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CN120380132A - 脂肪细胞成熟 - Google Patents

脂肪细胞成熟

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Publication number
CN120380132A
CN120380132A CN202380079969.XA CN202380079969A CN120380132A CN 120380132 A CN120380132 A CN 120380132A CN 202380079969 A CN202380079969 A CN 202380079969A CN 120380132 A CN120380132 A CN 120380132A
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CN
China
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pluripotent stem
protein
days
cells
differentiation
Prior art date
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Pending
Application number
CN202380079969.XA
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English (en)
Inventor
R·奥特
K·B·奎尼
S·帕拉西奥斯奥尔特加
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitabur Co ltd
Original Assignee
Mitabur Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及多能干细胞，其包含用于表达PPAR‑γ蛋白的表达构建体和用于表达CEBPα#蛋白的表达构建体。本发明进一步提供了包括使用多能干细胞产生脂肪细胞的方法和包含脂肪细胞或多能干细胞的食物。

Description

脂肪细胞成熟
技术领域
本发明涉及经修饰的多能细胞以及将所述细胞分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
根据联合国最新估计，2022年7月，目前世界人口为79亿[https://www.worldometers.info/es/poblacion-mundial/#ref-1]，并预计到2056年左右将达到100亿。这一增长将在全球范围内分布不均，包括印度、尼日利亚、巴基斯坦、埃及和美国在内的9个国家将在未来30年占全球人口预计增长的一半。人口和经济增长是肉类消费增加的主要驱动力。根据联合国粮食及农业组织(FAO，https://www.oecd-ilibrary.org/agriculture-and-food/oecd-fao-agricultural-outlook-2022-2031_f1b0b29c-en)，预计到2031年，全球肉类消费量将预估增长15％。另一方面，收入增长与肉类消费量增加之间的相关性在较低收入率下是显而易见的，但一旦消费者达到足够的生活水平，他们对环境、道德、动物福利和健康问题就会变得更加敏感。
因此，人们越来越有兴趣寻找替代蛋白质来源，这些蛋白质来源在理想情况下是可持续的，并且含有人类饮食中肉类通常提供的营养。培养肉成为传统动物农业的另一种替代品，旨在生产通常构成动物肉的骨骼肌和脂肪组织，但使用体外组织和生物工程技术除外。尽管努力开发稳健的方案，从易于获取和可再生的来源可扩展地生成动物细胞类型，但将动物(多能)干细胞分化为特定的细胞类型通常仍然繁琐、漫长且难以再现和/或尚未建立。
此外，迄今为止，基于植物的肉和培养肉替代品主要侧重于模拟肉的肌肉成分。然而，脂肪也是肉的重要成分，有助于感官/风味、质地属性和适口性(Zhang,Shu等人"DNApolymorphisms in bovine fatty acid synthase are associated with beef fattyacid composition 1.[牛脂肪酸合酶中的DNA多态性与牛肉脂肪酸组成相关1]"Animalgenetics[动物遗传学]39.1(2008):62-70.)。
Tontonoz等人(Cell[细胞],第79卷,1147-1156–30 -12-1994)先前已经描述了可以分化为脂肪细胞的经修饰的细胞系，其中使用逆转录病毒表达系统将PPARγ和CEBPα共表达到成纤维细胞系中，之后观察到其自发分化为脂肪细胞。US2012219530描述了慢病毒转导的人多能细胞，其分化效率为约20％。然而，这些方案有几个限制，包括异质脂肪细胞成熟度、缺乏可扩展过程、不是食品安全的且培养时间长达28天。
因此，本领域仍然需要生产和培养适合人类食用并且可以以可扩展和成本有效的方式生产的成熟脂肪细胞。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种多能干细胞，其包含：
i)插入第一遗传安全港位点中的用于表达转录调节蛋白的表达构建体；
ii)用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体，其中该PPAR-γ蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；以及
iii)用于表达CEBPα蛋白的表达构建体，其中该CEBPα蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；
其中将ii)和iii)的表达构建体插入不是第一遗传安全港位点的至少一个另外的遗传安全港位点中，
并且其中该诱导型启动子由该转录调节蛋白调节。
在本发明的某些实施例中，将ii)和iii)的表达构建体插入不同于第一遗传安全港位点的第二遗传安全港位点中。优选地，所述第一和另外的基因组安全港位点选自hROSA26基因座、AAVS1基因座、CLYBL基因或CCR5基因中的任两个，优选地，其中遗传安全港位点是hROSA26基因座和AAVS1基因座。
在本发明的某些实施例中，细胞选自由胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胚胎细胞系和体细胞系组成的组。
在本发明的某些实施例中，多能干细胞属于家畜或家禽物种。优选地，家畜物种是猪或牛，优选地猪。多能干细胞可以属于猪科，例如猪属，诸如家猪(S.domesticus)物种。
在本发明的某些实施例中，插入第二遗传安全港位点中的表达构建体编码PPAR-γ蛋白、接头和CEBPα蛋白，优选地其中接头是P2A，更优选地其中接头包含SEQ ID NO:3的序列。优选地，构建体包含SEQ ID NO:4的序列。
在本发明的某些实施例中，转录调节蛋白的活性由外源供应的物质衍生物控制。优选地，转录调节蛋白选自由以下组成的组：四环素反应转录激活蛋白(rtTa)，四环素阻遏物(TetR)，VgEcR合成受体，或包含来自酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域、来自人孕酮受体的截短配体结合结构域和来自人NF-kB的激活结构域的杂合转录调节蛋白，优选地转录调节蛋白是rtTA。
在某些实施例中，诱导型启动子包括Tet反应元件(TRE)。
在某些实施例中，诱导型启动子是tetON启动子。
在第二方面，本发明提供了一种用于产生脂肪细胞，优选地白色脂肪细胞的方法，该方法包括
a)在增殖培养基中培养根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞：随后
b)通过添加本文所述的外源物质诱导脂肪细胞分化。
在某些实施例中，增殖和/或分化培养基不包含或基本上不包含至少一种选自胰岛素、地塞米松、罗格列酮和异丁基甲基黄嘌呤的组的化合物。在某些优选的实施例中，增殖和/或分化培养基不包含或基本上不包含胰岛素。不包含或基本上不包含胰岛素的增殖和/或分化培养基可以任选地包含IGF-1和/或LR3。
