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CN1829736A - 严重急性呼吸道综合征冠状病毒 - Google Patents

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CN1829736A
CN1829736A CNA2004800162903A CN200480016290A CN1829736A CN 1829736 A CN1829736 A CN 1829736A CN A2004800162903 A CNA2004800162903 A CN A2004800162903A CN 200480016290 A CN200480016290 A CN 200480016290A CN 1829736 A CN1829736 A CN 1829736A
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CN
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seq
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sars
amino acid
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CNA2004800162903A
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English (en)
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R·拉普里奥
V·马斯格阿尼
K·斯塔德勒
J·-P·格雷格森
D·基恩
J·韩
J·保罗
A·韦纳
M·霍顿
宋炫澈
徐美英
J·J·唐纳利
H·D·克伦克
N·瓦里安特
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
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Chiron Corp
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Abstract

烈性呼吸道病毒的爆发，现在被称为严重急性呼吸道综合征(SARS)，已于2003年在香港、中国和世界上越来越多国家被确认。本发明涉及SARS冠状病毒的核酸和蛋白质。这些核酸和蛋白质可用于制备和制造疫苗制剂、诊断剂、试剂盒等。本发明还提供了通过给予小分子抗病毒化合物来治疗SARS的方法，以及鉴定用于治疗SARS的强效小分子的方法。

Description

严重急性呼吸道综合征冠状病毒 本文引用的所有文件其内容纳入本文作为参考。
要求优先权的相关申请
以下申请被全文纳入本文作为参考：美国临时专利申请60/462,218，代理案卷号PP20474.001，于2003年4月10日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/462,465，代理案卷号PP20480.001，于2003年4月11日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/462,418，代理案卷号PP20480.002，于2003年4月12日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/462,748，代理案卷号PP20480.003，于2003年4月13日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/463,109，代理案卷号PP20480.004，于2003年4月14日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/463,460，代理案卷号PP20480.005，于2003年4月15日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/463,668,代理案卷号PP20480.006，于2003年4月16日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/463,983，代理案卷号PP20480.007，于2003年4月17日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/463,971，代理案卷号PP20480.008，于2003年4月18日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/464,899，代理案卷号PP20480.009，于2003年4月22日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/464,838，代理案卷号PP20507.001，于2003年4月22日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/465,273，代理案卷号PP20518.001，于2003年4月23日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/465,535，代理案卷号PP20518.002，于2003年4月24日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/468,312，代理案卷号PP20480.010，于2003年5月5日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/473,144，代理案卷号PP20480.011，于2003年5月22日，美国临时专利申请60/495,024，代理案卷号PP20480.012，于2003年8月14日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/505,652，代理案卷号PP20480.013，于2003年9月23日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/510,781，代理案卷号PP20480.014，于2003年10月11日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/529,464，代理案卷号PP20480.015，于2003年12月11日通过美国邮局以快递邮件提交；美国临时专利申请60/536,177，代理案卷号PP20480.016，于2004年1月12日通过美国邮局以快递邮件提交；和美国临时专利申请60/＿，＿，代理案卷号PP20480.017，于2004年4月7日通过美国邮局以快递邮件提交。
发明领域
本发明涉及严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒的核酸和蛋白质。这些核酸和蛋白质可用于制备和制造用来治疗或预防SARS的疫苗制剂。本发明也涉及诊断试剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中存在或不存在SARS病毒的方法。本发明还涉及用小分子病毒抑制剂和小分子病毒抑制剂的组合以及治疗SARS的药盒来治疗或预防SARS的方法。
发明背景
烈性呼吸道病毒的爆发，现在被称为严重急性呼吸道综合征(SARS)，已于2003年在香港、中国和世界许多国家被确认。患者的症状通常包括发热、干咳、呼吸困难、头痛和低氧血。SARS病毒的分离物显示至少与几种已知的冠状病毒的RNA聚合物同源。这种同源性的系统发育分析见Peiris等，“冠状病毒是严重急性呼吸道综合征的可能病因”(Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratorysyndrome)，Lancet，2003年4月8日发表于http：///image.thelavcet.com/extras/03art3477web.pdf，其内容纳入本文作为参考。SARS病毒基因组的其它已测序片段显示与冠状病毒的开放读框1b重叠。参见Drosten等，“鉴定严重急性呼吸道综合征患者内的新冠状病毒”(Identification of a Novel Coronavirus in Patients withSevere Acute Respiratory Syndrome)，New England Journal of Medicine，2003年4月10日发表于http：//www.nejm.org，其内容纳入本文作为参考。
位于加拿大的大不列颠哥伦比亚省的基因组科学中心(Genome Science Center)在其网站(http：//www.bcgsc.ca/bioinifo/SARS/)上公布了一种称为TOR2分离物据信是SARS病毒的29738个碱基对病毒的基因组装配草图。本文的SEQ ID NO：1给出了该基因组装配草图。
疾病控制中心(CDC)在其网站
(http.www.cdc.gov/ncidod/sars/pdf/nucleoseq.pdf)上公布了SARS-CoV毒株的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。CDC还公布了预测的N、S和M蛋白的系统发育树(见图6)。该系统发育树将SARS病毒置于任何先前已知的冠状病毒类型之外。
日益需要抗SARS病毒的预防性或治疗性疫苗，以及鉴定例如哺乳动物组织或血清中病毒存在的诊断、筛选方法和组合物。
发明概述
本发明涉及严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒的核酸和蛋白质。这些核酸和蛋白质可用于制备和制造治疗或预防SARS的疫苗制剂。这种疫苗制剂可包括灭活(或被杀死的)SARS病毒、减毒SARS病毒、分离的SARS病毒制品以及重组或纯化的一种或多种SARS病毒抗原亚单位制剂。可通过病毒载体和/或病毒颗粒来帮助本发明多核苷酸的表达和输送。
本发明还涉及用于诊断或鉴定生物样品中存在或不存在SARS病毒的诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)和方法。本发明还包括非编码SARS病毒的多核苷酸序列、编码非免疫原性蛋白质的SARS病毒序列，用于这种诊断组合物和方法的保守的和变异的SARS病毒多核苷酸序列。
本发明还涉及含有一种或多种SARS病毒抗原以及一种或多种其它呼吸道病毒抗原的疫苗制剂。适用于本发明的其它呼吸道病毒抗原包括：流感病毒、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、超级肺病毒(metapneumovirus)和鼻病毒的抗原。其它呼吸道病毒抗原也可是SARS冠状病毒之外的冠状病毒的。优选其它呼吸道病毒抗原是流感病毒抗原。
本发明的组合物还包含一种或多种佐剂。适合用于本发明的佐剂包括粘膜佐剂、透皮佐剂或肠道外佐剂。适用于本发明的粘膜佐剂包括脱毒的细菌ADP-核糖基化毒素，如大肠杆菌热不稳定类毒素(例如，LTK63)、脱乙酰壳多糖及其衍生物，以及百日咳杆菌(Bordetella pertussis)类毒素的无毒双重突变株形式。适用于本发明的肠道外佐剂包括MF59以及铝或铝盐。
本发明还提供了通过给予小分子化合物来治疗SARS的方法，以及鉴定有效治疗SARS的小分子的方法。
在本发明的一个方面，提供了一种鉴定治疗活性剂的方法，该方法包括：(a)使治疗活性剂接触感染SARS病毒的细胞；(b)测定与SARS有关的酶的活性减弱。
在一较具体的实施方案中，所述治疗活性剂是小分子。在另一更具体的实施方案中，所述治疗活性剂是核苷类似物。在另一更具体的实施方案中，所述治疗活性剂是类肽、寡肽或多肽。在另一实施方案中，所述与SARS有关的酶是SARS蛋白酶。在另一实施方案中，所述与SARS有关的酶是SARS聚合酶。再在另一实施方案中，所述与SARS有关的酶是激酶。下面的第V章节进一步讨论了鉴定用于治疗SARS病毒感染的治疗活性剂的方法。
在本发明的另一方面，提供了治疗感染SARS的人的方法，包括给予有此需要的患者一种小分子。一实施方案中，所述小分子是SARS蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子是SARS聚合酶抑制剂。在另一实施方案中，所述与SARS有关的酶是激酶。再在另一实施方案中，所述小分子经口或肠道外给药。
本发明还提供了这种小分子在制造用于治疗严重急性呼吸道综合征的药物中的应用。
本发明的小分子化合物包括那些小于1000g/mol的分子，优选含有芳香性部分和一个以上选自O、S或N的杂原子。
优选的小分子包括但不限于：无环鸟苷、gancyclovir、vidarabidine、foscamet、cidofovir、amantidine、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、以及它们的组合。也可用干扰素来治疗患者，包括干扰素-α和干扰素-β。干扰素治疗已在猴子中显示有希望治疗SARS(Enserink(2004)Science 303：1273-1275)，尤其是被PEG化时(Haagmans等(2004)Nature Medicine 10：290-293)。
本发明的一个方面涉及鉴定接触过SARS病毒(SARSV)的个体和含有SARSV的生物样品的方法，和实施这种方法的试剂盒。这种方法可使用核酸检测技术，如PCR、RT-PCR(冠状病毒科是RNA病毒)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、分支DNA信号扩增测定、基于核酸序列的等温扩增(NASBA)、其它自身持续序列复制测定、自返式DNA扩增、链置换活化作用、循环探针技术或这些扩增方法的组合。如本领域所熟知的，这些核酸检测技术采用了含有与SARS病毒基因组类似或互补的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物(如用于扩增)和探针(例如用于捕获或检测)。
或者，或除上述核酸检测方法之外，本发明的方法可利用各种免疫测定技术来检测SARSV抗原和/或抗体。
因此，本发明涉及通过用特异性结合SARSV抗原的抗体来检测SARSV抗原的存在情况，从而鉴定接触过SARSV的个体或含有SARSV的生物样品的方法。所述抗体优选单克隆抗体。个体样品中存在的病毒抗原量可用来确定受感染个体的预后。优选待检测的SARSV抗原通常是一种结构蛋白，尤其是那些存在于病毒颗粒表面的蛋白，例如包括刺突(spike)糖蛋白(S)，也称为E2；包膜(小膜)蛋白(E)，也称为sM；膜糖蛋白(M)，也称为E1；血凝素-酯酶糖蛋白(HE)；也称为E3；以及核衣壳磷蛋白(N)。在优选的实施方案中，待检测的抗原是S、E和M蛋白，可用它们的抗体来检测。
本发明涉及用来鉴定个体SARSV的试剂盒以及这种试剂盒中所用的试剂。所述试剂盒中装有含特异性结合SARSV抗原的抗体的第一容器和含有SARSV抗原的第二容器。所述抗体优选单克隆抗体。该试剂盒可用于定量测定个体样品中抗原的量。这种信息可用于确定受感染个体的预后。
