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CN120173884A - 功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系白血病的组合物中的应用 - Google Patents

功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系白血病的组合物中的应用 Download PDF

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CN120173884A
CN120173884A CN202311734846.3A CN202311734846A CN120173884A CN 120173884 A CN120173884 A CN 120173884A CN 202311734846 A CN202311734846 A CN 202311734846A CN 120173884 A CN120173884 A CN 120173884A
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CN
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region
granzyme
combination
chimeric antigen
antigen receptor
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冯晓明
单玲玲
李踔
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Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
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Abstract

本发明提供了一种功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系白血病的组合物中的应用。本发明优化建立了一种新型的针对急性髓系白血病(AML)的嵌合抗原受体(CAR)，以及由该CAR修饰的免疫效应细胞(基因修饰的免疫效应细胞)。本发明中也揭示了其制备方法及其在抑制急性髓系白血病中的应用。

Description

功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系 白血病的组合物中的应用
技术领域
本发明属于医学生物领域，更具体地，本发明涉及一种功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系白血病的组合物中的应用，以及相应的细胞疗法。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是一种恶性血液疾病，临床上根据白血病细胞的来源和分化程度将AML分为多种亚型(M0-M7)，该疾病的死亡率高，治愈率低，预后较差。AML患者的五年生存率低。对于复发或难治性的AML患者(r/r AML)，传统治疗方案效果有限，造血干细胞移植(HSCT)是目前唯一可行的治愈方法。然而，仍有一部分患者在移植后出现复发，或者治疗效果不佳。急性粒单核细胞白血病(M4)/急性单核细胞白血病(M5)亚型是AML中较为特殊的类型，涉及单核系细胞恶性克隆性增生，具有高度的浸润性和侵袭性。M4/M5亚型约占AML的1/3，在临床实践中通常认为M4/M5的疗效不佳。
近年来，研究人员开发了几种不同的靶向治疗方法，包括免疫检查点抑制剂、T细胞受体修饰的T细胞治疗以及嵌合抗原受体-T细胞治疗等。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法在治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)方面表现出较好的疗效。
尽管临床前研究提出，使用CD33、CD38、CD123以及其他在髓系肿瘤细胞表面高表达的分子作为靶向抗原，但CAR-T细胞疗法在AML中的可行性仍然存在待确定的问题，在临床试验中CAR-T细胞靶向这些靶点治疗r/rAML效果不佳。CD33是CAR T细胞疗法治疗M4/M5型AML的潜在靶点之一。然而，CD33在正常造血干细胞中也有表达，这就凸显了确定M4/M5型AML特异性靶点以最大限度降低潜在不良反应风险的迫切需要。因此，本领域亟待找到更好的方式方法来改变现状，获得对于AML这一独特的癌症疾病的有效治疗途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种功能优化的嵌合抗原受体效应细胞及其在制备治疗急性髓系白血病的组合物中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种基因修饰的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制(包括缓解或治疗)急性髓系白血病的药物；所述基因修饰的免疫效应细胞转导有编码嵌合抗原受体的多核苷酸或其表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15(IL-15)、颗粒酶A(Granzyme A；GA)、颗粒酶B(Granzyme B；GB)，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
