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CN1561968A - 与抗体和聚亚烷基二醇结合的脂质体 - Google Patents

与抗体和聚亚烷基二醇结合的脂质体 Download PDF

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CN1561968A
CN1561968A CNA2004100456646A CN200410045664A CN1561968A CN 1561968 A CN1561968 A CN 1561968A CN A2004100456646 A CNA2004100456646 A CN A2004100456646A CN 200410045664 A CN200410045664 A CN 200410045664A CN 1561968 A CN1561968 A CN 1561968A
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lipid
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chemical compound
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田川俊明
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Mitsubishi Chemical Corp
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Abstract

一种脂质体，它是在脂质末端的一部分被马来酰亚胺化的脂质体上通过硫醚基结合了含聚亚烷基二醇部分的化合物，并通过硫醚基进一步结合了抗体而得到的脂质体，相对于包含在脂质体中的1摩尔马来酰亚胺化脂质，所述化合物的结合量和所述抗体的结合量分别为15－50mol％和0.1－2mol％。该脂质体具有优良的血中滞留性和治疗效果。

Description

与抗体和聚亚烷基二醇结合的脂质体
本申请是2000年4月20日提交的发明创造名称为“与抗体和聚亚烷基二醇结合的脂质体”的中国专利申请(国家申请号为No.00809056.4，国际申请号为PCT/JP00/02596)的分案申请。
技术领域
本发明涉及脂质体。更具体地说，涉及与抗体和/或聚亚烷基二醇结合的、具有优良的血中滞留性和治疗效果的脂质体。
背景技术
作为向特定部位输送大量药剂的手段，提出了将药剂封入脂质体，使抗体结合到脂质体表面的方法。特别是在癌的治疗领域，有许多关于其中封入了抗肿瘤药、与抗体结合的脂质体的有效性的报道(Konno等，Cancer Tes.，47，4471，1987；特开昭58-134032号公报)。进而，作为对脂质体存在的问题，即封入物的漏出、脂质体的凝集以及在网状内皮器官中的捕获等的改善方法，提出了向脂质体上结合聚亚烷基二醇的方法(特开平1-249717号公报、特开平2-149512号公报、Klibanovet，A.L.等，FEBS Lett.，268，235，1990)。
在特开平4-346918号公报中，公开了与蛋白质结合的含有药剂的脂质体，其特征在于具有蛋白质和包含聚亚烷基二醇部分的化合物残基，所述蛋白质和化合物残基分别通过各自的硫羟基与内含药剂的脂质体表面的马来酰亚胺基结合。这种脂质体是使结合在抗体上的硫羟基和结合在含聚亚烷基二醇部分的化合物上的硫羟基与脂质体表面的马来酰亚胺基反应来制备的，它的特征在于如通过历来的脂质体所观察到的那样，在肝脏、脾脏等网状内皮系统中的非特异性摄入得到抑制，实现了选择性的化学疗法。
在上述公报中，虽然对与脂质体结合的含聚亚烷基二醇部分的化合物的量没有具体说明，但是记载了使0.1mol％-20mol％的硫羟化抗体与1mol马来酰亚胺基(马来酰亚胺化脂质)反应，向残余的马来酰亚胺基中加入过量的含硫羟化聚亚烷基二醇部分的化合物，优选以等于或大于2当量的量加入，得到与抗体结合的聚亚烷基二醇改性脂质体(0016段)。此外，在实施例中所具体记载的脂质体的制备方法中，使100mg全脂质与5微摩尔含硫羟化聚乙二醇部分的化合物(换算后相当于全脂质的3.1mol％)反应，认为使大量过剩的含硫羟化聚乙二醇部分的化合物与脂质反应，可以得到理论量(残存在脂质体表面的马来酰亚胺基的量)的聚乙二醇改性脂质体。
