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CN1280428C - 一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其应用 - Google Patents

一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其应用 Download PDF

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CN1280428C CNB031237266A CN03123726A CN1280428C CN 1280428 C CN1280428 C CN 1280428C CN B031237266 A CNB031237266 A CN B031237266A CN 03123726 A CN03123726 A CN 03123726A CN 1280428 C CN1280428 C CN 1280428C
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Tsinghua University
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Abstract

本发明公开了一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其应用。该生物芯片，包括：a)在特定基质的表面采用合适的材料所构建的封闭腔体，所述的合适的材料具有较好的导热性和生物相容性，不抑制待分析物和反应物之间的结合，在所述封闭腔体内部的基质表面固定有能够与所述待分析物结合的第一固定反应物；b)一种用于将所述待分析物移动到所述第一固定反应物所处位置的器件；c)一种用于将所述分析物移近特定的标记的未固定的复合物的器件，所述复合物包括能够与所述待分析物结合的第二种反应物和与所述第二种反应物相连接的微小颗粒；d)一种用于将未与待分析物结合的所述标记的未固定的复合物从第一固定反应物区域移走的器件。本发明还提供了用该生物芯片系统来分析待分析样品的方法。

Description

一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其应用
技术领域
本发明涉及分析领域中一种生物芯片系统及其应用，特别涉及一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其在生物样品分析中的应用。
背景技术
有多种不同的方法可以用于不同的生物样品的分析。如核酸杂交，多聚酶链式反应，限制性内切酶分析以及凝胶电泳通常被用于核酸的检测；免疫分析以及凝胶电泳常被用于蛋白质的检测。作为一种革命性的分析技术，生物芯片以其所具有的集成化，微型化和自动化的潜力将在分析生物技术领域发挥越来越重要的作用。在生物芯片的早期阶段，生物芯片基本所指的就是核酸芯片和DNA微阵列，DNA芯片技术已经发展得比较完备并且在分析生物领域获得了广泛的应用。核酸芯片/阵列可以被用于核酸的高通量并行分析。(Debouck and Goodfellow，Nature Genetics，21(Suppl.)：48-50(1999)；Duggan et al.，Nature Genetics，21(Suppl.)：10-14(1999)；Gerhold et al.，TrendsBiochem.Sci.，24：168-173(1999)；and Alizadeh et al.，Nature，403：503-511(2000))。可以采用核酸芯片来快速地分析特定情况下的基因表达谱。也可以采用核酸芯片在一次实验中分析长达1kb的基因区域内的单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms，SNPs)(Guo et al.，Genome Res.，12：447-57(2002))。
基于生物芯片的概念、基本的生物学原理以及常规的生物技术的整合已经发展出了多种不同类型的生物芯片。其中包括用于疾病和癌症研究的蛋白质芯片(Belov et al.，Cancer Research，61：4483-4489(2001)；Knezevic et al.，Proteomics， 1：1271-1278(2001)；Paweletz et al.，Oncogene， 20：1981-1989(2001))；用于在基因组层次上研究分子病理学的组织芯片(Kononen et al.，Nat.Med.， 4：844-847(2001))；以及用于多糖和蛋白之间的相互作用研究的多糖芯片(Fukui et al.，Nat.Biotech.， 20：1011-1017(2002))。
采用被动式生物芯片的常规核酸分析方法(例如用于感染性疾病临床分析的方法)通常包括三个分离的步骤。第一步是样品制备，也就是处理样品，包括处理血清、全血、唾液、尿液以及粪便而获得核酸(DNA或RNA)。通常从样品中获得的核酸量不足以直接用于分析，需要进行进一步的扩增，扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，链置换扩增(SDA)以及滚环扩增(RCA)等(Andras et al.，Mol.Biotechnol.，19：29-44(2001))。第二步是核酸杂交，也就是在扩增出的样品和固定在芯片上的探针之间进行杂交。第三步是检测杂交信号，对杂交信号的检测通常基于对特定标记的检测，检测标记可以在扩增或者杂交的过程中引入。信号检测方法随所使用的标记的不同而变化，例如采用荧光检测仪来检测荧光标记，采用放射自显影来检测放射标记，而对于生物素标记以及地高辛标记等的检测则往往需要进一步的酶学放大反应。基于实际中对检测灵敏度的不同要求，可以采用不同的信号放大方法，例如Tyramide信号放大(TSA)(Karsten et.al.，Nucleic Acids Res.，E4.((2002))以及分支DNA(Kricka Clin.Chem.，45：453-8(1999))等。
由于核酸检测中的三个关键步骤的分离，导致了需要不同的步骤之间引入手工操作。这必将降低检测方法的简便性，费时费力；还会引入实验误差，降低两次实验之间的重复性和一致性；同时因为人工操作的引入还会增加反应体系被污染的可能性，而污染则正是阻碍核酸检测方法，尤其是包含有核酸扩增步骤的检测方法在临床上推广应用的重要原因。同时，在被动式生物芯片中，探针被固定于固相载体的表面，待分析物则在杂交腔体内处于游离状态，探针和待分析物之间的反应依靠待分析物在反应体系中的被动扩散而进行，探针区域的待分析物的浓度较低。在这种方式下，反应效率相对较低，反应所需的时间相对较长。
针对传统的二维被动式芯片的被动反应、探针固定量少的缺点已经发展出几种不同类型的解决方法。第一种方式是采用其它的基质材料和固定方法。在基因芯片技术中，探针通常被固定于一种二维的平面上，因此在芯片表面固定的探针的密度通常较低。为了获得更高的杂交效率，有研究者尝试将探针固定在三维结构和三维基质上(Zlatanovaet al.，Methods Mol.Biol.170：17-38(2001)；Tillib et al.，Anal.Biochem.292：155-160(2001)；Michael et al.，Anal.Chem.70：1242-1248(1998))。与常规的二维芯片相比，三维芯片具有以下两个特性：在一个固定的区域内可以固定更多的探针，同时在三维结构上的探针具有更高的自由度，因此，这种类型的芯片可以提高杂交的效率。但是这种芯片的缺点也是显而易见的，芯片的制作过程比较复杂，因此导致了这种芯片很难实现高密度。另一种方式是采用特殊设计的探针，这些探针在其5′上有一些附属的成分，包括用于提高固定的探针的柔韧性的5′间隔臂(Shchepinov et al.，NucleicAcids Res.25，1155-1161(1997))，以及茎环结构或发卡结构探针(Broude et al.，Nucleic Acids Res.29：E92(2001))。目标DNA与这种芯片的杂交可以通过碱基堆积效应来加强(Riccelli et al.，Nucleic Acids Res.29：996-1004(2001))。第三种更有效的提高杂交效率的方式是在芯片上施加物理作用力。可采用扰动来促进杂交时的扩散，例如Lucidea自动芯片处理器(Lucidea ASP)。电场力也被用来驱动核酸的快速运动并在核酸芯片表面的探针区域进行浓缩和富集(Sosnowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94：1119-1123(1997)；Cheng et al.，Nat.Biotechnol.16：541-546(1998))。这种类型的芯片被称为主动式芯片。电场驱动的芯片中的分子结合速度可以比常规的被动式芯片快1000倍。这种芯片的缺点在于芯片本身的加工过程比较复杂或者需要复杂的配套设备。