在一种或多种实施方式中，所述的特异性识别CD64的结合蛋白是抗体；优选地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体；更优选地，所述的抗体是单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一种或多种实施方式中，所述跨膜区是包含CD8或CD28的铰链区、跨膜区的序列；优选地，所述跨膜区是包含CD8的铰链区、跨膜区(如CD8hinge-CD8 TM)的序列；更佳地，所述的铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一种或多种实施方式中，所述胞内信号区包括选自4-1BB，CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD134，ICOS，GITR的胞内信号区序列，或其组合；优选地，所述胞内信号区包括4-1BB和CD3ζ；更佳地，所述4-1BB氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的CD3ζ氨基酸序列如SEQID NO:5所示。
在一种或多种实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区：CD64的单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB、CD3ζ以及增效因子。
在一种或多种实施方式中，所述的免疫效应细胞包括选自下组的细胞或其组合：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
在本发明的另一方面，提供一种嵌合抗原受体(CAR)或编码其的核酸，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15、颗粒酶A、颗粒酶B，或它们的组合；优选地，所述增效因子为白介素-15和颗粒酶B的组合。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的核酸。
在一种或多种实施方式中，所述的表达载体以pCDH为骨架质粒。
在一种或多种实施方式中，胞内信号区与增效因子之间以连接子连接，优选地所述连接子包括P2A或类似分子。
在一种或多种实施方式中，本发明还提供一种病毒，所述的病毒(如慢病毒)包含所述的表达载体，或由所述表达载体经由包装获得。
在本发明的另一方面，提供一种基因修饰的免疫效应细胞，该细胞抑制(包括缓解或治疗)急性髓系白血病，该细胞转导有编码嵌合抗原受体的多核苷酸或其表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15(IL-15)、颗粒酶A(Granzyme A；GA)、颗粒酶B(Granzyme B；GB)，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
在一种或多种实施方式中，所述的基因修饰的免疫效应细胞还表达细胞因子，所述细胞因子具有包括选自下组的特点：具有免疫调节活性或抗肿瘤活性，具有增强免疫效应细胞的功能。
在一种或多种实施方式中，所述的细胞因子包括(但不限于)：IL-12，IL-21，IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-17，IL-18，IL-23。
在一种或多种实施方式中，该细胞还表达趋化因子受体(其阻断肿瘤的转移)；优选地，所述的趋化因子受体包括：CCR2或CCR7。
在一种或多种实施方式中，该细胞还表达能降低PD-1表达的抑制分子(如siRNA)或者阻断PD-L1的蛋白。
在一种或多种实施方式中，该细胞还表达安全开关；优选地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。
在本发明的另一方面，提供一种制备基因修饰的免疫效应细胞的方法，包括：在免疫效应细胞中引入编码嵌合抗原受体的多核苷酸，使该细胞表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15(IL-15)、颗粒酶A(Granzyme A；GA)、颗粒酶B(Granzyme B；GB)，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制(包括缓解或治疗)急性髓系白血病的药物组合物或含有该药物组合物的药盒，所述药物组合物包括所述的基因修饰的免疫效应细胞，以及药学上可接受的药学载体或赋形剂。
在一种或多种实施方式中，所述的药盒中包括：容器，以及位于容器中的所述的药物组合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-GA、CD64bbz-GB载体的各个元件的结构示意图。
图2、不同CAR-T细胞的制备及其感染效率分析，以流式细胞术分析。
图3、体外杀伤模型中，不同CAR-T细胞的杀伤效率分析。
图4、不同CAR-T细胞对于动物肿瘤(荷瘤小鼠的肿瘤)的生长的抑制作用、体内的扩增分析，以及动物生存期分析。
图5、不同CAR-T细胞对于荷瘤小鼠肿瘤的生长抑制作用、体内的扩增分析，以及动物生存期分析。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究筛选，优化建立了一种新型的针对急性髓系白血病(AML)的嵌合抗原受体(CAR)，以及由该CAR修饰的免疫效应细胞(基因修饰的免疫效应细胞)。本发明中也揭示了其制备方法及其在抑制急性髓系白血病中的应用。
急性髓系白血病是一种以异常原始细胞聚集为特征的恶性疾病，死亡率很高。采用标准化疗方案后，仅大约40-45％的年轻急性髓性白血病患者和10-20％的老年急性髓性白血病患者可以治愈。治疗难治性急性髓系白血病的主要策略是异基因干细胞移植(SCT)。然而，SCT前未完全缓解的患者预后极差。
CAR-T细胞疗法治疗B急性淋巴细胞白血病(B-ALL)已经取得一定疗效，但是在治疗急性髓系白血病却效果很差，表现为CAR T细胞无法实现足够效率的扩增、靶向杀伤效果低/不显著，受试者对CAR-T细胞疗法显示出耐药性等。因此获取一种可以治疗急性髓系白血病的新型CAR T药物有极大的临床需求。
术语
