CN1261104A - 一种人氧化还原酶亚基及其编码序列,以及制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q氧化还原酶14千道尔顿亚基(NADH:ubiquinone oxidoreductase 14 kDa subunit,简称为“NADH－CoQ 14 kDa亚基”)的cDNA序列,该序列编码的蛋白是牛NADH－CoQB14.5b亚基的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

Description

一种人氧化还原酶亚基及其编码序列，以及制法和用途

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q氧化还原酶14千道尔顿亚基(NADH：ubiquinone oxidoreductase 14 kDa subunit，简称为“NADH-CoQ 14 kDa亚基”)的cDNA序列，该蛋白是牛NADH-CoQ B14.5b亚基的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

线粒体NADH：泛醌氧化还原酶(NADH：ubiquinone oxidoreductase)(也称为“复合物I”)是一个多亚基的蛋白酶复合物。它位于线粒体内膜，是线粒体氧化磷酸化电子转移链的第一步。它接受来源于NADH的电子，并通过一系列的电子载体将之转移到泛醌(辅酶Q10)上。复合物I内部的电子载体则包括FMN和6个铁-硫簇(N-1a，1b，2-5)(Ohnishi，T.et al.，Mitochondrial iron-sulfur flavohydrogenases.In：Capaldi，R.A.：Menbrane Proteins in Energy Transduction.New York：Dekker(pub.)，1979；Ragan，C.I.et al.Structure of NADH-ubiquinone oxidoreductasereductase(Complex I).Curr.Top.Bioenerg.15：1，1987)。复合物I可以被分为3个主要部分：黄素蛋白部分，铁硫蛋白部分，疏水蛋白部分。

黄素蛋白部分部分包括了黄素单核苷酸(FMN)、6个铁离子以及3条分别为51、24、10kDa的多肽(Galante，Y.M.et al.Arch.Biochem.Biophys.192：559-568，1979；Ragan，C.I.et al.Biochemstry，21：2518-2524，1982)。其中NADH结合位点和FMN位于51Kda的多肽上(Chen，S.&Guillory，R.J.J.Biochem.Chem.256：8318-8323，1981)。铁硫蛋白部分包括了9或10个铁离子(Ragan，C.I.et al.Biochemstry，21：2518-2524，1982)和一个15KDa的蛋白，后者的作用似乎是与泛醌(即辅酶Q)结合并把电子传递给泛醌(Suzuki，H & Ozawa，T.，Biochem.Biophys.Res.Commu.138：1237-1242)，MTND6蛋白也可能位于这一部分(Chomyn，A.et al.Science，234：614，1986)。疏水蛋白部分则包含了铁硫中心，它们被认为很可能是辅酶Q的电子供体(Ohnishi，T.et al.J.Biol.Chem.，260：2782-2788，1985；Ohnishi，T.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.56：775-782，1974).

对复合物I的研究在牛心脏线粒体中进行得最为详尽。它的41个亚基的一级结构已被阐明。其中7个蛋白亚基由线粒体基因组编码，其余则由核基因组编码(Walker，J.E.et al.Methods of Enzyme，260：14-34，1995)。在人中，对复合物I(同样由至少四十个以上亚基构成)的各亚基的研究相对较慢，除由线粒体编码的基因外，仅有少数编码复合物I的核基因组基因被较仔细的研究过，如复合物I的8kDa、10kDa、24kD和51kDa亚基等。

在各种具有不同临床病症的线粒体肌病患者中，复合物I的缺陷是很常见的。对人中突变型复合物I的研究同样以线粒体中的基因为主。迄今为止，在线粒体基因组中已发现了大量与复合物I功能相关的突变，这些突变包括点突变、缺失等(Wallace，D.C.，et al.Am.J.Hum.Genet.，57：201-223，1995；Schon，E.A.，et al.J.Bioenerg.Biomebr.，29：131-149，1997；Cooper，J.M.，et al.Biochimica et Biophysica.Acta.，1101：198-203，1992)。一个合理的想法是编码复合物I亚基的核基因也可能导致线粒体疾病，这一猜想同样得到了一定的实验支持：在一些线粒体疾病患者中发现了75-、13、24或20kDa亚基的缺失(Moreadith et al.J.Clin.Invest.，79：463-467，1987；Schapira et al. Molecular basis of mitochondrial myophathies：polypeptideanalysis in complex-I deficiency Lancet I(8584)，1988 500-503；Slipetz et al.Am.J.Hum.Genet.，48：1121-1126，1991)。然而，核基因与复合物I功能缺陷间的直接联系尚有待进一步探讨。