在某些实施例中，本文所述方法的分化期为至多10天、至多9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天。
在某些实施例中，产生的脂肪细胞用于人类和非人类膳食食用。
在另外的方面，本发明提供了本文所述的多能干细胞的用途或本文所述的用于产生脂肪细胞的方法的用途，该用途用于组织工程，任选地用于产生培养肉。
在又另外的方面，本发明提供了一种食品，其包含本文所述的多能干细胞或通过本文所述的方法获得的脂肪细胞。在某些实施例中，食品是培养肉。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本披露内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本领域技术人员将认识到与本文所述的方法和材料相似或等同的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实践。实际上，本发明决不限于该方法。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项目，但并不排除未特别提及的项目。此外，除非上下文明确要求存在一个/一种并且仅一个/一种要素，否则通过不定冠词“一个/一种(a或an)”提及要素并不排除存在超过一个/一种要素的可能性。因此，不定冠词“一个/一种(a或an)”通常意指“至少一个/至少一种”。
如本文所用，术语“和/或”指示所陈述情况中的一个或多个可以单独发生或与所陈述情况中的至少一个组合发生，直至与所有所陈述情况组合发生。
如本文所用，“至少”特定值意指该特定值或更多。例如，“至少2”被理解为与“2或更多”(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15……等)一样。
单词“约”或“大约”当与数值结合使用时(例如，约10)优选地意指该值可以是给定值(10)加或减该值的0.1％。
术语“异源”当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时是指这样的核酸或蛋白质，该核酸或蛋白质不是天然地作为存在它的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分存在，或其发现于不同于在自然界中发现它的细胞中或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对于引入它们的细胞不是内源的，但是已经从另一种细胞获得或合成或重组产生。通常，尽管不一定，这样的核酸编码不是由转录或表达DNA的细胞正常产生的蛋白质。类似地，外源RNA编码正常而言不在存在外源RNA的细胞中表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质也可以被称为外来核酸或蛋白质。本领域技术人员将认识到对于表达它的细胞而言是外源或外来的任何核酸或蛋白质在本文中都被术语异源核酸或蛋白质涵盖。术语异源也适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合，即组合序列中的至少两个相对于彼此是外来的组合。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够在与这样的序列相容的宿主细胞或宿主生物体中实现基因的表达的核苷酸序列。这些表达载体典型地包括至少合适的转录调节序列和任选地3’转录终止信号。还可以存在在实现表达中必要的或有帮助的另外的因子，如表达增强子元件。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指处于功能关系中的多核苷酸元件的连接。当核酸被放置成与另一个核酸序列具有功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则该转录调节序列与编码序列可操作地连接。可操作地连接意指被连接的DNA序列典型地是连续的，并且在需要接合两个蛋白质编码区的情况下，是连续的并且在阅读框中。诱导型启动子
如本文使用，术语“启动子”是指一种核酸片段，其起到控制一个或多个编码序列转录的作用，并且相对于编码序列的转录起始位点的转录方向位于上游，并且结构特征为存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活物蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接发挥作用以调节启动子的转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理或发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂。在本发明的情况下，控制是通过转录调节蛋白实现的。
本文中对公共序列数据库中可访问的核苷酸或氨基酸序列的任何提及是指本文件提交日可用的序列条目版本。
本说明书中引用的所有专利和参考文献通过引用以其全文特此并入。
发明人出人意料地发现，通过使用经修饰的多能干细胞，可以显著缩短多能细胞分化为成熟脂肪细胞所需的时间段，这些经修饰的多能干细胞包含用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体和用于表达CEBPα蛋白的表达构建体。如本文所述的实例所示，通过使用这些经修饰的多能细胞系，可以在不到10天内实现完全分化为成熟脂肪细胞。除了显著减少培养时间和所涉及的相关成本外，与先前描述的相比，使用本文描述的多能细胞还提供了更可靠和可扩展的成熟脂肪细胞生产。
因此，在第一方面，本发明涉及一种多能干细胞，其包含：
i)插入第一遗传安全港位点中的用于表达转录调节蛋白的表达构建体；
ii)用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体，其中该PPAR-γ蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；以及
iii)用于表达CEBPα蛋白的表达构建体，其中该CEBPα蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；
其中将ii)和iii)的表达构建体插入不是第一遗传安全港位点的至少一个另外的遗传安全港位点中，
并且其中该诱导型启动子由该转录调节蛋白调节。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)是一种作为转录因子的II型核受体，在人类中由PPARG基因编码。PPARG主要存在于脂肪组织、结肠和巨噬细胞中。在人类和小鼠中检测到PPARG的两种亚型：PPAR-γ1(发现于除肌肉以外的几乎所有组织中)和PPAR-γ2(主要发现于脂肪组织和肠道中)。在某些实施例中，本发明的PPAR-γ的编码序列编码PPAR-γ2。PPARG调节脂肪酸储存和葡萄糖代谢。PPARG激活的基因刺激脂肪细胞的脂质摄取和脂肪生成。PPARG敲除小鼠缺乏脂肪组织，从而确立了PPARG作为脂肪细胞分化的主要调节因子。在某些实施例中，PPAR-γ的编码序列具有SEQ ID NO:1的序列。
CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα)是人类CEBPA基因编码的蛋白质。这种无内含子基因编码的蛋白质是bZIP转录因子，它可以作为同二聚体与某些启动子和基因增强子结合。它还可以与相关蛋白CEBP-β和CEBP-γ以及不同的转录因子(例如c-Jun)形成异二聚体。编码的蛋白质是脂肪生成(形成新脂肪细胞的过程)和这些细胞中脂质积累以及肝脏中葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子。在某些实施例中，CEBPα的编码序列具有SEQ ID NO:2的序列。