此外，在上述公报中，虽然对与脂质体结合的抗体的量也没有具体说明，但是说明了使0.1mol％-20mol％的硫羟化抗体(换算后相对于100mg全脂质为0.3-60mg)与1mol马来酰亚胺基(马来酰亚胺化脂质)反应，在实施例中所具体记载的脂质体的制备方法中，使5mg(换算后相当于马来酰亚胺化脂质的1.7mol％)抗体与100mg全脂质结合，在上述公报中，没有具体公开除此之后的结合量。
发明内容
本发明者们在特开平4-346918号公报记载的脂质体的基础上，为提供在具有更高血中滞留性的同时也具有卓越安全性的脂质体而进行了深入研究。结果令人惊讶地发现，在特开平4-346918号公报所记载的脂质体中，当将对脂质体进行改性的聚亚烷基二醇的量减至低于理论值(残存在脂质体表面的马来酰亚胺基的量)后，改性量低于理论值的脂质体也可以获得与历来已知的脂质体几乎同等的血中滞留性。
而且，本发明者们在特开平4-346918号公报记载的脂质体的基础上，为提供能实现更好治疗效果的脂质体而进行了深入研究。结果令人惊讶地发现，在特开平4-346918号公报的实施例所记载的脂质体中，当将抗体的结合量减少后，能够达到远远高于上述公报的实施例所记载的脂质体的治疗效果。本发明在这些发现的基础上得以完成。
也就是说，本发明提供将含聚亚烷基二醇部分的化合物通过硫醚基结合到脂质末端的一部分被马来酰亚胺化的脂质体上而得到的脂质体，相对于包含在脂质体中的1mol马来酰亚胺化脂质，所述化合物的结合量为15-50mol％；提供相对于1mol马来酰亚胺化脂质，所述化合物的结合量为15-30mol％的上述脂质体；提供所述脂质体为使马来酰亚胺化脂质的马来酰亚胺基与添加了硫羟基的含聚亚烷基二醇部分的化合物反应得到的脂质体的上述脂质体；提供所述化合物结合到脂质体表面的上述脂质体；提供所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇的上述脂质体；提供所述化合物为具有2个聚乙二醇基团的化合物的上述脂质体；提供所述聚乙二醇的分子量为2,000-7,000道尔顿的上述脂质体；提供所述聚乙二醇的分子量为约5,000道尔顿的上述脂质体；提供脂质体的表面进一步结合了抗体的上述脂质体。
而且，提供将抗体通过硫醚基结合到脂质末端的一部分被马来酰亚胺化的脂质体上而得到的脂质体，相对于包含在脂质体中的1mol马来酰亚胺化脂质，所述抗体的结合量为0.1-2mol％；提供相对于1mol马来酰亚胺化脂质，所述抗体的结合量为0.4-0.7mol％的上述脂质体；提供所述脂质体为使具有马来酰亚胺基的脂质体与来自抗体的含硫基团反应形成硫醚键而得到的脂质体的上述脂质体；提供所述抗体为GAH抗体的上述脂质体；提供所述抗体为抗体片段F(ab’)2的上述脂质体；提供脂质体的表面进一步结合了含聚亚烷基二醇部分的化合物的上述脂质体。
而且，提供将含聚亚烷基二醇部分的化合物和抗体通过硫醚基结合到脂质末端的一部分被马来酰亚胺化的脂质体上在而得到的脂质体，相对于包含在脂质体中的1mol马来酰亚胺化脂质，所述化合物的结合量和所述抗体的结合量为15-30mol％和0.4-0.7mol％；提供所述脂质体为使马来酰亚胺化脂质的马来酰亚胺基与添加了硫羟基的含聚亚烷基二醇部分的化合物反应得到的脂质体的上述脂质体；提供所述化合物结合到脂质体表面的上述脂质体；提供所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇的上述脂质体；提供所述化合物为具有2个聚乙二醇基团的化合物的上述脂质体；提供所述聚乙二醇的分子量为2,000-7,000道尔顿的上述脂质体；提供所述聚乙二醇的分子量为约5,000道尔顿的上述脂质体；提供所述脂质体为使具有马来酰亚胺基的脂质体与来自抗体的含硫基团反应形成硫醚键而得到的脂质体的上述脂质体；提供所述抗体为GAH抗体的上述脂质体；提供所述抗体的抗体片段为F(ab’)2的上述脂质体。
此外，提供作为癌症治疗药的上述脂质体；癌症种类为胃癌或大肠癌的所述癌症治疗药；以及使用所述脂质体的癌症治疗方法。
附图说明
图1是结合在脂质体(封入了DXR，未结合抗体)上的聚乙二醇量与血浆中DXR浓度之间的关系图。横轴表示PEG量(相对于1molDPPC的mol％)。相对于全脂质的mol％和相对于1mol马来酰亚胺化DPPE的mol％的换算值分别为0.16和8.9(0.25)、0.32和17.8(0.5)、0.48和26.7(0.75)、0.64和35.6(1)以及0.81和45(1.25)(括号内表示相对于1mol DPPC的mol％)。