如本发明所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”指，包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至胞质信号传导结构域(也称为“胞内信号区”)的重组多肽构建体，其中所述胞内信号区包含源自刺激分子和/或共刺激分子的功能信号传导结构域。例如，刺激分子可以是与T细胞受体复合物相关的ξ链，共刺激分子可以是4-1BB(CD137)和/或CD28。
如本发明所用，所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，其包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞等；优选地，所述“免疫细胞”或“免疫效应细胞”为T淋巴细胞。
如本发明所用，“胞内信号传导结构域”或“胞内信号区”或“胞内信号传导激活区域”指CAR分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生可以促进CAR免疫效应细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能的例子，例如在CAR T细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
如本发明所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸/蛋白区域或核酸/蛋白序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。
如本发明所用，“单链抗体(scFv)片段”指的是抗体片段，其包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其它修饰方法作进一步修饰。
如本发明所用，“特异性识别”的意思是本发明的胞外结合区(如单链抗体)不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
针对急性髓系白血病这一具有特殊性质的难治性非实体瘤，发明人前期考察了多种多样的肿瘤相关基因，发现这类基因中相当大一部分也表达于部分组织的正常细胞中，较难应用于CAR修饰的免疫效应细胞技术；有的肿瘤特异性基因具有较好的肿瘤特异性表达特性，但基于其设计的CAR修饰的免疫效应细胞没有肿瘤细胞杀伤活性或者活性很低，这可能是因为该靶点可以引发肿瘤细胞分泌对免疫效应细胞起抑制作用的因子。经过对多种多样的基因的反复考察和筛选，确定了以CD64作为制备CAR的靶抗原、并且应用特定的增效因子来提高其扩增效率和/或杀伤效率。CD64的氨基酸序列公开于GenBank登录号(GenBank:BC152383.1)。
CD64是IgG的高亲和力受体，其呈现仅在髓系谱系的活化细胞上高水平表达，尤其在急性髓性白血病M4和M5亚型中表达增强，但不表达在造血干细胞上。CD64作为CAR-T治疗AML的潜在靶位点之一，但是临床前结果显示体内抗肿瘤效果是短暂的，且伴随着循环中CAR-T细胞数量的下降。因此，推动CD64 CAR-T细胞疗法进入临床应用同样需要增强CAR-T细胞对肿瘤的杀伤和持续时间。
本发明的研究显示，应用于本发明中涉及急性髓系白血病的CAR效应细胞的制备时，CD64可以是较为理想的CAR免疫效应细胞法治疗靶点，特别是其能够与增效因子相互配合、增效作用非常显著，以该技术方案制备CAR效应细胞细胞，可显著延长肿瘤患者的生存期。
在优选的方案中，本发明中特异性识别和结合CD64的结合蛋白为单链抗体，优选地其氨基酸序列列举于实施例的表1中。本发明人的研究表明，由本发明所述的两个单链抗体所构成的CAR效应细胞保留了对抗原阳性细胞的高效性选择性杀伤作用。
本发明的实施例中证明，本发明的CAR修饰的效应细胞可以高度选择性地清除CD64阳性的肿瘤细胞。本发明的针对CD64的CAR效应细胞是一种应用于进行急性髓系白血病治疗的高效低毒、靶向性强的新手段。
基于本发明人的新方案，提供了一种表达于免疫效应细胞表面的CAR，所述的CAR包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效分子。本发明CAR将特定的胞外结合区、胞内信号区组合在一起，进一步再于增效分子进行连接。将该CAR表达于免疫效应细胞的表面，可使得免疫效应细胞的扩增量大大增加，且对表达CD64的肿瘤具有高度特异性的细胞杀伤作用。所述增效分子的氨基酸序列列于实施例的表1中。
应理解，本发明也包括所述增效分子元件的同功能变体以及其它用于制备所述CAR的各个元件的同功能变体。
所述各个元件的同功能变体包括片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的各个元件相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，所述同功能变体还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述元件的活性片段和活性衍生物。所述同功能变体还包括(但并不限于)：与所述的元件的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。
本发明还提供了编码本发明各个元件或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或相应元件的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。“重组表达载体”可以是能在宿主体内复制和稳定的任何质粒和载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本发明中，所述增效分子为白介素-15(IL-15)、颗粒酶A(Granzyme A；GA)、颗粒酶B(Granzyme B；GB)，或它们的组合；优选地，所述增效因子为白介素-15和颗粒酶B的组合。所述增效分子与构成CAR的其它元件连接后，可以有效地发挥活性，并且所述增效分子的协同增效作用非常显著，所述协同增效尤其表现在提高CAR效应细胞的扩增能力以及杀伤效力，增强CAR效应细胞对CD64阳性AML细胞的治疗效果和持续时间。