在某些实施例中，编码根据本发明的蛋白质的核酸分子被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。密码子优化的方法是已知的，并且先前已经描述过(例如，用于哺乳动物细胞的WO 96/09378)。如果与野生型序列相比，至少一个非优选密码子被更优选的密码子替换，则序列被认为是密码子优化的。在此，非优选密码子是指在生物体中使用频率低于编码相同氨基酸的另一个密码子的密码子，更优选的密码子是在生物体中使用频率高于非优选密码子的密码子。特定生物体的密码子使用频率可以在密码子频率表中找到，例如http://www.kazusa.or.jp/codon。优选地，一个以上的非优选密码子，优选地大多数或所有非优选密码子被更优选的密码子替换。优选地，生物体中最常用的密码子用于密码子优化的序列中。被优选密码子替换通常会导致更高的表达。
转录调节蛋白是一种与DNA结合的蛋白质，优选地与位于启动子内或附近的DNA位点序列特异性结合，并促进转录机制与启动子的结合，从而转录DNA序列(转录激活物)或阻断这一过程(转录阻遏物)。这样的实体也被称为转录因子。
转录调节蛋白结合的DNA序列被称为转录因子结合位点或反应元件，这些在调节DNA序列的启动子中或附近发现。
转录激活蛋白与反应元件结合并促进基因表达。这样的蛋白质在本发明用于控制诱导型盒表达的方法中是优选的。
遗传安全港(GSH)位点是基因组内的基因座，其中可以插入基因或其他遗传物质，而对细胞或插入的遗传物质没有任何有害影响。最有益的是GSH位点，其中插入的基因序列的表达不受邻近基因的任何通读表达的干扰，并且诱导型盒的表达最大限度地减少对内源性转录程序的干扰。已经提出了更正式的标准，其有助于确定特定基因座将来是否是GSH位点(Papapetrou等人,2011,Nature Biotechnology[自然生物技术],29(1),73-8.doi:10.1 038/nbt.1 71 7.)。这些标准包括这样的位点，其(i)距离任何基因的5’端50kb或更多，(ii)距离任何与癌症相关的基因300kb或更多，(iii)距离任何微小RNA(miRNA)300kb或更多，(iv)位于转录单元外部以及(v)位于超保守区(UCR)外部。可能没有必要满足所有这些提出的标准，因为已经确定的GSH不符合所有标准。人们认为，合适的GSH将满足这些标准中的至少2个、3个、4个或全部。
在本发明的某些实施例中，第一和另外的基因组安全港位点选自hROSA26基因座、AAVS1基因座、CLYBL基因或CCR5基因中的任两个。在某些实施例中，第一和另外的基因组安全港位点位于人类基因组的chr1:152,360,840-152,360,859、chr1:175,942,362 -175,942,381、chr1:231,999,396-231,999,415、chr2:45,708,354–45,708,373；chr8:68,720,172–68,720,191。
在本发明的某些实施例中，第一和另外的基因组安全港位点选自牛安全港位点ROSA26、AAVS1、CLYBL基因和CCR5基因中的任两个。
优选地，遗传安全港位点是hROSA26基因座和AAVS1基因座。
在本发明的某些实施例中，将本文所述的用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体和本文所述的用于表达CEBPα蛋白的表达构建体插入不同于第一遗传安全港位点的第二遗传安全港位点中。在某些实施例中，插入第二遗传安全港位点中的表达构建体能够同时表达PPAR-γ蛋白和CEBPα蛋白。
如本文所用，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、胚胎衍生的干细胞、诱导多能干细胞和体细胞，而不管多能干细胞的衍生方法。因此，在某些实施例中，多能干细胞选自由胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胚胎细胞系和体细胞系组成的组。在某些实施例中，多能干细胞是外胚层衍生的干细胞(EpiSC)。在某些实施例中，多能干细胞表达一种或多种选自由以下组成的组的标记物：OCT-4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、Lin28、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。示例性多能干细胞可以使用本领域已知的方法产生。“诱导多能干细胞”(iPS细胞或iPSC)可以通过体细胞中重编程因子的蛋白质转导来产生。
根据本发明的多能干细胞可以来自任何物种。例如，胚胎干细胞已经成功地在小鼠、多种非人类灵长类动物和人类中衍生出来，并且胚胎干样细胞已经从许多其他物种中产生。因此，本领域技术人员可以从以下任何物种中产生胚胎干细胞和胚胎衍生的干细胞，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家狗和野狗)、猫(家猫和野猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、沙鼠、松鼠、豚鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。
同样，iPS细胞可以来自任何物种。这些iPS细胞已经使用小鼠和人类细胞成功地产生。此外，iPS细胞已经使用胚胎、胎儿、新生儿和成人组织成功地产生。因此，可以使用来自任何物种的供体细胞容易地产生iPS细胞。因此，可以从以下任何物种中产生iPS细胞，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家狗和野狗)、猫(家猫和野猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。
在某些实施例中，根据本发明或用于在本发明中使用的多能干细胞是动物细胞。在某些实施例中，根据本发明或用于在本发明中使用的多能干细胞来自可食用动物物种。
优选地，根据本发明或用于在本发明中使用的多能干细胞来自家畜或家禽动物。家畜物种包括但不限于家牛、猪、绵羊、山羊、羔羊、骆驼、水牛和兔子。
优选地，根据本发明或用于在本发明中使用的多能干细胞是猪或牛多能干细胞。最优选地是猪多能干细胞。在某些实施例中，根据本发明的干细胞是猪外胚层干细胞(pEpiSC)。
家禽物种包括但不限于家鸡、火鸡、鸭、鹅和鸽子。在某些实施例中，细胞来源于常见的猎物物种，如野鹿、鹑鸡类、水禽和野兔。优选地，根据本发明或用于在本发明中使用的多能干细胞不是人类细胞。
转录阻遏蛋白与反应元件结合并阻止基因表达。
转录调节蛋白可以通过多种机制被激活或失活，包括物质结合、与其他转录因子(例如，同源或异源二聚化)或共调节蛋白相互作用、磷酸化和/或甲基化。转录调节因子可以通过激活或失活来控制。
如果转录调节蛋白是转录激活蛋白，则优选的是，转录激活蛋白需要激活。这种激活可以通过任何合适的手段进行，但优选的是，通过向细胞中添加外源物质来激活转录调节蛋白。可以控制外源物质向细胞的供应，从而可以控制转录调节蛋白的激活。替代地，可以供应外源物质以使转录调节蛋白失活，然后撤回供应以激活转录调节蛋白。
如果转录调节蛋白是转录阻遏蛋白，则优选的是，转录阻遏蛋白需要失活。因此，提供一种物质来阻止转录阻遏蛋白阻遏转录，从而允许转录。
可以使用任何合适的转录调节蛋白，优选地可激活或可失活的转录调节蛋白。优选的是，可以提供外源物质来控制转录调节蛋白。这样的转录调节蛋白也称为诱导型转录调节蛋白。
因此，在某些实施例中，根据本发明的多能干细胞由外源供应的物质控制。
在某些实施例中，外源供应的物质选自由以下组成的组：肽(如Klotzsche等人；Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]280.26(2005):24591-24599或Schlicht等人；Applied and environmental microbiology[应用与环境微生物学]72.8(2006):5637-5642所述)或诱导物(Goeke等人Journal of molecular biology[分子生物学杂志]416.1(2012):33-45中所述；该文献通过引用并入本文)、适配体(如Hunsicker等人“Chemistry&biology[化学与生物学]16.2(2009):173-180中所述的RNA适配体；该文献通过引用并入本文)、四环素和脱水四环素或其衍生物。优选地，外源供应的物质是强力霉素。