本发明涉及通过用SARS抗原检测样品中抗SARS病毒抗原的抗体的存在与否来鉴定接触过SARS病毒的个体或含有SARSV的生物样品的方法。定量测定个体样品中存在的抗SARS蛋白质即SARS抗体的量可用来确定受感染个体的预后。可用一种或多种病毒蛋白质(结构蛋白或非结构蛋白)作为抗原来检测SARSV抗体；SARSV分离物中保守的SARSV抗原是优选的。就此而言，非结构蛋白(例如，Pol、Hel、3CLp、MP、PLP1、PLP2)可能特别有用。
本发明涉及用来鉴定接触过SARS的个体的试剂盒以及其中所用的试剂。所述试剂盒中装有在接触过SARS病毒抗原的应答中产生的抗体的第一容器和含有SARS抗原的第二容器。该试剂盒适合定量测定个体样品中存在的抗SARS抗体的量。这种信息可用于确定受感染个体的预后。
本发明涉及通过检测SARS病毒核酸的存在来鉴定接触过SARS病毒的个体或含有SARSV的生物样品的方法。定量测定个体样品中存在的SARS核酸的量可用于确定受感染个体的预后。该方法采用与SARSV基因组或转录物或复制产物序列相似或互补的寡核苷酸探针和/或引物。本文中描述了优选的探针和引物。本发明还包括进行SARSV核酸检测所用方法的试剂盒。
本发明还包括通过给予治疗有效量的表1和表2所列美国专利和公开的国际专利申请中所述的那些抗病毒化合物中至少一种来治疗和/或预防SARS的方法。在该方法的一个实施方案中，所述抗病毒化合物是小分子。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述抗病毒蛋白酶抑制剂是3C-样蛋白酶抑制剂和/或木瓜蛋白酶-样蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂。在另一实施方案中，第一种抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂，它与第二种抗病毒化合物—依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂—一起给予。本发明还提供联合应用类固醇抗炎药与至少一种抗病毒化合物，例如表1和表2所列文献中所述的抗病毒化合物。
本发明还提供了通过吸入给予治疗有效量的表1和表2所列美国专利和公开的国际专利申请中所述的那些抗病毒化合物中的至少一种来治疗和/或预防SARS的方法。在该方法的一个实施方案中，所述抗病毒化合物是小分子。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述抗病毒蛋白酶抑制剂是3C-样蛋白酶抑制剂和/或木瓜蛋白酶-样蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶的抑制剂。在另一实施方案中，第一种抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂，它是与第二种抗病毒化合物—依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂—一起给予。本发明还提供通过吸入联合给予类固醇抗炎药与至少一种抗病毒化合物，例如表1和表2所列文献中所述的抗病毒化合物。所述类固醇抗炎药可通过吸入施用以实现局部效果，或者可通过例如口服或静脉内途径施用以实现全身吸收。
本发明还提供了上述抗病毒化合物在制造用于治疗严重急性呼吸道综合征的药物中的应用。
本发明还提供了供消费者用于治疗和/或预防SARS的药盒。这种药盒装有：(a)含有治疗有效量的表1和表2所列美国专利和公开的国际专利申请中所述的那些抗病毒化合物中至少一种和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物；(b)装有所述药物组合物的容器；以及，任选地；(c)描述使用该药物组合物来治疗和/或预防SARS的方法的说明书。该药盒可任选装有多种治疗SARS的抗病毒化合物，其中，所述抗病毒化合物选自3C-样蛋白酶抑制剂和木瓜蛋白酶-样蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，该药盒装有抗病毒化合物，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂。当该药盒装有多种抗病毒化合物时，药盒中的抗病毒化合物可任选与同一种药物组合物组合。
本发明的另一方面提供了表1和表2所列美国专利和公开的国际专利申请中所述抗病毒化合物中至少一种在制造用于治疗或预防SARS的药物中的应用。
附图简述
图1：冠状病毒基因组结构的示意图。
图2：冠状病毒ORF1a/ORF1b基因产物的示意图。
图3(A-C)：选自包括核衣壳(N)、基质(M)和血凝素-酯酶(HE)基因的冠状病毒基因的对比。
图4(A-F)：冠状病毒多肽序列(包括ORF1a/ORF1b、核衣壳(NP)、血凝素-酯酶(HE)、包膜(Sm或E)、基质(M)和刺突(S)的对比。
图5：取自图4的刺突(S)多肽序列S1和S2结构域连接区以及所选冠状病毒蛋白酶切割位点的对比。
图6：SARS-CoV毒株的CDC系统发育树(Clustalx 1.82，相邻连接树)。
图6A显示了冠状病毒N蛋白分析结果，图6B显示了冠状病毒S蛋白分析结果，图6C显示了冠状病毒M蛋白分析结果。
图7：SARS病毒的保守序列和特有序列。图7A-7D显示了SARS病毒基因组结构蛋白的多序列对比(CLUSTAL W 1.82)(7A：PEP4刺突蛋白；7B：PEP7小膜蛋白；7C：PEP8基质糖蛋白；7D：PEP13核衣壳蛋白)，它们在所有或部分其它已知冠状病毒中有对应物。图7E-7H显示了在对比7A-7D的序列中蛋白质距离的树状图。标记229E：人冠状病毒；MEV：鼠肝炎病毒；TGV：传染性胃肠炎病毒；AIBV：鸟传染性支气管炎病毒；BOVINE：牛冠状病毒；PEDV：猪流行性腹泻病毒。
图8：几种冠状病毒5’UTR的对比，显示5’UTR的共有核苷酸序列。
图9：用于扩增5’UTR的优选引物的序列。F和R表示正向和反向PCR引物，数字表示图8中核苷酸的位置。
图10：几种冠状病毒3’UTR的对比，显示3’UTR的共有核苷酸序列。
图11：用于扩增3’UTR的优选引物序列。F和R表示正向和反向PCR引物，数字表示图10中核苷酸的位置。
图12：SEQ ID NO：6042的卷曲螺旋预测，采用Coils程序(图12A)或LearrCoil(图12B)。
图13：在现有SARS病毒基因之间某位点间插入感兴趣报告基因的例子。未图示小的非结构基因产物。
图14：SARS病毒复制子代表性例子的示意图。未图示小的非结构基因产物。
图15：SARS病毒nsp2蛋白酶(3CLp)以及对催化位点和底物位点的鉴定。
图16：鸟IBV、MHV和BcoV SARS病毒nsp2蛋白酶(3CLp)的对比。虚线框中的残基是底物位点的关键残基(F、Y和H)；实线框中的残基是催化性半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基。
图17：SARS冠状病毒的基因组结构。显示了复制酶区域和结构区域以及预测的ORF1a和ORF1b内的切割产物。还标出了ORF1a和ORF1b之间5’RNA前导序列(L)、3’聚腺苷酸通道和核糖体移码共有序列的位置。每个框代表一种蛋白质产物。根据它们与其它冠状病毒相应蛋白质的氨基酸相同性水平用阴影来表示(也可参见表2)。SARS特异性基因是白色的。用箭头标出了9个SARS特异性六碱基IG序列(5’-ACGAAC-3’；SEQ ID NO 7293)的位置。
图18：冠状病毒的代表组1(HCoV-229E，登录号：AF304460)、组2(小鼠肝炎病毒MHV，登录号：NC_001846)、组3(鸟传染性支气管炎病毒AIBV，登录号：NC001451)和SARS冠状病毒的基因组结构。用于该研究的其它完全测序的冠状病毒获自以下登录号：猪流行性腹泻病毒(PEDV)，AF353511；传染性胃肠炎病毒(TGV)，NC002306；牛冠状病毒(BCoV)：AF220295。红框代表组特异性基因。在基因组中还标出了前导RNA序列和聚腺苷酸通道的位置。用不同浓淡的圈标出了特异性IG序列的位置。在SARS基因组中，我们还发现了组2的冠状病毒特有的三个IG序列。
图19：预测的刺突蛋白锚定到病毒膜的拓扑学模型。标出了结构域和预测的功能域。预计N-末端区域(S1)包含受体结合域。与亮氨酸拉链基序部分叠加的S2结构域内有两个卷曲螺旋区域推测参与寡聚化作用。疏水结构域负责膜锚定。
图20：将12种冠状病毒和SARS的pol基因的922bp内部区域进行多序列对比获得的系统发育树。节点的数字表示引导程序分析的结果，强烈支持分支。完整冠状病毒基因组内没有的序列已从GenBank检索到以下登录号：猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、AF124988、人OC43病毒(OC43)、AF124989、犬冠状病毒(CCV)、AF124986、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、AF124987、火鸡冠状病毒(TCV)、AF124991、大鼠涎泪腺炎病毒(SDAV)、AF124990。
图21： 21A.通过将组I和组II的刺突蛋白S1结构域的共有序列(G1_cons和G2_cons)以及组3刺突蛋白(AIBV)的共有序列与SARS病毒的刺突蛋白进行对比获得的无根系统树。数字表示引导程序分析的结果。用来生成组1共有序列特征的序列是：HcoV-229E，登录号P15423；猪流行性腹泻病毒(PEDV)，登录号：NP598310；传染性胃肠炎病毒(TGV)，登录号：NP058424；犬冠状病毒(CCV)，登录号：S41453；猪呼吸道病毒(PRV)，登录号：S24284；猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)，登录号：VGIH79。用来生成组2共有序列的序列是：小鼠肝炎病毒(MHV)，登录号：NP045300；牛冠状病毒(BCoV)，登录号：NP_150077；人冠状病毒OC43，登录号：P36334；猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)，登录号：AAL80031；组3仅使用鸟传染性支气管炎病毒(AIBV)的刺突蛋白序列，登录号：AA034396。 21B：表示与SARS刺突蛋白相比，组1、2和3的S1结构域中半胱氨酸位置的示意图。水平条带表示S1氨基酸序列(SARS和AIBV)或共有序列特征(由组1，G1_cons，和组2，G2_cons产生)。短线的长度没有放大。相关的半胱氨酸位置用矩形条带表示。只有半胱氨酸在各个共有序列中完全保守。显示用线连接的半胱氨酸在SARS S1结构域和共有序列之间保守。
图22：奈瑟菌属粘附素A蛋白(NadA)。
图23：SARS冠状病毒基因组的原始翻译(阅读框+1)。
图24：SARS冠状病毒基因组的原始翻译(阅读框+3)。
图25：1b和刺突的开放读框，用*分开。
图26：SARS在vero细胞中生长。
图27：Matrix Cellufine Sulfate Superformance 150/10上SARS冠状病毒捕获步骤的色谱图。对100ml冠状病毒收获物进行分析。左边的Y轴表示280nm的吸光度。右边的Y轴表示梯度(％B)。X轴表示体积(ml)。
图28：银染的MCS色谱组分。各泳道为：(1)标记物；(2)冠状病毒vero细胞收获物；(3)0.65μm过滤后冠状病毒vero细胞收获物；(4)流穿液；(5)洗涤液；(6)20％峰(病毒峰)。在每个泳道上加样1μg测试蛋白质。
图29：MCS色谱组分的Western印迹。各泳道如图28所述。
图30：线性密度梯度超速离心，15-60％蔗糖(SW28，2小时，20000rpm)。该图显示了蛋白质浓度(■)和蔗糖浓度(◆)。
图31：NuPage 4-12％Bis-Tris-Ge(Novex)上的银染密度梯度组分，还原条件，70℃加热10分钟。各泳道为：(1)标记物；(2)20％峰MCS；(3)密度梯度组分11；(4)密度梯度组分12；(5)密度梯度组分13；(6)密度梯度组分14；(7)密度梯度组分15；(8)密度梯度组分16；(9)密度梯度组分17。组分15-17中有大量蛋白质。在泳道2、8和9上加样1μg蛋白质。
图32：MCS上SARS冠状病毒捕获步骤的色谱图。细节如图27，但使用200ml收获物。
图33：诸色谱组分的银染(左)和Western印迹(右)结果。各泳道如图28和29所述，但泳道(6)是5％峰。进行SDS-PAGE之前(样品)在室温处理30分钟。
图34：密度梯度超速离心，15-40％蔗糖(SW28，2小时，20000rpm)。该图显示了蛋白质浓度(■)和蔗糖浓度(◆)。
图35：NuPage 4-12％Bis-Tris-Ge(Novex)上密度梯度超速离心组分的银染(左)和Western印迹(右)结果，还原条件。各泳道是：(1)标记物；(2)密度梯度组分6；(3)密度梯度组分7；(4)密度梯度组分8；(5)密度梯度组分9；(6)密度梯度组分10；(7)密度梯度组分15。组分7-10(泳道3-6)含有纯的冠状病毒蛋白质。组分15(泳道7)中有大量杂质。在泳道2、8和9上加样1μg蛋白质。进行SDS-PAGE之前(样品)室温处理30分钟。
图36：密度梯度组分8-10的EM图。图36A显示了组分8；图36B显示了组分9；图36C显示了组分10。
图37：刺突/NadA融合构建物。
图38和39：S1L、S1L-NadA和SlL-NadAΔ锚在大肠杆菌中表达的结果。图38显示了对BL21(DE3)/pET、BL21(DE3)/pET-S1L和BL21(DE3)/pET-S1L-NadAΔ锚全裂解物的SDS-PAGE分析结果。用箭头指出各条带，从左到右三个泳道分别是：BL21(DE3)/pET；BL21(DE3)/pET-S1L；BL21(DE3)/pET-S1L-NadAΔ锚。图39显示了BL21(DE3)/pET、BL21(DE3)/pET-S1L-NadA(在非诱导条件下培养)和BL21(DE3)/pET-S1L-NadA(在诱导条件下培养)全裂解物的(39A)SDS-PAGE和(39B)Western印迹分析结果。用箭头指出各条带，从左到右三个泳道分别是：BL21(DE3)/pET；BL21(DE3)/pET-S1L-NadA；BL21(DE3)/pET-S1L-NadA。Western印迹显示存在该蛋白质的寡聚形式。
图40：SARS刺突克隆的示意图。
图41：SARS刺突蛋白的短暂表达(COS7细胞裂解物的Western印迹结果)。4-20％TG SDS凝胶各泳道加样20μg细胞裂解物(共1.2mg)。显示了标记抗体。
图42：4％TG SDS凝胶上COS7细胞裂解物的Western印迹分析结果，显示了胞内S分子的寡聚状态。
图43：4-20％TG SDS凝胶上COS7细胞裂解物的Western印迹分析结果，显示了SARS刺突蛋白的短暂表达。各泳道是：(1)模拟，AF；(2)模拟，DF；(3)nSh，AF；(4)nSh，DF；(5)nShΔTC，AF；(6)nShΔTC，DF。在各泳道上加样5μ1各种样品，总共400μl。印迹用抗His-标记的蛋白质标记。
