并行地，使用轨道振荡器，使20ml的在LB中的EC138细胞在125ml带挡板的烧瓶中在30℃生长。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)定期测量OD600。结果示于图12中，展示出旋转生长瓶/细胞生长装置使细胞生长至OD600 1.2，表现与轨道振荡器一样好或者比轨道振荡器更好。
在又另一个实验中，使用旋转生长瓶/细胞生长装置实时测量OD600。图13是示出使用振荡旋转和采用2桨旋转生长瓶实时测量EC138细胞培养物在30℃生长的结果的图。注意在4.4小时达到OD600 2.6。
在另一个实验中，使用旋转的生长瓶/细胞生长装置实时测量YPAD中的酵母s288c细胞的OD600。使用振荡旋转和采用2桨旋转生长瓶使细胞在30℃生长。图14是示出了结果的图。注意在14小时达到OD600 6.0。
实施例II：细胞浓缩
如上文关于图4A-图4E描述的TFF模块已经成功地用于处理大肠杆菌培养物和酵母培养物二者和对它们进行缓冲液交换。在浓缩大肠杆菌培养物时，进行以下步骤：
首先，将LB中生长至OD 0.5-0.62的20ml大肠杆菌培养物在一个方向通过TFF装置，然后在相对方向通过TFF装置。此时，将细胞浓缩至约5ml的体积。接下来，将50ml的10％甘油添加至浓缩的细胞中，并且将细胞在一个方向、在相对方向通过TFF装置，并且在第一个方向返回，总计通过三次。同样，将细胞浓缩至约5ml的体积。同样，将50ml的10％甘油添加至5ml细胞中，并且将细胞通过TFF装置，通过三次。重复这个过程；即，同样，将50ml 10％甘油添加到浓缩至5ml的细胞中，并且使细胞通过TFF装置三次。在三次50ml 10％甘油洗涤的第三次通过结束时，将细胞再次浓缩至约5ml的10％甘油。然后将细胞在交替的方向再通过TFF装置三次，其中将细胞浓缩成约400μl的体积。
测量大肠杆菌的滤液电导率和过滤器处理时间，其中结果示于图15A中。通过测量获得靶溶液电导率所需的过滤器通过的时间和次数来定量过滤器性能。通过比较过滤前和过滤后二者的细胞培养物的光密度(OD600)来确定细胞保留。通过测量每次过滤器通过期间的跨膜流量来监测过滤器的状况(filter health)。在约30分钟内，利用三次50ml 10％甘油洗涤并且每次洗涤使细胞通过装置三次，实现靶电导率(～16μS/cm)。将细胞体积从20ml减少至400μl，并且实现了约90％的细胞回收。
用酵母细胞培养物重复相同的过程。首先，使酵母培养物以相对方向通过TFF装置两次，浓缩至约5ml。将细胞用50ml 1M山梨醇洗涤三次，每次洗涤后通过TFF装置三次。在最后一次用1M山梨醇洗涤后使细胞第三次通过之后，使细胞通过TFF装置两次，其中将酵母细胞培养物浓缩至约525μl。图15B呈现了通过测量滤液电导率和过滤器处理时间确定的酵母细胞的过滤器缓冲液交换性能。在约23分钟内，利用三次50ml 1M山梨醇洗涤并且每次洗涤通过TFF装置三次，实现靶电导率(～10μS/cm)。将细胞体积从20ml减少至525μl。实现了约90％的细胞回收。
实施例III：电感受态大肠杆菌和酿酒酵母的产生与转化
为了测试FTEP装置的转化，产生电感受态大肠杆菌细胞。为了产生起始培养物，将6ml体积的LB chlor-25(具有25μg/ml氯霉素的LB)转移至14ml培养管中。使用25μl大肠杆菌等分试样接种LB chlor-25管。接种后，将管以45°角放置在设定为250RPM和30℃的摇动培养箱中过夜生长12-16小时之间。OD600值应在2.0和4.0之间。将250ml LB chlor-25管的1:100接种体积转移至四个无菌500ml带挡板摇瓶中，即2.5ml/250ml体积摇瓶。将烧瓶放置在设定为250RPM和30℃的摇动培养箱中。通过每1至2小时测量一次OD600监测生长。当培养物的OD600在0.5-0.6之间时(约3-4小时)，将烧瓶从培养箱中取出。将细胞以4300RPM，10分钟，4℃离心。除去上清液，并将100ml冰冷的10％甘油转移到每个样品。将细胞轻轻重悬，并且洗涤程序进行三次，每次将细胞重悬于10％甘油中。第四次离心后，将细胞重悬液转移至50ml锥形Falcon管中，并且添加另外的冰冷10％甘油，使体积多达30ml。同样，将细胞在4℃以4300RPM离心10min，去除上清液，并且将细胞沉淀物重悬在10ml的冰冷甘油中。将细胞以细胞悬液和冰冷甘油的1:100稀释进行等分。
使用所描述的FTEP装置进行比较电穿孔实验，以确定电感受态大肠杆菌的转化效率。流量由压力控制系统控制。将具有DNA的细胞悬液装载到FTEP入口储库中。转化的细胞直接从入口和入口通道流动，通过流动通道，通过出口通道，然后进入包含恢复培养基的出口。将细胞转移到包含另外的恢复培养基的管中，放置在30℃的培养箱振荡器中，以250rpm摇动3小时。将细胞铺板，以确定电穿孔后存活但未能摄取质粒的集落形成单位(CFU)和电穿孔后存活且摄取质粒的CFU。将板在30℃孵育；24小时后对大肠杆菌集落计数。
