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CN113993885B - 重组弹性蛋白及其生产 - Google Patents

重组弹性蛋白及其生产 Download PDF

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CN113993885B
CN113993885B CN202080042788.6A CN202080042788A CN113993885B CN 113993885 B CN113993885 B CN 113993885B CN 202080042788 A CN202080042788 A CN 202080042788A CN 113993885 B CN113993885 B CN 113993885B
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Abstract

本公开内容提供了非天然存在的截短的弹性蛋白分子。所述非天然存在的截短的弹性蛋白可以改善皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合度、触觉质感和/或视觉质感。所述非天然存在的截短的弹性蛋白可以减少细胞外基质的降解。

Description

重组弹性蛋白及其生产
交叉引用
本申请要求于2019年4月12日提交的美国临时专利申请号62/833,415及2019年8月20日提交的62/889,397的权益，上述申请通过引用整体并入本文。
背景技术
弹性蛋白(Elastin)是一种对动脉、肺、肌腱、韧带、皮肤和其他组织的正常功能至关重要的弹性蛋白质。弹性蛋白为组织提供拉伸和恢复其原始形状的能力。蛋白质原弹性蛋白是弹性蛋白的组成部分。与包含一系列基因的其他结构蛋白(如胶原)不同，人类中有一个原弹性蛋白基因。当编码原弹性蛋白的基因被表达时，单个原弹性蛋白基因被剪接以产生不同形式的原弹性蛋白。多个原弹性蛋白分子结合在一起形成弹性蛋白。
天然弹性蛋白的结构类似于胶原，具有富含甘氨酸和脯氨酸的氨基酸序列。单个多肽链由指定为GLY-X-Y的重复三联体氨基酸序列组成，所述序列中夹杂有提供灵活性的丙氨酸串。X和Y可以是任何氨基酸，并且第一个氨基酸是甘氨酸。在弹性蛋白中发现了高浓度的氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。弹性蛋白通常通过赖氨酰氧化酶的作用与其他弹性蛋白肽共价交联。由于弹性蛋白肽的广泛交联，很难从动物组织中提取弹性蛋白。
弹性蛋白的某些结构域可以作为细胞内通讯的信号结构域。此外，某些弹性蛋白结构域可用作多肽和其他生物分子的结合结构域。弹性蛋白的降解产物已被证明可以激活细胞过程，例如吞噬作用。这些细胞相互作用结构域与产生弹性蛋白特有的有弹性的弹性结构的丙氨酸段间隔。丙氨酸段也富含赖氨酸，在组织中，赖氨酸被赖氨酰氧化酶转化为醛赖氨酸并交联成渔网状结构，这使得从动物组织中提取弹性蛋白非常困难，这需要分解弹性蛋白分子进行释放。由于这个困难的提取过程，市售弹性蛋白的大小仅为3-5kDa。
在人天然弹性蛋白中，分子有两个部分，每个部分包含三个连续的VGVAPG重复序列，即VGVAPGVGVAPGVGVAPG。据报道，氨基酸序列VGVAPG可促进细胞外基质降解。
发明内容
在一个方面，提供了一种非天然存在的多肽，其由以下部分组成：与选自SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与选自SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些情况下，所述分泌标签为DsbA。在一些情况下，所述非天然存在的多肽是重组多肽。
在另一方面，提供了一种组合物，其包含0.001至30％w/w的前述任一项的非天然存在的多肽。在一些情况下，所述组合物包含0.001％至1％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.05％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.03％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.02％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.01％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.1％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.03％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.02％w/w的非天然存在的多肽，或0.005％至0.01％w/w的非天然存在的多肽。在一些情况下，所述组合物能够刺激成纤维细胞的生长、刺激原弹性蛋白的合成、减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成，或其任何组合。在一些情况下，所述组合物被配制用于局部应用。在一些情况下，所述组合物包含一种或多种局部载体和防腐剂。在一些情况下，所述局部载体选自水、油甘油聚醚-8酯(glycereth-8ester)、甘油、椰子烷烃、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、戊二醇、EDTA二钠、辛甘醇(caprylyl glycol)、氯苯甘醚和苯氧乙醇、脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉化粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇、环甲硅油和环戊硅氧烷。在一些情况下，所述防腐剂选自：生育酚、二碘甲基-对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、Germaben II、迷迭香提取物和EDTA。在一些情况下所述组合物为化妆品。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的皮肤的方法，所述方法包括向受试者的皮肤施用前述任一项的组合物，从而治疗受试者的皮肤。在一些情况下，所述治疗包括减少皮肤损伤、促进受损皮肤修复、保护皮肤免受紫外线损伤、增加皮肤细胞的活力、保护皮肤细胞免受城市灰尘暴露的影响，或其任何组合。在一些情况下，受试者皮肤中存在的成纤维细胞、角质形成细胞或两者的活力增加。在一些情况下，受试者皮肤中存在的成纤维细胞对原胶原的合成增加。在一些情况下，受试者皮肤中存在的角质形成细胞对一个或多个抗氧化基因的表达增加。在一些情况下，所述一个或多个抗氧化基因选自：SOD2、GPX2、GPX4、GSTK1、GSTZ1、GSTA4、GSTM2、CCS、GPX1、GLRX、PRDX5、PRDX6和PRDX2。在一些情况下，受试者皮肤中存在的角质形成细胞对一个或多个促凋亡基因的表达降低。在一些情况下，所述一个或多个促凋亡基因选自：APAF1、BAK1、CASP7、CASP8、FADD、MCL1和MET。在一些情况下，所述受试者皮肤中存在的角质形成细胞对炎性细胞因子的产生减少。在一些情况下，所述炎性细胞因子为IL-1α。在一些情况下，所述受试者皮肤中存在的角质形成细胞的活力增加。
在另一方面，提供了编码根据前述任一项的非天然存在的多肽的多核苷酸。在一些情况下，所述多核苷酸包含在载体中。在一些情况下，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列具有至少85％序列同一性的核酸序列：SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列具有至少90％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列具有至少98％序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述多核苷酸还包含编码分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点中的一种或多种的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列经过密码子优化以在宿主细胞中表达。
在另一方面，提供了一种重组细胞，其包含编码前述任一项的非天然存在的多肽的异源核酸序列的至少一个拷贝。在一些情况下，所述重组细胞是微生物细胞。在一些情况下，所述微生物细胞是细菌细胞。在一些情况下，所述细菌细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)物种。在一些情况下，所述异源核酸序列与选自以下的核酸序列具有至少95％的序列同一性：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述异源核酸序列包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。在一些情况下，所述异源核酸序列经过密码子优化以在细胞中表达。在一些情况下，所述重组细胞能够在细胞外分泌非天然存在的多肽。
在另一方面，提供了一种组合物，其包含前述任一项的重组细胞和包含前述任一项的非天然存在的多肽的培养基。
在另一方面，提供了一种生产非天然存在的多肽的方法，所述方法包括：a)在培养基中培育前述任一项的重组细胞，其中所述重组细胞将重组多肽分泌至所述培养基；b)收集包含分泌至其中的重组多肽的培养基；和c)从培养基中纯化重组多肽。
在另一方面，提供了一种非天然存在的多肽，其由以下部分组成：与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及任选地选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)；以及选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由以下部分组成：根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或其截短体(例如，具有至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸的多肽)。在一些情况下，所述非天然存在的多肽由根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。在一些情况下，所述分泌标签为DsbA。在一些情况下，所述非天然存在的多肽是重组多肽。在另一方面，提供了一种组合物，其包含0.001％至30％w/w的非天然存在的多肽。在一些情况下，所述组合物包含0.001至1％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.05％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.03％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.02％w/w的非天然存在的多肽，0.001％至0.01％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.1％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.03％w/w的非天然存在的多肽，0.005％至0.02％w/w的非天然存在的多肽，或0.005％至0.01％w/w的非天然存在的多肽。在一些情况下，所述组合物能够实现选自以下的一种或多种：刺激成纤维细胞的生长、增加成纤维细胞或角质形成细胞的活力、刺激原弹性蛋白的合成、刺激原胶原的合成、刺激一个或多个抗氧化基因的表达、降低一个或多个促凋亡基因的表达、减少一种或多种炎性细胞因子的产生和减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。在一些情况下，所述组合物被配制用于局部应用。在一些情况下，所述组合物包含一种或多种局部载体和防腐剂。在一些情况下，所述局部载体选自水、油甘油聚醚-8酯、甘油、椰子烷烃、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、戊二醇、EDTA二钠、辛甘醇、氯苯甘醚和苯氧乙醇、脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉化粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇、环甲硅油和环戊硅氧烷。在一些情况下，所述防腐剂选自：生育酚、二碘甲基-对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、Germaben II、迷迭香提取物和EDTA。在一些情况下所述组合物为化妆品。在另一方面，提供了一种重组细胞，其包含编码非天然存在的多肽的异源核酸序列的至少一个拷贝。在一些情况下，所述重组细胞是大肠杆菌物种。
在某些实施方案中，这里是各种多肽、包含此类多肽的组合物和使用此类多肽和/或其组合物的方法。在某些实施方案中，此类多肽包括非天然和/或重组多肽，例如包含相对于天然蛋白，例如本文所述的天然蛋白而言被截短的一个或多个氨基酸序列(例如，全长蛋白)。在某些情况下，此类多肽在本文中被描述为“截短蛋白”。在特定实施方案中，所述多肽包括天然人类蛋白的一个或多个(例如，两个或更多个)截短氨基酸序列。
在一方面，提供了非天然存在的全长或非天然存在的截短的人弹性蛋白分子。在一个实施方案中，截短的人弹性蛋白分子由宿主细胞产生。非天然存在的弹性蛋白可以是人弹性蛋白。在一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白可以是全长或截短的弹性蛋白(例如，相对于天然存在的和/或全长弹性蛋白)。
在一个实施方案中，提供了一种非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)，其中所述非天然存在的多肽不包含一个或多个连续氨基酸序列，并且其中所述一个或多个连续氨基酸序列中的每一个具有VGVAPG序列(SEQ ID NO:1)。在另一个实施方案中，所述非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)不包含两个或更多个连续氨基酸序列VGVAPG。例如，在一个实施方案中，所述非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)不包含氨基酸序列VGVAPGVGVAPG(SEQ ID NO:2)或所述非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)不包含氨基酸序列VGVAPGVGVAPGVGVAPG(SEQ ID NO:3)。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)减少细胞外基质降解，或不促进或引起细胞外基质降解。
在各个方面，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)的分子量可为1kDa至60kDa、5kDa至55kDa、5kDa至50kDa、5kDa至45kDa、5kDa至40kDa、5kDa至35kDa、5kDa至30kDa、5kDa至25kDa、5kDa至20kDa、5kDa至15kDa、5kDa至10kDa、10kDa至40kDa、10kDa至35kDa、10kDa至30kDa、10kDa至25kDa或10kDa至20kDa。
在又一个实施方案中，提供了一种非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)，其中所述非天然存在的多肽相对于天然存在的和/或全长人弹性蛋白在C-末端被截短，相对于天然存在的和/或全长人弹性蛋白在N-末端被截短，相对于天然存在的和/或全长人弹性蛋白被内部截短，或相对于天然存在的和/或全长人弹性蛋白在C-末端和N-末端均被截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽包含相对于SEQ ID NO:20的截短(例如，在N-末端、在C-末端和/或内部截短)。