针对传统生物芯片应用时几步反应分离的缺点，有研究者提出了芯片实验室的概念(Manz et al.，Anal.Chem.74：2623-2636 and 2637-2652(2002))。生物化学反应和分析过程通常包括三个步骤：样品制备、生物化学反应以及检测和数据分析处理。将其中一个步骤或几个步骤微型化并集成到一块芯片上所获得的具有特殊功能的生物芯片即是芯片实验室，例如用于样品制备的细胞过滤器芯片和介电电泳芯片、用于基因突变检测和基因表达的DNA微阵列芯片和用于药物筛选的高通量微型反应池芯片等。现在，世界各国的科学家们正致力于将生化分析的全过程通过使用不同的芯片而最后达到全部功能的集成，以实现所谓的微型全分析系统或缩微芯片实验室。使用缩微芯片实验室，人们可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。
现有的芯片实验室的缺点是需要复杂的微加工，技术要求较高。已有的报道中所描述的绝大部分都是某一步骤微型化后的芯片实验室，例如：样品制备芯片(Wilding etal.，(1998)Anal.Biochem.，257：95-100.)，细胞分离芯片(Wang et al.，(1993)J.Phys.D：Appl.Phys.，26：1278-1285.)，PCR芯片(Cheng et al.，1996)NucleicAcids Res.，24：380-385.)。Cheng等在1998年报道了第一例将样品制备，生化反应及结果检测整合的芯片实验室系统(Cheng et al.，(1998)Nat.Biotechnol.，16：541-546.)。但是这一系统并没有得到实用化。已有的实用化例子，例如Nanogen的电子芯片，仅实现了杂交和检测的自动化和整合。与芯片配合的有一整套复杂的仪器和分析控制软件，芯片本身的加工及使用成本高昂。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种用于分析待分析物的生物芯片系统。
本发明所提供的生物芯片系统包括：
a)在特定基质的表面采用合适的材料所构建的可控的封闭腔体，所述的合适的材料具有较好的导热性和生物相容性，不抑制待分析物和反应物之间的结合，在所述可控腔体内部的基质表面固定有能够与所述待分析物结合的第一固定反应物；
b)一种用于将所述待分析物可控地移动到所述第一固定反应物所处位置的器件；
c)一种用于将所述分析物可控地移近特定的标记的未固定的复合物的器件，所述复合物中包括能够与所述待分析物和微小颗粒结合的第二种反应物；所述复合物包括能够与所述待分析物结合的第二种反应物和与所述第二种反应物相连接的微小颗粒；
d)一种用于将未与待分析物结合的所述的标记的未固定的复合物从固定的第一种反应物的区域移走的器件。
任何合适的材料均可被用于本生物芯片系统的构建。例如自封闭腔体、自封闭胶、或者是塑料腔体。
任何合适的材料均可被用于本芯片系统的构建。例如，合适的材料包括硅、塑料、玻璃、石英玻璃、陶瓷、橡胶、金属、多聚物、杂交膜以及它们的任意组合。基质的表面可以通过化学修饰而带上活性基团或者生物分子，化学基团包括-CHO，-NH2，-SH，-S-S-，环氧基或者甲苯磺酰基，生物分子包括生物素，链霉亲和素，亲和素，组氨酸尾巴(his-tag)，strept-tag(链霉亲和素尾巴)，组氨酸和蛋白A。基质可以是芯片的一部分，例如DNA芯片，基质也可以不是芯片的一部分。
本发明中的生物芯片系统可以被用于分析待分析物，所述待分析物包括细胞，细胞器，分子，聚合物或者复合物等。
任何合适的反应物均可作为第一固定反应物。第一固定反应物可以是细胞，病毒，细胞器，分子，聚合物或者复合物等。第一固定反应物可以与待分析物发生特定的结合。第一固定反应物可以是抗体或者与待分析核酸互补的核酸。第一固定反应物可以通过任何合适的方法与基质相连接，例如通过化学反应基团或者是基质表面所带有的生物分子。
所述标记的未固定的复合物可在其第二反应物或者微小颗粒上带有可检测的标记。可检测的标记可以是任何合适的标记，例如放射标记，荧光标记，化学标记，酶学标记，发光标记，荧光共振能量转移标记或者是分子信标标记。更合适的，检测标记荧光标记。同时，更合适的荧光标记与第二个荧光标记临近而产生荧光信号。具体的荧光标记包括FAM，TET，HEX，FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，ROX，Fluroscein，TAMRA以及带有稀土金属的纳米粒子。同时，未固定的复合物中的微小颗粒可以作为一个直接的标记来判断待分析物的有无或者对其进行定量。
任何合适的反应物均可被用作第二反应物。第二反应物可以是细胞，病毒，细胞器，分子，聚合物或者复合物等。第二反应物可以与待分析物发生特定的结合。第二反应物可以是抗体或者与待分析核酸互补的核酸。第二反应物可以通过任何合适的方法与微小颗粒相连接，例如通过化学反应基团或者是微小颗粒表面所带有的生物分包括-CHO，-NH2，-SH，-S-S-或者甲苯磺酰基，生物分子包括生物素，链霉亲和素，亲和素，组氨酸尾巴，链霉亲和素尾巴，组氨酸以及蛋白A。
任何合适的微小颗粒均可被采用。更合适的，微小颗粒是磁性、可磁化的、带电的以及可带电的微小颗粒。微小颗粒可以带有任何合适的材料，例如有机材料，玻璃，二氧化硅，陶瓷，碳或者金属。微小颗粒可以具有任何合适的尺寸，例如直径从1纳米到10微米。
在实际应用中，在非固定的复合物中所采用的微小颗粒可以是磁性微粒。磁性微粒可以通过任何合适的方法制备。例如，可以采用专利CN 01/109870.8或WO02/075309所述的方法来制备。在本发明所述的生物芯片系统和方法中可以采用可以磁化的材料来制备磁性颗粒。可磁化材料的例子包括亚铁磁性材料，铁磁性材料，顺磁性材料以及超顺磁性材料。在一个具体的应用中，磁性颗粒带有顺磁性材料，例如顺磁性金属氧化物。更适宜的，顺磁性金属氧化物是过渡态金属氧化物或者合金等。任何过渡态的金属均可被采用，例如铁，镍，铜，鈷，锰，钽，锌以及zirconium(Zr).更好的情况是金属氧化物为Fe3O4或Fe2O3。在另一个具体的应用中，在磁珠中所采用的可磁化的物质是金属，这一金属可以是过渡态金属或者合金铁，镍，铜，鈷，锰，钽，锌以及zirconium(Zr)以及鈷-钽-zirconium(CoTaZr)合金。
磁珠也可以从可获得的初级磁珠中制备，也可以从被单体所包被的粗的材料以及金属氧化物中制备，如专利U.S.Patent No.5,834,121所示，上述单体在经过交联以后可以形成一个坚固的多聚物壳体。在这里“坚固”指的是交联而形成的多聚物壳体可以对包裹在其内的金属氧化物起到稳定的作用(也就是壳体不会膨胀或者溶解)，因此颗粒会保留在壳体的内部。在这里“微孔的”指的是在畸形的有机溶剂中会膨胀或者扩展的树脂状的多聚物基质。这里的“装载”指的是颗粒上的集合位点可以被功能化或者衍生化的一种能力。
