CN113968871A

CN113968871A - 苯基取代类acc抑制剂的晶型

Info

Publication number: CN113968871A
Application number: CN202110838136.XA
Authority: CN
Inventors: 符伟; 赵立文; 潘福君
Original assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-07-25
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2022-01-25

Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及苯基取代类ACC抑制剂的晶型及其制备方法与用途，具体涉及式(I)的(R)‑3‑(1‑(2‑(2‑甲氧基苯基)‑2‑((四氢‑2H‑吡喃‑4‑基)氧基)乙基)‑5‑甲基‑6‑(噁唑‑2‑基)‑2,4‑二氧代‑1,2‑二氢噻吩并[2,3‑d]嘧啶‑3(4H)‑基)苯甲酸的晶型及其制备方法，所述的晶型可用于制备治疗和/或预防ACC表达相关疾病的药物，

Description

苯基取代类ACC抑制剂的晶型

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(又名(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,4-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(2H)-基)苯甲酸)的晶型及其制备方法与用途。

背景技术

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是催化乙酰辅酶A反应生成丙二酰辅酶A的生物素酶，该催化反应是制约脂肪酸合成第一阶段的限速步骤。在哺乳动物中，ACC以两种组织特异性同功酶的形式存在，其中ACC1主要存在于脂质生成组织，如肝脏和脂肪，而ACC2主要存在于氧化组织，如肝脏、心脏和骨胳肌。ACC1和ACC2是由独立基因编码，虽然呈现不同的细胞分布，但二者共有75％的总体氨基酸序列一致性。在肝脏中，脂肪酸(FA)的合成和伸长是通过ACC1催化乙酰辅酶A生成的丙二酰基辅酶A，从而促使三酸甘油酯形成和极低密度脂蛋白(VLDL)产生。在合成脂肪酸能力有限的心脏和骨胳肌中，由ACC2形成的丙二酰基辅酶A发挥调控FA氧化的功能[Tong L,Harwood HJ Jr.J Cell Biochem.2006,99(6):1476-1788.]。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)被认为是肝脏代谢异常的两种表现，是目前最为常见的慢性肝病，而且其发病率正在逐年攀升。其中NASH可能会进一步发展为肝硬化和肝癌，可能引起由肝脏疾病引起的死亡。目前该类疾病缺乏有效的治疗策略，现有治疗药物仍然是以噻唑烷二酮类为代表的胰岛素增敏剂和抗氧化剂(如维生素E)，此外包括降脂药物、血管紧张素受体拮抗剂、多不饱和脂肪酸等，治疗效果非常有限。在目前的多项研究中，ACC1和ACC2被认为是有望治疗NAFLD和NASH的药物作用靶点[Geraldine Harriman,Jeremy Greenwood,Sathesh Bhat,et al.Proc Natl Acad SciU.S.A.2016,113(13):E1796-E1805.]。

对于靶向ACC途径的药物研究已有一定进展和研究基础，通过抑制ACC1和ACC2可以抑制肝脏细胞内脂肪的从头(de novo)合成，该治疗方案可显著降低肝脏脂肪含量和硬化程度，同时较早降低肝纤维化标志物水平。另有研究表明，对ACC1和ACC2同时抑制可降低肿瘤组织中重新产生FA的能力，具有抑制肿瘤细胞生长的作用[Svensson RU,Parker SJ,Eichner LJ,et al.Nat Med.2016,22(10):1108-1119.]。不过，仍然需要开发更优异的ACC抑制剂，以便获得活性更优且安全性更高的药物，从而用于治疗ACC介导的事件相关的疾病，如纤维化疾病、代谢性疾病、肿瘤和增生性疾病。

发明内容

本发明的发明人发现了一种苯基取代类ACC抑制剂，其化合物结构如下式(I)所示，化学名称为(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(以下简称“式(I)化合物”)：

本发明的发明人研究发现，式(I)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对ACC具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的ACC表达相关疾病，例如纤维化疾病、代谢性疾病、癌症或者组织增生类疾病的治疗剂。

本领域技术人员知道，药用活性化合物的晶型结构往往影响其化学稳定性、溶解度等性质，因此需要深入研究寻找适合药用的晶型。

本发明的目的是提供一种水溶性好、生物利用度高、稳定性高的苯基取代类ACC抑制剂的晶型。具体地说，本发明提供一种如式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型，

本发明的发明人对式(I)化合物晶型进行了X-射线粉末衍射、差示扫描热分析(DSC)、热重分析(TGA)、动态水分吸收仪(DVS)等检测。

在一些实施方案中，本发明式(I)化合物晶型A的X-射线粉末衍射图谱，参见图1，使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示X-射线粉末衍射图，其在约8.12±0.2、14.87±0.2处有特征峰。

进一步地，本发明式(I)化合物晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约8.12±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、14.87±0.2处有特征峰。

再一步地，本发明式(I)化合物晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约8.12±0.2、8.63±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、14.87±0.2、20.72±0.2、24.12±0.2处有特征峰。

更进一步地，本发明式(I)化合物晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约7.86±0.2、8.12±0.2、8.63±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、13.87±0.2、14.87±0.2、16.04±0.2、16.40±0.2、18.00±0.2、18.67±0.2、20.72±0.2、21.63±0.2、22.30±0.2、23.29±0.2、24.12±0.2、24.85±0.2、27.34±0.2处有特征峰。