图2是结合在脂质体(封入了DXR，结合了抗体)上的聚乙二醇量与血浆中DXR浓度之间的关系图。横轴表示PEG量(相对于100mg脂质的PEG量(mg))。相对于1mol DPPC的mol％、相对于全脂质的mol％和相对于1mol马来酰亚胺化DPPE的mol％的换算值分别为0.25、0.16和8(2.5)；0.50、0.31和17(5)；0.75、0.47和26(7.5)；以及1.0、0.62和34(10)(括号内表示相对于100mg脂质的PEG量(mg))。
图3表示结合在脂质体(封入了DXR)上的抗体量与肿瘤抑制效果(％T/C)之间的关系图。
图4表示在抗体结合量等于或大于2mg/100mg脂质的各试样中，血浆中DXR量(血中滞留性)与抗体结合量之间的关系图。
具体实施方式
构成本发明脂质体的脂质的例子包括但不限于下述物质：天然卵磷脂(例如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)等磷脂，鞘糖脂、甘油糖脂等糖脂、脂肪酸、两亲性二烷基二甲铵、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等(Liposome Technology，第2版，第1卷，141，1993)、烷基苷、烷基甲基葡糖酰胺(alkylmethylglucamide)、烷基蔗糖酯、二烷基聚氧乙烯醚、二烷基聚甘油醚等(Liposome Technology，第2版，第1卷，141，1993)、聚氧乙烯-聚乳酸等两亲性嵌段共聚物等(特表平6-508831号公报)等。可以单独使用这些脂质，或是将两种或两种以上结合使用，也可以与胆甾醇等非极性物质、DC-胆(3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆甾醇)等胆甾醇衍生物结合使用。
在本发明的脂质体中，为了结合含聚亚烷基二醇的化合物以及根据需要的抗体等蛋白质，使用例如马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺等被马来酰亚胺化的脂质(在本说明书中称为″                )作为一部分脂质成分是必要的。马来酰亚胺化脂质相对于全脂质的比例通常约为0.5-10mol％。
用马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的例子来进行说明，这种化合物是由具有与氨基的反应性的含马来酰亚胺的化合物与磷脂酰乙醇胺(PE)的氨基反应得到的。所述含马来酰亚胺的化合物可以含己酰基、苯甲酰基、苯基丁酰基等残基，其例子有N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸-N-琥珀酰亚胺酯、4-(对马来酰亚胺基苯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺等。可以使用的PE有二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂酰乙醇胺类，但优选DPPE。脂质成分还可以含有硬脂胺、磷酸联十六烷基酯等带电物质。而且，本发明的脂质体也可以是结合了部分或全部病毒的融合脂质体，例如可以是仙台病毒与脂质体融合后的脂质体。
作为典型的脂质体，例如可以使用含有相对于1摩尔磷脂酰胆碱为0.3-1摩尔，优选为0.4-0.6摩尔的胆甾醇和0.01-0.2摩尔、优选为0.02-0.1摩尔、更优选为0.02-0.05摩尔的马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，在加入磷脂酸的情况下，也可以使用其含量等于或小于0.4摩尔，优选等于或小于0.15摩尔的脂质组合物。
对本发明的脂质体的生产方法没有特别限制，可以使用任何本领域技术人员能够利用的方法。此外，对本发明的脂质体的形态也没有特别限制，可以是任何形态。例如可以是下述脂质体中的任何一种：向附着在玻璃壁上的脂质薄膜中加入水溶液，进行机械振荡形成的多层脂质体(MLV)；通过超声波处理法、乙醇注入法、弗氏压碎法得到的小单层脂质体(SUV)；用表面活性剂除去法、反相蒸发法(脂质体，砂本顺三等，南江堂，1998)、由加压将MLV从具有均一孔径的膜中压出的挤出法得到的大单层脂质体(LUV)(LiposomeTechnology，第2版，第1卷，141，1993)。脂质体的粒径为例如等于或小于300nm，优选为30-200nm左右。