在某些实施例中，本文所述的转录调节蛋白选自由以下组成的组：四环素反应转录激活蛋白(rtTa)，四环素阻遏物(TetR)，VgEcR合成受体，或包含来自酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域、来自人孕酮受体的截短配体结合结构域或来自人NF-kB的激活结构域的杂合转录调节蛋白。
四环素控制的转录激活是本领域熟知的诱导型基因表达方法，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如更稳定的强力霉素)存在下可逆地开启或关闭转录。在该系统中，转录激活蛋白是四环素反应转录激活蛋白(rtTa)或其衍生物。rtTA蛋白能够在特定的TetO操纵子序列处与DNA结合。这样的TetO序列的几个重复序列被放置在最小启动子(如CMV启动子)的上游，它们一起形成四环素反应元件(TRE)。该系统有两种形式，取决于添加四环素或衍生物使rTA蛋白激活(Tet-on)或是失活(Tet-Off)。
在Tet-Off系统中，四环素或其衍生物结合rTA并使rTA失活，使其不能结合TRE序列，从而阻止TRE控制基因的转录。Tet-On系统由两个组分组成；(1)组成型表达的四环素反应转录激活蛋白(rtTa)和rtTa敏感诱导型启动子(Tet反应元件，TRE)。这可以与四环素或其更稳定的衍生物(包括强力霉素(dox))结合，导致rtTa激活，使其结合TRE序列并诱导TRE控制基因的表达。在本发明的优选实施例中，转录调节蛋白是rtTA。
如果转录调节蛋白是rtTA，则插入不是第一GSH位点的至少一个另外的GSH中的诱导型启动子包括四环素反应元件(TRE)。因此，在某些实施例中，诱导型启动子包括Tet反应元件(TRE)。
在一些实施例中，其中转录调节蛋白是rtTA并包括TRE，外源供应的物质是抗生素四环素或其衍生物之一。
在本发明的某些实施例中，插入第二遗传安全港位点中的表达构建体是编码PPAR-γ蛋白和CEBPα蛋白的融合蛋白，如本文所述。在某些实施例中，插入第二遗传安全港位点中的表达构建体编码PPAR-γ蛋白、接头和CEBPα蛋白，在优选实施例中，该构建体包含SEQ ID NO:4或由其组成。
在某些实施例中，接头序列可以是可切割的接头。也就是说，接头序列可以包含能够被切割的氨基酸序列。例如，接头序列可以包含能够作为能够切割肽键(即切割位点)的酶的底物的序列。分子生物学领域的技术人员已知并可以使用许多这样的切割位点。在一些实施例中，可切割的接头可以包含自切割位点。自切割位点被自动切割，无需酶处理。例如，已经描述了2A自切割肽或2A肽家族，其包括2A肽P2A、E2A、F2A和T2A。F2A衍生自口蹄疫病毒；E2A衍生自A型马鼻炎病毒；P2A衍生自猪捷申病毒-1 2A；T2A衍生自明脉扁刺蛾病毒2A。在某些实施例中，可切割的接头因此选自由P2A、E2A、F2A和T2A组成的组。
在一些优选的实施例中，表达构建体包含小核糖核酸病毒2A(P2A)接头。优选地，表达构建体包含接头，该接头包含SEQ ID NO:3的序列或由其组成。
在某些实施例中，如本文所述的编码PPAR-γ蛋白、接头和CEBPα蛋白的插入第二遗传安全港位点中的表达构建体包含SEQ ID NO:4的序列或由其组成。
在某些实施例中，可操作地连接到PPAR-γ蛋白的诱导型启动子不同于连接到CEBPα蛋白的诱导型启动子。在某些实施例中，可操作地连接到PPAR-γ蛋白的诱导型启动子与连接到CEBPα蛋白的诱导型启动子相同。诱导型启动子在本领域中是熟知的，实例包括但不限于CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链等。
在某些实施例中，本发明中使用的诱导型启动子是tetOn启动子。优选地第3代TetOn启动子。
培养方法
本申请的发明人出人意料地发现，通过使用本文所述的多能细胞，可以显著减少获得脂肪细胞所需的分化时间。因此，在另外的方面，本发明涉及一种用于产生脂肪细胞的方法，该方法包括：
a)在增殖培养基中培养本文所述的多能干细胞：随后
b)通过添加本文所述的外源物质诱导脂肪细胞分化。
在某些实施例中，本发明的方法是离体方法。
在某些实施例中，该方法用于产生成熟脂肪细胞。成熟脂肪细胞在本文中定义为显示脂质积累和/或表达可检测水平的PPARy、FABP4、PLIN1和脂联素的脂肪细胞。
在某些实施例中，本发明的方法涉及用于产生白色脂肪细胞的方法。在某些实施例中，增殖和/或分化培养基不包含或基本上不包含至少一种选自胰岛素、地塞米松、罗格列酮和异丁基甲基黄嘌呤的组的化合物。在优选的实施例中，增殖和/或分化培养基不包含或基本上不包含胰岛素。
不包含或基本上不包含胰岛素的增殖和/或分化培养基可以任选地包含IGF-1和/或LR3。
增殖和/或分化培养基可以包含高达约20μg/mL胰岛素，例如高达约10μg/mL胰岛素，例如约5μg/mL胰岛素，例如1μg/mL胰岛素。
发明人出人意料地发现，使用本文所述的多能细胞避免了用定型诱导步骤培养细胞的需要。通常，当培养脂肪细胞时，可以区分几个培养期。定型或决定期涉及前脂肪细胞的形成，这些前脂肪细胞已经失去了分化为其他细胞类型的潜力。前脂肪细胞向脂肪细胞的分化是由按时间顺序表达的转录因子的高度调节网络促进的，以促进脂肪细胞形态和生化特征，例如胰岛素反应性、脂质转运和合成以及分泌能力。分化期也分为四个阶段：生长停滞、有丝分裂克隆扩增、早期分化和终末分化。在本文所述的方法中使用本文所述的多能干细胞允许多能干细胞分化为成熟脂肪细胞，而不需要定型诱导步骤并且不强制过表达。细胞跳过这个定型诱导步骤的能力是特别有利的，因为它减少了通常需要存在于分化培养基中的化合物和小分子的量。例如，发现本文所述的细胞能够在不存在BMP-4、激活素A和FGF2的情况下分化，这些BMP-4、活化素A和FGF2通常是令人满意的分化所必需的。从分化培养基中省去这些化合物和小分子的能力降低了培养基成本，并简化了监管验收的方式。术语分化期和分化阶段在本文中可互换使用。
因此，在某些实施例中，本文所述的方法不包括额外的定型期诱导步骤。
本文所述的方法显著减少了本文所述的多能细胞分化成成熟脂肪细胞的时间。在某些实施例中，使用所要求的方法产生成熟脂肪细胞的时间为最多10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天。在所述方法中使用所述的多能细胞，发明人观察到培养第4天转化率为至少95％，这意味着至少95％的细胞在培养4天后成熟。因此，在某些实施例中，产生至少95％成熟脂肪细胞的时间为最多4天。
在另外的方面，本发明提供了通过本文所述方法获得的脂肪细胞，优选地成熟脂肪细胞。
培养如本文所述细胞可以在所谓的2D培养条件下进行，这被认为是培养细胞的常规方法。然而，所述方法也可以容易地适用于允许在3D条件下培养，如下面的实例所示。
3D细胞培养是一种人工创建的环境，使细胞能够在三维中生长或与周围环境相互作用。在这样的培养中，细胞典型地形成3D集落，可称为“球状体”。3D培养方法可以更准确地建模细胞体内生长和行为。技术人员能够容易地进行3D细胞培养，例如通过利用多种可商购培养工具中的任一种。例如，3D培养可以使用支架或无支架技术进行。基于支架的技术利用支撑物(例如固体支架和水凝胶)使细胞能够形成3D培养物。这样的支架可能旨在模拟体内存在的天然细胞外基质(ECM)。无支架技术省去了使用支架来生长细胞。相反，可以通过使用例如低粘附板、悬滴板、微图案化表面、旋转生物反应器、磁悬浮和磁性3D生物打印来建立3D球状体。
用慢病毒载体转导的细胞不被认为是食品安全的或对人类和非人类膳食食用是不安全的。本文所述方法的本文所述多能细胞避免了使用慢病毒转导的细胞的需要。因此，在某些实施例中，根据本文披露的方法产生的脂肪细胞用于人类和非人类膳食食用。在某些实施例中，产生的脂肪细胞可用于产生供人类食用的培养肉。
在另外的方面，本发明提供了本文所述的多能干细胞或通过本文所述方法获得的脂肪细胞用于组织工程的用途。在某些实施例中，本文所述的方法用于离体或体内组织工程。