1992年Arizmendi，JM等人报导测得了两个牛心脏线粒体复合物亚基B14.5a和B14.5b(FEBS lett，1992，313(1)：80-84)，编码这两个蛋白的核苷酸序列也已被测序。

在人中，除编码复合物I的7个线粒体亚基外，仅少数核基因在核酸序列水平上进行了详细的研究，迄今共发现了10个复合物I亚基核基因被测序(GenBankAccession No.AF035840，AF013160，AF038406，AF044959，AF067139，HS17379，AFO20352，AF020351，HSU65579，HSU64028)。因此，进一步寻找编码复合物I其它亚基的核基因对于详细了解这些亚基间的相互关系以及在整个复合物中所起的作用，进而对阐明某些相关疾病的发生机理将有重要意义。

因此，本领域迫切需要发现和分离出NADH-CoQ氧化还原酶的其他亚基。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码NADH-辅酶Q氧化还原酶的一个亚基，本发明的人NADH-辅酶Q氧化还原酶亚基基因被命名为人NADH-CoQ 14 kDa亚基。

本发明的另一个目的是提供一种新的人NADH-辅酶Q氧化还原酶亚基，该蛋白被命名为人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽的方法。

本发明还提供了这种人NADH-CoQ 14 kDa亚基核酸序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为450个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于51-410位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人NADH-COQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNO.3中51-410位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框51-410位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中51-410位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ IDNO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人NADH-CoQ 14 kDa亚基相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白或多肽”指具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人NADH-CoQ 14 kDa亚基相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人NADH-CoQ 14 kDa亚基DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人NADH-CoQ 14kDa亚基多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人NADH-CoQ 14 kDa亚基保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                       表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人NADH-CoQ 14 kDa亚基的表达。

本发明还包括一种可用作探针或引物的核酸分子，该分子通常具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人NADH-CoQ 14 kDa亚基的核酸分子。

本发明还包括检测人NADH-CoQ 14 kDa亚基核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人NADH-CoQ 14 kDa亚基多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人NADH-CoQ 14 kDa亚基DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物或片段。较佳地，指那些能与人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人NADH-CoQ14 kDa亚基蛋白的分子，也包括那些并不影响人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人NADH-CoQ 14 kDa亚基或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人NADH-CoQ 14kDa亚基功能的抗体以及不影响人NADH-CoQ 14 kDa亚基功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人NADH-CoQ 14kDa亚基核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。也可进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基片段长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

在本发明的一个例子中，人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸为引物——A1：5’-CCTTGTAGTTCGTGGTCTGAGAC-3′为正向引物，寡核苷酸A2：5′-AGCAGGTATCAGTGAAACTGGAG-3’为反向引物，进行PCR。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。

线粒体中呼吸链的氧化磷酸化反应细胞获得能量的主要途径。其中，复合物I是该途径的第一步。已经发现，复合物I的缺陷与多种疾病相关；有文献还认为，复合物I还可能与衰老的发生有一定的关系(J.Bioenerg.Biomebr.，20(3)：365-382；Biochimica et Biophysica.Acta.，1101：198-203，1992)。组成复合物I的各个亚基的突变常常会给复合物I的功能带来不同程度的影响，从而与某些疾病相关。在线粒体编码复合物I亚基的七个基因中大多数都发现了许多不同的突变形式，其中的某些突变被发现与疾病相关，这些疾病包括Leber氏遗传性眼神经病(Leber’shereditary optic neuropathy，LHON)、帕金森氏综合症(PD)(Cooper，J.M.，et a1.Biochimica et Biophysica.Acta.，1101：198-203，1992)和早老性痴呆(AD)等。编码复合物I亚基的核基因也可能导致线粒体疾病，这一设想同样得到了一定的实验支持：在一些线粒体疾病患者中发现了75-、13、24或20kDa亚基的缺失(Moreadith etal.J.Clin.Invest.，79：463-467，1987；Schapira et al.Molecular basis of mitochondrialmyophathies：polypeptide analysis in complex-I deficiency Lancet I(8584)，1988 500-503；Slipetz et al.Am.J.Hum.Genet.，48：1121-1126，1991)。

本发明的基因被推定为编码人复合物I的一个亚基。一方面，作为组成复合物I的一部分，它必然对整个复合物的功能发挥着独特的作用，如同其它已知的编码复合物亚基的基因一样，它的突变对于复合物整体的功能必然产生一定影响，从而导致疾病的发生；另一方面，本发明也为进一步阐明复合物I的核基因在整体中的作用提供了一种新的途径。

