CN120000858B - 一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。本发明的复合膜由硬核和软壳组成。本发明通过二元羧酸酯交联剂和Zr‑MOP对自组装胶原纤维进行交联和仿生矿化形成硬核交联矿化胶原纤维膜，然后用软壳甲基丙烯酰化胶原凝胶将其包裹，压制后制得。本发明复合膜的软壳疏松多孔，有利于骨细胞的粘附和增殖；硬核为致密层，能够提供较好的支撑性能，有效阻挡上皮细胞及成纤维细胞侵入成骨区域；Zr‑MOP提供的可调控的孔结构能保证缺损区正常的物质交换。因此本发明的复合膜具有较高的机械强度、可控的降解速率及良好的生物相容性，在骨修复过程中能起到良好的屏障作用及促进骨再生的效果。

Description

一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜及其制备方法与 应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜及其制备方法与应用。

背景技术

炎症、外伤等因素导致的牙槽骨缺损在口腔临床实践中较为常见，由于骨缺损导致的骨量不足也是目前临床牙种植面临的主要挑战和热点问题。引导骨再生（Guided BoneRegeneration,GBR）技术是临床上解决种植体周围骨缺损的常用方法，该技术使用一种屏障膜在骨缺损区域和牙龈软组织之间建立起一道生物屏障，防止生长速度较快的软组织成纤维细胞侵入骨缺损区域，为生长较慢的成骨细胞提供附着位点和生长空间。屏障膜在引导骨再生术中起着重要作用，是GBR技术的核心，理想的屏障膜需要具有良好的生物相容性、较好的支撑性、与骨再生的时间相协调的可生物降解性以及保证基本营养物质交换的多孔性。

根据是否可降解的特性，GBR膜可分为不可降解膜和可生物降解膜，其中不可降解膜虽具有较好的机械强度，支撑性好，但需要二次手术取出，会增加炎症的风险及加大患者的负担；可生物降解膜能够在实现GBR功能的同时生物降解，是目前研究的热点。

胶原蛋白因其良好的生物相容性、可生物降解性等优良性质被广泛用作制备GBR膜的原料。目前临床使用最为广泛的GBR膜是瑞士盖氏公司的Bio-Gide胶原膜，其具有独特的双层结构，一层致密，能阻隔结缔组织侵入，另一层疏松多孔，有利于成骨细胞的附着和生长。然而，Bio-Gide以及目前大部分GBR膜仍存在一些缺陷，比如降解速度过快、机械性能较差、容易发生膜暴露。此外，具有双层结构的GBR膜在临床手术中需要区分正/反面（致密层朝向牙龈），然而医生在实际操作时容易混淆（尤其是膜被血液浸染之后），因此可能导致GBR手术效果被削弱。为解决GBR胶原膜易降解、塌陷和破裂、机械力学性能差等问题，现有技术通常采用化学交联及仿生矿化提升其相关性能，然而戊二醛等常规化学交联剂被发现会引起机体炎症和钙化反应，具有细胞毒性，并且传统的矿化材料（如羟基磷灰石）对膜的孔结构存在破坏作用，难以保证骨缺损区域的正常物质交换。

综上所述，目前的胶原基引导骨再生屏障膜仍然存在着机械强度较差、降解时间太快、临床须区分膜正/反面导致使用不便等问题，迫切需要新的制备技术和改性策略优化胶原膜的性能，提升膜的实用性。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜及其制备方法与应用，以解决目前GBR膜机械性能差，体内降解速度过快、缺乏孔结构、需要区分膜正/反面导致使用不便的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，包括硬核和软壳；其中硬核的核层厚度为0.1-1mm，由交联矿化胶原纤维膜组成；软壳的壳层厚度为0.05-0.1mm，由甲基丙烯酰化胶原凝胶组成。

本发明提供了上述引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备自组装胶原纤维凝胶；

（2）将步骤（1）制得的自组装胶原纤维凝胶分散为悬液，采用二元羧酸酯交联剂对悬液进行交联4-8h；

（3）在步骤（2）所得产物中加入水溶性金属有机多面体（Zr-MOP），反应2-4h，然后进行离心洗盐、重悬，抽滤后制得交联矿化胶原纤维膜；

（4）将胶原溶解后加入甲基丙烯酸酐溶液，反应3-6h，透析后制得甲基丙烯酰化胶原溶液，然后将步骤（3）制得的交联矿化胶原纤维膜浸泡于甲基丙烯酰化胶原溶液中，调节溶液pH至7.2-7.6，加入氯化钠，孵育后加入光引发剂进行光交联，制得甲基丙烯酰化胶原凝胶；

