CN120314588A - 一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒 - Google Patents
一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒Info
- Publication number
- CN120314588A CN120314588A CN202510659780.9A CN202510659780A CN120314588A CN 120314588 A CN120314588 A CN 120314588A CN 202510659780 A CN202510659780 A CN 202510659780A CN 120314588 A CN120314588 A CN 120314588A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human immunoglobulin
- target
- adcp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明使用hPBMC诱导的hMDMs作为效应细胞，使用表达α‑Gal抗原的Sp2/0‑Ag14细胞作为靶细胞，在合适的效靶比、供试品浓度梯度下实现了对免疫球蛋白类产品ADCP生物学活性的准确检测；本发明检测方法操作直观、精密度和准确度高，填补了目前对免疫球蛋白产品ADCP检测的空白，对于提高免疫球蛋白类产品的质量控制和临床应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
人免疫球蛋白类产品是一种由大量健康人混合原料血浆经分离提纯、病毒灭活/去除等步骤制备而成的高浓度人免疫球蛋白制剂。目前市售的主流人免疫球蛋白类产品分为静注人免疫球蛋白(Human Immunoglobulin(pH4)for Intravenous Injection，以下简称IVIG)和皮下注射人免疫球蛋白(Subcutaneous injection ofhuman immunoglobulin，以下简称SCIG)两种，其主要成分均是由B淋巴细胞分泌表达的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)，包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4四个亚类，含有广谱抗性。临床被用于多种原发性和继发性免疫球蛋白缺陷病、感染性疾病、炎症疾病以及自身免疫性疾病的治疗。研究表明，人免疫球蛋白类产品包含两个主要功能区域，结合抗原的Fab段和启动人体效应的Fc段。Fc段通过与免疫细胞表面Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb)、FcRn受体及补体结合进而发挥相应的免疫反应，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(Antibody dependent cellularphagocytosis,ADCP)、补体依赖的细胞毒性作用(Complement dependent cytotoxicity,CDC)等。
目前，现行《中国药典》和《欧洲药典》人免疫球蛋白各论中对IgG Fc段生物学活性质量标准仅CDC检测一种，只能反应Fc段与补体的激活能力。此外，公开号为CN 115537448A的中国发明专利公开了一种静注人免疫球蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用检测方法，填补了目前对IVIG进行ADCC检测的空白。但目前对人免疫球蛋白产品ADCP生物学活性检测方法的研究仍比较局限，尚未查询到相关专利或质量标准。公开号为CN113186167A的中国发明专利公开了一种用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法，该方法通过构建稳定表达CD32a-FcεRIγ融合蛋白受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ，将Raji细胞用作靶细胞，通过检测报告基因的表达水平(如荧光素酶活性或荧光强度)来评估ADCP活性。虽然该方法操作简单，试验周期短，但效应细胞的转染效率可能影响实验条件，报告基因的表达可能受其他因素的影响，存在背景信号的干扰。此外，该方法依赖于工程化细胞，通过检测信号通路激活报告基因的水平以表征抗体的ADCP生物学活性，无法充分表征人体对抗体的ADCP生物学活性。
此外，流式细胞术检测法也是检测ADCP的常用方法，该方法可以直接使用来自人体的细胞作为效应细胞检测ADCP生物学活性。该方法与报告基因法相比，直接使来自人体的效应细胞，能够更准确地模拟体内免疫反应过程，从而反映抗体药物的实际生物学效应；且可直接观察效应细胞对靶细胞的吞噬情况，检测结果更直观。然而尚未见采用流式细胞术检测法对人免疫球蛋白类产品进行ADCP检测的报道。人免疫球蛋白类产品含有广谱抗病原体、异源物种蛋白抗体，其检测的各项参数均会对检测的精密度和准确性造成影响。如何得到一种精密度和准确度好的ADCP检测方法需要进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒。
本发明提供了一种人免疫球蛋白ADCP活性的检测方法，它包括如下步骤：
(1)制备荧光标记的表达α-Gal抗原的Sp2/0-Ag14细胞，作为靶细胞；
(2)将人免疫球蛋白稀释到初始工作浓度，再进行梯度稀释；
(3)将步骤(2)稀释后的人免疫球蛋白加入到靶细胞中，孵育；
(4)将效应细胞按照效靶比加入到步骤(3)孵育后的体系中得到最终反应体系，孵育；
(5)步骤(4)孵育后收集细胞，加入流式检测抗体孵育，对效应细胞进行染色；
(6)步骤(5)染色后收集细胞，使用流式细胞仪进行检测，利用检测数据确定人免疫球蛋白的ADCP活性。
进一步地，步骤(1)中，所述荧光标记为PKH26荧光标记；