图44：4-20％TG SDS凝胶上COS7细胞裂解物的Western印迹分析结果，显示了SARS刺突蛋白的短暂表达。分泌出截短的刺突蛋白。从培养基(10cm平板)中纯化刺突蛋白，首先通过ConA柱，最后通过His·标记磁珠。在各泳道上加样1/3物质。
图45：4-20％TG SDS凝胶上COS7细胞裂解物的Western印迹分析结果，显示了SARS刺突蛋白的短暂表达。在左手边的两个印迹中(泳道1-5)，样品在SDS和β-巯基乙醇中煮沸；在右手边的两个印迹中(条带6-11)，样品仅在SDS中煮沸。泳道1-8用抗His-标记蛋白质的单克隆抗体标记；泳道9-11用兔抗-SARS抗体标记。
图46：SARS刺突蛋白表达对细胞活力的影响。
图47：4％TG SDS凝胶上COS7细胞裂解物的Western印迹分析结果，显示了胞内刺突分子的寡聚状态。印迹用抗-His-标记的mAb标记。COS7细胞裂解物的膜组分通过排阻柱分级，然后加样到泳道上。组分7-14显示的条带kDa值分别为：71000、1400、898、572、365、232、148和99。
图48：将细胞分组为水相组分和去污剂组分。
图49：将构建物用于OMV制品的示意图。
图50：SARS的HR1和HR2构建物。
图51：疫苗保护Balb/c小鼠模型免患SARS。
图52：刺突蛋白在转染的293细胞裂解物(52A)或COS7细胞培养物上清(52B)中的表达。蛋白质用4-20％TG SDS凝胶分离。标记是抗-His-标记，但52B右手边的三个泳道用兔抗-SARS血清标记。在图52A中，左手边的三个泳道用DTT处理并煮沸，但对右手边的三个泳道未作处理。在图52B中，没使用DTT处理，但所有的泳道(的样品)都80℃加热5分钟。
图53：在COS7细胞中表达的刺突蛋白的Western印迹。蛋白质在室温(RT)、80℃或10℃孵育以检查对分子量有何影响。图54显示了对SARS病毒颗粒进行的类似试验结果。
图55：脉冲追踪实验结果，显示了被α病毒复制子颗粒感染后SARS刺突蛋白的表达和加工。如图所示，细胞用或不用Endo H处理。
图56：加热对刺突蛋白三聚体的影响。
图57：酵母表达的蛋白质的考马斯蓝染色凝胶。各泳道是：1-可见蓝色标准品(10μl)；2-pAB24gbl(20μg)；3-SARS刺突S1c.1gbl(20μg)；4-SARS刺突S1c.2gbl(20μg)；5-可见蓝色标准品(10μl)；6-pAB24ip(5μl)；7-SARS刺突S1c.l(5μl)；8-SARS刺突S1c.2(5μl)。
图58-64：制备酵母表达构建物的示意图。
图65-66：酵母表达的刺突序列。
图67：显示SARS刺突蛋白在α病毒复制子颗粒中的表达和复制子RNA表达的Western印迹。图67A在非还原条件和室温(即不加热)下进行，各泳道为：(1)VEE/SIN-刺突感染；(2)VEE/SIN-GFP感染；(3)复制子-刺突RNA转染；(4)复制子-GFP RNA转染。图67B用SARS病毒颗粒在图示的不同温度下进行。
图68：在小鼠中诱导抗体应答。各疫苗组是：(1)灭活SARS病毒；(2)截短的重组刺突蛋白；(3)全长刺突：DNA+DNA.PLG+α病毒；(4)全长刺突：只有α病毒颗粒。
图69：人单克隆抗体S3.2与纯化的截短刺突蛋白结合。X轴表示抗体浓度，Y轴表示ELISA吸光度。内插结果是2158.13。
图70：不同疫苗(从左到右：灭活病毒；3μg截短的刺突蛋白；75μg编码截短的刺突蛋白的DNA)输送的SARS-CoV刺突蛋白所诱导的抗体的ELISA滴度几何平均值。
图71：用(左)nSdΔTC蛋白或(右)用PLG输送的编码nSdΔTC的DNA免疫后的中和滴度。
图72：刺突抗原结合抗体和中和抗体的关系。
图73：表达全长形式(左)或截短形式(右)刺突蛋白的CHO细胞系的Western印迹。蛋白质通过4-12％SDS-PAGE分离，在DTT中煮沸并用多克隆血清染色。
图74：SARS-CoV刺突糖蛋白和表达构建物的结构组成。L表示前导肽(残基1-13)，TM表示跨膜区，Cy表示胞质尾节段。未显示6个-His标记。
图75：在COS7细胞中表达的SARS刺突蛋白的Western印迹分析结果。在图75A中，COS7细胞用标出的质粒构建物转染，并用SDS-PAGE(4-20％聚丙烯酰胺)在还原和变性条件下分析转染后48小时细胞裂解物中的表达蛋白，用抗-组氨酸Mab显示诸蛋白质。在图75B中，在转染后48小时收集细胞培养基中的蛋白质，先用ConA柱然后用His-标记的磁珠进行纯化。纯化的蛋白质作SDS-PAGE(4-20％聚丙烯酰胺)分析并用抗-SARS兔血清显示。
图76：在细胞裂解物(泳道1、2)和培养基(泳道3、4)中发现的C-末端截短的刺突蛋白(SA)的Endo H敏感性。用箭头标出了胞内SΔ蛋白质和分泌的SΔ蛋白质的位置。
图77：SARS刺突蛋白的寡聚状态。用全长刺突构建物(nSh)转染COS7细胞中的重组S蛋白寡聚物。如各泳道上所标示，细胞裂解物用DTT和/或加热处理。处理和未处理样品中S蛋白的不同形式通过SDS-PAGE(4％聚丙烯酰胺)和Western印迹分析，用抗-组氨酸Mab显示。
图78：无DTT时，热变性对重组S蛋白寡聚状态的影响。按照指示在电泳之前加热COS7细胞裂解物，并按照图77的描述显示S蛋白。
图79：热变性对SARS病毒颗粒中刺突蛋白寡聚状态的影响。使SARS-CoV在Vero细胞中生长，用SDS将其从病毒颗粒中纯化并溶解，按上述进行热变性并按图77的描述显示，但使用抗纯化病毒的兔抗血清作为探针。
图80：通过交联试验分析SARS病毒颗粒刺突蛋白的寡聚状态。溶解的SARS病毒颗粒蛋白用DMS处理。将未处理(-)和DMS处理(+)的病毒颗粒蛋白在没有DTT时加热变性并通过4％PAGE和银染色显示。
图81和82：通过热变性分析截短的刺突蛋白的寡聚状态。将COS7细胞裂解物中的截短的刺突蛋白(81)或分泌到培养基中的截短的刺突蛋白(82)在没有DTT时按指示加热变性，并通过Western印迹分析显示。
图83：去糖基化的全长刺突寡聚物与构象体或非构象抗体的反应性。全长重组刺突寡聚物在非变性条件下用PNG酶部分去糖基化，用抗-组氨酸Mab(泳道1、2、3)或抗纯化的SARS CoV的兔抗血清(泳道4、5、6)通过Western印迹分析显示。
图84：western印迹显示表达的SARS刺突蛋白在COS7细胞裂解物各组分中的定位。细胞用所示的质粒转染，转染后48小时用Dounce匀浆器以低渗缓冲液裂解。离心细胞裂解物获得可溶性胞质溶胶组分和不溶性膜组分，膜组分用4％TritonX-100进一步溶解。蛋白质与SDS一起80℃加热后用SDS-PAGE(4-20％聚丙烯酰胺)在还原条件下分析。用抗-组氨酸Mab显示蛋白质。将胞质溶胶组分加样到泳道1、3和5，膜组分加样到泳道2、4和6。
图85：重组的全长(A、D)或截短的(B、E)刺突蛋白在COS7细胞胞内和表面的表达。转染后48小时固定细胞，用去污剂(Cytofix/perm，BD Biosciences)处理进行胞内免疫荧光检验(A、B、C)，或用2％低聚甲醛处理(40倍放大)观察细胞表面免疫荧光(D、E、F)。模拟转化的细胞(C、F)作为对照。
图86-105：大肠杆菌表达蛋白质的SDS-PAGE。Tot＝总蛋白；Sol＝可溶性蛋白质组分。标签为蛋白质名称(表26-30)。
图106：给予编码最优化N抗原载体后的免疫荧光。
图107：(A)天然M序列和(B)密码子最优化M序列的免疫荧光。
图108：(A)天然E序列和(B)密码子最优化E序列的免疫荧光。
图109-111：Vero细胞的Western印迹，采用大肠杆菌表达的刺突蛋白免疫接种后获得的兔抗体。
图112：293细胞中刺突蛋白的表达。泳道：(M)标记物；(1)转染的模拟物；(2，6)表达nS蛋白的细胞，裂解物；(3，7)表达nSdTC蛋白的细胞，裂解物；(4，8)表达nS蛋白的细胞，上清；(5，9)(4)表达nSdTC蛋白的细胞，上清。染色抗体：(2-5)DNA免疫后获得的小鼠血清；(6-9)用杀死的全病毒免疫后获得的兔血清。
图113：SEQ ID NO：9968的6个阅读框。
图114：SEQ ID NO：10033的6个阅读框。
图115：牛冠状病毒pol lab(顶行；SEQ ID NO：10068)、鸟传染性支气管炎pollab(第二行；SEQ ID NO：10069)、小鼠肝炎病毒pol lab(第三行；SEQ ID NO：10070)、SEQ ID Nos：9997/9998(第四行)和共有序列(底行；SEQ ID NO：10071)的对比。
图116：冠状病毒基因组结构示意图。
图117：冠状病毒ORF1a/ORF1b基因产物的示意图，包括″*″区域。
图118：对比。
图119：SEQ ID NO：10080中可替换的起始密码子。
图120：SEQ ID NO：10084的6个阅读框。
图121：SEQ ID NO：10033和SEQ ID NO：10084的对比。
图122：SEQ ID NO：10084的阅读框。
图123：SEQ ID NO：10084的起始密码子分析。
图124：SEQ ID NO：10210的BLAST分析。
图125：用(13A)Hopp & Woods或(13B)Kyte & Doolittle对SEQ ID NO：10210进行表位分析。
图126：SEQ ID NO：10299的阅读框。
图127：SEQ ID NO：10505的阅读框。
图128：SEQ ID NO：11563的阅读框。
图129：SEQ ID NO：10033的阅读框。
图130：SEQ ID NO：9997和SEQ ID NO：10033的对比。
图131：SEQ ID NO：10299的阅读框。
图132：SEQ ID NO：10505的阅读框。
图133：SARS蛋白酶纯化组分的Western印迹。
图134：用不同浓度的SARS蛋白酶切割DABCYL-EDANS(含有SARS蛋白酶切割位点的荧光标记的肽)。该图显示了无蛋白酶(◆)、0.95uM蛋白酶(■)和2.86uM蛋白酶(●)时活性/浓度的关系。
当序列表中的序列和图中的序列有出入时，以图中的序列为准。
发明详述
除非另有说明，实施本发明时将采用精通此领域的技术人员已知的常规化学、生化、分子生物学、免疫学和药理学方法。这些技术已在文献中有详细解释。例如可参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版(1995)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress，Inc.)；以及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)；Handbook ofSurface andColloidal Chemistry(Birdi，K.S.编，CRC Press，1997)；Short Protocols inMolecular Biology，第四版，(Ausubel等编，1999，John Wiley & Sons)；MolecularBiology Techniques：An Intensive Laboratory Course，(Ream等编，1998，AcademicPress)；PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第二版，(Newton & Graham编，1997，Springer Verlag)；Peters和Dalrymple，Fields Virology(第二版)，Fields等(编)，B.N.Raven Press，New York，NY。
这里引用的所有出版物、专利和专利申请的内容纳入本文作为参考。
严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒最近被鉴定为一种新的病毒种类。SARS病毒种类包括以下分离物。
-Peiris等所述的两种病毒分离物，“冠状病毒是严重急性呼吸道综合征的可能病因”(Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome)，Lancet于2003年4月8日在线公布于http：//image.thelancet.com/extras/03art3477web.pdf，其内容纳入本文作为参考，其序列以登录号AY268070保藏于GenBank。
-Drosten等所述的分离物和病毒序列，“鉴定严重急性呼吸道综合征患者内的新冠状病毒”(Identification of a Novel Coronavirus in Patients with Severe AcuteRespiratory Syndrome)，New England Journal of Medicine，于2003年4月10日在线公布于http：//www.nejm.org。
-2003年3月25日和24在WHO网站上描述的分离物和病毒序列。
-Tsang等所述的分离物和病毒序列，“香港严重急性呼吸道综合征的一类病因”(A Cluster of Cases of Severe Acute Respiratory Syndrome in Hong Kong)，New England Journal of Medicine，于2003年3月31日在线公布于http.//www.nejm.org。
-Poutanen等所述的分离物和病毒序列，“鉴定加拿大的严重急性呼吸道综合征”(Identification of Severe Acute Respiratory Syndrome in Canada)，NewEnglandJournal of Medicine，于2003年3月31日在线公布于http.//www.nejm.org。
如Lanet的文章所述，SARS病毒的646碱基对多核苷酸与冠状病毒家族的病毒有弱同源性。Lanet的文章还报道由该序列推出的氨基酸序列(215个氨基酸)与牛冠状病毒和鼠肝炎病毒的RNA聚合酶的序列同源性约57％。Lanet的文章还提供了蛋白质序列的系统发生分析，显示该聚合酶序列与组II的冠状病毒最密切相关。
精通此领域的病毒学家可鉴定、分离和/或测序其它SARS病毒分离物。病毒学家可容易地鉴定新的病毒分离物是否是SARS病毒。病毒学家可用来鉴定新的SARS分离物的标准包括：新的分离物与已知SARS病毒分离物的序列同源性；新病毒分离物与已知SARS病毒分离物基因组结构的类似性；与已知SARS病毒分离物的免疫学(血清学)相似性或相同性；病理学上与已知SARS病毒分离物病毒颗粒形态学的相似性；以及与已知SARS病毒分离物所致受感染细胞形态学上的相似性(例如通过电子显微镜观察)。
分离并测序SARS病毒分离物的方法包括Peiris等在Lancet论文中描述的方法。Lancet论文称，可用随机六聚物逆转录临床样品中的RNA，并在存在2.5mmol/L氯化镁时用包含序列SEQ ID NOS：6584 & 6585的引物扩增cDNA(94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min)。
用随机六聚物逆转录病毒分离物可按照以下步骤在RT-PCR试验中完成。使病毒分离物在哺乳动物细胞，尤其是恒河猴胎肾细胞中繁殖。然后分离病毒感染和未被病毒感染的恒河猴胎肾细胞的所有RNA。用含有SEQ ID NO：6586的引物逆转录RNA样品。用含有SEQ ID NO：6587的引物扩增cDNA。对被感染细胞制品中独特的PCR产物(根据大小确定)然后进行克隆和测序，比较该序列与GenBank中序列的遗传同源性。