使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENETMELEPO21)将流通式电穿孔实验针对2mm电穿孔比色皿(Bull dog Bio)基准化。制备具有DNA的细胞悬液的储备管，并且用于使用NEPAGENETM和流通式电穿孔的侧对侧实验。结果示于图16A中。在图16A中，最左侧的带阴影线///的柱表示细胞输入，左侧的带阴影线\\\的柱表示转化后存活的细胞数，并且右侧带阴影线///的柱表示实际转化的细胞数。FTEP装置在各种电压显示出与NEPAGENETM电穿孔仪相比对电感受态大肠杆菌细胞的等同转化。如可见的，转化存活率是至少90％，并且在一些实施方案中是至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，恢复率(成功转化和恢复的引入细胞的分数)是至少0.001，并且优选地在0.00001和0.01之间。在图16A中，恢复率是约0.0001。
此外，对NEPAGENETMELEPO21和FTEP装置的转化(摄取)、切割和编辑的效率进行比较。在图16B中，进行一式三份的实验，其中带阴影线///的柱表示输入用于转化的细胞数，并且带阴影线\\\的柱表示被转化(摄取)的细胞数、细胞基因组被由转化到细胞中的载体转录和翻译的核酸酶切割的细胞数(切割)，以及实现编辑(使用由转化到细胞中的载体转录和翻译的核酸酶进行切割和修复，以及使用二者均由转化到细胞中的载体转录的指导RNA和供体DNA序列)的细胞数。同样，可见，FTEP显示出与NEPAGENETM电穿孔仪等同的转化、切割和编辑效率。图16B中FTEP的恢复率大于0.001。
为了测试FTEP装置在酵母中的转化，使用如Bergkessel和Guthrie，MethodsEnzymol.，529:311-20(2013)中阐述的方法产生酿酒酵母细胞。简言之，用3ml接种物对YFAP培养基接种，进行过夜生长产生100ml细胞。每处理100ml培养物产生约1ml感受态细胞。将细胞在摇动培养箱中在30℃孵育，直至它们达到OD600为1.5+/-0.1。
使用100mM乙酸锂、10mM二硫苏糖醇和50mL缓冲液制备调节缓冲液(conditioningbuffer)，用于生长并保持在室温的每100mL细胞。在250ml瓶中以4300rpm收获细胞3分钟，并且去除上清液。将细胞沉淀物悬浮在100ml冷的1M山梨醇中，以4300rpm旋转3分钟，并且再次去除上清液。将细胞悬浮在调节缓冲液中，然后将悬液转移到适当的烧瓶中，并且以200RPM和在30℃摇动30分钟。将悬液转移到50ml锥形瓶中，并以4300rpm的速度旋转3分钟。去除上清液，并且将沉淀重悬在冷的1M山梨醇中。将这些步骤重复三次，总计三个洗涤-旋转-倾析步骤。将沉淀物悬浮在山梨醇中，至最终OD为1.50+/-0.20。
使用FTEP装置进行比较电穿孔实验，以确定电感受态酿酒酵母的转化效率。流量用注射泵(Harvard apparatus PHD ULTRATM4400)控制。将具有DNA的细胞悬液装载到1mL玻璃注射器(Hamilton 81320Syringe,PTFE Luer Lock)中然后安装到泵上。在流动开始后立即开启来自函数发生器的输出。处理的细胞直接流入具有1M山梨醇和羧苄青霉素的管中。收集细胞，直至处理完NEPAGENETM中电穿孔的相同体积，此时停止流动和来自函数发生器的输出。在培养箱振荡器中在30℃且以250rpm恢复3小时后，将细胞铺板，以确定电穿孔后存活但未能摄取质粒的集落形成单位(CFU)和电穿孔后存活且摄取质粒的CFU。将板在30℃孵育。48-76小时后对酵母集落计数。
使用体外高压电穿孔仪(NEPAGENETMELEPO21)将流通式电穿孔实验针对2mm电穿孔比色皿(Bull dog Bio)基准化。制备具有DNA的细胞悬液的储备管，并且用于使用NEPAGENETM和流通式电穿孔的侧对侧实验。结果在图17中示出。装置显示出与NEPAGENETM方法相比在2.5kV电压的电感受态酿酒酵母的更好的转化和存活。输入是处理的细胞总数。
实施例IV：主体液体方案：诱导和生长过度
用50mL的SOB+100μg/mL的羧苄青霉素和25μg/mL的氯霉素制备250mL的带挡板摇瓶。对于完整的去卷积实验，每次转化制备3个摇瓶。将来自每个转化反应的500μL未稀释的培养物转移到制备的250mL摇瓶中。在培养箱上设置了以下温度设置：30℃9小时→42℃2小时→30℃9小时。该温度方案用于允许细胞在最初8小时期间从转化额外恢复。在核酸酶诱导前一小时诱导λred系统，其中通过向培养物添加阿拉伯糖(2.5mL 20％阿拉伯糖)来触发λ诱导，并且通过将培养物的温度升高到42℃来触发核酸酶诱导。对于完全去卷积实验，不将阿拉伯糖添加到UPTAKE和CUT烧瓶中，因为那些烧瓶不应该表达λred；此外，UPTAKE烧瓶没有转移到42℃。