更进一步地，本发明式(I)化合物晶型A的X-射线粉末衍射图谱在约7.86±0.2、8.12±0.2、8.63±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、13.33±0.2、13.87±0.2、14.32±0.2、14.87±0.2、16.04±0.2、16.40±0.2、16.93±0.2、17.34±0.2、18.00±0.2、18.35±0.2、18.67±0.2、19.22±0.2、19.69±0.2、20.15±0.2、20.72±0.2、21.63±0.2、22.30±0.2、23.29±0.2、24.12±0.2、24.85±0.2、25.48±0.2、26.25±0.2、27.00±0.2、27.34±0.2、28.07±0.2、28.53±0.2、29.00±0.2、29.44±0.2、31.84±0.2处有特征峰。

非限制性地，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物晶型A具有如图1所示的X-射线粉末衍射图谱。

非限制性地，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物晶型A的DSC图谱(参见图2)显示其熔点为214.74℃。

非限制性地，在一个具体的实施方案中，本发明式(I)化合物晶型A具有如图3所示的热重分析(TGA)图谱，结果显示，其在150℃之前有约0.2％的失重，为无水物，在150℃-250℃有约1.0％的失重，结合变温XRPD升温至220℃得到棕色油状物，该段失重可能为样品熔融伴随着部分分解所致，明显分解的温度为318.5℃。

本发明提供一种所述的式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A的制备方法，包括将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中，析出结晶的步骤。

在一些实施方案中，本发明提供一种所述的式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中，析出结晶；和

(2)过滤、干燥。

上述反应步骤(1)中对原料(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的存在形态没有特别限定，可以使用任意晶体或无定型物。

上述反应步骤(1)中的有机溶剂为有机溶剂或它们的混合溶液，所述有机溶剂选自碳原子数小于6的醇类、酮类、酯类、醚类、腈类、烃类溶剂和四氢呋喃等，所述有机溶剂优选选自乙酸异丙酯、丙酮、丁酮、四氢呋喃、异丙醚、甲苯、正庚烷、二氯甲烷、水、甲醇、乙醇、异丙醇、仲丁醇、乙腈、二甲亚砜、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、1,4-二氧六环、硝基甲烷等中的一种或多种。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A的制备方法，为晶浆结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中得到悬浊液的步骤。在一些优选的实施方案中，所述方法进一步包括搅拌的步骤。优选地，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、水、丙酮、异丙醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、正庚烷、1,4-二氧六环、乙腈、氯仿、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、二甲亚砜和正庚烷中的一种或多种。

本发明提供另一种所述的式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A的制备方法，为高分子模板结晶法。在一些具体的实施方案中，所述方法包括例如将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中(优选至澄清后)，过滤，滤液中加入高分子材料，挥发的步骤。优选地，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、三氟乙醇、硝基甲烷、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙腈、水和正丙醇中的一种或多种，所述的高分子材料选自聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯醇、羟丙基纤维素、聚氯乙烯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯、羟甲基纤维素钠、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羧丙基纤维素、聚环氧乙烷和乙基纤维素。

按照本发明的方法制备得到的晶型A不含有或者含有较低含量的残留溶剂，符合国家药典规定的有关医药产品残留溶剂的限量要求，可以较好的作为医药活性成分使用。

本发明另一方面提供式(I)化合物无定型形式。

非限制性地，本发明式(I)化合物无定型形式的一个典型实例具有如图4所示的X-射线粉末衍射图谱。

非限制性地，本发明式(I)化合物无定型形式的一个典型实例具有如图5所示的DSC图谱。

非限制性地，本发明式(I)化合物无定型形式的一个典型实例具有如图6所示的TGA图谱。

本发明提供本发明的式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸无定型形式的制备方法，包括将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中，然后加热挥发的步骤；优选地，所述的有机溶剂选自正丙醇、仲丁醇、乙酸乙酯、1,4-二六氧环、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、水、氯仿、正庚烷、二氯甲烷、乙酸异丙酯和四氢呋喃中的一种或多种；优选地，所述式(I)所示的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸无定型形式的制备方法中，在40℃下快速减压挥干。

本发明的另一个方面提供一种晶体组合物，其中(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A占晶体组合物重量50％以上，优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上。

本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其含有(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型及药学上可接受的载体，优选为含有(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A及药学上可接受的载体。

本发明的另一个方面提供(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型或包含上述化合物晶型的药物组合物，尤其是(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A或包含上述化合物晶型A的药物组合物在制备用于治疗和/或预防ACC表达相关疾病的药物中的用途，例如纤维化疾病、代谢性疾病、肿瘤和增生性疾病的药物中的用途，其中所述纤维化疾病选自肝纤维化，其中所述代谢性疾病选自肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪肝炎，其中所述肿瘤和增生性疾病选自肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、乳头状甲状腺肿瘤、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、恶性淋巴肿瘤，膀胱、前列腺和胰腺的癌和肉瘤，以及皮肤、结肠、甲状腺和卵巢的原发和复发性实体瘤。

在一个优选的实施方案中，本发明提供(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型或包含上述晶型的药物组合物治疗和/或预防ACC表达相关疾病的方法和在制备治疗和/或预防ACC表达相关疾病药物中的应用，其中所述的纤维化疾病选自肝纤维化，其中所述代谢性疾病选自肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪肝炎，其中所述肿瘤和增生性疾病选自肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、乳头状甲状腺肿瘤、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、恶性淋巴肿瘤，膀胱、前列腺和胰腺的癌和肉瘤，以及皮肤、结肠、甲状腺和卵巢的原发和复发性实体瘤。

