CN1303393A

CN1303393A - 用于闪烁显像术的特异结合分子、含有这些特异分子的偶连物以及用于血管生成治疗的方法

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Publication number: CN1303393A
Application number: CN99806052A
Authority: CN
Inventors: D·尼里; L·塔里; F·维提; M·伯彻勒
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2001-07-11
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: AU4039899A; NZ508600A; DK1084145T3; HUP0102992A3; CA2333833A1; CN1250571C; CZ300495B6; EP1084145A2; HU225675B1; DE69926630T2; SK16792000A3; DE69926630D1; TR200003317T2; EE05435B1; AU759207B2; ATE301676T1; EA200001169A1; EE200000802A; SK286822B6; NO20005694D0

Abstract

本发明涉及对粘连蛋白ED－B结构域的特征表位具有亚纳摩尔特异亲和力的抗体,粘连蛋白为血管生成的一个标志。本发明也涉及到使用放射性标记的高亲和力抗ED－B的抗体来检测体内新形成的血管,以及含有该抗体的诊断试剂盒的使用。此外,本发明也涉及到含有上述抗体和适宜光敏分子(例如,感光剂)的偶连物,以及它们在新生血管检测和/或凝集方面的应用。

Description

用于闪烁显像术的特异结合分子、含有这些特异分子的偶连物以及用于血管生成治疗的方法

本发明涉及对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有亚纳摩尔特异亲和力的抗体，粘连蛋白为血管生成的一个标志。本发明也涉及到使用放射性标记的高亲和力抗ED-B的抗体来检测体内新形成的血管，以及含有该抗体的诊断试剂盒的使用。

此外，本发明也涉及到含有上述抗体和适宜光敏分子(例如，感光剂)的偶连物，以及它们在新生血管检测和/或凝集方面的应用。

如果没有新的血管形成(血管增生)，肿瘤的生长只能局限于一定的大小，对很多肿瘤已报道了微血管密度同肿瘤侵袭力(invasiveness)的相关关系(Folkman(1995).Nature Med.,1,27-31)。此外，血管增生是能够导致很多失明眼病的基础[Lee et.Al.,Surv.Ophthalmol.43,245-269(1998)；Friedlander,M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,9764-9769(1996).]。可选择性识别血管增生标志的分子为诊断和治疗以血管增殖为特征的肿瘤和其它疾病提供了可能，例如糖尿病性视网膜病和年龄相关的黄斑变性。血管增生的标志在大部分的侵袭性固体肿瘤都有表达，可以很容易同静脉内注射的特异结合物结合(Pasqualini et al.(1997).NatureBiotechnol.,15,542-546；Neri et al.(1997),Nature Biotechnol.,15 1271-1275)。对新生血管的靶向阻断可导致肿瘤梗塞和萎陷(O’Reilly et al。(1996).Nature Med.,2,689-692；Huang et al。(1997).Science,275,547-550)。

粘连蛋白的ED-B结构域是一在小鼠、大鼠和人上相同的91个氨基酸序列，通过选择性拼接插入到粘连蛋白分子中，特别是在新生血管结构的周围富积(Castellant et al.(1994).Int.J.Cancer 59,612-618)，并可以作为分子介入的目标。事实上，我们最近用荧光技术表明，抗ED-B的单链Fv抗体片段(scFv)在苯肿瘤小鼠的肿瘤血管中选择性富集，而且抗体的亲和性显然赋予了很好的靶向作用(Neri et al。(1997).NatureBiotechnol.,15 1271-1275；国际专利申请号PCT/GB97/01412，基于GB96/10967.3)。在注射后24小时或以后的时间点对肿瘤靶向作用进行评价。

在本领域已知可使用各种方法产生针对ED-B结构域的抗体从而将它们用于靶向肿瘤。

Peters等(Cell Adhesion and Communication 1995,3:67-89)公开了针对不含FN序列但含完整ED-B结构域的抗原的多克隆抗体，并表明它们可以同该结构域特异、直接地结合。

但是，Peters等人的试剂有一系列的缺点：Peters等人的抗血清仅识别经过N-聚糖酶处理后的ED-B(+)-FN。使得这些试剂不适合于应用到例如肿瘤靶向、显像和治疗，因为去糖基化不能在体内进行。作者自己认识到他们的抗体不识别由哺乳动物细胞产生的全长ED-B(+)-FN。他们也认识到不可能产生针对粘连蛋白ED-B结构域特异的单克隆抗体，尽管已经得到了针对粘连蛋白其它结构域(例如ED-A)的抗体。在本领域众所周知多克隆的抗血清不能用于上述提到的用途。

即使在该领域已经大力开展研究一些年之后，也只能用噬菌体展示技术才能得到用于本发明用途的单克隆抗体，该抗体可以识别不经过N-聚糖酶处理的粘连蛋白ED-B结构域。

Zang等(Matrix Biology 1994,14:623-633)公开了针对犬ED-B结构域的多克隆抗血清。尽管没有经过测试，作者期望它同人ED-B(+)-FN具有交叉反应。但是，作者也认识到产生直接识别粘连蛋白(631页)ED-B结构域的单克隆抗体具有一定的困难。抗血清在Western印迹实验中仅仅识别经N-聚糖酶处理后的ED-B(+)-FN。同上述提到的一样，聚糖酶的处理使得这些试剂不适于本发明中的应用。

在ELISA实验中，不需要去糖基化也可以识别ED-B(+)-FN，但只有用变性剂(4M尿素)从软骨抽提并用明胶附着在塑料上才行。作者评价：“将FN分子经明胶附着在ELISA塑料板的表面可在某种程度上暴露足以抗血清识别的表位”。因为FN在体内应用时不能变性和用明胶附着，因此本发明的单克隆结合物具有明显的优势。

日本专利JP02076598和JP04169195涉及到抗ED-B的抗体。尚不清楚这些文献中是否有关于抗ED-B单克隆抗体的描述。此外，单一的抗体(例如在JP02076598中所描述的抗体)似乎不可能具有“下述公式(1)、(2)或(3)中氨基酸序列的抗原决定子”：

-(1)EGIPIFEDFVDSSVGY

-(2)YTVTGLEPGIDYDIS

-(3)NGGESAPTTLTQQT

根据以下的证据：

ⅰ)一个单克隆抗体应该识别非常(良好)确定的表位。

ⅱ)已经用NMR光谱术测定了粘连蛋白ED-B结构域的三维结构。节段(1)、(2)和(3)位于ED-B结构的相反面，不能同时被一个单克隆抗体结合。

此外，为了证明抗体的可用性，需表明抗体在肿瘤定位以及在生物样品中对ED-B(+)-FN结构染色的证据，这些生物样品没经过可以破坏组织结构的试剂处理。

Carnemolla等在J.Biol.Chem.267,24689-24692中描述的BC1抗体可以识别FN的第7结构域上的表位，但不识别ED-B结构域上的表位，因为后者位于粘连蛋白ED-B结构域的隐蔽部位。该表位具有严格的人特异性。因此，BC1抗体同本发明中的抗体具有不同的反应活性。此外，在不存在完整的ED-B结构域时，BC1抗体可以识别单独的结构域7和结构域7-8(Carnemolla et al.1992,J.Biol.Chem.267,24689-24692)。这样的表位在体内可通过FN分子的水解性降解来产生。本发明试剂的优点是，可以定位FN分子或其片段，只要它包含有ED-B结构域。