和/或，步骤(3)中，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为30～60min；
和/或，步骤(4)中，所述效应细胞为巨噬细胞。
进一步地，步骤(4)中，所述巨噬细胞为由人原代外周血单个核细胞中的单核细胞诱导的巨噬细胞。
进一步地，步骤(4)中，所述效应细胞和靶细胞的效靶比为3:1～5:1。
进一步地，步骤(4)中，所述效应细胞和靶细胞的效靶比为5:1。
进一步地，步骤(4)中，所述最终反应体系中，人免疫球蛋白起始浓度为20mg/ml，4倍稀释梯度，共8个浓度点；
和/或，步骤(4)中，所述最终反应体系中，靶细胞的个数为200个细胞/μl；
和/或，步骤(4)中，所述最终反应体系中，使用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基作为实验缓冲液进行稀释。
进一步地，步骤(4)中，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为1～5h；
和/或，步骤(5)中，所述流式检测抗体为CD11b抗体；
和/或，步骤(5)中，所述孵育为避光孵育，孵育的温度为0～4℃，孵育的时间为15～30min。
进一步地，步骤(6)中，所述检测时，靶细胞经PE荧光通道检测，效应细胞经APC荧光通道检测。
本发明还提供了一种用于测定人免疫球蛋白ADCP活性的试剂盒，所述试剂盒包括人免疫球蛋白、荧光标记的靶细胞、效应细胞、流式检测抗体和实验缓冲液。
进一步地，
所述荧光标记的靶细胞为PKH26荧光标记的靶细胞；
和/或，所述效应细胞为巨噬细胞；
和/或，所述流式检测抗体为CD11b抗体；
和/或，所述实验缓冲液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
优选地，所述巨噬细胞为由人原代外周血单个核细胞中的单核细胞诱导的巨噬细胞。
本发明使用从hPBMCs中分选单核细胞并将单核细胞诱导成的巨噬细胞(humanMonocytes-Derived Macrophages,hMDMs)作为效应细胞，使用表达α-Gal抗原的Sp2/0-Ag14细胞作为靶细胞。并使用2种不同荧光分别标记效应细胞与靶细胞，效应细胞吞噬靶细胞后将呈现双阳性荧光信号；双阳性荧光信号的细胞数量所占靶细胞总数量的比例即可表征抗体的ADCP活性。
本发明中，效靶比是指效应细胞(Effector Cells)与靶细胞(Target Cells)的数量比例。
本发明取得了以下有益效果：
本发明提供了一种人免疫球蛋白类产品的ADCP检测方法，采用Sp2/0-Ag14细胞作为靶细胞，利用hPBMCs中分选单核细胞并将单核细胞诱导的巨噬细胞(human Monocytes-Derived Macrophages,hMDMs)作为效应细胞，在恰当的效靶比(5:1)、供试品浓度梯度(SCIG的起始浓度设为20mg/ml，4倍稀释梯度，8个浓度点)下实现了对人免疫球蛋白类产品ADCP生物学活性的准确检测；本发明检测方法操作直观，专属性好，精密度和准确度高，填补了目前对免疫球蛋白类产品ADCP检测的空白，对于提高免疫球蛋白类产品的质量控制和临床应用具有重要意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为ADCP靶细胞筛选实验中效应细胞hMDMs对不同靶细胞的细胞吞噬率结果图，图中数据表示为吞噬率百分比±SEM。
图2为效靶比优化实验中效应细胞hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞在不同效靶比下的细胞吞噬率结果图，图中数据表示为吞噬率百分比±SEM。
图3为供试品起始浓度优化实验中效应细胞hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞在效靶比为5:1条件下的细胞吞噬率结果图，图中数据表示为吞噬百分比±SEM。
图4为以Sp2/0-Ag14为靶细胞，hMDMs为效应细胞，在效靶比为5:1条件下对ADCP活性检测的精密度和准确度验证结果图，图中数据表示为吞噬百分比±SEM。
图5为效应细胞专属性验证结果图；图中数据表示为吞噬百分比±SEM。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明主要仪器设备如表1所示。
表1.主要仪器设备
本发明实验所用试剂如表2所示。
表2.实验所用试剂
本发明实验所用细胞系如表3所示。
表3.实验所用细胞系
本发明供试品信息如表4所示。
表4.供试品信息
| 样品 | 供应商 | 储液浓度(mg/ml) |
| SCIG | 成都蓉生 | 200 |
本发明人免疫球蛋白类产品ADCP活性的检测中，使用表达α-Gal抗原的Sp2/0-Ag14细胞(ATCC细胞库)作为靶细胞；使用hPBMCs作为效应细胞起始材料，从hPBMCs中分选单核细胞并诱导成为巨噬细胞(human Monocytes-Derived Macrophages,hMDMs)，hMDMs即为效应细胞；使用一种人免疫球蛋白SCIG(成都蓉生)。ADCP效应是IgG的Fab段与靶细胞表面的抗原结合后，其Fc段可与具有Fcγ受体(FcγRIIa、FcγRIa)的免疫细胞(如巨噬细胞、单核细胞)相互作用，促使这些免疫细胞对靶细胞进行吞噬和清除。这一作用机制在机体的免疫防御和免疫调节中发挥着重要作用。在流式检测中，使用两种不同荧光分别标记效应细胞与靶细胞；效应细胞吞噬靶细胞后将呈现双阳性荧光信号，则双阳性荧光信号的细胞数量所占靶细胞总数量的比例即可表征抗体的ADCP活性。
本发明检测方法的方法概述如下：