可以向本发明的脂质体中封入药物。对药物的种类没有特别限制，例如可以使用多柔比星、ダゥノマィシン(daunomycin)、长春碱、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗肿瘤药；噻吗洛尔等肾上腺素阻滞药；可乐定等抗高血压药；普鲁卡因胺等止吐药；氯喹等抗疟药；以及上述药物的药学上可接受的盐和衍生物；铼186、碘131、钇90等放射性物质；蓖麻蛋白A、白喉毒素、TNF等生物活性物质以及对它们进行编码的DNA等。但是可以封入本发明的脂质体的药物不限于这些。
优选上述药物的药学上可接受的盐为与药学上可接受的多价阴离子性物质形成的盐如柠檬酸盐、酒石酸盐、谷氨酸盐以及与它们的衍生物形成的盐。封入本发明的脂质体中的药物优选为抗肿瘤药。除了治疗用药物外，也可以向本发明的脂质体中封入诊断用药物。诊断用药物的例子有放射性元素如铟、锝等显象剂，碘、钆等造影剂，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等酶，铕衍生物等荧光体，N-甲基アクリジゥム(acridium)衍生物等发光体等，但并不局限于此。
对于将这些药物引入脂质体的方法没有特别限制，可以使用本领域技术人员能够利用的任何方法。例如，可以在脂质体形成时，以水溶液的形式加入药物，将其封入脂质体内部。此外，可以使用在脂质体形成后，在囊的内外形成pH梯度等浓度梯度，以这种势能作为驱动力将可以离子化的药物结合入脂质体内部的方法(CancerRes.，49，5922，1989；BBA，455，269，1976)等。
本发明的脂质体的特征在于：脂质体被含聚亚烷基二醇部分的化合物改性，而且被特定量的抗体改性。可以使用的聚亚烷基二醇的例子有聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇等，但优选使用聚乙二醇。在使用聚乙二醇的情况下，可以使用分子量为2,000-7,000道尔顿的聚乙二醇，优选使用约5,000道尔顿的聚乙二醇。
本发明的脂质体具有含上述聚亚烷基二醇部分的化合物通过硫醚键结合到脂质体表面的马来酰亚胺化脂质上的结构，通常可以在向含聚亚烷基二醇的化合物中引入硫羟基后，使该化合物与脂质体的马来酰亚胺基反应来生产结合了聚亚烷基二醇的脂质体。含聚亚烷基二醇的化合物通常为具有聚乙二醇基，并且末端能硫羟化的化合物或末端有硫醇基的化合物。具体例子有在三嗪上结合了聚亚烷基二醇基的化合物、所述三嗪进一步被氨基酸等所取代的化合物。在这种情况下，所述化合物也可以是具有2个聚亚烷基二醇基的化合物(双链)。
当所用的聚亚烷基二醇为聚乙二醇时，可以使用例如下述方法：使单甲氧基聚氧乙烯胺与各种硫羟羧酸脱水缩合的方法；用SPDP向单甲氧基聚氧乙烯胺中引入吡啶基二硫代丙酰基，再进行还原的方法；用亚氨基硫戊环(iminothiolane)向单甲氧基聚氧乙烯胺中引入硫羟基的方法；使单甲氧基聚氧乙烯羧酸的活性酯与各种硫羟胺结合的方法；使聚乙二醇三嗪衍生物与硫羟胺缩合的方法。更具体地说，使2，4-双(聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪(活化的PEG2(生化学工业株式会社生产))与胱氨酸反应，然后再进行还原可以得到结合了半胱氨酸的活化PEG2。
对向本发明的脂质体中引入的含聚亚烷基二醇部分的化合物的量没有特别限制，可以使过量的该化合物与残余的马来酰亚胺化脂质反应，优选聚亚烷基二醇的引入量相对于全脂质为约0.28-0.90mol％，更优选为约0.28-0.56mol％，相对于马来酰亚胺化脂质为约15-50mol％，更优选为约15-30mol％，相对于DPPC为约0.44-1.45mol％，更优选为约0.44-0.89mol％。
本发明的脂质体可以被蛋白质，即抗体改性。可以使用的蛋白质有例如抗体、FGF、EGF等各种生物活性物质，可以优选使用抗体。可以使用的抗体为抗体自身或抗体片段或抗体的衍生物等，可以使用抗体自身或抗体片段的任一种。本说明书中使用的术语``体”除抗体自身和抗体片段以外，还包括衍生的或改性的抗体，必须以最广的含义来解释。而且，作为抗体来说，可以利用与治疗靶即组织、细胞、细菌、病毒等具有反应性的抗体。例如，可以使用各种动物的多克隆抗体、小鼠单克隆抗体、人-鼠嵌合性抗体、人单克隆抗体等。从抗体不是异种动物的蛋白质考虑，更优选人单克隆抗体。适于使用的抗体为特开平5-304987号公报中记载的人单克隆抗体(GAH抗体)，例如按上述公报的实施例7中具体描述的方法，可以制备用GAH抗体改性的脂质体。如特开平5-304987号公报所述，由于GAH抗体对胃癌和大肠癌具有反应性，故本申请的脂质体作为胃癌、大肠癌的癌症治疗药物是有用的。通过对抗体种类与应当封入的药物的组合进行适当选择，可以制备具有优良治疗效果效果的脂质体。