在这里需要特别说明的是，X-射线粉末衍射图谱对于特定的晶型具有特征性。判断是否与已知晶型相同时，应该注意的是峰的相对位置(即2θ)而不是它们的相对强度。这是由于谱图(尤其在低角度)的相对强度会因为晶体条件、粒径或其它测定条件的差异产生的优势取向效果而变化，衍射峰的相对强度对于晶型的确定并非是特征性的。另外，同一个晶型的2θ值可能存在轻微误差，约为±0.2°。因此，在确定每种结晶结构时，应该将此误差考虑在内。在XRPD图谱中通常用2θ角或晶面距d值表示峰位置，两者之间具有简单的换算关系：d＝λ/2sinθ，其中d值代表晶面间距，λ代表X射线的波长，θ为衍射角。还应特别指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。

DSC测定当晶体由于其晶体结构发生变化或晶体熔融而吸收或释放热时的转变温度。对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变温度和熔点误差典型的在约5℃之内。当我们说一个化合物具有一给定的DSC峰或熔点时，这是指该DSC峰或熔点±5℃。需要指出的是对于混合物而言，其DSC峰或熔点可能会在更大的范围内变动。此外，由于在物质熔化的过程中伴有分解，因此熔化温度与升温速率相关。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括¹³C和¹⁴C，氧的同位素包括¹⁶O和¹⁸O等。

附图说明

图1为式(I)化合物晶型A的X-射线衍射谱图；

图2为式(I)化合物晶型A的DSC图谱；

图3为式(I)化合物晶型A的TGA图谱；

图4为式(I)化合物无定型物的X-射线衍射谱图；

图5为式(I)化合物无定型物的DSC图谱；

图6为式(I)化合物无定型物的TGA图谱；

图7为式(I)化合物晶型A的DVS图谱；

图8为式(I)化合物晶型A常规条件、长期条件和加速条件下放置13天的X-射线衍射谱图。

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

一、实验所用的测试仪器

1.X-射线粉末衍射谱(XRPD)

仪器型号：瑞士D8 Advance X-射线衍射仪

射线：铜靶波长为

Mo单色仪

扫描方式：θ-2θ

扫描范围：3-40°2θ

步长：0.02°2θ

电压：40kV

电流：40mA

速度：0.2s/step

检测样品量：＞2mg

校准物质：三氧化二铝

2.热重分析(TGA)

仪器型号：TA Instruments Q500型热重分析仪

温度范围：5-350℃

气流速度：氮气，40mL/min

升温速率：10℃/min

3.差示扫描量热(DSC)

仪器型号：TA Instruments Q200型差热分析仪

升温速率：10℃/min

气流速度：氮气，40mL/min

温度范围：0℃-250℃/330℃

4.动态水分吸附仪(DVS)

仪器型号：TA Instruments Q5000型动态水分吸附仪

升温速率：10℃/min

气流速度：氮气，10mL/min

二、化合物(I)的制备

实施例1：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

步骤1：2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯的制备

在100L反应釜中，加入二氯甲烷(79.5kg)、2-氨基-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯(6.0kg)和N,N'-羰基二咪唑(5.777kg)，氮气保护，20-25℃反应过夜。反应结束后，在25℃下加入三乙胺(3.605kg)和3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(9.309kg)，20-25℃反应过夜。反应结束后，将反应液分批缓慢加入至庚烷中，加完反应液搅拌0.5～1h，离心，水漂洗；湿品用水打浆，10-20℃打浆2h，离心，水漂洗。固体经70±5℃鼓风干燥，得到标题化合物，共9.68kg，收率79.40％。

步骤2：3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

在100L反应釜中，加入1,4-二氧六环(33.08kg)和2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯(3.2kg)，升温并控制温度50±5℃，搅拌至2-(3-(3-(乙氧羰基)苯基)脲基)-4-甲基噻吩-3-羧酸乙酯全部溶解后加入叔丁醇钾(2.38kg)，50±5℃反应0.5h。反应结束后，加入纯化水，反应0.5h，停止反应，缓慢分批次加入盐酸，调节pH至2～3，35±5℃析晶1h以上，然后15±5℃析晶8h以上，离心，水漂洗得固体。在另外两个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将三次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物，共7.00kg，收率90.90％。

步骤3：3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在100L反应釜中，加入N,N-二甲基甲酰胺(39.7kg)、3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(6.98kg)和N,N'-羰基二咪唑(5.62kg)，氮气保护，35±5℃反应2h。向反应液中加入无水乙醇，35±5℃反应过夜。反应结束后，将反液缓慢分批加入水中，加完15±5℃搅拌3h以上。离心，水漂洗，70℃鼓风干燥8h以上。得到标题化合物，共6.62kg，收率96.79％。

步骤4：3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在100反应釜中，加入N,N-二甲基乙酰胺(41.38kg)和3-(5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.945kg)，固体溶解后降温至-20℃，滴加N-溴代丁二酰亚胺(1.587kg)的N,N二甲基乙酰胺(13.79kg)溶液，维持温度不高于-20℃，滴加完毕后维持温度搅拌0.5h。反应结束后，升温至固体溶解，滴加纯化水，控温不高于30℃，滴加完毕，10-15℃析晶3h以上，离心，水漂洗得固体。在另外一个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将两次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物粗品，共6.105kg，收率83.92％。

在100L反应釜中，加入1,4-二氧六环(33.08kg)和3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯粗品(3.05kg)，升温至85℃，固体溶解后滴加纯化水(13.70kg)，滴加完毕后维持温度搅拌15～30min，趁热过滤，滤液15±5℃析晶1h，离心，水漂洗；湿品甲醇回流打浆1h，15±5℃析晶1h，离心，甲醇漂洗得固体。在另外一个100L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将两次得到的固体合并，70℃鼓风干燥8h以上，得到标题化合物，共5.05kg，收率82.80％。

