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CN1215433A - 胶霉毒素衍生物及由它制成的抗癌药 - Google Patents

胶霉毒素衍生物及由它制成的抗癌药 Download PDF

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CN1215433A
CN1215433A CN97193552A CN97193552A CN1215433A CN 1215433 A CN1215433 A CN 1215433A CN 97193552 A CN97193552 A CN 97193552A CN 97193552 A CN97193552 A CN 97193552A CN 1215433 A CN1215433 A CN 1215433A
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CN
China
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gliotoxin
acetyl
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producing
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CN97193552A
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向井千贺
大角幸治
中川隆裕
吉村敏彦
金山由佳
大林洋子
开田健一
村田正弘
须贺泰世
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Abstract

本发明涉及以乙酰胶霉素和用下述通式(Ⅰ)表示的胶霉毒素衍生物作为有效成分的抗癌药。这些胶霉毒素化合物对于以往药效不理想的固型癌有着优异的效果。

Description

胶霉毒素衍生物及由它制成的抗癌药
技术领域
本发明涉及对肿瘤增殖有抑制活性的胶霉毒素衍生物，以及以其作为有效成分的抗癌药。
背景技术
至今为止用于固型癌的抗癌药已被开发出许多种，但是较满意的抗癌药还没被开发出来。现在临床应用较多的抗癌药(阿霉素、顺铂、5-FU、喜树碱(kanptotecin)等)，对白血病细胞等增殖良好的肿瘤有效，但是对于在临床上有必要给予抗癌药的、增殖性恶劣的固型癌，这些现有的抗癌药不能充分发挥药效。这种情况就是现有的抗癌药在实际治疗中不能充分发挥药效的理由之一。
本发明的主题是提供对固型癌有非增殖依赖的细胞毒性、同时有细胞凋亡诱导活性的有效的抗癌药。
发明的公开
本发明者们为了达到上述目的进行了深入的研究，发现了霉菌(Dichotomomyces cejpii)的培养液有强烈的非增殖依赖的细胞毒性以及细胞凋亡诱导活性的事实。因此将其中的成分分离、确证后，是乙酰胶霉毒素。
乙酰胶霉毒素有下述的通式。
在此对乙酰胶霉毒素的生理活性进行了研究，发现其有如下作用：(1)有不依赖于细胞增殖的细胞毒性；(2)作为抗癌药有对使癌消退所必须具有的细胞凋亡(Apoptosis)诱导活性；(3)使用在临床上切除的肿瘤细胞进行三次培养(三次元培養)仍然显示出很好的细胞毒性；(4)并且对于体内评价试验来说，在较宽的剂量范围，对于移植的固型癌(人固型癌、小鼠固型癌)显示出显著的增殖抑制活性。
上述的乙酰胶霉毒素是已经被J.R.Johnson(J.Amer.Chem.Soc.,75,2110-2112(1953))等人报导过的已知的化合物。可是乙酰胶霉毒素具有抗癌效果却是至今还不被知道的事情。
并且，大量生产乙酰胶霉毒素的方法也是未知的。根据以上的发现，本发明者们由乙酰胶霉毒素合成了各种的化合物，研究了其抗癌活性。
结果，是发现了用下述通式表示的胶霉毒素衍生物，也对固型癌显示出高的抗癌活性。
Figure A9719355200051
[上述通式中，X表示氢原子、羟基、氰甲氧基、碳原子数1～3的烷氧基、碳原子数2～3的酰氧基、或者甲氧羰甲氧基。]
上述通式的化合物中X是羟基的化合物是已知化合物(J.Chem.Suc.(c),1799(1966))，其他的是新的化合物。这些化合物有抗癌活性是至今还不知道的。
即本发明是提供以含有乙酰胶霉毒素以及用上述通式表示的胶霉毒素衍生物作为有效成分作为特征的抗癌药。
附图的简单说明
图1表示本发明得到的乙酰胶霉毒素的1H核磁共振图谱。
图2表示本发明得到的乙酰胶霉毒素的13C核磁共振图谱。
图3是表示将在本发明的实施例得到的乙酰胶霉毒素给予大肠癌小鼠，对肿瘤重量的经时变化测定结果的图表。
图4是表示将在本发明的实施例得到的乙酰胶霉毒素给予大肠癌小鼠，对IR的经时变化测定结果的图表。
图5是表示将在本发明的实施例得到的乙酰胶霉毒素给予大肠癌小鼠，对尸体重量的经时变化测定结果的图表。
实施发明的最佳方式
本发明的胶霉毒素衍生物能够从乙酰胶霉毒素合成，乙酰胶霉毒素可以通过培养有产生它的能力的微生物而大量生产。
作为具有产生乙酰胶霉毒素能力的微生物的例子来说，可以举出Dichotomomyces cejpii AJ117330(FERM BP-5738)。这个微生物是从在神奈川县川崎市采集到的土壤中照下面的方法采取得到的。将这种土壤1g在55℃条件下进行湿热处理10分钟后通过稀释平板法，涂布在玉米粉琼脂培养基(添加抗生素，氯霉素50mg/L，玫瑰红15mg/L)的一面上。在25℃条件下培养5天，从出现的菌落中分离出本发明的菌株。
以下记载了由这种方法分离出的AJ117330(FERM BP-5738)菌株的细菌学的性质。
(a)在各种培养基中的生长形态
在麦芽提取物琼脂培养基上的生长良好，25℃、7天时菌落直径是52mm。菌落表面呈白色绒毛状，内部呈淡黄色。未发现在培养基中有色素、油滴生成。菌丝是松散的羊毛状，整个地形成闭囊壳。
在马铃薯·葡萄糖琼脂培养基上的生长良好，25℃、7天时菌落直径是58mm。菌落表面呈白色绒毛状，内部呈淡黄色。未发现在培养基中有色素、油滴生成。菌丝是松散的羊毛状，整个地形成闭囊壳。
在玉米粉琼脂培养基上的生长良好，25℃、7天时菌落直径是47mm。菌落表面呈白色绒毛状、周边薄，内部呈白色。未发现在培养基中有色素、油滴生成。形成闭囊壳。
(b)形态的特征
分散在培养基表面的闭囊壳，被球形-似球形、直径0.3～1mm、无色的菌丝松散地包裹。包裹于子囊果中的子囊是无色、含有着8孢子、为球形-似球形、直径8～12μm。子囊胞子是无色，从正面来看是球形、从侧面来看是透镜形、有2个赤道缘。大小约4μm(不包括赤道缘)。
分生孢子世代由粉状分生孢子(aleurioconidium)组成。分叉方式是不规则的，但通常是二叉状。分生孢子是卵型、大小是(6-10)×(5-8)μm。
生长温度是10～40℃，优选生长温度是25～35℃。生长pH是3～10，优选pH是5～7。
从以上细菌学方面的性质，本菌根据[菌类图鉴](1978，讲谈社(日本)，宇田川 俊一，椿启介等6人著)鉴定为子囊菌亚门，不整子囊菌亚纲、Dichotomomyces cejpii。本菌株于平成8年11月6日由通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县Tsukuba市东1丁目1番3号)依据布达佩斯条约进行了国际保藏，给予了FERM BP-5738的保藏编号。
培养属于Dichotomomyces属的，有生产乙酰胶霉毒素能力的微生物的培养基，可以是能够培养霉菌的物质，如果是含有碳源、氮源、无机盐类、有机营养物等的物质，固体培养基、液体培养基都能够使用。作为培养基的成分，蔬菜汁液是较好的选择，优选添加到50g/L～200g/L范围。