本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)的长度可为10至700个氨基酸、10至600个氨基酸、10至500个氨基酸、10至400个氨基酸、10至300个氨基酸、10至200个氨基酸、10至100个氨基酸、10至50个氨基酸、50至800个氨基酸、50至700个氨基酸、50至600个氨基酸、50至500个氨基酸、50至400个氨基酸、50至300个氨基酸、50至200个氨基酸，或50至100个氨基酸。在另一个实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如截短的人弹性蛋白)可以是比全长人原弹性蛋白或全长人弹性蛋白短至少1、5、10、20、50、100或更多个氨基酸的分子。
在具体实施方案中，本文的非天然存在的多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19，及其同源物(例如，与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性)。在更具体的实施方案中，本文的非天然存在的多肽由以下部分组成：选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19，及其同源物(例如，与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性)。
在另一方面，本文所述的非天然存在的多肽还包含一个或多个选自以下的氨基酸序列：分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白标签和蛋白酶切割位点。在一方面，所述分泌标签为DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA、Hy1A、DegP，或包含一种分泌标签的一部分与第二分泌标签的一部分融合的杂种分泌标签。在一个具体的实施方案中，分泌标签是DsbA。
在某些实施方案中，本文提供了组合物。在一些实施方案中，此类组合物包含本文所述的任何多肽(例如，截短或非天然存在的弹性蛋白)。在一方面，本文提供包含任何合适的量(例如0.001％w/w至30％w/w)的本文提供的任何多肽(例如截短的和/或非天然存在的弹性蛋白)的组合物。在一些情况下，所述组合物包含0.001％w/w至1％w/w、0.001％w/w至0.05％w/w、0.001％w/w至0.03％w/w、0.001％w/w至0.02％w/w、0.001％w/w至0.01％w/w、0.005％w/w至0.1％w/w、0.005％w/w至0.03％w/w、0.005％w/w至0.02％w/w或0.005％w/w至0.01％w/w的本文提供的任何多肽(例如截短的和/或非天然存在的弹性蛋白)。
在某些实施方案中，本文提供的组合物是局部组合物，例如被配制和/或适合用于局部施用或使用的组合物。本文提供的局部组合物可包括本文所述的任何多肽(例如，截短的和/或非天然存在的弹性蛋白，例如，以任何合适的量)和至少一种其他成分。在一个方面，本文提供了一种例如向受试者的皮肤提供(例如，如本文所述的)益处的方法，所述方法包括向受试者的皮肤局部施用所述局部组合物。在具体的实施方案中，所述局部组合物可用于减少皮肤损伤、促进受损皮肤修复、刺激皮肤细胞产生胶原、改善皮肤健康和保湿、改善皮肤外观的方法。在某些实施方案中，所述局部组合物可用于增加、促进、刺激或以其他方式增加皮肤中产生弹性蛋白的方法中。在某些实施方案中，所述局部组合物可用于刺激成纤维细胞生长和/或刺激原弹性蛋白合成和/或减少细胞中胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体形成的方法中。所述局部组合物还可包含至少一种其他成分，包括局部载体或防腐剂。
在一个实施方案中，局部组合物包含一种或多种选自以下的局部载体：水、油甘油聚醚-8酯、甘油、椰子烷烃、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、戊二醇、EDTA二钠、辛甘醇、氯苯甘醚和苯氧乙醇、脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉化粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇、环甲硅油和环戊硅氧烷。
在另一个实施方案中，局部组合物包含一种或多种选自以下的防腐剂：生育酚、二碘甲基-对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、Germaben II、迷迭香提取物和EDTA。
在一些实施方案中，提供了用于减少皮肤损伤和/或促进受损皮肤修复的方法。该方法可以包括将包含本文所述的任何非天然存在的多肽(例如，截短的和/或非天然存在的人弹性蛋白)的组合物(例如，局部组合物)施用于受试者的皮肤。在一些情况下，所述方法增加受试者皮肤的成纤维细胞或角质形成细胞的活力。在一些情况下，所述组合物(例如，局部组合物)的施用增加了受试者皮肤的成纤维细胞对原弹性蛋白的合成。在一些情况下，所述组合物(例如，局部组合物)的局部施用保护皮肤或角质形成细胞免受紫外线损伤。在一些情况下，组合物(例如，局部组合物)向受试者皮肤的施用减少了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。
在另一方面，非天然存在的多肽(例如，截短的人弹性蛋白)是重组多肽(例如，由宿主细胞例如通过重组表达产生)。重组多肽可以是重组人弹性蛋白(例如，非天然存在的和/或截短的人弹性蛋白)。在一个实施方案中，重组弹性蛋白是全长或截短的弹性蛋白。在一个实施方案中，重组多肽(例如，截短的人弹性蛋白)相对于天然和/或全长弹性蛋白在C-末端被截短，相对于天然和/或全长弹性蛋白在N-末端被截短，相对于天然和/或全长弹性蛋白被内部截短，或在天然和/或全长弹性蛋白的C-末端和N-末端均被截短。
在一些方面，本文所述的重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的人弹性蛋白)的长度可为10至700个氨基酸、10至600个、10至500个氨基酸、10至400个氨基酸、10至300个氨基酸、10至200个氨基酸、10至100个氨基酸、10至50个氨基酸、50至800个氨基酸、50至700个氨基酸、50至600个氨基酸、50至500个氨基酸、50至400个氨基酸、50至300个氨基酸、50至200个氨基酸，或50至100个氨基酸。
在另一个实施方案中，本文所述的重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的人弹性蛋白)的分子量可为1kDa至60kDa、5kDa至55kDa、5kDa至50kDa、5kDa至45kDa、5kDa至40kDa、5kDa至35kDa、5kDa至30kDa、5kDa至25kDa、5kDa至20kDa、5kDa至15kDa、5kDa至10kDa、10kDa至40kDa、10kDa至35kDa、10kDa至30kDa、10kDa至25kDa或10kDa至20kDa。
在各个方面，重组宿主细胞可包含编码本文所述的重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白)的异源核酸序列的至少一个拷贝。在一些情况下，编码重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的人弹性蛋白)的核酸序列可以包含选自以下的核酸序列：SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18，及其同源物(例如，与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性)。在另一个实施方案中，编码重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的人弹性蛋白)的核酸序列可由以下部分组成：选自以下的核酸序列：SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18，及其同源物(例如，与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性)。
在另一个实施方案中，本文所述的重组多肽可以包括选自以下的一种或多种：分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白标签和蛋白酶切割位点。在一些情况下，所述分泌标签为DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA、Hy1A、DegP，或包含一种分泌标签的一部分与第二分泌标签的一部分融合的杂种分泌标签。在一个具体的实施方案中，分泌标签是DsbA。
编码本文所述的多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白)的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体可用于转化宿主细胞，然后所述宿主细胞可以表达重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白)。
在另一个实施方案中，提供了已被工程改造以表达所公开的重组多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白)的宿主细胞(例如，重组宿主细胞)。宿主细胞可以是任何宿主细胞，包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和用于表达外源多核苷酸的任何其他细胞。在一个具体实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在具体实施方案中，宿主细胞能够在细胞外分泌重组多肽(例如，分泌至培养基中)。
在另一个实施方案中，提供了一种产生本文所述的多肽(例如，重组多肽，例如非天然存在的弹性蛋白和/或截短的弹性蛋白)的方法。该方法包括以下步骤：用重组宿主细胞接种培养基，所述重组宿主细胞包含编码本文所述的多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白)的异源核酸序列的至少一个拷贝，培养宿主细胞(例如，在培养基中培养宿主细胞)，由此宿主细胞在细胞外分泌重组多肽(例如，分泌至培养基中)，和分离重组多肽(例如，从宿主细胞和/或培养基中)。
在另一方面，本文提供用于减少皮肤细胞中炎性细胞因子的产生的方法。在一个实施方案中，皮肤细胞是角质形成细胞或成纤维细胞。该方法包括将本文所述的多肽(例如，非天然存在的和/或截短的弹性蛋白，例如在局部制剂中)施用于受试者的皮肤细胞或皮肤。在一些情况下，炎性细胞因子的产生(例如，TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-18和IL-1RA)减少。
在另一方面，提供了一种减少皮肤损伤或促进受损皮肤修复的方法。该方法可以包括将包含本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的弹性蛋白)的组合物(例如，配制用于局部施用的组合物)施用于受试者的皮肤。在一些情况下，所述方法增加受试者皮肤的成纤维细胞或角质形成细胞的活力。在一些情况下，组合物的施用增加了受试者皮肤的成纤维细胞或角质形成细胞对原弹性蛋白的合成。在一些情况下，组合物的局部施用保护皮肤、成纤维细胞或角质形成细胞免受紫外线伤害。在一些情况下，通过局部施用本文提供的组合物减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。
在另一方面，本文提供了保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法。在一些情况下，该方法包括将本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的弹性蛋白)施用于受试者的皮肤细胞或皮肤。在一些情况下，所述受试者的皮肤细胞或皮肤暴露于非天然存在的多肽增加了皮肤细胞暴露于城市灰尘后的活力。皮肤细胞可以是角质形成细胞或成纤维细胞。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1示出了蛋白质凝胶的照片。泳道1是尺寸标记。泳道2和3示出了实施例10的23kDa截短的人弹性蛋白，其以预期的分子量在凝胶上扩散。泳道4为空白，未负载任何蛋白质。泳道5和6示出了实施例11的13kDa截短的人弹性蛋白，其以预期的分子量在凝胶上扩散。
图2描绘了SDS-PAGE蛋白质凝胶，其示出了本文所述的重组产生的多肽(包含非天然存在的截短的弹性蛋白氨基酸序列)的高纯度和同质性。
图3描绘了用本文提供的示例性多肽(包含非天然存在的截短的弹性蛋白氨基酸序列)处理成纤维细胞后原胶原型I C-肽的分泌水平。
图4描绘了本文提供的示例性多肽(包含非天然存在的截短的弹性蛋白氨基酸序列)的抗氧化能力。
图5描绘了用本文提供的示例性多肽(包含非天然存在的截短的弹性蛋白氨基酸序列)处理角质形成细胞后各抗氧化基因的mRNA的表达水平。
图6描绘了用本文提供的示例性多肽(包含非天然存在的截短的弹性蛋白氨基酸序列)处理角质形成细胞后各促凋亡基因的mRNA的表达水平。
具体实施方式
在下面的描述中，阐述了某些具体细节以便提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开。
如本文所用，术语“约”通常是指±10％。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。通常，“包括”的公开包括“由……组成”的公开。
术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。通常，“包括”的公开包括“基本上由……组成”的公开。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数个指称物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个文档中，可以以范围格式来呈现本公开的各种实施方案。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的严格限制。因此，应该将范围的描述视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被视为已明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围多宽，这都适用。
每当在本文中指示数值范围时，其意图包括在指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。词语“在”第一指示数字和第二指示数字“之间的范围”和词语“从”第一指示数字“至”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且旨在包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“弹性蛋白”或“弹性蛋白样”在一些情况下是指这样的(例如单体的)多肽，其可以与一种或多种弹性蛋白或弹性蛋白样多肽相关，和/或可以与另一种多肽、核酸、多糖、脂质或其他分子结合。通常，术语“弹性蛋白”或“弹性蛋白样”是指具有与天然存在的弹性蛋白相关的一种或多种功能的多肽。当本文提供的非天然存在的多肽(例如截短的弹性蛋白)具有与天然存在的弹性蛋白相关的一种或多种功能时，它们可被称为“弹性蛋白”或“弹性蛋白样”。如本文所用，术语“原弹性蛋白”通常是指可被进一步加工(例如，通过切割、剪接等)以产生弹性蛋白多肽的多肽。弹性蛋白的非限制性实例是具有SEQ IDNO:20氨基酸序列的天然存在的人弹性蛋白。