温度循环完成后(～21小时)，移去摇瓶。对于NGS-SinglePlex：用0.8％NaCl(将50μL培养物加入450μL无菌0.8％NaCl)制备每种培养物的10-5至10-7的系列稀释液。稀释后，将300μL各种稀释物铺板在带有标准浓度的氯霉素和羧苄青霉素的150mm LB琼脂板上。然后将板置于30℃的培养箱中过夜生长，并在第二天挑选用于单重NGS。对于NGS扩增子：从每个摇瓶中取出250μL培养物，并用作质粒提取方案的输入。测量该培养物的OD，以基于进入质粒纯化所期望的细胞数量选择体积。任选地，可以将来自每个摇瓶的未稀释体积进行铺板，以观察盒的富集/耗尽，并在第二天刮去板和处理。
图18是显示在液体培养物中使用组成型编辑(观察到大约20％的编辑)、标准铺板程序(观察到大约76％的编辑)、在主体液体中诱导编辑的两个重复实验(观察到大约70％和76％的编辑)和使用标准铺板程序诱导编辑的两个重复实验(观察到大约60％和76％的编辑)观察到的各种编辑类型的条形图。还测量了编辑克隆性(editing clonality)。标准铺板程序的编辑克隆性显示出96孔的混合克隆性，一些集落达到100％克隆性，大多数集落达到大于50％克隆性，并且两次重复的平均克隆性为70％和60％(数据未显示)。主体液体方案的编辑克隆性显示出，大多数细胞被100％编辑或被0％编辑(例如野生型)，少数(约8％)在100％或0％之间。这些方案的平均编辑效率相似。
实施例V：大肠杆菌在200K SWIIN中的单个化、生长和编辑
成功地进行了使用MAD7核酸酶、在单个基因(yagP)中具有94个不同编辑的文库，并采用了诸如图6B-图6E中举例说明的200K单个化装置的单重自动化基因组编辑。所用的引擎载体包含在pL诱导型启动子的控制下的MAD7，并且所用的编辑载体包含在pL诱导型启动子的控制下的编辑盒，和在pBAD诱导型启动子pBAD的控制下的λRed重组工程系统，除了编辑盒包含94个yagP基因编辑(供体DNA)和适当的相应gRNA。对两种SWIIN工作流程进行了比较，并进一步针对标准铺板方案进行了基准化。SWIIN方案彼此不同，在一组重复中，含有阿拉伯糖的LB培养基用于将细胞分布在SWIIN中(阿拉伯糖用于诱导λRed重组工程系统(其允许修复在编辑期间在大肠杆菌中产生的双链断裂))，并且在另一组重复中，无阿拉伯糖的SOB培养基用于将细胞分布在SWIIN中并用于初始生长，进行培养基交换以用含阿拉伯糖的SOB培养基代替无阿拉伯糖的SOB培养基。大约70K细胞被装载到200K SWIIN中。
在所有方案(标准铺板、LB-SWIIN和SOB-SWIIN)中，允许细胞在30℃生长9小时，并通过将温度升高至42℃持续2.5小时来诱导编辑，然后使温度回复至30℃并使细胞生长过夜。本实验的结果显示在图19和下表1中。注意，在两个SWIIN工作流程的四个重复观察到相似的编辑性能，表明在含有和不含有阿拉伯糖的情况下SWIIN铺板在初始培养基中的性能是相似的。标准铺板方案中的编辑百分比为约77％，主体液体中的编辑百分比为约67％，并且SWIIN重复的编辑百分比范围为约63％至71％。注意，对于每个方案，独特编辑盒除以编辑盒的总数的百分比是相似的。
表1
Figure BDA0003393730490000711
实施例VI：处治
标准铺板方案：进行了三轮递归编辑和处治。预期编辑在三种糖基因(XylA-Y194*、LacZ-F593*和GalK-E249*)中引入了终止密码子。这些突变导致靶基因的功能丧失。通过使细胞在MacConkey培养基上生长而观察到这种功能丧失表型。编辑率通过计算带有功能丧失突变的细胞数量与总细胞数量的比率来确定。使包含图1C左侧所描绘的引擎载体的大肠杆菌181细胞成为感受态，并在100μL体积中用图1C右侧所描绘的编辑载体转化。允许细胞在3.0mL总体积的SOB培养基中恢复3小时。然后将恢复的细胞在含有氯霉素和对于编辑载体合适的抗生素的20mL SOB培养基中1:100稀释。然后将细胞铺板在含有氯霉素、编辑载体抗生素(例如羧苄青霉素、卡那霉素、博莱霉素、链霉素或诺尔丝菌素、N-乙酰基转移酶和阿拉伯糖)的固体SOB培养基上。阿拉伯糖诱导pBAD启动子驱动λRed重组酶系统的转录。