在向抗体引进了硫羟基后，可以通过使脂质体的马来酰亚胺基与该硫羟化抗体反应，用抗体对脂质体进行改性。向抗体引进硫羟基的方法，可以将通常用于使蛋白质硫羟化的吡啶二硫丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(carlsson，J.等，Biochem.J.，173，723，1978)、亚氨基硫戊环、巯基烷基酰亚胺酯(mercaptoalkylimidate)(Traut，R.R.等，Biochemistry，12，3266，1973)等化合物与抗体的氨基反应来进行。而且，也可以将抗体内生的二硫羟基还原为硫羟基来进行反应，从维持抗体活性的观点出发，优选使用内生的硫羟基的方法。
例如，在使用IgG的情况下，可以用胃蛋白酶等酶进行F(ab’)2化，并进一步用二硫苏糖醇等还原得到Fab’，将Fab’上所产生的硫羟基用于与脂质体的结合反应(Martin，F.J.等，Biochemistry，20，4229，1981)。在使用IgM的情况下，按照ミラ等的方法(J.Biol.Chem.，257，286，1965)，可以在缓和的条件下，将J键还原所得IgMs的Fc部分的硫羟基用于与脂质体的结合。在使用特开平5-304987号中描述的GAH抗体的情况下，优选使用F(ab’)2。加入了硫羟基的抗体等蛋白质与含马来酰亚胺基的脂质体的结合是通过在中性的缓冲液(pH6.5-7.5)中反应2-16小时而实现的。
本申请最优选的实施方式是与抗体和含聚亚烷基二醇部分的化合物结合的脂质体，为了制备所述脂质体，首先在中性缓冲液中使具有马来酰亚胺基的脂质体与硫羟化抗体反应。例如，以相对于每100mg构成脂质体的全脂质为0.5-5.3mg，0.5-4.5mg，优选1.2-2mg的量使抗体结合，即，使0.1mol％(具体地说为0.17mol％)-约2mol％左右(具体地说为1.5mol％、1.8mol％)、优选0.4-0.7mol％的硫羟化抗体与1摩尔马来酰亚胺基(马来酰亚胺化脂质)反应即可。接下来，使含硫羟化聚亚烷基二醇部分的化合物与残存的马来酰亚胺基反应，可以制备与抗体和含聚亚烷基二醇部分的化合物结合的脂质体，具体地说，可以向1摩尔马来酰亚胺化脂质基中加入15mol％-50mol％，优选15-30mol％(相对于全脂质为0.28-0.90mol％，优选0.28-0.56mol％，在使用DPPC的情况下，相对于DPPC为0.44-1.45mol％，优选0.44-0.89mol％)的含硫羟化聚亚烷基二醇部分的化合物，制备与抗体和含聚亚烷基二醇部分的化合物结合的脂质体。
根据本发明的脂质体的优选形态，向其中封入药物，优选封入多柔比星等抗肿瘤药，提供与含聚乙二醇部分的化合物和抗肿瘤抗体结合的脂质体。上述含药物的脂质体可以通过已知的方法，例如脱水法(特表平2-502348号公报)、加入稳定剂作为液态制剂使用的方法(特开昭64-9331号公报)、冷冻干燥法(特开昭64-9931号公报)等来制备，为了治疗癌等各种疾病，可以用血管内投药、膀胱内投药、腹腔内投药、局部投药等方法向患者投药。投药量可以根据有效成分的药物种类进行适当选择，例如在将封入了多柔比星的脂质体进行给药的情况下，可以使用的有效成分的量为等于或小于50mg/kg，优选等于或小于10mg/kg，更优选等于或小于5mg/kg。
实施例
以下通过实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明的范围不限于以下的实施例。
实施例1
(1)脂质体的制备和药物的封入
向由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)/胆甾醇/ε-马来酰亚胺基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MC-DPPE)(摩尔比为18/10/0.5)组成的脂质混合物(1.6g)中加入16mL 0.3M的柠檬酸缓冲液(pH4.0)，水合之后，用液氮和60℃的温浴冷冻和解冻3次，制成多层脂质体。进一步用挤出法将其颗粒大小调整为0.1μm。向该脂质体溶液中滴加1MNaOH进行中和，之后加温到60℃，向每100mg脂质中加入0.5mL 20mg/mL的多柔比星(DXR，别名アドリアマィシン(adriamycin)，ADM)水溶液进行封装。