如本文所用，术语“表达载体”或“载体”通常是指能够指导外源基因表达的核酸装配体。表达载体可包括与外源基因可操作连接的启动子、限制性核酸内切酶位点、编码一种或多种选择标记的核酸以及可用于重组技术实践的其他核酸。
如本文所用，术语“细胞外基质”通常是指为多细胞生物中的细胞提供支架的细胞外大分子(例如弹性蛋白、胶原、酶和糖蛋白)网络。细胞外基质可提供介导细胞粘附、细胞间通讯和其他功能的结构组分。
如本文所用，术语“成纤维细胞”通常是指合成原弹性蛋白、原胶原和其他结构蛋白的细胞。成纤维细胞广泛分布于体内，并存在于皮肤、结缔组织和其他组织中。
术语“荧光蛋白”通常是指可以在基因工程技术中用作外源多核苷酸表达的报道分子的蛋白质。该蛋白质在暴露于紫外线或蓝光下时发荧光并发出明亮的可见光。发出绿光的蛋白质包括绿色荧光蛋白(GFP)，发出红光的蛋白质包括红色荧光蛋白(RFP)。
如本文所用，术语“基因”通常是指编码特定蛋白质的多核苷酸，并且其可以单独指代编码区或可以包括在编码序列之前的调控序列(5'非编码序列)和之后的调控序列(3'非编码序列)。
术语“组氨酸标签”通常是指重组多肽上的2-30个连续的组氨酸残基系列。
术语“宿主细胞”通常是指经工程化以表达引入的外源多核苷酸的细胞。
术语“角质形成细胞”通常是指产生角蛋白、原弹性蛋白和存在于皮肤的表皮层中的其他细胞成分的细胞。
如本文所用，术语“非天然存在的”是指通常在自然界中不存在的基因、多肽或蛋白质，例如弹性蛋白。非天然存在的弹性蛋白可以经重组制备(例如通过被重组宿主细胞表达)。非天然存在的弹性蛋白可以是重组弹性蛋白(例如通过被重组宿主细胞表达)。非天然存在的弹性蛋白是截短的弹性蛋白。其他非天然存在的弹性蛋白多肽包括嵌合弹性蛋白。嵌合弹性蛋白可以是其中弹性蛋白多肽的一部分与第二弹性蛋白多肽的一部分邻接的多肽。例如，包含邻接有另一人多肽的一部分的人弹性蛋白的一部分的分子可以是嵌合弹性蛋白。在另一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白包括融合多肽，所述融合多肽包含另外的氨基酸，例如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白和/或蛋白酶切割位点。
通常，本文提供的弹性蛋白或截短的弹性蛋白(例如具有特定氨基酸序列)的公开包括具有或包含该精确氨基酸序列及其同系物的多肽。在一些情况下，本文提供的氨基酸序列的同系物可以具有更长或更短的序列，并且可以具有该氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的置换。这样的同系物与所述序列具有特定的序列同一性(例如以本文提供的序列同一性量)。序列同一性(例如出于评估百分比同一性的目的)可以通过任何合适的比对算法进行测量，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上可用的EMBOSS Needle比对器，任选采用默认设置)、BLAST算法(参见例如，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上可用的BLAST比对工具，任选采用默认设置)，或者Smith-Waterman算法(参见例如，www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html上可用的EMBOSS Water比对器，任选采用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适参数(包括默认参数)来评估最佳比对。在一些情况下，非天然存在的弹性蛋白可以与本文公开的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
术语“蛋白酶切割位点”通常是指被特异性蛋白酶切割的氨基酸序列。
术语“分泌标签”或“信号肽”通常是指征募宿主细胞的细胞机制以将表达的蛋白质转运至宿主细胞的特定位置或细胞器的氨基酸序列。
术语“截短的弹性蛋白”通常是指小于全长弹性蛋白的单体多肽，其中全长弹性蛋白的一个或多个部分不存在。弹性蛋白多肽可相对于全长弹性蛋白在C-末端被截短、相对于全长弹性蛋白在N-末端被截短、通过去除全长弹性蛋白多肽的一个或多个内部部分而被截短(例如内部截短)，或者相对于全长弹性蛋白在C-末端和N-末端两处都被截短。在非限制性实施方案中，截短的人弹性蛋白可包含根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其同系物。通常，本文提供的截短的弹性蛋白可以与天然或全长弹性蛋白具有相似或基本上相似的功能和/或提供相似或基本上相似的益处(例如，如本文提供的)。在一些情况下，与天然或全长弹性蛋白相比，本文提供的截短的弹性蛋白可以具有改善或增加的功能和/或益处(例如，如本文提供的)。
当用于提及氨基酸位置时，“截短”包括所述氨基酸位置。例如，在全长蛋白质的氨基酸位置100处的N-末端截短意味着从全长蛋白质的N-末端截短了100个氨基酸(即，截短的蛋白质缺少全长蛋白质的1至100位氨基酸)。类似地，全长蛋白质(假设是具有1000个氨基酸的全长蛋白质)在氨基酸位置901处的C-末端截短意味着从C-末端截短了100个氨基酸(即，截短的蛋白质缺少全长蛋白质的901至1000位氨基酸)。类似地，在氨基酸位置101和200处的内部截短是指全长蛋白质的100个氨基酸的内部截短(即，截短的蛋白质缺少全长蛋白质的101至200位氨基酸)。
在一些实施方案中，细胞培养物可还包括以下一种或多种：氯化铵、硫酸铵、氯化钙、氨基酸、硫酸亚铁(II)、硫酸镁、蛋白胨、磷酸钾、氯化钠、磷酸钠和酵母提取物。
宿主细菌细胞可以连续或不连续地培养；分批处理、加料分批处理或重复加料分批处理。
在一方面，提供了一种非天然存在的弹性蛋白。在一些情况下，非天然存在的弹性蛋白是由宿主细胞(例如，重组细胞)产生的重组多肽。在一些情况下，非天然存在的弹性蛋白可为人弹性蛋白。在一些情况下，非天然存在的弹性蛋白可为截短的弹性蛋白。截短的弹性蛋白可以相对于全长弹性蛋白(例如，具有SEQ ID NO:20氨基酸序列)被截短。截短可以是相对于全长弹性蛋白的内部截短、相对于全长弹性蛋白在N-末端部分的截短、相对于全长弹性蛋白在C-末端部分的截短或相对于全长弹性蛋白在在C-末端和N-末端的截短。
截短的弹性蛋白相对于全长弹性蛋白的截短长度可为10至700个氨基酸、10至600个氨基酸、10至500个氨基酸、10至400个氨基酸、10至300个氨基酸、10至200个氨基酸、10至100个氨基酸、10至50个氨基酸、50至800个氨基酸、50至700个氨基酸、50至600个氨基酸、50至500个氨基酸、50至400个氨基酸、50至300个氨基酸、50至200个氨基酸，或50至100个氨基酸。在另一个实施方案中，截短的弹性蛋白相对于全长弹性蛋白可以截短50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、,510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700或750个氨基酸。截短的弹性蛋白可由本文公开的多核苷酸序列的一部分或整个多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，截短的弹性蛋白(例如，其氨基酸序列)(例如，本文提供的多肽的)可以在C-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如最高达10个、10至800、10至700、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100个等等。在一些情况下，截短的弹性蛋白可以在C-末端被截短(相对于全长弹性蛋白)10个、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，截短的弹性蛋白(例如，其氨基酸序列)(例如，本文提供的多肽的)可以在N-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如最高达10个、10至800、10至700、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100个等等。在一些情况下，截短的弹性蛋白可以在N-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，截短的弹性蛋白(例如，其氨基酸序列)(例如，本文提供的多肽的)可以在N-末端和C-末端相对于全长弹性蛋白均被截短。在一些情况下，截短的弹性蛋白可以在N-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如最高达10个、10至800、10至700、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100个等等；并且可以在C-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如最高达10个、10至800、10至700、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100个等等。在一些情况下，截短的弹性蛋白可以在N-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短10个、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸；并且可以在C-末端(相对于全长弹性蛋白)被截短10个、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，截短的弹性蛋白(例如，其氨基酸序列)(例如，本文提供的多肽的)可以被内部截短(相对于全长弹性蛋白)任何合适数量的氨基酸残基，例如最高达10个、10至800、10至700、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100个等等。在一些情况下，截短的弹性蛋白可以被内部截短(相对于全长弹性蛋白)10个、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。
本文公开的截短的弹性蛋白可以包括相对于全长弹性蛋白的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的弹性蛋白可以包括相对于全长人弹性蛋白的截短。在一些情况下，全长人弹性蛋白具有下表1中提供的SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
表1.全长弹性蛋白氨基酸序列
在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置1和68之间、氨基酸位置1和73之间、氨基酸位置1和78之间、氨基酸位置1和83之间、氨基酸位置1和88之间、在氨基酸位置1和93之间、或氨基酸位置1和98之间的任何氨基酸位置处包含N-末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置213和760之间、氨基酸位置218和760之间、氨基酸位置223和760之间、氨基酸位置228和760之间、氨基酸位置233和760之间、氨基酸位置238和760之间、或243和760之间的任何氨基酸位置处包含C-末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可包含N-末端截短和C-末端截短两者。例如，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置1和68之间、氨基酸位置1和73之间、氨基酸位置1和78之间、氨基酸位置1和83之间、氨基酸位置1和88之间、在氨基酸位置1和93之间、或氨基酸位置1和98之间的任何氨基酸位置处包含N-末端截短；以及在SEQIDNO:20的氨基酸位置213和760之间、氨基酸位置218和760之间、氨基酸位置223和760之间、氨基酸位置228和760之间、氨基酸位置233和760之间、氨基酸位置238和760之间、或243和760之间的任何氨基酸位置处包含C-末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置83处包含N-末端截短；以及在SEQ ID NO:20的氨基酸位置228处包含C-末端截短。
在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置1和68之间、氨基酸位置1和73之间、氨基酸位置1和78之间、氨基酸位置1和83之间、氨基酸位置1和88之间、氨基酸位置1和93之间、或氨基酸位置1和98之间的任何氨基酸位置处包含N-末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置331和760之间、氨基酸位置336和760之间、氨基酸位置341和760之间、氨基酸位置346和760之间、氨基酸位置351和760之间、氨基酸位置356和760之间、或氨基酸位置361和760之间的任何氨基酸位置处包含C-末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的弹性蛋白可包含N-末端截短和C-末端截短。例如，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置1和68之间、氨基酸位置1和73之间、氨基酸位置1和78之间、氨基酸位置1和83之间、氨基酸位置1和88之间、氨基酸位置1和93之间、或氨基酸位置1和98之间的任何氨基酸位置处包含N-末端截短；以及可以在SEQ ID NO:20的氨基酸位置331和760之间、氨基酸位置336和760之间、氨基酸位置341和760之间、氨基酸位置346和760之间、氨基酸位置351和760之间、氨基酸位置356和760之间、或氨基酸位置361和760之间的任何氨基酸位置处包含C-末端截短。在一个具体的实施方案中，如本文所述的截短的弹性蛋白可以在SEQID NO:20的氨基酸位置83处包含N-末端截短；以及在SEQ ID NO:20的氨基酸位置346处包含C-末端截短。
在一些情况下，截短的弹性蛋白可包含下表2中提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，截短的弹性蛋白可由下表2中提供的任何氨基酸序列组成。在一些情况下，截短的弹性蛋白可基本上由下表2中提供的任何氨基酸序列组成。在具体的实施方案中，非天然存在的弹性蛋白为以下任一氨基酸序列或包含以下任一氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，截短的弹性蛋白包含与以下任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，截短的弹性蛋白可以是以下任一者的截短体(例如，具有至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140个或至少150个氨基酸的多肽)：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19；或可以是与以下任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列的截短体(例如，具有至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或至少150个氨基酸的多肽)：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。例如，截短的弹性蛋白可具有相对于以下任一者的N-末端截短、C-末端截短和/或内部截短：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19；或相对于以下任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸序列的N-末端截短、C-末端截短和/或内部截短：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
表2.截短的弹性蛋白的非限制性实例