培养可以在10～40℃、优选25～35℃,5～14天之间，通常是5～10天之间有氧的条件下进行。
对于从培养物中提取乙酰胶霉毒素来说，作为预处理的方法，最好是加丙酮、甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂，提取出残存在菌体内的乙酰胶霉毒素。添加量对于培养物的体积比为以1/4～1/1的比例较好。这个添加量，对于培养物是将培养液预先通过减压浓缩等进行浓缩处理之后的情况，即是指浓缩物。对于菌体内残存量较少的情况，没有必要进行这样的处理。
从培养物中回收乙酰胶霉毒素的方法有溶剂提取和吸附分离。对于溶剂提取法，在培养物中加入能够溶解乙酰胶霉毒素的有机溶媒。这个添加量对于培养物的体积比是1/4～1/1左右，通常在1/2～1/1左右的比例较好。对于有机溶媒来说，可以使用丙酮、C1-C4范围的低级醇、二甲基亚砜等和水混合的溶媒，也可以使用氯仿、醋酸乙酯、甲苯等和水分层的溶媒。对于使用了和水混合的有机溶媒的情况，用将菌体等的混悬物离心、过滤等方法分离；对于使用了和水分层的溶媒的情况，分离水层，收集上清液或者有机溶剂层进行精制。
对于吸附分离的情况，将合成吸附剂(例如Diaion HP20,Sepabeads SP207(三菱化学))等的吸附剂与培养液接触，将乙酰胶霉毒素吸附，回收。
精制可以采用通过硅胶柱吸附分离、液相色谱法、溶剂提取等方法的合理组合来进行。
本发明的胶霉毒素衍生物，是用上述通式(Ⅰ)表示的化合物，在这里，X是氢原子、羟基、碳原子数1-3的烷氧基、或者碳原子数2-3的酰氧基。
作为上述碳原子数1-3的烷氧基来说，可以举出甲氧基、乙氧基、丙氧基。再有作为碳原子数2-3的酰氧基来说，可以举出乙酰基、丙酰基。
作为用通式(Ⅰ)表示的胶霉毒素衍生物来说，可以举出如下的例子：
X是氢原子的(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是羟基的(3S,10aR)-6-羟基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是氰甲氧基的化合物(3S,10aR)-6-(氰甲氧基)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是甲氧基的化合物(3S,10aR)-6-甲氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是乙氧基的化合物(3S,10aR)-6-乙氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是丙氧基的化合物(3S,10aR)-6-丙氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是乙酰氧基的化合物(3S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是丙酰氧基的化合物(3S,10aR)-6-丙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮
X是甲氧羰基甲氧基的化合物(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-6-[(甲氧羰基)甲氧基]-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮。
用通式(Ⅰ)表示的本发明的化合物，可以按照如下所示的合成路线来合成。
即，首先将化合物(1)的二硫键用对甲氧基苯甲醛进行保护，在成为化合物(2)后，用甲醇盐脱去乙酰基，形成化合物(3)，然后通过用路易斯酸脱保护得到X是氢原子的化合物(4)。
这条路线可以用以下的通式表示。
Figure A9719355200091
X是羟基的化合物(6)，可以通过将化合物(1)与对甲苯磺酸反应后，把乙酰氧基变换成羟基而成为化合物(5)，接着用四氯代对苯醌氧化得到。上述化合物(5)是胶霉毒素的四面体(Tetrahedron),37,2045(1981)等)，能够按照在文献上记载了的已知方法来合成。
这条路线可以用以下的通式表示。
Figure A9719355200101
X是烷氧基的化合物(9)，可以通过将化合物(7)用烷基卤化物和碳酸钾进行烷基化而成为化合物(8)，再用路易斯酸脱保护得到。作为烷基卤化物来说，可以是碘甲烷、溴丁烷、溴丙烷、溴代乙腈、溴代醋酸甲酯。
Figure A9719355200102
X是乙酰氧基的化合物(13)，可以首先将用化合物(2)表示的化合物用盐酸，将乙酰氧基变换为羟基，接着用四氯代邻苯醌氧化得到化合物(11)，把它用无水醋酸乙酰化，再用路易斯酸脱保护得到。
这条路线可以用以下的通式表示。
Figure A9719355200103
Figure A9719355200111
若X是丙酰氧基化合物也可通过将(8)进行丙炔酰基化，同样可以合成。
用上述方法制造出的胶霉毒素衍生物，可以通过常规的分离精制方法、例如象上述的乙酰胶霉毒素那样同样地用溶剂提取、用色谱法、结晶等方法从反应混合物中容易地分离、并且精制。
对于将乙酰胶霉毒素以及胶霉毒素衍生物作为抗癌药来使用时，可以通过口服或非口服(肌肉、皮下、静脉、栓剂等)给药。给药剂量应根据症状而不同，但一般成人每人是1-3000mg的剂量范围分几次服用，每天是1-9000mg。
对于将本发明的胶霉毒素衍生物制成口服制剂的时候，可以加入赋形剂，根据必要还可以选择性加入结合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂等，根据常规方法制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、胶囊剂等。
作为赋形剂来说可以使用以下物质：乳糖、玉米淀粉、白糖、葡萄糖、山梨糖醇、微晶纤维素等；作为结合剂来说可以使用以下物质：聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、西黄蓍胶、明胶、紫胶、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、聚乙烯吡咯酮等；作为崩解剂来说可以使用以下物质：淀粉、琼脂、明胶粉、微晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、葡聚糖、果胶等；作为润滑剂来说可以使用以下物质：硬酯酸镁、滑石粉、聚乙二醇、二氧化硅、硬化植物油等；作为着色剂可以使用容许添加在医药品中的物质；作为矫味矫臭剂来说可以使用以下物质：可可粉、薄荷脑、芳香酸、薄荷油、冰片、桂皮粉等。对于这些片剂、颗粒剂来说，根据需要适当地包上糖衣、明胶衣、其他衣膜之事也是当然可以的。
对于制成注射剂的时候，根据必要可以添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等，由常规方法制成皮下、肌肉、静脉注射剂。
本发明的胶霉毒素衍生物，根据需要可以与盐酸、硫酸、磷酸等无机酸；以及草酸、富马酸、马来酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、谷氨酸等有机酸，形成在药学上能够容许的酸盐，其药效也能够得到充分发挥。
实施例1
(1)培养
十六烷基胶霉毒素将上述霉菌(Dichotomomyces cejpii)AJ117330(FERM BP-5738)菌株在培养基中培养，通过从其培养物中提取的方式能够得到。本霉菌的培养可以按下面所举的例子那样的方法进行。首先，将霉菌接种到麦芽提取物琼脂培养基上，在25℃培养7天。从这个麦芽提取物琼脂培养基上切离出琼脂块，接种到加入了有下述组成的生产培养基(培养基A)100ml的圆形烧瓶中(液面的高度约1cm)，在25℃静置培养8天。