精通此领域的技术人员能够用各种标准克隆技术，例如，利用随机引物的RT-PCR和检测与一个或多个上述序列重叠的序列，和/或利用寡核苷酸引物(如简并引物)，根据上面提供的序列来鉴定和克隆其它基因组区域(见图1-5、图8-11，SEQ IDNOS：3-20)。
利用多核苷酸序列，尤其是有关冠状病毒的RNA聚合酶序列，可进一步促进此领域技术人员对SARS病毒的克隆、测序和鉴定。
精通此领域的技术人员不难确定新的病毒分离物与上述已知SARS分离物的序列同源性。可用病毒核苷酸序列的同源性百分比来鉴定新的SARS分离物，新病毒与已知SARS病毒多核苷酸序列可有99％、95％、92％、90％、85％或80％的同源性。也可用多肽同源性百分比来鉴定新的SARS分离物，新病毒多核苷酸编码的多肽与已知SARS病毒编码的多肽可有99％、95％、92％、90％、85％或80％的同源性。
也可用基因组多核苷酸序列的同源性百分比来鉴定新的SARS分离物，新病毒特异性基因组区域的多核苷酸序列与已知SARS病毒的特异基因组区域的多核苷酸序列可有99％、95％、92％、90％、85％或80％的同源性。此外，可用多肽序列同源性百分比来鉴定新的SARS分离物，由新SARS病毒特异性基因组区域的多核苷酸编码的多肽序列与已知SARS病毒特异性区域的多核苷酸编码的多肽序列可有99％、95％、92％、90％、85％或80％的同源性。这些基因组区域可包括大多数冠状病毒通常共有的区域(例如，基因产物)，以及组特异性区域(例如抗原组)，例如下列基因组区域中的任何一个，这些区域是精通此领域的病毒学家不难鉴定的：5’非翻译区(UTR)、前导序列、ORF1a、ORF1b、非结构蛋白2(NS2)、血凝素-酯酶糖蛋白(HE)(也称为E3)、刺突糖蛋白(S)(也称为E2)、ORF3a、ORF3b、ORF3x、非结构蛋白4(NS4)、包膜(小膜)蛋白(E)(也称为sM)、膜糖蛋白(M)(也称为E1)、ORF5a、ORF5b、核衣壳磷蛋白(N)、ORF7a、ORF7b、基因间序列、3’UTR或依赖于RNA的RNA聚合酶(pol)。SARS病毒可具有含一个或多个上述基因组区域的可鉴定的基因组区域。SARS病毒抗原包括这些基因组区域任何一个编码的蛋白质。SARS病毒抗原可以是对SARS病毒特异性蛋白质或片段(与已知冠状病毒相比)。(参见图1-5，图8-11，SEQ ID NOS：3-20)。
精通此领域的技术人员还应了解被SARS病毒感染的哺乳动物细胞的电子显微镜照片。SARS感染细胞的电子显微镜照片见Lancet论文中。如该论文所述，经负染色(3％磷钨酸钾，pH 7.0)的SARS感染恒河猴胎肾细胞的超离心细胞培养提取物的电子显微镜照片中显示，存在直径约为80-90nm(范围为70-130nm)的多形态有包膜的病毒颗粒，其表面形态与冠状病毒一致(见Lancet的论文，图1)。感染细胞薄切片的电子显微镜照片显示，病毒颗粒的直径为55-90nm，位于胞质中有光滑壁的小泡内(见Lancet的论文，图2B)。电子显微镜照片还可用来观察细胞表面的病毒颗粒。人肺活检样品的电子显微镜照片显示了类似的病毒形态。见Lancet的论文图2A。
I.SARS多肽和多核苷酸
本发明涉及来自SARS病毒的核酸和蛋白质。下面进一步例举这种多核苷酸和多肽。
一实施方案中，本发明的多核苷酸不包括http：//content.nejfn.org/cgi/reprirnt/NEJMoa030781v2.pdf中所揭示的下列5个引物：SEQ ID NOS：6034-38。
本发明包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中存在或不存在SARS病毒的方法的探针的多核苷酸序列。本发明包括含有SEQ IDNOS：21-1020中所鉴定的一个或多个引物序列的多核苷酸序列。本发明还包括含有与SEQ ID NOS：21-1020中所鉴定的一个或多个引物序列相互补的多核苷酸序列。
本发明包括的多肽含有来自图23所示序列的氨基酸序列。这种氨基酸序列是SEQID NOS：6588-6809。本发明包括的多肽含有与这些序列具有序列相同性的氨基酸序列，本发明还包括含有这些序列之一的多肽的片段。
本发明包括含有来自图24所示序列的氨基酸序列的多肽序列。这种氨基酸序列是SEQ ID NOS：6810-7179。本发明包括的蛋白质含有与这些序列具有序列相同性的氨基酸序列，本发明还包括含有这些序列之一的蛋白质的片段。
本发明包括含有SEQ ID NO：6039的蛋白质。本发明包括含有与SEQ ID NO：6039具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有SEQ ID NO：6039的多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ ID NO：6039或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码SEQ ID NO：6039或其片段的多核苷酸序列。本发明包括的免疫原性组合物含有SEQ ID NO：6039或其片段的多肽。本发明包括能识别包含SEQ ID NO：6039或其片段的多肽的抗体。SEQ ID NO：6039被证实与冠状病毒的ORF1a功能上同源。
下面鉴定了SEQ ID NO：6039的预测跨膜区或疏水区。虽然冠状病毒的多蛋白可被蛋白水解切割成许多小的蛋白，但已知该多蛋白中的疏水结构域可介导该复制复合体与膜结合，并能够显著改变宿主细胞膜的结构。因此，该多蛋白的疏水结构域是开发减毒SARS病毒疫苗的基因突变的靶点。这些疏水结构域还是SARS病毒小分子抑制剂的靶点。这些疏水结构域也可用来产生那些区域的特异性抗体以治疗或预防SARS病毒感染。
预测的SEQ ID NO：6039中的跨膜螺旋
括号中的序列位置表示核心区域。
只有当评分超过500才认为有意义。
内向外螺旋：发现43个                     外向内螺旋：发现43个
    始于   终于          评分    中心     始于       终于    评分    中心
100(100)118(116)      103   107        94(97)118(112)        291   104
473(473)488(488)      1003  481        400(400)418(415)      243   407
529(532)549(549)      541   539        473(473)488(488)      1113  481
584(584)606(601)      1049  594        523(528)548(548)      285   538
773(773)791(789)      514   782        583(583)606(601)      662   593
1071(1071)1089(1086)  243   1078       776(776)791(791)      1435  783
1121(1121)1137(1137)  459   1130       1068(1071)1089(1086)  370   1078
1679(1679)1696(1696)  404   1686       1121(1121)1137(1137)  455   1130
2098(2102)2119(2116)  509   2109       1679(1679)1696(1694)  340   1686
2145(2145)2160(2160)  797   2153       2098(2098)2119(2116)  678   2109
2206(2209)2224(2224)  2686  2216       2148(2148)2163(2163)  434   2155
2316(2316)2332(2332)  2123  2325       2208(2210)2231(2226)  2389  2219
2335(2339)2358(2354)  2101  2346       2309(2309)2332(2326)  1773  2318
2373(2373)2390(2390)  532   2380      2342(2342)2368(2360)  1666  2353
2597(2600)2615(2615)  307   2607      2373(2373)2390(2390)  254   2380
2753(2753)2770(2768)  2242  2760      2753(2755)2770(2770)  2119  2763
2831(2833)2854(2851)  759   2841      2832(2835)2854(2851)  687   2844
2879(2882)2900(2897)  526   2889      2858(2858)2873(2873)  253   2866
2990(2996)3012(3010)  1289  3003      2879(2882)2899(2899)  400   2889
3024(3024)3042(3039)  2281  3032      2990(2990)3005(3005)  875   2998
3054(3058)3075(3072)  2536  3065      3020(3024)3042(3042)  2795  3032
3105(3109)3127(3123)  2010  3116      3059(3059)3075(3075)  2137  3067
3143(3143)3163(3159)  184   3152      3105(3108)3127(3123)  1902  3115
3253(3255)3272(3272)  319   3262      3142(3145)3162(3162)  540   3152
3346(3346)3366(3366)  203   3356      3343(3351)3366(3366)  496   3358
3375(3375)3392(3392)  305   3384      3437(3437)3453(3453)  848   3444
3438(3438)3455(3453)  1021  3445      3489(3491)3508(3505)  302   3498
3559(3567)3584(3581)  1885  3574      3560(3560)3577(3577)  1460  3569
3589(3589)3606(3604)  2018  3596      3591(3591)3606(3606)  2193  3598
3611(3611)3629(3629)  2304  3621      3610(3610)3627(3627)  1484  3620
3659(3659)3674(3674)  1561  3667      3656(3658)3678(3675)  1240  3668
3756(3758)3777(3774)  2352  3767      3681(3684)3701(3699)  590   3691
3890(3890)3904(3904)  485   3897      3710(3713)3738(3728)  1696  3721
3916(3919)3934(3934)  241   3926      3723(3723)3738(3738)  1670  3730
4035(4035)4051(4051)  335   4044      3760(3760)3777(3775)  2367  3767
4217(4217)4232(4232)  272   4224      3881(3884)3902(3900)  249   3892
4239(4239)4257(4254)  402   4247      4099(4099)4114(4114)  389   4106
                                      4234(4234)4254(4249)  325   4241
                                      4338(4341)4360(4360)  505   4348
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6039片段的多肽，其中所述片段包含含有一个或多个上面鉴定的疏水跨膜序列的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6039片段的多肽，其中所述片段包含以下一个或多个SEQ ID NO：6039的多肽序列：473-488，529-549，584-606，773-791，2098-2119，2145-2160，2206-2224，2316-2332，2335-2358，2373-2390，2753-2770，2831-2854，2879-2900，2990-3012，3024-3042，3054-3075，3105-3127，3438-3455，3559-3584，3589-3606，3611-3629，3659-3674，3756-3777，473-488，583-606，776-791，2098-2119，2208-2231，2309-2332，2342-2368，2753-2770，2832-2854，2990-3005，3020-3042，3059-3075，3105-3127，3142-3162，3437-3453，3560-3577，3591-3606，3610-3627，3656-3678，3710-3738，3723-3738和3760-3777。优选该片段包含以下一个或多个SEQ ID NO：6039的多肽序列：2206-2224，2316-2332，2335-2358，2753-2770，3024-3042，3054-3075，3105-3127，3589-3606，3611-3629，3756-3777，2208-2231，2753-2770，3020-3042，3059-3075和3591-3606。优选该片段包含以下一个或多个SEQ ID NO：6039的多肽序列：2206-2224和3020-3042。本发明还包括编码上面鉴定的各个多肽片段的多核苷酸。
本发明包括减毒的SARS病毒，其中所述减毒的SARS病毒在编码上面鉴定的一个疏水结构域的多核苷酸中含有添加、缺失或取代。本发明还包括制造减毒SARS病毒的方法，该方法包括通过对SARS病毒基因组进行添加、删除或取代而改变上面鉴定的SEQ ID N0：6039中一个或多个疏水结构域的编码使SARS病毒发生突变。
本发明包括特异性识别上面鉴定的SEQ ID NO：6039中一个或多个疏水结构域的抗体。本发明包括能结合上面鉴定的SEQ ID NO：6039中一个或多个疏水结构域、干扰其疏水性或使其破坏的小分子。