(2)抗体的硫羟化及与脂质体的结合(结合了抗体的脂质体的制作)
向溶解在含1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH7.5)中的GAH抗体(特开平4-346918号公报、特开平5-304987号公报中所记载的物质，是对胃癌及大肠癌具有反应性的单克隆抗体，3mg/mL，14.4mL)中加入92.4μL 3mg/mL的亚氨基硫戊环，使其在37℃反应1小时从而引入硫羟基(参照Biochemistry，12，3206，1973)。将反应液进行凝胶过滤，将缓冲液换为含1mM EDTA的0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)后，以相对于每1mg多柔比星为0.21mg的量加入硫羟化抗体(1.7mg/mL)，使其在25℃反应1小时，使抗体结合到脂质体上。
(3)聚乙二醇的硫羟化及与脂质体的结合(结合了PEG的脂质体的制作)
按照特开平4-346918号公报的方法，使胱氨酸与2，4-双(聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪反应，然后进行还原，制成具有硫羟基的聚乙二醇(双链型PEG)。也就是说，使用胱氨酸制备硫羟化PEG(30mg/mL、PEG的分子量为2000的双链型(PEG2000)或PEG的分子量为5000的双链型(PEG5000)，向每1mL上述反应液中加入0.18mL，使其在10℃发生结合反应。反应开始后5-240分钟后取样，将样品应用于琼脂糖(セファロス)CL6B柱，除去未反应的硫羟化PEG，中止反应，制成PEG量不同的免疫脂质体。与未进行PEG结合操作的免疫脂质体同样，用琼脂糖CL6B进行凝胶过滤来制作未结合PEG的免疫脂质体。
(4)结合了抗体和PEG的脂质体的制作
使上述(3)中的硫羟化PEG与上述(2)中制备的结合了抗体的脂质体反应，制成结合了抗体和PEG的脂质体。
(5)结合PEG量的定量
用HPLC法测定与免疫脂质体结合的PEG量。将免疫脂质体溶液作为最终浓度为2％的SDS溶液在60℃加温30分钟，使脂质体可以完全溶解。使用GPC柱(东ソ株式会社生产，2000SWXL)，用pH7.5的缓冲液(25mM NaH2PO4、0.1％SDS、70％甲醇)进行洗脱，分离PEG，用在215nm检出的面积值来对PEG进行定量。
(6)DXR定量
向950μL 50％丙醇/0.5M盐酸中加入50μL试样，测定在500nm的吸光度以确定DXR。
(7)结合抗体量的定量
与PEG量的定量相同，使用GPC柱(东ソ株式会社生产，3000SWXL)，用pH7.0的缓冲液(25mM NaH2PO4、200mM Na2SO4、0.1％SDS)进行洗脱，分离抗体，用在280nm检出的抗体峰的面积值来对抗体进行定量。
(8)脂质量的定量
用HPLC法对脂质(DPPC和胆甾醇的总量)进行定量。向L-柱ODS(化学品检测协会)4.6mm×250mm中装入脂质体，用四氢呋喃(THF)/乙腈/水(2∶1∶1，v/v/v，0.1％三氟乙酸)进行洗脱。不进行在215nm的检测，而由DPPC的峰面积和胆甾醇的峰面积来进行定量。向1体积的脂质体试样中加入9体积的上述洗脱液来制备脂质定量用试样。
实施例2：结合了PEG的脂质体的制备(药动学试验)
按照实施例1的方法，制备引入了相对于1mol构成脂质体的全脂质为0-约0.7mol％、相对于1摩尔DPPC为0-约1mol％、相对于1摩尔马来酰亚胺化脂质为0-约40mol％的PEG的脂质体(封入了DXR、未结合抗体、结合了PEG2000或PEG5000)。
<表1>
脂质体 DXR浓度 PEG量*            PEG量**  PEG量***
       (mg/ml)
1      1.14    0.083(PEG5000)     0.13      4.61
2      1.17    0.22(PEG5000)      0.34      12.2
3      1.27    0.40(PEG5000)      0.63      22.2
4      1.32    0.48(PEG5000)      0.75      26.7