使细胞在30℃生长9小时，在42℃生长2小时以诱导驱动核酸酶和编辑gRNA的转录的pL启动子，并且然后在30℃再生长9小时。将细胞从板上刮下并在仅含氯霉素的SOB培养基中稀释。然后将细胞洗涤3x，并且将8mL细胞悬浮在12mL SOB+chlor培养基中，并生长至OD＝3.0，以确保细胞处于稳定期。将培养物的温度升高至42℃持续两小时以诱导核酸酶，并将20μL DAPG加入到最终浓度为25μM以诱导处治gRNA(例如反pUC gRNA)的转录。使细胞在30℃生长6小时。处治后，将细胞在LB+chlor培养基中洗涤，重悬在LB+chlor培养基中，并在30℃再次生长至OD＝0.5。将细胞用10％甘油洗涤三次以使其成为电感受态，并进行另一轮编辑。在整个编辑轮中维持引擎载体。编辑载体的演替(succession)包括与图1C右侧所示相同的编辑载体架构；然而，编辑gRNA/供体DNA和可选择标记随着每一轮而改变。用于每轮编辑和处治的编辑gRNA和编辑载体抗生素抗性基因列于表2。
表2：SPP实验描述
轮 1 2 3
gRNA类型 编辑 编辑 编辑
编辑基因座 LacZ GalK XylA
编辑载体Abx Carb Nat Kan
编辑和处治率二者的结果示于图20A。对于编辑效率，请注意，第一轮编辑后，99％的细胞具有一个编辑；在第二轮编辑后，一小部分细胞没有编辑，大约95％的细胞具有一个编辑，大约95％的细胞具有两个编辑；并且在第三轮编辑之后，一小部分细胞没有编辑，大约90％的细胞具有一个编辑，大约80％的细胞具有两个编辑，并且大约38％的细胞具有所有三个编辑。请注意，这些数字是具有至少1个、2个或3个编辑的细胞的分数；因此，如果一个细胞具有三个编辑，则它会计入每个类别，也就是说，它是累积编辑率。处治效率使用以下等式计算：
Figure BDA0003393730490000721
如图20A所示，每一轮的处治效率远高于95％。
主体液体方案：使用糖编辑gRNA进行四轮递归编辑和处治。预期编辑在三种糖基因(XylA-Y194*、LacZ-F593*和GalK-E249*)中引入了终止密码子。这些突变导致靶基因的功能丧失。通过使细胞在MacConkey培养基上生长可以观察到这种功能丧失表型。编辑率通过计算带有功能丧失突变的细胞数量与总细胞数量的比率来确定。第四轮编辑为YiaW_C183，并且通过对集落取样并在编辑基因座处对96个集落进行Sanger测序来确定比率。使包含图1C所描绘的引擎载体的大肠杆菌181菌株细胞成为感受态，并在100μL体积中用图1C所描绘的编辑载体转化。允许细胞在3.0mL总体积的SOB培养基中恢复3小时。然后将恢复的细胞在含有氯霉素和对于编辑载体合适的抗生素(例如羧苄青霉素、卡那霉素、诺尔丝菌素、N-乙酰基转移酶)的20mL SOB培养基中1:100稀释。然后使细胞在含有氯霉素和适于编辑载体的抗生素的SOB培养基中铺板生长过度8小时。将阿拉伯糖加入培养基中，最终浓度为1％。
然后使细胞在30℃再生长1小时，在42℃生长2小时以诱导驱动核酸酶和编辑gRNA的转录的pL启动子，然后在30℃再生长9小时。然后使细胞沉淀，洗涤3x，并重悬在仅含氯霉素的20mL SOB培养基中。将12mL另外的培养基加入到8mL的在悬浮液中的细胞。通过将细胞培养物的温度升高至42℃持续2小时，并通过添加20μL DAPG至25μM的最终浓度来诱导处治(例如，核酸酶和处治gRNA的转录)。然后使细胞在30℃生长6小时至OD＝2.5。处治后，将细胞在LB+chlor培养基中洗涤，重悬在LB+chlor培养基中，并在30℃再次生长至OD＝0.5，并用10％甘油洗涤用于另一轮编辑。编辑gRNA和编辑载体抗生素抗性基因列于表3，并且结果示于图20B。编辑载体的演替包括与图1C右侧所示相同的编辑载体架构；然而，编辑gRNA/供体DNA和可选择标记随着每一轮而改变。
对于编辑效率，请注意，在第一轮编辑后，100％的细胞没有编辑，这是意料之中的，因为在第一轮中，编辑载体不包含编辑gRNA或细胞靶序列；在第二轮编辑后，大约30％的细胞没有编辑，并且大约70％的细胞具有一个编辑；并且在第三轮编辑之后，大约60％的细胞没有编辑，大约40％的细胞具有一个编辑，大约30％的细胞具有两个编辑；并且在第四轮编辑后，大约80％的细胞没有编辑，并且大约5％的细胞具有一个、两个或三个编辑中的每一种。请注意，这些数字是具有至少1个、2个或3个编辑的细胞的分数；因此，如果一个细胞具有三个编辑，则它会计入每个类别，也就是说，它是累积编辑率。每一轮后达到的处治百分比超过95％，并且在前两轮后超过99％。
表3：主体液体实验描述
轮 1 2 3 4
gRNA类型 非编辑 编辑 编辑 编辑
编辑基因座 无 XylA GalK LacZ
编辑载体Abx Carb Kan Nat Carb