IL-15是一种多效细胞因子，对于先天性和适应性免疫细胞的稳态起着关键作用。此外，IL-15还能通过调节代谢活性增加抗凋亡基因Bcl-2的表达，延长细胞存活，增加T细胞数量，提升其效应器功能(即打破对肿瘤的耐受性并激活其他耐受性T细胞)，并促进效应器细胞对靶组织细胞的精准识别和定位，从而显著提高治疗效果。
颗粒酶是免疫细胞发挥抗肿瘤作用的重要介质。当CAR T细胞识别到表达特定抗原的癌细胞时，它们会向癌细胞释放Granzymes等因子，从而引发细胞凋亡。颗粒酶A是一种类胰蛋白酶，可诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡，主要依靠切割SET复合物诱导细胞死亡，此外，颗粒酶A还能裂解高迁移率族框蛋白2(HMGB2)和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(Ape1)并使其失活，从而干扰碱基切除修复，进而破坏DNA修复；颗粒酶B可激活Caspase-3或直接切割其底物BH3相互作用结构域死亡激动剂(bid)和半胱天冬酰胺酶激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂(ICAD)，从而引发细胞死亡级联反应，促进靶细胞凋亡。
所述胞外结合区包含特异性识别CD64的蛋白。将该CAR表达于免疫效应细胞的表面，可使得免疫效应细胞对高表达CD64的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。
作为本发明的优选方式，所述的胞外结合区为单链抗体(scFv)。所述scFv是功能性的。通常所述单链抗体以通过制备重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)，再将之操作性连接而制备。优选地，所述的VH与VL通过柔性连接子加以连接。
本发明所述的嵌合抗原受体中，所述单链抗体可通过与铰链区序列以及跨膜区序列操作性连接，进而与胞内信号区进行操作性连接。在本发明的优选方式中，所述的铰链区为CD8铰链区。
CAR的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的优选实施方案中，跨膜区选自CD8(CD8α)或者CD28的跨膜区。CD8铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区可被用于将CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。
胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，4-1BB，CD134，ICOS，GITR蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3 zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外，CD28，4-1BB，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起免疫效应细胞(主要是T淋巴细胞)的持续增殖，并能够提高免疫效应细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR免疫效应细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的实施例中，提供了本发明人优选的CAR(图1)。此外应理解，在本发明优化的CAR基础上，进行一些改变或修饰的CAR也可被包含在本发明中。
作为本发明的一种方式，CAR在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。
本发明也包括编码所述CAR的核酸。本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码CAR蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。
本发明还包括上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还提供了基因修饰的免疫效应细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。所述的所述细胞为细胞或含有所述细胞的细胞间，优选地为T细胞或含有T细胞的细胞群。
本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。
本发明还提供了包含上述编码表达于免疫效应细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸的表达构建体(载体)，包括病毒载体或非病毒载体。
所述的非病毒载体系统例如睡美人转座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统，其转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells forallogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。此外，mRNA转染技术也是可被应用的。