预测的SEQ ID NO：6039的N-糖基化位点见下表中的鉴定。
     位置                  可能性    同意   Nglyc结果
  48 NGTC SEQ ID NO：7180  0.6371    (7/9)  +
 389 NHSN SEQ ID NO：7181  0.6132    (6/9)  +
 916 NFSS SEQ ID NO：7182  0.5807    (7/9)  +
1628 NHTK SEQ ID NO：7183  0.5610    (7/9)  +
1696 NKTV SEQ ID NO：7184  0.5297    (5/9)  +
2031 NPTI SEQ ID NO：9764  0.5299    (5/9)  +  WARNING：PRO-X1.
2249 NSSN SEQ ID NO：7185  0.6329    (9/9)  ++
2459 NPTD SEQ ID NO：9765  0.5599    (6/9)  +  WARNING：PRO-X1.
2685 NVSL SEQ ID NO：7186  0.6071    (8/9)  +
4233 NATE SEQ ID NO：7187  0.6144    (7/9)  +
因此，本发明包括SEQ ID NO：6039的片段，其中所述片段包含的氨基酸序列含有一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。优选该片段包含一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NOS：7180-7187和9764-9765。优选该片段包含氨基酸序列NSSN(SEQ IDNO：7185)。
本发明包括含有SEQ ID NO：6039片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
在表13中鉴定了SEQ ID NO：6039的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：7400-7639的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)所述氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：7400-7639的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。
本发明提供所述多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
冠状病毒的ORF1a和ORF1b序列通常被翻译成一个ORF1ab多蛋白。翻译过程中核糖体的滑动产生一个a-1移码。这种滑动的一个区域如下所示：
     gggttttacacttagaaacacagtctgtaccgtctgcggaatgtggaaaggttatggctgtagttgtga
+1     G  F  T  L  R  N  T  V  C  T  V  C  G  M  W  K  G  Y  G  C  S  C  D
+3    G  F  Y  T  -  K  H  S  L  Y  R  L  R  N  V  E  R  L  W  L  -  L  -
    ccaactccgcgaacccttgatgcagtctgcggatgcatcaacgtttttaaacgggtttgcggtgtaagt
+1    Q  L  R  E  P  L  M  Q  S  A  D  A  S  T  F  L  N  G  F  A  V  -  V
+3   P  T  P  R  T  L  D  A  V  C  G  C  I  N  V  F  K  R  V  C  G  V  S
    gcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggcactagtactg(SEQ ID NO：7224)
+1    Q P V L H R A A Q A L V L(SEQ ID NOS：7225-7226)
+3   A A R L T P C G T G T S T(SEQ ID NOS：7227-7229)
它将产生以下翻译平移(SEQ ID NOS：7230-7231)：
ccaactccgcgaacccttgatgcagtctgcggatgcatcaacgtttttaaacgggtttgcggtgtaagt
 Q  L  R  E  P  L  M  Q  S  A  D  A  S  T  F  L  N R  V  C  G  V  S
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：7232的多肽。本发明包括的多肽含有与SEQ DNO：7232具有序列相同性的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：7232多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ ID NO：7232或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含编码SEQ ID NO：7232或其片段的多核苷酸序列。本发明包括的免疫原性组合物中含有SEQ ID NO：7232或其片段的多肽。本发明包括能识别含有SEQ ID NO：7232或其片段的多肽的抗体。
本发明还包括含有氨基酸序列X1-X2-X3的多肽，其中，X1是SEQ ID NO：7233，X2为1-10个氨基酸，X3是SEQ ID NO：7234。X2可包括1-10个氨基酸的任何序列(SEQ IDNOS：7235-7244)，但在优选的实施方案中，X2选自：F、FL、FLN、FLNR(SEQ ID NO：7245)、FLNRV(SEQ ID NO：7246)和FLNRVC(SEQ ID NO：7247)。优选X2是SEQ ID NO：7247。这些优选的实施方案示于SEQ ID NOS：7248-7253。
本发明包括的多肽含有与所述氨基酸序列X1-X2-X3具有序列相同性的氨基酸序列。本发明包括含有所述氨基酸序列X1-X2-X3的多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含所述氨基酸序列X1-X2-X3或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码所述氨基酸序列X1-X2-X3或其片段的多核苷酸序列。本发明包括的免疫原性组合物中含有所述氨基酸序列X1-X2-X3或其片段的多肽。本发明包括能识别含有所述氨基酸序列X1-X2-X3或其片段的多肽的抗体。
氨基酸序列X1-X2-X3(即SEQ ID NOS：7235-7244)被证实与鼠肝炎病毒的多蛋白功能上同源。该多蛋白经切割可产生多种蛋白质。可由X1-X2-X3多蛋白，其中X2是6个氨基酸(SEQ ID NO：7240)，生成的蛋白质如下。
  小鼠病毒蛋白质   在小鼠病毒中的坐标  在SEQ ID NO：7240中的坐标
  Nsp2   3334-3636   3241-3546
  Nsp3   3637-3923   3547-3836
  Nsp4   3924-4015(或4012)   3837-3919
  Nsp5   4016(或4013)-4209   3920-4117
  Nsp6   4210-4319   4118-4230
  Nsp7   4320-4456   4231-4369
  Nsp9   4457-5384   4370-5301
  Nsp10   5385-5984   5302-5902
  Nsp11   5985-6505   5903-6429
  Nsp12   6506-6879   6430-6775
  Nsp13   6880-7178   6776-7073
本发明包括氨基酸序列X1-X2-X3(即SEQ ID NOS：7235-7244)的片段，其中所述片段包含上表所鉴定的多肽序列之一。本发明还包括氨基酸序列X1-X2-X3的片段，其中所述片段包含在其N-末端有一丝氨酸并在其C-末端有一谷氨酰胺的多肽序列。本发明还包括氨基酸序列X1-X2-X3的片段，其中所述片段包含在其N-末端有一丙氨酸并在其C-末端有一谷氨酰胺的多肽序列。本发明还包括氨基酸序列X1-X2-X3的片段，其中所述片段包含在其N-末端有一天冬酰胺并在其C-末端有一谷氨酰胺的多肽序列。本发明还包括氨基酸序列X1-X2-X3的片段，其中所述片段包含在其N-末端有一半胱氨酸并在其C-末端有一谷氨酰胺的多肽序列。上述每个片段都可用于融合蛋白。
本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含至少一个上一段所鉴定的氨基酸序列X1-X2-X3(即SEQ ID NOS：7235-7244)的片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码至少一个上一段所鉴定的氨基酸序列X1-X2-X3的片段的多核苷酸序列。本发明包括免疫原性组合物，其中包含含有一个上一段所鉴定的氨基酸序列X1-X2-X3的片段的多肽。本发明包括能识别含有一个上一段所鉴定的氨基酸序列X1-X2-X3的片段的多肽的抗体。
氨基酸序列X1-X2-X3(其中X2是6个氨基酸)中预计的N-糖基化位点经鉴定是位于以下氨基酸位置上的天冬酰胺：48；389；556；916；1628；1696；1899；2079；2249；2252；2507；2685；3303；3373；3382；3720；4150；4233；4240；5016；5280；5403；5558；5650；5905；6031；6130；6474；6918；6973。因此，本发明包括SEQID NO：7239的片段，其中所述片段有至少10个氨基酸，且其中所述片段包含一个或多个SEQ ID NO：7239以下氨基酸位置上的天冬酰胺：8；389；556；916；1628；1696；1899；2079；2249；2252；2507；2685；3303；3373；3382；3720；4150；4233；4240；5016；5280；5403；5558；5650；5905；6031；6130；6474；6918；和6973。
SEQ ID NOS：7235-7244内的锌结合区2位点经鉴定位于氨基酸残基2102-2112(SEQ ID NO：7254HGIAAINSVPW)。SEQ ID NOS：7235-7244的多肽将被SARS病毒加工成为多个肽。该锌结合区落入多肽的nsp1区域。SEQ ID NO：7254是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶点。本发明包括含有SEQ ID NO：7254的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：7254的多肽序列的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：7254以作为抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：7254。本发明包括SEQ ID NOS：7235-7244的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO：7254。本发明包括含有SEQ ID NO：7254的多肽，其中所述多肽与锌原子复合。本发明包括能防止锌离子与SEQ ID NO：7254多肽结合的小分子。本发明包括融合蛋白，其中所述融合蛋白含有SEQ ID NO：7254。
SARS病毒编码的多蛋白将含有至少两个蛋白酶结构域：木瓜蛋白酶-样半胱氨酸(cystein)蛋白酶(PLP)和糜蛋白酶-小核糖核酸病毒3C-样蛋白酶(3CLp)。(PLP结构域可有一个以上的拷贝)。这些蛋白酶的功能是将该多蛋白切割成多个较小的蛋白质。3C-样蛋白酶，也称为“主要蛋白酶(main protease)”或Mpro，本身是通过其自身蛋白酶(autoprotease)活性从多蛋白上切割的。通常可参见Fields等(编)的《病毒学领域》(Fields Virology)(第二版，B.N.Raven Press，New York，NY)第35章，以及Anand等，EMBO Journal(2002)21(13)：3213-3224。3CLp通常与上面鉴定的Nsp2区域相对应。
SARS病毒3CLp蛋白还以SEQ ID NO：6569(还有SEQ ID NO：9769)为特征，如图15所示。
图16也示出了SARS病毒3CLp与鸟传染性支气管炎(IBV；SEQ ID NO：6570)、小鼠肝炎病毒(MHV；SEQ ID NO：6571)和牛冠状病毒(BCoV；SEQ ID NO：6572)的3CLp对比的结果。因此，本发明包括的多肽序列含有SEQ ID NO：6569或其片段或与其具有序列相同性的多肽序列。本发明还包括编码SEQ ID NO：6569或其片段的多核苷酸序列。本发明包括编码与SEQ ID NO：6569具有序列相同性的多肽序列的多核苷酸序列。
本发明还包括筛选SARS病毒3CLp蛋白抑制剂的方法。一实施方案中，本发明包括筛选SEQ ID NO：6569抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SARS病毒3CLp蛋白的方法。本发明包括重组表达含有SEQ ID NO：6569的多肽序列或其酶解的活性片段或与其具有序列相同性的多肽序列的方法。本发明包括抑制或降低SARS病毒3CLp蛋白的蛋白水解活性的小分子。本发明包括抑制或降低含有SEQ IDNO：6569多肽的蛋白水解活性的小分子。
在图15和16中鉴定了SARS病毒3CLp的催化残基。具体地说，鉴定了催化性组氨酸和催化性半胱氨酸。这种催化位点是可抑制或降低3CLp蛋白酶活性的小分子的靶点。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6569的片段的多肽，其中所述片段包含至少一种催化位点。优选所述催化位点选自图15和16中的催化性组氨酸和催化性半胱氨酸。本发明包括编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：6569的片段，其中所述片段包含至少一个催化位点。优选所述催化位点选自图15和16中的催化性组氨酸和催化性半胱氨酸。
本发明还包括筛选化合物文库以鉴定能抑制SARS病毒3CLp催化位点的小分子的方法。优选该3CLp包含SEQ ID NO：6569或其片段，或与其具有序列相同性的序列。该催化位点优选选自图15和16中示出的催化性组氨酸和催化性半胱氨酸。
本发明包括抑制SARS病毒3CLp催化位点的小分子。优选3CLp包含SEQ IDNO：6569，或其片段，或与其具有序列相同性的序列。该催化位点优选选自图15和16中示出的催化性组氨酸和催化性半胱氨酸。
图15和16中鉴定了SARS病毒3CLp底物位点的残基。具体地说，底物位点位于苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸上。这种底物位点是能抑制或降低3CLp蛋白酶活性的小分子的靶。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6569的片段的多肽，其中所述片段包含至少一个底物位点。优选所述底物位点选自图15和16中的底物苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。本发明包括编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：6569的片段，所述片段包含至少一个底物位点。优选所述底物位点选自图15和16中的底物苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。
本发明还包括筛选化合物文库以鉴定封闭SARS病毒3CLp底物位点的小分子的方法。优选3CLp包含SEQ ID NO：6569或其片段，或与其具有序列相同性的序列。该底物位点优选选自图15和16中示出的底物苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。
本发明包括抑制SARS病毒3CLp底物位点的小分子。优选3CLp包含SEQ IDNO：6569，或其片段，或与其具有序列相同性的序列。该底物位点优选选自图15和16中示出的底物苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸。
本发明还包括含有编码SARS病毒3CLp或其片段的多核苷酸的诊断试剂盒。优选SARS病毒的3CLp包含SEQ ID NO：6569或其片段，或与其具有序列相同性的多肽序列。优选该片段包含选自催化位点和底物位点的一个或多个位点。优选该催化位点选自图15和16中鉴定的一个或多个位点。优选该底物位点选自图15和16中鉴定的一个或多个位点。
本发明还包括含有SARS病毒3CLp特异性抗体或其片段的诊断试剂盒。优选该抗体为含SEQ ID NO：6569的多肽，或其片段，或与其具有序列相同性的多肽序列的特异性抗体。优选该抗体为选自催化位点和底物位点的一个或多个SARS病毒3CLp位点的特异性抗体。优选该催化位点选自图15和16中所鉴定的一个或多个位点。优选该底物位点选自图15和16中所鉴定的一个或多个位点。
本发明包括含有图25所示序列的氨基酸序列的多肽。用*分开的图25中的氨基酸序列是SEQ ID NOS：7188和7189。本发明包括含有与图25翻译物具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有图25序列多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含图25翻译物或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码图25翻译物或其片段的多核苷酸序列。本发明包括免疫原性组合物中含有图25翻译物或其片段的多肽。本发明包括能识别含有图25所示序列或其片段的多肽的抗体。图25的序列被证明与冠状病毒的ORF1b功能上同源。
SEQ ID NO：7188是图25内的开放读框。本发明包括含有SEQ ID NO：7188的多肽。本发明包括多肽含有与SEQ ID NO：7188具有序列相同性的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：7188的多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ IDNO：7188或其片段的多肽。本发明包括含有编码SEQ ID NO：7188或其片段的多核苷酸序列的诊断试剂盒。本发明包括免疫原性组合物，其中包含含有SEQ ID NO：7188或其片段的多肽。本发明包括能识别含有SEQ ID NO：7188或其片段的多肽的抗体。
SEQ ID NO：7190是SEQ ID NO：7188内的开放读框。本发明包括含有SEQ ID NO：7190的多肽、其片段或与其具有序列相同性的多肽。本发明还包括编码SEQ ID NO：7190、其片段或与其具有序列相同性的多肽的多核苷酸。编码SEQ ID NO：7190的多核苷酸的一个例子是SEQ ID NO：7191。
SEQ ID NO：7188也含有包含SEQ ID NO：6042的开放读框。本发明包括含有SEQ IDNO：6042的多肽。本发明包括含有与SEQ ID NO：6042具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有SEQ ID NO：6042的多肽的片段。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ ID NO：6042或其片段的多肽。本发明包括含有编码SEQ ID NO：6042或其片段的多核苷酸序列的诊断试剂盒。本发明包括免疫原性组合物，其中包含含有SEQ ID NO：6042或其片段的多肽。本发明包括能识别包含SEQ ID NO：6042或其片段的多肽的抗体。SEQ ID NO：6042被证明与冠状病毒刺突蛋白功能上同源。
预计的SEQ ID NO：6042的跨膜区经鉴定如下。
预计的SEQ ID NO：6042的跨膜螺旋
括号中的序列位置表示核心区域。
只有当评分超过500才被认为有意义。
内向外螺旋：发现18个                    外向内螺旋：发现13个
始于    终于         评分   中心      始于    终于         评分   中心
1(1)16(16)            959   9         1(1)17(17)            684   10
233(237)257(252)      905   244       222(222)240(237)      238   229
345(347)364(361)      490   354       244(247)264(264)      613   254
345(354)369(369)      420   362       349(355)369(369)      314   362
497(497)513(513)      239   506       496(496)511(511)      488   503
573(573)588(588)      811   580       573(573)591(591)      712   581
645(648)666(663)      302   656       650(652)666(666)      474   659
690(696)714(711)      428   704       674(679)702(696)      190   686
857(860)882(874)      1508  867       691(696)713(711)      210   704
1031(1031)1046(1046)  446   1039      866(868)886(886)      1172  876
1199(1203)1219(1217)  2667  1210      1198(1201)1215(1215)  3221  1208
刺突蛋白SEQ IID NO：6042是暴露在表面的多肽。疏水跨膜区可能妨碍蛋白质的重组表达。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的多肽，其中，上面鉴定的一个或多个疏水区被除去。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。本发明包括在宿主细胞中重组表达该蛋白质。用来扩增刺突蛋白基因的引物及其片段，如编码可溶性胞外域的片段，包括SEQ ID NOS：9753-9763(Xiao等(2003)Biochem Biophys Res Comm312：1159-1164)。
SEQ ID NO：6042的其它特征经鉴定如下。
PSORT—蛋白质定位位点预测
                               版本6.4(WWW)
SEQ ID NO：6042-1255残基
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
计数：2
最N-端位置TMS：496，i＝2
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
I(中部)：503电荷差异(C-N)：1.0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
UR长度：13
UR峰值：3.28
CR净电荷：0
辨别评分：8.66
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
信号肽评分(-3.5)：5.94
可能的切割位点：13
>>>似乎含有可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
从14位计算
ALOM新计数：1**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：0B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
计数：1值：-12.26   域值：-2.0
内部可能性＝-12.26  跨膜1202-1218(1194-1228)
外围可能性＝0.16
修饰的ALOM评分：2.55
>>>似乎含有Ia型膜蛋白
胞质尾自1219至1255(37残基)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(14)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
基序位于：14
不可切割？Ipos设为：24
靶向线粒体序列的辨别：
正电(2.18)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
(Gavel位置24)从：1至：10评分：8.0
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
位置：964(1255)，计数：1SRL
SKL评分(过氧化物酶体)：0.1
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：1.37
不从N-末端计的AAC，修改的评分
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
AAC评分(过氧化物酶体)：0.079
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
评分：0.39状态：不清楚
Ia型尾中的GY基序？(溶酶体)
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号状态：阴性(0.00)
Ia型为质膜蛋白质优选
核实NPXY基序.