实验前14天，复苏hPBMCs细胞并计数，使用单核细胞分选试剂盒分选单核细胞，随后用含100ng/ml M-CSF的1640完全培养基培养14天，诱导单核细胞为hMDMs。实验前一天，消化收集靶细胞并用PKH26染料标记，接种至培养皿中过夜培养(37℃/5％CO2)。实验当天，收集PKH26标记的靶细胞并用ADCP实验缓冲液重悬，并使用ADCP实验缓冲液配制供试品工作液(如供试品为SCIG，则SCIG起始浓度设为20mg/ml，4倍稀释梯度，8个浓度点)。然后调整靶细胞密度(200细胞/μl)并接种至96孔板中，加入供试品工作液孵育30分钟。收集效应细胞(hMDMs)并用ADCP实验缓冲液重悬，根据效靶比调整密度后加入96孔板中，孵育1小时。孵育结束后，收集所有细胞至新的96孔尖底板板中离心沉淀，向实验板中加入用流式缓冲液(1×DPBS+1％FBS)配制的CD11b流式检测抗体工作液，对效应细胞进行标记染色，4℃避光孵育15分钟。孵育结束后，离心获得细胞沉淀，用流式缓冲液重悬并清洗两次。最后，使用流式细胞仪检测；PKH26标记的靶细胞经PE荧光通道检测，CD11b染色的效应细胞经APC荧光通道检测。上述ADCP实验缓冲液均为1640完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)。
本发明涉及的细胞复苏及培养如下：
(1)hPBMCs细胞复苏：先将细胞所用完全培养基，即RPMI 1640完全培养基(RPMI1640+10％FBS)预热，于50ml离心管中，加入一定体积的相应完全培养基，后将经37℃水浴融化的细胞悬液转移至前述离心管中，于离心机中400g离心10分钟，离心后弃去上清，使用相应完全培养基重悬细胞后进行计数，后以适当密度接种于摇瓶中或取一定量hPBMCs分选为单核细胞用于诱导hMDMs。
(2)PLC/PRF/5、Sp2/0-Ag14细胞复苏：先将各细胞所用完全培养基预热，于15ml离心管中，加入一定体积的相应完全培养基，后将经37℃水浴融化的细胞悬液转移至前述离心管中，于离心机中600rpm或800rpm离心5分钟，离心后弃去上清，使用相应完全培养基重悬细胞后进行计数，后以适当密度接种于细胞培养皿中(或其它可用于细胞培养的耗材)。
(3)PLC/PRF/5、Sp2/0-Ag14细胞传代培养：先将各细胞所用完全培养基、消化液等试剂预热或恢复至室温。PLC/PRF/5为贴壁细胞，需先弃去培养上清，使用1×DPBS润洗1-3次，加入适量消化液后于细胞培养箱(37℃/5％CO2)中消化一定时间(细胞大片脱落即可)，后加入适量相应完全培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中；Sp2/0-Ag14细胞为悬浮细胞，无需消化，直接收集细胞悬液至离心管中即可。将PLC/PRF/5和Sp2/0-Ag14细胞悬液于离心机中600rpm或800rpm离心5分钟，离心后弃去上清，使用相应完全培养基重悬细胞后进行计数，后以适当密度接种于细胞培养皿中(或其它可用于细胞培养的耗材)。
实施例1、本发明人免疫球蛋白ADCP活性的检测
1、ADCP实验步骤
(1)实验前14天，复苏收集hPBMCs细胞并用RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)重悬后计数。
(2)根据细胞计数结果，取一定量的hPBMCs细胞，使用单核细胞分选试剂盒分选单核细胞。
(3)使用含100ng/ml浓度M-CSF的RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)持续培养单核细胞14天，诱导单核细胞为巨噬细胞(hMDMs)。
(4)hMDMs或hPBMCs效应细胞的QC，用于评估所诱导的hMDMs是否成功：使用CD11b、CD14、CD45、CD64、CD163、CD206流式检测抗体对效应细胞进行标记，于4℃冰箱中孵育15分钟，避光。然后采用流式细胞仪进行检测，若CD11b、CD14、CD45、CD64、CD163、CD206均为阳性即表明hPBMCs细胞成功诱导为hMDMs。
(5)实验前一天，消化、离心收集靶细胞并用PKH26染料对靶细胞进行染色标记。
(6)将PKH26标记的靶细胞接种至新的培养皿中，于细胞培养箱(37℃/5％CO2)过夜培养。
(7)如使用hPBMCs作为ADCP效应细胞：则可于实验前一天复苏，并使用RPMI 1640完全培养基过夜培养。
(8)实验当天，消化、离心收集PKH26标记的靶细胞并用ADCP实验缓冲液(1640完全培养基)重悬细胞。
(9)用ADCP实验缓冲液(RPMI 1640+10％FBS)配制供试品，即SCIG工作液(因最终实验体系组成为50μl靶细胞重悬液，50μl供试品溶液，100μl效应细胞重悬液，供试品溶液占总体系的四分之一，为保证供试品的终浓度为目的浓度，所以在前期配制供试品溶液时浓度设为供试品工作浓度的4倍，即X4)。
(10)调整PKH26标记的靶细胞密度并将细胞悬液转移至96孔实验板相应孔中(10000细胞/孔，50μl/孔)。
(11)转移SCIG工作液至96孔实验板相应孔中，室温孵育实验板30分钟(50μl/孔)。
(12)消化、离心收集hMDMs或hPBMCs效应细胞(离心条件：400g离心10分钟)并用ADCP实验缓冲液重悬效应细胞。
(13)根据效靶比调整效应细胞密度，转移效应细胞悬液至96孔实验板相应孔中(100μl/孔)。
(14)将实验板于细胞培养箱(37℃/5％CO2)中孵育约1小时。
(15)孵育结束后，取出实验板，收集所有细胞至新的96孔尖底板中并离心获得细胞沉淀。
(16)用流式缓冲液(1×DPBS+1％FBS)配制CD11b流式检测抗体工作液。
(17)使用过量CD11b流式检测抗体对实验板中hMDMs或hPBMCs效应细胞进行染色标记，4℃冰箱中孵育15分钟，避光。
(18)流式检测抗体孵育结束后，离心获得细胞沉淀，使用流式缓冲液重悬并清洗细胞2次。
(19)使用流式细胞仪对ADCP进行检测：PKH26标记的靶细胞经PE荧光通道检测，CD11b染色的效应细胞经APC荧光通道检测。
2、ADCP数据分析
ADCP实验原始数据经由BD FACSDiva Software系统导出并使用FlowJo、Microsoft Office Excel 2021和GraphPadPrism软件进行分析。
在FlowJo软件中，通过PE-APC散点图画十字门对ADCP数据进行分析，其中PE通道表示靶细胞标记，APC通道表示效应细胞标记，那么十字象限中，PE+APC+象限中的细胞数量即表示PKH26+CD11b+的被吞噬的靶细胞数量，PE+APC+象限与PE+APC-象限中的细胞总量即表示所有PKH26+的靶细胞。