多种用于病毒包装的载体可被应用于本发明中，例如包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，也包括在这些病毒载体基础上进一步改造后形成的病毒载体。在本发明的一个具体实施方案中，本发明使用的骨架载体是慢病毒质粒载体pCDH。在pCDH载体中，CAR分子的表达由EF1α启动子驱动转录表达，CAR慢病毒载体质粒在辅助包装质粒Rev，VSV-G和pMDL存在的情况下，共转染HEK293T细胞，即可包装为带有CAR分子的慢病毒。此外应理解，尽管本发明中优选了pCDH载体，但是其它类型的载体也是可用的，只要最终能够获得有活性的CAR以及由其修饰的免疫效应细胞。
本发明还包括包含由病毒载体包装而成的病毒。所述的病毒可以是慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等，也包括在这些病毒基础上进一步改造后形成的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。应理解，尽管本发明中优选应用慢病毒，但本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如慢病毒的转导方法。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于急性髓系白血病的免疫治疗。
本发明所述的免疫细胞还可以表达除了上述嵌合抗原受体以外的另一种嵌合抗原受体，该受体可以不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。
本发明所述的免疫细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。
本发明所述的免疫细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于恢复抗肿瘤T细胞反应，从而抑制肿瘤生长。
本发明所述的免疫细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。如前所述，目前CAR疗法还受到其生产的复杂性和与细胞活性相关的不良事件的挑战，比如细胞因子风暴(CRS)等。因此，能有效调控CAR-T的药物或疗法，例如设置安全开关是更为优选的。
在本发明的具体实施例中，发明人通过使CD64 bbz(CD64 scFV-4-1BB-CD3ζ)和IL-15联合过表达改造了CD64bbz细胞，结果显著促进了CAR-T细胞的激活、增殖和存活。本发明人通过体内实验验证CD64 bbz和IL-15联合表达较对照组(CD64bbz单独表达和空白对照pCDH)有明显增强的抗肿瘤效果和CAR-T扩增能力，并显著延长了动物的生存期。这说明增效分子的过表达在CD64 CAR-T细胞抗AML方面具有很强大且持续的效果。此外，为了进一步提高CART细胞抗肿瘤作用和持续效果，本发明人在CD64bbz-IL-15基础上联合颗粒酶A或颗粒酶B(优选颗粒酶B)表达。通过体内和体外实验证明，CD64bbz-IL-15与颗粒酶A或颗粒酶B的联合表达在抗肿瘤效果和持续时间方面均非常显著地优于CD64bbz，尤其是或颗粒酶B的联合表达效果极其优异。
CD64 bbz和IL-15联合表达以及在此基础上表达颗粒酶A或颗粒酶B(优选颗粒酶B)能增强抗肿瘤效果是本发明人首次发现和披露，并为其发挥更大的临床应用提供理论支持。
本发明的基因修饰的免疫效应细胞可以应用于制备组合物，特别是药物组合物。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫效应细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的免疫效应细胞或含有所述细胞的组合物还可被置于适当的药盒中，以便于临床医师的是用。较佳地，所述的药盒中还可含有说明本发明的组合物的使用方法的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、载体构建
本实施例中，建立CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-GA、CD64bbz-GB载体。
载体结构如图1所示，其中各个元件的序列如表1，插入到pCDH载体的酶切位点中。载体的抗原结合域来源于CD64抗体的单链片段可变(scFv)区。
表1
将合成在pUC57载体上的CD64 scFv以及分子IL-15/GA/GB的目的片段(苏州金唯智生物科技有限公司)通过限制性内切酶(NEB)在目的基因两端特定位置切割；用同样的限制性内切酶特异性酶切慢病毒载体pCDH，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段和载体片段。
将切下来的凝胶片段进行回收(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0)，并通过NanoDrop分光光度计测定DNA片段浓度，按比例加入载体和片段后通过T4连接酶将目的片段连接至慢病体载体pCDH上，将连接产物转化进入Stable感受态细胞(博迈德生物)。置于37℃摇床中，200rpm震荡复苏培养60分钟后取100ul菌液涂布至LB琼脂平板(氨苄抗性)，37℃恒温箱中倒置培养12-18小时后挑取单克隆菌落至液体LB培养基中，200rpm，37℃摇床震荡培养16小时后提取质粒。
通过Sanger测序验证，成功构建载体CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-GA、CD64bbz-GB。
实施例2、慢病毒包装及CAR-T细胞制备
本实施例中，应用慢病毒包装及制备CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-GA、CD64bbz-GB和pCDH T细胞。
1、CAR慢病毒包装
首先使用无内毒素大提质粒试剂盒(MACHEREY-NAGEL)提取测序序列无误的慢病毒质粒CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-GA、CD64bbz-GB和pCDH(空载体质粒)以及慢病毒辅助包装质粒Rev，VSV-G和pMDL。