核实YXRF基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
-----最终结果-----
质膜---确定性＝0.460(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.171(肯定的)<成功>
内质网(膜)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
内质网(腔)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
SEQ ID NO：6042显示具有N-末端信号区，它之后依次是暴露于表面的区域、跨膜区和C-末端胞质结构域。因此，本发明包括SEQ ID NO：6042的具有免疫原性并暴露于表面的片段。优选所述片段不含SEQ ID NO：6042C-末端的最后50个氨基酸的氨基酸序列。优选所述片段包括不含SEQ ID NO：6042C-末端的最后70个氨基酸的氨基酸序列。优选所述片段不含SEQ ID NO：6042的翻译区(transdomain region)。优选所述片段不含SEQ ID NO：6042的C-末端胞质结构域。优选所述片段不含N-末端信号序列。优选所述片段不含SEQ ID NO：6042N-末端的氨基酸1-10。优选所述片段不含SEQ ID NO：6042N-末端的氨基酸1-14。能够引发抗-刺突抗体的SEQ IDNO：6042的两个寡肽片段是SEQ ID NOS：7398和7399，如Xiao等所述(具有额外的C-末端半胱氨酸)，2003，Biochem Biophys Res Comm 312：1159-1164。Yang等(2004)描述了刺突蛋白的截短C-末端，该截短除去了胞质区部分，或者还除去了跨膜区(Nature 428：561-564)。
本发明所包括的SEQ ID NO：6042的一个变体是SEQ ID NO：9962。与SEQ ID NO：6042相比，该序列在残基581位上用Ser代替了Ala，并在残基1152位上用Phe代替Leu。
冠状病毒的刺突蛋白可被切割成两个独立的链S1和S2。这两条链仍可结合在一起形成二聚体或三聚体。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的多肽，其中所述多肽被切割成S1和S2结构域。本发明还包括含有SEQ ID NO：6042的多肽，其中，N-末端的氨基酸1-10，优选氨基酸1-14被除去，且其中SEQ ID NO：6042被切割成S1和S2结构域。优选所述多肽为三聚体形式。
刺突蛋白似乎在蛋白质的跨膜区，优选在S2结构域内形成一个α-螺旋结构。这种α-螺旋结构被认为可与至少两个其它刺突蛋白结合形成三聚体。下面鉴定了刺突蛋白的螺旋或卷曲区域。预计SEQ ID NO：6042(刺突蛋白)的卷曲螺旋位于氨基酸900-1005和1151-1185(参见图12)。
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽序列，其中所述片段包括SEQ ID NO：6042的卷曲区域。所述片段优选包括选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：6042的第900-1005位氨基酸和1151-1185位氨基酸。本发明包括含有SEQ IDNO：6042的片段的多肽序列，其中所述片段不包括SEQ ID NO：6042的卷曲区域。所述片段优选包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6042的第900-1005位氨基酸和1151-1185位氨基酸。
刺突蛋白被认为在冠状病毒与哺乳动物宿主细胞融合和感染中扮演了中介作用。通过分析冠状病毒刺突蛋白以及其它病毒中类似的表面蛋白鉴定到至少两个与这种融合有关的结构基序：七残基重复序列(HR)和膜融合肽，这两个基序通常位于S2结构域内。
在冠状病毒S2结构域的胞外域中通常发现至少有两个4，3疏水七残基重复序列(HR)结构域。一个七残基重复序列区(HR1)通常位于邻近融合肽的地方，而第二个七残基重复序列区(HR2)通常位于S2结构域的C-末端附近，邻近跨膜锚定点。七残基重复序列的特征是卷曲螺旋结构，在病毒表面蛋白(如冠状病毒刺突蛋白)中发现的七残基重复序列被认为形成与病毒侵入有关的成束螺旋结构。参见Bosch等，J.Virology(2003)77：8801-8811(该参考文献的图1B示出了SARS和5种冠状病毒HR1和BR2区域的对比，表示为“HCov-SARS”)。
七残基重复序列通常含有7个氨基酸的重复结构，表示为a-b-c-d-e-f-g，其中，残基a和d的疏水侧链通常形成一非极性条纹(stripe)，而在残基e和g中发现了静电相互作用。位置a最常是Leu、Ile或Ala，而位置d常是Leu或Ala。残基e和g常是Glu或Gln，而Arg和Lys也主要出现于位置g。带电残基常见于b、c和f位，这些残基可与溶剂接触。已知这些常规参数有例外。例如，这7个氨基酸中有时会发现Pro残基。
已假定MHV株的HR1和HR2序列可装配成耐热性寡聚α螺旋棒样复合体，复合体中HR1和HR2螺旋以反平行方式走向。同样，在该研究中提出，HR2是病毒进入细胞以及细胞-细胞融合的强抑制剂。
已在SARS病毒基因组中鉴定到HR1和HR2序列。SARS病毒HR1区大致包含SEQ IDNO：6042的氨基酸879-1005，或其能够形成至少一个α-螺旋转角的片段。优选所述片段包含至少7个(例如，至少14个、21个、28个、35个、42个、49个或56个)氨基酸残基。SEQ ID NO：7192包括SEQ ID NO：6042的氨基酸879-1005。
优选的HR1片段包含SEQ ID NO：6042的氨基酸残基879-980。该优选片段是SEQID NO：7193。
另一个优选的HR1片段包含SEQ ID NO：6042的氨基酸残基901-1005。该优选片段是SEQ ID NO：7194。
SARS病毒HR2区大致包含SEQ ID NO：6042的氨基酸1144-1201，或其能够形成至少一个α-螺旋转角的片段。优选所述片段包含至少7个(例如，至少14个、21个、28个、35个、42个、49个或56个)氨基酸残基。SEQ ID NO：7195包括氨基酸1144-1201。优选的HR2片段包含SEQ ID NO：6042的氨基酸1144-1195。该优选片段是SEQ IDNO：7196。
刺突蛋白中的膜融合肽序列也被认为参与病毒与宿主细胞融合(和感染)。融合肽通常含有约16-26个在病毒家族内保守的氨基酸残基。这些膜融合肽是相对疏水的，并且当它们形成α螺旋时通常显示为不对称性疏水性分布。它们通常也富含丙氨酸和甘氨酸。
在冠状病毒中鉴定到至少三个疏水性膜融合肽区域(PEP1、PEP2和PEP3)。参见Luo等，“鼠冠状病毒刺突蛋白中两个保守的疏水区在细胞-细胞融合中的作用”(Roles in Cell-Cell Fusion of Two Conserved Hydrophobic Regions in the MurineCoronavirus Spike Protein)，Virology(1998)244：483-494。该论文的图1显示了小鼠肝炎病毒、牛冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、传染性胃肠炎病毒和传染性支气管炎病毒的膜融合肽序列的对比。也可参见Bosch等，“冠状病毒刺突蛋白是I类病毒融合蛋白：融合核心复合体的结构和功能”(The Coronavirus Spike Protein isa Class I Virus Fusion Protein：Structural and Functional Characterizationof the Fusion Core Complex)Journal of Virology(2003)77(16)：8801-8811。
还鉴定到SARS刺突蛋白中的PEP1(SEQ ID NO：7197)、PEP2(SEQ ID NO：7198)和PEP3(SEQ ID NO：7199)序列。
认为冠状病毒刺突蛋白(以及其它类似的表面病毒蛋白)在受体与靶细胞膜结合后经历了构象变化。认为这种构象变化的结果是一个或多个疏水性膜融合肽被暴露并插入靶细胞膜中。当随后刺突蛋白重折叠成它最稳定的构象时释放出的自由能据认为在病毒与细胞膜融合中发挥重要作用。
可用一个或多个SARS HR序列，优选HR2或其片段来抑制病毒进入以及与哺乳动物宿主靶细胞膜融合。本发明提供了一种抑制病毒感染的方法，所述方法包括给予含有一种或多种SARS HR多肽或其片段的组合物。优选所述组合物含有SARS HR2序列。
在另一实施方案中，本发明包括含有SARS HR1序列或其片段以及SARS HR2序列或其片段的组合物。所述HR1和HR2序列可任选相互结合形成寡聚物。所述组合物可包含HR1和HR2结构域之间的中间结构域序列。利用这种中间序列可促进HR区之间的寡聚化或其它结构性相互作用。
可用本领域已知的方法重组生产用于本发明的HR序列。可修饰SARS HR序列以利于细菌表达。具体地说，可修饰HR序列以利于将该重组蛋白输送到细菌宿主细胞表面。例如，可在重组HR序列的N末端加入细菌膜蛋白的前导序列。还可用此领域已知的方法通过化学合成来产生用于本发明的HR序列(见下文)。
申请人已经鉴定了SARS刺突蛋白和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的表面蛋白NadA(以及其它类似的细菌黏着蛋白)之间的结构类似性，本说明书将在下面更详细地论述。另一种利于细菌表达HR序列的方法包括在重组HR序列的C-末端加入NadA-样蛋白的柄(stalk)和/或锚序列。优选将含有细菌锚序列的重组序列制备在外膜囊泡中(之后将在申请中更详细叙述它的制备)。缺失该细菌锚序列的重组序列可被分泌并从上清中分离得到。
本发明包括的多肽序列包含第一序列和第二序列，其中所述第一序列包括细菌膜蛋白的前导序列，所述第二序列包含冠状病毒的HR序列。优选所述第一序列包含细菌粘附素蛋白的前导序列。更优选所述细菌黏着蛋白是NadA。优选所述第二序列包含HR1、HR2或这两者。一实施方案中，所述第二序列包含HR1、HR2和天然产生的刺突蛋白中存在的中间结构域序列。例如，所述第二序列可包含冠状病毒刺突蛋白片段，该片段中包含开始于HR1区域N-末端并终止于HR2区域C-末端的氨基酸。
本发明还包括含有第一、第二、第三和第四序列的多肽序列，其中所述第一序列包括细菌膜蛋白的前导序列；其中所述第二序列包含冠状病毒的HR序列；其中所述第三序列包含细菌粘着蛋白的柄区域；且其中所述第四序列包含细菌黏着蛋白的锚区域。一实施方案中，含有前导肽序列的第一序列被除去。在另一实施方案中，含有柄区域的第三序列被除去。在另一实施方案中，含有锚区域的第四序列被除去。
可用此领域已知的方法，例如，可通过甘氨酸接头将上述构建物的多肽序列连接在一起。
可用于这种细菌表达系统的构建物的例子示于图50。图50所示各个构建物的多肽序列给在SEQ ID NOS：7200-7206中。
7200  前导区NadA(2-29)-HR1(879-980)-6Xgly-HR2(1144-1195)-柄+锚NadA(88-405)
7201  前导区NadA(1-29)-HR1(879-980)-6Xgly-HR2(1144-1196)-柄NadA(88-351)
7202  前导区NadA(1-29)-HR1-HR2(879-1196)-柄+锚NadA(88-405)
7203  前导区NadA(1-29)-HR1-HR2(879-1196)-柄NadA(88-351)
7204  HR1-HR2(879-1196)-柄NadA(88-351)-6个his
7205  前导区NadA(1-29)-HR1-HR2(879-1196)-锚NadA(351-405)
7206  前导区NadA(1-29)-HR1-HR2(879-1196)
给予这些膜融合序列中的一种或多种也可能干扰冠状病毒与宿主细胞膜融合的能力。因此，本发明包括含有以下氨基酸序列的分离的多肽：SEQ ID NO：7197、SEQID NO：7198和SEQ ID NO：7199。本发明还包括含有与以下氨基酸序列具有序列同源性的氨基酸序列的分离的多肽：SEQ ID NO：7197、SEQ ID NO：7198和SEQ ID NO：7199。
这些SARS膜融合肽中的两个或多个可被结合在一起。本发明包括含有两种SARS膜融合肽的组合物，其中所述肽选自至少两种选自下组的氨基酸：SEQ ID NO：7197、SEQ ID NO：7198和SEQ ID NO：7199，或与其具有序列相同性的序列。
两种或多种SARS膜融合肽可连接在一起。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的多肽，其中所述第一和第二氨基酸序列选自下组：SEQ IDNO：7197、SEQ ID NO：7198和SEQ ID NO：7199，或与其具有序列相同性的序列。优选所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列是不同的SARS膜融合肽，即它们不是相同的。
本发明还包括治疗或预防SARS病毒感染的方法，该方法包括给予一种或多种上述SARS膜融合肽组合物。
如上所述，所述刺突蛋白能够形成三聚体。本发明还包括含有三聚形式SEQ IDNO：6042的多肽。本发明包括至少含有多肽的组合物，其中各个多肽至少包含SARS病毒刺突蛋白的α-螺旋卷曲区。优选所述刺突蛋白包含SEQ ID NO：6042或其片段。
本发明还包括含有SARS病毒刺突蛋白或其片段的的组合物，其中所述蛋白质与跨膜有关，且其中所述片段包含SARS病毒刺突蛋白的α-螺旋区域。优选该组合物包含至少三个SARS病毒刺突蛋白或其片段，其中所述片段包含SARS病毒刺突蛋白的α-螺旋区域。
本发明还包括特异性结合SARS病毒刺突蛋白三聚形式的抗体。优选所述刺突蛋白包含SEQ ID NO：6042或其片段。本发明包括特异性结合SARS病毒刺突蛋白三聚形式的抗体，其中所述蛋白质与跨膜有关。
本发明还包括特异性结合SARS病毒刺突蛋白单体形式或其片段的抗体。优选所述抗体特异性结合SEQ ID NO：6042或其片段的单体形式。
本发明还包括干扰或破坏SARS病毒刺突蛋白三聚体卷曲的小分子。
本发明还包括用作疫苗的减毒SARS病毒，其中所述减毒的病毒含有不会破坏SARS病毒刺突蛋白三聚构象的多核苷酸插入、缺失或取代。本发明还包括用作疫苗的减毒SARS病毒，其中所述减毒的病毒含有不会破坏SARS病毒刺突蛋白α-螺旋形成的多核苷酸插入、缺失或取代。
可通过重组方法制造刺突蛋白。一实施方案中，所述刺突蛋白在病毒样颗粒中表达，从而该蛋白质附着于细胞膜上。这种附着有利于提呈刺突蛋白的免疫原性表位。优选刺突蛋白的α-螺旋部分与细胞膜结合。优选刺突蛋白在结合的跨膜区内形成三聚体。
预测的SEQ ID NO：6042的N-糖基化位点经鉴定如下：
位置                        可能性       同意   NGlyc结果
  29  NYTQ  SEQ ID NO：7207  0.7751      (9/9)  +++
  65  NVTG  SEQ ID NO：7208  0.8090      (9/9)  +++
 109  NKSQ  SEQ ID NO：7209  0.6081      (7/9)  +
 119  NSTN  SEQ ID NO：7210  0.7039      (9/9)  ++
 158  NCTF  SEQ ID NO：7211  0.5808      (7/9)  +
 227  NITN  SEQ ID NO：7212  0.7518      (9/9)  +++
 269  NGTI  SEQ ID NO：7213  0.6910      (9/9)  ++
 318  NITN  SEQ ID NO：7214  0.6414      (9/9)  ++
 330  NATK  SEQ ID NO：7215  0.6063      (8/9)  +
 357  NSTF  SEQ ID NO：7216  0.5746      (8/9)  +
 589  NASS  SEQ ID NO：7217  0.5778      (6/9)  +
 602  NCTD  SEQ ID NO：7218  0.6882      (9/9)  ++
 699  NFSI  SEQ ID NO：7219  0.5357      (7/9)  +
 783  NFSQ  SEQ ID NO：7220  0.6348      (9/9)  ++
1080  NGTS  SEQ ID NO：7221  0.5806      (7/9)  +
1116  NNTV  SEQ ID NO：7222  0.5106      (5/9)  +
1176  NESL  SEQ ID NO：7223  0.6796      (9/9)  ++
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上文鉴定的糖基化位点(SEQ ID NOS：7207-7223)。本发明还包括编码一种或多种上述片段的多核苷酸。这种糖基化位点可共价连接到糖上。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上文鉴定的糖基化位点，且其中所述多肽在一个或多个上述位点被糖基化。
预测的O-糖基化位点经鉴定如下：
残基      编号      可能性      阈值      意见
Thr      698      0.8922      0.7696      T
Thr      706      0.9598      0.7870      T
Thr      922      0.9141      0.7338      T
Ser      36       0.8906      0.7264      S
Ser      703      0.8412      0.7676      S
本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的O-糖基化位点。本发明还包括编码一个或多个上述片段的多核苷酸。本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上文鉴定的O-糖基化位点，且其中所述多肽在一个或多个所含糖基化位点共价连接到糖上。
本发明还包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点，且其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的O-糖基化位点。
本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
预测的SEQ ID NO：6042的磷酸化位点是Ser-346、Tyr-195和Tyr-723。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6042的片段的多肽，其中所述片段包含至少10个氨基酸残基，且其中所述片段包含一个或多个选自下组的氨基酸：Ser-346、Tyr-195和Tyr-723。一实施方案中，一个或多个选自Ser-346、Tyr-195和Tyr-723的氨基酸被磷酸化。
Xiao等(2003)Biochem Biophys Res Comm 312：1159-1164已经描述了刺突糖蛋白的表达和功能特征。
表16中鉴定了SEQ ID NO：6042的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自鉴定为SEQ ID NOS：8041-8280的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)所述氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)所述多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒来表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有两个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：8041-8280的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
以下抗原用途是优选的：(1)作为T-细胞抗原；(2)用于在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间生成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)引发CTL应答的抗原。该用途优选预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)以抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中，所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物如上文所定义的多肽，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，并优选CTL应答。所述免疫应答优选保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6040的多肽。本发明包括的多肽含有与SEQ IDNO：6040具有序列相同性的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6040的多肽的片段。本发明包括编码SEQ ID NO：6040或其片段的多核苷酸。本发明包括含有SEQ IDNO：6040或其片段的多肽的诊断试剂盒。本发明包括含有编码SEQ ID NO：6040或其片段的多核苷酸序列的诊断试剂盒。本发明包括能识别含有SEQ ID NO：6040或其片段的多肽的抗体。
SEQ ID NO：6040被证实与冠状病毒的膜蛋白功能上同源。预测的SEQ ID NO：6040的跨膜螺旋经鉴定如下：
预测的跨膜螺旋
括号中的序列位置表示核心区域。
只有当评分超过500才被认为有意义。
内向外螺旋：发现3个
从            至               评分            中心
27(30)       48(45)            1138            38
137(139)     153(153)          486             146
外向内螺旋：发现3个
从           至                 评分           中心