另外，将从麦芽提取物琼脂培养基上切离出的上述的琼脂块，放置到含有生产培养基(培养基A)100ml的500ml三角烧瓶中，以180转/分、25℃旋转培养6天。将上述培养物分成4批(400ml)移植到放置了20L的培养基A的30L广口瓶中，在25℃、250转/分、通气1/2vvm条件下培养6天。
[培养基A组成]
蔬菜汁(kagome公司制，无盐)       100g/L
马铃薯右旋葡萄糖肉汤(Difco公司   12g/L
制)
酵母提取物(Difco公司制)          2g/L
可溶性淀粉                       15g/L
KH2PO4                         1.0g/L
MgSO4·7H2O                    0.5g/L
CaCl2·7H2O                    0.5g/L
2-(N-吗啉代)乙烷磺酸             2g/L
(2)乙酰胶霉毒素的分离精制
经上述的方法培养结束后，在3L的培养液中加入等量(3L)的丙酮，于室温下提取30分钟，把含有丙酮的培养液通过蒸发器除去丙酮，在分液漏斗中用乙酸乙酯做溶剂进行萃取。将溶剂萃取液用硫酸钠脱水，经蒸发器进行减压干燥得到470mg的提取物。接着使其吸附在硅胶柱上，用甲苯洗净后，用甲苯/乙酸乙酯(8∶2)洗脱出活性成分，用蒸发器进行减压浓缩得到了42mg。该粗精制物经高速液相色谱(资生堂Capsel-Pak C18、溶剂：水∶乙腈=72∶28)的等色洗脱，得到纯净的活性物质。对这个活性成分理化性质的测定结果如下：
溶解性：易溶于氯仿、二甲基亚砜；溶于乙酸乙酯、乙腈、甲苯、甲醇、丙酮；难溶于水。
紫外吸收光谱：end、266nm(溶剂：水∶乙腈=60∶40)
分子量：368
薄层层析色谱：吸附剂HPTLC Kieselgel 60F254(MERK公司)，
展开剂己烷∶乙酸乙酯=6∶4，
Rf值0.233
高速液相色谱：
仪器UV检测器：Waters996(Waters公司)
泵：HITACHI L-6200(日立制作所)
柱：分析用反相高速液相色谱柱(CAPCELL PAK C18 UG120 5μm,4.6mmφ×260mm(资生堂(株)制))
流动相：30-100％乙腈(线性梯度(linear grudient)20分钟)
流速：0.8ml/分
保留时间：约10.5分
在1H核磁共振光谱(400MHz,CDCl3)中的化学位移值(见图1)如下。
1H-NMR(CDCl3)δ:5.97-6.04(3H,m),5.57(1H,d),5.02(1H,d),4.31(1H,dd),4.19(1H,dd),3.74(1H,d),3.44(1H,dd),3.17(3H,s),2.96(1H,d),2.14(3H,s)
FAB MASS:369(MH+)
在13C核磁共振光谱(600MHz,CDCl3)中的化学位移值见图2。
将活性成分通过质量分析器进行质量分析、测定H-NMR，将其数据在联机系统进行检索的结果，证明是乙酰胶霉毒素。
(3)乙酰胶霉毒素对各种癌细胞的细胞毒性测定及细胞衰亡的判定
乙酰胶霉毒素对各种癌细胞的抗肿瘤活性由MTT法测定。用由RPMI 1640培养基(GIBCO公司制)、10％牛胎儿血清组成的培养基(以下简称培养基A)，将配制成4.0×104个/ml的各种癌细胞各0.1ml，注入到96孔微量滴定板的各个孔穴中。将该板在二氧化碳恒温培养箱37℃培养20小时后，在各孔中加入用培养基A适当稀释的受试品(试验化合物)0.025ml，在二氧化碳恒温培养箱内37℃培养72小时。在各孔中加入用DulbeccoPBS(-)(nissui公司制)配制成5mg/ml的MTT溶液0.01ml，在二氧化碳恒温培养箱内37℃培养3小时。接着加入0.01N盐酸/20％SDS各0.05ml，把生成的结晶溶解后，通过微量板检测器测定在570nm处的吸光度。通过比较不经处理细胞与用已知浓度的受试品处理过的细胞的吸收度，算出使细胞增殖减少50％的受试品浓度(IC50)。结果见表1。细胞衰亡照上述的方法，将该板在二氧化碳恒温培养箱内37℃培养20小时后，在各孔中加入用培养基A适当稀释的受试品(试验化合物)0.025ml，在二氧化碳恒温培养箱内37℃培养72小时后，在各孔中加入核染色荧光色素DAPI(4,6-二脒基-2-苯吲哚)0.5ng/ml，在室温放置10分钟后用荧光显微镜来确证染色体聚集。
[用于细胞毒性测定的细胞]
人白血病细胞(K562：大日本制药)、人大肠癌细胞(HCT-15,HCT-116,SW946：大日本制药)、人白血病细胞(U937：大日本制药)、人肺癌细胞(LX-1：微生物化学研究所)、小鼠白血病细胞(P388：大日本制药)、小鼠大肠癌细胞(Colon-26：(财)癌研究会癌研究所)。
    细胞类别   IC50(ng/ml)
    HCT-15    (人大肠癌)     39
    HCT-116   (人大肠癌)     180
    SW948     (人大肠癌)     190
    LX-1      (人肺癌)     74
    U937      (人白血病)     14
    P388     (小鼠白血病)     5.8
    Colon-26    (小鼠大肠病)     76
(3)使用临床切除肿瘤的3次培养
使用等级2b的人大肠癌组织进行3次培养。3次培养可以按已经被报道了的方法进行(Int.J.Cancer Res.,82,607-612(1991)、癌和化学疗法，18,239-243(1991)、癌和化学疗法，19,743-748(1992))。将切除的大肠癌组织切细成2mm块，用含10％牛胎儿血清的RPMI-1640培养基，在5％CO2、37℃培养3天后，将现有的抗癌药、乙酰胶霉毒素稀释、添加后，再培养3天，使用MTT法求得杀伤细胞率。另使用人实验固型癌的3次培养法象以下那样进行。在裸体小鼠(Balb nu/nu)的皮下移植人大肠癌细胞株HCT-116，使其生成肿瘤。在生成肿瘤部位切除癌组织，分别切细成2mm块，按上述的方法对现有的抗癌药、乙酰胶霉毒素进行评价。以上的结果见表2。使用了人实验固型癌的3次培养
    Conc.(ug/ml)     I.R.(％)
    ADR     6     0
    CDDP     25     6
    MMC     15     34
    TAXOL     100     19
 Vinblastine     100     20
    5-FU     500     38
  胶霉毒素     25     66
    12.5     28
 乙酰-胶霉毒素     25     67
    12.5     56
    6.25     43
(注解)
ADM    ：阿霉素
CDDP   ：顺铂
MMC    ：丝裂霉素
TAXOL  ：紫杉酚
Vinblastine：长春碱
5-FU       ：5-氟尿嘧啶
(4)对于固型癌体内的抗癌效果
(A)使用小鼠大肠癌COLON-26的体内评价
购入CDFI小鼠(雌性：4周龄)，将用体内进行皮下续代的Colon-26从皮下取出，在平皿内切碎，以10mg/小鼠那样，用trucker移植到CDFI小鼠的皮下。将这天作为0天，到第7天时测定肿瘤大小和体重，以n=4分组。肿瘤大小通过以下的算式作为肿瘤重量算出。肿瘤重量(mg)=肿瘤体积(mm3)=1/2×长径(mm)×短径(mm)2