合适的材料可以被用作可磁化的材料，例如，锰铁矿，锰铁酸盐，鈷，镍，磁铁矿以及多种不同的合金。锰铁矿是优选的金属氧化物。通常，金属盐往往先被转化成金属氧化物然后被包被上多聚物或者被吸收进微球中，该微球带有热塑性的多聚物树脂并且在其上有较少的基团。当想从金属氧化物开始而获得疏水的初级微球，有必要提供来源于乙烯基单体的热塑多聚物坚固的壳体，最好是能够与微孔基质结合或者被微孔基质结合的交联的聚苯乙烯。磁珠可以采用已有的方法来制备，例如来自文献中的方法(Vandenberge et al.，J.of Magnetism and Magnetic Materials，15-18：1117-18(1980)；Matijevic，Acc.Chem.Res.，14：22-29(1981)；and U.S.Patent.Nos.5,091,206；4,774,265；4,554,088；and 4,421,660.)本发明中可能用到的初级磁珠可来于专利所述(U.S.Patent.Nos.5,395,688；5,318,797；5,283,079；5,232,7892；5,091,206；4,965,007；4,774,265；4,654,267；4,490,436；4,336,173；and4,421,660.)或者初级微球可以通过商业途径从已有的亲水或者疏水的微球中获取，只要其能够满足尺寸以及稳定性的要求，并且具有吸收使用的乙烯基单体而形成网状基质的能力。优选的是，初级磁球是一种疏水的，聚苯乙烯包被的，顺磁性的颗粒。这种聚苯乙烯顺磁性小球可以从Dynal，Inc.(Lake Success，N.Y.)，Rhone Poulonc(France)，and SINTEF(Trondheim，Norway)获得。原始的仅带有一层不稳定的多聚物的颗粒或者磁性颗粒可通过在其表面上进行进一步的处理而带上坚固的多聚物外壳而被使用。
有多种方式可用于移动待分析物和其它的物质，这些移动方式可以通过任何合适的力而产生。在一实际应用中，通过电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力来可控的将待分析物移近第一固定的反应物(第一种移动方式)。在另一实际应用中，通过电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力来可控的将待分析物移近标记的未固定的复合物(第二种移动方式)。在第二种方式的移动中可以通过对标记的未固定的复合物内的微小颗粒施加作用力而实现可控地将待分析物移近标记的未固定的复合物。在另一实际应用中，将未与待分析物结合的标记的未固定的复合物从第一固定的反应物的位置可控地移开(第三种移动方式)是通过采用电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力来实现的。在第三种方式的移动中可以通过对标记的未固定的复合物内的微小颗粒施加作用力而实现可控地将其从第一种固定的反应物的区域移开。
在一具体应用中，待分析物是DNA，RNA，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)，蛋白质，肽，抗体以及多糖。DNA，RNA，肽核酸(PNA)，锁定核酸(LNA)，的长度在5碱基对到1000碱基对之间。在另一具体应用中，本发明可以被用于分析DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，DNA-LNA杂交，DNA-PNA杂交，RNA-RNA杂交，RNA-PNA杂交，RNA-LNA杂交，PNA-PNA杂交，PNA-LNA杂交，蛋白质与蛋白质之间的相互作用，蛋白质与核酸之间的相互作用，蛋白质与多糖之间的相互作用以及抗原抗体之间的相互作用。
本发明的生物芯片系统可以单分析通道的，也可以是多分析通道的，通道的数目可以从1到10,000。
本发明可以进一步包括一种温度控制器件，温度控制器件可以是PCR仪，原位PCR仪，水浴器件或者是微型的热控制器件。
本发明可以进一步包括用于检测待分析物与标记的未固定的符复合物以及第一个固定的反应物所形成的三明治结构的器件。可用的检测器件包括光学显微镜，光学扫描仪以及荧光扫描仪。
本发明的第二个目的是提供一种用于待分析物分析的方法。
本发明所提供的方法包括a)给出一种上述的生物芯片系统；
b)往所述生物芯片系统的可控的封闭腔体中加入带有或者可能带有待分析物和标记的未固定的复合物的样品，所述复合物中带有能够与待分析物以及微小颗粒结合的第二种反应物；
c)对所述生物芯片系统进行操作使得在所述标记的未结合的复合物、所述待分析物以及所述芯片基质上固定的的第一反应物之间形成三明治结构；
d)评估所述三明治结构以确定所述样品中所述待分析物的存在与否或者对其进行定量。
本发明的方法可以被用于分析任何固体，液体或气体样品。本发明的方法可以用于分析单个或者多个待分析物，待分析物的数量可以从1到3,000。多重分析可以顺序进行或者同步进行。
在一具体应用中，本发明的标记的未固定的复合物、待分析物以及第一固定反应物之间的三明治结构可以通过以下方式来形成，首先将待分析物移近标记的未固定的复合物使其与后者结合，然后将待分析物与标记的未固定的复合物的结合体移近第一固定反应物，使得待分析物与固定的反应物之间发生结合而形成三明治结构，然后从所述第一固定反应物的区域移走未与所述待分析物结合的标记的未结合的复合物。
在另一具体应用中，标记的未固定的复合物中的微小颗粒可以直接用作检测标记。
本发明的方法可以被用于任何待分析物的分析，如细胞，细胞器，病毒，分子，聚合物以及复合物等。细胞包括动物细胞，植物细胞，细菌细胞，重组细胞或者是培养的细胞。动物，植物，细菌细胞可以来源于动物纲，植物纲或者细菌纲中的任何种或者亚种。细胞可以来源于任何纤毛虫的种或者亚种。细胞粘液，鞭毛以及微孢子也可以采用本发明的方法来分析。来源于鸟类例如鸡，脊椎动物例如鱼，哺乳动物例如小鼠，大鼠，兔子，狗，猪，奶牛，牛，绵羊，山羊，马，猴子以及其它的不包括人类在内的其它的灵长类动物的细胞也可以采用本发明的方法来进行分析。
对于动物细胞，来源于特定组织或者器官的细胞也可以采用本发明的方法来进行分析。例如来源于连接组织，上皮组织，肌肉组织或者神经组织的细胞可以采用本发明的方法来进行分析。类似的，来源于必要器官中的细胞也可以采用本发明的方法来进行分析，必要组织包括眼睛，环节螺旋器官，听觉器官，切维茨器官，环绕心室器官，科尔蒂器官，关键器官，指甲，末梢，女性外生殖器官，男性外生殖器官，移动器官，鲁菲尼器官，生殖器官，高尔基肌腱器官，味觉器官，听觉器官，女性内生殖器，男性内生殖器，输送器官，雅各布森器官，神经体液器官，神经腱器官，嗅觉器官，耳石器，下垂器官，罗森米勒器，感觉器官，螺旋器官，皮下连合器官，皮下穹隆器官，额外器官，触觉器官，靶器官，触摸器官，泌尿器官，动脉薄板末端器官，前庭器官，耳蜗前庭器官，退化器官，视觉器官，梨鼻器，游动器官，韦伯器官以及祖克坎德耳体。样品可以来源于哺乳动物的内部器官，例如脑，肺，肝，胰腺，骨髓，胸腺，心脏，淋巴，血液，骨头，软骨，胰腺，肾脏，胆囊，胃，肠，睾丸，卵巢，子宫，神经系统，腺体，血管等。而且来源人和植物，真菌例如酵母，细菌如真细菌和古细菌的细胞也可以采用本发明的方法进行分析。任何来源于原核或真核生物的重组细胞也可以采用本发明的方法来进行分析。体液，例如血液，尿液，唾液，骨髓，精液等，以及其它细胞成分例如血清或血浆也可以采用本发明的方法来进行分析。
细胞器包括细胞核，线粒体，叶绿体，核糖体，内质网，高尔基体，溶媒体，分泌小泡，液泡体以及微粒体。分子包括无机分子，有机分子以及复合物等。有机分子包括氨基酸，肽，蛋白质，核苷，寡核苷酸，核酸，生物素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂肪以及它们的复合物等等。
任何氨基酸均可采用本发明的方法来进行分析。例如可以用于D-型和L-型氨基酸的分析。另外，任何在自然状态下由Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)以及Val(V)等组成的肽或者蛋白质均可采用本发明的方法进行分析。
任何蛋白质或者多肽均可用发明中的方法进行分析。举例来说，酶，转运蛋白例如离子通道或离子泵，营养和储存蛋白，收缩和运动蛋白例如肌动蛋白和肌球蛋白，结构蛋白，防御蛋白或调节蛋白例如抗体，激素和生长因子等均可采用发明中的方法进行分析。蛋白质性质和多肽性质的抗原也可以采用本发明的方法进行分析。
可采用本发明的方法来分析任何合适的目标核酸。目标核酸包括DNA，例如A-，B-或者Z-形DNA，或者RNA例如mRNA，tRNA和rRNA。核酸可以单链，双链或者三链的形式。
可以采用本发明的方法来分析任何核苷。核苷包括腺苷，鸟嘧啶，胞啶，胸苷和尿苷。其他形式的核苷还包括AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP以及dTTP均可以采用本发明的方法来进行分析。