5      1.16    0.096(PEG2000)     0.15      5.33
6      1.08    0.30(PEG2000)      0.47      16.7
7      1.47    0.60(PEG2000)      0.94      33.3
8      1.55    0.70(PEG2000)      1.09      38.9
9      3.49    -                  -         -
*相对于全脂质的mol％
**相对于1摩尔DPPC的mol％
***相对于1摩尔马来酰亚胺化脂质的mol％
在实验中使用BALB/cAjcl雄性小鼠(6周大)。将一组4只小鼠用于各脂质体，用1只未处理小鼠作空白试验。将DXR量为2mg/kg的脂质体投药到小鼠的尾静脉中。投药16小时后，将ネンブタル注射液(大日本制药株式会社生产)投药到小鼠腹腔内，在麻醉条件下开胸采血，分离血浆用于DXR的分析。
向100μL血浆中加入1mL 0.3M盐酸-50％乙醇(盐酸乙醇)，在60℃加热10分钟，萃取DXR，冷却至4℃，在15000rpm下离心10分钟，取上清液。用盐酸乙醇将该试样稀释至4倍，测定在激发波长490nm、荧光波长590nm下的荧光。使用被盐酸乙醇稀释到已知浓度的DXR来制作检测线，对血浆中的DXR进行定量。此外，小鼠血浆的DXR回收率在DXR换算3.75μg/mL-30μg/mL的范围内为95-98％(参考文献：Cancer Res.，47，4471，1989)。
各脂质体组的血浆中DXR浓度的平均值(±标准偏差)如图1所示。血浆中DXR浓度作为脂质体的血中滞留性的指标，发现其不论对于PEG5000还是PEG2000，都是随结合到脂质体上的PEG量而增加。
实施例3：结合了PEG和抗体的脂质体的制备(药动学试验)
按照实施例1的方法，制备引入了相对于脂质体全脂质为0-0.6mol％、相对于DPPC为0-约1mol％、相对于马来酰亚胺化DPPE为0-约30mol％的PEG的脂质体(封入DXR、结合抗体、结合PEG5000)。
<表2>
脂质体     DXR浓度          抗体        PEG    PEG     PEG
      (mg/100mg脂质)  (mg/100mg脂质)    量*   量**   量***
1           10.2            1.5         0      0       0
2           10.4            1.6         0.06   0.10    3
3           10.3            1.6         0.10   0.16    5
4           10.3            1.6         0.15   0.24    8
5           11.1            1.6         0.28   0.44    15
6           10.5            1.6         0.30   0.48    16
7           10.2            1.6         0.36   0.56    19
8           11.0            1.8         0.48   0.76    26
9           10.8            1.3         0.52   0.82    28
10          10.8            1.7         0.61   0.97    33
*相对于全脂质的mol％
**相对于1摩尔DPPC的mol％
***相对于1摩尔马来酰亚胺化DPPE的mol％
与实施例2同样，对血浆中的DXR进行定量。各脂质体组的血浆中DXR浓度的平均值(±标准偏差)如图2所示。血浆中DXR浓度随结合到脂质体上的PEG量而增加，但是能够确认相对于全脂质约0.3mol％、相对于DPPC约0.5mol％、相对于马来酰亚胺化DPPE约17mol％的引入量使其达到稳定浓度。此外，在DXR从脂质体泄漏的情况下，由于确认了泄漏的DXR迅速从血液中燃烧掉，所以认为在实施例2和3的结果中所示的血浆中DXR浓度来自封入脂质体中的DXR。
实施例4：结合了PEG和抗体的脂质体的制备(药效试验、药动学试验)