在各个方面，截短的人弹性蛋白不包含两个或更多个连续氨基酸序列VGVAPG(SEQID NO:1)。在一些情况下，截短的人弹性蛋白不包含VGVAPGVGVAPG(SEQ ID NO:2)。在一些情况下，截短的人弹性蛋白不包含VGVAPGVGVAPGVGVAPG(SEQ ID NO:3)。在一些情况下，非天然存在的截短的人弹性蛋白减少细胞外基质降解或不引起细胞外基质降解。
在一些情况下，截短的弹性蛋白的长度可为100至150个氨基酸、100至200个氨基酸、100至300个氨基酸、140至250个氨基酸、140至200个氨基酸、150至250个氨基酸、160至250个氨基酸、160至220个氨基酸、170至200个氨基酸、180至190个氨基酸或185至190个氨基酸。
在一些方面，截短的人弹性蛋白的分子量可为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或大于50kDa。在一些实施方案中，分子量小于约10、15、20、25、30、35、40、45或50kDa。在一些实施方案中，分子量为1kDa至60kDa、5kDa至55kDa、5kDa至50kDa、5kDa至45kDa、5kDa至40kDa、5kDa至35kDa、5kDa至30kDa、5kDa至25kDa、5kDa至20kDa、5kDa至15kDa、5kDa至10kDa、10kDa至40kDa、10kDa至35kDa、10kDa至30kDa、10kDa至25kDa或10kDa至20kDa。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白可以包含信号序列。通常，信号序列可以是表达载体的组成部分，或者可以是插入载体中的外源基因的一部分。所选择的信号序列可以是被宿主细胞识别和处理(例如，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和处理外源基因的天然信号序列的细菌宿主细胞，该信号序列可以由任何通常已知的细菌信号序列代替。在一些实施方案中，可以使用DsbA信号序列将重组产生的多肽靶向周质空间。Dinh和Bernhardt,J Bacteriol,2011年9月,4984-4987。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白可以进一步包括包含分泌标签的氨基酸序列。分泌标签可以将弹性蛋白引导至宿主细胞的周质空间。在具体实施方案中，信号肽衍生自DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA、DegP或Hy1A，或包含一个分泌标签的一部分与第二分泌标签的一部分融合的杂种分泌标签。在一方面，分泌标签附接于非天然存在的弹性蛋白。在另一方面，分泌标签可以从非天然存在的弹性蛋白上切割下来。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白进一步包含组氨酸标签。组氨酸标签或多组氨酸标签可以是附接至弹性蛋白的2至20个组氨酸残基的序列。组氨酸标签可以包含2至20个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至18个组氨酸残基、5至16个组氨酸残基、5至15个组氨酸残基、5至14个组氨酸残基、5至13个组氨酸残基、5至12个组氨酸残基、5至11个组氨酸残基、5至10个组氨酸残基、6至12个组氨酸残基、6至11个组氨酸残基或7至10个组氨酸残基。组氨酸标签可用于通过采用基于镍的色谱介质的色谱方法进行蛋白质纯化。在一方面，组氨酸标签可以附接于非天然存在的弹性蛋白。在另一方面，组氨酸标签可以从非天然存在的弹性蛋白上切割下来。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白还包含荧光蛋白。示例性的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。荧光蛋白是本领域众所周知的。在一个实施方案中，非天然存在的弹性蛋白包含GFP和/或RFP。在一个实施方案中，超折叠GFP可以与非天然存在的弹性蛋白融合。超折叠GFP可以是即使与折叠不良的多肽融合时也可以正确折叠的GFP。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白还包含蛋白酶切割位点。蛋白酶切割位点可用于切割重组产生的弹性蛋白以去除多肽的一个或多个部分。可以去除的多肽部分包括分泌标签、组氨酸标签、荧光蛋白标签和/或蛋白酶切割位点。蛋白酶可以包括内切蛋白酶、外切蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。示例性的蛋白酶切割位点包括被凝血酶、TEV蛋白酶、因子Xa、肠肽酶和鼻病毒3C蛋白酶切割的氨基酸。在一方面，切割标签可附接于非天然存在的弹性蛋白。在另一方面，切割标签通过适当的蛋白酶被从非天然存在的弹性蛋白去除。
本文某些实施方案中提供的是包含本文提供的一种或多种多肽的(例如局部的)组合物或制剂。在一些实施方案中，组合物例如以任何合适量(例如，当给予或施用于个体或细胞时适合提供益处的量)提供本文提供的任何合适量的多肽。在一些具体的实施方案中，组合物包含当(例如，局部地)施用于受试者皮肤时适合于向受试者皮肤提供有益作用的量。在具体的实施方案中，组合物包含0.001％至30％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)。在更具体的实施方案中，组合物包含0.001％至20％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)、0.001％至10％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)、0.001％至5％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)、0.001％至2％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)、0.001％至1％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)、0.001％至0.5％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)以及0.001％至0.2％w/w的例如本文提供的多肽(或非天然存在的弹性蛋白)。
在一方面，包含非天然存在的人弹性蛋白的组合物是个人护理产品(例如，化妆品)。在一些实施方案中，将组合物配制用于局部施用。组合物可以包含其他适合人类使用的化妆品成分。个人护理产品可用于预防或治疗紫外线辐射对人类皮肤或毛发的损害。个人护理产品可用于增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合度、触觉质感或视觉质感，和/或刺激胶原产生。个人护理产品可以应用于皮肤或毛发。组合物包括例如面膜、皮肤清洁剂(如肥皂、清洁霜、清洁洗剂、洁面剂、清洁乳、清洁垫、洗面奶)、面部和身体乳霜和保湿剂、面部精华、面膜和身体膜、爽肤水和面部喷雾、眼霜和眼部护理剂、去角质配方、润唇膏和口红、洗发水、护发素和沐浴露、毛发和头皮精华、发雾和喷雾、眼影、遮瑕膏、睫毛膏和其他彩色化妆品。
包含非天然存在的弹性蛋白的组合物可以进一步包含至少一种另外的成分，包括局部载体或防腐剂。局部载体包括选自脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉化粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇、环甲硅油、环戊硅氧烷和水的局部载体。防腐剂包括选自生育酚、二碘甲基-对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物顺式异构体、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、苯氧基乙醇、丁二醇、1,2己二醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、Germaben II、迷迭香提取物和EDTA的防腐剂。
本文还提供减少皮肤损伤、促进受损皮肤修复、保护皮肤免受紫外线损伤和/或保护皮肤细胞免受城市灰尘暴露的影响的方法。在另一个实施方案中，提供了增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合度、触觉质感或视觉质感和/或刺激弹性蛋白或胶原产生的方法。该方法包括将包含非天然存在的弹性蛋白的组合物施用于受试者的皮肤。不受特定理论或机制的束缚，当施用于皮肤时，组合物中的非天然存在的弹性蛋白通过免受紫外线损伤而减少皮肤损伤，和/或通过增加细胞活力和/或增加原弹性蛋白或原胶原合成而促进受损皮肤修复，和/或促进皮肤细胞的活力。一方面，非天然存在的截短的人弹性蛋白减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。
本文提供的方法包括例如通过本文提供的步骤使用组合物用于该方法中所示的治疗。在实施方案中，本公开内容提供了本文提供的组合物(例如，截短的弹性蛋白或包含截短的弹性蛋白的制剂)在本文提供的方法中的用途。
在一些实施方案中，组合物的施用刺激成纤维细胞的生长，和/或刺激原弹性蛋白的合成，和/或减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，所述组合物的施用刺激成纤维细胞的生长至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，所述组合物的施用刺激原弹性蛋白的合成至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，所述组合物的施用使TT二聚体的形成减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，使用基于ELISA的测定测量TT二聚体的形成。
在一些实施方案中，本文公开了一种促进受损皮肤修复、保护皮肤免受紫外线损伤或增加皮肤细胞的活力的方法，该方法包括将组合物施用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，当施用所述组合物时，受损皮肤可修复至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，当施用所述组合物时，皮肤可保护免受紫外线损伤至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，皮肤细胞的活力增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是角质形成细胞。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是成纤维细胞。在一些实施方案中，可以使用MTT测定测量成纤维细胞的活力。
在一些实施方案中，本文公开了通过将组合物施用于受试者的皮肤或皮肤细胞来增加成纤维细胞合成原胶原的方法。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，当施用所述组合物时，受试者皮肤中存在的成纤维细胞对原胶原的合成可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，受试者皮肤中存在的成纤维细胞对原胶原的合成可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％，通过基于ELISA的测定测量。在一些实施方案中，基于ELISA的测定测量原胶原型I-C肽的水平。
在一些实施方案中，本文公开了一种减少皮肤细胞产生炎性细胞因子的方法，该方法包括将非天然存在的弹性蛋白或包含非天然存在的弹性蛋白的组合物施用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤。在一些实施方案中，细胞因子包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-18、IL-1RA或其组合。在一些实施方案中，炎性细胞因子可以是白细胞介素，例如IL-1、IL-6或IL-8。在一些实施方案中，炎性细胞因子可以是IL-1a。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，当施用所述组合物时，皮肤细胞产生的炎性细胞因子可减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是角质形成细胞。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是成纤维细胞。在一些实施方案中，可以使用基于ELISA的测定测量细胞因子的产生。
在一些实施方案中，本文提供的截短的弹性蛋白可以刺激受试者的皮肤细胞或皮肤中抗氧化基因的表达。在一些情况下，本文提供的截短的弹性蛋白可以刺激选自以下的一个或多个抗氧化基因的表达：SOD2、GPX2、GPX4、GSTK1、GSTZ1、GSTA4、GSTM2、CCS、GPX1、GLRX、PRDX5、PRDX6和PRDX2。在一些情况下，可以测量mRNA表达(例如，通过微阵列、RNA测序等)。
在一些实施方案中，本文提供的截短的弹性蛋白可以减少受试者的皮肤细胞或皮肤中促凋亡基因的表达。在一些情况下，本文提供的截短的弹性蛋白可以减少选自以下的一个或多个促凋亡基因的表达：APAF1、BAK1、CASP7、CASP8、FADD、MCL1和MET。在一些情况下，可以测量mRNA表达(例如，通过微阵列、RNA测序等)。
在一些实施方案中，本文公开了一种增加皮肤细胞的活力的方法，该方法包括将非天然存在的弹性蛋白或包含非天然存在的弹性蛋白的组合物施用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤。在一些实施方案中，与未施用组合物的皮肤或皮肤细胞相比，当施用所述组合物时，皮肤细胞的活力可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是角质形成细胞。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是成纤维细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种保护皮肤细胞免受暴露于城市灰尘的影响的方法，该方法包括将非天然存在的弹性蛋白或包含非天然存在的弹性蛋白的组合物施用于受试者的皮肤或皮肤细胞的步骤，其中皮肤细胞的活力增加。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，皮肤细胞的活力可增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是角质形成细胞。在一些实施方案中，皮肤细胞可以是成纤维细胞。在一些实施方案中，可以使用MTT测定来测量活力。
在一些实施方案中，组合物具有抗氧化能力。在一些实施方案中，抗氧化能力可以使用氧自由基吸收能力(ORAC)测定来测量。在一些实施方案中，抗氧化能力可以以Trolox当量单位来测量。在一些实施方案中，组合物的抗氧化能力可为至少50μM、100μM、150μM、200μM、250μM或大于250μM Trolox当量单位。
在一些实施方案中，非天然存在的弹性蛋白可由多核苷酸编码(例如，非天然存在的弹性蛋白；例如，用于在宿主细胞中表达)。多核苷酸可以编码全长弹性蛋白或截短的弹性蛋白。在各种实施方案中，多核苷酸可以包括根据SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或其同系物(例如，与其具有至少80％、85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性)中的任一个的多核苷酸。在一些情况下，可以对多核苷酸进行密码子优化(例如，用于在宿主细胞中表达)。