（5）对步骤（4）所得产物进行冷冻干燥，压制后制得。

进一步，步骤（1）中制备自组装胶原纤维凝胶具体包括以下步骤：将胶原溶于含氯化钠的PBS溶液中，使用氢氧化钠溶液调节pH至中性，然后孵育3-4h制得。

进一步，胶原为鱼皮胶原、牛/猪皮胶原、牛/猪跟腱胶原、鱼皮/鱼鳞胶原或牛/猪软骨胶原。

进一步，步骤（2）中二元羧酸酯交联剂的化学结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，R为C₁-C₁₀的烷基链。

进一步，二元羧酸酯交联剂的制备方法包括以下步骤：将N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸加入丙酮中，混合后加入脱水剂反应4-8h，过滤后收集沉淀，洗涤后烘干，制得；其中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸的质量比为1:0.1-10；脱水剂与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.1-20。

进一步，二元羧酸为己二酸、辛二酸或戊二酸；脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

进一步，步骤（3）中Zr-MOP的制备方法包括以下步骤：将二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸加入水与二甲基乙酰胺混合溶液中反应2-6h，过滤后烘干，制得；其中，二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸的质量比为1:0.1-10；水与二甲基乙酰胺的体积比为1:1-20。

进一步，步骤（4）中胶原与甲基丙烯酸酐溶液的质量比为1:0.01-0.5；胶原为鱼皮胶原、牛/猪皮胶原、牛/猪跟腱胶原、鱼皮/鱼鳞胶原或牛/猪软骨胶原。

本发明还提供了一种上述引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜在制备口腔骨缺损修复材料中的应用。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明以自组装胶原纤维为构建单元，自组装是胶原在特定条件下通过非共价作用自发聚集成纤维的一种特性，可以通过此方式制备纳米尺度胶原纤维，由其作为构建单元制备的纤维膜相比于胶原分子膜具有更好的机械性能及耐降解性。同时，相比于常用于制备纳米纤维的静电纺丝法，自组装能最大程度保留胶原天然活性，且制备难度远低于静电纺丝，具有较好的应用潜力；

（2）本发明采用生物相容性良好的N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化二元羧酸制得二元羧酸酯交联剂，用于自组装胶原纤维的化学交联，相较于现有的屏障膜，本发明的复合膜具有“硬核-软壳”的独特夹心结构，具有良好的生物相容性、较高的机械强度以及合适的降解速率；

（3）本发明采用水溶性金属有机多面体（Zr-MOP）对胶原自组装纤维进行仿生矿化，因此本发明制备的复合膜具有可调控的孔结构，水溶性金属有机多面体有利于与胶原的反应结合，且改变金属有机多面体的类型可灵活调控膜的孔结构，有利于骨缺损处营养物质的交换，对骨修复有着积极作用；

（4）本发明制备的复合膜在临床使用时无需区分正反面，同样能达到GBR的效果，使用更加便捷且避免了混淆正反面给GBR带来的负面影响；

（5）本发明采用甲基丙烯酸酐改性胶原，保留其天然三股螺旋结构，并赋予其光交联的特性，能够与胶原纤维膜紧密结合，形成三维多孔纤维网络，有利于骨细胞的生长及粘附；

（6）本发明的复合膜制备方法采用真空抽滤、自然风干、冷冻干燥和室温机械压片，操作简单易行，对设备要求不高，适合规模化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的表面SEM图像；

图2为本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的截面SEM图像；

图3为本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的应力-应变曲线；

图4为本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜在胶原酶作用下质量随时间的变化曲线；

图5为本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的吸附-解吸曲线及孔径分布曲线；

图6为L929成纤维细胞在本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜上培养3天后在膜内的迁移情况。

具体实施方式

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，包括硬核和软壳；其中硬核的核层厚度为0.5mm，由交联矿化胶原纤维膜组成；软壳的壳层厚度为0.08mm，由甲基丙烯酰化胶原凝胶组成。