在附图中，

图1为本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基(NADHS14)与牛心脏线粒体复合物I B14.5亚基(BOS14.5)的核酸序列同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。

图2为本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基(NADHS14)与牛心脏线粒体复合物I B14.5亚基(BOS14.5)的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人肝脏λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A1：5’-CCTTGTAGTTCGTGGTCTGAGAC-3’(SEQ ID NO：1)为正向引物，寡核苷酸A2：5’-AGCAGGTATCAGTGAAACTGGAG-3’(SEQ ID NO：2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到约450碱基对的目的片段。

2.PCR产物的测序

将PCR扩增产物A1/A2与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCEL^TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共450bp，详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于51-410位核苷酸。

根据得到的全长基因组序列推导出人NADH-CoQ 14kDa亚基的氨基酸序列，共119个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：4。

实施例2

同源比较

用本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现与牛的心脏线粒体复合物I的B14.5b亚基有很高同源性。用PCGENE软件比较，发现它与牛的心脏线粒体复合物I的B14.5b亚基在蛋白水平上的同一性高达74％，相似性达82.4％(图2)；而在核酸水平上，两者的编码序列(CDS)间的同一性也高达84.2％(图1)。因此本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因被认为是牛的心脏线粒体复合物I的B14.5b亚基基因在人体中的同系物。根据结构决定功能，结构相似功能相近的生物学原理，可以从本家族成员的基因或蛋白的功能来推测本发明的人类NADH-CoQ 14 kDa亚基的功能。

众所周知，线粒体中呼吸链的氧化磷酸化反应对于生物体是极其重要的，该途径是细胞获得能量的主要途径。其中，复合物I是该途径的第一步。已经发现，复合物I的缺陷与多种疾病相关；有文献还认为，复合物I还可能与衰老的发生有一定的关系(J.Bioenerg.Biomebr.，20(3)：365-382；Biochimica et Biophysica.Acta.，1101：198-203，1992)。有理由认为，组成复合物I的各个亚基的突变常常会给复合物I的功能带来不同程度的影响，从而与某些疾病相关。

有关实验也证明了这一观点。在线粒体编码复合物I亚基的七个基因中大多数都发现了许多不同的突变形式，其中的某些突变被发现与疾病相关，这些疾病包括Leber氏遗传性眼神经病(LHON)、帕金森氏综合症(PD)(Cooper，J.M.，et al.Biochimica et Biophysica.Acta.，1101：198-203，1992)和早老性痴呆(AD)等。

编码复合物I亚基的核基因也可能导致线粒体疾病，这一设想同样得到了一定的实验支持：在一些线粒体疾病患者中发现了75-、13、24或20kDa亚基的缺失(Moreadith et al.J.Clin.Invest.，79：463-467，1987；Schapira et al.Molecular basis ofmitochondrial myophathies：polypeptide analysis in complex-I deficiency Lancet I(8584)，1988 500-503；Slipetz et al.Am.J.Hum.Genet.，48：1121-1126，1991)。然而，核基因与复合物I功能缺陷间的直接联系尚有待进一步探讨。

本发明的基因被推定为编码人复合物I的一个亚基。一方面，作为组成复合物I的一部分，它必然对整个复合物的功能发挥着独特的作用，如同其它已知的编码复合物亚基的基因一样，它的突变对于复合物整体的功能必然产生一定影响，从而导致疾病的发生；另一方面，本发明也为进一步阐明复合物I的核基因在整体中的作用提供了一种新的途径。

本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人NADH-CoQ 14 kDa亚基还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人NADH-CoQ 14 kDa亚基的N端与牛心脏线粒体复合物I的B14.5b亚基的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人NADH-CoQ 14 kDa亚基的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

此外，本发明人NADH-CoQ 14 kDa亚基核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人NADH-CoQ 14 kDa亚基的表达水平或者抑制人NADH-CoQ14kDa亚基的过度表达。本发明的人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人NADH-CoQ 14 kDa亚基缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

人NADH-CoQ 14 kDa亚基在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以实施例1中的PCR产物为模板，将编码人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人NADH-CoQ 14 kDa亚基cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-TCAGGGATCCATGATCGCACGGCGGAACC-3′(SEQ ID NO.5)，

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人NADH-CoQ 14 kDa亚基编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-ACTGGTCGACTCAACGTATTGGATGGAAT-3’(SEQ ID NO.6)，