对于癌诊断，更具体讲，对于原发和继发肿瘤病症的显像，免疫闪烁显像术是其中的一种技术选择。在此方法中，在用放射性标记的化合物(例如将放射性核素连接在合适的载体上)注射后，对病人用合适的装置显像(例如，伽玛相机)。对于闪烁显像的应用，为了减轻对病人的离子辐射，一般使用半衰期短的伽玛放射体，如锝-99m，碘-123或铟-111。

在核医学上经常使用的放射性核素是锝-99m(99mTc)，它是半衰期为6小时的伽玛放射体。病人在注射基于99mTc的放射性药物后的12-24小时内可以进行显像分析；但是，更期望核素在更早的时间点在目的病灶部位富集。

此外，为了达到更好的诊断和成治疗效果，如果已经能够得到可以对新生血管进行快速和选择性定位的抗体，可以激励研究人员寻找其它合适的能偶连抗体的分子。

考虑到需要在注射后几小时放射性核药物便能够定位肿瘤病灶，而抗体的亲和力可以影响对血管增生的靶向作用，本发明的目的是产生针对粘连蛋白ED-B结构域特异的、并具有亚纳摩尔解离常数的抗体(对于抗体-抗原亲和的定义和测定，参照Neri等(1996).Trends in Biotechnol.14,465-470的综述)。本发明的另一个目的是提供合适形式的放射性标记抗体，该抗体直接针对粘连蛋白的ED-B结构域，可以在注射后几小时来检测肿瘤病灶。

本发明这些目的一方面是对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有特异亲和力的抗体，并且该抗体同上述ED-B表位具有改进了的亲和力。

本发明另一方面是上述抗体用于快速标向血管增生的标志。

本发明的另一方面为含有上述抗体和用于检测血管增生的其它试剂的诊断试剂盒。

本发明的进一步方面是用上述抗体诊断和治疗肿瘤和以血管增殖为特征的疾病。

最后，本发明的重要的一方面是包含上述抗体和和合适光敏分子(例如，慎重选择的感光剂)的偶连物，以及在光介导下对新生血管选择性阻断的应用。

在本发明中应用的技术表达术语定义如下。

-抗体

其描述了免疫球蛋白是否为天然、部分或全部人工合成。该术语也包括具有与抗体结合结构域相同或同源的结合结构域的多肽或蛋白。这些多肽或蛋白可以是天然、部分或全部人工合成而来。抗体的实例为免疫球蛋白的同种型和它们的同种亚类；包含有抗原结合结构域的片段如Fab,scFv,dAb,Fd；和diabodies。也可为单克隆抗体或其它抗体，使用重组DNA技术产生其它抗体或保留了原始抗体特性的嵌和分子。这些技术包括将编码抗体中免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA导入不同免疫球蛋白的不变区或不变区加支架区。参照，例如，EP-A-184187,GB2188638A或EP-A-239400。杂交瘤或其它产生抗体的细胞可经遗传突变或其它改变，这可不改变或改变所产生抗体的结合特性。因为抗体可以经过很多种方法修饰，术语“抗体”应理解为包含任何具有特异结合能力的成员或具有所需特性结合结构域的物质。因此，该术语包括抗体片段、衍生物、功能等价物和抗体的同源物，包括含有免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然或全部或部分人工合成。因此也包括含有同另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌和分子。嵌和抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中有描述。它表明完整抗体的片段可完成结合抗原的功能。结合片段的实例为(ⅰ)包括VL、VH、CL和CH1结构域的Fab片段；(ⅱ)包括VH和CH1结构域的Fd片段；(ⅲ)包括单一抗体VL和VH结构域的Fv片段；(ⅳ)包括VH结构域的dAB片段(Ward et al.(1989)Nature,9,341,544-546.)；(ⅴ)分离的CDR区；(ⅵ)包含两个连接在一起的Fab片段的二价片段F(ab’)2片段；(ⅶ)单链F分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过多肽接头连接在一起，使得两个结构域偶联形成抗原结合位点(Birdet al.(1988)Science,242,423-426.；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-83.)； (ⅷ)双特异单链FV二聚体(PCT/US92/09965)和(ⅸ)“diabodies”。通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90,6444-6448)。Diabodies为多肽的多聚体，每一个多肽包含第一和第二结构域，前者含有免疫球蛋白轻链结合区，后者含有免疫球蛋白重链结合区，两个结构域连接(例如，通过肽接头)在一起但不能相互作用形成抗原结合位点：抗原结合位点是通过多聚体中一个多肽的第一结构域与多聚体中另一个多肽的第二结构域相互作用形成(WO94/13804)。对于双特异抗体的应用，这些是传统的双特异抗体，可以用很多种方式生产(Holliger和Winter(1993),Curr.Opin.Biotech.,4,446-449)，例如化学制备或来自杂交瘤，或是上述提到的任何双特异抗体的片段。优选使用scFv二聚体或diabodies，而非完整的抗体。scFv或diabodies可构建为不含Fc区，仅使用可变区，有效地减轻抗同种型反应。其它形式的双特异抗体包括由Neri等描述((1995)J.Mol.Biol.,246,367-373)的单链CRAbs。

-互补决定区

抗体可变结构域的互补决定区传统上鉴定为超变区的抗体序列，其包含对特异抗原识别所必需的残基。在本发明中，我们参照Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917对CDR的定义和编号。

-功能等价变体

它是指分子(变体)，尽管它具有与另一分子(原体)不同的结构，但它保留了一些重要的同源性，同时至少具有原体分子的一些生物学功能，例如同特定抗原和表位结合的能力。变体可是片段，衍生物或突变体形式。变体、衍生物或突变体的获得可通过对原体分子的修饰如添加、缺失、替代或插入一个或多个氨基酸，或同另一分子连接。这些变化可发生在核苷酸或蛋白水平上。例如，被编码的多肽可以是连接在另一个分子Fc尾巴上的Fab片段。可选择的，可以连接标记物如酶、荧光素等。例如，针对粘连蛋白ED-B结构域特异表位的抗体“A”的功能等价物变体可以是具有不同的互补决定区序列的抗体“B”，但它能够识别抗体“A”的相同表位。

我们已经在抗体噬菌体展示库中分离出对粘连蛋白ED-B结构域特异的重组抗体，该抗体为scFv形式，可在组织切片上识别ED-B(+)粘连蛋白。其中之一的抗体E1已经过亲和力改进产生抗体H10和L19，其具有增强的亲和力。抗体L19对粘连蛋白的ED-B结构域具有亚纳摩尔浓度的解离常数。

高亲和力抗体L19和D1.3(对无关抗原特异的抗体，例如鸡蛋溶菌酶)被放射标记并注射到产生肿瘤的小鼠上。在不同的时间点获得肿瘤、血和器官中的生物学分布，表示为每克组织中注射剂量的百分率(％ID/g)。在注射后3小时，L19的％ID/g(肿瘤)要优于％ID/g(血液)，但阴性对照的D1.3则不是这样。肿瘤：血液比率随时间延长而增加。这说明高亲和力的L19抗体是有用的肿瘤靶向剂，例如用于免疫闪烁显像来检测血管增生。

-感光剂(或光敏剂)

感光剂可定义为，在水和/或氧存在的情况下，分子经辐射后可产生有毒种类分子(例如，单峰氧)，后者可以同生物分子起反应，并因此对生物目标如细胞、组织或体液产生损伤。

能够在高于600nm波长吸收的感光剂特别有用。事实上，光在组织和体液的穿透力在600-900nm的范围内最大[Wan等.(1981)Photochem.Photobiol.34,679-681]。

感光剂在辐射后的靶向导入对治疗血管增生相关疾病是具有很大吸引力的课题(Yarmush,M.L.et al.Antibody Targeted photolysis.Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 10,197-252(1993)；Rowe,P.M.Lancet 351,1496(1998)；Levy,J.Trends Biotechnol.13,14-18(1995))，尤其是对选择性删除眼部新生血管。可以使用的医疗器械如激光光凝固术，在直接或使用感光剂后进行，但具有缺乏选择性的缺点，可导致健康组织和血管的损伤[Macular Photo coagulation Study Group,Arch.Ophtalm.112,480-488(1994)；Haimovici,R et al.,Curr.Eye Res.16,83-90(1997)；Schmidt-Erfurth,U.et al.；Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.236,365-374(1998).]。

在上述提到的论点基础上，可以认识到发现能够改进感光剂选择性和特异性的方法非常的重要，例如将其偶合到合适的载体分子上。开发高质量的载体分子并非轻而易举的事情。此外，可能并非所有的感光剂在体内都能“运输”到目的部位。一些因素例如感光剂的化学结构、可溶性、脂溶性、粘度和效力都可能严重影响到感光剂偶连物的“靶向性”和效能。

我们此处提到的高亲和力抗体L19可特异识别粘连蛋白的ED-B结构域，在眼部血管增生的兔子模型中，在全身给药后可选择性定位新形成的血管。而通过化学方法将L19抗体偶连到感光剂锡(Ⅳ)二氢卟酚e6后，用红光辐射，可选择性介导眼部新生血管阻断和促进相应内皮细胞的凋亡。这些结果表明，可通过免疫化学在体内从现存的血管中区分新生血管，因此强烈的说明辐射后感光剂的靶向传递可有效的治疗失明性疾病和其它同血管增生相关的疾病。

图例简述

本发明的实施方案用下述图例说明，其中

图1显示了设计的抗体噬菌体库；

图2显示了人黑素瘤COLO-38细胞裂解物的双向凝胶分析和Western印迹；

图3A、3B、3C显示了多形性胶质母细胞瘤的免疫组织化学实验；

图4显示了抗体-(ED-B)复合物的稳定性分析。

图5显示了注射放射性标记的抗体片段后，其在肿瘤小鼠的肿瘤中的生物学分布。

图6显示了L19的氨基酸序列；

图7A和7B显示了带有植入片的兔子眼睛；

图8显示了兔角膜切片的组织化学分析；

图9显示了用红色的碱性磷酸酶底物和苏木精对兔子眼睛结构(角膜、虹膜和结膜)切片的免疫组织化学分析；

图10显示了荧光标记的抗体在眼睛新生血管的定位；

图11显示了注射有偶连感光剂的蛋白在辐射前后的兔子眼睛的宏观分析；

图12显示了注射有偶连感光剂的蛋白在红光辐射后的兔子眼睛结构的微观分析。

图例详述

图1显示：

设计的抗体噬菌体展示文库。(a)抗体片段在噬菌体体中展示为pⅢ融合，如示意图所示。在抗体结合位点(抗原的眼部位置)，Vk CDRs骨架为黄色，VH CDR骨架为兰色。随机突变的残基为Vk CDR3的91、93、94和96位(黄色)，和VH CDR3的95、96、97和98位残基(兰色)。这些侧链的Cb原子以更深的颜色显示。同时也显示了CDRl和CDR2的残基(灰色)，这些残基可以突变以改进抗体的亲和力。利用RasMol程序(http://www.chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html)，从pdb文件1igm(Brookhaven Protein DataBank；http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm)建立scFv的结构模型。(b)PCR扩增和文库克隆策略。对原始摸板DP47和DPK22进行修饰(参照文章)产生CDR3区的突变。基因以矩形框表示，CDRs则在矩形框内以数字框表示。然后将VH和VL片段装配并克隆到pDN322噬菌体质粒载体中。在扩增和装配中所用的引物(从SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:18)列于其下。

图2显示

二维凝胶和Western印迹(a)人黑素瘤COLO-38细胞裂解物的2D-PAGE的银染结果，其中加入了含有重组ED-B的7B89。具有两个7B89点(圆圈)是因为用于蛋白纯化的His-tag的部分水解。(b)同图2a凝胶相一致的免疫印迹，其中抗ED-B E1(表1)和M2抗FLAG抗体用作检测试剂。仅能检测到7B89点，证实了从凝胶点中分离出的重组抗体的特异性。

图3A-3C显示：

多形性胶质母细胞瘤的免疫组织化学实验的系列切片，显示了用scFvs E1(A)、A2(B)和G4(C)染色的典型类肾小球血管结构。标尺：20μm。

图4显示：

抗体-(ED-B)复合物的稳定性。ScFvs E1、H10和L19与粘连蛋白ED-B结构域的结合分析。(a)BIAcore sensogram，显示了在抗体亲和力改进后的改善解离图。(b)scFv-(ED-B)复合物的非变性凝胶电泳分析。只有高亲和力的L19抗体可以同荧光标记的抗原形成复合物。荧光检测按照所述进行(Neri et al.(1996)BioTechniques,20,708-712)。

(c)scFv-(ED-B-生物素)复合物同超过一百倍摩尔的未生物素化的ED-B的竞争，用Origen装置进行电化学发光检测。可以观察到半衰期较长的L19-(ED-B)复合物。黑色正方形：L19；开放的三角形：H10。

肿瘤和血液生物学分布表示为每克组织占注射剂量的百分率，对时间作图。同时报告了相关的生物学分布。

图6显示了L19的氨基酸序列，包括重链(VH)、连接子和轻链(VL)。

图7A和7B显示了具有植入片的兔子眼睛，该植入片为用血管原性物质浸泡的聚合物片。

图8显示了具有新生血管的兔角膜切片的组织化学分析，用L19抗体染色。

图9显示了用L19抗体对兔子眼睛结构的免疫组织化学分析。可观察到角膜(a)新生血管结构周围的红色染色，但在虹膜(b)、结膜(c)周围的血管则不染色。小箭头：角膜表皮。相关的血管用大箭头表示。标尺：50μm。

图10显示了荧光标记的抗体在眼睛新生血管的免疫光检测。在注射对FN的ED-B结构域特异的抗体偶连物L19-Cy5(a)的兔子角膜新生血管可观察到强的荧光，但用抗体HyHEL-10-Cy5(b)则观察不到。对角膜切片的免疫荧光显微镜检测证实，L19-Cy5(c)而非HyHEL-10-Cy5(d)定位在角膜周围的新生血管。图(a,b)是抗体注射8小时后；(c,d)则是抗体注射24小时后从兔子分离的角膜切片。P,pellet。

图11显示了用感光剂偶连物处理后兔子眼睛的宏观图象。在注射L19-PS前(a)和用红光(b)辐射后的兔子眼睛。箭头表示凝固的新生血管，进一步证实为辐射后16小时在道(c)Cy5荧光血管造影中的超荧光区。注意在其它血管结构中没有观察到凝固，例如在膨胀的结膜血管。作为对比，具有超荧光渗露血管的Cy5荧光血管造影和未处理的兔子眼睛着色图显示在(d)和(h)。图(e、f、g)同(a、b、c)相似，但对应于注射卵白蛋白-PS并用红光辐射。没观察到凝固且血管造影照片显示渗露血管的超荧光。注射有L19-PS并具有早期血管增生的兔子眼睛显示在(i-j)。在红光辐射前(i)和辐射后16小时(j)的图象显示了广泛的具选择性的光诱导血管内凝固(箭头)。血管阻塞(箭头)在红光辐射(i)后立即处死的兔子眼睛犹为明显，但在没有经过辐射的相同兔子则观察不到。P，小丸(小球)(pellet)。箭头表示角膜-巩膜连接(缘)。在所有图中，可见事先存在的膨胀结膜血管位于角膜-巩膜连接之上，而角膜新生血管的生长则从角膜-巩膜连接到pellet(P)。

图12显示了选择性血管阻塞的显微分析。注射卵白蛋白-PS(a、e、I)或L19-PS并经辐射的兔子角膜(a、e、b、f：没固定；I、j：甲醛固定)的H/E切片。大的箭头表示代表性的未损伤(e、I)或完全阻塞(f,j)的血管。同L19-PS在辐射后(b、f、j)介导的对角膜新生血管的选择性阻塞和限制性的周边性血管损伤(嗜酸粒细胞增多)相比，在相同兔子的结膜(k)和虹膜(I)没有损伤的症状。荧光TUNEL分析显示了注射L19-PS(c,g)或卵白蛋白-PS(d,h)后经辐射兔子不同数目的凋亡细胞。大的箭头表示一些相关的血管结构。小箭头表示角膜表皮。标尺：100μm和25μm。

本发明通过下面实施例进行更直接描述。

实施例1

从抗体噬菌体展示库中分离对粘连蛋白ED-B结构域特异的人scFv抗体片段

用VH(DP47；Tomlinson et al.(1992).J.Mol.Biol.,227,776-798.)和Vk(DPK22；Cox et al.(1994).Eur.J.Immunol.,24,827-836)种系基因(参照图1的克隆和扩增策略)克隆人抗体库。以部分简并引物(图1)(从SEQ ID NO:11到SEQ ID NO:18)用基于PCR的方法在CDR3的95-98位引入随机突变，从而产生文库VH成分。而文库VL成分是用相同的方法在CDR3的91、93、94和96位引入随机突变而来。PCR方法按照所描述的方法进行(Marks et al.(1991).J.Mol.Biol.,222,581-597)。VH-VL scFv片段的装配用PCR的方法(图1；Clackson et al.(1991).Nature,352,624-628)，对凝胶纯化的VH和VL片段进行。30μg的VH-VL scFv片段用各300单位的NcoⅠ和NotⅠ进行双酶切，然后连接到经15μg同样两种酶消化的pDN322噬菌体质粒载体中。PDN322是噬菌体质粒pHEN1(Hoogenboom et al.(1991).Nucl.Acids Res.,19,4133-4137)的衍生物，其中在NotⅠ位点和基因Ⅲ之前的琥珀密码子之间的序列用下述的序列代替，该序列用于编码D3SD3-FLAG-His6 tag(Neri et al.(1996).Nature Biotechnology,14,385-390):

Notl D D D S D D D

Y K D D

5’-GCGGCCGCAGATGACGATTCCGACGATGACTACAAGGACGAC

D D K H H H H H H amber

GACGACAAGCACCATCACCATCACCAT TAG-3＇

根据Marks等(1991.J.Mol.Biol.,222,581-597)的方法转化到TG1大肠杆菌菌株，并根据标准方案(Nissim et al.(1991).J.Mol.Biol.,222,581-597)制备噬菌体。随机筛选5个克隆并测序检测是否出现蔓延(pervasive)污染。

重组的粘连蛋白片段ED-B和7B89，分别包含1和4个Ⅲ型同源重复，按照所述的方法(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405)，在pQE-12基于的表达载体中(Qiagen,Chatsworth,CA,USA)表达。

用N-羟基琥珀酰亚胺酯生物素二硫化物(试剂B-4531；Sigma,Buchs,Switzerland；10)生物素化的抗原以10nM的浓度筛选重组的粘连蛋白ED-B结构域(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405,Zardi et al.(1987).EMBO J.,6,2337-2342)，然后从二维凝胶中洗脱，用链霉素包被的Dynabeads进行捕捉(Dunal,Oslo,Norway)。在每轮1ml筛选反应中用1013噬菌体。噬菌体与抗原在2％的牛奶/PBS(MPBS)中孵育10分钟。然后在该溶液中加入事先用MPBS阻断的100μl的Dynabeads(10mg/ml；Dynal,Oslo,Norway)。混合5分钟后，用磁化从溶液中分离珠子，并用PBS-0.1％Tween-20(PBST)和PBS分别洗涤7次和3次。孵育2分钟洗脱，使用500al 50mM的二硫苏糖醇(DTT)来减少抗原和生物素之间的二硫键。重新捕捉珠子，得到的溶液用于感染处于指数生长期的TG1大肠杆菌细胞。经过3轮淘选之后，洗脱的噬菌体用于感染指数生长的HB2151大肠杆菌细胞并在1.5％琼脂板上(2×TY+1％葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素)铺板。挑取单克隆，在2×TY+1％葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素中培养，在30度用1mM的IPTG诱导过夜使其表达抗体。得到的上清用链霉素包被的微孔板用10nM的生物素化ED-B处理，用ELISA进行筛选，所用检测试剂为抗FLAG M2的抗体(IBI Kodak,New Haven,CT)。本方法筛选中，32％的筛选克隆为阳性，对其中三个具有最强ELISA信号(E1、A2和G4)的克隆进一步测序、定性。

ELISA实验所用的试剂有：从凝胶点上回收的生物素化ED-B、未变性的ED-B、同粘连蛋白中邻近结构域相连的ED-B(含有7B89结构域的重组蛋白)和许多无关抗原。抗体E1、A2和G4可以同所有三个含ED-B的蛋白起特异而强烈的反应。该结果，加上三个重组抗体均可用ED-B亲和层析柱从细菌上清中纯化的事实，说明他们可识别ED-B天然结构中的表位。用不包含ED-B结构域的粘连蛋白片段没有检测到反应(结果未显示)。为了检验从针对凝胶点分离的抗体是否同天然抗原具有很好的亲和力，用表面胞质基因组共振在BIAcore仪器上按所述方法(Neri etal.(1997)Nature Biotechnol.,15,1271-1275)进行实际时间分析。单体部分的E1、A2和G4 scFv片段同ED-B的亲和力在197-108M-1范围之内(表1)。

为了进一步检测抗体的特异性和可用性，进行了二维PAGE免疫印迹，其中在凝胶上走人黑色素瘤细胞系COLO-38的细胞裂解物，其中已加入少量含ED-B的重组7B89蛋白(图2)。ScFv(E1)仅在7B89点有强而特异的染色。

用E1、A2和G4抗体对多形性胶质细胞瘤的低温切片上含ED-B的粘连蛋白进行了免疫定位，该疾病为侵袭性人脑细胞肿瘤，伴随明显的血管增殖过程。图3显示了多形性胶质细胞瘤的系列切片，其中有被三个抗体染成红色的典型类肾小球结构的血管。按所描述的方法(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405,Castellani et al.(1994).Int.J.Cancer,59,612-618)，手术程序取样后，立即将多形性胶质细胞瘤冻于液氮中，进行切片免疫定位。简言之，用M2抗FLAG抗体(IBI Kodak)、生物素化的抗鼠多克隆抗体(Sigma)、链霉素-生物素碱性磷酸酶复合物染色试剂盒(BioSpa,Milan,Italy)和萘酚-AS-MX-磷酸和快速红TR(Sigma)进行免疫染色。用Gill’s苏木精对染，然后按以前所述(Castellani et al.(1994).Int.J.Cancer,59,612-618)用甘油凝胶(Dako,Carpenteria,CA)封片。

使用相似的技术和抗体L19(参照另一个样品)，我们同样可以对新生血管特异染色，这些血管的产生可通过在兔子角膜植入用血管源性物质浸泡的聚合物pellet来诱导，例如血管内皮生长因子或佛波酯。

实施例2

对ED-B具有亚纳摩尔亲和力结合的人scFv抗体片段的分离

选择scFv(E1)来检验其与有限数量突变CDR残基结合改善的可能性，CDR位于抗原结合位点的外周(图1A)。我们同时将抗体VH的31-33、50、52和54残基突变，并在相应的丝状噬菌体中显示相应的所有组成成分。在抗原-抗体复合物的三维结构中，已发现这些残基经常同抗原接触。在得到的含4×10⁸克隆的所有组成成分中，进一步筛选同粘连蛋白ED-B结构域结合的克隆。在对96个克隆两轮陶选和筛选之后，分离到亲和力改进了27倍的抗体(H10；表1和2)。同其它观察到的亲和力改进的抗体相似，改善的亲和力是因为同抗原解离的变慢，并非改善了kon值(Schier et al.(1996).Gene,169,147-155,Ito(1995).J.Mol.Biol.,248,729-732)。一般认为，抗体轻链很少参与同抗原的亲和力，因为缺乏轻链的天然或人工抗体仍能同抗原结合(Ward et al.(1989)Nature,341,544-546,Hamers-Casterman et al.(1993).Nature,363,446-448)。因此我们随机选取VL结构域的两个残基(32和50)，正好位于抗原结合位点(图1a)的中心，并且在3D结构中同抗原接触。得到的含有400个克隆的文库在噬菌体中展示，筛选同抗原的结合克隆。通过用BIAcore仪器(Jonsson etal.(1991).BioTechniques,11,620-627)对实际时间相互作用的研究，对解离图的分析和电化学发光检测的竞争实验对koff值进行测定，鉴定出克隆(L19)，同粘连蛋白ED-B结构域的Kd=54pM(表1和2)。亲和力改进实验按照下述进行。ScFv(E1)的基因是用下列引物扩增的PCR：在VH(数目：28)的CDR1的31-33位引入随机突变的引物LMB1bis (5’-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3’)(SEQ ID NO:1)和DP47CDR1for(5’-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNMNNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3’)(SEQ ID NO:2)，在VH的CDR2的50、52、54位引入随机突变的引物DP47CDR1back(5’-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3’)(SEQ ID NO:3)和DP47CDR2for(5’-GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACTACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3’)(SEQID NO:4)。覆盖VH基因3’部分、肽接头和VL基因的剩下的scFV基因片段，用引物DP47CDR2back(5’-ACA TAC TAC GCA GAC TCCGTG AAG-3’)(SEQ ID NO:5)和JforNot(5’-TCA TTC TCG ACT TGCGGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3’)(SEQ ID NO:6)(94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟)扩增。得到的3个PCR产物用凝胶纯化并用带引物LMB1bis和JforNot的PCR装配(94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟)。从PCR混合物中纯化单一的PCR产物，用NotⅠ/NcoⅠ双酶切，连接到经过相同酶双酶切的pDN332载体。在连接混合物中用大约9μg载体和3μg插入物，酚抽提纯化，乙醇沉淀并重悬在50μl的灭菌水中，用电穿孔转染TGI E.coli细胞。得到的亲和力改进文库含4×10⁸个克隆。按照描述的方法得到(Nissim et al.(1994).EMBO J.,13,692-698)抗体-噬菌体颗粒在7B89包被的免疫管中进行第一轮筛选(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405)。筛选到的克隆用于第二轮陶汰筛选，使用生物素化的ED-B，然后用链霉素包被的磁珠捕捉(Dynal,Oslo,Norway；参照以前的段落)。筛选后，大约25％的克隆在可溶性ELISA(参照以前章节的实验程序)为阳性。从ELISA阳性侯选克隆中，我们进一步用BIAcore分析(Jonsson et al.(1991)，BioTechniques,11,620-627)鉴定出具有最低koff值的一个克隆(H10；表1)。

ScFv(E1)的基因是用下面引物扩增的PCR：在VL(for numbering：Chothia and Lesk (1981)J.MOl.Biol.,196,901-917)的CDR1的32位引入随机突变的引物LMB1bis和DPKCDR1for(5’-G TTT CTG CTG GTACCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G)(SEQID NO:7)和引物DPKCDR1back(5’-TTA GCC TGG TAC CAG CAGAAA CC-3’)(SEQ ID NO:8)和在VL的CDR2的50位引入随机突变的DP47CDR2for (5’-GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATAGAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3’)(SEQ ID NO:9)。剩下的scFV基因片段用寡DPKCDR2back(5’-GCA TCC AGC AGG GCC ACTGGC-3’)(SEQ ID NO:10)和JforNot(94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟)扩增。得到的3个PCR产物进行装配、消化并按照上述突变重链的方法克隆到pDN332。得到的文库用含有3％BSA的生物素化ED-B孵育30分钟，然后用链霉素包被的微孔板(Boheringer Mannheim GmbH,Germany)捕捉10分钟。用20mM的DTT(1,4-二硫-DL-苏硫醇，Fluka)洗脱噬菌体，感染指数生长的TG1细胞。用ELISA分析得到上清可以同ED-B结合的96个克隆，用BIAcore分析则鉴定出L19克隆。抗-ED-B E1、G4、A2和L19抗体片段在侵袭性肿瘤(图3)的新生血管中可选择性染色。

按Pini等((1997),J.Immunol.Meth.,206,171-182)前述的方法将单一新鲜的菌落接种到1升2×TY培养基中，得到上述的抗ED-B的片段，然后在CNBr激活的琼脂糖凝胶(sepharose)柱子(Pharmacia，Uppsala,Sweden)上亲和纯化，该柱子上已经偶连了10mg含ED-B的7B89重组蛋白(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405)。上样后，用50ml平衡缓冲液(PBS,1mM EDTA,0.5M NaCl)洗涤。然后用100mM的三乙胺洗脱抗体片段，立即用pH7.0的Hepes中和，在PBS中进行透析。用所述(Neri et al.(1997).Nature Biotechnol.,151271-1275)[图4]的方法用纯化抗体通过BIAcote进行亲和力测定。然后按照所述的方法(Neri et al.(1997).Nature Biotechnol.14,385-390)，使用在N末端(Carnemolla et al.(1996).Int.J.Cancer,68,397-405,Neriet al.(1997).Nature Biotechnol.,15 1271-1275)以红外荧光基团Cy5(Amersham)[图4]荧光标记的重组ED-B进行迁移率改变实验分析。对于缓慢解离的反应，BIAcore分析并不总是足以精确测定其动力学参数，因为存在可能的重新结合的影响、基线的不稳定性以及在确定在单一指数趋势后解离相需要较长的时间。因此我们用竞争实验(Neri et al.(1996)，Trends in Biotedhnol.,14,465-470)[图4]进行了动力学解离常数koff值的测定。简言之，按照所述方法(Deaver,D.R.(1995).Nature,377,758-760)在钌复合物标记的M2抗FLAG抗体(0.5ug/ml)和多克隆的抗鼠IgG(Sigma)存在的情况下，抗ED-B抗体(30nM)与生物素化的ED-B(10nM)共同孵育10分钟。与此溶液平行的实验是在不同的时间加入未生物素化的ED-B(1μM)。然后加入在Origen Assay缓冲液中稀释(Deaver,D.R.(1995).Nature,377,758-760)的链霉素包被二联玻珠(20ul,1mg/ml),得到的混合物用ORIGEN Analyzer(IGEN Inc.Gaithersburg,MD USA)进行分析。该仪器检测到的电化学发光信号(ECL)同在竞争反应后仍然结合生物素化ED-B的scFv片段的量呈正相关。用ECL信号对竞争时间作图，可以得到与特征性常数koff对应的单一指数[图4；6表2]。

实施例3

用高亲和性的对粘连蛋白ED-B结构域特异的放射性标记scFv对肿瘤进行靶向

放射性标记的scFv(L19)或scFv(D1.3)(一对鸡蛋溶菌酶特异的无关抗体)静脉注射或皮下植入到F9畸胎瘤小鼠，该肿瘤为快速生长的侵袭性肿瘤。在不同时间点获得抗体的生物学分布(图4)。scFv(L19)或scFv(D1.3)在抗原柱(Neri et al.(1997),Nature Biotechnol.15,1271-1273)上亲和纯化，然后按lodogen方法用碘-125进行放射性标记(Pierce,Rockford,IL,USA)。通过将放射性标记的抗体上样到抗原柱，然后对流过和洗脱部分的放射性进行计算，可估算放射性标记的抗体保持了＞80％的免疫反应活性。对皮下植入了F9鼠畸胎瘤(Neri et al.(1997)NatureBiotechnol.15,1271-1273)的裸鼠注射溶解在100ul盐溶液中的3μg(3-4uCi)scFv。肿瘤的大小为50-250mg，因为更大的肿瘤具有坏死中心。但是，用较大肿瘤(300-600mg)进行的靶向实验可得到相同的结果。每个时间点用3只小鼠。人为杀死小鼠，对器官称重并测定放射性。代表器官的靶向结果表示为每克组织注射抗体剂量的百分率(％ID/g)。ScFv(L19)快速经过肾脏从血中流失；同一般抗体不同的是，它不在肝脏和其它器官累积。在注射后3小时，每克组织注射剂量的百分率为8％的定位在肿瘤；随后该数值的减少是因为在24-48小时之内，肿瘤的大小增大一倍。对L19，在注射后3、5和24小时后的肿瘤∶血液的比率分别为1.9、3.9和11.8，但对阴性对照抗体，该数值一直低于1.0。

在注射后数小时，放射性标记的scFv(L19)优先定位在肿瘤，说明它对血管增生病人的免疫闪烁显像是有用的。

实施例4

抗ED-B抗体可选择性对新生的眼部血管染色

血管增生，即从事先存在的血管形成新的血管，是很多疾病的一个特征过程，包括癌和导致失明的大部分眼部疾患。对新生血管的选择性靶向和阻断可以为诊断和治疗提供可能。

我们检测了B-FN是否为眼部血管增生的一特异标志，并检测了在全身给药后，识别B-FN的抗体是否可在体内选择性的靶向眼部的新生血管。为了达到此目的，我们通过手术植入含血管内皮生长因子或佛波酯的小丸(pellet)(图7)，在兔子角膜刺激血管增生，从而可直接观察到新生血管。按照所述方法[D’Amato,R.J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,4082-4085(1994)]，将含有800纳克血管内皮生长因子(Sigma)或400n纳克的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(“PMA”；Sigma)的硫酸铝(德国Darmstadt的Merck惠赠)/海昌小丸植入到New ZealandWhite雌性兔子的角膜。两种因子均可诱导血管增生。每天监测兔子。由两种诱导剂诱导的新形成血管在免疫组织化学中具有强烈的ED-B阳性信号。对于所有进一步的实验，均使用PMA小丸。

免疫组织化学研究表明L19在兔子眼角膜(图8；9a)诱导的新生血管具有强烈的染色，但在事先存在的眼部血管(图9b、c)和其它组织(结果未显示)则没有。免疫组织化学按照所述进行[Carnemolla,B.et al.,Int.J.Cancer 68,397-405(1996)]。

实施例5

人抗体片段L19与ED-B具有亚纳摩尔亲和力，可在体内靶向眼部血管增生

使用上面所描述实施例中的兔子角膜血管增生的模型，以及免疫光检测方法[Neri et al.,Nature Biotechnol.15,1271-1275(1997)]，我们证明，L19与红色的荧光基团Cy5的化学偶连物在静脉注射后，可选择性的靶向眼部血管增生，而针对无关抗原的抗体片段(HyHEL-10)-Cy5则不能。在L19注射后，可很快在生长的眼部血管清晰地检测到荧光染色，并同以前在肿瘤血管增生中观察到的类似，可持续至少两天。随后用离体角膜切片的免疫荧光显微镜分析进一步证实，L19而非HyHEL-10，定位在血管结构的周围(图10c、d)。基于抗体对眼部新生血管的选择性靶向的证实，加之抗B-FN抗体在不同种都具有反应性，保证了将来临床的应用。免疫荧光显像对处于危险状况病人症状在荧光血管造影检测到之前，对眼部血管增生的早期检测非常有用。

一些方法细节：

对于离体免疫荧光和一些H/E染色，在包埋之前，角膜在4％多聚甲醛的PBS中固定。用于荧光光检测实验的兔子用5mg/ml的乙酰丙嗪镇静。对于靶向实验，每只兔子静脉内注射3.5mg的scFv(L19)₁-Cy5_0.66和2.8mg的seFv(HyHEL-10)₁-Cy_50.83(注射时间=15分钟)。在注射L19后，立即可以在角膜新生血管观察到强的荧光信号，并且能持续几小时，而在HyHEL-10则不能。作为额外检测特异性的实验，对于注射scFv(HyHEL-10)-Cy5并且荧光光检测为阴性的兔子，在第二天注射scFv(L19)-Cy5之后，在角膜血管增生部位可显示强的荧光染色。