细胞吞噬率采用以下公式进行计算：
细胞吞噬率(％)＝(PKH26+CD11b+细胞数量/PKH26+细胞数量)×100％在GraphPadPrism软件中，在XY Table模式下将供试品浓度数值与所得细胞吞噬率数据对应粘贴，之后在Parameters:Transform模块下将供试品浓度转化为对数浓度即X＝Log(X)，之后在Parameters:Nonlinearregression模块下进行log(agonist)vs.response--Variableslope(fourparameters)拟合，并出具拟合曲线。拟合中，使用以下四参数方程可得到EC50的相对数值：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)×HillSlope))。其中，X＝Log(样品浓度)，Y＝细胞吞噬率。Bottom和Top分别代表最小响应值和最大响应值，Hillslope表示剂量反应曲线的斜率，当Hillslope大于1时，曲线更陡峭，表明剂量的微小变化会导致反应的显著变化，当Hillslope小于1时，曲线更平缓，表明剂量变化对反应的影响较小。
通过以下具体试验例证明本发明的有益效果。
本发明通过对靶细胞种类、效靶比、供试品浓度梯度进行摸索，提供了一种准确、直观的免疫球蛋白类产品ADCP生物学活性检测方法；该方法精密度和准确度高，对于提高免疫球蛋白类产品的质量控制和临床应用具有重要意义。
试验例1、靶细胞筛选
使用ADCP实验缓冲液将SCIG(供试品)进行稀释得到供试品溶液，该供试品溶液最终在总反应体系中的起始浓度为20mg/ml，共稀释至6个浓度点，分别为20、10、2、0.4、0.04、0.008mg/ml。并分别以表达α-Gal抗原的Sp2/0-Ag14细胞和表达人乙肝表面抗原(HBsAg)的PLC/PFR/5细胞作为靶细胞，探索其对SCIGADCP生物学活性检测的影响。此时效靶比为3:1，效应细胞为hMDMs。
然后按照实施例1所述方法进行ADCP活性检测，并计算每种靶细胞下不同浓度供试品的细胞吞噬率，得到细胞吞噬率与浓度的曲线图。
实验结果如图1所示：由图1可知以Sp2/0-Ag14细胞作为靶细胞时可以得到较完整的量效曲线，而以PLC/PFR/5细胞作为靶细胞无法得到量效曲线。说明SCIG不能介导hMDMs对PLC/PRF/5靶细胞的吞噬作用，但能介导hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞的吞噬作用，且有明显的量效曲线。因此，在后续实验中选择Sp2/0-Ag14作为靶细胞以评估SCIG的ADCP生物学活性。
试验例2、效靶比优化
在确定靶细胞(Sp2/0-Ag14细胞)后，使用ADCP实验缓冲液将SCIG稀释至总体系中终浓度为20mg/ml作为起始工作浓度，SCIG浓度梯度设置为20、10、2、0.4、0.04、0.008mg/ml，共6浓度点；设定效靶比为3:1或5:1，考察不同效靶比对SCIG ADCP生物学活性检测的影响。效应细胞为hMDMs。
然后按照实施例1所述方法进行ADCP活性检测，计算每种效靶比下不同浓度供试品的细胞吞噬率，得到细胞吞噬率与浓度的曲线图，同时采用四参数模型进行数据分析。
表5.ADCP效靶比优化实验结果(靶细胞：Sp2/0-Ag14)
结果如图2和表5所示，2个效靶比均可见明显的效应曲线，实验窗口随着效靶比增加而增大。在相同实验体系下，与3:1(效靶比)相比，5:1(效靶比)最大响应值更高，跨度也更大，说明效靶比为5:1时检测灵敏度更高，重复性和可靠性更好。因此，在后续检测中，选用效靶比为5:1进行实验。
试验例3、供试品浓度梯度优化
在试验例2中，确认了SCIG可介导hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞的吞噬作用，但量效曲线不完整，缺乏明显的上下平台。于是在此部分实验中，根据试验例2实验结果对SCIG浓度梯度进行进一步优化，SCIG在总体系中起始工作浓度设为20mg/ml，4倍稀释梯度稀释，共8个浓度点(20、5、1.25、0.3125、0.078125、0.01953125、0.004882813、0.001220703mg/ml)。效靶比为5:1。按照实施例1所述方法进行ADCP活性检测。计算该供试品浓度梯度下的细胞吞噬率，得到细胞吞噬率与浓度的曲线图，同时采用四参数模型进行数据分析。
结果如图3和表6所示：在效靶比(E:T)为5:1的条件下，SCIG可介导hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞的吞噬作用，有明显量效反应，量效曲线基本完整(存在比较完整的上下平台)，并且跨度值更大。因此，后续将参考此供试品浓度梯度的设置开展实验。
表6.供试品起始浓度优化实验结果(靶细胞：Sp2/0-Ag14)
试验例4、精密度、准确度考察
根据试验例3的实验结果，以hMDMs为效应细胞，以Sp2/0-Ag14细胞为靶细胞，SCIG在总体系中起始工作浓度设为20mg/ml，并进行4倍梯度稀释，共8浓度点。实验结果表明该实验体系可表征SCIG的ADCP生物学活性，且具有明显的量效曲线，量效曲线基本完整。故以此浓度设置验证该方法的精密度、准确度。
精密度和准确度实验中，以hMDMs为靶细胞，Sp2/0-Ag14细胞为靶细胞，效靶比(E:T)为5:1，总体系中SCIG浓度梯度为20、5、1.25、0.3125、0.078125、0.01953125、0.004882813、0.001220703mg/ml，将SCIG组别重复三次实验进行分析。按照实施例1所述方法进行检测。
