CN1317381C - 短梗霉多糖薄膜及用于菌种保藏的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种短梗霉多糖(pullulan)薄膜及用于菌种保藏的方法，该薄膜流涎法制备，膜的厚度为0.02mm～0.04mm，拉伸强度27Mpa～32Mpa，直角撕裂强度31KN/m～38KN/m，透光率95%～98%，氧气透过量2.7cm³/m².bar.d～1.6cm³/m².bar.d；采用短梗霉多糖薄膜保藏菌种的方法，在两层经无菌处理短梗霉多糖薄膜的中间涂上甘油和海藻糖保护剂及微生物菌种，贴紧后以塑料膜套封，可以满足干燥、缺氧、低温、缺营养和添加保护剂等菌种保藏的环境要素。这种带有菌种的膜片汇编成册，便于微生物菌种的分类研究，占地面积小，操作方便，不需要昂贵的设备，邮寄方便，使用时只需剪下菌种保藏片的一个小保藏单元，溶于培养基中，微生物即可生长。

Description

短梗霉多糖薄膜及用于菌种保藏的方法

技术领域

本发明涉及一种新的微生物保藏方法。

背景技术

微生物菌种保藏方法常用的有斜面法，砂管法、矿油保藏法、冷冻干燥法和液氮保藏法等。斜面法、矿油保藏法，砂管法等保藏时间过长菌种会逐渐衰亡，冷冻干燥法和液氮法菌种保藏效果好，但需相应设备条件，成本较高，液氮还易引起爆炸，不安全。上述各种方法保藏菌种所占用空间大，邮寄，使用都不方便。现行各种微生物保藏方法比较(周德庆，微生物学教程，高等教育出版社2002，5)见下表：

方法	优点	缺点
			斜面和液体培养基定期移植保藏	简单易行、代价小、便于观察检测，适宜各类菌种	保藏时间短3-6个月，菌种易退化
矿物油覆盖低温(冰箱)	在给定的条件下使菌株接近于非活动状态，适宜各类菌，保藏时间延长1-2年	占据空间大，易变异、染菌机会亦较多
			蒸馏水	简单实用，效果较好	适宜面不广，保藏期短，水质有可能影响菌种保藏的效果
干燥法：干沙，土壤，硅胶	比矿物油覆盖保藏时间长，适于产孢子的微生物，保藏期1-10年	对某些菌不适宜
			滤纸	一些小的圆状滤纸可用来转移菌落，每次转移只用一张滤纸即可	准备工作比以上更麻烦，也许更易染菌
干燥冷冻	适用于大部分细菌，包括放线菌及一些真菌、酵母，目前广泛使用，保藏5-15年	操作繁琐，技术要求较高，对一些适湿的孢子真菌不太适用
			超低温(用20％甘油作保护剂在-75℃的超低温冰箱中)	适用于大部分细菌、酵母。包括放线菌和真菌，代谢处于停顿状态，操作方便，保藏期长	设备费用较高，一般基层单位难以达到
超低温(在液氮中-196℃)	代谢处于停顿状态，保藏时间可达20年以上	最初费用较高，需稳定的经济条件以保证液氮的供应，如果使用液相保存的话，暴露在空气里就会发生爆炸，需要很好的练习使用

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的问题，提出一种短梗霉多糖薄膜及用于菌种保藏的方法，这种保藏方法占用空间小，保藏成本低，邮寄、使用方便、安全。

实现本发明目的的短梗霉多糖薄膜，其膜的厚度为0.02mm～0.04mm，拉伸强度27Mpa～32Mpa，直角撕裂强度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧气透过量2.7cm³/m².bar.d～1.6cm³/m².bar.d