步骤5：(R)-3-(6-溴-1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在50L立式夹套反应釜中，加入1-甲基-2-吡咯烷酮(29.390kg)、3-(6-溴-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.859kg)、(R)-4-(2-溴-1-(2-甲氧基苯基)乙氧基)四氢-2H-吡喃(2.000kg)和碳酸钾(1.450kg)，开启搅拌，氮气保护，开启加热，控制温度为120℃-130℃。反应完全后，把反应液降温至25±5℃。加入甲基叔丁基醚、水，搅拌20-30min后静止分层，除去水层，保留有机层。合并有机层，加入水(28.600kg)，搅拌，静止分层，除去水层，保留有机层。在另外的50L反应釜中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将得到的两份有机层合并，减压浓缩，乙醇漂洗得固体，固体经50±5℃鼓风干燥，得到标题化合物，共2.530kg，收率61.87％。ESI-MS[M+H]⁺m/z:643.1。

步骤6：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯的制备

在10L四口反应瓶中，加入1,4-二氧六环(6.460kg)、(R)-3-(6-溴-1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(1.250kg)、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(0.557kg)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0.267kg)和2-(三正丁基锡基)噁唑(0.769kg)，用氮气置换3-5次，开启加热搅拌，回流30min，停止反应。反应液在60-100℃时过滤，除去固体，收集滤液。在另外的10L四口反应瓶中重复以上投料量、反应步骤和后处理步骤。将得到的两份滤液合并，减压浓缩。乙醇漂洗得固体，固体在50±5℃下鼓风干燥，得标题化合物粗品2.090kg。

在50L反应釜中，加入甲醇(4.100kg)、乙酸乙酯(4.680kg)和以上步骤得到的粗品(2.085kg)，加热回流搅拌，温度为70±5℃时，加入巯基硅胶(0.100kg)，搅拌30min后趁热抽滤，将滤液转移50L反应釜中，降温至0-10℃，析晶4小时以上后过滤，滤饼用甲醇(0.395kg)淋洗，得固体，固体经60±5℃鼓风干燥12小时以上，得标题化合物1.310kg，收率53.30％。ESI-MS[M+H]⁺m/z:632.2。

步骤7：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的制备

将甲醇(4.27kg)和四氢呋喃(14.4kg)加入到100L反应釜中，加入(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸乙酯(2.156kg)，搅拌溶解后，加入氢氧化锂(0.131kg)的水(5.390kg)溶液，控制温度0～10℃，滴加结束后，室温搅拌反应。反应完全后，将反应液降温至0-5℃，加入盐酸(1.08kg)，调节pH至1-2，将析出的固体离心过滤，滤饼用水(5.000kg)洗，60±5℃鼓风干燥12小时以上。得标题化合物，共2.025kg，收率98.4％。

步骤8：(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸的精制

将乙醇(13.880kg)加入到100L反应釜中，加入以上步骤制得的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸(1.000kg)，加热搅拌溶解，加入

Thiol(0.050kg)继续搅拌20min，再加入活性炭(0.050kg)继续搅拌20min后过滤。将滤液转移到50L反应釜中，降温至10℃，搅拌析晶，过滤得固体。70±5℃鼓风干燥，得标题化合物0.825kg，收率82.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.11(s,1H),8.25(s,1H),8.04(d,1H),7.83(d,1H),7.67(t,1H),7.52(t,2H),7.42(s,1H),7.32(t,1H),7.04(dd,2H),5.35-5.32(m,1H),4.17-4.14(m,1H),4.04-3.98(m,1H),3.80(s,3H),3.62-3.59(m,2H),3.44-3.41(m,1H),3.31-3.24(m,2H),2.79(s,3H),1.72-1.65(m,2H),1.30-1.24(m,2H)。ESI-MS[M+H]⁺m/z:604.2。

实施例2：式(I)化合物晶型A的制备

1：各取约5mg或10mg式(I)化合物，分别在室温下加入1mL甲醇、2mL乙醇、0.4mL丙酮、0.4mL丁酮、0.5mL乙腈、3.5mL乙醇/1mL水、1.5mL丙酮/0.5mL水、2.5mL四氢呋喃/1mL甲苯、2mL硝基甲烷/2mL乙酸异丙酯、1.5mL丙酮/2mL异丙醚，分别在40℃下加入0.2mL异丙醇、0.2mL正丁醇、1.9mL乙腈/1.4mL水，得到溶清液，过滤后，放置在相应条件下自然挥发干。对所得的固体进行XRPD表征，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为晶型A。

2：室温悬浮搅拌试验。各称量约15mg式(I)化合物至1.5毫升玻璃小瓶中，加入0.3毫升甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、1,4-二氧六环、正庚烷、苯甲醚、乙酸、乙腈、丙酮/水(9:1,v:v)、二甲亚砜/甲苯(1:9,v:v)、甲醇/水(935:65,v:v,a_w＝0.2)，得到的悬浮液于室温下以750rpm的转速搅拌7天后，离心收集固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为晶型A。

3：取约15mg式(I)化合物，分别在室温下加入1mL乙醇/1mL正庚烷、0.4mL二甲亚砜/2mL水、2mL水饱和的乙酸乙酯、0.4mL1,4-二氧六环/1.5mL水、0.2mL氯仿/1.5mL甲基环己烷，得到悬浊液，放置在室温下搅拌4天，取样进行XRPD表征，然后继续于室温下搅拌，14天后重新取样进行XRPD表征，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型在4天及18天时均为晶型A。