在某些方面，用途是用于产生培养肉。也就是说，本发明提供了本文所述的多能干细胞或通过本文所述方法获得的脂肪细胞用于产生培养肉的用途。
在又另外的方面，本发明提供了一种食品(也称为“食物”)，其包含本文所述的多能干细胞或通过所述方法产生和/或获得的脂肪细胞。在某些实施例中，食品是或进一步包含供人类或非人类食用的可食用组合物。例如，供人类或非人类食用的可食用组合物包含肌细胞、成熟肌肉细胞、矿物质、合成物质、调味物质(例如，如草药和香料)、基于植物的蛋白质或微生物来源的蛋白质(如酵母蛋白)中的至少一种。适用于在食品中使用的基于植物的蛋白质和酵母蛋白是本领域技术人员已知的。在某些实施例中，食品是培养肉或培养肉产品。
在又另外的方面，本发明提供了一种生产食品的方法，该方法包括将本文所述的多能干细胞或产生的和/或获得的脂肪细胞与本文所述供人类食用或非人类食用的可食用组合物组合。在某些实施例中，食品是培养肉。
序列描述
表1：序列
SEQ ID NO: 名称
1 编码PPAR-γ蛋白的DNA序列
2 编码CEBPα蛋白的DNA序列
3 GSG-P2A_接头
4 PPARG-P2A-CEBPA–构建体
5 pMI014_PPARG-P2A-CEBPA_opti-ox-aavs1
附图说明
图1：EpiSC-PPARγ和EpiSC-PPARγ-CEBPα2D分化之间的比较。未分化(第0天)和分化(第2、4、6和8天)的EpiSC-PPARγ和EpiSC CEBPα-PPARγ。明场显微镜，10倍。
图2：猪PPARγ和CEBPαOpti-Ox细胞的mRNA相对基因表达。A)PPARγ，B)CEBPα，C)内源性PPARγ，D)内源性CEBPα，E)脂联素，F)LPL，G)脂滴包被蛋白-1，H)FABP4，i)CD36和J)CEBPβ，K)ZBTB16和L)Oct 4。EpiSC-PPARγ和EpiSC CEBPα-PPARγ在2D中分化8天。
图3：未分化的EpiSC-PPARγ和EpiSC-PPARγ-CEBPα以及分化2、4、6和8天后的总细胞内甘油三酯定量。
图4：EpiSC-PPARγ和EpiSC-PPARγ-CEBPα2D分化之间的比较。未分化(第0天)和分化的(第7、14和20天)。荧光显微镜，10倍。用Oil Red O(红色，中性脂质)和DAPI(蓝色，细胞核)染色。
图5：EpiSC-PPARγ和EpiSC-PPARγ-CEBPα3D分化之间的比较。用Oil Red O(红色，中性脂质)和DAPI(蓝色，细胞核)染色的悬浮分化(3D，第6天)的EpiSC-PPARγ和EpiSCPPARγ-CEBPα。荧光显微镜，10倍。
图6：根据方案D(中胚层步骤+成熟步骤)或方案F(仅成熟步骤)分化(第4、12和20天)的EpiSC PPARγ-CEBPα。A)明场显微镜，40倍。B)从在方案D或方案F条件下分化20天的EpiSC CEBPα-PPARγ提取的细胞内Oil Red O染色的定量(吸光度)。
图7：在以下条件下分化(第2、7和13天)的EpiSC PPARγ-CEBPα：根据方案D(中胚层步骤+成熟步骤)，用补充有(1)KSR、胰岛素和地塞米松(2)KSR和地塞米松或(3)KSR和胰岛素的成熟培养基进行；或根据方案F(仅成熟步骤)，用根据条件(1)、(2)和(3)补充的成熟培养基进行。明场显微镜，20倍。
图8：在以下条件下悬浮分化(3D，第13天)的EpiSC PPARγ-CEBPα，根据方案D(中胚层步骤+成熟步骤)，用补充有(1)KSR、胰岛素和地塞米松(2)KSR和地塞米松或(3)KSR和胰岛素的成熟培养基进行；或根据方案F(仅成熟步骤)，用根据条件(1)、(2)和(3)补充的成熟培养基进行。用OilRed O(红色，中性脂质)和DAPI(蓝色，细胞核)染色的聚集体。荧光显微镜，10倍。
图9：在生物反应器中，根据类似于方案D(中胚层步骤+成熟步骤)的补料分批方案，用补充有胰岛素和地塞米松的培养基悬浮分化(3D，第7天)的EpiSC PPARγ-CEBPα。在分化的第0、3、5和7天收集聚集体，并定量总细胞内甘油三酯。
图10：根据方案F(仅成熟步骤)，用补充有(A)胰岛素20μg/mL、(B)胰岛素10μg/mL、(C)胰岛素5μg/mL或(D)不含胰岛素的成熟培养基分化(第7天)的EpiSC PPARγ-CEBPα。在没有胰岛素的情况下，成熟培养基还补充有(E)0.05μg/mL IGF-1或(F)0.05μg/mL IGF-1/LR3。明场显微镜，20倍。
实例
本发明由以下实例进一步说明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
材料和方法
猪外胚层衍生的干细胞(pEpISC)分化为脂肪细胞。
使未分化的pEpISC(Opti-Ox PPARγ和Opti-Ox CEBPα-PPARγ)在hESC合格的geltrex(A1413301，赛默科技公司(Thermo Scientific))包被板上的N2B27增殖培养基(50％ DMEM Ham F-12(L0093-500，博奥韦斯特公司(Biowest))、50％ Neurobasal培养基(21103049，赛默飞世尔公司)、B27补充剂(17504044，赛默飞世尔公司)、N2补充剂(17502001，赛默飞世尔公司)、glutamax(35050061，赛默飞世尔公司)、10mM 2-巯基乙醇(31350010，赛默飞世尔公司)、0.02μg/mL激活素A(QK001，Q-kine)、0.10μg/mL FGF2(QK002，Q-kine)、0.625μg/mL XAV939(X3004，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)))中生长。对于2D脂肪细胞分化，在温和细胞解离试剂(07174，干细胞技术公司(STEMCELLtechnologies))处理后获得单细胞，并评估细胞数量和活力。将单pEpISC细胞以50000-150000个细胞/cm2的密度接种在相应的细胞培养板中。在含有10μm Rock抑制剂(Y-27632(HBF2297，HelloBio公司))的增殖培养基中孵育过夜后，将细胞在补充有25ng/mL激活素A(120-14E，派普泰克公司(PeproTech))、10ng/mL BMP4(120-05ET，派普泰克公司)、4ng/mLFGF2(Qk002，Qkine)和50mg/mL抗坏血酸(A8960，西格玛奥德里奇公司)的StemPro-34 SFM培养基(10639011，赛默科技公司)中培养48小时，以增强干细胞定型为脂肪细胞谱系。在第2天，将培养基替换为由含有15％敲除血清替代物(10828-028，赛默飞世尔公司)、1μg/mL胰岛素(12585014，赛默飞世尔公司)和1μM地塞米松(D1756，西格玛奥德里奇公司)的DMEMHam F-12(L0093-500，博奥韦斯特公司)组成的脂肪细胞成熟培养基。将pEpISC分化指定天数。将培养基每两天更新一次。将强力霉素(1μg/mL，D9891，西格玛奥德里奇公司)加入分化培养基中，以激活这些细胞中的Opti-OX系统。
对于球状体或聚集体分化实验，将未分化的单pEpISC(Opti-Ox PPARγ和Opti-OxCEBPα-PPARγ)以300万个细胞/mL接种在250mL摇瓶中，该摇瓶含有25mL增殖培养基(含有50％ DMEM Ham F-12(L0093-500，博奥韦斯特公司)、50％ Neurobasal培养基(21103049，赛默飞世尔公司)、B27补充剂(17504044，赛默飞世尔公司)、N2补充剂(17502001，赛默飞世尔公司)、glutamax(35050061，赛默飞世尔公司)、10mM 2-巯基乙醇(31350010，赛默飞世尔公司)、0.02μg/mL激活素A(QK001，Q-kine)、0.10μg/mL FGF2(QK002，Q-kine)、0.625μg/mLXAV939(X3004，西格玛奥德里奇公司、2X％敲除血清替代物(10828-028，赛默飞世尔公司)KSR和10ng/mL FGF2)。第二天，一旦形成小球状体，将培养基替换为补充的StemPro-34SFM。以相同的方式，在分化的第2天添加成熟培养基，每两天更新一次，直到实验结束。