可采用本发明的方法来分析任何维生素，包括硫胺(维生素B1)，核黄素，烟酸，泛酸，维生素B6，生物素，叶酸，维生素B12以及微生物C等水溶性的维生素以及维生素A，维生素D，维生素E，维生素K等脂溶性的维生素在内的维生素均可以采用本发明中的方法来分析。
任何单糖，无论是D型还是L型以及无论是醛糖还是酮糖均可以采用本发明的方法来进行分析。单糖包括丙糖例如甘油醛，四糖例如赤藓糖和苏糖，戊糖例如核糖，阿拉伯糖，木糖，木糖和核酮糖，己糖例如阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖果糖以及庚糖例如景天庚酮糖。
可采用本发明的方法来分析任何脂类。脂类包括三羧酸甘油酯，例如硬酯酸甘油酯，软脂酸甘油酯，甘油精，蜡，磷酸甘油酯例如磷酯酰乙醇胺，卵磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷酸肌醇，心磷脂，神经鞘脂类例如鞘磷脂，脑苷脂和神经节苷脂，固醇例如胆固醇和豆固醇和固醇脂肪酸酯。脂肪酸可以是饱和脂肪酸例如月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬酯酸，花生酸和木蜡酸，或者是不饱和脂肪酸例如棕榈油酸，油酸，亚油酸和花生四烯酸。
本发明的方法可以被用于分析任何样品。例如本发明中的方法可以用于分析哺育动物样品，哺乳动物包括牛，山羊，绵羊，马，兔子，猪，大鼠，小鼠，人类，猫，猴子，狗以。本发明的方法也可以被用于分析临床样品，临床样品包括血清，血浆，全血，痰，脑脊液，羊水，尿液，肠胃内容物，头发，唾液，汗液，口腔刮取物以及活检组织。本发明的方法可以用于人类的临床样品的分析。
附图说明
图1为生物芯片系统结构示意图。
图2-1到2-9为生物芯片系统分析样品的程序
图3为对图1所示的生物芯片系统的一种操作方式
具体实施方式
定义
除了专门定义之外，本发明所用的技术和科学术语都和普通理解的意思相同，可以被发明所属技术领域内的一个普通的技术人员所理解。所有在本发明中所参考的专利、申请、已经公开的申请以及其它的出版物已经在专利的参考文献中列出。如果本部分中所提到的某个定义与本发明中所参考的专利、申请、已经公开的申请以及其它的出版物的定义相矛盾或者不一致，则以本部分中的定义为准。下面的术语如果不在本发明中特别说明，都以下面的解释为准：
“一个”或“一种”指“至少一个”或者“一个或更多”。
“第二种方式用于可控的将待分析物移近特定的标记的未固定的复合物”指的是将待分析物移近特定的标记的未固定的复合物或者将特定的标记的未固定的复合物移近待分析物或者将待分析物以及标记的未固定的复合物移向第三者或者一个特定的位置。
“特异性结合”指的是一种物质与另一种物质的结合依赖与特定的分子结构。举例来说，一个受体会与具有与配体结合位点互补的化学结构的配体发生特异性结合。
“特异的结合对”指的是这样一种物质或者一类物质，它与特定的配体具有特异的结合能力，而不与其它的物质发生结合。一种具体的形式是特异的结合对包括能够与配体相互作用的特异性结合分析试剂，或者样品能够与配体间发生免疫化学反应。例如在试剂或样品配体之间，或者是配体与样品之间具有抗原抗体或半抗原与抗体的关系。另外，在专业内还有很多熟知的在配体及其结合对之间所存在结合反应可以作为特异性结合分析的基础，这其中包括激素、维生素、代谢物和药物成分与它们各自所对应的受体和结合物质之间的结合反应(See e.g.，Langan et al.eds.，Ligand Assay，pp.211 et seq.，Masson Publishing U.S.A.Inc.，New York，1981)。
“抗体”指的是特殊类型的免疫球蛋白，包括：IgA，IgD，IgE，IgG等，IgG1，IgG2，IgG3，and IgG4，and IgM。抗体可以任何可能的形式存在，同时也包括任何可能的片段以及衍生物。例如抗体包括多克隆抗体，单克隆抗体，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fv片段，抗体二聚体，单链抗体，由抗体片段所形成的多重特异性抗体。
“植物”指的是任何属于植物纲的具有光合作用，真核的多细胞的生物体，它的特征是可以产生胚，带有叶绿体，具有纤维素性质的细胞壁，不能够运动。
“动物”指的是属于动物纲的多细胞的生物体，它的特征是具有运动性，无光合作用机制，能够对刺激产生反应，不能够无限生长并且具有特定的形态结构。动物可以是，但不仅仅限于，鸟类例如鸡、脊椎动物例如鱼、哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔子、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马、猴子以及其它的不包括人类在内的其他的灵长类动物。
“细菌”指的是小的原核生物体(其尺寸在1微米左右)，不具有细胞核结构，具有70S的线粒体，细菌的蛋白合成与真菌的不同。许多针对细菌的抗生素是针对细菌的蛋白合成但是不影响带有细菌的感染的宿主。
“真细菌”指的是细菌中的除古细菌之外的的一个主要分支。绝大部分的革兰氏阳性细菌：兰细菌、支原体、肠道菌、假单胞菌以及叶绿体属于真细菌。真细菌的细胞质膜上带有类酯脂肪，如果有细胞壁则细胞壁上带有肽聚糖，真细菌中没有发现内含子。
“古细菌”指的是细菌中除了真细菌之外的一个主要分支，古细菌中有三个主要的类型：极端嗜盐菌、产甲烷细菌以及依赖于硫磺的极端嗜热菌。古细菌与真细菌的区别在于核糖体的结构，有些古细菌中带有内含子，还包括生物膜的组成。
“真菌”指的是真核生物的一个分支，可以大量的生长，但是不具有根，茎和叶缺乏叶绿素以及其他光合合成所需要的色素。每个真菌菌体具有单细胞的细丝状结构，具有真正的核，具有分支结构并且被含有聚糖或几丁质的细胞壁所包围。
“病毒”指的是生物体内的一种无细胞结构的寄生物，它带有DNA或RNA以及蛋白质外壳。病毒的尺寸范围从20nm到300nm。按照巴尔地摩分类，第一类病毒的基因组为双链DNA；第二类病毒的基因组为单链DNA；第三类病毒的基因组为双链RNA；第四类病毒的基因组为正链的单链RNA，基因组本身可以作为mRNA；第五类病毒的基因组为负链的单链RNA，该基因组可以作为mRNA合成的模板；第六类带有正链的单链RNA基因组，但在复制以及mRNA合成时均具有一个DNA的中间体。绝大部分的病毒均能够导致植物、动物以及原核生物的疾病，原核生物中的病毒被称为噬菌体。
“组织”指的是由一群相似的细胞以及包围这些细胞的细胞间物质所形成的结构。在机体中有四种基本的组织类型：1)上皮组织；2)连结组织，包括血液，骨骼以及软骨；3)肌肉组织以及4)神经组织。
“器官”指的是机体内执行某种特定功能的部分，例如呼吸，分泌和消化。
“样品”指的是采用本发明中所述的仪器和方法来进行分析的可能带有目标的任何物品。样品可以是生物样品，例如生物液体或者生物组织。生物液体可以是尿液、血液、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液眼泪、粘液羊水以及其他类似的物质。生物组织则指的是聚集的细胞，通常是一种特定的细胞通过细胞间的物质而形成的人、动物、植物、细菌、真菌以及病毒的特定的结构，包括上皮组织、连接组织、肌肉组织以及神经组织。生物组织包括器官、瘤、淋巴结、动脉以及单个的细胞。生物组织可被用于制备细胞悬浊样品。样品也可以是在体外所混合的细胞混合物。样品可以是培养的细胞悬浊液。当样品是生物样品时，样品可以是粗的样品或者对原始样品经过多种处理以后所获得的处理过的样品。例如，不同的细胞分离方法(磁激活的细胞筛选)可被用于从血液等液体样品中分离或富集目标细胞。本发明中所用到的样品包括通过目标细胞富集而获得的细胞。
“液体/流体”样品指的是自然状态下以液体或者流体状态存在的样品，例如生物流体。“液体样品”也指在自然状态下以固态或者气态存在，但经过处理后被包含于液体、流体、溶液或者悬浊物中的样品。例如，液体样品可以包括带有生物组织的的液体、流体、溶液或者悬浊物。
“磁性物质”指的是任何带有磁性的物质，在磁铁或磁力存在的时候会产生磁力或者被磁力所操纵。
“能产生磁力的物质”指的是任何能够被磁铁所影响的物质，因此当被悬浮或者放置于磁场中的时候能被诱导而产生磁性，处于一种带磁性的状态。能产生磁力的物质包括但不限于顺磁性物质、铁磁体以及亚铁磁体。