其制备方法包括以下步骤：

（1）称取10份鱼皮胶原溶于200份0.01M PBS（含0.1M氯化钠）溶液中制备胶原溶液，用0.1M氢氧化钠溶液将溶液pH调至7.4，在37℃下孵育4h，然后将胶原纤维机械分散均匀得到胶原纤维悬液；

（2）将20份N-羟基硫代琥珀酰亚胺与15份己二酸加入100份丙酮中，混合后加入25份1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）交联反应4h，过滤后收集沉淀，沉淀洗涤后真空干燥，制得二元羧酸酯交联剂；其中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸的质量比为1:0.1。其化学结构式如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，R为C₄H₈；

（3）将二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸加入水与二甲基乙酰胺混合溶液中反应4h，过滤后烘干，制得水溶性金属有机多面体Zr-MOP；其中，二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸的质量比为1:0.1；水与二甲基乙酰胺的体积比为1:10。

（4）向步骤（1）制得的胶原纤维悬液中添加0.1份步骤（2）制得的二元羧酸酯交联剂（二甲基亚砜（DMSO）溶解），然后加入0.05份步骤（3）制得的Zr-MOP（去离子水分散），4℃下反应2h，反应中止后，将反应体系离心取沉淀，加入去离子水洗涤，重复离心3次，采用真空抽滤泵进行抽滤，然后将过滤产物在室温下风干，制得胶原膜的“硬核”部分，即交联矿化胶原纤维膜；

（5）称取5份鱼皮胶原溶解于100份0.1M乙酸中，再用1M的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至9，再加入0.5份的甲基丙烯酸酐溶液搅拌反应，反应3h，然后使用0.1M的乙酸溶液透析两天得到甲基丙烯酰化胶原溶液；

（6）将步骤（4）制得的交联矿化胶原纤维膜浸没于10份步骤（5）制得的甲基丙烯酰化胶原溶液中，调节溶液pH为7.4，加入0.2份氯化钠充分溶解，在37℃孵育溶液30min，然后加入0.005份VA-086光引发剂，置于紫外光源下照射10min进行光交联获得凝胶，制得复合膜的“软壳”部分，即甲基丙烯酰化胶原凝胶；

（7）将步骤（6）所得产物将膜置于-20℃冷冻，后用冷冻干燥机在-60℃下冷冻干燥，最后用压片机于5Mpa，25℃下加压15min，制得内部致密、外部两侧疏松多孔的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜（见图1-2）。

实施例2：

一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，包括硬核和软壳；其中硬核的核层厚度为1mm，由交联矿化胶原纤维膜组成；软壳的壳层厚度为0.1mm，由甲基丙烯酰化胶原凝胶组成。

其制备方法包括以下步骤：

（1）称取10份牛皮胶原溶于100份 0.01M PBS（含0.12M 氯化钠）溶液中制备胶原溶液，用0.1M氢氧化钠溶液将溶液pH调至7.2，在37℃下孵育4h，然后将胶原纤维机械分散均匀得到胶原纤维悬液；

（2）将10份N-羟基硫代琥珀酰亚胺与30份戊二酸加入100份丙酮中，混合后加入20份1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐交联反应8h，过滤后收集沉淀，沉淀洗涤后真空干燥，制得二元羧酸酯交联剂；其中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸的质量比为1:5。其化学结构式如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，R为C₃H₆；

（3）将二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸加入水与二甲基乙酰胺混合溶液中反应4h，过滤后烘干，制得水溶性金属有机多面体Zr-MOP；其中，二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸的质量比为1:1；水与二甲基乙酰胺的体积比为1:20。

（4）向步骤（1）制得的胶原纤维悬液中添加0.05份步骤（2）制得的二元羧酸酯交联剂（DMSO溶解），然后加入0.1份步骤（3）制得的Zr-MOP（去离子水分散），4℃下反应2h，反应中止后，将反应体系离心取沉淀，加入去离子水洗涤，重复离心3次，采用真空抽滤泵进行抽滤，然后将过滤产物在室温下风干，制得胶原膜的“硬核”部分，即交联矿化胶原纤维膜；

（5）称取5份鱼皮胶原溶解于50份0.1M乙酸中，再用1M的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至9，再加入0.1份的甲基丙烯酸酐溶液搅拌反应，反应3h，然后使用0.1M的乙酸溶液透析两天得到甲基丙烯酰化胶原溶液；