28(31)       45(45)             819            38
71(73)       90(90)             210            81
136(142)     156(156)           272            149
具有最高预测跨膜螺旋区域的氨基酸区域从SEQ ID NO：6040第27位氨基酸到第48位。这种跨膜区通常难以重组表达。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6040的片段的多肽，其中所述片段不包括第27-48位之间的氨基酸序列。本发明包括含有SEQID NO：6040的片段的多肽，其中所述片段不包括第28-45位之间的氨基酸序列。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6040是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6040蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6040位于以下部位之一：线粒体基质间隙、微体(过氧化物酶体)、细胞核以及线粒体内膜。预计SEQ ID NO：6040与受感染细胞内的细胞器相结合。
因此，SEQ ID NO：6040是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶点。本发明包括含有SEQID NO：6040或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6040的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6040的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6040。本发明包括能防止SEQ ID NO：6040多肽与受感染细胞内的细胞器相结合的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6040的融合蛋白。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                                     版本6.4(WWW)
SEQ ID NO：6040        163残基
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：9
    UR峰值：1.75
    CR净电荷：1
    辨别评分：-2.56
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：1.94
    可能的切割位点：53
>>>似乎没有N-端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：0**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：0B
ALOM：发现跨膜区(K1ein等)
    计数：0值：1.32域值：-2.0
    外围可能性＝1.32
    修饰的ALOM评分：-1.16
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：156
    HRSVTI
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(0.88)
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置156)从：27至：44 评分：5.0
线粒体基质？评分：0.36
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：99(163)，计数：1 SKL
    SKL评分(过氧化物酶体)：0.3
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：-4.28
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：0.02状态：不清楚
对溶酶体的修改评分：0.152
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
    发现：位置：132(5)KRKR
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核修改  评分：0.60
核信号肽  状态：不清楚(0.30)
核实CaaX基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实CaaX基序.
-----最终结果-----
线粒体基质间隙---确定性＝0.480(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.300(肯定的)<成功>
核---确定性＝0.300(肯定的)<成功>
线粒体内膜---确定性＝0.188(肯定的)<成功>
预测的SEQ ID NO：6040的N-糖基化位点经鉴定如下。
位置                      可能性       同意  NGlyc结果
2NKTG(SEQ ID NO：7255)    0.7804      (9/9)  +++
106NLTL(SEQ ID NO：7256)  0.6123      (7/9)  +
因此，本发明包括SEQ ID NO：6040的片段，其中所述片段至少有10个氨基酸，且其中所述片段在选自SEQ IID NO：6040第2-106位的氨基酸位置上包含一个或多个天冬酰胺。本发明包括SEQ ID NO：6040的片段，其中所述片段包含一个或多个选自SEQ ID NO：7255和SEQ ID NO：7256的氨基酸序列。优选所述片段包含氨基酸序列NKTG(SEQ ID NO：7255)。
本发明包括含有SEQ ID NO：6040的片段的多肽，其中所述片段不包括一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
表14鉴定了SEQ ID NO：6040的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自鉴定为SEQ ID NOS：7640-7800的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒来表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有两个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：7640-7800的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
以下抗原用途是优选的：(1)作为T-细胞抗原；(2)用于在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间生成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)引发CTL应答的抗原。该用途优选预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。
本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)以抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中，所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物如上文所定义的多肽，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，并优选CTL应答。所述免疫应答优选保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6041的多肽。SEQ ID NO：6041经证明与ORF1ab多蛋白的一部分功能上同源。本发明包括含有与SEQ ID NO：6040具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有SEQ ID NO：6041的多肽片段。本发明包括编码含有与SEQ ID NO：6041具有序列相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本发明包括编码含SEQ ID NO：6041多肽的片段的多核苷酸。
本发明包括装有SEQ ID NO：6041或其片段的多肽的诊断试剂盒。本发明包括含有编码SEQ ID NO：6041或其片段的多核苷酸序列的诊断试剂盒。本发明包括的免疫原性组合物含有SEQ ID NO：6041多肽或其片段。本发明包括能识别含有SEQ IDNO：6041或其片段的多肽的抗体。
冠状病毒的多蛋白与酶活性有关。因此，SEQ ID NO：6041是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶点。本发明包括含有SEQ ID NO：6041或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6041多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6041的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6041。本发明包括防止SEQ ID NO：6041多肽发挥共酶活性的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6041的融合蛋白。
下面鉴定了SEQ ID NO：6041的预测跨膜区或疏水区。虽然冠状病毒的多蛋白被蛋白水解切割成许多较小的蛋白质，但已知该多蛋白内的疏水结构域能介导膜与复制复合体相结合，并能够显著改变宿主细胞膜的结构。因此，多蛋白的疏水结构域是基因突变产生减毒SARS病毒疫苗的靶点。该疏水结构域还是SARS病毒小分子抑制剂的靶点。该疏水结构域也可用来产生能特异性结合那些区域的抗体以治疗或预防SARS病毒感染。
SEQ ID NO：6041可能的跨膜螺旋
括号中的序列位置表示核心区域。
只有当评分超过500才被认为有意义。
内向外螺旋：发现18个
 始于        终于      评分 中心
234(234)254(250)       1046 241
256(256)272(270)       252  263
319(319)334(334)       227  327
503(505)522(519)       405  512
613(615)633(629)       619  622
677(679)703(696)       467  689
849(851)869(865)       229  858
1080(1080)1097(1094)   306  1087
1147(1149)1163(1163)   354  1156
1557(1557)1581(1577)   817  1567
1954(1954)1971(1971)   832  1964
2369(2372)2395(2387)   300  2379
2513(2513)2532(2529)   690  2522
外向内螺旋：发现14个
始于         终于      评分   中心
239(239)254(254)       924    247
239(248)272(263)       468    256
311(314)334(328)       267    321
499(503)522(519)       485    512
617(617)634(631)       425    624
849(853)872(872)       572    864
1147(1147)1162(1162)   765    1155
1564(1564)1581(1579)   883    1572
1951(1951)1968(1966)   657    1958
2513(2522)2539(2537)   711    2529
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6041的片段的多肽，其中所述片段包含含有上面鉴定的一个或多个疏水跨膜序列的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6041的片段的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO：6041的以下一个或多个多肽序列：234-254、613-633、1557-1581、1954-1971、2513-2532、239-254、1564-1581、1951-1968、2513-2539。优选该片段包含SEQ ID NO：6041的以下一个或多个多肽序列：234-254和239-254。本发明还包括编码上面鉴定的各个多肽片段的多核苷酸。
本发明包括减毒的SARS病毒，其中所述减毒的SARS病毒在编码上面鉴定的一个疏水结构域的多核苷酸中有添加、缺失或取代。本发明还包括制造减毒SARS病毒的方法，该方法包括通过对SARS病毒基因组进行添加、删除或取代使SARS病毒发生突变，从而改变上面鉴定的SEQ ID NO：6041中一个或多个疏水结构域的编码。
本发明包括特异性识别上面鉴定的SEQ ID NO：6041中一个或多个疏水结构域的抗体。本发明包括结合上面鉴定的SEQ ID NO：6041中一个或多个疏水结构域、干扰其疏水性或使其破坏的小分子。
预测的SEQ ID NO：6041的N-糖基化位点在下表中鉴定。
位置                      可能性       同意    NGlyc结果
571NLSH(SEQ ID NO：7257)   0.6598      (8/9)  +
835NTSR(SEQ ID NO：7258)   0.5762      (7/9)  +
958NVTD(SEQ ID NO：7259)   0.7494      (9/9)  ++
1113NISD(SEQ ID NO：7260)  0.7259      (8/9)  +
1205NSTL(SEQ ID NO：7261)  0.6296      (9/9)  ++
1460NVTG(SEQ ID NO：7262)  0.6844      (9/9)  ++
1685NHSV(SEQ ID NO：7263)  0.5181      (5/9)  +
2029NKTT(SEQ ID NO：7264)  0.5423      (5/9)  +
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6041的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段含有一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明包括含有SEQ ID NO：6041的片段的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NOS：7257-7264中一个或多个序列。优选所述片段包含以下一个或多个序列：SEQ ID NOS：7257、7259、7260、7261和7262。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明包括含有SEQ ID NO：6041的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
在表15中鉴定了SEQ ID NO：6041的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：7801-8040的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有鉴定为SEQ ID NOS：7801-8040的一个或多个T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。
本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括多肽序列SEQ ID NO：6043或其片段。本发明包括含有与SEQ IDNO：6043具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6043的氨基酸序列或其片段的多核苷酸。
预测的SEQ ID NO：6043的跨膜区如下。
内向外螺旋：发现4个
从                至                 评分          中心
41(41)            56(56)             1789          49
76(79)            99(99)             2142          89
105(105)          125(125)           1250          115
外向内螺旋：发现3个
从至评分中心
41(41)            59(56)              2053         49
76(82)            98(96)              1580         89
103(105)          125(123)            1257         115
含有最高预测跨膜螺旋区的氨基酸区域从SEQ ID NO：6043第27位氨基酸到第99位。这种跨膜区通常难以重组表达。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6043的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包括第27-48位之间的氨基酸。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6043是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6043蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6043位于以下部位之一：线粒体内膜、胞质膜、高尔基体和线粒体内膜空隙。预计SEQ ID NO：6043与受感染细胞内的细胞器相结合。
因此，SEQ ID NO：6043是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶点。本发明包括含有SEQID NO：6043或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6043的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6043的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6043。本发明包括防止SEQ ID NO：6043的多肽与受感染细胞内的细胞器结合的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6043的融合蛋白。
PSORT---蛋白质定位位点预测，SEQ ID NO：6043
                                       版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：3
    最N-端位置TMS：40，i＝2
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：47  电荷差异(C-N)：3.5
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：12
    UR峰值：1.41
    CR净电荷：0
    辨别评分：-4.67
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：3.44
    可能的切割位点：15
>>>似乎没有N-端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：2**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：0B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：2值：-6.90     域值：-2.0
    内部可能性＝-6.90    跨膜83-99(78-101)
    内部可能性＝-5.04    跨膜40-56(37-60)
    外围可能性＝-0.32
    修饰的ALOM评分：1.48
>>>可能是IIIb型膜蛋白(Nexo Ccyt)
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：128
    MRCWLC
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(0.76)
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
***推理步骤：2
IIIa或IIIb型为内质网膜蛋白优选
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置128)从：39至：56 评分：11.5
>>>似乎含有线粒体内信号肽
线粒体内膜？评分：0.59
线粒体内膜空隙？评分：0.22
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：92(274)，计数：1SHL
    SKL评分(过氧化物酶体)：0.3
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：4.78
过氧化物酶体蛋白质？状态：阳性
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：1.16状态：不清楚
III型蛋白质可能定位于高尔基体
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号    状态：阴性(0.00)
核实III型的TMS数(质膜)
核实N-肉豆蔻酰化.