“顺磁性物质”指的是这样一种物质，该物质中的原子、离子或者分子带有永久的磁偶极矩。在没有外加磁场的情况下，由于原子的偶极矩的指向是随机的，因而整体不带有磁性。原子的偶极矩的随机指向是由于物质内的热扰动所导致的。当施加磁场后，原子偶极距会趋向与磁场的方向平行，因为与非平行状态相比在这种状态下原子所处的能量状态更低。因此就会在磁场的方向上产生净磁。进一步的关于“顺磁性的”以及“顺磁性”的描述可以从多种文献中获得，例如B.I Bleaney and B.Bleaney，Oxford，Electricity and Magnetism.Chapter 6，page169-171，1975。
“铁磁体材料”指的是与强磁性的物质不同的一种物质，其磁性依赖于外加磁场的强度。在未施加外加磁场的情况下，铁磁体材料也会带有一定的磁性，此时所保持的磁性被称为“剩磁”。进一步的关于“铁磁体的”和“铁磁体”的描述可以从不同的文献中获得，例如B.I Bleaney and B.Bleaney，Oxford，Electricity and Magnetism.Chapter 6，page171-174，1975。
“亚铁磁体”指的是能够自发地产生磁性，带有剩磁以及具有其它与常规的铁磁体相似性质的物质，但是其自发所产生的磁性与物质中的偶极矩完全平行排列时的磁性并不相符。进一步的有关“亚铁磁体的”和“亚铁磁体”的描述可以从多同文献中获得，例如B.I Bleaney and B.Bleaney，Oxford，Electricity and Magnetism.Chapter16，page519-524，1975。
“金属氧化物颗粒”指的时任何颗粒形式的金属氧化物。特定的带有顺磁性或者超顺磁性的金属氧化物。“顺磁性颗粒”被定义为这样一种颗粒，它在外加磁场的情况下比较敏感，但是不能够维持长久的磁性。换句话说，“顺磁性颗粒”也可以被定义为由顺磁性材料所制造的颗粒。顺磁性颗粒可以是，但不仅仅限于金属氧化物，例如Fe3O4颗粒、金属合金颗粒(例如CoTaZr颗粒)。
“杂交严谨度”主要用于区分错配的程度，其详细的描述如下：
1)高严谨度：0.1×SSPE(or 0.1×SSC)，0.1％SDS，65℃；
2)中等严谨度：0.2×SSPE(or 1.0×SSC)，0.1％SDS，50℃；
3)低严谨度：1.0×SSPE(or 5.0×SSC)，0.1％SDS，50℃。
采用不同的缓冲液，盐和温度可以获得相同的杂交严谨度。
“芯片”指的是一种固相基质，在这种基质上具有大量的一维、二维或者三维的微结构或者微小尺度结构，在其上可以进行特定的物理、化学、生物学、生物物理学或生物化学的过程。微结构或微小尺度结构，例如通道或者反应池，能够被整合进芯片，或者在芯片直接构造或者连接到基质上以利于在芯片上进行物理的，生物物理的、生物学的、生物化学或者化学的反应或者过程。芯片的其中一维可以很薄但在其它维上则具有多种可能的结构，例如，这种结构可以是三角形，圆形，椭圆形或者其它的非规则形状。芯片上用于进行反应的的主表面的尺寸可以在很大的范围内变化，例如，该尺寸的大小可以从1mm2到大约0.25m2。芯片的更合适的尺寸是从大约4mm2到大约25cm2，并且其中典型的一维的大小在大约1mm大约7.5cm之间。芯片的表面可以是平整的，也可以是不平整的。具有不平整表面的芯片可以在其上构建通道或者反应池。芯片可以是这样的一种固相基质，在其上固定了多种不同的DNA分子，蛋白质分子或者细胞。
“确定”指的是定量或者定性的检测样品中的待分析物，并且获得一个指示、比值、百分比或者可视的结果。确定可以是直接的也可以是间接的，实际用于检测的物质不需要是待分析物本身，但可以是一种衍生物或者进一步的其它物质。
“小分子”指的是没有形成同聚物或者没有与大分子或者调节物结合的分子，不能具有抗原性。小分子的分子量在10kD以下，更好的情况是小分子的分子量在5kD左右或者小于5kD。
“一个可控的封闭腔体”指的是腔体的开启和封闭是可控的，例如向外界开放以允许样品和试剂进入，然后封闭腔体，以允许在腔体内形成待分析物、标记的未固定的复合物以及基质上固定的反应物之间的三明治结构，在这一过程中，封闭腔体与外界环境之间无任何物质的交换。
“生物相容性”指的是材料对生物系统、生物反应或化学反应不具有毒性和有害作用的品质和能力。
“导热性”指的是一种材料作为热的绝缘体的效率，而这种效率可以以导热性来表示。能量通过一个物体进行的转移效率与通过这个物体以及其交叉区域的温度剃度成正比。限定在最小的厚度和温度差异的情况下。热传导的基本公式如下：
Q＝λAdT/dx
这里Q指的是热流，A是交叉组合区域的面积，dT/dx指的是温度/厚度的剃度，λ被定义为热传导值。具有大的的热传导值的物质是很好的热的导体，而只具有很小的热传导值的物质则是差的热导体，也就是很好的绝热体。因此，如果我们知道不同物体的导热值(单位是W/m·K)，我们就可以比较不同材料的绝热效率，如果需要的话还可以进行定量比较。
“核酸”指的是任何形式的DNA或RNA，包括单链、双链、三链、线状以及环状等多种形式。核酸可以是多聚核苷酸、寡核苷酸以及核酸和核酸类似物的嵌合体，核酸可以是由熟知的几种核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸以及它们的类似物或衍生物所组成。核酸可以由自然存在的或非自然存在的核苷酸碱基组成，如黄嘌呤、核苷碱基的延伸物2-氨基酰嘌呤或类似物等。核酸可以是肽核酸。核酸可以是任意长度，可以是单链或双链，或者是部分单链和部分双链。同时还包括其它的非典型的磷酸二酯键骨架的寡核苷酸衍生物，例如磷酸三酯键，肽核酸(PNA)、甲基磷酸、磷硫酸、多聚核苷酸引物、锁定核酸(LNA)以及其它。
“探针”或“核酸探针分子”是指能与目标序列杂交的寡核苷酸或核酸，主要是用于目标序列的检测。“目标序列”指的是探针能够特异性结合的核酸序列。如在扩增过程中起始目标序列扩增的引物不同，探针在使用时不需要通过多聚酶的延伸来扩增目标序列。
“互补或配对”指的是两个核酸序列至少有50％的序列互补。更适宜于指两个核酸序列具有至少60％，70，％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列互补。“互补或配对”同时也指两个核酸序列能够在低，中或者高的严谨度下杂交。
“充分的互补或充分的配对”指的是两个核酸序列有至少90％的序列互补。更适宜于指两个核酸序列具有至少95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列互补。“充分的互补或充分的配对”也可以解释为两个核酸序列能够在高严谨度下杂交。
“两个完全配对的核酸序列”指的是一个核酸双链中的两个核酸链按照Watson-Crick碱基配对原则互补配对，也就是在DNA:DNA双链中A和T配对，C和G配对，而在DNA:RNA或者RNA:RNA双链中A和U配对，C和G配对，在配对的两条链中没有插入和缺失。
“退火温度”(“Tm”)指的是使50％的双链解链时所需要的温度，这里的双链包括DNA:DNA，DNA:RNA，RNA:RNA，PNA:DNA，LNA:RNA以及LNA:DNA等。
“标记”指的是具有可检测的物理特性的化学基团或者是能够使化学基团具有可检测的物理标记的复合物，例如能够催化底物转变成或产生可检测产物的酶。“标记”同时也包括能够抑制特定的物理特性显现的复合物。“标记”也可以是一个复合物，该复合物是结合对中的一个成分，而这一结合对中的另外一个成分则带有可用于检测的物理标记。例如标记包括：金属、荧光基团、发光基团、化学发光基团、光学基团、带电基团、极性基团、发色基团、半抗原、蛋白质结合配体、核苷酸序列、放射基团、酶、颗粒、荧光共振能量转移标记、分子信标或者以上列举的各种标记的任意组合。
实施例1、生物芯片系统