按照实施例1的方法，制备100mg脂质体全脂质结合了0.5、1.2、2.0、4.5、5.3以及11.4mg抗体的下述脂质体2-7(封入DXR、结合PEG5000)。同样，制备未结合抗体的脂质体1。在结合了PEG的脂质体中，由于在PEG结合量范围(＞4.4mg/100mg脂质)内各脂质体的血中滞留性相等，下示实验结果取决于抗体的结合量。
<表3>
脂质体   抗体结合量mg/100mg脂质   DXR封入量mg/100mg脂质   PEG结合量mg/100mg脂质
    1     0     9.5     8.2
    2     0.5     9.1     8.2
    3     1.2     9.5     8.1
    4     2.0     8.9     5.3
    5     4.5     9.6     6.2
    6     5.3     9.7     6.4
    7     11.4     10.0     3.2
将胃癌细胞系MKN45皮下移植到裸鼠背部的2处(1×106细胞/处)。在″的时候，开始将抗体结合量不同的脂质体进行投药。脂质体的投药量为每次5.0mg/kg(换算为DXR量)，作为阳性对照设定DXR(5.0mg/kg)投药组，向对照组投给生理盐水。对各组均在投药开始日(0日)、第3日及第6日进行静脉内投药。
随着时间增加测定肿瘤径(长径、短径)，计算估计的肿瘤重量(短径2×长径/2)。在3次投药结束后，继续测定直到第19日。将投药开始日估计的各肿瘤重量作为1.0，计算肿瘤的增殖度，评估各处理组相对于对照组、DXR投药组的肿瘤抑制效果。计算在最终测定日(第19日)各处理组的％T/C值(处理组的肿瘤增殖度/对照组的肿瘤增殖度×100)，从与各试样的抗体结合量的关系求出肿瘤增殖抑制效果达到最大的抗体结合量(最佳值)。
结果，确认了相对于对照组，对所有的处理组都有显著的肿瘤增殖抑制效果；相对于DXR投药组，如图3所示，确认结合的抗体量在0.5-5.3mg/100mg全脂质范围内的试样具有显著的肿瘤增殖抑制效果，结合的抗体量在2mg/100mg全脂质附近时达到肿瘤增殖抑制活性的峰值。
在″                                          4-7(2.0、4.5、5.3和11.4mg/100mg全脂质)静脉内投药给小鼠(一组2-3只，1.0mg/kg，换算为DXR的量)，投药4小时后从各个体采集血浆。与实施例2相同，用荧光测定法测定血浆中的DXR量。比较对各试样投药后血浆中的DXR量，求出抗体结合量与封入了DXR并结合了抗体的脂质体的血中滞留性的关系。在药动学试验中，对抗体结合量等于或大于2mg/100mg脂质的各试样，求出对各试样投药后的血浆中DXR量与各试样的抗体结合量之间的关系(图4)。结果，确认抗体结合量超过2mg/100mg脂质后，随着抗体结合量的增加，血中滞留性降低。
产业利用性
本发明的脂质体的特征在于：具有优良的血中滞留性，并且聚亚烷基二醇的结合量少于历来的脂质体。因此，本发明的脂质体可以避免由聚亚烷基二醇引起的副作用，而且从工业生产性的观点出发也是有利的。此外，与历来的结合抗体的脂质体相比，本发明的脂质体还具有能实现优良的治疗效果的特征。

Claims (9)

1.一种脂质体，所述脂质体是将含聚亚烷基二醇部分的化合物通过硫醚基结合到脂质末端的一部分被马来酰亚胺化的脂质体上而形成的，该化合物的结合量相对于脂质体中所含的1摩尔马来酰亚胺化脂质为15-50mol％。
2.权利要求1的脂质体，其中所述化合物的结合量相对于1摩尔马来酰亚胺化脂质为15-30mol％。
3.权利要求1或2的脂质体，该脂质体是使马来酰亚胺化脂质的马来酰亚胺基与加入了硫羟基的含聚亚烷基二醇部分的化合物反应得到的脂质体。
4.权利要求1-3中任一项的脂质体，其中所述化合物结合在所述脂质体的表面。
5.权利要求1-4中任一项的脂质体，其中所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇。
6.权利要求5的脂质体，其中所述化合物为具有2个聚乙二醇基的化合物。
7.权利要求6的脂质体，其中所述聚乙二醇的分子量为2,000-7,000道尔顿。
8.权利要求6的脂质体，其中所述聚乙二醇的分子量为约5,000道尔顿。
9.权利要求1-8中任一项的脂质体，其中所述脂质体的表面进一步结合了抗体。
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