式(I)化合物晶型A的X-射线衍射谱图(参见图1)，使用Cu-Ka辐射，以2θ角度表示X-射线粉末衍射图，在约7.86、8.12、8.63、10.63、12.38、13.33、13.87、14.32、14.87、16.04、16.40、16.93、17.34、18.00、18.35、18.67、19.22、19.69、20.15、20.72、21.63、22.30、23.29、24.12、24.85、25.48、26.25、27.00、27.34、28.07、28.53、29.00、29.44、31.84处有特征峰。将图1中的2θ以及峰的相对强度列于表1。

式(I)化合物晶型A的DSC表征结果示于图2中，结果显示，其熔点约为215℃。

式(I)化合物晶型A的TGA表征结果示于图3中，结果显示，其在150℃之前有约0.2％的失重，为无水物，在150℃-250℃有约1.0％的失重，结合变温XRPD显示升温至220℃得到棕色油状物，该段失重可能为样品熔融伴随着部分分解所致，明显分解的温度约为319℃。

表1：式(I)化合物晶型A的XRPD图谱详情

实施例3：式(I)化合物无定型物的制备

称取约300毫克式(I)化合物，加入5mL二氯甲烷，溶清后过滤，40℃下快速减压挥干，收集挥干的固体并进行进一步测试。XRPD表征结果(参见图4)显示该晶型为无定型物；取样1.6400mg进行DSC测试，DSC(参见图5)未发现明显吸热峰；取样11.235mg进行TGA测试，TGA(参见图6)显示其在160℃前有约3.1％的表面失重，分解温度约为318℃。

实施例4：无定型物冷却结晶试验

各取15mg式(I)化合物无定型物，分别加入0.3mL乙醇/1mL甲苯、0.2mL乙醇/1mL正庚烷、0.1mL丙酮/0.5mL乙酸乙酯、0.3mL丙酮/1mL甲苯，升温至60℃溶清，过滤后置于冰盐浴下搅拌，析出固体后，离心取固体样进行XRPD表征，若无固体析出，则置于4℃搅拌过夜，收集固体并进行XRPD测试，表征结果显示本次各溶剂的实验晶型均为晶型A。

三、式(I)化合物各晶型的相关性质研究

实验例1：式(I)化合物晶型A的相关性质评估

1.1引湿性

在25℃恒温条件下对式(I)化合物晶型A进行DVS测试。将样品预先在0％RH条件下平衡，去除吸附的溶剂或水分后开始测试。测试结果如图7所示。当湿度增加时，样品的水分吸附量逐渐增加，当湿度达到80％RH时，吸水量为0.28％，表明晶型A轻微吸湿，且在DVS测试前后未观察到晶型变化。

1.2固态稳定性

将式(I)化合物晶型A在常规条件(室温、干燥、密封、避光)、长期条件(25℃、65％RH、敞口、避光)和加速条件(40℃、75％RH、敞口、避光)下放置13天，进行XRPD表征(见图8)，结果显示晶型和熔点基本未变。

实验例2：式(I)化合物无定型物的相关性质评估

取式(I)化合物无定型物17.6070mg进行DVS/等温吸附曲线检测，显示其0％RH-80％RH范围内重量变化大于2.0％，易吸湿；在60℃-75％RH、40℃-75％RH、室温-97％RH、室温-75％RH和室温-52％RH条件下放置31天的稳定性实验未发现衍射峰。

实验例3：体外乙酰基-CoA羧化酶(ACC)抑制实验

1实验材料

1.1化合物

对照化合物为专利WO2013/071169实施例I-181中公开的化合物ND-630(其为目前临床中最有希望的用于此类疾病的药物)，化学名为(2-[1-[2-(2-甲氧基苯基)-2-(氧杂环己烷-4-基氧基)乙基]-5-甲基-6-(1,3-噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1H,2H,3H,4H-噻吩并[2,3-d]嘧啶-3-基]-2-甲基丙酸)，参照专利WO2013/071169中描述的方法制备并通过氢谱和质谱鉴定。

化合物准备：以上实施例1制备的本发明的化合物和对照化合物，每个化合物用DMSO配制成10mM备用，实验时从1000nM开始3倍稀释依次为1000nM、333.3nM、111.1nM、37.1nM、12.3nM、4.12nM、1.37nM、0.46nM、0.15nM、0.05nM。

1.2主要试剂

HEPES缓冲液购自Invitrogen公司；MgCl₂、柠檬酸钾缓冲溶液、DTT、乙酰基-CoA和NaHCO₃购自Sigma公司；BRIJ-35购自MERCK公司；ACC1和ACC2酶均购自BPS生物公司；ADP-Glo^TM激酶试剂盒购自Promega公司。

1.3耗材和仪器：

96孔聚丙烯板购自Nunc公司；振荡器购自QILINBEIER公司；离心机购自Eppendorf公司；384孔白板和Envision 2104读板器购自Perkin Elmer公司。

2实验方法

2.1.试剂配制

1×反应缓冲液(pH＝7.4)配制：用HEPES(1M)、MgCl₂(1M)、BRIJ-35(10％)、柠檬酸钾缓冲溶液(1M)、BSA(10mg/mL)和DTT(500mM)的储备液配制酶活反应缓冲液：包含HEPES(50mM)、MgCl₂(2mM)、BRIJ-35(0.01％)、柠檬酸钾缓冲溶液(2mM)、BSA(50μg/mL)和DTT(2mM)。

