CN120442620A - 用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂及降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测体系背景的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂及降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测体系背景的方法，该寡核苷酸阻断剂包括至少一对寡核苷酸序列，每条寡核苷酸序列均包括核心阻断序列以及分别处于该核心阻断序列5’端和3’端的支撑序列，仅该核心阻断序列与探针中的延伸位点部分或完全互补。其中，核心阻断序列能占据无靶标的游离抗体‑探针偶联物的延伸位点，使无靶标的游离抗体‑探针偶联物不能相互结合延伸，从而降低PEA超灵敏蛋白检测背景；而支撑序列不仅能防止核心阻断序列自身形成二级结构，而且能防止空间扭曲或刚性拉力导致的核酸配对效率下降，稳定寡核苷酸阻断剂的阻断效果。

Description

用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂及降低基于邻位反应的 超灵敏蛋白检测体系背景的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂及降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测体系背景的方法。

背景技术

蛋白检测技术在生物医学研究和临床诊断中具有重要意义，尤其在重大疾病的早期筛查、病程监控和疗效评估中，检测灵敏度直接决定了其应用深度和精准性。传统检测技术如ELISA（酶联免疫吸附实验）、化学发光等，虽具备一定的定量能力，但检测下限通常在pM级别，无法满足对血浆中fg/mL甚至ag/mL水平的低丰度蛋白标志物进行准确检测的需求。随着精准医疗和早期干预的不断推进，发展具备更高灵敏度、更小样本需求和更快响应能力的蛋白检测手段，已成为临床与科研的共同诉求。

近年来兴起的超灵敏检测技术，例如Quanterix公司的单分子免疫方法（Simoa），其检测下限能达到fM甚至aM级别，检测灵敏度比传统技术高100~1000倍，能够对血浆中超低丰度的蛋白标志物进行检测分析。然而，基于Simoa技术平台的方法涉及多步的清洗过程、需要配套精密的芯片以及昂贵的仪器设备，造成其检测成本居高不下，难以适用于大规模的临床诊断中。

除了Simoa技术平台外，近年来发展迅速的基于邻近反应的蛋白检测技术，如邻位连接反应（Proximity Ligation Assay，PLA）与邻位延伸反应（ProximityExtensionAssay，PEA），同样可实现超灵敏的血浆蛋白检测，具备免清洗、兼容qPCR等优势，适合快速检测与自动化平台集成。PLA和PEA皆为均相体系，依赖双抗体识别靶标后触发核酸信号扩增，但其酶促反应机制存在本质差异。PLA依赖DNA连接酶实现核酸连接，反应效率在血浆等复杂样本中常受到干扰物质抑制。PEA则以DNA聚合酶替代连接酶，提升反应效率，广泛适用于血浆等液相环境。然而，在PLA和PEA中均存在游离探针非特异性结合导致的背景噪音问题。

为降低邻位反应体系背景信号，目前存在两种策略，一是采用固相PLA清洗的方式降低背景，二是采用封闭样品中非特异性蛋白的方式降低背景。如专利CN117431300A提出了一种通过阻断探针与捕获探针间杂交位点并辅以清洗操作以提升检测灵敏度的方法。但该方法引入多次清洗，破坏了PLA免清洗、快速检测的本质优势。专利CN103154266B公开了一种蛋白-核酸偶联封闭剂，通过与样品中非靶标蛋白结合阻止假阳性信号扩增。这些策略虽在一定程度上缓解了背景噪声问题，但前者依赖固相体系与物理清洗，后者缺乏位点特异性，均不适用于游离抗体-探针偶联物间非特异延伸引起的背景控制。

发明内容

为解决邻位延伸反应（PEA）体系中游离抗体-探针偶联物之间非特异性延伸所导致的背景噪声问题，本发明提供了一种基于短链寡核苷酸设计的阻断剂，该阻断剂能特异性占据一对探针延伸位点，在不依赖洗涤的液相体系中实现有效背景控制。

实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂，包括至少一对寡核苷酸序列，每条寡核苷酸序列均包括核心阻断序列以及分别处于该核心阻断序列5’端和3’端的支撑序列，仅该核心阻断序列与探针中的延伸位点部分或完全互补。

本发明通过分析邻位延伸法使用的抗体-探针偶联物中延伸位点的核酸序列，设计出了具有普适性的寡核苷酸单链形式的寡核苷酸阻断剂结构。该寡核苷酸阻断剂的单链具有与探针部分或完全互补的核心阻断序列和与探针完全不互补的支撑序列；其中，核心阻断序列能够占据无靶标的游离抗体-探针偶联物的延伸位点，使无靶标的游离抗体-探针偶联物不能相互结合延伸，从而降低PEA体系的背景（而捕获到靶标的一对抗体-探针偶联物之间的亲和力强于寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物之间的亲和力，因此寡核苷酸阻断剂会被竞争性置换出去，使延伸位点暴露）；支撑序列可有效防止核心区域形成二级结构，并缓解空间构象应力带来的配对效率下降，从而增强阻断剂的结构稳定性与功能持续性。

本发明的寡核苷酸阻断剂中，核心阻断序列是依据所采用的探针的核苷酸序列来设计的，而探针的核苷酸序列在PEA体系中是通用的，不因目标分析物的不同而改变。因此可以认为，本发明对核心阻断序列的具体核苷酸序列是没有任何限制的，只需按本发明所限定的条件、在所选取的探针序列的基础上设计即可。

作为优选，在上述的寡核苷酸阻断剂中，所述的核心阻断序列的核苷酸数量小于等于10个。

在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列的长度可以相同也可以不同，优选将长度控制在10个核苷酸以下；试验发现，当核心阻断序列的长度过大时，不仅阻断效果呈下降趋势，而且合成成本增加。

作为优选，在上述的寡核苷酸阻断剂中，所述的核心阻断序列与探针的延伸位点之间至少具有4个连续互补碱基；即核心阻断序列与探针的延伸位点之间具有4-10个连续互补碱基。

不过，在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列可以独立地与探针的延伸位点部分或完全互补，本发明对此无特殊要求。在较为优选的情况下，使至少一条寡核苷酸序列的核心阻断序列与探针中的延伸位点完全互补会获得更好的阻断效果。

作为优选，在上述的寡核苷酸阻断剂中，在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列之间至少具有4个连续互补碱基，且两条核心阻断序列之间的连续互补碱基数量少于核心阻断序列与探针的延伸位点之间连续互补碱基数量；更优选地，两条核心阻断序列之间具有4-6个连续互补碱基。

核心阻断序列之间的互补碱基数量通常少于核心阻断序列与探针之间的互补碱基数量，一方面这能降低寡核苷酸阻断剂之间互补的可能性，另一方面确保核心阻断序列优先与探针的延伸位点结合。

作为优选，在上述的寡核苷酸阻断剂中，所述的支撑序列至少具有3-6个连续的碱基T。

本发明还提供了一种降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测体系背景的方法，该方法包括：

（1）将上述寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物、待分析样品共同孵育；

（2）加入延伸溶液，混匀后进行延伸反应；

（3）继续加入qPCR体系，混匀后进行qPCR反应，并对qPCR检测结果进行分析。

可以看出，本发明的寡核苷酸阻断剂使用起来十分简便，能够在不依赖特定酶或额外清洗步骤的情况下，有效降低邻位延伸法分析体系的背景信号，从而提高检测的灵敏度和特异性，为高通量、超灵敏蛋白检测提供了新的解决方案，适用于对广泛的样本进行分析。

作为优选，在上述方法的步骤（1）中，寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物的浓度比为（100-2000）: 1；该抗体-探针偶联物的工作浓度为100-500pM；

步骤（1）中，在37℃下孵育10-20 min。

在上述方法的步骤（1）中，抗体-探针偶联物可以采用现有或未知的任意方法制备，本发明对此无任何要求，作为具体实施方式的举例，可以采用如下方法制备：

（a）采用TCO-PEG4-NHS试剂活化抗体，获得活化抗体；

（b）采用Tz-PEG4-NHS试剂活化氨基修饰的探针，获得活化探针；

（c）将活化抗体和活化探针偶联，即获得该抗体-探针偶联物。作为优选，在上述应用的步骤（2）中，延伸溶液的组成为：4 μL 10 × 缓冲液，4 μL 100 μM等摩尔混合的四种脱氧核苷酸三磷酸，2 μL 8000U/mL Bst延伸酶，26μL去离子水；

延伸反应流程为：37℃延伸20 min，80℃灭活20 min；

步骤（3）中，qPCR体系的组成为：qPCR检测引物各0.4μL，0.2 μL 6-羧基荧光素，10μL 含荧光染料与聚合酶的商业qPCR混合体系，5μL去离子水。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

（1）本发明通过分析邻位延伸法中使用的抗体-探针偶联物中延伸位点的核酸序列，设计出了具有普适性的寡核苷酸单链形式的新型寡核苷酸阻断剂，该寡核苷酸阻断剂的单链具有与探针部分或完全互补的核心阻断序列和与探针完全不互补的支撑序列，其中，核心阻断序列能够占据无靶标的游离抗体-探针偶联物的延伸位点，使无靶标的游离抗体-探针偶联物不能相互结合延伸，从而降低PEA体系的非特异性背景（捕获到靶标的一对抗体-探针偶联物之间的亲和力强于寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物之间的亲和力，因此寡核苷酸阻断剂会被竞争性置换出去，使延伸位点暴露）；而支撑序列不仅能够防止核心阻断序列自身形成二级结构，而且能够防止空间扭曲或刚性拉力导致的核酸配对效率下降，稳定寡核苷酸阻断剂的阻断效果。

（2）本发明的寡核苷酸阻断剂使用起来十分简便，能够在不依赖特定酶或额外清洗步骤的情况下，有效降低邻位延伸法分析体系的背景信号，从而提高检测的灵敏度和特异性，为高通量、超灵敏蛋白检测提供了新的解决方案，适用于对广泛的样本进行分析。

（3）当将本发明的寡核苷酸阻断剂用于邻位延伸法检测蛋白时，目标蛋白的信号可增强2.5倍以上。

附图说明

图1为本发明寡核苷酸阻断剂的工作原理示意图；

其中，Cycles表示循环数，Fluorescence表示荧光信号，Negative表示阴性，Threshold表示临界值，Positive表示阳性；

图2为不同浓度的本发明寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析IL-6时的阻断效果；

其中，Concentration表示IL-6浓度，下同；

图3为具有不同核苷酸序列的本发明寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析IL-6时的阻断效果；

图4为在不同的抗体-探针偶联物浓度下本发明寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析IL-6时的阻断效果；

图5为本发明寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析PSA时的阻断效果；

图6为本发明寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析IL-17时的阻断效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1-7寡核苷酸阻断剂的设计

本发明的实施例中提出了一种寡核苷酸阻断剂，包括至少一对寡核苷酸序列，每条寡核苷酸序列均由核心阻断序列以及分别处于该核心阻断序列5’端和3’端的支撑序列组成，其中，仅该核心阻断序列与探针的延伸位点部分或完全互补，而支撑序列与探针的延伸位点完全不互补。

其中，核心阻断序列的核苷酸数量小于等于10个，且各核心阻断序列与探针中的延伸位点之间均至少具有4个连续互补碱基。

而在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列之间具有4-6个连续互补碱基。

支撑序列则由3-6个连续的碱基T组成。

为了对该寡核苷酸阻断剂的具体性能进行介绍，本发明的实施例在遵循上述原则的前提下，在如下探针的基础上设计了几对寡核苷酸阻断剂：

探针-1：5’-GTGAGGCCAGCGTCTTTTATATTAGGCCCTGGTATAGCAGACTGAAA-3’（SEQ IDNo.1）；

探针-2：5‘-CGCAATGTCGCACATGATTCTCTGACGAACCGCTTTGCCTGATTTCAGTCT-3’（SEQID No.2）。

各对寡核苷酸阻断剂的核苷酸序列见表1。

表1 各对寡核苷酸阻断剂的核苷酸序列

	F（5’→ 3’）	R（5’→ 3’）
			寡核苷酸阻断剂1	TTTACACAGTACTTT（SEQ ID No.3）	TTT AGACTGAAA TTT（SEQ ID No.4）
寡核苷酸阻断剂2	TTTAAACAGTCT TTT（SEQ ID No.5）	TTTTT AGACTGAAATTTTT（SEQ ID No.6）
			寡核苷酸阻断剂3	TTTAATCAGTCT TTT（SEQ ID No.7）	TTTTT AGACTGAAAT TTTTT（SEQ ID No.8）
寡核苷酸阻断剂4	TTT TTTCAGTCT TTT（SEQ ID No.9）	TTTTTT AGACTGAAAT TTTTT（SEQ ID No.10）
			寡核苷酸阻断剂5	TTT TTTCAGTCTGTTT（SEQ ID No.11）	TTT AGACTGAAA TTT（SEQ ID No.12）
寡核苷酸阻断剂6	TTT TTTCAGTCTGCTTTT（SEQ ID No.13）	TTT AGACTGAAA TTT（SEQ ID No.14）
			寡核苷酸阻断剂7	TTT TTTCAGTCTGCTATTTT（SEQ ID No.15）	TTT AGACTGAAA TTT（EQ ID No.16）

注：下划线加粗标识的是核心阻断序列，斜体部分为与探针延伸位点互补的碱基。

本实施例的寡核苷酸阻断剂的工作原理如图1所示。可以看出，寡核苷酸阻断剂的核心阻断序列首先与抗体-探针偶联物上的探针延伸位点结合，当加入待分析样品后，抗体-探针偶联物的抗体部分与靶标结合，此时，捕获到靶标的一对抗体-探针偶联物之间的亲和力强于寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物之间的亲和力，因此寡核苷酸阻断剂会被竞争性置换出去，使延伸位点暴露，二者结合后延伸即产生信号；而未捕获靶标的游离抗体-探针偶联物的延伸位点仍被寡核苷酸阻断剂占据，这就使无靶标的游离抗体-探针偶联物不能相互结合延伸，从而降低PEA体系的背景噪声。

实施例8-11寡核苷酸阻断剂1用于分析IL_6时的阻断效果

本实施例一种降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测背景的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将寡核苷酸阻断剂1与抗体-探针偶联物、待分析样品共同孵育；

其中，抗体-探针偶联物可以采用如下方法制备：

（a）采用TCO-PEG4-NHS试剂活化抗体，获得活化抗体；

具体地，先将符合目标抗体质量要求的脱盐柱离心去除储存缓冲液，然后使用0.1M NaHCO₃+ PBS离心置换3次，在置换后的滤柱中加入10 µg抗体（OriGeneD624，D623）后离心，在滤液中加入中1/10抗体物质的量的偶联剂TCO-PEG4-NHS，于室温避光反应25 min，获得反应液A；

而后，将符合抗体质量要求的脱盐柱离心去除储存缓冲液，然后使用PBS缓冲液离心置换三次；用该脱盐柱对反应液A进行脱盐处理，以除去多余的TCO-PEG4-NHS，获得活化抗体；

（b）采用Tz-PEG4-NHS试剂活化氨基修饰的探针，获得活化探针；

具体地，先将符合探针质量要求的脱盐柱离心去除储存缓冲液，然后使用硼酸盐缓冲液（0.1mol/L PH=8.5）离心置换三次；取10 μL NH₂修饰的DNA于滤柱，离心后加入1/20物质的量的Tz-PEG4-NHS，室温避光反应25 min，获得反应液B；

而后，将符合探针质量要求脱盐柱离心去除储存缓冲液，然后使用PBS缓冲液离心置换三次；用该脱盐柱对反应液B进行脱盐处理以除去多余Tz-PEG4-NHS，获得活化探针；

（c）将活化抗体和活化探针偶联，即获得该抗体-探针偶联物；

具体地，将脱盐后的活化抗体和活化探针按1:1的比例混合均匀，室温避光反应45min，即获得抗体-探针偶联物；

本实步骤中，用PEA Buffer将抗体-探针偶联物稀释至浓度为500pM备用；而后将寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物分别以100：1、300:1、500:1、800:1、1000:1、1500：1、2000：1的比例混匀后，加入待分析样品（IL-6浓度为：1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0pg/mL），在37℃下孵育15 min；

（2）加入延伸溶液，混匀后进行延伸反应；

本实施例中延伸溶液的组成为：4 μL 10 × 缓冲buffer，4 μL A/T/C/GTP，2 μL8000U/mL Bst延伸酶，26μL去离子水；

待将延伸溶液与孵育液混匀后，放入PCR仪器中进行延伸反应，延伸反应流程为：37℃延伸20 min，80℃灭活20 min；

（3）继续加入qPCR体系，混匀后进行qPCR反应，并对qPCR检测结果进行分析；

本实施例中，qPCR体系的组成为：qPCR检测引物各0.4μL，0.2 μL FAM，10 μL MixBuffer，5μL去离子水；

其中，qPCR检测引物包括：

上游引物：GTGAGGCCAGCGTCTTTTATATTA（SEQ ID No.17）；

下游引物：CAATGTCGCACATGATTCT（SEQ ID No.18）；

qPCR反应程序见表2：

表2 qPCR反应程序

qPCR反应结束后，比较不同情况下的CT值，以评估寡核苷酸阻断剂对PEA非特异性背景信号的抑制作用，结果见表和图2。

表3 不同浓度的寡核苷酸阻断剂1在邻位延伸法分析IL-6中的阻断效果

注：倍数是指寡核苷酸阻断剂相对于抗体-探针偶联物的浓度倍数，ΔCT表示1000pg/mL浓度与空白背景0 pg/mL的定量检测循环差值，代表了检测的信号强度。

从表3和图2的结果可以看出，不加寡核苷酸阻断剂时的ΔCT值为8.51，而当加入100倍、300倍、600倍、800倍、1000倍、1500倍和2000倍寡核苷酸阻断剂时，ΔCT分别为9.64、9.97、10.15、9.86、10.29、9.78、9.58；即由于寡核苷酸阻断剂的阻断作用，超灵敏蛋白检测的背景CT降低，使得目标分析物IL-6的信号分别增强了2.19倍、2.75倍、3.11倍、2.55倍、3.43倍、2.41倍、2.10倍。

并且，从表2和图2的结果还可以看出，适当的寡核苷酸阻断剂倍数有利于进一步提高阻断效率，在300-1000倍下，目标分析物的信号增强更为显著。

实施例12-17不同寡核苷酸阻断剂用于分析IL-6时的阻断效果

本实施例一种基于邻位延伸法的蛋白检测方法，该方法与实施例5基本相同，不同之处在于：采用的寡核苷酸阻断剂依次为：寡核苷酸阻断剂2、寡核苷酸阻断剂3、寡核苷酸阻断剂4、寡核苷酸阻断剂5、寡核苷酸阻断剂6、寡核苷酸阻断剂7。

同时再次设置寡核苷酸阻断剂1和无寡核苷酸阻断剂的情形作为对比。

各寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物的浓度比均为1000:1。

各寡核苷酸阻断剂的阻断效果见表4和图3。

表4 不同寡核苷酸阻断剂在邻位延伸法分析IL-6中的阻断效果

从表4和图3中可以看出，不加寡核苷酸阻断剂时的ΔCT值为8.77，而在分别加入寡核苷酸阻断剂1、寡核苷酸阻断剂2、寡核苷酸阻断剂3和寡核苷酸阻断剂4时的ΔCT值为10.08、10.19、10.22、10.25，由于寡核苷酸阻断剂的阻断作用，超灵敏蛋白检测的背景CT降低，使得目标分析物IL-6的信号分别增强了4.60倍、4.96倍、5.06倍、5.17倍。

不过，当加入寡核苷酸阻断剂5、寡核苷酸阻断剂6、寡核苷酸阻断剂7时，ΔCT值依次为9.83、9.20、9.04，目标分析物IL-6的信号分别增强2.08倍、1.34倍、1.21倍。

实施例18-20寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物的不同比例对阻断效果的影响

本实施例一种基于邻位延伸法的蛋白检测方法，该方法与实施例5基本相同，不同之处在于：抗体-探针偶联物的浓度依次为100pM、200 pM、400pM；寡核苷酸阻断剂1与抗体-探针偶联物的比例为1000:1。

同时再次设置抗体-探针偶联物的浓度为500 pM的情形作为对比。

阻断结果如表5和图4所示。

表5 探针浓度对阻断效果的影响

从表5和图4可以看出，在不同的抗体-探针偶联物浓度下，IL-6的信号强度差异在1.09-1.93倍，其中当抗体-探针偶联物的浓度为100pM时，阻断效果最佳。

实施例21寡核苷酸阻断剂1用于分析PSA时的阻断效果

本实施例一种基于邻位延伸法的蛋白检测方法，该方法与实施例5基本相同，不同之处在于：目标分析物为PSA，抗体-探针偶联物的浓度为200pM，寡核苷酸阻断剂1与抗体-探针偶联物的浓度比为1000:1。

分析结果见表6和图5。

表6 寡核苷酸阻断剂1在邻位延伸法分析PSA中的阻断效果

从表6和图5中可以看出，与不加寡核苷酸阻断剂相比，加入寡核苷酸阻断剂1后，PSA的信号增强了2.08倍。

实施例22寡核苷酸阻断剂1用于分析IL_17时的阻断效果

本实施例一种基于邻位延伸法的蛋白检测方法，该方法与实施例5基本相同，不同之处在于：目标分析物为IL-17，抗体-探针偶联物的浓度为100pM，寡核苷酸阻断剂1与抗体-探针偶联物的浓度比为1000:1。

分析结果见表7和图6。

表7 寡核苷酸阻断剂1在邻位延伸法分析IL-17中的阻断效果

从表7和图6中可以看出，与不加寡核苷酸阻断剂相比，加入寡核苷酸阻断剂1后，IL-17的信号增强了2.68倍。

Claims (10)

1.用于蛋白检测体系的寡核苷酸阻断剂，包括至少一对寡核苷酸序列，其特征在于，每条寡核苷酸序列均包括核心阻断序列以及分别处于该核心阻断序列5’端和3’端的支撑序列，仅该核心阻断序列与探针的延伸位点部分或完全互补。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，所述的核心阻断序列的核苷酸数量小于等于10个。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，所述的核心阻断序列与探针的延伸位点之间至少具有4个连续互补碱基。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，在同属一对的两条寡核苷酸序列中，至少一条寡核苷酸序列的核心阻断序列与抗体-探针偶联物核酸部分的延伸位点完全互补。

5.如权利要求1所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列之间至少具有4个连续互补碱基，且两条核心阻断序列之间的连续互补碱基数量少于核心阻断序列与抗体-探针偶联物核酸部分的延伸位点之间连续互补碱基数量。

6.如权利要求5所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，在同属一对的两条寡核苷酸序列中，两条核心阻断序列之间具有4-6个连续互补碱基。

7.如权利要求1所述的寡核苷酸阻断剂，其特征在于，所述的支撑序列至少具有3-6个连续的碱基T。

8.一种降低基于邻位反应的超灵敏蛋白检测体系背景的方法，其特征在于，包括：

（1）将如权利要求1-7中任意一项所述的寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物、待分析样品共同孵育；

（2）加入延伸溶液，混匀后进行延伸反应；

（3）继续加入qPCR体系，混匀后进行qPCR反应，并对qPCR检测结果进行分析。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，寡核苷酸阻断剂与抗体-探针偶联物的浓度比为（100-2000）: 1；该抗体-探针偶联物的工作浓度为100-500pM；

步骤（1）中，在37℃下孵育10-20 min。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，延伸溶液的组成为：4 μL 10 ×缓冲液，4 μL 100 μM等摩尔混合的四种脱氧核苷酸三磷酸，2 μL 8000U/mL Bst延伸酶，26μL去离子水；

延伸反应流程为：37℃延伸20 min，80℃灭活20 min；

步骤（3）中，qPCR体系的组成为：qPCR检测引物各0.4μL，0.2 μL 6-羧基荧光素，10 μL含荧光染料与聚合酶的商业qPCR混合体系，5μL去离子水。