对于荧光检测，眼睛用装配有Cy5-激发滤镜和两个光引导的钨卤灯(model Schott KL1500；Zeiss,Jena,Germany)照射，距离眼睛最远2厘米。荧光用该C-5985单色CCD相机(Hamamatsu,Hamamatsu-City,Japan)检测，该相机装配有C-mount Canon Zoom Lens(6×16；16-100mm；1∶1.9)和50mm直径的Cy5发射滤镜(Chroma)，置于被照射眼睛的3-4cm远。掌握时间为0.4秒。

Cy5荧光血管造影实验用相同的实验设备，但静脉内注射0.25mg的Cy5-Tris(Cy5-NHS和tris[三羟甲基氨基甲烷]的反应产物；注射时间=5s)。掌握时间为0.2秒。

抗体片段以scFv形式。ScFv(L19)和scFv(HyHEL-10)的纯化和用吲哚花青染料的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的标记在别处有描述[Neri,D.Et al.,Nature Biotechnol.15,1271-1275(1997)；Fattorusso,R.,et al.(1999)Structure,7,381-390]。两个抗体的抗体：Cy5的标记比率分别为1.5∶1和1.2∶1。Cy5-NHS购自Amersham Pharmacia Biotech(Zurich,Switzerland)，卵白蛋白购自Sigma(Buchs,Switzerland)。

在标记反应后，抗体偶连物从未整和的荧光素和感光剂中的分离使用PD-10柱子(Amersham Pharmacia Biotech)，该柱子用50mM的磷酸盐，pH7.4,100mM的NaCl(PBS)平衡。抗体偶连物的免疫反应活性用偶连有抗原的亲和层析柱子测定[Neri,D.Et al.,Nature Biotechnol.15,1271-1275(1997)]，在所有情况下都大于78％。免疫偶连物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其迁移带相当于分子量=30,000道尔顿(纯度90％)。

实施例6

人抗体片段L19与感光剂氯化锡(Ⅳ)e6的化学偶连物可选择性靶向眼部血管增生，并在红光辐射后介导对血管增生的阻断

为了检测抗体介导的靶向是否可达到选择性删除血管的目的，我们用和感光剂氯化锡(Ⅳ)e6化学偶合的L19抗体片段和在新生血管中无定位的蛋白(卵白蛋白)注射兔子。然后用红光(光剂量=78J/cm²)辐射接受注射兔子的眼睛。图11给出了代表性的结果。在用L19-PS注射并辐射16小时之后的兔子(图11a、b)，可观察到显著的差别：在角膜新生血管有凝固，而在结膜和其它眼部结构则没有。用吲哚花青荧光团Cy5(图11c)的荧光血管造影证实，血管阻塞可作为超荧光区的一个特征。相反，在没经辐射兔子眼睛的渗露新生血管中也观察到了超荧光区(图11d、h)。而在注射卵白蛋白-PS并经过辐射的兔子眼睛，则检测不到这种改变(图11e-g)，无论是用眼科显微或Cy5荧光团。辐射对靶向L19-PS偶连物在角膜血管增生早期的影响显示在图11i-l。在活的动物，可肉眼观察到选择性的凝固血管(图11I、j)，而在立即处死后的动物则更明显。

用显微技术可进一步观察光动力损伤。辐射后，在注射L19-PS的动物(图11b、f、j)的没经固定或多聚甲醛固定的角膜切片均可用标准的苏木精/伊红(H/E)染色检测到血管阻塞，而在卵白蛋白-PS处理的动物则没有(图11a、e、I)。用荧光TUNEL分析可清晰地看到被感光剂偶连物靶向的角膜细胞凋亡(图11c、g)，但在阴性对照则几乎检测不到(图11d、h)。更高的放大倍数可观察到血管结构中内皮细胞的凋亡(图11g)。在处理动物的虹膜、巩膜和结膜则观察不到血管损伤，无论是TUNEL分析(未显示)还是H/E染色(图11k、l)。

选择性的光动力对新生血管的删除对于治疗眼部疾患和其它血管增生相关的疾病具有很好的前景，只要这些疾病容易用光慢射或光纤维进行辐射。该研究结果证明，眼部新生血管可被选择性阻断，而不损伤事先存在的血管或正常组织。

一些方法细节：

氯化锡(Ⅳ)e₆是从一系列感光剂中选择出来的，根据它们同兔抗鼠多克隆抗体(Sigma)结合后的效能、可溶性和特异性。然后根据这些免疫偶连物对包被有针对人CD47特异单克隆抗体(#313441A；Pharmingen,San Diego CA,U.S.A.)的红细胞的光裂解作用来进行筛选。氯化锡(Ⅳ)e₆的制备按照所述进行[Lu,X.M.et al.,J.Immunol.Methods156,85-99(1992)]。对于偶连到蛋白，首先将氯化锡(Ⅳ)e₆(2mg/ml)在室温下的二甲基甲酰胺中同10倍摩尔比的EDC(N’-3-二甲基氨基丙基-N-乙基碳二酰亚胺盐酸盐，Sigma)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，Sigma)混合30分钟。得到的激活混合物加入到8倍体积的蛋白溶液(1mg/ml)中，在室温孵育1小时。

在标记反应后，用PD-10柱子(Amersham Pharmacia Biotech)从未整和的荧光素和感光剂中分离抗体偶连物，柱子用50mM磷酸盐，pH7.4,100mM NaCl(PBS)平衡。抗体偶连物免疫活性的检测按照前述实施例中的描述进行。

对于光杀灭实验，对兔子静脉注射12mg的scFv(L19)₁-氯化锡(Ⅳ)e₆或38mg卵白蛋白-氯化锡(Ⅳ)e₆，后续实验均在黑暗中进行。注射8小时后，用氯胺酮(35mg/kg)/赛拉嗪(5mg/kg)/乙酰丙嗪(1mg/kg)麻醉，然后用一装备有Cy5滤镜(Chroma)和两个光引导的Schott KL1500钨卤灯辐射兔子其中一只眼睛，同兔眼相距1cm。辐射区域大约1平方厘米，辐射强度密度为100mW/平方厘米，用SL818光检测器测定(NewportCorp.,Irvine,CA,U.S.A.)。在辐射后没有观察到动物不适的征兆。作为预防措施，在辐射后对兔子进行镇痛(丁丙诺啡，0.03mg/kg)。为了监测光杀灭，用检眼镜对兔子眼睛进行观察，并用一fundus相机KOWA SL-14(GMP SA,Rennens,Lausanne,Switzerland)照相。每个氯化锡(Ⅳ)e₆偶连物处理5只兔子，仅辐射兔子双眼中的一只，另外一只眼睛作为阴性对照。另外设的对照为，两只兔子仅接受辐射，但没经感光剂偶连物处理。

在用大剂量的镇痛剂使兔子处死后，立即摘除眼睛，去除角膜，在Tissue Tek(Sakura Finetechnical,Tokyo,Japan)中包埋。对于离体免疫荧光和一些H/E染色，角膜在包埋前先用含4％多聚甲醛的PBS中固定。5μm的Cryostat切片用于进一步的显微镜分析。荧光TUNEL实验按照厂商的说明进行(Roche Diagnostic,Rotkreuz,Switzerland)。

表1：

筛选到的抗ED-B抗体克隆的序列VH链 VL链克隆 31-33^* 50-54^* 95-98^* 32^* 50^* 91-96^*A2 SYA AISGSG GLSI Y G NGWYPWG4 SYA AISGSG SFSF Y G GGWLPYE1 SYA AISGSG FPFY Y G TGRIPPH10 SFS SIRGSS FPFY Y G TGRIPPL19 SFS SIRGSS FPFY Y Y TGRIPP

从设计的合成文库中分离抗体克隆的相关氨基酸位置(*：根据Tomlinson et al.(1995)EMBO J.,14,4623-4638的计数方法)。单一的氨基酸代码根据标准的IUPAC命名。

表2：

抗ED-B scFv片段的亲和力克隆 kon(s^-1M^-1) koff(s^-1)^B koff(s^-1)^C Kd(M)^*A2 1.5×10⁵ 2.8×10^-3 - 1.9×10^-8G4 4.0×10⁴ 3.5×10^-3 - 8.7×10^-8E1 1.6×10⁵ 6.5×10^-3 - 4.1×10^-8H10 6.7×10⁴ 5.6×10^-4 9.9×10^-5 1.5×10^-9L19 1.1×10⁵ 9.6×10^-5 6.0×10^-6 5.4×10^-11

*)Kd=k_off/k_on。对于高亲和力结合物H10和L19，根据BIAcore实验而来的k_off值并不可靠，因为带阴电荷羧化的固相葡聚糖基质的影响；因此Kd值中k_off的计算来自竞争实验(实验程序)中的测定。k_off，动力学解离常数；k_on，动力学结合常数；Kd，解离常数。B=在BIAcore中的测定；C=在竞争实验中电化学发光检测的测定。数值在浓度测定精确的基础上精确度+/-50％。

序列表<110>EIDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH<120>用于闪烁成像的特异结合分子、包含这些特异分子的偶联物以及

用于治疗血管增生的方法<130>1900PTEP<140><141><150>US 09/075,338<151>1998-05-11<150>US<151>1999-04-28<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

LMBlbis<400>1gcggcccagc cggccatggc cgag 24<210>2<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DP47CDR1for<400>2gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 54<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DP47CDR1back<400>3atgagctggg tccgccaggc tcc 23<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DP47CDR2for<400>4gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60<210>5<211>24<212> DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DP47CDR2back<400>5acatactacg cagactccgt gaag 24<210>6<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

JforNot<400>6tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg 53<210>7<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPKCDR1for<400>7gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPKCDR1back<400>8ttagcctggt accagcagaa acc 23<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPKCDR2for<400>9gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPKCDR2back<400>10gcatccagca gggccactgg c 21<210>11<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DP47baNco<400>11gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45<210>12<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

CDR3for<400>12ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg 55<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

VHpu11th<400>13

24gcggcccagc atgccatggc cgag<210>14<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

Jassm<400>14cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca 60gtagtc 66<210>15<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPK22assm<400>15gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt gacgcagtct 60cc 62<210>16<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

DPK3for<400>16caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac agtaatacac 60tgc 63<210>17<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

Jfornot<400>17gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc cgaacg 56<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物

VLpu11th<400>18gatgggtcca gtggcggtag cggg 24<210>19<211>116<212>PRT<213>粘连蛋白ED-B结构域特异的VH抗体<400>19Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

36Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ash Ser Lys Ash Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met ASh Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110Thr Val Ser Ser

115<210>20<211>14<212>PRT<213>抗体连接子<400>20Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly1 5 10<210>21<211>108<212>PRT<213>粘连蛋白ED-B结构域特异VL抗体<400>21Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1．对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有特异亲和力的抗体，其中抗体对该ED-B表位具有改善了的亲和力。

2．权利要求1中抗体，其中抗体的亲和力在亚纳摩尔范围。

3．权利要求1中抗体，其中抗体识别ED-B(+)粘连蛋白。

4．权利要求1中抗体，其中抗体以scFv形式。

5．权利要求4中抗体，其中抗体为重组抗体。

6．权利要求4中抗体，其中亲和力通过在CDR残基中引入一定数目的突变改进。

7．权利要求6中抗体，其中抗体已突变残基为VH的31-33、50、52和54位，VL的32和50位。

8．权利要求1中抗体，其中抗体同粘连蛋白ED-B结构域的结合Kd值为27-54pM，最优选Kd为54pM。

9．权利要求1中抗体，其中抗体为L19抗体。

10．权利要求1中抗体，该抗体具有下面的氨基酸序列：VHEVQLLESGGG LVQPGGSLPL SCAASGFTFSSFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:19)linkerGDGSSGGSGGASTG(SEQ ID NO:20)VLEIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQQTGRIPPTFG QGTKVEIK(SEQ ID NO:21)

11．权利要求1中抗体，其中抗体为L19抗体的功能等价变体。

12．权利要求9中抗体，其中抗体为放射性标记抗体。

13．权利要求12中抗体，其中抗体为放射性碘标记。

14．抗体在血管增生的快速靶向标记中的应用，其中抗体对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有特异亲和力，并且抗体对该ED-B结构域具有改善的亲和力。

15．权利要求14中所述应用在血管增生的免疫闪烁检测中的应用。

16．权利要求15中所述应用在疾病检测中的应用，这些疾病以血管增殖为特征，例如糖尿病性视网膜病变，年龄相关的黄斑退化和肿瘤。

17．权利要求14中所述应用，其中抗体在不同组织注射后定位3-4小时，最优选3小时。

18．诊断试剂盒，包括抗体和一个或多个其它对检测血管增生必需的试剂，该抗体对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有特异亲和力，并且抗体对该ED-B结构域具有改善的亲和力。

19．抗体在诊断和治疗肿瘤和血管增殖为特征疾病中的应用，该抗体对粘连蛋白ED-B结构域的特征表位具有特异亲和力，并且抗体对该ED-B结构域具有改善的亲和力。

20．偶连物，其包含权利要求1的抗体和能够诱导血液凝固和血管阻断的分子。

21．根据权利要求20中的偶连物，其中能诱导血液凝固和血管阻断的分子为光激活分子。

22．根据权利要求21中的偶连物，其中光激活分子为感光剂。

23．根据权利要求22中的偶连物，其中感光剂在大于600nm的波长有吸收。

24．根据权利要求22中的偶连物，其中感光剂为氯化锡(Ⅳ)e6衍生物。

25．权利要求20中的偶连物在制备可注射组合物中的应用，该组合物用于治疗血管增生相关疾病的治疗。

26．权利要求22中的偶连物在制备可注射组合物的应用，该组合物用于治疗血管增生相关疾病的治疗。

27．权利要求26中的偶连物的应用，其中血管增生相关疾病是由眼部血管增生导致或眼部血管增生相关的。