（6）将步骤（4）制得的交联矿化胶原纤维膜浸没于20份步骤（5）制得的甲基丙烯酰化胶原溶液中，调节溶液pH为7.2，加入0.5份氯化钠充分溶解，在37℃孵育溶液30min，然后加入0.001份VA-086光引发剂，置于紫外光源下照射10min进行光交联获得凝胶，制得复合膜的“软壳”部分，即甲基丙烯酰化胶原凝胶；

（7）将步骤（6）所得产物将膜置于-20℃冷冻，后用冷冻干燥机在-60℃下冷冻干燥，最后用压片机于10Mpa，30℃下加压10min，制得内部致密、外部两侧疏松多孔的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜。

实施例3：

一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，包括硬核和软壳；其中硬核的核层厚度为0.5mm，由交联矿化胶原纤维膜组成；软壳的壳层厚度为0.08mm，由甲基丙烯酰化胶原凝胶组成。

其制备方法包括以下步骤：

（1）称取20份猪皮胶原溶于150份0.01M盐酸（含0.1M氯化钠）溶液中制备胶原溶液，用3M三羟基氨基甲烷溶液将溶液pH调至7.6，在37℃下孵育4h，然后将胶原纤维机械分散均匀得到胶原纤维悬液；

（2）将40份N-羟基硫代琥珀酰亚胺与10份辛二酸加入100份丙酮中，混合后加入60份1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）交联反应8h，过滤后收集沉淀，沉淀洗涤后真空干燥，制得二元羧酸酯交联剂；其中，N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸的质量比为1:10。其化学结构式如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，R为C₆H₁₂；

（3）将二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸加入水与二甲基乙酰胺混合溶液中反应4h，过滤后烘干，制得水溶性金属有机多面体Zr-MOP；其中，二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸的质量比为1:10；所述水与二甲基乙酰胺的体积比为1:40。

（4）向步骤（1）制得的胶原纤维悬液中添加0.3份步骤（2）制得的二元羧酸酯交联剂（二甲基亚砜（DMSO）溶解），然后加入0.15份步骤（3）制得的Zr-MOP（去离子水分散），4℃下反应2h，反应中止后，将反应体系离心取沉淀，加入去离子水洗涤，重复离心3次，采用真空抽滤泵进行抽滤，然后将过滤产物在室温下风干，制得胶原膜的“硬核”部分，即交联矿化胶原纤维膜；

（5）称取20份鱼皮胶原溶解于100份0.1M乙酸中，再用1M的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至9，再加入1份甲基丙烯酸酐溶液搅拌反应，反应3h，然后使用0.1M的乙酸溶液透析两天得到甲基丙烯酰化胶原溶液；

（6）将步骤（4）制得的交联矿化胶原纤维膜浸没于20份步骤（5）制得的甲基丙烯酰化胶原溶液中，调节溶液pH为7.6，加入1份氯化钠充分溶解，在37℃孵育溶液60min，然后加入0.01份VA-086光引发剂，置于紫外光源下照射20min进行光交联获得凝胶，制得复合膜的“软壳”部分，即甲基丙烯酰化胶原凝胶；

（7）将步骤（6）所得产物将膜置于-20℃冷冻，后用冷冻干燥机在-60℃下冷冻干燥，最后用压片机于10Mpa，35℃下加压15min，制得内部致密、外部两侧疏松多孔的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜。

试验例：

（1）本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的应力-应变曲线：将实施例1制备的复合膜裁剪成长30mm，宽5mm的长条状，将上下两端夹在万能试验机的夹具上，进行拉伸强度测试，得到实施例1制备的复合膜的应力-应变曲线。由图3可知，复合膜的最大拉伸强度约为35MPa，商用Bio-Gide的拉伸强度约为5Mpa，表明采用本发明的制备方法制备复合膜能有效提高其力学性能。

（2）本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜在胶原酶作用下质量随时间的变化曲线：将复合膜裁剪成1*1cm圆片，置于24孔板中，加入2mL浓度15U/mL的胶原酶溶液，在37℃下分别孵育1、3、5和7h，然后分别取出洗涤，干燥后称重，与原始质量进行比较，得到膜质量分数随酶作用时间变化曲线。图4中CCFM为未矿化胶原膜，MCCFM为矿化交联纤维膜，4%，8%，12%表示Zr-MOP加入的比例。由图4可知，经矿化交联处理后，复合膜的耐酶降解能力显著提升，表明采用交联改性和仿生矿化手段能显著提高复合膜的稳定性，能够有效延长复合膜的降解时间。