给药按以下的时间表从第7天开始。剂量用0.2ml/小鼠进行腹腔给药。乙酰胶霉毒素用二甲基亚砜(DMSO)溶解成为100mg/ml的溶液，再用5％吐温-80(生理盐水)配制成所需的浓度(0.5mg/kg,1mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。0.6、1mg/kg的评价是连续5天给药，10mg/kg是第7、8天给药2次，20mg/kg仅在第7天给药。
抗癌效果用由肿瘤重量计算出的肿瘤增殖抑制率(IR)表示。
IR由以下的算式求出。
IR(％)=(1-给药组的肿瘤重量/对照组的肿瘤重量)
各给药剂量的IR在以下表示。
(B)使用人大肠癌HCT-116的体内评价
购入Balb/c nu/nu(雌性：5周龄)，将用体内进行皮下续代的HCT-116从皮下取出，在平皿内切碎，象30mg/小鼠那样，用trucker移植到Balb/c nu/nu的皮下。将这天作为0天，到第7天时测定肿瘤大小和体重，以n=2分组。乙酰胶霉毒素用二甲基亚砜(DMSO)溶解成为100mg/ml的溶液，再用5％吐温-80(生理盐水)配制成所需的浓度(0.5mg/kg,1mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。0.5、1mg/kg的评价是连续5天给药，10mg/kg是第7、8天给药2次，20mg/kg仅在第7天给药。抗癌效果用由肿瘤重量计算出的肿瘤增殖抑制率(IR)表示。
将试验例(A)、(B)的结果表示在表3、4以及图3-5。表3是表示用小鼠大肠癌COLON-26的体内评价时，第21天的IR和体重、表4是表示用人大肠癌HCT-116的体内评价时，第21天的IR和体重，它们分别与乙酰胶霉毒素的各给药剂量之间的对应关系。
  I.R.(％)   体重(g)
 0.5mg/kg×5i.p.(d7-11)     28     24.7
 1mg/kg×5i.p.(d7-11)     19     24.9
 10mg/kg×2i.p.(d7,8)     38     24.1
 20mg/kg×li.p.(d7)     34     25.2
(对照组是24.7g)
  I.R.(％)     体重(g)
 0.5mg/kg×5i.p.(d7-11)     41     17.1
 1mg/kg×5i.p.(d7-11)     65     17.8
 10mg/kg×2i.p.(d7,8)     65     15.8
 20mg/kg×1i.p.(d7)     28     15.9
(对照组是17.5g)
图3、图4和图5分别表示肿瘤重量、IR和尸重(小鼠体重-肿瘤重量)的重量，与时间的变化关系。各图的(A)是用小鼠大肠癌COLON-26的体内评价结果；(B)是用人大肠癌HCT-116的体内评价结果，乙酰胶霉毒素在试验例(B)，到21天1mg/kg×5表示IR 65％、10g/kg×2表示IR 65％，显示出高的抗癌效果。这个效果一直持续到42天。因此，本发明得到的抗癌药并不仅简单地限于对非增殖细胞有良好的细胞毒性，而且通过给药剂量的变化，有在临床上可以充分使用的可能性的特点，这是非常有用的。
实施例2
同实施例1同样地进行，培养了霉菌Dichotomomyces cejpiiAJ117330(FERM BP-5738)。将4kg Diaion HP-20添加到这个培养物的40L上清液中，在室温搅拌1小时后，分离树脂，用丙酮17L提取。减压浓缩除去丙酮，得到水溶液，用4L乙酸乙酯提取之后，用饱和氯化钠溶液洗净后，用无水硫酸钠脱水，减压浓缩。将这样得到的残渣溶解于乙腈，与少量的硅胶一同浓缩干燥后，进行硅胶色谱精制，分取甲苯∶己烷(8∶2以及7∶3)的洗脱组分。本组分减压浓缩，得到5.6g的粗精制物，将其溶解于甲醇，在4℃以及-20℃结晶。
实施例3
X是氢原子的化合物(4)(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
工序1
(3S,5aS,6S,10aR)-6-乙酰基-2,3,5a,6-四氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚～1,4-二酮的合成
将乙酰胶霉毒素(471mg,1.28mmol)溶解于二氯甲烷20ml和甲醇3ml的混合溶剂中，边在冰浴中冷却边加入硼氢化钠105mg(2.78mmol)，搅拌30分钟。用TLC确认还原反应终结后，加入p-甲氧基苯甲醛3.7ml(30.4mmol)、三氟化硼乙醚络盐3.5ml(28.4mmol)，在室温搅拌40分钟。加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷提取后，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶媒。得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷100％)精制，得到淡黄色油状的目的化合物。(553mg、收率88％)1H-NMR(CDCl3)δ:2.22(3H,s),2.66(1H,dd,J=4.73,10.7Hz),2.97(1H,d,J=18.5Hz),3.16(3H,s),3.36(1H,d,J=18.5Hz),3.74(1H,dd,J=10.7,12.9Hz),3.79(3H,s),4.48(1H,dd,J=4.73,12.9Hz),5.17(1H,d,J=14.7Hz),5.56-5.61(1H,m),5.95-6.06(2H,m),6.08(1H,s),6.18(1H,d,J=14.7Hz),6.85(2H,d,J=8.85Hz),7.50(2H,d,J=8.85Hz)ESI MASS:511.3(M++Na+)
工序2
(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将(3S,5aS,6S,10aR)-6-乙酰基-2,3,5a,6-四氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(412mg,0.843mmol)溶解于二氯甲烷36ml和甲醇4ml的混合溶媒中，加入甲醇钠(28％甲醇溶液)175μl，在室温搅拌1小时20分钟。加水，用2N盐酸调节至pH7后，用二氯甲烷提取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶媒。得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷100％)精制，得到淡黄色固体的目的化合物。(294mg、收率81％)1H-NMR(CDCl3)δ:2.69(1H,dd,J=5.10,9.90Hz),3.26(3H,s),3.29(1H,d,J=17.3Hz),3.77(3H,s),3.90(1H,dd,J=9.90,12.8Hz),3.97.(1H,d,J=17.3Hz),4.72(1H,dd,J=5.10,12.8Hz),5.30(1H,s),6.81(2H,d,J=8.85Hz),7.23(1H,dd,J=7.20,8.10Hz),7.28(2H,d,J=8.85Hz),7.32(1H,d,J=7.20Hz),7.37(1H,dd,J=8.10,8.10Hz),8.20(1H,d,J=8.10Hz)ESI MASS:451.3(M++Na+)
工序3