SWIIN方案：使用糖编辑gRNA进行四轮递归编辑和处治。预期编辑在三种糖基因(XylA-Y194*、LacZ-F593*和GalK-E249*)中引入了终止密码子。这些突变导致靶基因的功能丧失。通过使细胞在MacConkey培养基上生长可以观察到这种功能丧失表型。编辑率通过计算带有功能丧失突变的细胞数量与总细胞数量的比率来确定。第四轮编辑为YiaW_C183，并且通过对集落取样并在编辑基因座处对96个集落进行Sanger测序来确定比率。使包含图1C所描绘的引擎载体的大肠杆菌181菌株细胞成为感受态，并在100μL体积中用图1C所描绘的编辑载体转化。允许细胞在2.7mL的SOB培养基中恢复3小时。将恢复的细胞悬浮在10mL中，并且然后装载到200K SWIIN中，并在含有氯霉素和适于编辑载体的抗生素的SOB培养基中生长8小时。进行培养基交换，将阿拉伯糖加入培养基中，最终浓度为1％。然后细胞在30℃再生长1小时，在42℃生长2.5小时以诱导驱动核酸酶和编辑gRNA的转录的pL启动子，然后在30℃再生长9小时。然后从SWIIN回收细胞，洗涤3x，并重悬在仅含氯霉素的20mL SOB培养基中。将12mL另外的培养基加入到8mL悬浮细胞中。使细胞生长至OD＝3.0，并通过将20μLDAPG添加至最终浓度为25μM，并将培养物的温度升高至42℃达2小时来诱导处治(例如，处治gRNA和核酸酶的转录)。
处治后，将细胞在LB+chlor培养基中洗涤，重悬在LB+chlor培养基中，并在30℃再次生长至OD＝0.5用于另一轮编辑。编辑gRNA和编辑载体抗生素抗性基因列于表4，并且处治和编辑效率的结果示于图20C。编辑载体的演替包括与图1C右侧所示相同的编辑载体架构；然而，编辑gRNA/供体DNA和可选择标记随着每一轮而改变。对于第一轮编辑，在SWIIN上的编辑导致大约20％的细胞没有编辑，并且80％的细胞具有一个编辑；对于第二轮编辑，大约20％的细胞没有编辑，20％具有一个编辑，并且80％具有两个编辑；对于第三轮编辑，大约6％的细胞没有编辑，4％具有一个编辑，40％具有两个编辑，并且60％具有三个编辑；最后，在第四轮编辑后，大约80％的细胞没有编辑，8％具有一个编辑，6％具有两个编辑，并且2％具有三个编辑。请注意，这些数字是具有至少1个、2个或3个编辑的细胞的分数；因此，如果一个细胞具有三个编辑，则它会计入每个类别，也就是说，它是累积编辑率。所有轮编辑的处治百分比大于85％，并且在第一轮和第三轮后，编辑百分比大于95％。
表4：SWIIN实验描述
轮 1 2 3 4
gRNA类型 编辑 编辑 编辑 编辑
编辑基因座 LacZ GalK XylA yiaW
编辑载体Abx Carb Nat Kan Carb
实施例VII：全自动化单重RGN指导的编辑运行
用本公开内容的自动化多模块仪器成功地进行了使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑。参见美国专利第9,982,279号；和2018年6月30日提交的USSN 16/024,831；2018年6月30日提交的USSN 16/024,816；2018年9月28日提交的USSN 16/147,353；2018年9月30日提交的USSN 16/147,865；和2018年6月30日提交的USSN 16/147,871。
经由Gibson
Figure BDA0003393730490000751
将ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒组装成包括在自动化仪器中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。lacZ_F172功能性敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的第172个残基处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将组装的编辑载体和重组工程化就绪(recombineering-ready)的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，并且允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且允许细胞恢复另外2小时。恢复后，将细胞保持在4℃，直至由使用者取回。
在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺板在补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基上，并且生长直至出现集落。白色集落代表功能性编辑的细胞，紫色集落代表未编辑的细胞。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理装置进行。
自动化处理的结果是约1.0E-03个总细胞被转化(与常规台式的结果相当)，并且编辑效率是83.5％。通过对细胞基因组的编辑的区域测序确认白色集落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察自动化细胞处理的步骤，并且发送文本消息来更新自动化处理程序的状态。