2.2.ACC酶活实验

1)ACC1酶活测试

将4.5μL 2.2×的ACC1酶(2nM)工作液加入384孔板中；然后加入0.5μL的不同浓度的化合物，室温孵育15min。

用2.1中配制的缓冲液配制2×的底物(40μM ATP，20μM乙酰CoA，60mM NaHCO3)；向384孔板中加入5μL的2×底物，室温孵育30min；然后加入10μL ADP-Glo试剂，室温孵育40min，终止反应；最后加入20μL酶检测试剂，室温孵育40min，用Envision 2104仪器读取荧光值信号(RLU)。

2)ACC2酶活测试

将4.5μL 2.2×的ACC2酶(1.1nM)工作液加入384孔板中；然后加入0.5μL的不同浓度的化合物，室温孵育15min。

用2.1中配制的缓冲液配制2×的底物(40μM ATP，40μM乙酰CoA，24mM NaHCO₃)；向384孔板中加入5μL的2×底物，室温孵育30min；然后加入10μL ADP-Glo试剂，室温孵育40min，终止反应；最后加入20μL酶检测试剂，室温孵育40min，用Envision 2104仪器读取荧光值信号(RLU)。

3实验数据处理

阴性对照组：含5％DMSO的溶媒；阳性对照组：含100nM的ND-630。求取各浓度以及阳性和阴性对照的数据的平均值，并且计算标准差。由下式计算抑制百分比：抑制率(100％)＝100×(RLU_阴性对照-RLU_化合物)/(RLU_阴性对照-RLU_阳性对照)。抑制率数据用非线性回归方程式拟合计算各化合物的IC₅₀，非线性回归方程为Y＝最低值+(最高值-最低值)/(1+10^((LogIC50 ^{-X)×HillSlope)})，其中X为化合物浓度的对数，Y为抑制百分比(100％)。

4实验结果

表2

以上实验结果表明，本发明的化合物对ACC1和ACC2均具有好的抑制活性。

实验例4：大鼠肝脏分布评价

1.实验材料

1.1动物

雄性SD大鼠，SPF级，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；220-250g，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。实验前给予2-3天适应期。给药前禁食8～12h，给药2h后给水，4h后给食。

1.2供试化合物

实施例1的本发明式(I)的化合物和对照化合物ND-630。

1.3仪器

API 4000型三重四级杆液质联用仪、Analyst QS A01.01色谱工作站均购自美国AB SCIEX公司；Milli-Q超纯水器购自Millipore公司；CF16R XII台式高速冷冻离心机购自Hitachi公司；Qilinbeier Vortex-5振荡器购自德国IKA公司；电热恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；电动移液器购自美国Thermo公司；微量分析天平购自上海梅特勒有限公司。

2.实验方法

2.1供试药物配制

称取供试化合物6mg(以游离碱计)，加入至20mL乙醇-PEG400-生理盐水(10:30:60)中，涡旋2min，超声3min，配制浓度为0.3mg/mL的供试品溶液，用于口服给药；取供试品溶液100μL用甲醇定容至10ng/mL，同时配制等浓度的对照品，HPLC上进样检测供试品及对照品溶液浓度，计算供试品准确度。

2.2样品采集

单次口服给予SD大鼠供试化合物3mg/kg，给药体积为10mL/kg，大鼠给药后，分别于0.25h、1h和4h颈动脉取血，安乐死取肝脏，立即收集肝脏和血液(用肝素钠抗凝)，置于冰上。

2.3肝脏样品处理和分析

称取0.4g肝脏，剪碎，于2mL 75％甲醇-水中匀浆,将匀浆液离心(离心条件：8000rpm/min，5min，4℃)，转移上清液冻存，进样前复溶、离心，取上清，用LC-MS/MS分析上清样品中化合物的含量。

2.4血浆样品处理和分析

采集后的全血样品置于冰盒中，于30min以内离心(离心条件：8000rpm/min，5min，4℃)并转移上层血浆100μL，加300μL甲醇沉淀，振荡、离心，加入流动相稀释，取上清，用LC-MS/MS分析上清样品中化合物的含量。

3实验结果

表3

化合物在肝脏中的浓度越高，治疗肝脏疾病的效价越高，同等剂量下疗效越好，而肝脏/血浆比越高，表明供试化合物的靶器官选择性越强，化合物的安全性可能越好。从以上结果可以看出，本发明的化合物在肝脏中有较高的分布，肝脏选择性及靶向性良好(肝/血比＞50)，因此，本发明化合物有望成为更优效更安全的治疗脂肪肝、非酒精性脂肪肝肝炎(NASH)等代谢性肝脏疾病的药物。

实验例5：体外人肝脏星状细胞LX-2激活抑制实验

1实验材料

1.1化合物制备

实施例1的本发明式(I)的化合物和对照化合物ND-630，每个化合物用DMSO配制成60mM，备用。

1.2细胞株

人肝星状细胞LX-2，由徐列明教授在美国西奈山医学院肝病中心建立，上海肝病研究所细胞库保存。

1.3主要试剂

DMEM培养基、FBS、胰酶、磷酸盐缓冲液(DPBS)和青霉素-链霉素双抗购自美国GIBCO公司；重组人TGF-β1细胞因子(PeproTech公司，货号：100-21)；TransZOL Up PlusRNA抽提试剂盒(全式金，货号：ER501-01)；cDNA逆转录试剂盒(全式金，货号：AH341-01)；5×SYBR Green qPCR试剂盒(QuantiNovaTM，货号：154045739)。