(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(204mg,0.476mmol)溶解于二氯甲烷100ml，在冰浴中冷却下，加入m-氯过安息香酸110mg(0.637mmol)，搅拌40分钟后，再加入m-氯过安息香酸39.3mg(0.228mmol)，搅拌25分钟。加二甲基硫130μl(1.77mmol)、高氯酸-甲醇溶液(1∶5)290μl，在室温搅拌20小时30分钟后，加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷提取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶媒。得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷100％)精制，用甲醇重结晶，得到淡黄色结晶的目的化合物。(29.8mg、收率20％)1H-NMR(CDCl3)δ:3.26(3H,s),3.34(1H,d,J=18.8Hz),3.48(1H,dd,J=5.65,9.80Hz),4.29(1H,dd,J=9.80,12.7Hz),4.32(1H,d,J=18.8Hz),4.48(1H,dd,J=5.65,12.7Hz),7.22(1H,dd,J=7.50,7.50Hz),7.33-7.38(2H,m),7.94(1H,d,J=7.50Hz)
高分辨率的质谱：C13H13N2O3S2(MH+)
计算值：m/z 309.0368
测定值：m/z 309.0366
实施例4
X是羟基的化合物(6)(3S,10aR)-2,3-二氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
工序1
(3S,5aS,6S,10aR)-2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将乙酰胶霉毒素(154mg,0.418mmol)溶解于乙醇32ml，加入p-甲苯磺酸68mg(0.357mmol)，在100℃搅拌14小时。在减压下除去溶媒，得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷∶甲醇=99∶1)精制，得到淡黄色固体的目的化合物。(50.8mg、收率3796)
1H-NMR(CDCl3)δ:2.94(1H,d,J=18.0Hz),3.1(3H,s),3.74(1H,d,J=18.0Hz),4.10(1H,dd,J=5.78,9.53Hz),4.23(1H,dd,J=9.53,12.6Hz),4.44(1H,dd,J=5.78,12.6Hz),4.81(2H,s),5.77(1H,d,J=9.90Hz),5.87(1H,s),5.90-6.00(2H,m)
FAB MASS:327(MH+)
工序2
(3S,10aR)～2,3-二氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将(3S,5aS,6S,10aR)-2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(50.8mg,0.156mmol)溶解于甲苯3.5ml中,加入o-氯醌37.9mg(0.154mmol)，在100℃搅拌2小时30分钟。加入o-氯醌14.2mg(0.0578mmol)，在100℃搅拌1小时.在减压下除去溶媒，得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷∶醋酸乙酯=8∶2)精制，得到淡黄色固体的目的化合物(30.9mg)。用甲醇重结晶，得到淡黄色结晶(20.1mg、收率4096)。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.27(3H,s),3.31(1H,d,J=18.6Hz),3.33(1H,dd,J=5.70,10.1Hz),4.31(1H,dd,J=10.1,12.9Hz),4.33(1H,d,J=18.6Hz),4.49(1H,dd,J=5.70,12.9Hz),6.82(1H,d,J=7.35Hz),6.90(1H,d,J=8.40Hz),7.15(1H,dd,J=7.35,8.40Hz),10.5(1H,s)
高分辨率的质谱：C13H13N2O4S2(MH+)
计算值：m/z 325.0317
测定值：m/z 325.0330
实施例5
X是乙酰氧基的化合物(13)(3S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
工序1
(3S,5aS,6S,10aR)-2,3,5a,6-四氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4～甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将(3S,5aS,6S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3,5a,6-四氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(489mg,1.00mmol)溶解于乙醇85ml中，加入4N盐酸1,4-二氧杂环己烷溶液4.2ml(16.8mmol)、水4.2ml，回流1小时。在80℃搅拌13小时45分钟后，加入4N盐酸1,4-二氧杂环己烷溶液4.2ml(16.8mmol)回流10小时30分钟。在减压下除去溶剂，在得到的残渣中加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶媒。得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷100％)精制，得到淡黄色固体的目的化合物。(356mg、收率80％)1H-NMR(CDCl3)δ:2.90(1H,d,J=16.8Hz),3.21(3H,s),3.33(1H,d,J=16.8Hz),3.39-3.51(1H,m),3.79(3H,s),3.84(1H,dd,J=9.45,12.7Hz),4.64(1H,dd,J=5.70,12.7Hz),4.88(1H,d,J=12.6Hz),4.95(1H,d,J=12.6Hz),5.25(1H,s),5.76-5.81(1H,m),5.90-5.95(2H,m),6.21(1H,s),6.85(2H,d,J=8.70Hz),7.33(2H,d,J=8.70Hz)ESI MASS:447.1(MH+)
工序2
(3S,10aR)-2,3-二氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
(3S,5aS,6S,10aR)-2,3,5a,6-四氢-6羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(410mg,0.918mmol)溶解于甲苯70ml中，加入o-氯醌238mg(0.968mmol)，在100℃加热2小时30分钟。在减压下除去溶剂，得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷100％)精制，得到379mg淡黄色油状物。在甲醇中滤除不溶成分，得到淡黄色固体的目的化合物(214mg、收率53％)。
1H-NMR(CDCl3)δ:2.73(1H,dd,J=5.18,10.1Hz),3.22(1H,d,J=17.7H z),3.27(3H,s),3.78(3H,s),3.91(1H,dd,J=10.1,12.9Hz),3.95(1H,d,J=17.7Hz),4.69(1H,dd,J=5.18,12.9Hz),5.33(1H,s),6.80(1H,d,J=8.10Hz),6.83(2H,d,J=8.70Hz),6.93(2H,d,J=8.10Hz),7.17(1H,dd,J=8.10,8.10Hz),7.32(2H,d,J=8.70Hz),10.7(1H,s)ESI MASS:445.2(MH+)
工序3
(3S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成。
将(3S,10aR)-2,3-二氢-6-羟基-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(78mg,0.175mmol)溶解于乙腈12ml和二氯甲烷9.5ml的混合溶液，加入碳酸钾2.28g(16.5mmol)，在室温下搅拌10分钟。在其中加入冰醋酸16.5mg(0.175mmol)，在室温搅拌4小时。滤除碳酸钾，在减压下除去溶剂。得到的残渣用硅胶色谱(二氯甲烷∶甲醇=95∶5)精制，用预制硅胶板(二氯甲烷∶甲醇=25∶1,2次展开)精制，得到目的化合物26.8mg。(0.0507mmol，收率29％)
1H-NMR(CDCl3)δ:2.39(3H,s),2.71(1H,dd,J=4.58,10.5Hz),3.24(3H,s),3.32(1H,d,J=17.9Hz),3.77(3H,s),3.83(1H,dd,J=10.5,12.8Hz),4.06(1H,d,J=17.9Hz),4.57(1H,dd,J=4.58,12.8Hz),6.07(1H,s),6.82(2H,d,J=8.85Hz),7.07(1H,d,J=8.10Hz),7.20(1H,d,J=6.60Hz),7.26(1H,dd,J=6.60,8.10Hz),7.40(2H,d,J=8.85Hz)
ESI MASS:509.2(M++Na+)
工序4
(3S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成
将(3S,10aR)-6-乙酰氧基-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(82mg,0.0169mmol)溶解于二氯甲烷12ml，在冰浴中冷却下，加入m-氯过安息香酸35.2mg(0.204mmol)，搅拌10分钟，再加入m-氯过安息香酸19.4mg(0.112mmol)，搅拌25分钟。加二甲基硫48ml(0.654mmol)、高氯酸-甲醇溶液(1∶5)75ml，在室温搅拌1小时30分钟后，再加入高氯酸-甲醇溶液(1∶5)25ml，在室温搅拌2小时。加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷提取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶剂。得到的残渣用预制硅胶板层析(二氯甲烷∶甲醇=25∶1,2次展开)精制后，用甲醇重结晶，得到淡黄色结晶的目的化合物。(24.5mg、收率40％)1H-NMR(CDCl3)δ:2.34(3H,s),3.25(3H,s),3.33(1H,d,J=18.6Hz),3.40(1H,dd,J=5.63,9.98Hz),4.26(1H,dd,J=9.98,12.8Hz),4.39(1H,d,J=18.6Hz),4.40(1H,dd,J=5.63,12.8Hz),7.00-7.05(1H,m),7.21-7.27(2H,m)
高分辨率的质谱：C15H15N2OS2(MH+)
计算值：m/z 367.0422
测定值：m/z 367.0417
实施例6
工序1
X是氰基甲氧基的化合物，(3S,10aR)-6-(氰基甲氧基)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成。
(3S,10aR)-6-(氰基甲氧基)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(20)的合成
将14(74.2mg,0.167mmol)溶解于二甲基甲酰胺10ml中，加入碳酸钾3.13g(22.6mmol)，加入溴代乙腈14μl(0.201mmol)，在室温下搅拌85小时30分钟。滤除碳酸钾，在减压下除去溶媒。得到的残渣用预制硅胶板层析(二氯甲烷∶甲醇=25∶1,2次展开)精制，得到20的黄色固体(14.4mg，收率18％)
1H-NMR(CDCl3)δ 2.88(1H,dd,J=3.00,7.05Hz),3.26(3H,s),3.26(1H,d,J=17.7Hz),3.77(3H,s),3.86(1H,dd,J=7.05,13.1Hz),4.04(1H,d,J=17.7Hz),4.59(1H,dd,J=3.00,13.1Hz),4.89(1H,d,J=16.1Hz),5.08(1H,d,J=16.1Hz),5.44(1H,s),6.82(2H,d,J=8.85Hz),7.12(1H,d,J=7.20Hz),7.21(1H,d,J=7.80Hz),7.29(1H,dd,J=7.20,7.80Hz),7.32(2H,d,J=8.85Hz),ESI MASS,506.3(M+Na+)
工序2
将20(10.5mg,0.0217mmol)溶解于二氯甲烷1ml中，在冰浴中冷却，加入m-氯过安息香酸4.88mg(0.0283mmol)，搅拌25分钟，再加入m-氯过安息香酸2.92mg(0.0169mmol)，搅拌20分钟。加二甲基硫6.6μl(0.0899mmol)、高氯酸-甲醇溶液(1/5)13μl，在室温搅拌3小时后，加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶剂。得到的残渣用预制硅胶板层析(二氯甲烷∶甲醇=25∶1,2次展开)精制后，得到淡黄色固体的化合物21。(4.86mg、收率62％)1H-NMR(CDCl3)δ3.27(3H,s),3.32(1H,d,J=18.5Hz),3.49(1H,dd,J=5.63,9.68Hz),4.30(1H,dd,J=9.68,12.8Hz),4.39(1H,d,J=18.5Hz),4.45(1H,dd,J=5.63,12.8Hz),4.76(2H,s),7.16-7.25(3H,m)；
高分辨率的质谱：C15H14N3O4S2(M++H)
计算值：m/z 364.0462
测定值：m/z 364.0421
实施例7
工序1
X是甲氧羰基甲氧基的化合物(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-6-[(甲氧氧基)甲羟基]-2-甲基-10H-3,10a-桥二硫吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮的合成。
(3S,10aR)-2,3-二氢-3-(羟甲基)-6-[(甲氧羰基)甲氧基]-2-甲基-10H-3,10a-[桥硫-(4-甲氧苯基)亚甲硫基]吡嗪并[1,2-a]吲哚-1,4-二酮(20)的合成
将14(126mg,0.283mmol)溶解于二甲基甲酰胺4ml中，加入碳酸钾2.12g(15.3mmol)，加入溴代乙酸乙酯31μl(0.327mmol)，在室温下搅拌23小时30分钟。加入溴代乙酸乙酯10μl(0.106mmol)，在室温下搅拌13小时30分钟。滤除碳酸钾，在减压下除去溶剂。得到的残渣用预制硅胶板层析(己烷∶乙酸乙酯=1∶1,3次展开)精制，得到标号23的黄色固体(116mg，收率80％)
1H-NMR(CDCl3)δ3.00(1H,dd,J=4.65,10.8Hz),3.23(1H,d,J=17.1Hz),3.26(3H,s),3.77(3H,s),3.81(3H,s),3.85(1H,dd,J=10.8,12.6Hz),4.03(1H,d,J=17.1Hz),4.58(1H,dd,J=4.65,12.6Hz.),4.85(1H,d,J=16.5Hz),4.95(1H,d,J=16.5Hz),5.71(1H,s),6.81(2H,d,J=8.70Hz),6.91(1H,d,J=8.70Hz),6.98(1H,d,J=7.20Hz),7.20(1H,dd,J=7.20,8.70Hz),7.38(2H,d,J=8.70Hz),ESI MASS,517.3(MH+)
工序2
将23(99.5mg,0.193mmol)溶解于二氯甲烷5ml，在冰浴中冷却，加入m-氯过安息香酸41.0mg(0.0238mmol)，搅拌20分钟后，再加入m-氯过安息香酸20.1mg(0.116mmol)，搅拌10分钟，加入m-氯过安息香酸14.0mg(0.0811mmol)，搅拌15分钟。加二甲基硫100μl(1.36mmol)、高氯酸-甲醇溶液(1/5)120μl，在室温搅拌1小时40分钟后，加饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取，将有机层用饱和食盐水洗净，无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶剂。得到的残渣用预制硅胶板层析(二氯甲烷∶甲醇=25∶1,2次展开)精制后，得到淡黄色固体的化合物24。(32.8mg、收率43％)1H-NMR(CDCl3)δ3.26(3H,s),3.29(1H,d,J=18.6Hz),3.60(1H,dd,J=5.48,10.1Hz),3.81(3H,s),4.28(1H,dd,J=10.1,12.8Hz),4.38(1H,d,J=18.6Hz),4.44(1H,dd,J=5.48,12.8Hz),4.65(1H,d,J=15.9Hz),4.70(1H,d,J=15.9Hz),6.98(1H,d,J=8.10Hz),7.04(1H,d,J=7.65Hz),7.17(1H,dd,J=7.65,8.10Hz)；
高分辨率的质谱：C16H17N2O6S2(M++H)
计算值：m/z 397.0528，
测定值：m/z 397.0520。
实施例8
细胞毒性的评价
通过MTT法测定合成的衍生物对于各种癌细胞的抗肿瘤活性。作为癌细胞，可以使用小鼠大肠癌细胞Colon 26((财)癌研究所癌研究会)和小鼠白血病细胞P388(大日本制药)，对于培养来说使用含10％牛胎儿血清的培养基。在96孔微量反应板上用5×103个/50μl/孔播种，添加各浓度的受试品水溶液50μl，在37℃培养3天后，通过MTT法测定活细胞数，制成用量反应曲线。由此曲线算出受试品的50％增殖抑制浓度(IC50)。各化合物的IC50值见表。
化合物     P388IC50[ng/ml]     Colon26IC50[ng/ml]
实施例3的化合物     3.2     58
实施例4的化合物     21     110
实施例5的化合物     13     74
实施例6的化合物     5.8     70
实施例7的化合物     -     82
实施例9
对于固型癌的体内抗癌效果
(A)使用了小鼠大肠癌细胞结肠26的体内评价
购入CDF1小鼠(雌：4周龄)，将在小鼠皮下续代的Colon 26从皮下取出，剪刀剪碎，用trucker移植到CDFI小鼠皮下。以这天作为0天，到第7天用游标卡尺测定肿瘤，算出肿瘤体积，进行分组(各组n=4)。
受试品溶解于二甲基亚砜，用5％吐温80-生理盐水的溶液稀释，吸取0.2ml通过静脉注射或者皮下注射给药。给药时间是在移植后、7天后、11天后、15天后或者7天后、8天后以1日1次进行。在移植后第21天进行肿瘤体积的测定，算出肿瘤体积以及肿瘤增殖抑制率(I.R.)。
肿瘤体积照下述的算式计算。
肿瘤体积[mm3]=短径[mm]2×长径[mm]×(1/2)
肿瘤增殖抑制率(I.R.)照下述的算式计算。
I.R.[％]={1-(给药组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积)}×100
(B)使用了人大肠癌细胞HCT-116的体内评价
购入Balb/c nu/nu(雌：5周龄)，将体内皮下续代的HCT-116(大日本制药)从皮下取出，剪刀剪碎，用trucker移植到CDFI小鼠皮下。以这天作为0天，到第7天用游标卡尺测定肿瘤，算出肿瘤体积，进行分组(各组n=2)。受试品溶解于二甲基亚砜，用5％吐温80-生理盐水的溶液稀释，通过静脉注射或者皮下注射给药。给药时间是在移植后、7天后、11天后、15天后以1日1次进行。在移植后第21天进行肿瘤体积的测定，按上述的算式算出肿瘤体积以及肿瘤增殖抑制率(I.R.)。
对于Colon 26的抗癌效果
  化合物  给药剂量及方法 给药时间   I.R.(第21天) I.R.最大值
  阿霉素     10[mg/kg]×2(i.v.) 第7,14天     38.9 38.9(21天)
实施例2的化合物     2.5[mg/kg]×3(i.p.)5[mg/kg]×3(i.p.)10[mg/kg]×2(i.p.) 第7,11,15天第7,11,15天第7,8天     19.611.826.0 44.9(10天)56.8(9天)68.8(10天)
 实施例3的化合物     2.5[mg/kg]×3(i.p.)5[mg/kg]×3(i.p.) 第7,11,15天第7,11,15天     35.243.7 35.3(8天)51.6(8天)
实施例4的化合物     2.5[mg/kg]×3(i.p.)5[mg/kg]×3(i.p.)10[mg/kg]×2(i.p.) 第7,11,15天第7,11,15天第7,8天  40.152.943.5 54.5(11天)58.9(10天)79.8(10天)
对于HCT116的抗癌效果
化合物 给药剂量及方法 给药时间 I.R.(第21天) I.R.最大值
CDDP  5[mg/kg]×3(i.p.) 第7,11,15天  15.6 47.5(第18天)
实施例4的化合物  5[mg/kg]×3(i.p.) 第7,11,15天  63.8 66.5(第18天)
产业上应用可能性
本发明的胶霉毒素衍生物对于原先药效不理想的固型癌，可发挥优良的药效，在医药产业上是非常有用的。

Claims (11)

1．一种抗癌药，其特征在于含有通式(Ⅰ)表示的胶霉毒素衍生物作为有效成分，
Figure A9719355200021
上述通式中，X表示氢原子、羟基、氰甲氧基、碳原子数1～3的烷氧基、碳原子数2～3的酰氧基、或者甲氧羰甲氧基。
2．权利要求1记载的抗癌药，其中X是氢原子、碳原子数1～3的烷氧基、或者碳原子数2～3的酰氧基。
3．权利要求1记载的抗癌药，其中X是氢原子、羟基或者乙酰氧基。
4．用通式(Ⅰ)表示的胶霉毒素衍生物，
上述通式中，X表示氢原子、碳原子数1～3的烷氧基、或者碳原子数2～3的酰氧基。
5．权利要求4记载的胶霉毒素衍生物，其中X是氢原子或者乙酰氧基。
6．一种抗癌药，其特征在于含有乙酰胶霉毒素作为有效成分。
7．乙酰胶霉毒素的制造方法，其特征在于培养有生产乙酰胶霉毒素能力的微生物，提取生成的乙酰胶霉毒素。
8．权利要求6记载的乙酰胶霉毒素的制造方法，其特征在于有生产乙酰胶霉毒素能力的微生物是属于Dichotomomyces属。
9．权利要求7记载的乙酰胶霉毒素的制造方法，其特征在于有生产乙酰胶霉毒素能力的微生物是Dichotomomyces cejpii FERMBP-5738。
10．乙酰胶霉毒素的制造方法，其特征在于在乙酰胶霉毒素生产菌的培养物中加入吸附剂，使乙酰胶霉毒素吸附，再将吸附剂从培养物分离。
11．乙酰胶霉毒素的制造方法，其特征在于在乙酰胶霉毒素生产菌的培养物中加入能溶解乙酰胶霉毒素的有机溶媒，将乙酰胶霉毒素用该有机溶媒提取。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839130A (zh) * 2012-08-24 2012-12-26 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一株胶霉菌素生产菌株及应用该菌株生产胶霉菌素的方法
CN104870452A (zh) * 2012-10-22 2015-08-26 希望之城 Etp衍生物
CN105010360A (zh) * 2015-07-22 2015-11-04 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种胶霉毒素乳油制剂
CN105884782A (zh) * 2016-04-20 2016-08-24 广东省微生物研究所 一种吲哚二酮哌嗪类化合物的制备方法
CN106317058A (zh) * 2016-08-17 2017-01-11 广东省微生物研究所 化合物dichotocejpin A及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用
CN106818793A (zh) * 2017-01-03 2017-06-13 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 两种胶霉毒素在制备生物农药中的应用
CN113087712A (zh) * 2021-04-12 2021-07-09 郑州大学 L-氨基酸-6-胶霉毒素酯三氟乙酸盐及其制备方法
CN113105479A (zh) * 2021-04-12 2021-07-13 郑州大学 胶霉毒素6-芳香环羧酸酯系列衍生物及其制备方法
US11584760B2 (en) 2016-09-15 2023-02-21 City Of Hope Dithio ETP derivatives

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE325889T1 (de) * 2000-07-07 2006-06-15 Eirx Therapeutics Ltd Screening-verfahren
ITMI20042477A1 (it) * 2004-12-23 2005-03-23 Cell Therapeutics Europe Srl Uso di antibiotici a strutura dichetoditiopiperazinica per la preparazione di composizioni farmaceutiche antiangiogeniche
AT502055B1 (de) 2005-06-21 2007-11-15 Univ Wien Med Anti tumor medikament
KR100936277B1 (ko) * 2007-11-20 2010-01-13 한국과학기술연구원 스핑고모나스 속 박테리아 균주와 아스페질러스 속 곰팡이균주의 혼합배양방법, 이로부터 유래한 신규항암-항생물질인 글리오니트린, 및 상기 글리오니트린 또는이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는약학적 조성물
KR102091730B1 (ko) * 2017-07-05 2020-03-23 바스테라 주식회사 에피디티오디옥소피페라진 화합물 또는 이의 유도체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐동맥고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN111057713A (zh) * 2019-12-18 2020-04-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
CN111073902B (zh) * 2019-12-30 2022-04-26 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839130A (zh) * 2012-08-24 2012-12-26 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一株胶霉菌素生产菌株及应用该菌株生产胶霉菌素的方法
US9856273B2 (en) 2012-10-22 2018-01-02 City Of Hope ETP derivatives
CN104870452A (zh) * 2012-10-22 2015-08-26 希望之城 Etp衍生物
CN108440571A (zh) * 2012-10-22 2018-08-24 希望之城 Etp衍生物
US9527868B2 (en) 2012-10-22 2016-12-27 City Of Hope ETP derivatives
US10246471B2 (en) 2012-10-22 2019-04-02 City Of Hope ETP derivatives
CN105010360B (zh) * 2015-07-22 2017-04-19 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种胶霉毒素乳油制剂
CN105010360A (zh) * 2015-07-22 2015-11-04 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 一种胶霉毒素乳油制剂
CN105884782A (zh) * 2016-04-20 2016-08-24 广东省微生物研究所 一种吲哚二酮哌嗪类化合物的制备方法
CN105884782B (zh) * 2016-04-20 2018-08-17 广东省微生物研究所 一种吲哚二酮哌嗪类化合物的制备方法
CN106317058A (zh) * 2016-08-17 2017-01-11 广东省微生物研究所 化合物dichotocejpin A及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用
US11584760B2 (en) 2016-09-15 2023-02-21 City Of Hope Dithio ETP derivatives
CN106818793A (zh) * 2017-01-03 2017-06-13 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 两种胶霉毒素在制备生物农药中的应用
CN113087712A (zh) * 2021-04-12 2021-07-09 郑州大学 L-氨基酸-6-胶霉毒素酯三氟乙酸盐及其制备方法
CN113105479A (zh) * 2021-04-12 2021-07-13 郑州大学 胶霉毒素6-芳香环羧酸酯系列衍生物及其制备方法
CN113105479B (zh) * 2021-04-12 2022-07-01 郑州大学 胶霉毒素6-芳香环羧酸酯系列衍生物及其制备方法

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