OilRed O染色
如前所述，将未分化和分化的pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-Ox CEBPα-PPARγ用Oil Red O染色(O0625，西格玛公司(Sigma))。简而言之，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养或聚集的细胞，并在室温下用4多聚甲醛(PFA)固定40分钟。用PBS洗涤3次并用60％异丙醇透化后，将细胞在室温下用经水稀释至40％的OilRed O(0.5％于异丙醇中)染色30分钟。此后，用去离子水洗涤pEpISC几次，直到只有脂滴被染料正确染色。
在倒置明场显微镜(Oxion Inverso，Euromex公司)或荧光显微镜(EVOS M7000，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))下拍摄未分化和分化的细胞。在脂肪生成过程中的不同检查点，通过用100％异丙醇从细胞中提取Oil Red O染料并在540mM下分光光度法测量所得溶液(Glomax Discover，普洛麦格公司(Promega))，估计pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-Ox CEBPα-PPARγ的甘油三酯含量。根据制造商的说明书，通过估计通过HOESCH 33342染色(H1399，赛默飞世尔科技公司)分光光度法测量的细胞数来调整Oil Red O数据。
按照先前描述的相同方案，对在聚集体或球状体中分化的pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-Ox CEBPα-PPARγ进行染色。按照两种不同的方法进行成像采集。为了快速检查脂肪细胞质量，将染色的聚集体转移到载玻片上。去除过量的缓冲液后，使用硬性封片介质(P36984，赛默飞世尔科技公司)对载玻片进行封片。在这个过程中，球状体聚集体被压平，从而获得脂质存在的概况并评估其分布。为了更准确的分析，将未染色和固定的细胞聚集体冷冻保存在蔗糖溶液中。然后用低温恒温器(CM 1950，徕卡公司(Leica))在20μm处对冷冻样品进行切片。使用前面描述的Oil Red O染色方案对冷冻切片进行染色。测量包括总细胞数、每个细胞的总脂质数、脂质大小和形状、总强度(脂质对象内)。
甘油三酯含量
根据制造商的说明，使用甘油三酯定量比色/荧光试剂盒(MAK266-1KT，西格玛奥德里奇公司)从未分化和分化的培养/聚集体pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-OxCEBPα-PPARγ定量细胞内甘油三酯含量。简而言之，在加热下用去离子水中的5％ NonidetP40替代物(11754599001，西格玛奥德里奇公司)溶液提取总脂质。通过添加脂肪酶，甘油从甘油三酯中释放出来，随后反应产生颜色，可以在570nm下用分光光度法测量(GlomaxDiscover，普洛麦格公司(Promega))。TG浓度基于由TG标准品制成的标准曲线计算，并将其归一化为总细胞蛋白含量。
实时定量PCR分析(RT-qPCR)
根据制造商的说明，使用Reliaprep细胞微型制备系统(Z6012，普洛麦格公司(Promega))提取未分化和分化的pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-Ox CEBPα-PPARγ中的总RNA。使用微量分光光度计DS-11(得诺为公司(DeNovix))测定RNA浓度和质量。首先用DNA酶I处理来自每个样品的500纳克纯化的总RNA，以去除可能的基因组DNA污染，随后使用iScript gDNA Clear cDNA合成试剂盒(1725035BUN，伯乐公司(BioRad))将其逆转录为cDNA。设计猪多能性和成熟脂肪细胞标记物的特异性引物进行实时定量PCR分析(表I)。根据制造商的指南，使用PowerTrack SYBR Green预混液(A46112，赛默飞世尔公司)在(热循环仪)系统中将来自两个独立实验的至少三个样品一式三份进行扩增。RT-qPCR条件为95℃持续30秒，随后95℃持续15s和60℃持续1min进行40个循环。YWHAZ基因用作管家基因，以使靶基因表达水平归一化。通过2-ΔΔCt方法计算相对基因定量。
结果
实例1：在动物细胞中通过双重GSH靶向开发诱导型转基因过表达方法
为了探索OPTi-OX用于猪(pPSC)正向编程的潜力，我们生成了PPARG OPTi-OXpPSC。我们依次在CAG启动子控制下将rtTA盒靶向猪ROSA26 GSH，在强力霉素诱导型元件控制下将PPARG转基因靶向猪AAVS1 GSH，并观察到稳健和均质的诱导型转基因表达。强力霉素处理后诱导PPARG表达导致细胞积累脂质。这些结果表明，单独的PPARG过表达足以驱动pPSC中的脂肪生成。然而，pEpiSC PPARg脂肪积累和细胞形态远不能与猪成熟脂肪细胞相比，并且一些特定的晚期脂肪生成标记物(例如PLIN1或脂联素)即使在分化21天后也没有表达。
在通过调节与脂肪生成有关的关键信号传导级联对脂肪生成因子进行系统筛选后，选择PPARg和CEBPa用于联合细胞重编程策略。我们设计了一种敲入，其在一个开放阅读框中包含PPARg、P2A“自切割”肽接头和CEBPa，以通过强力霉素诱导同时表达PPARg和CEBPa。2A肽接头是充分表征的18-22个氨基酸的短肽接头，由于翻译期间核糖体跳跃，其产生了从单个开放阅读框表达两个单独的基因产物。通过掺入嘌呤霉素抗性盒选择AAVS1GSH中的稳定敲入，并通过在细胞培养基中加入嘌呤霉素进行选择。选择后，将单pEpiSC细胞进行铺板，并分离克隆细胞系用于生长和分析。随后使用PCR基因组分析、Sanger测序和RT-qPCR证实强力霉素诱导型PPARg-P2A-CEBPa的掺入。使用双重GSH靶向方法，我们选择携带每个转基因的两个拷贝的克隆品系，并观察到两个元件的纯合靶向允许诱导型过表达(数据未显示)。重要的是，双重GSH靶向方法不影响SC自我更新或分化，如通过RT-qPCR测定的(数据未显示)。
实例2：EpiSC-PPARγ-CEBPα2D短期分化为脂肪细胞。
pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-Ox PPARγ-CEBPα用强力霉素分化长达8天。使用明场显微镜拍摄未分化细胞(第0天)和分化期间(第2、4、6和8天)的照片。如在图1中可以看出，含有Opti-Ox-PPARγ-CEBPα的pEpISC在分化期间产生的脂滴大于pEpiSCPPARγ，这表明更好的细胞成熟和更多的脂质积累。这种差异在分化开始后的第4天就已经可见，这表明包含Opti-Ox PPARγ-CEBPα的pEpISC分化得快的多。
我们使用RT-qPCR评估猪内源性PPARγ、CEBPα、脂联素、LPL、脂滴包被蛋白-1、FABP4、CD36和CEBPδ的mRNA相对基因表达，结果如图2所示。如所预期的，pEpiSC PPARγ-CEBPα细胞在分化2天后就已表达Opti-Ox CEBPα和Opti-Ox PPARγ，这证实了Opti-Ox系统能够稳定地表达转基因，并证实了细胞模型的可用性。pEpiSC PPARγ-CEBPα细胞具有多种脂肪细胞标记物(LPL和CD36、脂滴包被蛋白1(指示脂质积累)、CEBPδ和ZBTB16(晚期脂肪生成标记物)、脂联素和FABP4(终末细胞分化的标记物))的较高表达。脂联素和脂滴包被蛋白1在pEpiSC PPARγ中没有表达。表明pEpiSC PPARγ-CEBPα具有较高的分化潜力。此外，我们观察到，在第2天，在pEpiSC PPARγ-CEBPα中诱导了Oct4表达。在pEpiSC PPARγ中没有观察到这种效应。已知Oct4是细胞定型为脂肪细胞谱系的重要调节因子，这表明pEpiSCPPARγ-CEBPα在分化期间不需要定型步骤，从而允许更快分化。