1.4耗材和仪器：

CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司产品，多功能酶标仪，美国MolecularDevices公司产品，Thermo Nano Drop 2000核酸定量分析仪，ABI 9700PCR扩增仪，ABI7500PCR荧光定量，Thermo高速离心机(MEGAFUGE8)；全自动制冰机(雪科，IMS-30)。

2实验方法

2.1.试剂配制

将本发明实施例的化合物和对照化合物DMSO母液用培养基依次稀释到30μM、10μM、3μM。按照PeproTech试剂盒说明书将TGF-β1用试剂盒配制的10mM的枸橼酸缓冲液溶解至1μg/mL，备用。

2.2.LX-2细胞处理

LX-2细胞传代后以的2×10⁵个/mL密度接种于6孔培养板内，每孔含10％FBS的DMEM 2mL，5％CO₂培养箱内37℃培养，记为Day1。24h后(Day2)，融合度达到70-80％，吸弃旧培养液，换以无血清的DMEM对细胞作低血清饥饿处理。于Day3吸弃旧培养液，加入培养液或含有不同浓度药物的培养液继续温育培养，分为对照组(无血清DMEM培养液)，TGFβ1组，TGFβ1+化合物组，TGFβ1工作浓度10ng/mL。药物作用24h后(Day4)，吸弃细胞上清，预冷1×PBS洗涤细胞1次，用于抽提总RNA。

2.3.总RNA抽提

2.3.1样品前处理：于细胞培养6孔板中每孔加入1mL的TransZOL Up试剂，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，使用移液枪吹打细胞使得细胞完全脱落，将裂解液转移至2mL RNase free离心管中，反复吹吸直至裂解液无明显沉淀。

2.3.2抽提步骤：根据TransZOL Up总RNA抽提试剂盒说明书进行操作。

2.4.总RNA浓度及纯度测定

取2μL总RNA置于NanoVue分光光度计检测A260nm波长吸光度，算出RNA浓度。RNA样品的纯度根据260nm及280nm吸光值比值(A260/A280)计算，比值在1.8～2.1范围，说明RNA无污染也无降解，方可用于后续试验。

2.5.cDNA的合成

将提取的RNA按照等质量稀释到相应的浓度为0.1μg～0.5μg(Total RNA≤1μg)之间，实验各个样本逆转录体系中总RNA的质量为～500ng。

按照逆转录试剂盒说明书(TransScriptⅡAll-in-One First-Strand cDNASynthese kit,Lot:AH341-1)，进行如下操作。合成的cDNA-70℃保存备用。

将以上体系轻轻混匀，以上体系液体放入ABI 9700PCR仪器中，设置如下程序：50℃×15min→85℃×5s→4℃×10min，将获得的cNDA贮存于-20℃或者立即使用。

2.6.Real-time PCR反应

所用Real-Time PCR引物：

PCR样本体系：

加样后轻轻混匀，离心，将PCR管置于PCR仪中，设置程序如下。

PCR仪器循环设置：

每样本设2个复孔，PCR仪器设定程序，计算目的基因相对表达量。

3实验数据处理

Real Time PCR结果的阈值由Real Time PCR detector system自动设置，按如下方法计算Col1A1基因的相对含量。

ΔCt(药物处理组Col1A1基因)＝Avg.Ct(药物处理组Col1A1基因)-Avg.Ct(药物处理组GAPDH基因)；

ΔCt(TGF组Col1A1基因)＝Avg.Ct(TGF组Col1A1基因)-Avg.Ct(TGF组GAPDH基因)；

ΔCt(对照组Col1A1基因)＝Avg.Ct(对照组Col1A1基因)-Avg.Ct(对照组GAPDH基因)；

ΔΔCt＝ΔCt(TGF组/药物处理组Col1A1基因)–ΔCt(对照组Col1A1基因)的平均值；Col1A1基因的相对含量计算公式：RQ＝2^-ΔΔCt

相对定量的结果由ABI 7500实时定量荧光PCR仪器自动分析所得。

4实验结果

表4 Col1A1基因的相对含量计算

化合物	抑制率(％)
		实施例1	82.11
ND-630	42.06

Collagen 1是肝纤维化形成过程的关键的信号因子，其表达由Col1A1基因含量所代表。实验结果表明，本发明的化合物对TGF-β1诱导的LX-2细胞的Collagen 1基因的表达具有显著的抑制活性。与ND-630相比，本发明的化合物对肝细胞纤维化形式的抑制活性更强，可用于ACC介导的纤维化疾病、增生性疾病等。

实验例6:HFD-CCL4诱导的NASH及肝纤维化药效评价

先用高脂饮食(HFD)诱导动物肝脏脂肪变性，在此基础上再用四氯化碳(CCL4)诱导肝脏炎症、坏死，发生肝纤维化，该模型与人NASH疾病发生过程以及病理现象类似。本项实验目的是在HFD-CCL4诱导的C57BL/6小鼠的NASH模型中评价本发明的化合物的药效，以ND-630作为对照化合物。HFD-CCL4诱导10周，药物干预4周，观察药物对NASH及肝纤维化的治疗作用。

1.实验材料

1.1仪器

脱水机Leica HistoCore PEARL；石蜡包埋机Leica HistoCore Arcadia C&H；石蜡切片机Leica RM2235；自动染色剂Leica ST5020；扫描仪HAMAMATSU NANO Zoomer S210；SR染色分析软件Visiopharm VIS 6.6.0.2516。