实验结果表明，在效靶比(E:T)为5:1的条件下，供试品SCIG可介导hMDMs对Sp2/0-Ag14靶细胞的吞噬作用。对三组数据分析时，在Graphpad软件中，使三组数据共用同一Top/Bottom/Hillslope数值进行拟合(在Parameters:Transform模块下，设定Globalnonlinear regression(dose-response curves)-Bottom\Top\Hillslope 3parametersConstraint type:shared value for all data sets，即假设三组数据曲线完整度一致)获得三组数据各自EC50数值，结果显示，三组数据量效曲线EC50数值相近，结果详见图4和表7。同一样本设置3次独立检测，每次试验1块96孔细胞培养板，一块96孔板上设置3复孔，检测精密性，起始工作浓度的细胞吞噬率及EC50如表8，统计相对标准偏差(relativestandard deviation,RSD)；准确度的评价参数回收率通过样品的相对效价计算，结果详见表9。
精密度检测中起始工作浓度的RSD为1.82％，EC50 RSD为14.02％；准确度验证中回收率为115.49％。根据药典2020版中的9012生物样品定量分析方法验证指导原则，生物分析方法的精密度和准确度均应在20％范围以内，本方法的精密度和准确度满足相关要求。即本发明具有良好的精密度和准确度。
表7.精密度和准确度验证结果(靶细胞：Sp2/0-Ag14)
表8.精密度评价参数：相对标准偏差
备注：平均值和标准偏差SD可于Excel中使用相关函数(AVERAGE函数、STDEV函数)计算得出；相对标准偏差RSD由标准偏差除以相应的平均值乘100％可得，可在检验检测工作中分析结果的精密度。
表9.准确度评价参数：回收率
备注：将Plate 01看作100％RS，即100％效价的标准品，将其EC50数值除以其它实验板EC50数值再乘100％可得相对效价；相对效价的均值可于Excel中使用AVERAGE函数计算得出；将相对效价均值除以100％效价再乘100％即为回收率。
试验例5、专属性验证
因前期已开展了靶细胞筛选试验，此处只验证该方法的效应细胞专属性。按照试验例4所述检测方法，选择20mg/ml作为起始浓度，4倍梯度稀释，共8个浓度点，进一步验证该方法的效应细胞专属性。效应细胞专属性以未经诱导的hPBMCs细胞代替hMDMs细胞作为效应细胞，选择效靶比5:1，按照实施例1所述方法进行ADCP活性检测，结果如图5和表10所示，SCIG介导hPBMCs效应细胞的ADCP窗口微弱，可能是因为hPBMCs成分复杂，细胞类型多；相比于hPBMCs作为效应细胞，SCIG介导hMDMs效应细胞发挥ADCP的实验窗口则更为明显，即hMDMs细胞作为效应细胞具有更好的检测结果。可见本发明ADCP检测方法专属性好。
表10.效应细胞专属性验证结果(靶细胞：Sp2/0-Ag14)
综上，本发明通过靶细胞筛选、效靶比优化、供试品浓度梯度优化等步骤，提供了一种人免疫球蛋白类产品的ADCP检测方法，采用Sp2/0-Ag14细胞作为靶细胞，利用hPBMCs中分选单核细胞并将单核细胞诱导的巨噬细胞(human Monocytes-Derived Macrophages,hMDMs)作为效应细胞，在恰当的效靶比(5:1)、供试品浓度梯度(SCIG的起始浓度设为20mg/ml，4倍稀释梯度，8个浓度点)下实现了对人免疫球蛋白类产品ADCP生物学活性的准确检测；本发明检测方法操作直观，专属性好，精密度和准确度高，填补了目前对免疫球蛋白类产品ADCP检测的空白，对于提高免疫球蛋白类产品的质量控制和临床应用具有重要意义。
Claims (10)
1.一种人免疫球蛋白ADCP活性的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)制备荧光标记的表达α-Gal抗原的Sp2/0-Ag14细胞，作为靶细胞；
(2)将人免疫球蛋白稀释到初始工作浓度，再进行梯度稀释；
(3)将步骤(2)稀释后的人免疫球蛋白加入到靶细胞中，孵育；
(4)将效应细胞按照效靶比加入到步骤(3)孵育后的体系中得到最终反应体系，孵育；
(5)步骤(4)孵育后收集细胞，加入流式检测抗体孵育，对效应细胞进行染色；
(6)步骤(5)染色后收集细胞，使用流式细胞仪进行检测，利用检测数据确定人免疫球蛋白的ADCP活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述荧光标记为PKH26荧光标记；
和/或，步骤(3)中，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为30～60min；
和/或，步骤(4)中，所述效应细胞为巨噬细胞。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述巨噬细胞为由人原代外周血单个核细胞中的单核细胞诱导的巨噬细胞。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述效应细胞和靶细胞的效靶比为3:1～5:1。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述效应细胞和靶细胞的效靶比为5:1。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述最终反应体系中，人免疫球蛋白起始浓度为20mg/ml，4倍稀释梯度，共8个浓度点；
和/或，步骤(4)中，所述最终反应体系中，靶细胞的个数为200个细胞/μl；
和/或，步骤(4)中，所述最终反应体系中，使用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基作为实验缓冲液进行稀释。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述孵育的温度为25～37℃，孵育的时间为1～5h；
和/或，步骤(5)中，所述流式检测抗体为CD11b抗体；
和/或，步骤(5)中，所述孵育为避光孵育，孵育的温度为0～4℃，孵育的时间为15～30min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(6)中，所述检测时，靶细胞经PE荧光通道检测，效应细胞经APC荧光通道检测。
9.一种用于测定人免疫球蛋白ADCP活性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括人免疫球蛋白、荧光标记的靶细胞、效应细胞、流式检测抗体和实验缓冲液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：