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人NADH-CoQ 14kDa亚基的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalI和BamHI消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人NADH-CoQ 14 kDa亚基。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人NADH-CoQ 14 kDa亚基。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约14KDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例4

人NADH-CoQ 14 kDa亚基在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，以实施例1中的PCR产物为模板，将编码人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人NADH-CoQ 14 kDa亚基cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-TCAGGGATCCATGATCGCACGGCGGAACC-3′(SEQ ID NO.7)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人NADH-CoQ 14 kDa亚基编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5’-ACTGGATATCTCAACGTATTGGATGGAAT-3’(SEQ ID NO.8)

该引物含有EcoRV限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人NADH-CoQ 14kDa亚基的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用BamHI和EcoRV消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，并测序验证人NADH-CoQ 14 kDa亚基的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为14KDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人NADH-CoQ 14 kDa亚基基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白特异性地发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

            序列表(1)一般信息：

(i)申请人：复旦大学

(ii)发明名称：一种人氧化还原酶亚基及其编码序列，以及制法和用途

(iii)序列数目：8(2)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征

  (A)长度：23碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：CCTTGTAGTT CGTGGTCTGA GAC                             23(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征

  (A)长度：23碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AGCAGGTATC AGTGAAACTG GAG                             23(2)SEQ ID NO.3的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：450bp

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO.3：CCTTGTAGTT  CGTGGTCTGA  GACCAGGCCT  CAAGTGGAAA  CGGCGTCACC  ATGATCGCAC  60GGCGGAACCC  AGAACCCTTA  CGGTTTCTGC  CGGATGAGGC  CCGGAGCCTG  CCCCCGCCCA  120AGCTGACCGA  CCCGCGGCTC  CTCTACATCG  GCTTCTTGGG  CTACTGCTCC  GGCCTGATTG  180ATAACCTGAT  CCGGCGGAGG  CCGATCGCGA  CGGCTGGTTT  GCATCGCCAG  CTTCTATATA  240TTACGGCCTT  TTTTTTTGCT  GGATATTATC  TTGTAAAACG  TGAAGACTAC  CTGTATGCTG  300TGAGGGACCG  TGAAATGTTT  GGATATATGA  AATTACATCC  AGAGGATTTT  CCTGAAGAAG  360ATAAGAAAAC  ATATGGTGAA  ATTTTTGAAA  AATTCCATCC  AATACGTTGA  AGTCTTCAAA  420ATGCTTGCTC  CAGTTTCACT  GATACCTGCT                                      450(2)SEQ ID NO.4的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：119个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO.4Met Ile Ala Arg Arg Asn Pro Glu Pro Leu Arg Phe Leu Pro Asp 15Glu Ala Arg Ser Leu Pro Pro Pro Lys Leu Thr Asp Pro Arg Leu 30Leu Tyr Ile Gly Phe Leu Gly Tyr Cys Ser Gly Leu Ile Asp Asn 45Leu Ile Arg Arg Arg Pro Ile Ala Thr Ala Gly Leu His Arg Gln 60Leu Leu Tyr Ile Thr Ala Phe Phe Phe Ala Gly Tyr Tyr Leu Val 75Lys Arg Glu Asp Tyr Leu Tyr Ala Val Arg Asp Arg Glu Met Phe 90Gly Tyr Met Lys Leu His Pro Glu Asp Phe Pro Glu Glu Asp Lys 105Lys Thr Tyr Gly Glu Ile Phe Glu Lys Phe His Pro Ile Arg     119(2)SEQ ID NO.5的信息

(i)序列特征

  (A)长度：29碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.5：TCAGGGATCC ATGATCGCAC GGCGGAACC                       29(2)SEQ ID NO.6的信息

(i)序列特征

  (A)长度：29碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.6：ACTGGTCGAC TCAACGTATT GGATGGAAT                       29(2)SEQ ID NO.7的信息

(i)序列特征

  (A)长度：29碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.7：TCAGGGATCC ATGATCGCAC GGCGGAACC                       29(2)SEQ ID NO.8的信息

(i)序列特征

    (A)长度：29碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO.8：ACTGGATATC TCAACGTATT GGATGGAAT                       29

Claims (14)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人NADH-CoQ 14kDa亚基蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者

所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列。

4.一种分离的人NADH-CoQ 14kDa亚基蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。

10.一种产生具有人NADH-CoQ 14kDa亚基蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有人NADH-CoQ 14kDa亚基蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸51-410位。

12.一种能与权利要求4所述的人NADH-CoQ 14 kDa亚基蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。

14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

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