实施例VIII：全自动化递归编辑运行
使用自动化多模块细胞处理系统成功地实现了递归编辑。经由Gibson
Figure BDA0003393730490000761
将ampR质粒骨架和lacZ_V10*编辑盒组装成包括在自动化系统中的等温核酸组装模块中的“编辑载体”。与lacZ_F172编辑类似，lacZ_V10编辑功能性敲除lacZ基因。“lacZ_V10”指示编辑发生在lacZ氨基酸序列中的氨基酸位置10处。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。将第一组装的编辑载体和重组工程化就绪的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞和核酸合并，并且允许混合1分钟，并且进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数是：电压，2400V；长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转移脉冲的参数是：电压，150V；长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在包含氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加至培养基中，并且使细胞生长另外2小时。然后将细胞转移至离心模块中，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬在包含氯霉素和羧苄青霉素的TB中，其中使细胞生长至2.7的OD600，然后浓缩并且赋予电感受态。
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备第二编辑载体。第二编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果成功，galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。由galK Y154*盒产生的编辑在第154个氨基酸残基处引入终止密码子，将酪氨酸氨基酸改变为终止密码子。该编辑使galK基因产物为非功能性的，并且抑制细胞代谢半乳糖的能力。组装后，在等温核酸组装模块中使用AMPure珠使第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并且在缓冲液中洗脱。使用与以上详述的相同参数，将组装的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(用第一编辑载体转化并且针对第一编辑载体选择)转移到转化模块进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一生长模块)，允许在包含羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃直至取回，之后将细胞的等分试样铺板在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上。为了定量lacZ和galK编辑二者，在两种培养基类型上产生复制斑块板(replica patch plate)：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的MacConkey琼脂基。所有液体转移都由自动化多模块细胞处理系统的自动化液体处理装置进行。
在该递归编辑实验中，筛选的集落中的41％具有lacZ和galK编辑二者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率可比较。
虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，如结合本发明的优选实施方案详细描述的，但是应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域技术人员可以作出不脱离本发明的精神的许多变化。本发明的范围将由所附权利要求书及其等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则其中列举的特征或要素都不应被解释为根据35U.S.C.§112,
Figure BDA0003393730490000771
的手段加功能的限定。

Claims (20)

1.一种用于在递归的核酸指导的核酸酶编辑期间处治细胞的方法，所述方法包括：
设计和合成第一组编辑盒，其中所述第一组编辑盒包含一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对，其中每个编辑gRNA和供体DNA对处于第一诱导型启动子的控制下；