所述荧光标记的靶细胞为PKH26荧光标记的靶细胞；
和/或，所述效应细胞为巨噬细胞；
和/或，所述流式检测抗体为CD11b抗体；
和/或，所述实验缓冲液为含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202510659780.9A CN120314588B (zh) | 2025-05-21 | 一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202510659780.9A CN120314588B (zh) | 2025-05-21 | 一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN120314588A true CN120314588A (zh) | 2025-07-15 |
| CN120314588B CN120314588B (zh) | 2025-10-17 |
Family
ID=
Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006034881A1 (en) * | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method and kits for in vitro identification of cells, particularly lymphoid cells, which interacted by contact with target cells and biological applications thereof |
| EP1672366A2 (en) * | 1999-06-11 | 2006-06-21 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Methods and compositions for opsonophagocytic assays |
| US20190079077A1 (en) * | 2016-03-14 | 2019-03-14 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins |
| CN109790519A (zh) * | 2016-06-22 | 2019-05-21 | 塞尔丽思股份公司 | 细胞靶向的药物活性物质或标记物递送体系 |
| CN110869388A (zh) * | 2017-03-17 | 2020-03-06 | 塔斯克疗法有限公司 | 用于肿瘤特异性细胞消耗的Fc优化的抗CD25 |
| CN112877288A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-01 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种nk细胞培养体系及应用 |
| CN113186167A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-07-30 | 中国食品药品检定研究院 | 用于测定抗cd20单克隆抗体药物adcp生物学活性的方法 |
| EP3967307A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-16 | Instytut Hematologii I Transfuzologii | Use of pim kinase inhibitors to augment the efficacy of anti-cd20 antibody-based therapies in hematologic malignancies and non-malignant conditions |
| WO2022262101A1 (zh) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | 南京蓝盾生物科技有限公司 | 具有增强的adcc效应的抗cd70抗体及其应用 |
| CN115537448A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-30 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种静注人免疫球蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用检测方法 |
| CN115808522A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-17 | 郑州大学 | 一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒 |
| CN117599202A (zh) * | 2023-10-13 | 2024-02-27 | 武汉轻工大学 | 一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统及分析抗乳腺癌作用机制的方法 |
| WO2024255853A1 (en) * | 2023-06-16 | 2024-12-19 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Cell-based assays using immobilized recombinant proteins to measure immune regulation of therapeutic biologics |
| US20250073323A1 (en) * | 2021-08-06 | 2025-03-06 | Anyadi, Llc | Process for producing personalized cancer immunotherapy |