生物芯片系统的结构示意图如图1所示，反应腔体1可以被打开和封闭。合适的材料是生物相容性材料，不会抑制待分析物与反应物之间的任何相互作用，例如DNA和DNA，DNA和RNA，LNA和DNA，LNA和RNA，PNA和DNA，PNA和RNA，蛋白质和蛋白质，抗体和抗原，蛋白质和DNA，蛋白质和多糖之间的相互作用。一些合适的材料包括但不限于自封闭腔(MJ Research，Inc.，MA，U.S.A.)，自封闭胶(MJ Research，Inc.，MA，U.S.A.)以及塑料封闭腔体。反应系统2包括固定有反应物的微小颗粒，带有待分析物的样品，适合于反应物与待分析物之间发生相互作用的溶液。反应物3能够通过共价或者非共价的方式而固定于基质4的表面，基质4的表面修饰有特定的化学分子或者带有生物分子从而与反应物3结合。固相基质4是一种具有良好导热性，生物相容性并且容易获得的材料。可以用作固相基质的材料包括但不限于玻璃，石英玻璃，陶瓷，硅，金属和塑料。器件5用于往反应腔体上加外力，这一外力可以促进微小颗粒在腔体内的运动从而提高固定在微小颗粒表面的反应物与待分析物结合的效率。器件6用于往反应腔体上施加外力，这一外力可以促进微小颗粒以及待分析物在基质上固定的第一种反应物的区域富集从而加速待分析物与基质上固定的反应物之间的结合。器件7用于往反应腔体上施加外力，这一外力可以促进没有与基质上固定的第一种反应物结合的微小颗粒从第一反应物的区域移开从而降低背景噪音。检测反应结果的器件8，可以是检测可见光的显微镜或者是检测荧光的荧光扫描仪。反应温度控制器件9，它可以调整升降温的速度以及温度控制的精度，温度控制器件可以是商用的PCR仪，原位PCR仪，水浴器件，或者是用于整个器件微型化的微型温度控制设备。
实施例2、生物芯片系统
在本实施例中，微小颗粒是磁性颗粒，器件5是磁力、机械或者超声器件，分别可以产生磁场力、机械力或超声作用力。器件6是磁力器件，可以产生磁场力。器件7是磁力器件或者离心器件，分别产生磁场力或离心力。本生物芯片系统的其它结构同实施例1。
实施例3、生物芯片系统
在本实施例中，微小颗粒是聚苯乙烯颗粒，器件5是机械或者超声器件，分别可以产生机械力或超声作用力。器件6是离心器件，可以产生离心力。器件7是离心器件，可以产生离心力。如图3所示，采用这种方式时，当带有反应物的基质正面朝上时，固定反应物的区域相对于基质上的其它区域下陷，以利于在离心力的作用下，微小颗粒在反应物区域的富集。本生物芯片系统的其它结构同实施例1。
实施例4、生物芯片系统
在本实施例中，微小颗粒是带电颗粒，器件5是电子、机械或者超声器件，分别可以产生电场力、机械力或超声作用力。器件6是电子器件，可以产生电场力。器件7是电子器件或者离心器件，分别产生磁场力或离心力。本生物芯片系统的其它结构同实施例1。
实施例5、生物芯片系统分析样品的程序
采用本发明的生物芯片系统进行样品分析可按图2-1至2-9所示的程序进行：
(1)如图2-1所示，将待测样品与反应溶液混合形成反应体系2，然后将该体系加入反应腔体1。体系2中包括反应所需的液体环境、在表面上分别固定有两种不同反应物A’和B’的微小颗粒D，待检测的目标a，b和x。基质4的不同位置上固定有三种不同的反应物A，B和C。反应物A’和A能够与待检目标a特异性结合，反应物B’和B能够和待检目标b特异性结合。
(2)如图2-2所示，开动器件5，在反应体系中产生作用/作用力F1，微小颗粒在反应体系2中运动加速。此时可以开启温度控制器件9以控制反应体系的温度。
(3)如图2-3所示，在器件5开动的过程中，固定在微小颗粒上的反应物A’和B’与其各自对应的待检目标a和b的识别和结合被促进，相互之间发生特异的结合。然后关闭器件5。
(4)如图2-4所示，开动器件6，产生作用/作用力F2，微小颗粒携带结合的待检目标向固相基质4上的反应物区域富集。
(5)如图2-5所示，器件6开动期间，微小颗粒携带结合的待检目标已经在固相基质4上的反应物区域富集。此时可以关闭器件6，开启温度控制器9以控制反应体系的温度。
(6)如图2-6所示，反应一段时间后，固定在微小颗粒上的待检目标a和b分别与固定在固相基质4上的反应物A和B结合，然后停止反应。
(7)如图2-7所示，开动器件7，产生作用/作用力F3，未与基质4表面发生特异性结合的微小颗粒开始离开基质4上的反应物的固定区域。
(8)如图2-8所示，器件7开动一段时间后，未与芯片表面固定的反应物发生特异性结合的微小颗粒离开基质4上的反应物的固定区域，而在反应腔体1内的其他区域富集。然后关闭器件7。
(9)如图2-9所示，采用特定的设备检测基质4上的信号。反应物A和反应物B处出现特异性信号，而反应物C处则无信号，检测结果表明待测样品中含有待检目标a和b。
实施例6、乙型肝炎病毒核酸的检测
1.带有醛基基团的基质的制备
将玻璃基质浸泡于洗液中，室温过夜。用自来水冲洗以洗净玻璃基质上的酸液，蒸馏水冲洗三次，去离子水漂洗一次，再用去离子水冲洗一次。离心甩干玻璃基质。110℃，15分钟，彻底干燥玻璃基质。将玻璃基质浸入1％APTES(异丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中。在室温下用摇床轻摇1小时。用95％乙醇清洗处理过的玻璃基质。先冲洗一次，再漂洗一次。将洗净的玻璃基质放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，关闭通气阀，110℃处理20分钟。将凉至室温的玻璃基质浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400ml 12.5％戊二醛溶液：100ml 50％的戊二醛，300ml磷酸盐缓冲液(1M NaH2PO4 30ml，2.628g NaCl)，调PH值到7.0))。室温下轻摇4小时。将玻璃基质从戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去离子水冲洗两次，离心甩干，室温干燥。
2.引物和反应物的合成
引物和反应物均由上海博亚生物技术公司合成。
反应物1为amino-5′-polyT(15nt)GCATGGACATCGACCCTTATAAAG-3′(SEQ ID NO：1)。反应物2为Hex-5′-GGAGCTACTGTGGAGTTACTCCTGG-3′-Biotin(SEQ ID NO：2)。上游引物是5′-gTTCAAgCCTCCAAgCTgTg-3′(SEQ ID NO：3)。下游引物是5′-TCAgAAggCAAAAAAgAgAgTAACT-3′(SEQ ID NO：4)。
3.生物素标记的反应物在磁性微小颗粒上的固定
DynabeadsM-280Streptavidin(10mg/mL，Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway.)100μl(磁性微小颗粒上)，用1×PBS(0.1％BSA)洗三次，将磁性微小颗粒上溶于100μl 1×PBS(0.1％BSA)中，加入2μl反应物2(50μM，溶于去离子水中)，混匀，30℃反应30分钟，同时震荡使得磁性微小颗粒上不沉底。1×TE洗3次，溶于1×TE中。
4.制备表面固定有反应物的的玻璃基质
反应物1溶于50％的DMSO中，终浓度为10μM。采用Cartesian的点样仪(Cartesian Technologies，Inc.CA，USA)按照预先设定好的样式点样。将点好的玻璃基质在室温中放置过夜以干燥玻璃基质。室温下将玻璃基质在0.2％的SDS中浸泡两次，每次2分钟，振动。将玻璃基质用去离子水冲洗两次，去离子水漂洗一次，离心甩干。把玻璃基质转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中，再加入100无水乙醇)，室温摇床轻摇5分钟。将玻璃基质用去离子水冲洗一次，去离子水漂洗两次，每次1分钟。离心甩干。
5.构建反应腔体
采用MJ Research(MJ Research，Inc.MA，USA)的自封闭腔来构建反应腔，具体的构建过程按照产品的使用说明，反应腔体所覆盖的基质区域含有印制的反应物，例如固定的探针。
6.核酸模板
采用包含有上下游引物扩增区域的克隆质粒(pCP10，100ng/μl)。
7.核酸扩增
PCR反应体系的组成如下：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3 at 24℃)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2；0.5μmol/L的上游引物以及下游引物；1单位的Taq DNA聚合酶；200μmol/L的dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.1％的BSA，0.1％的吐温20以及终浓度为2μmol/L的探针2，2μL的模板；反应的总体积为25μl。将配置好的体系加入反应腔体中并且进行密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行。采用如下的热循环程序。预变性：94℃，1minutes；主循环：94℃，30秒钟，55℃，30秒钟，72℃，1分钟，30个循环；72℃，10分钟。
8.杂交
取本实施例第3步中制备好的磁性颗粒25μl，离心去上清，加入PCR产物25μl，混匀后加入反应腔体中，封闭腔体。首先将PCR产物在94℃下变性2分钟，迅速降温至52℃，在反应腔体上施加交变磁场加速腔体内磁性颗粒的运动，保持交变磁场10分钟。停止交变磁场，在固定有反应物的基片区域的正下方施加磁场使得磁性颗粒在该区域富集，停止磁场，杂交30分钟。在腔体上施加磁场使未与基质上的反应物发生特异性结合的磁性颗粒移开基质上的反应物区域。
9.检测
可见光信号采用Leica透射显微镜观察，检测的程序遵照仪器的使用说明。结果显示基质上的固定有反应物的区域有清晰的黑色点阵信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则无黑色点阵信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦无黑色点阵信号，说明待测样品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
荧光信号采用ScanArray 4000荧光扫描仪(GSI Lumonics，MA，USA)来检测，激发波长为543nm，选用机器配置的3#激光器，信号的检测则采用机器配置的7#激光片，激光器和光电倍增管的功能均选定80％，扫描的焦距根据不同玻片做适当调整。检测的程序遵照仪器的使用说明。结果显示基质上的固定有反应物的区域有较强的荧光信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦只有较弱的荧光信号，说明待测样品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
实施例7、丙型肝炎病毒核酸的检测
丙型肝炎病毒的检测过程与实施例6中的过程相似。不同之处如以下所述。本实施例中所采用的反应物1为amino-5’-polyT(15nt)ACGACACTCATACTAACGCCA-3’(SEQ IDNO：5)。反应物2是Hex-5’-GTCGTCCTGGCAATTCCG-3’-NH2(SEQ ID NO：6)。上游引物是5’-CTCgCAAgCACCCTATCAggCAgT-3’(SEQ ID NO：7)。下游引物是5’-gCAgAAAgCgTCTAgCCATggCgT-3’(SEQ ID NO：8)。按照制造商所提供的说明将氨基修饰的反应物2固定于磁性微小颗粒(DynabeadsM-270 Carboxylic Acid at 10mg/ml，Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway)上。丙型肝炎病毒的核酸从临床血清学检测阳性的新鲜全血样品中制备，采用Roche(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland)的High PureTM Viral Nucleic Acid Kit来进行核酸的提取，起始样品量为100μl，具体操作见产品说明书。最终溶于25μl洗脱液中。在反应腔体内完成杂交后，可见光信号采用Leica透射显微镜来检测。结果显示基质上的固定有反应物的区域有清晰的黑色点阵信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则无黑色点阵信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦无黑色点阵信号，说明待测样品中含有丙型肝炎病毒的核酸。荧光信号采用ScanArray 4000荧光扫描仪。结果显示基质上的固定有反应物的区域有较强的荧光信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦只有较弱的荧光信号，说明待测样品中含有丙型肝炎病毒的核酸。
实施例8、大肠杆菌16S rRNA的检测
大肠杆菌16S rRNA的检测过程与实施例6中的过程相似。不同之处如以下所述。本实施例中的反应物1是amino-5’-polyT(15nt)GCAAA GGTAT TTACT TTACT CCC-3’(SEQID NO：9)。反应物2是Hex-5’-AATCA CAAAG TCGTA AGCGC C-3’-Biotin(SEQ ID NO：10)。16S rRNA从普通LB培养基培养的大肠杆菌DH5α中制备，样品起始量为100μL，采用QIAGEN(QIAGEN GmbH Germany)的RNeasy kit提取，提取物溶于30μL 5×SSC和0.1％SDS中。在反应腔体内完成杂交后，可见光信号采用Leica透射显微镜来检测。结果显示基质上的固定有反应物的区域有清晰的黑色点阵信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则无黑色点阵信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦无黑色点阵信号，说明待测样品中含有大肠杆菌的16S rRNA。荧光信号采用ScanArray 4000荧光扫描仪。结果显示基质上的固定有反应物的区域有较强的荧光信号，同一区域的阴性对照探针所在的位置则只有较弱的荧光信号，同时未加入待测样品的基质上的固定有反应物的区域亦只有较弱的荧光信号，说明待测样品中含有大肠杆菌的16S rRNA。

Claims (52)

1.一种生物芯片，它包括：
a)在特定基质的表面采用合适的材料所构建的可控的封闭腔体，所述的合适的材料具有良好的导热性和生物相容性，不抑制待分析物和反应物之间的结合，在所述可控的封闭腔体内部的基质表面固定有能够与所述待分析物结合的第一固定反应物；
b)一种用于将所述待分析物可控地移动到所述第一固定反应物所处位置的器件；
c)一种用于将所述分析物可控地移近特定的标记的未固定的复合物的器件，所述复合物中包括能够与所述待分析物和微小颗粒结合的第二种反应物；所述复合物包括能够与所述待分析物结合的第二种反应物和与所述第二种反应物相连接的微小颗粒；
d)一种用于将未与所述待分析物结合的所述标记的未固定的复合物从第一固定反应物区域移走的器件。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述可控的封闭腔体是自封闭腔体。
3、根据权利要求2所述的生物芯片，其特征在于：所述自封闭腔体是自封闭胶或者是塑料腔体。
4.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述基质材料选自硅、塑料、玻璃、陶瓷、橡胶、金属、多聚物、杂交膜或它们的任意组合。
5.根据权利要求4所述的生物芯片，其特征在于：所述玻璃是石英玻璃。
6.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述基质表面带有化学反应基团或者生物分子。
7.根据权利要求6所述的生物芯片，其特征在于：所述化学反应基团选自-CHO，-NH2，-SH，-S-S-，环氧基和甲苯磺酰基。
8.根据权利要求6所述的生物芯片，其特征在于：所述生物分子选自生物素、亲和素、组氨酸尾巴、链霉亲和素尾巴、组氨酸和蛋白A。
9.根据权利要求8所述的生物芯片，其特征在于：所述亲合素为链霉亲和素。
10.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述待分析物选自细胞，细胞器，分子，和它们的聚合物或复合物。
11.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第一固定反应物选自细胞，病毒，细胞器，和它们的聚合物或复合物。
12.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第一固定反应物是分子。
13.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第一固定反应物与所述待分析物特异地结合。
14.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第一固定反应物通过化学反应基团或者所述基质表面所带有的生物分子与所述基质相连接。
15.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述标记的未固定的复合物在其第二反应物或者微小颗粒上带有检测标记。
16.根据权利要求15所述的生物芯片，其特征在于：所述标记选自放射标记，发光标记，化学标记，荧光共振能量转移标记和分子信标标记。
17.根据权利要求16所述的生物芯片，其特征在于：所述发光标记为荧光标记；所述化学标记为酶学标记。
18.根据权利要求17所述的生物芯片，其特征在于：所述荧光标记与第二个荧光标记临近时产生荧光信号。
19.根据权利要求17中所述的生物芯片，其特征在于：所述荧光标记选自FAM，TET，HEX，FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，ROX，Fluroscein，TAMRA和带有稀土金属的纳米粒子。
20.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第二反应物选自细胞，病毒，细胞器，分子，和它们的聚合物或者复合物。
21.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第二反应物与所述待分析物特异的结合。
22.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述第二反应物通过化学反应基团或者是所述微小颗粒表面所带有的生物分子与所述微小颗粒相连接。
23.根据权利要求22所述的生物芯片，其特征在于：所述化学基团选自-CHO，-NH2，-SH，-S-S-和甲苯磺酰基。
24.根据权利要求22所述的生物芯片，其特征在于：所述生物分子选自生物素，亲和素，组氨酸尾巴、链霉亲和素尾巴，组氨酸和蛋白A。
25.根据权利要求24所述的生物芯片，其特征在于：所述亲和素为链霉亲和素。
26.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述微小颗粒是磁性、能够被磁化的、带电的或能够带电的微小颗粒。
27.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述微小颗粒的材料选自有机材料，玻璃，二氧化硅，陶瓷，碳和金属。
28.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述微小颗粒的直径是从1纳米到10微米。
29.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片通过电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力将所述待分析物移近所述第一种固定反应物。
30.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片通过电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力将所述待分析物移近所述标记的未固定的复合物。
31.根据权利要求30所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片通过对所述标记的未固定的复合物内的微小颗粒施加作用力实现将所述待分析物移近所述标记的未固定的复合物。
32.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片通过电场力，磁场力，声场力，重力或者离心力来将未与所述待分析物结合的所述标记的未固定的复合物从所述第一固定的反应物位置移开。
33.根据权利要求32所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片通过对所述标记的未固定的复合物内的微小颗粒施加作用力将所述标记的未固定的复合物从所述第一固定反应物的区域移开。
34.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述待分析物选自DNA，RNA，PNA，LNA，蛋白质和多糖。
35.根据权利要求34所述的生物芯片，其特征在于：所述蛋白质为肽或抗体。
36.根据权利要求34所述的生物芯片，其特征在于：所述DNA，RNA，PNA和LNA的长度为5碱基对到1000碱基对。
37.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片被用于分析DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，DNA-LNA杂交，DNA-PNA杂交，RNA-RNA杂交，RNA-PNA杂交，RNA-LNA杂交，PNA-PNA杂交，PNA-LNA杂交，蛋白质与蛋白质之间的相互作用，蛋白质与核酸之间的相互作用，蛋白质与多糖之间的相互作用或抗原抗体之间的相互作用。
38.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片是单分析通道或多分析通道的。
39.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片的分析通道的数目从1到10,000。
40.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片包括一种温度控制器件。
41.根据权利要求40所述的生物芯片，其特征在于：所述温度控制器件是PCR仪，原位PCR仪，水浴器件或者是微型热控制器件。
42.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述芯片包括用于检测所述待分析物与所述标记的未固定的复合物和所述第一固定反应物所形成的三明治结构的器件。
43.根据权利要求42所述的生物芯片，其特征在于：所述检测是光学显微镜，光学扫描仪或荧光扫描仪检测。
44.根据权利要求42所述的生物芯片，其特征在于：所述三明治结构的形成过程中，所述封闭腔体与外界环境之间没有物质的交换。
45.一种分析待分析物的方法，包括：
a)给出权利要求1所述的生物芯片；
b)往所述生物芯片的封闭腔体中加入带有或者可能带有待分析物和标记的未固定的复合物的样品，所述复合物中带有能够与待分析物以及微小颗粒结合的第二种反应物；
c)对所述生物芯片进行操作使得在所述标记的未结合的复合物、所述待分析物以及所述芯片基质上固定的第一反应物之间形成三明治结构；
d)评估所述三明治结构以确定所述样品中所述待分析物的存在与否或者对其进行定量。
46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述样品是固体、液体或气体样品。
47.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述方法用于单个或者多个待分析物分析。
48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于：所述多个待分析物分析按照顺序进行或者同步进行。
49.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述方法用于1到30,000个待分析物的分析。
50.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述三明治结构通过以下方式形成：首先将所述待分析物移近所述标记的未固定的复合物使其与后者结合；然后将所述待分析物与所述标记的未固定的复合物的结合体移近所述第一固定的反应物，使得所述待分析物与所述第一固定的反应物之间发生结合而形成三明治结构，然后从所述第一固定反应物的区域移走未与所述待分析物结合的标记的未结合的复合物。
51.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述标记的未固定的复合物中的微小颗粒直接用作检测的标记。
52.根据权利要求45所述的方法，其特征在于：所述三明治结构的形成过程中，封闭腔体与外界环境之间没有物质的交换。
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