转染前一天，将第1/3代10cm培养皿中的人胚肾细胞(HEK293 T)传代至新的10cm培养皿中，以便它们在转染当天达到80-90％汇合。转染前30分钟将三种辅助质粒(Rev，VSV-G和pMDL)分别和目的质粒(CD64bbz-IL-15，CD64bbz-GA，CD64bbz-GB，CD64bbz，pCDH)按照一定比例加入到opti-MEM培养基，混匀后加入定量的PEI助转染试剂，形成质粒混合物。转染前将HEK293T细胞中完全培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)换为4ml无血清DMEM培养基，然后将质粒混合物加入80-90％融合的293T培养皿中。
转染后6小时将细胞培养基换为10ml完全培养基。转染后48小时收取细胞上清。将收取的细胞上清3000rpm离心15min后，去除沉淀，上清使用0.45μm滤膜过滤。慢病毒放置-80℃冻存备用。
2、CD64bbz、CD64bbz-IL-15、CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GA、CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB CAR-T细胞以及pCDH细胞的制备
用STEMCELL T细胞分选试剂盒(EasySepTM Human CD3 Positive Selection KitII)分离外周血中T细胞，在T细胞完全培养基(T细胞培养基+10％FBS+1％PS)中加入100U/ml的IL-2培养，并用抗CD3/CD28抗体刺激。
细胞刺激48小时后，将活化的T细胞悬浮于T细胞培养基中，加入相应慢病毒和1‰polybrene，轻轻混匀。将细胞悬液在4℃，2000rpm离心1小时20分钟后将T细胞在37℃培养8-12小时。然后用含有100U/ml的IL-2的T细胞完全培养基给细胞换液。对于需要二次感染的细胞，用相同的方法分别在刺激后72小时内进行两次转染。转染48小时后利用流式细胞术检测CAR的感染效率。
结果如图2所示。根据图2，每种CAR T细胞的感染效率在35％-45％之间。其中，IL-15与GA或GB的联用应用的组感染效率较为显著地高于单用IL-15的组。
实施例3、不同CAR-T细胞的杀伤活性分析
以高表达CD64抗原的U937AML细胞系作为靶细胞。
将过表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein；GFP)的靶细胞(U937-GFP)重悬(密度按照10000-100000个/ml)，取50ul加入到96孔板。按照适当的E：T比例(1：3；1：5；1：10)加入50ul效应细胞，每组三个平行，同时有三个平行中只有靶细胞。
将孔板放在37℃，5％ CO2孵箱中培养16小时后，吹匀，每孔吸出50ul细胞悬液后Counting beads染色进行流式检测。计算细胞裂解百分比并绘制杀伤曲线。
结果如图3所示，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组呈现最为理想的杀伤效果。当效靶比E：T为1：5时，与CD64bbz组相比，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组杀伤效果的提升非常显著(**P<0.01)。当效靶比E：T为1：10时，与其他组相比，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组杀伤效果的提升极为显著(****P<0.0001)。
因此，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB CAR-T细胞在体外杀伤模型中显示出更优的杀伤效率，尤其是在高肿瘤负荷情况下。
实施例4、不同CAR-T细胞对于动物肿瘤生长的抑制作用
1、动物体内扩增及生存率分析
进行动物实验，分析CD64bbz和CD64bbz-IL-15CAR-T细胞对于荷瘤小鼠的肿瘤的抑制作用，以引入空载体质粒组(pCDH)的细胞为对照。
使用5～8周龄NOD-Prkdcscid Il2rgtm1/Bcgen(NSG)mice(北京百奥赛图)免疫缺陷鼠，尾静脉注射3×105个过表达luciferase的U937细胞(U937-luc)，允许肿瘤细胞在小鼠体内生长5天。之后，麻醉小鼠后用活体成像仪对小鼠体内的肿瘤负荷进行检测，分析成瘤情况。
确认已经在小鼠体内成瘤后，通过尾静脉注射1.5×106效应细胞或者空白对照pCDH，之后每7-10天进行一次活体成像检测体内肿瘤负荷以及CART扩增持续效果，并记录生存期。
结果如图4所示。根据图4，在0-21天记录肿瘤负荷以及CAR T细胞数，结果显示，CD64bbz-IL-15组肿瘤负荷明显低于CD64bbz组(**P<0.01)；CD64bbz-IL-15组CAR T细胞数量明显高于CD64bbz的数量。与空白对照组以及CD64bbz组相比，CD64bbz-IL-15组的生存期显著更优异。
2、动物体内扩增及生存率分析
动物操作过程如前述“1”，分析CD64bbz、CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GA、CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB CAR-T细胞对于荷瘤小鼠的肿瘤的抑制作用。以引入空载体质粒组(pCDH)的细胞为对照。在第0-28天活体成像检测体内肿瘤负荷以及CAR T扩增持续效果，观察生存期(图5)。
根据图5，在0-21天记录肿瘤负荷以及CAR T细胞数，在回输后，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组肿瘤较其他组相比始终处于低负荷状态，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组CART细胞数量明显高于其他组的细胞数量。