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1672366A2 (en) * | 1999-06-11 | 2006-06-21 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Methods and compositions for opsonophagocytic assays |
| WO2006034881A1 (en) * | 2004-09-28 | 2006-04-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method and kits for in vitro identification of cells, particularly lymphoid cells, which interacted by contact with target cells and biological applications thereof |
| US20190079077A1 (en) * | 2016-03-14 | 2019-03-14 | Biogen International Neuroscience Gmbh | Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins |
| CN109790519A (zh) * | 2016-06-22 | 2019-05-21 | 塞尔丽思股份公司 | 细胞靶向的药物活性物质或标记物递送体系 |
| CN110869388A (zh) * | 2017-03-17 | 2020-03-06 | 塔斯克疗法有限公司 | 用于肿瘤特异性细胞消耗的Fc优化的抗CD25 |
| EP3967307A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-16 | Instytut Hematologii I Transfuzologii | Use of pim kinase inhibitors to augment the efficacy of anti-cd20 antibody-based therapies in hematologic malignancies and non-malignant conditions |
| CN112877288A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-01 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种nk细胞培养体系及应用 |
| CN113186167A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-07-30 | 中国食品药品检定研究院 | 用于测定抗cd20单克隆抗体药物adcp生物学活性的方法 |
| WO2022262101A1 (zh) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | 南京蓝盾生物科技有限公司 | 具有增强的adcc效应的抗cd70抗体及其应用 |
| US20250073323A1 (en) * | 2021-08-06 | 2025-03-06 | Anyadi, Llc | Process for producing personalized cancer immunotherapy |
| CN115537448A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-30 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种静注人免疫球蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用检测方法 |
| CN115808522A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-17 | 郑州大学 | 一种基于细胞免疫荧光法的人CNTN1-Ab检测方法及试剂盒 |
| WO2024255853A1 (en) * | 2023-06-16 | 2024-12-19 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Cell-based assays using immobilized recombinant proteins to measure immune regulation of therapeutic biologics |
| CN117599202A (zh) * | 2023-10-13 | 2024-02-27 | 武汉轻工大学 | 一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统及分析抗乳腺癌作用机制的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KIRSTY A MCBAIN 等: "Accelerating ADCP screening using the iQue® Advanced Flow Cytometry Platform", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 206, no. 1, 1 May 2021 (2021-05-01) * |
| LYNN KAMEN 等: "A novel method for determining antibody-dependent cellular phagocytosis", J IMMUNOL METHODS, vol. 468, 14 March 2019 (2019-03-14) * |