所述的短梗霉多糖薄膜的制备方法，以流涎法制备，其方法为：首先由发酵得到短梗霉多糖，发酵原料采用淀粉，淀粉经水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，该混合物配制培养基，由短梗霉发酵转化成为短梗霉多糖；该多糖经菌体分离、脱色、过滤、浓缩成浓度为15g/100ml～20g/100ml的短梗霉多糖溶液；将浓缩的短梗霉多糖溶液装入密封容器内，然后给密封容器内施加0.08Mpa～0.15Mpa的气压，喷嘴开度调至0.1mm～0.2mm，热风温度调至60～80℃，控制干燥后的薄膜厚度为0.02mm～0.04mm。

所述的短梗霉多糖薄膜用于保藏菌种的方法，首先将其薄膜裁剪成面积大小为8mm×8mm～20mm×20mm单元膜片，并进行无菌处理；然后在两层经无菌处理的短梗霉多糖薄膜中间涂上甘油和海藻糖保护剂及微生物菌种，将二膜贴紧后，外层以另二层经无菌处理的塑料膜套封，构成一个多糖薄膜菌种保藏单元；再将该菌种保藏单元汇编成保藏册，在-24℃以下保存，时间可达12个月，使用时取出保藏单元，剪开塑料外封，将含有菌种的多糖膜投入培养基中，多糖膜溶化，菌种即可生长。

所采用的外层塑料薄膜为耐高温和可热封的尼龙复合膜，或是聚酯复合膜，耐受温度为121℃～125℃。

所述的短梗霉多糖薄膜的无菌处理，其处理方法为：短梗霉多糖膜用15W紫外灯20cm距离照射20分钟。

所述的外封的塑料膜的无菌处理，其处理方法为：其塑料膜在灭菌锅内121℃灭菌30分钟。

本发明中待保藏的微生物菌种从斜面上和平皿菌落上挑取，涂布于一层短梗霉多糖膜之上，另一层短梗霉多糖膜涂布保护剂甘油和海藻糖、然后将二膜贴紧、外层套二张塑料膜，并将四边封口，形成保藏单元，其操作过程全部在无菌室内完成。

其保藏单元片汇编成类似于集邮册的细菌分册，酵母分册，霉菌分册，放线菌分册，册的材料可以是塑料聚酯膜等，册内的每一页可插入多张保藏单元片，每一册由若干页组成。

本发明具体是这样来实现的

第一、无菌短梗霉多糖膜片制备

首先由发酵得到短梗霉多糖，发酵原料采用淀粉，淀粉经水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，该混合物配制培养基，由短梗霉发酵转化成为短梗霉多糖。该多糖经菌体分离、脱色、过滤、浓缩成浓度为15g/100ml～20g/100ml，以流涎法制得短梗霉多糖薄膜，流涎法制膜由三个单元组成，第一个单元为一密封容器内装浓缩的多糖；第二个单元为流涎喷头；第三个单元是配有不锈钢循环带的干燥箱(见图1)，箱内可通热风加热。密封容器与流涎喷头以管道相连，制膜时，密封容器内施加0.08Mpa～0.15Mpa的气压，多糖被压入流涎喷头经喷嘴均匀分布到不锈钢循环带上，喷嘴开度调至0.1mm～0.2mm，热风温度调至60～80℃，控制干燥后的薄膜厚度为0.02mm～0.04mm。制得的膜裁剪为8mm×8mm～20mm×20mm的面积大小，该多糖膜是无色透明的，其拉伸强度27Mpa～32Mpa，直角撕裂强度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧气透过量2.7cm³/m².bar.d～1.6cm³/m².bar.d

以上薄膜置于无菌室内，在15W紫外灯下照射杀菌，照射距离为20cm，照射时间为20分钟，经照射处理后成为无菌的多糖膜备用。

第二、外封的塑料膜的选取和灭菌

短梗霉多糖膜作载体保藏微生物，必须要外封一层塑料膜，这样保藏膜片才不会污染空气中的微生物，外封的塑料膜也必须是无菌的，这样就可保证封藏的多糖膜上保存的菌种是无杂菌的，外封的塑料膜选取耐高温的尼龙膜、聚酯或类似的复合材料，将这种塑料膜包扎后在灭菌锅内121℃灭菌30分钟，取出置无菌室内，备用。