接下来，我们使用Oil Red O染色定量未分化和分化细胞的总甘油三酯含量(图3)。Oil Red O是一种脂溶性染料，其染色中性甘油三酯和脂质。结果显示，pEpiSC PPARγ-CEBPα具有显著更高的甘油三酯含量，这表明与pEpiSC PPARγ相比，它们的分化更快且更有效。
实例3：EpiSC-PPARγ-CEBPα2D长期分化为脂肪细胞。
我们重复了实例2中的实验，但现在将pEpISC Opti-Ox PPARγ和pEpISC Opti-OxPPARγ-CEBPα细胞分化长达20天，并在第7、14和21天收集分化的细胞用于Oil Red O染色(图4)。pEpiSC CEBPα-PPARγ细胞在脂肪生成期间积累的脂滴大于pEpiSC PPARγ。在第7天，已经可以检测到这种差异，其中pEpISC Opti-Ox PPARγ-CEBPα具有明确定义的脂肪细胞样形状和均匀的脂质积累。此外，pEpiSC PPARγ-CEBPα细胞在开始分化之前不需要达到汇合状态(数据未显示)，这表明pEpiSC PPARγ-CEBPα不太依赖于外部促脂肪生成因子(ECM，分泌因子)。
实例4：EpiSC-PPARγ-CEBPα在分化期间跳过定型步骤
为了确认不需要定型分化步骤，使用两种分化方案在2D中分化EpiSC-PPARγ-CEBPα。方案D(包括定型+成熟步骤)和方案F(仅成熟步骤)。在分化期间第4、12和20天收集细胞，并在明场显微镜下分析(图6A)。中性脂质含量通过OilRed O估计，用HOESCH方法测量的细胞数进行调整。两种染料通过分光光度法定量(图6B)。
虽然定型步骤对于提高pEpiSC PPARγ的分化能力是必要的(数据未显示)，但EpiSC-PPARγ-CEBPα脂肪生成性能在方案D和F之间是相当的(图6A)。事实上，在没有中胚层步骤的情况下，分化的EpiSCs-PPARγ-CEBPα中每个细胞的中性脂质积累较高(图6B)，这使得该模型在降低成本(工艺和培养基)方面更有前景，因为可以省去几个小分子来进行培养肉的监管验收。
实例5：EpiSC-PPARγ-CEBPα2D分化：使用方案D和方案F在使用KSR+胰岛素+地塞米松、KSR+地塞米松(无额外胰岛素)和KSR+胰岛素(无地塞米松)的情况下进行分化。
为了探索EpiSC-PPARγ-CEBPα在分化的成熟步骤中是否需要额外的胰岛素和地塞米松，在存在或不存在额外胰岛素和/或地塞米松的情况下，使用分化方案D和F在2D中分化EpiSC-PPARγ-CEBPα。在分化期间第2、7和13天收集细胞，并在明场显微镜下分析(图7A)。脂肪生成性能在使用胰岛素和地塞米松的方案D和F与不使用胰岛素和/或地塞米松的这些方案之间是相当的。能够省去胰岛素和地塞米松使得该模型在降低成本(工艺和培养基)方面更有前景，因为可以省去几个小分子来进行培养肉的监管验收。
实例6：EpiSC-PPARγ-CEBPα的3D培养
细胞在3D中悬浮培养是按比例放大到大体积并以成本竞争力价格(例如在振荡器和/或生物反应器中)产生培养肉产品所需的脂肪细胞量的必要步骤。尽管细胞在3D中悬浮培养允许细胞在更接近模拟细胞的体内生理环境的环境中生长，但需要正确地从2D转变到3D培养，并且需要在3D中验证从2D实验获得的分化数据。
因此，EpiSC-PPARγ-CEBPα适应3D悬浮细胞生长，并作为聚集体生长；根据制造商的说明，将在贴壁的6孔细胞板中扩增的EpiSC-PPARγ-CEBPα用Accumax(00-4666-56，赛默飞世尔科技公司)进行单细胞化，然后转移到150mL摇瓶中的12.5mL培养基和RHO/ROCK途径抑制剂中，然后扩增至少3个循环。3D扩增期间，每天更新培养基。随后，将3D适应的EpiSC-PPARγ-CEBPα用于振荡器和生物反应器实验。
为了探索3D中的脂肪生成性能，将300万个细胞/mL接种在含有25mL培养基的250mL摇瓶中，并在额外的胰岛素和地塞米松存在下，使用分化方案D分化EpiSC-PPARγ-CEBPα。每隔一天更换培养基。在分化期间第6天收集细胞，用Oil Red O和DAPI染色，并使用先前描述的煎饼法通过荧光显微镜可视化(图5)，如本文先前所述分析猪PPARγ和CEBPαOpti-Ox衍生的mRNA以及猪内源性PPARγ、CEBPα、脂联素、LPL、脂滴包被蛋白-1、FABP4、CD36和CEBPβ的mRNA相对基因表达。相对基因表达与在2D培养中生长的细胞中观察到的相对基因表达没有显著差异(数据未显示)，证实脂肪细胞适合在3D培养中生长和分化。
实例7：EpiSC-PPARγ-CEBPα3D悬浮分化：方案优化：使用方案D和方案F在使用KSR+胰岛素+地塞米松、KSR+地塞米松(无额外胰岛素)和KSR+胰岛素(无地塞米松)的情况下进行分化。
为了证实在3D中也可以省去额外的胰岛素和地塞米松，在振荡器中分化EpiSC-PPARγ-CEBPα，并在3D中重复实例5的设置。pEpiSC PPARγ-CEBPα也根据方案D(中胚层步骤+成熟步骤)和方案F(仅成熟步骤)进行3D悬浮分化(图8)。在聚集体的中心也可检测到细胞内甘油三酯，这表明3D结构(包括大小聚集体)内部足够的营养物和因子输运。因此，pEpiSC PPARγ-CEBPα也能够在成熟培养基中没有添加额外的胰岛素并且没有添加地塞米松的情况下分化为脂肪细胞，这再次证实了该模型在降低成本(工艺和培养基)方面更有前景，因为可以省去几个小分子来进行培养肉的监管验收。
实例8：在生物反应器中EpiSC-PPARγ-CEBPα3D悬浮分化：
为了探索pEpiSC PPARγ-CEBPα是否可以在生物反应器中生长和分化，使用Ambr250模块化生物反应器系统(赛多利斯公司(Sartorius))设计补料分批程序，其中将6x106/mL未分化细胞接种在120mL DMEMF/12培养基(21041-025，吉博科公司(Gibco))中，该培养基补充有KSR、BMP4、FGF2、激活素A、Glutamax和抗坏血酸，其浓度与先前实验所述相同。葡萄糖浓度维持在7mM以上，温度保持在生理水平，搅拌速度足以确保聚集体大小不超过营养物输运的限制，根据需要添加7.5％碳酸氢钠以将pH维持在7.4±0.5，溶解氧设定点设定在30％-70％之间。在第0、2、4和6天添加额外的胰岛素和强力霉素，而地塞米松仅在第2天添加一次。在分化的第0、3、5和7天收集聚集体用于进一步分析。每24小时监测培养基成分浓度，以确定可能的限制(数据未显示)。在第0、3、5和7天获得用于中性脂质定量和基因表达分析的样品。在第0天和第6天测量聚集体的大小。
在pEpiSC PPARγ-CEBPα分化3天后，已经检测到细胞内甘油三酯，而脂质积累不断增加，直到分化第7天实验结束(图9)。这些结果证实，pEpiSC PPARγ-CEBPα可以在生物反应器中分化为脂肪细胞，这突出了该模型用于按比例扩大工艺的潜力。
实例9：EpiSC-PPARγ-CEBPα在不存在胰岛素的情况下分化
将PPARγ-CEBPαpEpISC以125000个细胞/cm2接种在预包被有Geltrex的6孔板中的增殖培养基+3.5μM法舒地尔中。将细胞均匀分布在孔中，并在38.5℃、5％CO2下孵育过夜，以确保其附壁。第二天，通过用补充有0.5μg/mL强力霉素并含有20μg/mL胰岛素(对照，条件图10A)、10μg/mL胰岛素(条件图10B)、5μg/mL胰岛素(条件图10C)或不存在胰岛素(条件图10D)的成熟培养基(方案F)更新培养基来诱导脂肪细胞分化。不含胰岛素的成熟培养基还补充有0.05μg/mLIGF-1(条件图10E)和0.05μg/mLIGF-1/LR3(条件图10F)。每两天更换一次成熟培养基，并在分化期间在38.5℃、5％ CO2下孵育细胞。在分化第8天拍摄明场图像。这些结果证实，胰岛素不是有效分化所需的。
下文阐述了本文所披露的方法和组合物的陈述(特征)和实施例。除非明确指出相反，否则如此定义的本发明所披露的每个陈述和实施例都可以与任何其他陈述和/或实施例组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征都可以与被指示为优选或有利的任何一个或多个其他特征组合。
实施例
本发明至少提供了以下编号的陈述/实施例：
1.一种多能干细胞，其包含：
i)插入第一遗传安全港位点中的用于表达转录调节蛋白的表达构建体；