1.2动物

C57BL/6小鼠(雄性，18-20g)购于北京维通利华有限公司。实验动物饲养所有实验操作都经过KCI动物使用和福利委员会(IACUC)批准。小鼠饲养条件如下：温度20–25℃，湿度40％–70％，昼夜明暗交替时间12小时/12小时。每周换2次垫料。

2.实验方法

2.1化合物配制本发明实施例1的式(I)化合物和ND-630采用PEG200:0.2MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(35:65)溶液稀释至0.3mg/mL，1mg/mL，3mg/mL，备用给药，现配现用。

2.2动物造模

HFD-CCL4诱导C57BL/6小鼠NASH模型：动物在KCI实验动物中心SPF屏障内进行3-7天的适应性饲养后，动物更换HFD饲料饲养，饲养周期为10周。HFD饲养第6周结束时，根据动物体重将HFD组随机分组，每组10只，口服给予CCL4(一周三次，上午9-10点)，并持续4周。详细建模方法根据KCI已建立的方法建立HFD-CCL4诱导的雄性C57BL/6小鼠NASH模型，造模剂为Olive Oil+CCL4溶液(由KCI配制)。其余10只动物给予正常维持饲料伴随饲养作为正常对照动物。

动物分为正常对照组、HFD-CCL4模型组(模型组)和化合物组(本发明实施例1的式(I)化合物组、ND-630组)。

2.3化合物的给药方案

HFD饲养第6周结束后开始灌胃给予本发明实施例1的式(I)化合物和ND-630，每日一次，持续4周，第10周结束给药。本发明实施例1的式(I)化合物组和ND-630组的剂量均为30mg/kg/d。

2.4实验样本收集

末次给药结束后翌日即CCL4最后一次给予48h后各组动物禁食六小时，按照KCI标准操作规程将动物进行安乐死。根据KCI动物解剖实验操作规程将动物进行解剖，动物经低温PBS全身灌流后，采集肝脏，将部分动物肝脏(固定选择每个动物左侧同一肝叶)液氮迅速冷冻，-80℃低温保存。余下动物肝脏经福尔马林后固定(肝脏与固定液的体积比例为1:10)，进行相关病理相关检测。

2.5苏木素-伊红染色

肝左叶经10％福尔马林固定后，用石蜡包埋，制成5μm切片，用于苏木素-伊红(haematoxylin-eosin,H&E)染色。苏木素-伊红染色反映组织炎症，脂肪沉积，空泡变性和组织纤维化的程度，对病变程度进行半定量分析。

2.6天狼猩红染色

肝组织制成5μm切片，干燥2h，复水后用天狼猩红(北京海德创业，货号26357)室温染色30min，再脱水封片，用于图像分析。用Aperio ScanScope CS2(莱卡)，200×倍数扫描病理切片，再在Aperio ImageScope程序中打开扫描的图片，去除血管，剩下目标图像用Color Deconvolution v9分析算法。使用软件将被染为红色的纤维化部分识别为阳性信号，并计算出纤维化的百分率。

3.统计学分析

数据以均值±标准误表示。显著性分析采用学生t-test,one way ANOVA或者twoway ANOVA及post-hoc Dunnett′s test。

4.实验结果

4.1肝脏脂肪变性

实验动物给予高脂饮食10周，与正常对照组比，模型组肝脏脂肪变性程度显著加深。实施例1的化合物组(30mg/kg/d)较模型组脂肪变性明显消失，与正常对照组无差异，明显优于ND-630组(30mg/kg/d)。实验结果见表5。

表5肝脏脂肪变性

由此可见，本发明的化合物对HFD-CCL4诱导的小鼠NASH模型有一定的治疗作用；在组织病理上，与模型组相比可有效降低肝脏脂肪变性。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims

1.一种(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在8.12±0.2、14.87±0.2处有特征峰。

2.根据权利要求1所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在8.12±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、14.87±0.2处有特征峰。

3.根据权利要求1所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在8.12±0.2、8.63±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、14.87±0.2、20.72±0.2、24.12±0.2处有特征峰。

4.根据权利要求1所述的晶型A，其特征是X-射线粉末衍射光谱用2θ角度表示在7.86±0.2、8.12±0.2、8.63±0.2、10.63±0.2、12.38±0.2、13.87±0.2、14.87±0.2、16.04±0.2、16.40±0.2、18.00±0.2、18.67±0.2、20.72±0.2、21.63±0.2、22.30±0.2、23.29±0.2、24.12±0.2、24.85±0.2、27.34±0.2处有特征峰。

5.一种(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A，其具有基本上如图1所示的X-射线粉末衍射光谱。

6.一种制备如权利要求1-5任意一项所述晶型A的方法，所述方法包括将(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸溶于有机溶剂中，析出结晶的步骤。

7.一种(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸无定型物，其具有基本上如图4所示的X-射线粉末衍射光谱。

8.一种晶体组合物，其中权利要求1-5之任一项所述的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A占晶体组合物重量50％以上，优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-5之任一项所述的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A或权利要求7所述的无定型物和可药用载体。

10.如权利要求1-5之任一项所述的(R)-3-(1-(2-(2-甲氧基苯基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氧基)乙基)-5-甲基-6-(噁唑-2-基)-2,4-二氧代-1,2-二氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-3(4H)-基)苯甲酸晶型A或权利要求7所述的无定型物或如权利要求8所述的晶体组合物或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防ACC表达相关疾病的药物中的用途。