（3）本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的吸附-解吸曲线及孔径分布曲线：将复合膜剪碎，称取1g复合膜装入测量管中，用BET全自动比表面积分析仪对膜比表面积和孔径进行测量，得到其吸附-解吸曲线级孔径分布曲线。由图5可知，复合膜膜平均孔径约为45nm，为介孔结构，能够实现良好的物质交换。

（4）L929成纤维细胞在本发明实施例1制备的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜上培养3天后在膜内的迁移情况：首先对膜进行辐照灭菌处理，后将膜裁剪成1*1cm圆片置于激光共聚焦小皿中，将培养至对数生长期的L929小鼠成纤维细胞按照细胞密度5000个/样接种于复合膜表面，3天后对细胞染色观察细胞在复合膜横截面的迁移情况以判断膜的细胞屏障性能。由图6中B图可知，3天后细胞在截面迁移的最大深度约为0.1mm，与对照组的商用胶原膜（见图6中A图）相当，表明实施例1制备的复合膜具有较好的细胞屏障功能，能在引导骨再生术中有效发挥屏障作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，包括硬核和软壳；其中所述硬核的核层厚度为0.1-1mm，由交联矿化胶原纤维膜组成；所述软壳的壳层厚度为0.05-0.1mm，由甲基丙烯酰化胶原凝胶组成；

所述引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备自组装胶原纤维凝胶；

（2）将步骤（1）制得的自组装胶原纤维凝胶分散为悬液，采用二元羧酸酯交联剂对悬液进行交联4-8h；

（3）在步骤（2）所得产物中加入水溶性金属有机多面体，反应2-4h，然后进行离心洗盐、重悬，抽滤后制得交联矿化胶原纤维膜；

（4）将胶原溶解后加入甲基丙烯酸酐溶液，反应3-6h，透析后制得甲基丙烯酰化胶原溶液，然后将步骤（3）制得的交联矿化胶原纤维膜浸泡于甲基丙烯酰化胶原溶液中，调节溶液pH至7.2-7.6，加入氯化钠，孵育后加入光引发剂进行光交联，制得甲基丙烯酰化胶原凝胶；

（5）对步骤（4）所得产物进行冷冻干燥，压制后制得。

2.根据权利要求1所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，步骤（1）中所述制备自组装胶原纤维凝胶具体包括以下步骤：将胶原溶于含氯化钠的PBS溶液中，使用氢氧化钠溶液调节pH至中性，然后孵育3-4h制得。

3.根据权利要求2所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，所述胶原为鱼皮胶原、牛皮胶原或猪皮胶原。

4.根据权利要求1所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，步骤（2）中所述二元羧酸酯交联剂的化学结构如式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，R为C₁-C₁₀的烷基链。

5.根据权利要求4所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，所述二元羧酸酯交联剂的制备方法包括以下步骤：将N-羟基硫代琥珀酰亚胺与二元羧酸加入丙酮中，混合后加入脱水剂反应4-8h，过滤后收集沉淀，洗涤后烘干，制得；其中，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺与所述二元羧酸的质量比为1:0.1-10；所述脱水剂与所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.1-20。

6.根据权利要求5所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，所述二元羧酸为己二酸、辛二酸或戊二酸；所述脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

7.根据权利要求1所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，步骤（3）中所述水溶性金属有机多面体的制备方法包括以下步骤：将二氯二茂锆与氨基-对二苯甲酸加入水与二甲基乙酰胺混合溶液中反应2-6h，过滤后烘干，制得；其中，所述二氯二茂锆与所述氨基-对二苯甲酸的质量比为1:0.1-10；所述水与所述二甲基乙酰胺的体积比为1:1-20。

8.根据权利要求1所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜，其特征在于，步骤（4）中所述胶原与所述甲基丙烯酸酐溶液的质量比为1:0.01-0.5；所述胶原为鱼皮胶原、牛皮胶原或猪皮胶原。

9.权利要求1所述的引导骨再生用胶原基硬核夹心复合膜在制备口腔骨缺损修复材料中的应用。