将所述第一组编辑盒组装到载体骨架中，从而形成第一组编辑载体，其中所述载体骨架包含第一可选择标记和处治靶序列；
使选择的细胞成为电感受态，其中所述选择的细胞包含引擎载体，并且所述引擎载体包含在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA、在第三诱导型启动子的控制下的核酸酶；和第二可选择标记；
用第一组编辑载体转化所述选择的细胞以产生转化的细胞；
经由所述第一可选择标记和所述第二可选择标记选择转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和所述核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所述细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所述编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第二组编辑载体转化所述细胞以产生第二转化的细胞，其中所述第二组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第三可选择标记和所述处治靶序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子是相同的诱导型启动子。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子是pL启动子，并且所述编辑载体或所述引擎载体包含在组成型启动子的控制下的c1857基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶处治序列是pUC复制起点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述处治gRNA是反pUC起点gRNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二诱导型启动子是pPhIF启动子。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法在第二转化步骤之后还包括以下步骤：
经由所述第二可选择标记和所述第三可选择标记选择所述第二转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和所述核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所诱导的细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所诱导的细胞中来自所述第二组编辑载体的编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第三组所述编辑载体转化所述细胞以产生第三转化的细胞，其中所述第三组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第四可选择标记和所述处治靶序列。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法在第三转化步骤之后还包括以下步骤：
经由所述第二可选择标记和所述第四可选择标记选择所述第三转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和所述核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所诱导的细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所诱导的细胞中来自所述第三组编辑载体的编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第四组编辑载体转化所述细胞以产生第四转化的细胞，其中所述第四组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第五可选择标记和所述处治靶序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一组编辑盒、所述第二组编辑盒、所述第三组编辑盒和所述第四组编辑盒各自包含编辑gRNA和供体DNA对的文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述编辑载体的文库各自包含至少1000个不同的编辑gRNA和供体DNA对。
11.一种用于在递归的核酸指导的核酸酶编辑期间处治细胞的方法，包括：