ii)用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体，其中该PPAR-γ蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；以及
iii)用于表达CEBPα蛋白的表达构建体，其中该CEBPα蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；
其中将ii)和iii)的这些表达构建体插入不是该第一遗传安全港位点的至少一个另外的遗传安全港位点中，
并且其中该诱导型启动子由该转录调节蛋白调节。
2.根据实施例1所述的多能干细胞，其中将ii)和iii)的这些表达构建体插入不同于该第一遗传安全港位点的第二遗传安全港位点中。
3.根据实施例1或2所述的多能干细胞，其中该细胞选自由以下组成的组：胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胚胎细胞系和体细胞系。
4.根据实施例1-3中任一项所述的多能干细胞，其中这些多能干细胞属于家畜或家禽物种。
5.根据实施例4所述的多能干细胞，其中这些家畜物种是猪或牛，优选地猪。
6.根据实施例2-5中任一项所述的多能干细胞，其中插入该第二遗传安全港位点中的该表达构建体编码PPAR-γ蛋白、接头和CEBPα蛋白，优选地其中该接头是P2A，更优选地其中该接头包含SEQ ID NO:3的序列。
7.根据实施例6所述的多能干细胞，其中该构建体包含SEQ ID NO:4的序列。
8.根据实施例1-7中任一项所述的多能干细胞，其中该转录调节蛋白的活性由外源供应的物质衍生物控制。
9.根据实施例1-8中任一项所述的多能干细胞，其中该转录调节蛋白选自由以下组成的组：四环素反应转录激活蛋白(rtTa)，四环素阻遏物(TetR)，VgEcR合成受体，或包含来自酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域、来自人孕酮受体的截短配体结合结构域和来自人NF-kB的激活结构域的杂合转录调节蛋白，优选地该转录调节蛋白是rtTA。
10.根据实施例1-9中任一项所述的多能干细胞，其中该诱导型启动子包括Tet反应元件(TRE)。
11.根据实施例1-10中任一项所述的多能干细胞，其中该诱导型启动子是tetON启动子。
12.根据实施例1-11中任一项所述的多能干细胞，其中所述第一和另外的基因组安全港位点选自hROSA26基因座、AAVS1基因座、CLYBL基因或CCR5基因中的任两个，优选地，其中该遗传安全港位点是hROSA26基因座和AAVS1基因座。
13.一种用于产生脂肪细胞，优选地白色脂肪细胞的方法，该方法包括：
a)在增殖培养基中培养根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞：随后
b)通过添加根据权利要求8所述的外源物质诱导脂肪细胞分化，优选地该增殖和/或分化培养基不包含胰岛素和/或地塞米松。
14.根据实施例13所述的方法，其中该分化期为至多10天、至多9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。
15.根据实施例13或14所述的方法，其中所产生的脂肪细胞用于人类和非人类膳食食用。
16.根据实施例1-12中任一项所述的多能干细胞的用途或根据实施例13-15中任一项所述的用于产生脂肪细胞的方法的用途，该用途用于组织工程，任选地用于产生培养肉。
17.一种食品，其包含根据实施例1-12中任一项所述的多能干细胞或通过根据权利要求13-15中任一项所述的方法获得的脂肪细胞。
18.根据实施例17所述的食品，其中该食品是培养肉。

Claims (18)

1.一种多能干细胞，其包含：
i)插入第一遗传安全港位点中的用于表达转录调节蛋白的表达构建体；
ii)用于表达PPAR-γ蛋白的表达构建体，其中该PPAR-γ蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；以及
iii)用于表达CEBPα蛋白的表达构建体，其中该CEBPα蛋白的编码序列可操作地连接到诱导型启动子；
其中将ii)和iii)的这些表达构建体插入不是该第一遗传安全港位点的至少一个另外的遗传安全港位点中，
并且其中该诱导型启动子由该转录调节蛋白调节。
2.根据权利要求1所述的多能干细胞，其中将ii)和iii)的这些表达构建体插入不同于该第一遗传安全港位点的第二遗传安全港位点中。
3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞，其中该细胞选自由诱导多能干细胞和胚胎细胞系组成的组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多能干细胞，其中这些多能干细胞属于家畜或家禽物种。
5.根据权利要求4所述的多能干细胞，其中这些家畜物种是猪或牛，优选地猪。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的多能干细胞，其中插入该第二遗传安全港位点中的该表达构建体编码PPAR-γ蛋白、接头和CEBPα蛋白，优选地其中该接头是P2A，更优选地其中该接头包含SEQ ID NO:3的序列。
7.根据权利要求6所述的多能干细胞，其中该构建体包含SEQ ID NO:4的序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞，其中该转录调节蛋白的活性由外源供应的物质衍生物控制。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞，其中该转录调节蛋白选自由以下组成的组：四环素反应转录激活蛋白(rtTa)，四环素阻遏物(TetR)，VgEcR合成受体，或包含来自酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域、来自人孕酮受体的截短配体结合结构域和来自人NF-kB的激活结构域的杂合转录调节蛋白，优选地该转录调节蛋白是rtTA。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞，其中该诱导型启动子包括Tet反应元件(TRE)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞，其中该诱导型启动子是tetON启动子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞，其中所述第一和另外的基因组安全港位点选自hROSA26基因座、AAVS1基因座、CLYBL基因或CCR5基因中的任两个，优选地，其中该遗传安全港位点是hROSA26基因座和AAVS1基因座。
13.一种用于产生脂肪细胞，优选地白色脂肪细胞的方法，该方法包括：
a)在增殖培养基中培养根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞：随后
b)通过添加根据权利要求8所述的外源物质诱导脂肪细胞分化，优选地该增殖和/或分化培养基不包含胰岛素和/或地塞米松。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该分化期为至多10天、至多9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所产生的脂肪细胞用于人类和非人类膳食食用。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的多能干细胞的用途或根据权利要求13-15中任一项所述的用于产生脂肪细胞的方法的用途，该用途用于组织工程，任选地用于产生培养肉。
17.一种食品，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的多能干细胞或通过根据权利要求13-15中任一项所述的方法获得的脂肪细胞。
18.根据权利要求17所述的食品，其中该食品是培养肉。
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