一方面，多核苷酸可以包含在载体中(例如以转变宿主细胞)。多核苷酸可以进一步包含编码酶的核酸，该酶允许宿主生物体在选择剂的存在下生长。选择剂可包括某些糖，包括含半乳糖的糖，或抗生素，包括氨苄西林、潮霉素、G418等。用于赋予选择剂抗性的酶可以包括β-半乳糖苷酶。
一方面，提供了表达所公开的多核苷酸(和由所述多核苷酸编码的多肽)的宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞可包含异源核酸序列(例如，编码本文所述的多肽)的至少一个拷贝。宿主细胞可以是任何宿主细胞，包括革兰氏阴性细菌细胞、革兰氏阳性细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或用于表达外源多核苷酸的任何其他细胞。在一个具体的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在各个方面，宿主细胞可能够将非天然存在的弹性蛋白分泌到细胞外(例如，分泌至培养基中)。
除碳、氮和无机磷酸盐源以外，还可以包含适当浓度的任何必要的补充剂，其单独引入或作为与另一种补充剂或培养物(诸如复合氮源)的混合物引入。在某些实施方案中，培养基还包含一种或多种选自以下的成分：氯化铵、硫酸铵、氯化钙、酪蛋白氨基酸、硫酸亚铁(II)、硫酸镁、蛋白胨、磷酸钾、氯化钠、磷酸钠和酵母提取物。
另一个实施方案提供了生产非天然存在的弹性蛋白的方法。该方法包括用包含异源核酸序列的至少一个拷贝的重组宿主细胞接种培养基，所述异源核酸序列编码非天然存在的弹性蛋白，培养宿主细胞(例如，在培养基中培养宿主细胞)和从宿主细胞中分离出非天然存在的弹性蛋白。在一些情况下，该方法包括在培养基中培养重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞将非天然存在的弹性蛋白分泌到培养基中，收集包含分泌至其中的非天然存在的弹性蛋白的培养基，并从培养基中纯化和/或分离(例如，通过离心、过滤等)非天然存在的弹性蛋白。
在另一方面，提供了发酵制备蛋白质的方法。该方法包括以下步骤：
a)在包含镁盐的培养基中培养重组细菌细胞，其中所述培养基中镁离子的浓度为至少约6mM，并且其中所述细菌细胞包含编码所述蛋白质的外源基因；和
b)从所述培养基中收获所述蛋白质。
细菌可以连续培养(如例如WO 05/021772中所述)或以分批法(分批培养)或以加料分批或重复加料分批法的方式不连续培养，以用于产生目标蛋白。在一些实施方案中，蛋白质生产是大规模进行的。各种大规模发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1,000升的容量，优选大约1,000至100,000升的容量。在一些情况下，发酵罐使用搅拌器叶轮分配氧气和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常是指在发酵罐中发酵，发酵罐的容量不超过约20升。
为了积累目标蛋白，在足以积累目标蛋白的条件下培养宿主细胞。这样的条件包括例如温度、养分和允许细胞表达和积累蛋白质的细胞密度条件。此外，如本领域技术人员已知的，这样的条件可以是指在这些条件下细胞可以执行针对分泌蛋白的如下基本细胞功能：转录、翻译和蛋白质从一个细胞室到另一细胞室的传递。
在合适的温度下培养细菌细胞。对于大肠杆菌生长，例如，典型温度范围为约20℃至约39℃。在一个实施方案中，温度为约20℃至约37℃。在另一个实施方案中，温度为约30℃。在一个实施方案中，可以在一个温度下在非切换状态或切换状态下培养宿主细胞，并切换至不同温度以诱导蛋白质产生。可以先在一个温度下培养宿主细胞以繁殖细胞，然后在较低温度下培养细胞以诱导蛋白质产生。第一温度可以是23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。第二温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。在第二温度下的培养可以进行1小时至100小时、5小时至90小时、5小时至80小时、5小时至80小时、5小时至70小时、10小时至70小时、15小时至70小时、15小时至65小时、15小时至60小时、20小时至60小时、20小时至55小时、20小时至50小时、24小时至50小时、24小时至48小时、30小时至50小时、30小时至45小时或30小时至40小时。
培养基的pH可以是约5-9的任何pH，主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH可以为约6.0至约7.4、约6.2至约7.2、约6.2至约7.0、约6.2至约6.8、约6.2至约6.6、约6.4或约6.5。
为了诱导基因表达，通常可以将细胞培养直至达到一定的光密度，例如，OD 600为约1.1，在该点开始诱导(例如，通过添加诱导剂，通过耗尽阻抑剂、抑制剂或培养基组分等)以诱导编码目标蛋白的外源基因的表达。在一些实施方案中，外源基因的表达可以通过选自例如异丙基-β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、四环素、脱水四环素、vavlycin、木糖、铜、锌等的诱导剂来诱导。基因表达的诱导还可以通过降低发酵过程中的溶解氧水平来实现。细胞繁殖期间发酵的溶解氧水平可以在10％至30％之间。为了诱导基因表达，可将溶解氧水平降低至低于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％。在宿主细胞中，无论是处于生理状态还是处于转换状态，都可以通过降低如本文所公开的发酵温度来诱导蛋白质产生。
实施例
实施例1.25kDa截短的人弹性蛋白
下文公开了不具有His标签、接头和/或凝血酶切割位点的非天然存在的截短的人弹性蛋白。非天然存在的截短的人弹性蛋白相对于全长人弹性蛋白(SEQ ID NO:20)被截短。下文公开了编码该弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列。在SEQ ID NO:4中，DsbA分泌标签由核苷酸1-57编码，并编码SEQ ID NO:5的氨基酸1-19。在SEQ ID NO:4中，非天然存在的截短的人弹性蛋白序列由核苷酸58-927编码，并编码SEQ ID NO:5的氨基酸20-309。
编码该非天然存在的截短的弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:4中提供。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGGTCCGCAACCTGGGGTTCCGTTAGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCCGGCGGTTATGGTCTGCCGTACACAACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCGGGTGGAGTTGCGGGTGCAGCAGGTAAAGCGGGTTATCCTACCGGAACCGGTGTAGGTCCGCAGGCCGCTGCTGCCGCCGCCGCAAAAGCAGCGGCTAAATTTGGCGCCGGAGCAGCGGGTGTTCTGCCTGGAGTTGGTGGTGCGGGCGTGCCAGGGGTACCTGGTGCAATTCCGGGTATTGGTGGTATTGCCGGTGTCGGCACCCCGGCCGCGGCAGCTGCGGCAGCGGCGGCTGCCAAAGCTGCTAAATACGGTGCCGCGGCGGGTCTGGTGCCAGGAGGTCCGGGTTTTGGTCCGGGAGTGGTTGGCGTGCCTGGCGCAGGCGTTCCTGGTGTGGGCGTTCCAGGTGCAGGGATTCCTGTTGTGCCTGGTGCCGGTATTCCCGGCGCGGCCGTTCCGGGGGTGGTTAGCCCGGAAGCCGCAGCGAAGGCTGCGGCAAAGGCAGCAAAGTATGGCGCACGCCCAGGAGTCGGCGTGGGTGGTATCCCGACCTATGGGGTGGGCGCAGGGGGTTTTCCTGGTTTCGGCGTAGGTGTAGGAGGTATACCGGGCGTGGCCGGTGTACCAGGGGTTGGTGGCGTCCCTGGTGTTGGCGGTGTGCCAGGTGTTGGTATTTCACCGGAAGCACAGGCAGCAGCCGCAGCTAAGGCAGCGAAATATGGTGCCGCCGGCGCAGGAGTTTTAGGTGGGCTGGTTCCGGGCCCGCAGGCAGCTGTGCCGGGGGTTCCAGGCACCGGTGGTGTCCCTGGAGTCGGTACGCCGTAA(SEQ ID NO:4)
包括DsbA分泌信号的25kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白序列的氨基酸序列在SEQ ID NO:5中公开。
MKKIWLALAGLVLAFSASAGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPGVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGAAGAGVLGGLVPGPQAAVPGVPGTGGVPGVGTP(SEQ ID NO:5)
编码不含DsbA分泌标签的非天然存在的截短的人弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:6中提供。
GGTCCGCAACCTGGGGTTCCGTTAGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCCGGCGGTTATGGTCTGCCGTACACAACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCGGGTGGAGTTGCGGGTGCAGCAGGTAAAGCGGGTTATCCTACCGGAACCGGTGTAGGTCCGCAGGCCGCTGCTGCCGCCGCCGCAAAAGCAGCGGCTAAATTTGGCGCCGGAGCAGCGGGTGTTCTGCCTGGAGTTGGTGGTGCGGGCGTGCCAGGGGTACCTGGTGCAATTCCGGGTATTGGTGGTATTGCCGGTGTCGGCACCCCGGCCGCGGCAGCTGCGGCAGCGGCGGCTGCCAAAGCTGCTAAATACGGTGCCGCGGCGGGTCTGGTGCCAGGAGGTCCGGGTTTTGGTCCGGGAGTGGTTGGCGTGCCTGGCGCAGGCGTTCCTGGTGTGGGCGTTCCAGGTGCAGGGATTCCTGTTGTGCCTGGTGCCGGTATTCCCGGCGCGGCCGTTCCGGGGGTGGTTAGCCCGGAAGCCGCAGCGAAGGCTGCGGCAAAGGCAGCAAAGTATGGCGCACGCCCAGGAGTCGGCGTGGGTGGTATCCCGACCTATGGGGTGGGCGCAGGGGGTTTTCCTGGTTTCGGCGTAGGTGTAGGAGGTATACCGGGCGTGGCCGGTGTACCAGGGGTTGGTGGCGTCCCTGGTGTTGGCGGTGTGCCAGGTGTTGGTATTTCACCGGAAGCACAGGCAGCAGCCGCAGCTAAGGCAGCGAAATATGGTGCCGCCGGCGCAGGAGTTTTAGGTGGGCTGGTTCCGGGCCCGCAGGCAGCTGTGCCGGGGGTTCCAGGCACCGGTGGTGTCCCTGGAGTCGGTACGCCGTAA(SEQ ID NO:6)
不含DsbA分泌标签的非天然存在的截短的人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ IDNO:7中公开。
GPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPGVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGAAGAGVLGGLVPGPQAAVPGVPGTGGVPGVGTP(SEQ IDNO:7)
SEQ ID NO：4的多核苷酸通过Gen9 DNA(现在为Ginkgo Bioworks)内部合成来合成。将pET28载体与SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之间的重叠序列设计为20至30bp长，并使用PCR通过酶GXL聚合酶(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)来添加。然后使用In-Fusion克隆(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO：4)一起组装成最终质粒。然后通过Genewiz(www.genewiz.com/en)的Sanger测序验证质粒序列。
将转化的细胞在基本培养基中培养，并以50:50的细胞:甘油比冷冻在具有蔬菜甘油的1.5ml等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml基本培养基中于37℃、200rpm下复苏过夜。将细胞转移到300ml基本培养基中，生长6-9小时，以达到OD600为5-10。
本实施例和本公开内容全文中使用的基本培养基制备如下：
1)将5L在DI水中的浓度为550g/kg的葡萄糖浆(VWR，产品号97061-170)高压灭菌。
2)在3946mL的DI水中将以下各项高压灭菌：
20g(NH4)2HPO4(VWR，产品号97061-932)。
66.5g KH2PO4(VWR，产品号97062-348)。
22.5g H3C6H5O7(VWR，产品号BDH9228-2.5KG)。
8.85g MgSO4.7H2O(VWR，产品号97062-134)。
10mL的1000x微量金属制剂(表3)。
在高压灭菌后，添加
118g的(1)至(2)
5mL的25mg/mL卡那霉素硫酸盐(Kanamycin Sulfate)(VWR-V0408)
使用28％NH4OH(VWR，产品号BDH3022)以调节pH至6.1。
表3.痕量金属制剂
七水硫酸亚铁,27.8g/L(Spectrum,7782-63-0)
七水硫酸锌,2.88g/L(Spectrum,7446-20-0)
二水氯化钙,2.94g/L(Spectrum,2971347)
二水钼酸钠,0.48g/L(Spectrum,10102-40-6)
四水氯化锰,1.26g/L(Spectrum,13446-34-9)
亚硒酸钠,0.35g/L(Spectrum,10102-18-8)
硼酸,0.12g/L(Spectrum,10043-35-3
在25℃至28℃的不同温度下进行发酵。对于某些发酵，将发酵温度保持在恒定温度。对于其他发酵，将发酵温度维持期望的时间段，并且当细胞密度OD 600达到10-20时，降低温度以诱导蛋白质产生。通常，将温度从28℃降低到25℃；在25℃下继续发酵40-60小时。
在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的非天然存在的截短的弹性蛋白，在对照菌株中没有条带的位置观察到预期大小为25千道尔顿的清晰条带。
表2. 21kDa截短的人弹性蛋白
根据实施例1的方法合成非天然存在的截短的人弹性蛋白。
相对于全长人弹性蛋白(SEQ ID NO:20)在N-末端截短的21kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO:8中。21kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白具有从全长人弹性蛋白(SEQ ID NO:20)中缺失的氨基酸1-522。
GPGGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK(SEQ ID NO:8)
编码21kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列公开于SEQ ID NO:9中。