第三、待保藏微生物菌种的培养

本发明保藏的微生物菌种主要指细菌、酵母、霉菌和放线菌，所保藏的微生物可以是菌种保藏中心收藏的菌种，也可是其它任何途径得来的菌种，待培养的微生物菌种以其相应的培养基分别在平皿和试管斜面上进行培养，得到单菌落和纯的斜面菌种。

第四、制作菌种保藏单元

在无菌室内，挑取生长好的纯菌种，涂布于准备好的短梗霉多糖膜片上，在另一多糖膜片上涂布灭过菌的甘油，然后将二膜片紧贴，甘油和菌种挤压混匀被封存在二膜之间，取已灭过菌的二层塑料膜，面积略大于上述多糖膜片，以便于热封机四边封口。将二层塑料膜上下套封载有菌种的多糖膜片，以手提式热封机沿边缘四边封口，形成密封的菌种保藏单元。

第五、制作菌种保藏册

以一般塑料材料如聚酯等制备成集邮册形式的菌种保藏册，册的封面可标上细菌分册，霉菌分册，酵母分册，放线菌分册。册内页具有类似于集邮册的很多栅格，栅格内分门别类的插入上述已制备的菌种保藏单元片。上述保藏册置于冰箱内-24℃以下长期保存。

第六、测保藏单元活菌数

将上述保藏册的菌种保藏单元，每3-6个月各取一菌测其活菌数。

以短梗霉多糖膜为载体进行菌种保藏，由于短梗霉多糖成膜性好，所成的膜不透氧，具有与塑料膜类似的可热封性，可以满足菌种保藏低温、无氧、干燥、缺营养和添加保护剂等环境要素，由于短梗霉多糖的基本结构是葡萄糖、对微生物没有毒害作用。

本发明用短梗霉多糖膜作载体保藏菌种，占用空间小，保藏成本低，邮寄、使用方便、安全。

附图说明

图1  短梗霉多糖流涎成膜和鼓风干燥示意图

图2  菌种保藏册封面示意图

图中序号1流液嘴，2多糖膜料液，3控制板，4不锈钢循环带，5干燥箱，6鼓风机，7电热丝，8主动机，9卷膜盘

具体实施方式

实施例1

大米淀粉经水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，该混合物配制培养基，由短梗霉发酵转化成为短梗霉多糖。该多糖经菌体分离、脱色、过滤、精制、浓缩至浓度为20g/100ml，打入喷膜头内，喷嘴开度0.1mm，以恒定压力0.09MPa喷膜，循环不锈钢带均匀接膜，80℃热风干燥得到0.03mm厚透明干燥的多糖薄膜一卷，测得其性能指标如下：

拉伸强度32Mpa      直角撕裂强度38KN/m

透光率96％         氧气透过量1.6cm³/m².bar.d

实施例2

将实施例1制得的多糖膜裁剪成10mm×10mm的单元片，置于无菌室内，以15W紫外灯，20cm距离分别照射5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟对膜片杀菌，杀菌结束后，以少量生理盐水溶解膜片，然后分别涂布在完全培养基和肉汤培养基的平皿上30℃培养6天，观察结果如下：

照射时间(分钟)       5    10  15   20   30

完全培养基上菌落数   17   3   0    0    0

肉汤培养基上菌落数   13   1   0    0    0

多糖膜片经紫外照射15分钟可达到完全无菌。安全起见，照射时间可延至20分钟

实施例3

分别将实施例1制得的若干多糖膜片紫外照射20分钟备用，市售尼龙复合膜片裁剪成15mm×15mm大小，121℃，30分钟灭菌备用。

分别取大肠杆菌(AS1.751)、北京棒秆菌(AS1.299)、枯草芽孢杆菌(AS1.339)和黄色短杆菌(AB 91058)斜面菌株，在平皿肉汤培养基上涂布，32℃培养，生长成单菌落；