与空白对照组以及CD64bbz组相比，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GA和CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组的生存期都显著延长。
因此，CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GA和CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB细胞在小鼠模型中都能更好的抑制肿瘤生长，显著延长小鼠生存期，更优选的是CD64bbz-IL-15+CD64bbz-GB组。
上述结果表明，IL-15与GA或GB的联用应用，能够极大地提高CAR T细胞对于肿瘤生长的抑制作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.一种基因修饰的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制急性髓系白血病的药物；所述基因修饰的免疫效应细胞转导有编码嵌合抗原受体的多核苷酸或其表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；
其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；
其中，所述增效因子为：白介素-15、颗粒酶A、颗粒酶B，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别CD64的结合蛋白是抗体；优选地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体；更优选地，所述的抗体是单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述跨膜区是包含CD8或CD28的铰链区、跨膜区的序列；优选地，所述跨膜区是包含CD8的铰链区、跨膜区的序列；更佳地，所述的铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或
所述胞内信号区包括选自4-1BB，CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD134，ICOS，GITR的胞内信号区序列，或其组合；优选地，所述胞内信号区包括4-1BB和CD3ζ；更佳地，所述4-1BB氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的CD3ζ氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区：CD64的单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB、CD3ζ以及增效因子。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括选自下组的细胞或其组合：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
6.一种嵌合抗原受体或编码其的核酸，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15、颗粒酶A、颗粒酶B，或它们的组合；优选地，所述增效因子为白介素-15和颗粒酶B的组合；
优选地，所述的特异性识别CD64的结合蛋白是抗体；优选地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体；更优选地，所述的抗体是单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.一种基因修饰的免疫效应细胞，该细胞抑制急性髓系白血病，该细胞转导有编码嵌合抗原受体的多核苷酸或其表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；
其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；
其中，所述增效因子为：白介素-15、颗粒酶A、颗粒酶B，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
8.如权利要求7所述的基因修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的特异性识别CD64的结合蛋白是抗体；优选地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体；更佳地，所述的抗体是单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
9.一种制备基因修饰的免疫效应细胞的方法，包括：在免疫效应细胞中引入编码嵌合抗原受体的多核苷酸，使该细胞表面表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区，胞内信号区及增效因子；其中，所述胞外结合区包含特异性识别CD64的结合蛋白；其中，所述增效因子为：白介素-15、颗粒酶A、颗粒酶B，或它们的组合；优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合，或白介素-15和颗粒酶A的组合；更优选地，所述增效因子为：白介素-15和颗粒酶B的组合。
10.一种用于抑制急性髓系白血病的药物组合物或含有该药物组合物的药盒，所述药物组合物包括权利要求7或8所述的基因修饰的免疫效应细胞，以及药学上可接受的药学载体或赋形剂。
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