| 姜振宇 等: "标记抗体导向的药物对巨噬细胞杀伤作用的体外研究", 中华血液学杂志, no. 09, 14 September 2000 (2000-09-14) * |
| 许晓光;王春艳;石炳毅;蔡明;韩永;金伯泉;: "人白细胞相关免疫球蛋白样受体1/白细胞相关免疫球蛋白样受体2可能配体的生物信息学分析及鉴定", 中国组织工程研究与临床康复, no. 40, 30 September 2008 (2008-09-30) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brezinsky et al. | A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity | |
| WO2018065401A1 (en) | System and products for improved quantification of adcc activity | |
| US20230341381A1 (en) | Methods and reagents for determining immunoglobulin gamma (IgG) antibody isotype concentration from biological samples | |
| AU2006272204A1 (en) | Potency assays for antibody drug substance binding to an Fc receptor | |
| Moreira et al. | Cross-reactivity of commercially available anti-human monoclonal antibodies with canine cytokines: establishment of a reliable panel to detect the functional profile of peripheral blood lymphocytes by intracytoplasmic staining | |
| CN112433055A (zh) | 一种基于报告基因方法检测pvrig抗体的生物学活性的方法 | |
| JP6039552B2 (ja) | 高産生細胞株を選択するための改良された方法 | |
| Lorenz et al. | Sensitive flow cytometric method to test basophil activation influenced by homeopathic histamine dilutions | |
| CN120314588B (zh) | 一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒 | |
| CN115537448A (zh) | 一种静注人免疫球蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用检测方法 | |
| CN101268372A (zh) | 与fc受体结合的抗体药物的药效测定 | |
| CN120314588A (zh) | 一种人免疫球蛋白抗体依赖性细胞介导的吞噬作用生物学活性的检测方法和检测试剂盒 | |
| Chengolova et al. | The relationship of bovine milk somatic cell count to neutrophil level in samples of cow's milk assessed by an automatic cell counter | |
| US20050221325A1 (en) | Detection of secreted polypeptides | |
| CN101375165A (zh) | 抗体鉴定测试 | |
| JP2002525580A (ja) | 好塩基球及び好酸球の検出又は定量のための方法 | |
| CN112430623B (zh) | 一种快速测定cgrp/cgrp受体抗体药物生物学活性的方法 | |
| CN111316098B (zh) | 用于治疗的基于流动的测定 | |
| CN120334552B (zh) | 一种人免疫球蛋白对非人种属细胞的adcp活性的检测试剂的组合、检测试剂盒及其检测方法 | |
| Miller et al. | Development of an ELISA based bridging assay as a surrogate measure of ADCC | |
| Camacho-Sandoval et al. | Taking advantage of a high-throughput flow cytometer for the implementation of an ADCC assay for regulatory compliance | |
| CN120249435A (zh) | 一种人免疫球蛋白的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性生物学活性的检测方法 | |
| US20040110122A1 (en) | Three-color reagent for measurement of CD4 positive lymphocytes by flow cytometry | |
| CN120539422A (zh) | 一种人免疫球蛋白抗乙肝病毒adcp活性的检测试剂盒和检测方法 | |
| Salinas-Jazmín et al. | In vitro methods for comparing target binding and CDC induction between therapeutic antibodies: applications in biosimilarity analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |