CN120569488A - 人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能够迅速且低成本地实施由人体细胞分泌的人胰岛素的定量的方法。其为一种人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法，其特征在于，对将表达融合C‑肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞进行培养，并测定所分泌的融合C‑肽量，所述融合C‑肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C‑肽链中而成的融合C‑肽。

Description

人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法

技术领域

本发明涉及人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法及其应用。

背景技术

I型糖尿病是一种基本不会自胰腺的生成并分泌胰岛素的细胞(β细胞)获得胰岛素的疾病。日本国内的患者数量约为110万人，海外的患者数量约为110万人，一年内就有7.8万人产生症状，表现出激增的倾向。

现有的治疗方法、即胰岛素注射为对症疗法，但因低血糖导致的昏睡及血糖管理较困难。血糖管理的负担会影响患者家庭的QOL(Quality of Life，生活质量)。并且，脑死亡捐献者稀少、可接受胰岛移植的患者有限，仅适应于成人。

从上述几点出发，期望人β细胞的再生移植治疗，利用iPS细胞的再生医疗受到关注，但存在增加肿瘤风险等问题，尚未到达临床阶段。另一方面，本申请的发明人报告了一种通过直接重编程由体细胞分化诱导为β细胞的技术(专利文献1~3)，但尤其是人体细胞的分化诱导效率尚不充分。

此外，即便在利用通过直接重编程获得的β细胞的情况下，促进胰岛素分泌能力的成分的开发也是重要的。对于胰岛素分泌能力促进成分的筛选而言，需要开发其筛选体系。作为其方法，报告了一种使用人胰岛细胞，检测胰岛细胞的增殖标记物、增殖信号的技术(非专利文献1、2)。此外，还报告了一种将大鼠β细胞的复制调节活性作为指标的筛选体系(非专利文献3)。进一步还报告了一种将胰岛素原分子的C-肽部分替换为荧光素酶，并利用大鼠、小鼠的细胞检测出胰岛素分泌能力的技术(专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/002937号说明书

专利文献2：国际公开第2017/073740号说明书

专利文献3：国际公开第2021/095811号说明书

专利文献4：美国专利申请公开第2020017485号

非专利文献

非专利文献1：J Biomol Screen. 2012 Apr; 17(4): 509-518

非专利文献2：Am J Physiol Endocrinol Metab. 2016 Nov 1; 311(5): 859-E868

非专利文献3：Endocrinology. 2018 Sep; 159(9): 3143-3157

发明内容

（一）要解决的技术问题

然而，对于非专利文献1及2记载的方法，较难获得所使用的人胰岛细胞，其检测仅对增殖带来影响的分子，无法筛选对包含胰岛素分泌能力的所有β细胞功能具有作用的成分。此外，对于非专利文献3记载的方法，其检测大鼠β细胞的复制活性，无法筛选对包含胰岛素分泌能力的所有β细胞功能具有作用的成分。此外，对于专利文献1记载的方法，在小鼠胰岛素的C-肽上融合有荧光素酶的长结构，无法正确反映出对应于人的胰岛素的反应。进一步，由于荧光素酶分子较大，可能会使分泌能力部分受损，难以反应出完全的胰岛素分泌。

因此，本发明提供一种能够迅速且低成本地实施由人体细胞分泌的人胰岛素的定量的方法。

（二）技术方案

对此，本申请的发明人发现通过使用表达融合C-肽的基因，能够迅速且低成本地对人体细胞的胰岛素分泌能力进行定量，进而完成了本发明，其中，所述融合C-肽为针对胰岛素原分子内的C-肽部分，识别不阻碍胰岛素的表达/分泌的位置，并将能够以高灵敏度检测出的短链肽插入该位置而成的融合C-肽。

即，本发明提供以下的发明[1]~[17]。

[1] 一种人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法，其特征在于，对将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞进行培养，并测定所分泌的融合C-肽量，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

[2] 根据[1]所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽的插入位置为相当于C-肽链的7V的C末侧的位置。

[3] 根据[1]或[2]所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自能够通过化学发光分析检测出的标签肽及能够通过免疫分析检测出的标签肽中的标签肽。

[4] 根据[1]~[3]中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自能够与荧光素酶结合的标签肽、含DDDDK的标签肽及来自血凝素的标签肽中的标签肽。

[5] 根据[1]~[4]中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为能够与荧光素酶结合的标签肽。

[6] 根据[1]~[5]中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO:1)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)及YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)中的标签肽。

[7] 根据[1]~[6]中任一项所述的定量方法，其中，所述人培养细胞株为：(1)人培养细胞株；(2)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因导入人体细胞而成的细胞；或(3)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因、及KLF9、KLF11或KLF12的基因、以及UCN3基因同时导入人体细胞而成的细胞。

[8] 一种重组细胞，其为将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

[9] 根据[8]所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽的插入位置为相当于C-肽链的7V的C末侧的位置。

[10] 根据[8]或[9]所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自能够通过化学发光分析检测出的标签肽及能够通过免疫分析检测出的标签肽中的标签肽。

[11] 根据[8]~[10]中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自能够与荧光素酶结合的标签肽、含DDDDK的标签肽及来自血凝素的标签肽中的标签肽。

[12] 根据[8]~[11]中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为能够与荧光素酶结合的标签肽。

[13] 根据[8]~[12]中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO:1)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)及YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)中的标签肽。

[14] 根据[8]~[13]中任一项所述的重组细胞，其中，所述人培养细胞株为：(1)人培养细胞株；(2)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因导入人体细胞而成的细胞；或(3)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因、及KLF9、KLF11或KLF12的基因、以及UCN3基因同时导入人体细胞而成的细胞。

[15] 一种促进人胰岛素的生成及分泌的物质的筛选方法，其特征在于，在受试物的存在下，培养[8]~[14]中任一项所述的重组细胞，并测定所分泌的融合C-肽量。

[16] 一种人胰岛素生成及分泌促进剂，其含有通过[15]所述的筛选方法获得的物质。

[17] 一种胰岛素生成及分泌促进剂，其含有选自丙戊酸及泽布拉林(Zebularine)中的1种或2种。

（三）有益效果

根据本发明，能够迅速且低成本地实施由人体细胞分泌的人胰岛素的定量。因此，能够迅速且低成本地筛选对包含胰岛素分泌能力的所有β细胞功能具有作用的成分。

附图说明

图1示出将具有各5种构造的小鼠胰岛素1-HiBiT及胰岛素2-HiBiT融合蛋白质表达质粒导入小鼠胰岛β细胞株MIN6后且培养3天后的细胞内的胰岛素蛋白质生成量的表达上升效果的比较结果。纵轴用以荧光素酶活性为指标所测定的化学发光量示出了细胞溶解液中所含的胰岛素-HiBiT融合蛋白质量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图2用以荧光素酶活性为指标所测定的化学发光量示出了将具有各5种的构造的小鼠胰岛素1-HiBiT及胰岛素2-HiBiT融合蛋白质表达质粒导入小鼠胰岛β细胞株MIN6后且培养3天后的分泌至细胞外的胰岛素-HiBiT融合蛋白质量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图3示出了通过基因组编辑法将编码人胰岛素-HiBiT融合蛋白质的基因编入来自人脂肪的培养细胞株SW872的胰岛素基因组中，并将耐药性作为指标实施单细胞分离并进行扩增培养后，通过基因组PCR(genomic PCR)及琼脂糖电泳确认基因组编辑是发生在单等位基因与双等位基因中的哪一处时所获得的结果。

图4示出了将具有不同的3种的构造的人胰岛素-HiBiT融合蛋白质的编码基因分别编入来自人脂肪的培养细胞株SW872的基因组并进行培养，使4种转录因子(O：Ngn3，K：Glis1，A：MafA，P：Pdx1)共表达并对成为β细胞的直接重编程进行诱导所获得的结果；及由该细胞生成/分泌的胰岛素蛋白质量的比较结果。纵轴用以荧光素酶活性为指标所测定的化学发光量示出了细胞培养液中所含有的HiBiT蛋白质量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图5示出了在维持向细胞外分泌能力的人胰岛素-HiBiT融合基因仅于单等位基因编入基因组的来自人脂肪的培养细胞株SW872内，使3种转录因子(O：Ngn3，A：MafA，P：Pdx1)共表达并进行培养后，在诱导/非诱导条件下对促进成为β细胞的直接重编程的基因K因子进行连续培养时的来自细胞的人胰岛素-HiBiT融合蛋白质生成量的比较结果。图表(a)的纵轴表示利用酶联免疫吸附试验法测定的人胰岛素蛋白质量，(b)的纵轴表示基于HiBiT的荧光素酶活性。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图6示出了分别导入有仅质粒、人胰岛素表达质粒、人胰岛素-HA表达质粒、人胰岛素-FLAG表达质粒的人SW872细胞的培养上清中的蛋白质的基于ELISA的检测。HA抗体、FLAG抗体的结果也均示出了培养上清中生成并分泌有人胰岛素-HA及人胰岛素-FLAG。

图7A示出了在维持向细胞外分泌能力的人胰岛素-HiBiT融合基因编入基因组的来自人脂肪的培养细胞株SW872内，使3种转录因子(Ngn3，MafA，Pdx1)共表达并进行培养，通过转染导入编码各种基因的表达质粒，对来自细胞的人胰岛素-HiBiT融合蛋白质生成量进行比较，由此探索对成为β细胞的直接重编程进行促进的基因时所获得的结果。纵轴用以荧光素酶活性为指标所测定的化学发光量示出细胞培养液中所含有的HiBiT融合蛋白质量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。(1)示出了编码人KLF9的基因的导入使人胰岛素-HiBiT融合蛋白质生成量增大的情况。

图7B的(2)示出了同时导入编码人KLF9与人UCN3的基因时，人胰岛素-HiBiT融合蛋白质生成量进一步增大的情况。

图7C的(3)在来自人脂肪的培养细胞株Huh7内使3种转录因子(Ngn3，MafA，Pdx1)共表达并进行培养，对胰岛素或编码KLF9与UCN3基因的表达质粒转染，对来自细胞的人胰岛素生成量进行比较。纵轴表示细胞中所含有的胰岛素含量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图7D的(4)示出了在Huh7内使4种转录因子(Ngn3，Glis1，MafA，Pdx1)共表达并进行培养，将胰岛素或编码KLF9与UCN3基因的表达质粒转染，对来自细胞的人胰岛素生成量进行比较时所获得的结果。

图7E的(5)示出了在SW872内使4种转录因子(Ngn3，Glis1，MafA，Pdx1)共表达并进行培养，并对其同时转染编码KLF9、KLF11或KLF12中的任一种基因与UCN3基因的表达质粒，对来自细胞的人C-肽生成量进行比较时所获得的结果。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

图8示出了在人胰岛素-HiBiT融合基因编入基因组的来自人脂肪的培养细胞株SW872内，使3种转录因子(Ngn3，MafA，Pdx1)共表达并进行培养，并且添加各种化合物，对来自细胞的人胰岛素-HiBiT融合蛋白质生成量进行比较，由此探索对成为β细胞的直接重编程进行促进的低分子化合物时所获得的结果。纵轴用以荧光素酶活性为指标所测定的化学发光量示出细胞溶解液中所含的胰岛素-HiBiT融合蛋白质量。误差线表示重复的3个测试样本的测定值的标准偏差误差。

具体实施方式

本发明的一个方案为一种人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法，其特征在于，对将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞进行培养，并测定所分泌的融合C-肽量，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

此外，本发明的另一个方案为一种重组细胞，其为将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

此外，本发明的另一个方案为一种促进人胰岛素的生成及分泌的物质的筛选方法，其特征在于，在受试物的存在下，培养所述的重组细胞，并测定所分泌的融合C-肽量。

进一步，本发明的另一个方案为一种人胰岛素生成及分泌促进剂，其含有通过所述筛选方法获得的物质。

进一步，本发明的另一个方案为一种胰岛素生成及分泌促进剂，其含有选自丙戊酸及泽布拉林中的1种或2种。

胰岛素的前驱体、即胰岛素原(具有在胰岛素的A链与B链之间结合有C-肽的构造)于β细胞生成，并在分泌之前通过酶发生分解进而分别生成各自1分子的胰岛素(A链与B链通过二硫键而结合)与C-肽。因此，血液中的C-肽量为胰岛素分泌能力的临床检测项目，其检测方法已知有ELISA、RIA及RT-qPCR法。

人中的C-肽为EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQ ID NO: 2)所示的具有31个氨基酸的肽。

对在该C-肽链的何种位置插入能够检测出的标签肽不会阻碍胰岛素的表达/分泌，是完全不清楚的。对此，本申请的发明人首先设计多个将能够检测出的标签肽插入小鼠胰岛素C-肽而成的融合肽，选择不会妨碍小鼠胰岛素的生成的融合肽的构造。其结果，对于小鼠，确认到在2处插入所述标签的融合肽不会阻碍胰岛素的表达/分泌。其中，小鼠中的未阻碍胰岛素的表达/分泌的插入位置相当于人胰岛素C-肽(所述SEQ ID NO: 2)的7V及13G的位置。

接着，设计在人胰岛素C-肽的与在小鼠中为良好的小鼠胰岛素C-肽的2处相同的位置插入能够检测出的标签肽而成的融合肽，对人胰岛素的表达/分泌进行了研究，结果发现，当使用表达在相当于人胰岛素原C-肽链的7V的C末侧的位置插入所述标签肽而成的融合C-肽的基因的情况下，不会阻碍人胰岛素的表达/分泌，能够正确地测定人胰岛素分泌能力。

另外，人胰岛素C-肽无需与所述31氨基酸完全相同，可以在C末侧和/或N末侧具有1~3个氨基酸，或者可缺失内部的1~6氨基酸。例如，可以是：RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR(SEQ ID NO: 3)、RREAEDLQVGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR(SEQ ID NO: 4)、EAEDLQVGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQ ID NO: 5)、RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQ ID NO: 6)、EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR(SEQ ID NO: 7)。

作为所使用的能够检测出的标签肽，例如，可列举出选自能够通过化学发光分析检测出的标签肽、及能够通过免疫分析检测出的标签肽中的标签肽。其中，作为能够通过化学发光分析检测出的标签肽，可列举出能够与荧光素酶结合的标签肽。此外，作为能够通过免疫分析检测出的标签肽，可列举出选自含DDDDK标签肽(FLAG标签)及来自血凝素的标签肽(HA标签)的肽。

作为进一步优选的能够检测出的标签肽，可列举出选自VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO:1)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO: 51)及YPYDVPDYA(SEQ ID NO: 51)中的标签肽。

其中，从迅速且低成本地测定融合C-肽的角度出发，作为能够检测出的标签肽，更优选能够与荧光素酶结合的标签肽，进一步优选VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO: 1)。

在实施本发明时，首先，构建表达将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽的基因，获得将所得到的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞。在将所述表达融合肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换时，能够采用常规的基因组编辑方法，例如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9。

作为所使用的人培养细胞株，可列举出来自肝脏的细胞株Huh7、来自脂肪的细胞株SW872等。

此外，本发明还能够采用通过直接重编程由体细胞诱导具有优异的胰岛素分泌能力的β细胞的方法。此时，作为所使用的细胞，优选：(1)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因导入人体细胞而成的细胞、或(2)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因、及KLF9、KLF11或KLF12的基因、以及UCN3基因同时导入人体细胞而成的细胞。

只要对所获得的重组细胞进行培养，并测定所分泌的融合C-肽量，就能够对人体细胞中的人胰岛素分泌量进行定量。

对于重组细胞的培养，能够使用适合人培养细胞株的培养基，例如DMEM、RPMI1640、MEM、αMEM、M199等，在常规的条件下，例如温度约为37℃、CO₂浓度为2~5%的条件下进行培养。

在将能够与荧光素酶结合的标签肽用作能够检测出的标签肽时，只要使荧光素酶的片段在所述培养液中进行反应，就能够根据其发光量对所分泌的所述融合肽的量、即人体细胞中的人胰岛素分泌量进行定量。其中，所使用的荧光素酶的片段及发光量的测定能够采用市售的HiBiT系统(Promaga K. K.)。

在将能够通过免疫分析检测出的标签肽用作能够检测出的标签肽时，只要通过免疫分析设想所述培养液中的所分泌的融合C-肽量，就能够对人体细胞中的人胰岛素分泌量进行定量。其中，作为免疫分析，可列举出放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)等，但特别优选ELISA。

只要在受试物的存在下培养所述重组细胞，培养所述的重组细胞，并测定所分泌的融合C-肽量，就能够筛选出促进人胰岛素生成及分泌的物质。

所分泌的C-肽量的测定根据上述中使用的标签肽的种类来实施。

作为更优选的方案，为一种促进人胰岛素的生成及分泌的物质的筛选方法，其在受试物的存在下，培养所述重组细胞，并使荧光素酶的片段发挥作用从而测定人体细胞的胰岛素分泌能力。

其中，作为受试物，可以是常规的化合物，也可以是对所述重组细胞带来影响的基因。在为基因的情况下，可以是预先导入至所述重组细胞中的基因。

只要通过添加受试化合物或基因，胰岛素的生成分泌能力上升，就能够判定该受试化合物或基因为促进人β细胞的胰岛素生成及分泌能力的物质，其能够用作胰岛素生成及分泌促进剂。

通过直接重编程由体细胞诱导具有优异的胰岛素分泌能力的β细胞时，除了专利文献1~3记载的基因以外，表达通过所述筛选获得的胰岛素分泌能力促进基因即可。其中，作为专利文献1~3记载的基因，可列举出Glis1或Glis3(K因子)；Ngn3Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因；或者Glis1或Glis3与Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因的组合；还可列举出将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因与KLF9和UCN3基因同时导入人体细胞的情况。

其中，在使上述基因在体细胞内表达时，按照专利文献1~3中记载的方法实施即可。具体能够通过将于逆转录病毒载体或慢病毒载体分别克隆了所述这3种基因而成的物质同时感染欲评价的培养体细胞，在这些3种基因或5种基因于细胞内进行了共表达的状态下，以1-2周在专利文献1~3中记载的分化诱导培养基中进行培养，由此能够获得具有胰岛素分泌能力的β细胞。或者能够使用mRNA、或编入有oriP-EBNA1的游离型载体、作为单链RNA病毒的仙台病毒载体等，使所述3种基因或5种基因在细胞内共表达。通过上述方法，相较于前述的慢病毒、逆转录病毒，导入基因不会被编入宿主基因组，能够获得更加安全地进行了分化的β细胞。

通过所述筛选方法获得的物质能够用作人胰岛素生成及分泌促进剂。具体而言，通过该筛选方法，发现了丙戊酸及泽布拉林可作为促进人胰岛素的生成及分泌的成分。即，本发明的一个方案为一种含有选自丙戊酸及泽布拉林中的1种或2种的胰岛素生成及分泌促进剂。

丙戊酸作为癫痫、躁狂症、偏头疼等的治疗药物而为人所知，但并不知晓其具备胰岛素分泌促进作用。泽布拉林为DNA甲基化抑制剂，但并不知晓其具有胰岛素分泌促进作用。

实施例

接着，例举实施例，对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受限于这些实施例。

实施例1

(1)小鼠胰岛素C-肽融合肽的设计

对于小鼠胰岛素蛋白质，于胰岛β细胞的内质网自作为前驱体的前胰岛素原蛋白质首先通过处理(processing)去除末端的信号序列从而成为胰岛素原，由此切取C-肽从而成为胰岛素。C-肽与胰岛素分子以等摩尔同时生成，并被分泌至细胞外，因此，能够通过其定量间接地测定胰岛素分泌能力。其中，将HiBiT标签插入小鼠胰岛素原分子内的优选部位，尝试构建不会损害C-肽的切取反应，且与C-肽一同融合的HiBiT标签被分泌至细胞外从而能够迅速、低成本地对其进行定量的C-肽-HiBiTHiBiT融合肽。

首先，设计将HiBiT标签插入或替换小鼠胰岛素1及小鼠胰岛素2各自的C-肽的5个不同的部位而成的融合蛋白质，调差是否会影响C-肽的切取、分泌。仅单纯插入HiBiT标签时，C-肽融合体的分子量増大，可能会影响其切取及分泌。对此，作为与小鼠前胰岛素原1的C-肽区域的HiBiT融合蛋白质，设计SEQ ID NO: 10、12、14、16、18所示的氨基酸序列。它们分别被设计成向自小鼠前胰岛素原1的N末端起第69个与第70个的氨基酸之间插入HiBiT而成的氨基酸序列、或者向自小鼠前胰岛素原1的N末端起第71~78个、第62~68个、第72~76个、或第64~68个之间的肽替换为HiBiT而成的氨基酸序列，并于表达质粒克隆这些氨基酸序列的编码基因。

将这些与小鼠前胰岛素原1的HiBiT融合肽按照记载顺序称为mIns1-HiBiT1、mIns1-HiBiT2、mIns1-HiBiT3、mIns1-HiBiT4、及mIns1-HiBiT5。将编码mIns1-HiBiT1的表达质粒的序列示于SEQ ID NO: 8。此外，将编码mIns1-HiBiT1的基因的碱基序列示于SEQID NO: 9，并将其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 10。mIns1-HiBiT2~5的表达质粒为将SEQ IDNO: 8所示序列的第1785个~第2141个的核苷酸序列部分分别替换成SEQ ID NO: 11、13、15、17所示的基因序列而成的物质。这些基因均委托VectorBuilder Inc.(东京，日本)合成，并自其购入。

同样地，作为与小鼠前胰岛素原2的C-肽区域的HiBiT融合蛋白质，设计SEQ IDNO: 21、23、25、27、29所示的氨基酸序列。它们分别被设计成在自小鼠前胰岛素原的N末端起第69个与第70个氨基酸之间插入HiBiT而成的氨基酸序列、或者将第72~79个、第62~68个、第72~76个、或第64~68个之间的肽替换为HiBiT而成的氨基酸序列，并于表达质粒克隆这些氨基酸序列的编码基因。将这些与小鼠前胰岛素原2的HiBiT融合肽按照记载顺序称为mIns2-HiBiT1、mIns2-HiBiT2、mIns2-HiBiT3、mIns2-HiBiT4、及mIns2-HiBiT5。将编码mIns2-HiBiT1的表达质粒的序列示于SEQ ID NO: 19。此外，将编码mIns2-HiBiT1的基因的碱基序列示于SEQ ID NO: 20，并将其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 21。mIns2-HiBiT2~5的表达质粒为将SEQ ID NO: 19所示的序列的第1786个~第2148个的核苷酸序列部分分别替换成SEQ ID NO: 22、24、26、28所示的基因序列而成的物质。这些基因均委托VectorBuilder Inc.(东京，日本)合成，并自其购入。

(2)不妨碍小鼠胰岛素生成的构造的选择

对于所述实施例1(1)中设计的小鼠胰岛素C-肽融合肽，为了调查其是否会对细胞内的基因表达、及蛋白质分泌造成影响，将这些肽的表达载体导入小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞(分配自阪大)并调查表达动态。将传代次数为21的MIN6冻存物接种于10cm培养皿，在DMEM培养基(Sigma D5796-500ML)10%FBS、1%抗生素(Sigma青霉素-链霉素(SigmaPenicillin-Streptomycin))中培养2天后，使细胞在0.25w/v%胰蛋白酶-1mmol/l EDTA·4Na溶液(含有酚红)(WAKO 201-16945)中游离并利用血细胞计数版计数细胞数量后，以4000个细胞/孔接种于96孔培养板。次日，以0.1mL/孔替换成上述培养基后，将分别向各0.08μg的合计10种的所述mIns1-HiBiT1~5及mIns2-HiBiT1~5的各表达质粒中加入0.08μg的内部校准用载体pGL3-luc(Promega Corporation)所获得的合计0.16μg的DNA，于接种了所述细胞的96孔板的各孔中利用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.)并按照规程(protocol)对细胞进行转化。继续培养，并在7小时后交换培养基。进一步进行培养并在2天后实施葡萄糖响应试验。

悬浮于各孔的100μL的1.4mM 葡萄糖/KRB缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、1.2mMCaCl₂、1.2mM MgCl₂)中并于37℃培养1小时后，悬浮于100μL的2.8mM葡萄糖/KRB缓冲液中并进行1小时的培养。去除缓冲液并进行收集(Low Glucose sample(低葡萄糖样品))，接着悬浮于0.1mL的16.8mM葡萄糖/KRB缓冲液中并进行1小时的培养。用与上述方相同的方式去除培养基并进行收集(Hi Glucose sample(高葡萄糖样品))，用100μL的冰冷的PBS(-)清洗剩余的细胞后，加入50μL的x1 细胞裂解液(Cell Lysis buffer)(Promega E194A)，通过移液使细胞破碎并进行回收(cell lysate sample(细胞裂解物样品))。使用HiBiT分析试剂盒(Promega Corporation、Nano-GloHiBiTExtracellular Detection System)对各试料中的胰岛素含量进行比较。

其结果，如图1所示，mIns1-HiBiT1~5均未观察到胰岛素-HiBiT融合蛋白质的显著生成。然而，构造与人胰岛素相近的小鼠胰岛素2与HiBiT的融合蛋白质在mIns2-HiBiT2~5中观察到了显著的生成，尤其是mIns2-HiBiT2及mIns2-HiBiT5的融合蛋白质的表达与分泌均显著。特别是mIns2-HiBiTHiBiT5还观察到了葡萄糖响应性的分泌，暗示了其为不妨碍C-肽的固有性质的最优选的构造的融合蛋白质。

(3)人胰岛素C-肽融合肽的设计

所述实施例1(2)的结果暗示了，在与具备与人胰岛素相近的构造的小鼠胰岛素2的HiBiT融合体中，mIns2-HiBiT2及mIns2-HiBiT5为不阻碍胰岛素表达、分泌的构造。对此参考这些构造设计了人胰岛素与HiBiT的融合蛋白质。作为阴性对照，设计与mIns2-HiBiT1相同的hIns-HiBiT1，作为有望的构造体，设计与mIns2-HiBiT2及mIns2-HiBiT5相同的hIns-HiBiT2及hIns-HiBiT5。将它们的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 31、33、35。

(4)向人体细胞株的基因组的导入

委托VectorBuilder Inc.(东京，日本)合成编码所述实施例1(3)所设计的人胰岛素-HiBiT融合蛋白质、即hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5这3种的DNA(示于SEQ IDNO: 30、32、34)，并自其购入。将编码这3种人胰岛素-HiBiT融合蛋白质的基因序列示于SEQID NO: 30、32、34。

通过基因组编辑技术将这些基因编入人体细胞株基因组中的胰岛素基因，制作用于替换的质粒群。

首先，委托VectorBuilder Inc.(东京，日本)合成SEQ ID NO: 36所示的Pre-Donor-arm1-HiBiT-arm2(前供体-arm1-HiBiT-arm2)质粒，并自其购入。将质粒作为模板，使用由SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 38所示的序列构成的引物实施PCR反应，获得单链DNA片段。PCR使用PrimeSTAR^TMMax DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)，并于热循环仪在98℃下放置2分钟后，反复循环25次：98℃且10秒、55℃且10秒、72℃且30秒的连续反应，然后于72℃反应2分钟。与此同时，将pcDNA13.1(-)(Thermo Fisher Scientific Inc.)作为模板，使用SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40所示的引物，用与上述相同的方式进行PCR反应。利用琼脂糖电泳对所获得的2条单链DNA分别进行纯化，并将两者以1:1进行混合后，使用INFUSION连接酶(Infusion ligase)(Takara Bio Inc.)并通过INFUSION连接反应(Infusion ligation反应)制作SEQ ID NO: 41所示的质粒、Pre-Donor-arm1-NeoR-arm2(前供体-arm1-NeoR-arm2)。进一步将该质粒作为模板，并使用SEQ ID NO: 42及43所示的引物，用与上述相同的方式进行PCR反应，获得单链DNA片段。与此同时，将SEQ ID NO: 30、32、34所示的编码hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5的基因作为模板，并使用SEQ IDNO: 44、45所示的引物，进行与上述相同的PCR，分别获得包含编码hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5的基因的单链DNA片段。将它们与通过PCR由质粒Pre-Donor-arm1-NeoR-arm2获得的单链DNA片段进行混合，用与上述相同的方式通过无酶连接 (Infusionligation)构建具有与hIns-HiBiT1、hIns-HiBi2、hIns-HiBi5的编码基因、新霉素抗性基因、胰岛素基因相同的臂序列的基因组编辑的供体载体。将作为其中之一的包含hIns-HiBiT1的供体载体Arm1-hIns-HiBiT1-NeoR-Arm2的序列示于SEQ ID NO: 46。此外，包含hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5的供体载体为：SEQ ID NO: 46的Arm1-hIns-HiBiT1-NeoR-Arm2序列的第60~432个的核苷酸序列替换为SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34所示的hIns-HiBiT2及hIns-HiBiT5的序列而成的供体载体。

为了通过基因组编辑将所述供体载体中的hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5的各序列导入人体细胞各部的基因组，委托VectorBuilder Inc.合成载置有与胰岛素基因相同的向导DNA与hCAS9的SEQ ID NO: 47所示的向导RNA-hCAS9质粒，并自其购入。

将所述Arm1-hIns-HiBiT1~5-NeoR-Arm2供体载体及向导RNA-hCAS9载体在来自人脂肪的细胞株SW872(ATCC HTB-92^TM)及来自人肝脏的细胞株Huh7(分配自阪大)中以1:1的方式使用Lipofectamine 3000对各自的细胞进行转染。Huh7将所述的DMEM用作培养基，SW872将Gibco DMEM/F12(1:1) cat＃11330-032 10%FBS、1%P/S用作培养基。在转染7小时后，交换培养基，并同时添加400μM作为抗性标记物的G418，尝试引发了基因组编辑的细胞的分离。3天后交换一次培养基，在约1周之后利用所述胰蛋白酶EDTA使细胞分裂并实施传代，使用96孔尝试进行细胞的单一化。结果，认为在Huh7、SW872两种细胞中分别对于hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5获得在约2周的期间内由1个细胞发生了增殖的单一的克隆细胞。

(5)重组基因导入的确认

对于所述实施例1(4)中使单细胞增殖所获得的通过基因组编辑获得的重组细胞组，实施基因组PCR来确认：实际上重组基因是否导入至基因组中，或者是在单等位基因、双等位基因中的哪一种进行了基因组编辑。将实施基因组编辑所获得的各单一克隆细胞接种于24孔培养板，在各孔中增殖至100000个细胞以上。使用Monarch基因组DNA提取试剂盒(Monarch Genomic DNA Purification Kit)(New England Bio Labs.，产品编号：T3010)由各细胞中提取基因组DNA，并将其作为模板，利用SEQ ID NO: 48、49所示的引物集(Primer set)、或者SEQ ID NO: 48、50所示的引物集实施PCR，通过琼脂糖凝胶电泳确认发生了扩增的PCR条带，从而确认重组是单等位基因还是双等位基因。在与所述实施例相同的PCR反应条件下实施。将引物与重组基因的构造示于图3。

其结果，如凝胶电泳照片所示，利用SEQ ID NO: 48、49的引物集获得条带的未编辑的等位基因与利用SEQ ID NO: 48、50的引物集获得条带的发生了重组的细胞基本均等，可知不论是纯合、杂合中的哪一种编辑细胞，均得以构建。

(6)人胰岛素-HiBiT融合蛋白质的功能评价

使用所述实施例1(5)中获得的表达人胰岛素-HiBiT融合蛋白质的重组人体细胞，评价hIns-HiBiT1、hIns-HiBiT2、hIns-HiBiT5的各重组蛋白质的功能。使用分别获得的单等位基因的重组SW872细胞，将3种重组细胞接种于24孔培养皿并使其增殖。在培养3天使其基本呈汇合状态后，将培养基替换成分化为β细胞的分化培养基。分化培养基以最终浓度使得在所述的DMAM培养基(Sigma D5796-500ML)10%FBS、1%抗生素(Sigma青霉素-链霉素)中添加有10μM的2-巯基乙醇、10μM的ZnSO₄、10μM的cAMP、10mM的烟酰胺。进一步，为了引发向β细胞的直接重编程，使所述细胞组感染将专利文献1~3记载的基因、即Glis1、Ngn3、Mafa及Pdx1这4种基因搭载在单链RNA病毒、即仙台病毒载体而成的物质，并使4种基因共表达。仙台病毒购自TOKIWA-Bio inc.。

其结果，如图4所示，来自细胞的胰岛素表达得到促进并且实际上能够观察到胰岛素的表达分泌的仅为hIns-HiBiT5重组蛋白质。示出了：与小鼠胰岛素2的融合中观察到优异的生成、分泌的HiBiT2的插入位置对人无效，仅hIns-HiBiT5的融合体为能够用于定量胰岛素的表达、分泌的构造。另外，图中的N.C.为阴性对照，其为使用未使具有hIns-HiBiT5的融合体的重组SW872感染所述仙台病毒的细胞所获得的结果。

实施例2

(筛选)

所述的实施例1(5)中所制造并在(6)中验证了功能的分泌hIns-HiBiT5的融合蛋白质的人重组细胞，在网罗性地探索促进以往胰岛素的定量成本高且需要花费时间而较困难的成为β细胞的分化及功能的基因/化合物、其他方法的方面是有力的工具。其中，验证了本发明所制造的人重组细胞实际上是否能够有效用于促进β细胞功能的新型的基因探索。

使生成所述实施例1(6)中确认了有用性的hIns-HiBiT5的人SW873细胞感染表达Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因的仙台病毒载体，利用β细胞分化培养基进行2天培养。然后，向细胞内追加导入搭载于游离型载体(Fujifilm)的专利文献1~3记载的基因、即Glis1，调查是否观察到β细胞的分化、即胰岛素表达的亢进。其结果，在感染仙台病毒2天后，追加加入游离型载体搭载的Glis1，由此观察到了优异的胰岛素生成促进作用。其中，图5中的(a)使用ELISA(Medallia Inc.)测定胰岛素量，其需要3个小时的反应时间与平均每一个试料为100日元以上的成本。(b)所示的HiBiT融合蛋白质的定量能够以10分钟的反应时间且3-50日元/试料的成本进行测定。

实施例3 基于多种标签的人胰岛素C-肽融合肽的有效性的验证

对于所述实施例2所示的hIns-HiBiT5的构造，示出了当将短的肽标签插入胰岛素分子中的哪个位置时能够有效发挥作用。由于该肽导入位置的有效性不限于使用了HiBiT肽的情况，即便将hIns-HiBiT5的HiBiT肽替换为其他短的肽，也能够测定胰岛素生成、分泌量。具体而言，制作替换成能够通过抗体等轻松地检测出的HA标签(SEQ ID NO: 51)、或者FLAG标签(SEQ ID NO: 52)的构造体，调查它们是否能够在不妨碍胰岛素生成、分泌的情况下检测出。

(1)hIns-HA、及hIns-FLAG表达质粒的制作

使用SEQ ID NO: 53及54所示的引物，将人胰岛DNA(健康供体)cDNA(产品编号HIcDNA133dT、及HIcDNA-171dT 株式会社プライマリーセル)作为模板实施PCR反应，获得单链DNA片段。PCR使用PrimeSTAR^TMMax DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)利用热循环仪于98℃放置2分钟后，重复进行25次98℃且10秒、55℃且10秒、72℃且30秒的连续反应后，于72℃反应2分钟。与此同时，对于表达质粒pEBMulti-Hyg(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation 产品编号050-08121 碱基数11029个碱基对)，通过添加限制性内切酶XhoI(New England Biolabs)并于37℃反应1小时从而将其切断。将所获得的2条单链DNA分别利用琼脂糖电泳进行纯化，并将两者以1:1进行混合后，使用INFUSION连接酶(Takara BioInc.)并通过INFUSION连接反应，制作在pEBMulti-Hyg的多克隆内的XhoI位点克隆有SEQID NO: 55所示的人胰岛素cDNA(互补DNA：由包含被翻译成蛋白质的基因的起始密码子至终止密码子的序列构成的DNA)而成的表达质粒、pEBMulti-hIns。该质粒表达SEQ ID NO:56所示的人胰岛素前驱体。

接着，使用SEQ ID NO: 57及58所示的引物将上述所制作的pEBMulti-hIns作为模板实施PCR反应，获得单链DNA片段。PCR条件与上述相同。通过相同的方式使用SEQ ID NO:61及62所示的引物将所述pEBMulti-hIns作为模板实施PCR反应，获得单链DNA片段。将所获得的2条单链DNA分别利用琼脂糖电泳进行纯化，并使用INFUSION连接酶(Takara BioInc.)通过INFUSION连接反应，制作在pEBMulti-Hyg的多克隆内的XhoI位点克隆有SEQ IDNO: 59所示的hIns-HA、及SEQ ID NO: 63所示的hIns-FLAG而成的表达质粒、pEBMulti-hIns-HA、及pEBMulti-hIns-FLAG。

(2)人胰岛素-HA及FLAG融合蛋白质的功能评价

使接种于24孔培养皿的SW872细胞在与所述实施例相同的分化培养基中感染将Glis1、Ngn3、Mafa及Pdx1这4种基因搭载在单链RNA病毒、即仙台病毒载体上而成的物质(TOKIWA-Bio inc.)，使4基因共表达。4小时后，将培养基替换为前述的成为β细胞的分化培养基。培养24小时后，将所述(1)所获得的表达质粒、pEBMulti-hIns-HA、pEBMulti-hIns-FLAG、及作为阴性对照的pEBMulti-Hyg、pEBMulti-hIns分别使用Lipofectamine 3000进行转染。7小时后交换培养基进行2天的连续培养后，回收100μL的培养上清。通过使用了抗体的ELISA检测这些培养上清中是否包含由细胞表达并分泌的HA或FLAG的各融合蛋白质。首先，作为第一抗体，使用抗HA抗体(HA-Tag Rabbit mAb(细胞信号传导))、抗FLAG抗体(DYKDDDDK Tag Rabbit mAb(细胞信号传导))，并利用碳酸/碳酸氢盐缓冲液(pH9.8)将其分别稀释至100ng/孔，于MaxiSorp96孔板(Nunc Co .,Ltd.制造)固相化。于4℃彻夜反应后，利用TBS(Tris-Buffered Saline)洗涤3次，将包含3%牛血清白蛋白(BSA；Bovine SerumAlbumin)的TBS溶液以250μL/孔的方式添加至各个孔，并于室温静置2小时。利用TBS洗涤3次，将上述所回収的各培养上清以50μL/孔的方式进行添加，并于室温静置1小时。

利用TBS-T洗涤3次后，将利用1%BSA/TBS-T稀释至10000倍的Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(细胞信号传导)的溶液以50μL/孔的方式进行添加，并于室温静置1小时。之后，利用TBS-T洗涤4次，在添加TMB Peroxidase Substrate(TMB 过氧化物酶 EIA复合体基质试剂盒 Bio-Rad)后，利用1mol/L磷酸溶液停止反应，通过吸光测定读数仪测定450nm的吸光值。其结果，如图6所示，由使hIns-HA、及hIns-FLAG表达的细胞的培养上清，确认到了相较于仅导入了作为阴性对照的载体的细胞、或者来自使hIns表达的细胞的培养上清更加明显的信号，可知hIns-HA及hIns-FLAG均与hIns1-HiBiT5相同，不会妨碍胰岛素融合蛋白质的生成及分泌。由此示出了即便肽的种类不同，hIns1-HiBiT5的肽插入位置也仍是有效的。HiBiTHiBiT。

实施例4 基于筛选的胰岛素生成促进基因的鉴定

所述的实施例2示出了实际上本发明所制作的人重组细胞能够有效用于促进β细胞功能的新型的基因探索。其中，利用与所述实施例3(1)相同的方法，通过PCR将来自人cDNA文库中的可能会促进成为β细胞的直接重编程的多个人基因组扩增，并于所述实施例3中所使用的表达质粒pEBMulti-Hyg的多克隆位点进行克隆。接着，使生成在所述实施例1(6)中确认了有用性的hIns-HiBiT5的人SW872细胞感染Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因所表达的仙台病毒载体(TOKIWA-Bio inc.)，于β细胞分化培养基培养24小时。使用Lipofectamine3000向该病毒感染细胞传染克隆为pEBMulti-Hyg的各种人基因，于分化培养基培养5天后，使用HiBiT分析试剂盒(Promega Corporation、Nano-GloHiBiTExtracellular DetectionSystem)对各试料中的胰岛素含量进行比较。

其结果，如图7中的(1)所示，在使人KLF9基因(SEQ ID NO: 71)共表达于表达Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因的重组SW872细胞时，观察到胰岛素-HiBiT融合蛋白质的生成的亢进。在对此处所使用的表达Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因的重组SW872细胞进行长期培养并发生了扩张的细胞实施相同的实验时，如图7中的(2)所示，可知除人KLF9基因以外，合并使人UCN3基因(SEQ ID NO: 67)共表达时，进一步显著地促进了胰岛素-HiBiT融合蛋白质的生成。其中，使来自肝脏的细胞株Huh7感染表达Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因的仙台病毒载体(TOKIWA-Bio inc.)，并于β细胞分化培养基培养24小时后，利用Lipofectamine3000转染人KLF9基因及人UCN3基因的表达质粒，5天后测定胰岛素生成量。人KLF9基因及人UCN3基因的表达质粒通过使用SEQ ID NO: 65、66及SEQ ID NO: 69、70所示的引物用与实施例3(1)中记载的方法相同的方式利用PCR法及INFUSION连接反应进行制作。作为阴性对照，使用了pEBMulti-Hyg，作为阳性对照，使用了pEBMulti-hIns。利用酸性乙醇(盐酸与乙醇的混合液)对转染了各种质粒的各12000细胞进行处理，利用缓冲液将处理后的细胞提取液的上清稀释至5倍并测定胰岛素含量。胰岛素的定量使用HISCL HI-1000(SysmexCorporation)。如图7中的(3)所示，对于使人KLF9基因及人UCN3基因进行了共表达的人体细胞，观察到了相较于仅使Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因表达时为20倍以上的胰岛素生成的亢进。进一步，在相同条件的实验中，使Huh7细胞感染于表达向Ngn3、Mafa、Pdx1中添加Glis1而成的4种基因的仙台病毒载体(TOKIWA-Bio inc.)时，如图7中的(4)所示，通过人KLF9基因及人UCN3基因的共表达，引发了更加显著的胰岛素生成促进。根据以上结果可知，对于以往的成为人β细胞的直接重编程方法而言，追加KLF9基因及人UCN3基因的共表达能够发挥出强力促进人胰岛素生成及分泌的作用。

接着，将属于与人KLF9基因相同的家族基因的人KLF11基因、及KLF12基因，分别参照美国国家生物技术信息中心参考序列数据库检索号(accession number)的NM_001198851.2、及NM_007249.5，获取开放阅读框的碱基序列信息。用与上述实施例中将人KLF9基因于表达质粒pEBMulti-Hyg的多克隆位点进行克隆的方法相同的方法，对这些基因cDNA进行克隆。具体而言，使用使3种基因各自的自起始密码子起30碱基结合至碱基序列CCTCACTAAAGGGGTACC的3’末端而成的引物、使自终止密码子起上游30碱基的互补链序列结合至碱基序列AAGCTTATCGATACCGTC的3’末端而成的引物，用与实施例3(1)中记载的方法相同的方式通过PCR法及INFUSION连接反应制作各表达质粒。用与上述相同的方式使来自人脂肪的细胞株SW872感染Ngn3、Mafa、Pdx1及Glis1这4种基因表达的仙台病毒载体(TOKIWA-Bio inc.)后，于β细胞分化培养基中培养24小时后，利用Lipofectamine 3000将人KLF9基因、人KLF11基因、或者人KLF11基因与人UCN3基因的表达质粒一同转染，5天后测定培养液中的、与胰岛素生成量成比例的人C肽生成量。作为阴性对照，使用pEBMulti-Hyg。C-肽的定量使用了HISCL HI-1000(Sysmex Corporation)。如图7中的(5)所示，人KLF11基因、或者人KLF12基因与人UCN3基因的共表达，相较于阴性对照而言，与人KLF9相同也观察到了C-肽生成量的亢进。根据该结果可知，作为属于与KLF9基因相同的家族的基因的KLF11基因、或者人KLF12基因与KLF9基因同样地也能够通过与人UCN3基因的共表达而促进基于以往的由成为人β细胞的直接重编程方法带来的人胰岛素的生成及分泌能力的获得。

实施例5 低分子化合物的筛选

用与所述实施例4相同的方式，使生成hIns-HiBiT5的人SW872细胞感染Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因表达的仙台病毒载体，于β细胞分化培养基中培养24小时。对其以最终浓度为0.3~30nM的方式添加各种低分子化合物，从而于分化培养基中培养3天后，进一步于以相同的浓度添加了相同的化合物的分化培养基中培养2天。使用HiBiT分析试剂盒对各试样中的胰岛素含量进行比较，调查是否存在促进向β细胞分化的低分子化合物。化合物使用能够获取的多种市售化合物和东京大学创药机构提供的9600种化合物的文库进行筛选。其结果，0.2%左右的化合物促进了胰岛素-HiBiT融合蛋白质的生成。对于其中的2种，利用Huh7细胞实际调查了胰岛素生成促进作用，结果如图8所示，丙戊酸(Sigma-Aldrich 产品编号P4543 CAS编号1069-66-5)在1~30nM时促进来自Huh7细胞的胰岛素生成，泽布拉林(TokyoChemical Industry Co., Ltd. 产品编号 Z0022 CAS编号3690-10-6)在0.3~10nM时促进来自Huh7细胞的胰岛素生成。胰岛素的定量方法用与实施例4相同的方式实施。另外，丙戊酸利用乙醇制作100mM溶液，并进行希釈，以规定的浓度添加至细胞。泽布拉林利用二甲基亚砜制作100mM溶液，并进行希釈，添加至规定的细胞。

根据以上结果可知，在以往的成为人β细胞的直接重编程方法的基础上，通过添加丙戊酸或泽布拉林、或者这两者，能够用作促进来自细胞的生成及分泌人胰岛素的促进剂。

SEQ ID NO: 1

HiBiT氨基酸序列

VSGWRLFKKIS

SEQ ID NO: 2

C-肽样序列

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ

SEQ ID NO: 3

C-肽样序列

RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR

SEQ ID NO: 4

C-肽样序列

RREAEDLQVGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR

SEQ ID NO: 5

C-肽样序列

EAEDLQVGGGPGAGSLQPLALEGSLQ

SEQ ID NO: 6

C-肽样序列

RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ

SEQ ID NO: 7

C-肽样序列

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR

SEQ ID NO: 8

mIns1-HiBiT1 表达质粒

CAACTTTGTATAGAAAAGTTGCTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTGCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGAACAACTGGAGCTGGGAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAAGCCCCGGGGACCTTCAGACCTTGGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGGCCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAGCGGCCGCGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCTCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGGCGCGCCGCGGCCGC

SEQ ID NO: 9

mIns1-HiBiT1 编码基因

ATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGAACAACTGGAGCTGGGAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAAGCCCCGGGGACCTTCAGACCTTGGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 10

mIns1-HiBiT1 氨基酸序列

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVEQLELGVSGWRLFKKISGSPGDLQTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 11

mIns1-HiBiT2 编码基因

ATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGAACAACTGGAGCTGGGAGGAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 12

mIns1-HiBiT2 氨基酸序列

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVEQLELGGVSGWRLFKKISALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 13

mIns1-HiBiT3 编码基因

ATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAGGAAGCCCCGGGGACCTTCAGACCTTGGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 14

mIns1-HiBiT3 氨基酸序列

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPVSGWRLFKKISGGSPGDLQTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 15

mIns1-HiBiT4 编码基因

ATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGAACAACTGGAGCTGGGAGGAAGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCACCTTGGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 16

mIns1-HiBiT4 氨基酸序列

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVEQLELGGSVSGWRLFKKISTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 17

mIns1-HiBiT5 编码基因

ATGGCCCTGTTGGTGCACTTCCTACCCCTGCTGGCCCTGCTTGCCCTCTGGGAGCCCAAACCCACCCAGGCTTTTGTCAAACAGCATCTTTGTGGTCCCCACCTGGTAGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCAAGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAGGAAGCCCCGGGGACCTTCAGACCTTGGCGTTGGAGGTGGCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGTGGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 18

mIns1-HiBiT5 氨基酸序列

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEDPQVVSGWRLFKKISGGSPGDLQTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 19

mIns2-HiBiT1 表达质粒

CAACTTTGTATAGAAAAGTTGCTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTGCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGCACAACTGGAGCTGGGTGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAGGCCCGGGAGCAGGTGACCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGGCCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAGCGGCCGCGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCTCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCGGCGCGCCGCGGCCGC

SEQ ID NO: 20

mIns2-HiBiT1 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGCACAACTGGAGCTGGGTGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGAGGCCCGGGAGCAGGTGACCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 21

mIns2-HiBiT1 氨基酸序列

MALWMRFLPLLALLFLWESHPTQAFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMSRREVEDPQVAQLELGVSGWRLFKKISGGPGAGDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 22

mIns2-HiBiT2 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGCACAACTGGAGCTGGGTGGAGGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 23

mIns2-HiBiT2 氨基酸序列

MALWMRFLPLLALLFLWESHPTQAFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMSRREVEDPQVAQLELGGGVSGWRLFKKISLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 24

mIns2-HiBiT3 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGTGGAGGCCCGGGAGCAGGTGACCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 25

mIns2-HiBiT3 氨基酸序列

MALWMRFLPLLALLFLWESHPTQAFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMSRREVEDPVSGWRLFKKISGGGPGAGDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 26

mIns2-HiBiT4 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGCACAACTGGAGCTGGGTGGAGGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 27

mIns2-HiBiT4 氨基酸序列

MALWMRFLPLLALLFLWESHPTQAFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMSRREVEDPQVAQLELGGGVSGWRLFKKISLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 28

mIns2-HiBiT5 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCTTCCTGCCCCTGCTGGCCCTGCTCTTCCTCTGGGAGTCCCACCCCACCCAGGCTTTTGTCAAGCAGCACCTTTGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTCTACACACCCATGTCCCGCCGTGAAGTGGAGGACCCACAAGTGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGTGGAGGCCCGGGAGCAGGTGACCTTCAGACCTTGGCACTGGAGGTGGCCCAGCAGAAGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTGCACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAAC

SEQ ID NO: 29

mIns2-HiBiT5 氨基酸序列

MALWMRFLPLLALLFLWESHPTQAFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMSRREVEDPQVVSGWRLFKKISGGGPGAGDLQTLALEVAQQKRGIVDQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 30

hIns-HiBiTT1 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAAGAATTCA

SEQ ID NO: 31

hIns-HiBiT1 氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGVSGWRLFKKISGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 32

hIns-HiBiT2 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAAGAATTCA

SEQ ID NO: 33

hIns-HiBiT2 氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGVSGWRLFKKISLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 34

hIns-HiBiT5 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAAGAATTCA

SEQ ID NO: 35

hIns-HiBiT5 氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVVSGWRLFKKISGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 36

Pre-Donor-arm1-HiBiT-arm2 质粒

TCTAGATAGCATCGTACGCGTACGTGTTTGGCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCGGATCCATGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTAAGAATTCAAGGCCTCTCGAGCCACTATAGTGAGTCGTATTACGTAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAACGCGCCGCACACAAAAACCAACACACAGATCATGAAAATAAAGCTCTTTTATTGGTACCGAATTCGCCAGGGAGCTCTCAGACGTCGCTTGGTCGGTCTTTATTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCACATGGTTTAGTTCCTCACCTTGTCGTATTATACTATGCCGATATACTATGCCGATGATTAATTGTCAACAGGCTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAGACGTGCGCTTTTGAAGCGTGCAGAATGCCGGGCCTCCGGAGGACCTTCGGGCGCCCGCCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCCGGACCCACCCCTTCCCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAGCTGCTATTGGCCGCTGCCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCAGCGGTGCTGTCCATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACGACGCGAGCTGCGGGGCGGGGGGGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAGCCGGTTGGCGCCTACCGGTGGATGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTGCCCAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGGGAAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAGAATCCATGGCCCTGTGGATGCGCCCAAACACGTACGCGTACGATGCTCAAGCTTGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGATCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

SEQ ID NO: 37

引物neoRdonorF

CCGATCCCATGGTTTAGTTCCTCACCTTG

SEQ ID NO: 38

引物neoRdonorR

CTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTC

SEQ ID NO: 39

引物inFneoRr

AAACCATGGGATCGGCCATTGAACAAG

SEQ ID NO: 40

引物inFneoRf

AGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG

SEQ ID NO: 41

Pre-Donor-arm1-NeoR-arm2

TCTAGATAGCATCGTACGCGTACGTGTTTGGCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCGGATCCATGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTAAGAATTCAAGGCCTCTCGAGCCACTATAGTGAGTCGTATTACGTAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAACGCGCCGCACACAAAAACCAACACACAGATCATGAAAATAAAGCTCTTTTATTGGTACCGAATTCGCCAGGGAGCTCTCAGACGTCGCTTGGTCGGTCTTTATTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCGATCCCATGGTTTAGTTCCTCACCTTGTCGTATTATACTATGCCGATATACTATGCCGATGATTAATTGTCAACAGGCTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAGACGTGCGCTTTTGAAGCGTGCAGAATGCCGGGCCTCCGGAGGACCTTCGGGCGCCCGCCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCCGGACCCACCCCTTCCCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAGCTGCTATTGGCCGCTGCCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCAGCGGTGCTGTCCATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACGACGCGAGCTGCGGGGCGGGGGGGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAGCCGGTTGGCGCCTACCGGTGGATGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTGCCCAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGGGAAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAGAATCCATGGCCCTGTGGATGCGCCCAAACACGTACGCGTACGATGCTCAAGCTT

SEQ ID NO: 42

引物DonorR

CCATGGATCCGGCAGAAGGAC

SEQ ID NO: 43

引物DonorF

CTAAGAATTCAAGGCCTCTCG

SEQ ID NO: 44

引物hInsHiBiTF

CTGCCGGATCCATGGCCCTGTG

SEQ ID NO: 45

引物hInsHiBiTR

CGAGAGGCCTTGAATTCTTAG

SEQ ID NO: 46

Arm1-hIns-HiBiT1-NeoR-Arm2

TCTAGATAGCATCGTACGCGTACGTGTTTGGCCCAGATCACTGTCCTTCTGCCGGATCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAAGAATTCAAGGCCTCTCGAGCCACTATAGTGAGTCGTATTACGTAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAACGCGCCGCACACAAAAACCAACACACAGATCATGAAAATAAAGCTCTTTTATTGGTACCGAATTCGCCAGGGAGCTCTCAGACGTCGCTTGGTCGGTCTTTATTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCGATCCCATGGTTTAGTTCCTCACCTTGTCGTATTATACTATGCCGATATACTATGCCGATGATTAATTGTCAACAGGCTGCAGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAGAGGAGAACAGCGCGGCAGACGTGCGCTTTTGAAGCGTGCAGAATGCCGGGCCTCCGGAGGACCTTCGGGCGCCCGCCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCTGAGCCCGCCCCCGGACCCACCCCTTCCCAGCCTCTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAGCAAAGCTGCTATTGGCCGCTGCCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCAGCGGTGCTGTCCATCTGCACGAGACTAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACGTCCTGCACGACGCGAGCTGCGGGGCGGGGGGGAACTTCCTGACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAGCCGGTTGGCGCCTACCGGTGGATGTGGAATGTGTGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTGCCCAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTTGGGAAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAGAATCCATGGCCCTGTGGATGCGCCCAAACACGTACGCGTACGATGCTCAAGCTT

SEQ ID NO: 47

向导RNA-hCAS9 质粒

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAGATCACTGTCCTTCTGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGGCCGGCCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCATCGTACGCGTACGTGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGACCGGTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAAGAATTCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACTCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGTCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGAAGCCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

SEQ ID NO: 48

引物Ins1

GTCTCCCAGATCACTGTCCTTC

SEQ ID NO: 49

引物Ins2r

TCTTCCCCATCTCCTGACTATG

SEQ ID NO: 50

引物HiBiTR

AATCTTCTTGAACAGCCGCCAG

SEQ ID NO: 51

HA标签

YPYDVPDYA

SEQ ID NO: 52

FLAG标签

DYKDDDDK

SEQ ID NO: 53

引物 pEB-Ins F

CCTCACTAAAGGGGTACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCC

SEQ ID NO: 54

引物 pEB-Ins R

AAGCTTATCGATACCGTCTCACTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAG

SEQ ID NO: 55

hIns 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG

SEQ ID NO: 56

hIns氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 57

引物 Ins-HA R

CTGGAACATCGTATGGGTACACCTGCAGGTCCTCTGCCTCCC

SEQ ID NO: 58

引物 HA-Ins F

CCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAG

SEQ ID NO: 59

hIns-HiBiT5-HA 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAA

SEQ ID NO: 60

hIns-HiBiT5-HA 氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVYPYDVPDYAGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 61

引物 Ins-FlagR

CGTCGTCATCCTTGTAATCCACCTGCAGGTCCTCTGCCTCCC

SEQ ID NO: 62

引物 Flag-InsF

ACAAGGATGACGACGATAAGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAG

SEQ ID NO: 63

hIns-HiBiT5-FLAG 编码基因

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAAGAATTCA

SEQ ID NO: 64

hIns-HiBiT5-FLAG 氨基酸序列

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVDYKDDDDKGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO: 65

hUcn3

引物 hUcn3 F

CCTCACTAAAGGGGTACCATGCTGATGCCGGTCCACTTCCTGC

SEQ ID NO: 66

引物 hUcn3 R

AAGCTTATCGATACCGTCCTACTTCTTCCTCCCAATTTGCGCCATCAG

SEQ ID NO: 67

hUcn3 编码基因

ATGCTGATGCCGGTCCACTTCCTGCTGCTCCTGCTGCTGCTCCTGGGGGGCCCCAGGACAGGCCTCCCCCACAAGTTCTACAAAGCCAAGCCCATCTTCAGCTGCCTCAACACCGCCCTGTCTGAGGCTGAGAAGGGCCAGTGGGAGGATGCATCCCTGCTGAGCAAGAGGAGCTTCCACTACCTGCGCAGCAGAGACGCCTCTTCGGGAGAGGAGGAGGAGGGCAAAGAGAAAAAGACTTTCCCCATCTCTGGGGCCAGGGGTGGAGCCAGAGGCACCCGGTACAGATACGTGTCCCAAGCACAGCCCAGGGGAAAGCCACGCCAGGACACGGCCAAGAGTCCCCACCGCACCAAGTTCACCCTGTCCCTCGACGTCCCCACCAACATCATGAACCTCCTCTTCAACATCGCCAAGGCCAAGAACCTGCGTGCCCAGGCGGCCGCCAATGCCCACCTGATGGCGCAAATTGGGAGGAAGAAGTAG

SEQ ID NO: 68

hUcn3 氨基酸序列

MLMPVHFLLLLLLLLGGPRTGLPHKFYKAKPIFSCLNTALSEAEKGQWEDASLLSKRSFHYLRSRDASSGEEEEGKEKKTFPISGARGGARGTRYRYVSQAQPRGKPRQDTAKSPHRTKFTLSLDVPTNIMNLLFNIAKAKNLRAQAAANAHLMAQIGRKK

SEQ ID NO: 69

hKLF9

引物 hKLF9 F

CCTCACTAAAGGGGTACCATGTCCGCGGCCGCCTACATGGACTTCG

SEQ ID NO: 70

引物 hKLF9 R

AAGCTTATCGATACCGTCTCACAAAGCGTTGGCCAGCGCCTTTTTCGATC

SEQ ID NO: 71

hKLF9 编码基因

ATGTCCGCGGCCGCCTACATGGACTTCGTGGCTGCCCAGTGTCTGGTTTCCATTTCGAACCGCGCTGCGGTGCCGGAGCATGGGGTCGCTCCGGACGCCGAGCGGCTGCGACTACCTGAGCGCGAGGTGACCAAGGAGCACGGTGACCCGGGGGACACCTGGAAGGATTACTGCACACTGGTCACCATCGCCAAGAGCTTGTTGGACCTGAACAAGTACCGACCCATCCAGACCCCCTCCGTGTGCAGCGACAGTCTGGAAAGTCCAGATGAGGATATGGGATCCGACAGCGACGTGACCACCGAATCTGGGTCGAGTCCTTCCCACAGCCCGGAGGAGAGACAGGATCCTGGCAGCGCGCCCAGCCCGCTCTCCCTCCTCCATCCTGGAGTGGCTGCGAAGGGGAAACACGCCTCCGAAAAGAGGCACAAGTGCCCCTACAGTGGCTGTGGGAAAGTCTATGGAAAATCCTCCCATCTCAAAGCCCATTACAGAGTGCATACAGGTGAACGGCCCTTTCCCTGCACGTGGCCAGACTGCCTTAAAAAGTTCTCCCGCTCAGACGAGCTGACCCGCCACTACCGGACCCACACTGGGGAAAAGCAGTTCCGCTGTCCGCTGTGTGAGAAGCGCTTCATGAGGAGTGACCACCTCACAAAGCACGCCCGGCGGCACACCGAGTTCCACCCCAGCATGATCAAGCGATCGAAAAAGGCGCTGGCCAACGCTTTGTGA

SEQ ID NO: 72

hKLF9 氨基酸序列

MSAAAYMDFVAAQCLVSISNRAAVPEHGVAPDAERLRLPEREVTKEHGDPGDTWKDYCTLVTIAKSLLDLNKYRPIQTPSVCSDSLESPDEDMGSDSDVTTESGSSPSHSPEERQDPGSAPSPLSLLHPGVAAKGKHASEKRHKCPYSGCGKVYGKSSHLKAHYRVHTGERPFPCTWPDCLKKFSRSDELTRHYRTHTGEKQFRCPLCEKRFMRSDHLTKHARRHTEFHPSMIKRSKKALANAL

Claims (17)

1.一种人体细胞的胰岛素分泌能力的定量方法，其特征在于，对将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞进行培养，并测定所分泌的融合C-肽量，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

2.根据权利要求1所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽的插入位置为相当于C-肽链的7V的C末侧的位置。

3.根据权利要求1或2所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自能够通过化学发光分析检测出的标签肽及能够通过免疫分析检测出的标签肽中的标签肽。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自能够与荧光素酶结合的标签肽、含DDDDK的标签肽及来自血凝素的标签肽中的标签肽。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为能够与荧光素酶结合的标签肽。

6.根据[1]~[5]中任一项所述的定量方法，其中，能够检测出的标签肽为选自VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO:1)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)及YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)中的标签肽。

7.根据权利要求1~6中任一项所述的定量方法，其中，所述人培养细胞株为：(1)人培养细胞株；(2)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因导入人体细胞而成的细胞；或(3)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因、及KLF9、KLF11或KLF12的基因、以及UCN3基因同时导入人体细胞而成的细胞。

8.一种重组细胞，其为将表达融合C-肽的基因与人培养细胞株基因组中的胰岛素基因进行替换而成的重组细胞，所述融合C-肽为将能够检测出的标签肽插入人胰岛素原分子内的C-肽链中而成的融合C-肽。

9.根据权利要求8所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽的插入位置为相当于C-肽链的7V的C末侧的位置。

10.根据权利要求8或9所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自能够通过化学发光分析检测出的标签肽及能够通过免疫分析检测出的标签肽中的标签肽。

11.根据权利要求8~10中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自能够与荧光素酶结合的标签肽、含DDDDK的标签肽及来自血凝素的标签肽中的标签肽。

12.根据权利要求8~11中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为能够与荧光素酶结合的标签肽。

13.根据权利要求8~12中任一项所述的重组细胞，其中，能够检测出的标签肽为选自VSGWRLFKKIS(SEQ ID NO:1)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)及YPYDVPDYA(SEQ ID NO:51)中的标签肽。

14.根据权利要求8~13中任一项所述的重组细胞，其中，所述人培养细胞株为：(1)人培养细胞株；(2)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因导入人体细胞而成的细胞；或(3)将Ngn3、Mafa及Pdx1这3种基因、及KLF9、KLF11或KLF12的基因、以及UCN3基因同时导入人体细胞而成的细胞。

15.一种促进人胰岛素的产生及分泌的物质的筛选方法，其特征在于，在受试物的存在下，培养权利要求8~14中任一项所述的重组细胞，并测定所分泌的融合C-肽量。

16.一种人胰岛素产生及分泌促进剂，其含有通过权利要求15所述的筛选方法获得的物质。

17.一种胰岛素产生及分泌促进剂，其含有选自丙戊酸及泽布拉林中的1种或2种。