取酵母菌(AY91014)在平皿麦芽汁琼脂培养基上涂布，30℃培养生成单菌落；取出芽短梗霉AS3.3693在平皿完全培养基上涂布，30℃培养生长成单菌落。无菌室内，从培养皿中分别挑取上述6株菌单菌落(每一株菌各菌落大小基本相等)，涂布在上述紫外线照射过的无菌多糖膜片上，以另一抹有薄层甘油和微量海藻糖的无菌多糖膜片将其贴紧，然后以上述二片灭过菌的尼龙复合膜将该多糖膜上下复盖，以塑料封口机将其四边热封，形成一个外封塑料膜，内有夹层多糖膜的菌种保藏单元，以上操作全部在无菌室内进行。上述6种菌的保藏单元膜片在-24℃下保藏6个月、9个月、12个月、18个月，每一菌每次各取出三片，分别以生理盐水溶化稀释法涂到相应的平皿培养基上培养，测其活菌数如下(每次三片，取平均值)：

保藏时间(月)                   6      9     12     18

大肠杆菌AS1.751(10⁶个)        87     83    81     83

北京棒杆菌AS1.299(10⁶个)      134    135   134    133

枯草芽孢杆菌AS1.339(10⁶个)    119    117   116    116

黄色短杆菌AB 91058(10⁶个)     97     93    93     92

酵母AY91014(10⁶个)            106    104   103    105

出芽短梗霉AS3.3693(10⁶个)     168    166   169    166

以上各菌平皿培养物均未发现杂菌。

Claims (6)

1、一种短梗霉多糖薄膜用于保藏菌种的方法，其膜为厚度0.02mm～0.04mm，拉伸强度27Mpa～32Mpa，直角撕裂强度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧气透过量2.7cm³/m².bar.d～1.6cm³/m².bar.d，其特征在于，首先将其薄膜裁剪成面积大小为8mm×8mm～20mm×20mm单元膜片，并进行无菌处理；然后在两层经无菌处理的短梗霉多糖薄膜中间涂上甘油和海藻糖保护剂及微生物菌种，将二膜贴紧后，外层以另二层经无菌处理的塑料膜套封，构成一个多糖薄膜菌种保藏单元；再将该菌种保藏单元汇编成保藏册，在-24℃以下保存，使用时取出保藏单元，剪开塑料外封，将含有菌种的多糖膜投入培养基中，多糖膜溶化，菌种即可生长。

2.如权利要求1所述的用于保藏菌种的方法，其特征在于，所采用的外层塑料薄膜为耐高温和可热封的尼龙复合膜，或是聚酯复合膜，耐受温度为121℃～125℃。

3.如权利要求1所述的用于保藏菌种的方法，其特征在于，所述的短梗霉多糖薄膜的无菌处理，其处理方法为：短梗霉多糖膜用15W紫外灯20cm距离照射20分钟。

4.如权利要求1所述的用于保藏菌种的方法，其特征在于，所述的外封的塑料膜的无菌处理，其处理方法为：其塑料膜在灭菌锅内121℃灭菌30分钟。

5.如权利要求1所述的用于保藏菌种的方法，其特征在于，待保藏的微生物菌种从斜面上和平皿菌落上挑取，涂布于一层短梗霉多糖膜之上，另一层短梗霉多糖膜涂布保护剂甘油和海藻糖、然后将二膜贴紧、外层套二张塑料膜，并将四边封口，形成保藏单元，其操作过程全部在无菌室内完成。

6.如权利要求1所述的用于保藏菌种的方法，其特征在于保藏单元片汇编成集邮册式的细菌分册，酵母分册，霉菌分册，放线菌分册，册的材料是塑料聚酯膜，册内的每一页插入多张保藏单元片，每一册由若干页组成。