设计和合成第一组编辑盒，其中所述第一组编辑盒包含一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对，其中每个编辑gRNA和供体DNA对处于第一诱导型启动子的控制下；
将所述第一组编辑盒组装到载体骨架中，从而形成第一组编辑载体，其中所述载体骨架包含第一可选择标记、处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA；
使选择的细胞成为电感受态，其中所述选择的细胞包含引擎载体，并且所述引擎载体包含在第三诱导型启动子的控制下的核酸酶和第二可选择标记；
用所述第一组编辑载体转化所述选择的细胞以产生转化的细胞；
经由所述第一可选择标记和所述第二可选择标记选择转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所述细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所述编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第二组编辑载体转化所述细胞以产生第二转化的细胞，其中所述第二组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第三可选择标记、处治靶序列和在所述第二诱导型启动子的控制下的所述处治gRNA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子是相同的诱导型启动子。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子是pL启动子，并且所述编辑载体或所述引擎载体包含在组成型启动子的控制下的c1857基因。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶处治序列是pUC复制起点。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述处治gRNA是反pUC起点gRNA。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二诱导型启动子是pPhIF启动子。
17.根据权利要求11所述的方法，所述方法在第二转化步骤之后还包括以下步骤：
经由所述第二可选择标记和所述第三可选择标记选择所述第二转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和所述核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所诱导的细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所诱导的细胞中来自所述第二组编辑载体的编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第三组编辑载体转化所述细胞以产生第三转化的细胞，其中所述第三组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第四可选择标记、处治靶序列和在所述第二诱导型启动子的控制下的所述处治gRNA。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法在第三转化步骤之后还包括以下步骤：
经由所述第二可选择标记和所述第四可选择标记选择所述第三转化的细胞；
通过诱导所述第一诱导型启动子和所述第三诱导型启动子从而诱导所述一个或更多个编辑gRNA和供体DNA对和所述核酸酶的转录而在所述选择的细胞中诱导编辑；
使所诱导的细胞生长，直到所述细胞达到生长的稳定期；
通过诱导所述第三诱导型启动子和所述第二诱导型启动子从而诱导所述核酸酶和处治gRNA的转录来处治所诱导的细胞中来自所述第三组编辑载体的编辑载体；
使所述细胞生长；
使所述细胞成为电感受态；和
用第四组编辑载体转化所述细胞以产生第四转化的细胞，其中所述第四组编辑载体包含具有在所述第一诱导型启动子的控制下的一个或更多个gRNA和供体DNA对的编辑盒、第五可选择标记、所述处治靶序列和在第二诱导型启动子的控制下的处治gRNA。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一组编辑盒、所述第二组编辑盒、所述第三组编辑盒和所述第四组编辑盒各自包含编辑gRNA和供体DNA对的文库。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述编辑载体的文库各自包含至少1000个不同的编辑gRNA和供体DNA对。
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