GGTCCGGGCGGTGTCGCAGCAGCAGCTAAAAGCGCGGCGAAAGTTGCGGCCAAAGCCCAACTGCGCGCCGCCGCGGGCCTCGGTGCAGGTATTCCGGGGCTGGGTGTCGGAGTTGGAGTCCCGGGTTTGGGCGTGGGCGCGGGAGTTCCGGGACTGGGAGTGGGTGCCGGAGTTCCTGGCTTTGGTGCAGGCGCAGATGAAGGTGTTCGTCGTAGCCTGAGTCCGGAACTGCGTGAAGGTGATCCGAGTAGCAGCCAGCATCTGCCGAGCACCCCGAGCAGCCCGCGTGTTCCGGGTGCATTAGCTGCAGCAAAAGCCGCCAAGTATGGTGCAGCCGTGCCGGGCGTCTTAGGTGGTCTGGGCGCCCTGGGTGGTGTAGGCATTCCGGGAGGTGTTGTGGGTGCAGGACCGGCCGCCGCAGCTGCGGCCGCCAAAGCAGCTGCAAAAGCGGCCCAGTTTGGTTTAGTGGGCGCCGCAGGTTTAGGCGGTTTAGGTGTGGGTGGACTGGGTGTACCTGGCGTAGGCGGTCTGGGTGGAATTCCGCCCGCAGCGGCCGCGAAAGCGGCAAAATATGGCGCGGCAGGCCTGGGCGGCGTGCTGGGTGGGGCAGGTCAGTTTCCGCTGGGCGGGGTTGCCGCACGTCCGGGATTTGGTCTGAGCCCGATTTTCCCTGGCGGCGCATGTCTGGGTAAAGCATGTGGTCGTAAACGTAAATAA(SEQ ID NO:9)
如实施例1中所公开的，培养细胞并表达SEQ ID NO:9的多核苷酸。
实施例3. 60kDa截短的人弹性蛋白
相对于全长人弹性蛋白(SEQ ID NO:20)内部截短的60.3kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO:10中。60.3kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白具有从全长人弹性蛋白(SEQ ID NO:20)中缺失的氨基酸461-527。
GGVPGAIPGGVPGGVFYPGAGLGALGGGALGPGGKPLKPVPGGLAGAGLGAGLGAFPAVTFPGALVPGGVADAAAAYKAAKAGAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPEAAAKAAAKAAKYGARPGVGVGGIPTYGVGAGGFPGFGVGVGGIPGVAGVPGVGGVPGVGGVPGVGISPEAQAAAAAKAAKYGAAGAGVLGGLVPGPQAAVPGVPGTGGVPGVGTPAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGIPGLGVGVGVPGLGVGAGVPGLGVGAGVPGFGAGADEGVRRSLSPELREGDPSSSQHLPSTPSSPRVPGALAAAKAAKYGAAVPGVLGGLGALGGVGIPGGVVGAGPAAAAAAAKAAAKAAQFGLVGAAGLGGLGVGGLGVPGVGGLGGIPPAAAAKAAKYGAAGLGGVLGGAGQFPLGGVAARPGFGLSPIFPGGACLGKACGRKRK(SEQ ID NO:10)
编码60.3kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的密码子优化的多核苷酸序列公开于SEQ ID NO:11中。
GGTGGCGTACCAGGCGCAATTCCTGGGGGTGTCCCAGGCGGTGTTTTTTATCCGGGCGCCGGTCTTGGCGCACTGGGTGGCGGTGCACTGGGCCCGGGCGGCAAACCGCTGAAACCGGTACCAGGTGGTTTAGCAGGCGCCGGCTTAGGCGCAGGTCTGGGAGCATTTCCGGCAGTTACCTTTCCAGGGGCACTGGTTCCTGGAGGTGTGGCCGATGCAGCCGCGGCATATAAAGCCGCTAAAGCCGGTGCGGGTTTAGGAGGCGTCCCAGGTGTCGGTGGCCTGGGTGTTAGCGCCGGTGCAGTTGTTCCGCAGCCGGGAGCAGGGGTTAAACCTGGTAAAGTGCCGGGAGTAGGTCTGCCAGGCGTTTATCCTGGTGGTGTTTTGCCGGGTGCCCGTTTTCCGGGCGTTGGTGTTCTTCCAGGCGTGCCGACCGGAGCCGGTGTTAAACCGAAAGCCCCCGGTGTTGGAGGTGCATTTGCAGGCATCCCGGGAGTTGGCCCGTTTGGTGGTCCGCAACCTGGGGTTCCGTTAGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCCGGCGGTTATGGTCTGCCGTACACAACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCGGGTGGAGTTGCGGGTGCAGCAGGTAAAGCGGGTTATCCTACCGGAACCGGTGTAGGTCCGCAGGCCGCTGCTGCCGCCGCCGCAAAAGCAGCGGCTAAATTTGGCGCCGGAGCAGCGGGTGTTCTGCCTGGAGTTGGTGGTGCGGGCGTGCCAGGGGTACCTGGTGCAATTCCGGGTATTGGTGGTATTGCCGGTGTCGGCACCCCGGCCGCGGCAGCTGCGGCAGCGGCGGCTGCCAAAGCTGCTAAATACGGTGCCGCGGCGGGTCTGGTGCCAGGAGGTCCGGGTTTTGGTCCGGGAGTGGTTGGCGTGCCTGGCGCAGGCGTTCCTGGTGTGGGCGTTCCAGGTGCAGGGATTCCTGTTGTGCCTGGTGCCGGTATTCCCGGCGCGGCCGTTCCGGGGGTGGTTAGCCCGGAAGCCGCAGCGAAGGCTGCGGCAAAGGCAGCAAAGTATGGCGCACGCCCAGGAGTCGGCGTGGGTGGTATCCCGACCTATGGGGTGGGCGCAGGGGGTTTTCCTGGTTTCGGCGTAGGTGTAGGAGGTATACCGGGCGTGGCCGGTGTACCAGGGGTTGGTGGCGTCCCTGGTGTTGGCGGTGTGCCAGGTGTTGGTATTTCACCGGAAGCACAGGCAGCAGCCGCAGCTAAGGCAGCGAAATATGGTGCCGCCGGCGCAGGAGTTTTAGGTGGGCTGGTTCCGGGCCCGCAGGCAGCTGTGCCGGGGGTTCCAGGCACCGGTGGTGTCCCTGGAGTCGGTACGCCGGCAGCAGCAGCTAAAAGCGCGGCGAAAGTTGCGGCCAAAGCCCAACTGCGCGCCGCCGCGGGCCTCGGTGCAGGTATTCCGGGGCTGGGTGTCGGAGTTGGAGTCCCGGGTTTGGGCGTGGGCGCGGGAGTTCCGGGACTGGGAGTGGGTGCCGGAGTTCCTGGCTTTGGTGCAGGCGCAGATGAAGGTGTTCGTCGTAGCCTGAGTCCGGAACTGCGTGAAGGTGATCCGAGTAGCAGCCAGCATCTGCCGAGCACCCCGAGCAGCCCGCGTGTTCCGGGTGCATTAGCTGCAGCAAAAGCCGCCAAGTATGGTGCAGCCGTGCCGGGCGTCTTAGGTGGTCTGGGCGCCCTGGGTGGTGTAGGCATTCCGGGAGGTGTTGTGGGTGCAGGACCGGCCGCCGCAGCTGCGGCCGCCAAAGCAGCTGCAAAAGCGGCCCAGTTTGGTTTAGTGGGCGCCGCAGGTTTAGGCGGTTTAGGTGTGGGTGGACTGGGTGTACCTGGCGTAGGCGGTCTGGGTGGAATTCCGCCCGCAGCGGCCGCGAAAGCGGCAAAATATGGCGCGGCAGGCCTGGGCGGCGTGCTGGGTGGGGCAGGTCAGTTTCCGCTGGGCGGGGTTGCCGCACGTCCGGGATTTGGTCTGAGCCCGATTTTCCCTGGCGGCGCATGTCTGGGTAAAGCATGTGGTCGTAAACGTAAATAA(SEQ ID NO:11)
如实施例1中公开的，培养细胞并表达SEQ ID NO:11的多核苷酸。
实施例4.截短的弹性蛋白对成纤维细胞活力、原胶原合成和原弹性蛋白合成的影 响
人成纤维细胞培养物用于评估实施例1的非天然存在的截短的人弹性蛋白分子影响原胶原和原弹性蛋白合成的能力。人成纤维细胞培养物还用于测定暴露于截短的弹性蛋白后人成纤维细胞的活力。
由实施例1的截短的弹性蛋白制备2％w/w截短的弹性蛋白的原液。然后将来自2％截短的弹性蛋白原液的等分试样用于下述实验中。
成纤维细胞的制备
将成纤维细胞接种到24孔板的各个孔中的0.5mL成纤维细胞生长培养基(FGM)中，并在37±2℃和5±1％CO2下培育过夜。第二天，通过抽吸去除培养基以消除任何非黏附细胞，并替换为0.5mL新鲜的FGM。细胞生长直至铺满，每48至72小时替换一次培养基。在铺满后，将细胞用其中补充有1.5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)处理24小时，以洗除正常培养基中包含的生长因子的任何影响。在24小时清洗期后，将细胞用溶解在含有1.5％FBS的FGM中的特定浓度的截短的弹性蛋白处理。转化生长因子β(TGF-β)(20ng/mL)用作胶原和弹性蛋白合成的阳性对照。未经处理的细胞(阴性对照)仅接受含有1.5％FBS的DMEM。将细胞培育48小时并且在培育期结束时，收集细胞培养基，并冷冻储存(-75℃)或立即进行分析。将材料一式三份进行测试。
MTT测定
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，一种四唑)测定是用于测定细胞代谢活性的比色测定。通过MTT测定评估细胞数量的变化。当细胞暴露于MTT时，活细胞中线粒体对MTT的减少导致形成不溶性的紫色福尔马肼(formazin)晶体，所述晶体用异丙醇从细胞中提取并通过分光光度法定量。非活细胞不能减少MTT，因此不能产生紫色福尔马肼晶体。紫色的强度与活细胞(代谢活性细胞)的数量成正比。紫色的强度与细胞的代谢活性成正比，与测试材料的毒性成反比。
在上文所述的2天培育之后，除去细胞培养基(见上文)，并将成纤维细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次以除去任何剩余的弹性蛋白分子。最后一次洗涤后，将500μL补充有0.5mg/ml MTT的DMEM添加到每个孔中，并将细胞在37±2℃和5±1％CO2下培育1小时。培育后，去除DMEM/MTT溶液，再次用PBS洗涤细胞一次，然后向孔中加入0.5mL异丙醇以提取紫色福尔马肼晶体。将200微升异丙基提取物转移到96孔板中，板在540nm处读数，使用异丙醇作为空白对照。
计算阴性对照细胞的平均MTT吸光度值并用于表示100％细胞活力。然后将来自经历各种处理的细胞的各个MTT吸光度值除以阴性对照细胞的平均值并表示为百分比，以确定每次处理引起的细胞活力的变化。
原胶原合成
成纤维细胞是细胞外基质肽的主要来源，包括结构蛋白胶原和弹性蛋白。原胶原是皮肤真皮层中的成纤维细胞合成的一种大肽，是胶原的前体。当肽被加工形成成熟的胶原蛋白时，前肽部分被切掉(I型C-肽)。成熟的胶原蛋白和I型C-肽片段随后被释放到细胞外环境中。随着胶原的合成，I型C-肽片段积累到组织培养基中。由于原胶原肽的两部分之间的化学计量比为1:1，因此I型C-肽的测定反映了合成的胶原的量。I型C-肽可以通过基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法进行测定。
制备0ng/mL至640ng/mL的一系列I型C-肽标准品。接下来，通过以下步骤制备ELISA微孔板：从板框上去除任何不需要的条带，然后将100μL过氧化物酶标记的抗原胶原I-C型肽抗体添加到测定中使用的每个孔中。然后将二十(20)μL样品(收集的组织培养基)或标准品加入适当的孔中，盖上微孔板并使其在37℃下培育3±0.25小时。培育后，将孔抽吸并用400μL洗涤缓冲液洗涤3次。去除最后一次洗涤液后，每孔加入100μL过氧化物酶底物溶液(过氧化氢+四甲基联苯胺作为色原(chromagen))，在室温下将板培育15±5分钟。培育后，将100μL终止溶液(1N硫酸)添加到每个孔中，并且板使用酶标仪在450nm处读数。
为了量化存在的每种物质的量，使用已知浓度的每种物质产生标准曲线。进行回归分析以建立最佳拟合这些数据点的线。测试材料和未处理样品的吸光度值用于估计每个样品中存在的每种物质的量。
弹性蛋白合成
弹性蛋白是弹性纤维网络的主要成分，其赋予组织在短暂拉伸后回弹的能力。这种蛋白质由成纤维细胞(可溶性弹性蛋白)释放到细胞外空间，然后在该空间与其他弹性蛋白交联形成广泛的纤维和片层(不溶性弹性蛋白)网络。通过基于ELISA的方法可以很容易地从细胞培养基中测量可溶性弹性蛋白。
可溶性α-弹性蛋白以1.25μg/mL的浓度溶解在0.1M碳酸钠(pH 9.0)中。然后将150μL该溶液加入96孔Maxisorp Nunc板的孔中，并将该板在4℃下培育过夜。第二天，用含有0.25％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween 20的PBS充满孔。然后将板与该封闭液在37℃下培育1小时，然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤两次。
制备0至100ng/mL的一组α-弹性蛋白标准品。然后将180μL标准品或截短的弹性蛋白转移到650μL微量离心管中。制备抗弹性蛋白抗体溶液(抗体在含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS中以1:100稀释)，并将20μL溶液加入管中。然后将管在4±2℃下培育过夜。第二天，从每个管转移150μL到96孔弹性蛋白ELISA板，并将板在室温下培育1小时。然后将板用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次。洗涤后，加入200μL在含有0.25％BSA和0.05％Tween 20的PBS中稀释的含有过氧化物酶偶联的二抗的溶液，并将板室温下培育1小时。将板洗涤3次后，加入200μL底物溶液，并将板在室温下避光培育10至30分钟。在最后的培育之后，板使用读板器在460nm处读数。
实施例5.截短的弹性蛋白对角质形成细胞增殖和UVB保护的影响
人角质形成细胞细胞培养模型用于评估测试材料对细胞增殖产生影响的能力。此外，还评估了测试材料对暴露于UVB后细胞活力的影响。
由实施例1的截短的弹性蛋白制备2％w/w截短的弹性蛋白的原液。然后将来自2％截短的弹性蛋白原液的等分试样用于下述实验中。
该研究分两部分进行。在第一部分中，培养的角质形成细胞与测试材料一起培育48小时，之后，使用MTT测定评估活细胞数量的变化。在研究的第二部分，培养的角质形成细胞用UVB辐照，然后用测试材料处理48小时。在48小时结束时，再次通过MTT测定评估活细胞的数量。
可以使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，一种四唑)测定来确定活细胞的细胞数量的变化。MTT测定是对细胞代谢活性的比色分析，是活细胞数量的反映。活细胞中线粒体对MTT的减少导致形成不溶性紫色福尔马肼晶体，所述晶体用异丙醇从细胞中提取并通过分光光度法定量。紫色的强度与代谢活细胞的数量成正比。
增殖测定
对于增殖测定，将角质形成细胞接种到不含生长因子的96孔板中，并在37±2℃和5±1％CO2下培育24小时。初始培育后，将培养基替换为补充有测试材料的培养基。正常培养基(含有生长因子)用作阳性对照。加入测试材料后，将细胞培养48小时，如上文所述。在培育期结束时，使用MTT测定确定活细胞数量的变化。
UVB保护测试
对于UVB保护测定，使用正常培养基将角质形成细胞接种到96孔板中，并在37±2℃和5±1％CO2下培育24小时。在该初始培育后，将培养基替换为100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将细胞暴露于UVB(40mJ/cm2)。UVB暴露后，用补充有测试材料的新鲜培养基替换PBS(100μg/mL的抗坏血酸作为阳性对照)，细胞在37±2℃和5±1％CO2下培养48小时。在48小时培育结束时，使用MTT测定确定细胞活力。
实施例6.截短的弹性蛋白对胸腺嘧啶二聚体形成的影响
在暴露于紫外线辐射后，细胞中存在的DNA中的胸腺嘧啶二聚体(TT二聚体)含量增加。TT二聚体形成的增加与皮肤损伤和某些类型的细胞增殖性疾病(包括皮肤癌)相关。
测试实施例1的截短的弹性蛋白以确定它是否可以减少人表皮角质形成细胞中TT二聚体的形成。将人角质形成细胞接种到使用正常培养基的12孔板中，并在37±2℃和5±1％CO2下培育24小时。初始培育后，将培养基替换为100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并使细胞暴露于UVB(25mJ/cm2)。UVB暴露后，将PBS替换为补充有测试材料或Trolox(100μLg/ml，阳性对照)的新鲜培养基，并将细胞在37±2℃和5±1％CO2下培养过夜。在培育结束时，提取细胞DNA并使用基于ELISA的方法测定胸腺嘧啶二聚体含量。
过夜培育后，从孔中移除细胞培养基，并替换为200μL PBS和20μL蛋白酶K。在旋转板以混合PBS和蛋白酶K后，将200μL缓冲液AL加入每个孔。再次旋转板以混合试剂后，将板在55±2℃下培育10分钟。将板冷却至室温后，通过添加200μL 100％乙醇沉淀DNA。然后将沉淀的DNA混合物转移到2mL收集管中的DNEasy离心柱(DNEasy Spin Column)，并以8,000RPM离心1分钟。弃去流通管和收集管，并将500μL洗涤缓冲液一加入离心柱中，将柱放入新的收集管中，以8,000RPM离心1分钟。再次弃去流通管和收集管，将500μL洗涤缓冲液二加入离心柱，并将柱放入新的收集管中，并以14,000RPM离心3分钟。然后将离心柱放入新的1.5mL离心管中，并向柱中加入110μL超纯水。将柱在室温下培育1分钟，然后以8,000RPM离心1分钟。
提取的DNA通过荧光测定法定量。在96孔板中，将2μL等分的DNA样品与100μLTris-EDTA(TE)缓冲液混合。一系列DNA标准品也被转移到96孔板的孔中(一式两份)。最后，每孔加入100μL稀释的CyQUANT Green染料，使用480nm激发波长和520nm发射波长测定每孔的荧光强度。
胸腺嘧啶二聚体检测可以使用OxiSelectTM UV-诱导的DNA损伤ELISA试剂盒(OxiSelectTM UV-Induced DNA Damage ELISA Kit)来测定。
通过使样品在95℃下培育10分钟，然后在冰上冷却，将基因组DNA样品或标准品的等分试样转化为单链DNA。将100μL各样品或标准品转移至DNA结合ELISA板，并在4℃下培育过夜。第二天，将孔用100μL PBS冲洗一次，然后用150μL分析稀释剂在室温下封闭1小时。移除分析稀释剂(Assay Diluent)后，每孔加入100μL抗CPD抗体，并将板在室温下培育1小时。培育后，每孔用250μL洗涤缓冲液洗涤板3次，然后将150μL封闭剂加入板中。将板在室温下再次封闭1小时，然后如前所述洗涤3次。然后，每孔加入100μL二抗，并将板在室温下培育1小时。再次洗涤板后，每孔加入100μL底物，将板培育5-20分钟以在板中产生颜色。通过加入100μL终止溶液终止显色反应，并且板使用读板器在460nm处读数。
为了量化存在的DNA的量，使用已知浓度的DNA及其各自的荧光强度(以RFU或相对荧光单位测量)生成标准曲线。进行回归分析以建立最佳拟合这些数据点的线。然后使用每个未知样品的相对荧光单位(RFU)来估计DNA的量。
使用具有已知量的胸腺嘧啶二聚体含量的一系列DNA标准品来生成标准曲线。该标准曲线用于确定样品DNA中的DNA损伤量。使用方差分析(ANOVA)计算并比较每个处理组的平均值。
实施例7.截短的人弹性蛋白对成纤维细胞的保护作用
根据实施例4的方法测定非天然存在的截短的人弹性蛋白对成纤维细胞活力、原胶原合成和弹性蛋白合成的影响。
根据实施例5的方法测定非天然存在的截短的人弹性蛋白对角质形成细胞增殖和UVB保护的影响。
根据实施例6的方法测定非天然存在的截短的人胶原在暴露于UV辐射后对胸腺嘧啶二聚体形成的影响。
实施例8.截短的弹性蛋白对炎性细胞因子的影响
角质形成细胞和真皮成纤维细胞在皮肤的免疫反应中起重要作用。为响应刺激性化学物质或紫外线辐射(促炎性/促刺激性刺激)，角质形成细胞可以释放大量细胞因子。这些细胞因子被认为有助于使免疫细胞接触炎症部位。角质形成细胞释放的细胞因子包括TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-18和IL-1RA。
用于该研究的测试模型是MatTek EpiDerm。该皮肤模型由正常人源性表皮角质形成细胞组成，这些细胞已经被培养形成多层、高度分化的人表皮模型。超微结构分析显示存在角质透明蛋白粒、张力丝束、桥粒和多层角质层，其中包含以体内表皮特征的模式排列的细胞间层状脂质层。成熟表皮特异性分化的标志物(例如丝聚合蛋白原、K1/K10细胞角蛋白对、外皮蛋白和I型表皮转谷氨酰胺酶)已在该模型中定位。MatTek EpiDerm还具有有丝分裂和代谢活性。
MatTek EpiDerm组织用于评估各种测试材料对于抑制炎性介质IL-1α释放的能力。将测试材料与非处方外用氢化可的松制剂(阳性对照)以及未处理的组织(阴性对照1)和未处理的非发炎组织(阴性对照2)进行比较。该测试还用于评估暴露于测试材料后组织的活力。
合成IL-1α、IL-6和IL-8并将其储存在角质形成细胞中，并且已被鉴定为皮肤刺激和炎症的介质。这些细胞因子的释放可以通过基于比色法的酶联免疫吸附测定(ELISA)在组织培养基中直接测量。简而言之，与固体支持物共价连接的抗体可以结合废培养基样品中存在的IL-1α、IL-6或IL-8。与乙酰胆碱酯酶共价连接的二抗可以进而检测特异性结合的细胞因子。在加入合适的有色底物后，乙酰胆碱酯酶可产生可通过分光光度法测量的有色终产物。
MatTek EpiDerm组织购自MatTek公司并储存在4℃下直至使用。使用前，将待使用的组织从琼脂糖运输托盘中取出并放入含有0.9mL不含氢化可的松的测定培养基(37±2℃)的6孔板中。使组织在37±2℃和5±1％CO2下培育过夜。在初始培育后，将测定培养基替换为0.9mL新鲜不含氢化可的松的培养基(37±2℃)。为每种测试材料制备三个组织。
组织的炎性反应通过紫外线照射(UVB)引发。紫外线灯用于向组织提供300mJ/cm2剂量的UVB辐射。在施加炎性刺激后，立即将50μL或mg的测试材料直接施加到组织表面。非处方氢化可的松乳膏用作阳性对照。对于阴性对照，组织暴露于炎性刺激但未用任何类型的抗炎材料处理。将一组额外的组织不暴露于炎性刺激，以提供细胞因子的基线测量。将组织在暴露于炎性刺激后在37±2℃和5±1％CO2下培育24小时。24小时培育后，收集细胞培养基并储存在-75℃下，直至分析细胞因子。
通过在PBS中稀释合适的捕获抗体来制备ELISA板。接下来，将100μL稀释的捕获抗体添加到96孔ELISA板的孔中，并将该板在室温下培育过夜。第二天，将板用300μL洗涤缓冲液(0.05％Tween 20于PBS中)洗涤3次，然后通过向每孔中加入300μL封闭缓冲液(1％BSA于PBS中)进行封闭。使用封闭缓冲液培育板至少1小时。培育后，移除封闭缓冲液，如上所述将板洗涤3次。
制备一系列标准品，并将这些标准品中的各100μL分配到适当的96孔板中的两个孔中(重复)。随后，将100μL的每个样品加入另外的孔中，并将板在室温下培育2小时。培育后，如上所述将板洗涤3次。移除最后一次洗涤液后，加入100μL生物素偶联检测抗体。板在室温下培育两小时后，如上所述再次洗涤板。然后将100μL HRP-链霉亲和素加入每个孔中，并将板在室温下培育20分钟。接下来，每孔加入100μL底物溶液(过氧化氢+四甲基联苯胺作为色原)。一旦发生足够的显色，将50μL终止溶液(2N硫酸)加入每个孔中，并且板在460nm处读数。
在24小时培育后，将组织用至少100μL磷酸盐缓冲盐水冲洗两次以去除测试材料，然后转移至含有1.0mL补充有MTT(1mg/mL)的测定培养基的6孔板中，并使其在37±2℃和5±1％CO2下培育3±0.25小时。培育后，将组织用100μL磷酸盐缓冲盐水冲洗至少两次，抹干，然后放入每孔含有2mL异丙醇的24孔板中。将24孔板盖上，并使其在室温下在摇摆平台上培育至少2小时，以从组织中提取还原的MTT。提取后，将200μL异丙醇/MTT混合物样品转移到96孔板中，使用酶标仪在540nm处读取样品的吸光度，使用200μL异丙醇作为空白对照。
实施例9.截短的弹性蛋白的城市灰尘保护
角质形成细胞培养模型用于评估截短的弹性蛋白通过在暴露于城市灰尘后促进细胞存活来发挥保护作用的能力。
人表皮角质形成细胞用测试材料预处理，然后暴露于城市灰尘。在处理期结束时，通过MTT测定确定细胞活力的变化。
将角质形成细胞接种到96孔板的各个孔的100μL培养基中，并在37±2℃和5±1％CO2下培育过夜。第二天，通过抽吸去除培养基以消除任何非黏附细胞，并替换为100μL新鲜培养基。细胞生长直至铺满，每48至72小时更换一次培养基。
用测试材料进行预处理，然后进行城市灰尘处理
测试材料在细胞培养基中以其最终所需浓度的2倍制备。城市灰尘(NIST 1649B，购自Sigma Chemicals)也以2倍溶液制备。对于预处理，将50μL 2倍测试材料与50μL培养基混合，并将细胞培育24小时。在预处理期结束时，移除含有培养基的测试材料，并替换为50μL 2倍城市灰尘和50μL培养基。另一组细胞仅用培养基处理(无粉尘暴露)，并用作参考对照以代表100％的细胞活力。然后将细胞培育24小时，然后进行MTT测定以确定细胞活力的变化。
在处理期结束时，移除细胞培养基，并用PBS洗涤细胞。洗涤后，向每孔中加入100μL补充有0.5mg/mL MTT的细胞培养基，并将细胞在37±2℃和5±1％CO2下培育30分钟。培育后，移除培养基/MTT溶液，再次用PBS洗涤细胞一次，然后向孔中加入100μL异丙醇以提取紫色福尔马肼晶体。然后96孔板在540nm处读数，使用异丙醇作为空白对照。
计算未暴露于灰尘的细胞的平均MTT吸光度值，并用于表示细胞数的100％值。然后，来自经受各种处理的细胞的各MTT值除以未暴露于灰尘的细胞的平均值，并以百分比表示，以确定由每个处理导致的细胞数变化。
实施例10. 23kDa截短的人弹性蛋白
下文公开了一种不含His标签、接头和凝血酶切割位点的非天然存在的截短的人弹性蛋白。下文公开了编码该截短的弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列。在SEQ ID NO:12中，DsbA分泌标签由SEQ ID NO:13的核苷酸1-57编码，并且编码SEQ IDNO:13的氨基酸1-19。在SEQ ID NO:12中，截短的弹性蛋白序列由SEQ ID NO:13的核苷酸58-843编码并编码SEQ ID NO：13的氨基酸20-281。
编码这种非天然存在的截短的弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ IDNO:12中提供。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCCGGTCTGGGTGGCGTGCCTGGCGTTGGTGGCCTGGGCGTTAGCGCCGGTGCAGTTGTTCCGCAGCCTGGTGCGGGTGTTAAACCGGGTAAAGTTCCTGGTGTTGGTCTGCCTGGTGTTTATCCAGGCGGTGTTCTGCCAGGTGCGCGTTTTCCTGGCGTGGGTGTTCTGCCGGGTGTTCCGACCGGTGCAGGCGTGAAACCGAAAGCACCAGGTGTTGGTGGTGCATTTGCAGGTATTCCAGGTGTGGGTCCGTTTGGTGGTCCGCAGCCAGGCGTTCCGCTGGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCTGGCGGTTATGGTCTGCCGTATACCACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCTGGCGGTGTTGCCGGTGCGGCAGGTAAAGCAGGCTATCCGACCGGTACCGGTGTAGGTCCGCAGGCAGCAGCCGCAGCAGCGGCAAAAGCAGCAGCGAAATTTGGTGCGGGTGCAGCCGGTGTGCTGCCAGGCGTAGGTGGCGCTGGTGTACCTGGTGTCCCTGGCGCAATTCCAGGTATTGGCGGTATTGCAGGCGTTGGTACTCCGGCAGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCCGCAGCTAAAGCAGCCAAATATGGTGCAGCGGCAGGCCTGGTTCCTGGCGGTCCAGGTTTTGGTCCGGGTGTTGTTGGCGTCCCAGGTGCCGGTGTGCCTGGTGTGGGTGTTCCAGGTGCGGGTATTCCGGTTGTTCCTGGCGCAGGCATTCCGGGTGCCGCAGTTCCGGGTGTAGTTAGCCCGGAATAA(SEQ ID NO:12)
包括DsbA分泌信号的23kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白序列的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中公开。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPE(SEQ ID NO:13)
编码不含DsbA分泌标签弹性蛋白的非天然存在的截短的人弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:14中提供。
GCCGGTCTGGGTGGCGTGCCTGGCGTTGGTGGCCTGGGCGTTAGCGCCGGTGCAGTTGTTCCGCAGCCTGGTGCGGGTGTTAAACCGGGTAAAGTTCCTGGTGTTGGTCTGCCTGGTGTTTATCCAGGCGGTGTTCTGCCAGGTGCGCGTTTTCCTGGCGTGGGTGTTCTGCCGGGTGTTCCGACCGGTGCAGGCGTGAAACCGAAAGCACCAGGTGTTGGTGGTGCATTTGCAGGTATTCCAGGTGTGGGTCCGTTTGGTGGTCCGCAGCCAGGCGTTCCGCTGGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCTGGCGGTTATGGTCTGCCGTATACCACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCTGGCGGTGTTGCCGGTGCGGCAGGTAAAGCAGGCTATCCGACCGGTACCGGTGTAGGTCCGCAGGCAGCAGCCGCAGCAGCGGCAAAAGCAGCAGCGAAATTTGGTGCGGGTGCAGCCGGTGTGCTGCCAGGCGTAGGTGGCGCTGGTGTACCTGGTGTCCCTGGCGCAATTCCAGGTATTGGCGGTATTGCAGGCGTTGGTACTCCGGCAGCTGCAGCCGCTGCCGCAGCCGCAGCTAAAGCAGCCAAATATGGTGCAGCGGCAGGCCTGGTTCCTGGCGGTCCAGGTTTTGGTCCGGGTGTTGTTGGCGTCCCAGGTGCCGGTGTGCCTGGTGTGGGTGTTCCAGGTGCGGGTATTCCGGTTGTTCCTGGCGCAGGCATTCCGGGTGCCGCAGTTCCGGGTGTAGTTAGCCCGGAATAA(SEQ ID NO:14)
不含DsbA分泌标签的非天然存在的截短的人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ IDNO:15中公开。
AGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQAAAAAAAKAAAKFGAGAAGVLPGVGGAGVPGVPGAIPGIGGIAGVGTPAAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLVPGGPGFGPGVVGVPGAGVPGVGVPGAGIPVVPGAGIPGAAVPGVVSPE(SEQ ID NO:15)
SEQ ID NO:12的多核苷酸通过Twist DNA合成。将pET28载体和SEQ ID NO:12之间的重叠序列设计为20至30bp长，使用PCR通过酶GXL聚合酶(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)来添加。然后，使用In-Fusion克隆(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO:12)一起组装成最终质粒。然后通过Genewiz(www.genewiz.com/en)的Sanger测序验证质粒序列。
将转化的细胞在实施例1的基本培养基中培养，并以50:50的细胞:甘油比冷冻在具有蔬菜甘油的1.5ml等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml基本培养基中于37℃、200rpm下复苏过夜。将细胞转移到300ml基本培养基中，生长6-9小时，以达到OD600为5-10。
在12％BisTris蛋白质凝胶上检测23kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白。凝胶的照片描绘在图1中。通过使用液相色谱-质谱法的完整质谱法确认23kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的质量是正确的。
实施例11. 13kDa截短的人弹性蛋白
下文公开了不含His标签、接头和凝血酶切割位点的非天然存在的截短的人弹性蛋白。下文公开了编码该弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列和氨基酸序列。在SEQ IDNO:16中，DsbA分泌标签由核苷酸1-57编码，并且编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-19。在SEQID NO:16中，截短的弹性蛋白序列由核苷酸58-489编码，并且编码SEQ ID NO:17的氨基酸20-163。
编码该弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO:16中提供。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCCGGTCTGGGTGGCGTGCCTGGCGTTGGTGGCCTGGGCGTTAGCGCCGGTGCAGTTGTTCCGCAGCCTGGTGCGGGTGTTAAACCGGGTAAAGTTCCTGGTGTTGGTCTGCCTGGTGTTTATCCAGGCGGTGTTCTGCCAGGTGCGCGTTTTCCTGGCGTGGGTGTTCTGCCGGGTGTTCCGACCGGTGCAGGCGTGAAACCGAAAGCACCAGGTGTTGGTGGTGCATTTGCAGGTATTCCAGGTGTGGGTCCGTTTGGTGGTCCGCAGCCAGGCGTTCCGCTGGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCTGGCGGTTATGGTCTGCCGTATACCACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCTGGCGGTGTTGCCGGTGCGGCAGGTAAAGCAGGCTATCCGACCGGTACCGGTGTAGGTCCGCAGTAA(SEQ ID NO:16)
包括DsbA分泌信号的13kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白序列的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中公开。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQ(SEQ ID NO:17)
编码不含DsbA分泌标签的非天然存在的截短的人弹性蛋白的密码子优化的核苷酸序列在SEQ ID NO：18中提供。
GCCGGTCTGGGTGGCGTGCCTGGCGTTGGTGGCCTGGGCGTTAGCGCCGGTGCAGTTGTTCCGCAGCCTGGTGCGGGTGTTAAACCGGGTAAAGTTCCTGGTGTTGGTCTGCCTGGTGTTTATCCAGGCGGTGTTCTGCCAGGTGCGCGTTTTCCTGGCGTGGGTGTTCTGCCGGGTGTTCCGACCGGTGCAGGCGTGAAACCGAAAGCACCAGGTGTTGGTGGTGCATTTGCAGGTATTCCAGGTGTGGGTCCGTTTGGTGGTCCGCAGCCAGGCGTTCCGCTGGGTTATCCGATTAAAGCACCGAAACTGCCTGGCGGTTATGGTCTGCCGTATACCACCGGTAAACTGCCGTATGGTTATGGCCCTGGCGGTGTTGCCGGTGCGGCAGGTAAAGCAGGCTATCCGACCGGTACCGGTGTAGGTCCGCAGTAA(SEQ ID NO:18)
没有DsbA分泌标签的非天然存在的截短的人弹性蛋白的氨基酸序列在SEQ IDNO:19中公开。
AGLGGVPGVGGLGVSAGAVVPQPGAGVKPGKVPGVGLPGVYPGGVLPGARFPGVGVLPGVPTGAGVKPKAPGVGGAFAGIPGVGPFGGPQPGVPLGYPIKAPKLPGGYGLPYTTGKLPYGYGPGGVAGAAGKAGYPTGTGVGPQ(SEQ ID NO:19)
通过Twist DNA合成SEQ ID NO：16的多核苷酸。将pET28载体与SEQ ID NO：16之间的重叠序列设计为20至30bp长，并使用PCR通过酶GXL聚合酶(www.takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)来添加。然后使用In-Fusion克隆(www.takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pET28a载体和插入DNA(SEQ ID NO：16)一起组装成最终质粒。然后通过Genewiz(www.genewiz.com/en)的Sanger测序验证质粒序列。
将转化的细胞在基本培养基中培养，并以50:50的细胞:甘油比冷冻在具有蔬菜甘油的1.5ml等分试样中。将一小瓶这种冷冻培养物在50ml基本培养基中于37℃、200rpm下复苏过夜。将细胞转移到300ml基本培养基中，生长6-9小时，以达到OD600为5-10。
在12％BisTris蛋白质凝胶上检测13kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白。凝胶的照片描绘在图1中。通过使用液相色谱-质谱法的完整质谱法确认13kDa非天然存在的截短的人弹性蛋白的质量是正确的。
实施例12. 13kDa非天然存在的截短的弹性蛋白的纯度和均质性
具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽通过SDS-PAGE进行分析以评估纯度和均质性。图2表明具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的多肽在SDS-PAGE蛋白质凝胶上显示为单个条带，表明高纯度和均一性。相比之下，市售的弹性蛋白在蛋白质凝胶上以污斑(smear)形式出现，表明高度异质性。
实施例13.非天然存在的截短的人胶原的体外研究
非天然存在的截短的人弹性蛋白刺激I型胶原蛋白的成纤维细胞产生
成纤维细胞是细胞外基质肽的主要来源，包括结构蛋白胶原和弹性蛋白。评估人原代成纤维细胞的I型胶原分泌。成纤维细胞与SEQ ID NO：19的多肽一起培养48小时。通过ELISA分析培养物上清液中的原胶原I型C-肽，即总分泌的I型胶原蛋白的读数。图3验证了用SEQ ID NO：19的多肽的0.1％w/w溶液(图3，“B”)、0.05％w/w溶液(图3，“C”)和0.025％w/w溶液(图3，“D”)处理的成纤维细胞比未处理的对照成纤维细胞(图3，“A”)分泌更高水平的I型胶原。
非天然存在的截短的人弹性蛋白验证了抗氧化能力
进行氧自由基吸收能力(ORAC)测定以分析根据SEQ ID NO:19的多肽的抗氧化能力。ORAC测定是无细胞测定，其使用荧光读数来测量抗氧化能力。数据以Trolox(维生素E)当量(TE)记录。如图4所示，根据SEQ ID NO:19的多肽的0.0125％w/w溶液(图4，“E”)、0.025％w/w溶液(图4，“D”)、0.05％w/w溶液(图4，“C”)”)、0.1％w/w溶液(图4，“B”)和0.2％w/w溶液(图4，“A”)各自证明了抗氧化特性。例如，根据SEQ ID NO:19的多肽的0.2％w/w溶液表现出与228μM Trolox相当的抗氧化特性。
非天然存在的截短的人弹性蛋白刺激角质形成细胞中的抗氧化基因
将角质形成细胞与单独的培养基或与根据SEQ ID NO:19的多肽的0.03％w/w溶液一起培育24小时。从细胞中提取RNA并通过Clariom微阵列(ThermoFisher)分析总体基因表达。图5证明了与未处理的细胞(图5，“A”)相比，多个抗氧化基因(包括SOD2、GPX2、GPX4、GSTK1、GSTZ1、GSTA4、GSTM2、CCS、GPX1、GLRX、PRDX5、PRDX6和PRDX2)在用根据SEQ ID NO:19的多肽处理的角质形成细胞中被上调(图5，“B”)。
非天然存在的截短的人弹性蛋白降低角质形成细胞中凋亡基因的表达
将角质形成细胞与单独的培养基(未处理的)或与根据SEQ ID NO:19的多肽的0.03％w/w溶液一起培育24小时。从细胞中提取RNA并通过Clariom微阵列(ThermoFisher)分析总体基因表达。图6证明了与未处理的细胞(图6，“A”)相比，多个促凋亡基因(包括APAF1、BAK1、CASP7、CASP8、FADD、MCL1和MET)在用根据SEQ ID NO：19的多肽处理的角质形成细胞中被下调(图6，“B”)。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将会暗示本领域技术人员根据其进行的各种修改或改变，并且将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (23)

1.一种非天然存在的多肽，所述非天然存在的多肽由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成。
2.一种组合物，其包含0.001％至5％w/w的根据权利要求1所述的非天然存在的多肽。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物表现出一种或多种选自以下的特性：刺激成纤维细胞的生长、增加成纤维细胞或角质形成细胞的活力、刺激原弹性蛋白的合成、刺激原胶原的合成、刺激一个或多个抗氧化基因的表达、降低一个或多个促凋亡基因的表达、减少一种或多种炎性细胞因子的产生、减少胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(TT)二聚体的形成及其任何组合。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物被配制用于局部应用。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物包含局部载体、防腐剂或两者。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述局部载体选自水、油甘油聚醚-8酯、甘油、椰子烷烃、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、戊二醇、乙二胺四乙酸(EDTA)二钠、辛甘醇、氯苯甘醚、苯氧乙醇、脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾剂、气雾剂、粉化粉剂、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、单硬脂酸甘油酯、醇、乳化剂、液体石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇、环甲硅油、环戊硅氧烷及其任何组合。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述防腐剂选自：生育酚、二碘甲基-对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、迷迭香提取物、EDTA及其任何组合。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物为化妆品。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中将所述组合物配制为用于施用至皮肤的个人护理产品。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述个人护理产品选自：面膜、皮肤清洁剂、肥皂、清洁霜、清洁洗剂、洁面剂、清洁乳、清洁垫、洗面奶、面部乳霜、身体乳霜、保湿剂、面部精华、面膜、身体膜、爽肤水、面部喷雾、眼霜、眼部护理剂和去角质配方。
11.根据权利要求2所述的组合物，其中将所述组合物配制为用于施用至毛发的个人护理产品。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述个人护理产品选自：洗发水、护发素、毛发精华、头皮精华、发雾和毛发喷雾。
13.一种向受试者的皮肤提供美容益处的方法，所述方法包括向受试者的皮肤施用权利要求2-10中任一项所述的组合物，从而向受试者的皮肤提供美容益处。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述美容益处是改善受试者的皮肤外观、保护受试者的皮肤或两者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述改善受试者的皮肤外观选自：增加皮肤的紧致度、增加皮肤的弹性、增加皮肤的水合度、增加皮肤的触觉质感、增加皮肤的或视觉质感，及其任何组合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述保护受试者的皮肤选自：减少皮肤损伤、促进受损皮肤修复、保护皮肤免受紫外线(UV)损伤、增加皮肤细胞的活力、保护皮肤细胞免受城市灰尘暴露的影响，及其任何组合。
17.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1所述的非天然存在的多肽的核酸序列。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在载体中。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码分泌标签、组氨酸标签和蛋白酶切割位点中的一种或多种的核酸序列。
20.根据权利要求17或权利要求18所述的多核苷酸，其中所述编码所述非天然存在的多肽的核酸序列经过密码子优化以在宿主细胞中表达。
21.一种重组细胞，其包含编码权利要求1所述的非天然存在的多肽的异源核酸序列的至少一个拷贝。
22.根据权利要求21所述的重组细胞，其中所述重组细胞是微生物细胞。
23.根据权利要求22所述的重组细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
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