-----最终结果-----
线粒体内膜---确定性＝0.664(肯定的)<成功>
质膜---确定性＝0.600(肯定的)<成功>
高尔基体---确定性＝0.400(肯定的)<成功>
线粒体内膜空隙---确定性＝0.362(肯定的)<成功>
预测的SEQ ID NO：6043的N-和O-糖基化位点经鉴定如下。
位置                        可能性    同意     NGlyc结果
227NATF(SEQ ID NO：7265)    0.6328    (7/9)    +
残基   编号    可能性      阈值       意见
Thr    28      0.9095      0.6280T
Thr    32      0.8740      0.6595      T
Thr    34      0.9058      0.6655      T
Thr    170     0.6816      0.6600      T
Thr    267     0.9240      0.5779      T
Thr    268     0.7313      0.5708      T
Thr    269     0.9859      0.5583      T
Thr    270     0.8023      0.5492      T
Ser    27      0.6930      0.6091      S
Ser    252     0.6457      0.5977      S
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6043的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段包含上面鉴定的N-糖基化位点或O-糖基化位点。本发明包括含有SEQ ID NO：6043的片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点或O-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明包括含有SEQ ID NO：6043的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
在表17中鉴定了SEQ ID NO：6043的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：8281-8486的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：8281-8486的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6044的多肽。本发明包括含有SEQ ID NO：6044的片段或含有与SEQ ID NO：206具有序列相同性的序列的多肽。本发明包括编码SEQ IDNO：6044的多核苷酸。
SEQ ID NO：6044被鉴定为假想的蛋白质。下面鉴定了预测的SEQ ID NO：6044的疏水区或跨膜区：
内向外螺旋：发现3个
从                至                  评分           中心
1(1)              17(15)              891            8
47(47)            66(63)              221            56
外向内螺旋：发现4个
从                至                  评分           中心
1(4)              21(19)              599            11
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6044的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包括1-19位之间的氨基酸。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6044是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6044蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6044位于以下部位之一：细胞核、线粒体基质、溶酶体(腔)和微体(过氧化物酶体)。预计SEQ ID NO：6044与受感染细胞内的细胞器相结合。
因此，SEQ ID NO：6044是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶。本发明包括含有SEQ IDNO：6044或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6044的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6044的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6044。本发明包括防止SEQ ID NO：6044的多肽与受感染细胞内的细胞器有关的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6044的融合蛋白。
PSORT---蛋白质定位位点预测，SEQ ID NO：6044
                                        版本6.4(WWW)
154残基
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：7
    UR峰值：1.06
    CR净电荷：1
    辨别评分：-7.97
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：-3.28
    可能的切割位点：34
>>>似乎没有N-端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：0**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：OB
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：0值：1.43域值：-2.0
    外围可能性＝1.43
    修饰的ALOM评分：-1.19
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位子：151
    FRKKQV
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(-0.46)
***推理步骤：2
    KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置151)从：46至：50 评分：5.0
线粒体基质？评分：0.36
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(154)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：0.61
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.149
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：0.81  状态：不清楚
对溶酶体的修改评分：0.231
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
    发现：位置：134(3)KHKK
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
    发现：位置：136(3)KK VSTNLCTHSF RKKQV
最终Robbins评分(核)：0.60
核实RNA结合基序(核或胞质)
核修改  评分：0.90
核信号  状态：正电(0.70)
核实CaaX基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实CaaX基序.
-----最终结果-----
核---确定性＝0.880(肯定的)<成功>
线粒体基质间隙---确定性＝0.360(肯定的)<成功>
溶酶体(腔)---确定性＝0.231(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.149(肯定的)<成功>
在4号残基上鉴定到SEQ ID NO：6044的一个预测的O-糖基化位点。
残基    编号      可能性       阈值       意见
Thr     4         0.6839        0.6484      T
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6044氨基酸序列的片段的多肽，其中所述片段包含上面鉴定的O-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明包括含有SEQ ID NO：6044的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
在表18中鉴定了SEQ ID NO：6044的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：8487-8665的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有SEQ ID NOS：8487-8665的一个或多个被鉴定为
T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6045的多肽序列。本发明包括含有与SEQ ID NO：6045具有序列相同性的氨基酸序列的多肽序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6045的片段的多肽序列。本发明包括编码这些多肽中任一的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6045被证实与冠状病毒的包膜蛋白或小膜蛋白功能上同源。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ  ID NO：6045或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码SEQ ID NO：6045或其片段的多核苷酸。本发明包括含有SEQ IDNO：6045或其片段的免疫原性组合物。本发明包括特异性识别含有SEQ ID NO：6045或其片段的多肽的抗体。
下面鉴定了预测的SEQ ID NO：6045的跨膜区：
内向外螺旋：发现1个
从                 至             评分          中心
17(19)             33(33)         2881          26
外向内螺旋：发现1个
从                 至             评分          中心
17(17)             34(34)         2981          27
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6045的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包括第17-34位之间的氨基酸。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。一实施方案中，本发明包括含有SEQ ID NO：6045的片段的多肽，其中所述片段不包括SEQ ID NO：6045第1-34位的氨基酸残基。
预测的SEQ ID NO：6045的蛋白质定位位点如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测，SEQ ID NO：6045
                                        版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：2
    最N-端位置TMS：17，i＝1
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：24电荷差异(C-N)：2.0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：29
    UR峰值：3.40
    CR净电荷：-2
    辨别评分：13.07
GvH：检测信号肽序列(yon Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：4.37
    可能的切割位点：32
…mtop阳性值…
>>>似乎有不可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：1**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：OB
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：1值：-15.12   域值：-2.0
    内部可能性＝-15.12  跨膜17-33(8-44)
    外围可能性＝0.47
    修饰的ALOM评分：3.12
>>>似乎是Ib型(Nexo Ccyt)膜蛋白
    胞质尾自34至76(44残基)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(6)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：6
    不可切割？Ipos设为：16
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(0.19)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
>尾末端的相对位置：44％
膜蛋白在ER通常具有不可切割的信号肽
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置16)从：70至：99 评分：21.5
>>>似乎含有线粒体内信号肽
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(76)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：-4.11
过氧化物酶体蛋白质？状态：阴性
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：0.68状态：不清楚
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号状态：阴性(0.00)
核实Ib型胞质尾(质膜)
核实NPXY基序.
核实YXRF基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
-----最终结果------
质膜---确定性＝0.730(肯定的)<成功>
内质网(膜)---确定性＝0.640(肯定的)<成功>
内质网(腔)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
外侧---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
在SEQ ID NO：6045的48和66号残基上鉴定到预测的N-糖基化位点。
位置      可能性     同意    NGlyc      结果
48NVSL    0.6514    (9/9)    ++        (SEQ ID NO：7266)
66NSSE    0.5880    (7/9)    +         (SEQ ID NO：7267)
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6045的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明包括含有SEQ ID NO：6045的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明包括含有SEQ ID NO：6045的片段的多肽，其中所述片段不包括一个或多个上面鉴定的糖基化位点。本发明还包括编码这种多肽的多核苷酸。
在表19中鉴定了SEQ ID NO：6045的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：8666-8820的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：8666-8820的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6046的多肽序列。本发明包括含有与SEQ ID NO：6046具有序列相同性的氨基酸序列的多肽序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6046的片段的多肽序列。本发明包括编码这些多肽中任一的多核苷酸。
SEQ ID NO：6046与冠状病毒的基质蛋白功能上同源。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ ID NO：6046或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码SEQ ID NO：6046或其片段的多核苷酸。本发明包括含有SEQ ID NO：6046或其片段的免疫原性组合物。本发明包括特异性识别含有SEQ ID NO：6046或其片段的多肽的抗体。
鉴定了预测的SEQ ID NO：6046的跨膜区如下：
内向外螺旋：发现3个
从            至            评分        中心
21(21)        38(36)        2412        29
51(53)        69(69)        2645        60
74(82)        96(96)        2464        89
外向内螺旋：发现3个
从            至            评分        中心
18(21)        38(38)        2363        28
52(52)        67(67)        2363        60
76(76)        95(92)        2605        84
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6046的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包含选自以下位置之间的氨基酸：18-38、52-67和76-95。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测的SEQ ID NO：6046的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                               版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：3
    最N-端位置TMS：21，i＝1
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：28 电荷差异(C-N)：6.0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：1
    UR峰值：3.16
    CR净电荷：-3
    辨别评分：2.21
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：4.29
    可能的切割位点：39
…mtop阳性值…
>>>似乎有不可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
在ALOM中检测到可切割信号肽？：OB
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：3值：-7.64   域值：0.5
    内部可能性＝-7.64  跨膜21-37(18-39)
    内部可能性＝-7.59  跨膜50-66(43-72)
    内部可能性＝-5.04  跨膜79-95(72-99)
    外围可能性＝2.38
    修饰的ALOM评分：2.13
>>>可能是IIIb型膜蛋白(Nexo Ccyt)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(2)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：2
    不可切割？Ipos设为：12
靶向线粒体序列的辨别：
    阴性(-4.16)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
IIIa或IIIb型为内质网膜蛋白优选
膜蛋白在ER通常具有不可切割的信号肽
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(221)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：5.01
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：2.30状态：阳性
III型蛋白质可能定位于高尔基体
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号  状态：阴性(0.00)
核实III型的TMS数(质膜)
核实N-肉豆蔻酰化.
------最终结果------
内质网(膜)---确定性＝0.685(肯定的)<成功>
质膜---确定性＝0.640(肯定的)<成功>
高尔基体---确定性＝0.460(肯定的)<成功>
内质网(腔)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
在SEQ ID NO：6046的4号残基上鉴定到一个预测的N-糖基化位点：
N-糖基化位点的预测
位置      可能性     同意     NGlyc结果
4NGTI     0.8430    (9/9)     +++          (SEQ ID NO：7268)
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6046的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明还包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：6046的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
包括在本发明范围之内的SEQ ID NO：6046的一个变体是SEQ ID NO：9963。与SEQID NO：6046相比，该序列在72位残基上Val代替了Ala。
在表20中鉴定了SEQ ID NO：6046的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：8821-9018的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：8821-9018的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6047或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽序列。预测的SEQ ID NO：6047的跨膜区经鉴定如下。
内向外螺旋：发现2个
从           至            评分       中心
7(10)        29(27)        729        17
21(24)       41(41)        640        34
外向内螺旋：发现2个
从           至            评分        中心
4(4)         22(19)        874         2
22(24)       41(41)        499         31
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6047的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包括选自以下位置之间的氨基酸：4-22和22-41。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6047是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6047蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6047位于以下部位之一：胞质膜、内质网、高尔基体和微体(过氧化物酶体)。预计SEQ ID NO：6047与受感染细胞内的细胞器相结合或与病毒进入宿主细胞有关。
因此，SEQ ID NO：6047是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶。本发明包括含有SEQ IDNO：6047或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6047的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6047的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6047。本发明包括防止SEQ ID NO：6047的多肽与受感染细胞内的细胞器结合或与宿主细胞膜相互作用的小分子。本发明包括含有SEQ IDNO：6047的融合蛋白。预测的SEQ ID NO：6047的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                          版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：1
    最N-端位置TMS：2，i＝1
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：9电荷差异(C-N)：0.5
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：6
    UR峰值：3.08
    CR净电荷：0
    辨别评分：5.12
GvH：检测信号肽序列(von Hei jne)
    信号肽评分(-3.5)：-4.45
    可能的切割位点：34
>>>似乎有不可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：1**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：0B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：1值：-2.44   域值：-2.0
    内部可能性＝-2.44  跨膜2-18(1-20)
    外围可能性＝1.22
    修饰的ALOM评分：0.59
>>>似乎是II型(Ncyt Cexo)膜蛋白
    胞质尾自1至1(1残基)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(5)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：5
    不可切割？Ipos设为：15
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(1.48)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
胞质尾的相对位置：1％
    ER膜蛋白优选较大的值(＞30％)
膜蛋白在ER通常具有不可切割的信号肽
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置15)从：64至：93评分：30.0
>>>似乎含有线粒体内信号肽
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(63)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：1.91
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.161
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：0.04状态：不清楚
核实高尔基体的共有序列
核实高尔基体的共有序列
核实II型的胞质尾(高尔基体)
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号状态：阴性(0.00)
核实II型的线粒体信号肽(质膜)
II型为质膜蛋白优选
核实NPXY基序.
核实YXRF基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
-----最终结果-----
质膜---确定性＝0.685(肯定的)<成功>
内质网(膜)---确定性＝0.640(肯定的)<成功>
高尔基体---确定性＝0.370(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.161(肯定的)<成功>
在表21中鉴定了SEQ ID NO：6047的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：9019-9131的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：9019-9131的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6048或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。预测的SEQ ID NO：6048的跨膜区经鉴定如下。
内向外螺旋：发现2个
从             至               评分        中心
3(3)           18(18)           1857        10
100(100)       117(115)         2904        107
外向内螺旋：发现2个
从             至               评分        中心
1(1)            15(15)          1299        8
100(100)        117(115)        3009        107
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6048的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。优选该片段不包括选自以下位置上的氨基酸：1-15和100-117。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6048是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6048蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6048位于以下部位之一：胞质膜、溶酶体(膜)、微体(过氧化物酶体)和内质网(膜)。SEQ ID NO：6048可能与受感染细胞内的细胞器有关或在病毒进入宿主细胞时与宿主细胞胞质膜相互作用。
因此，SEQ ID NO：6048是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶点。本发明包括含有SEQID NO：6048或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6048的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6048的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6048。本发明包括防止SEQ ID NO：6048的多肽与受感染细胞内的细胞器结合或与宿主细胞膜相互作用的小分子。本发明包括含有SEQ IDNO：6048的融合蛋白。预测的SEQ ID NO：6048的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                          版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：2
    最N-端位置TMS：3，i＝2
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：10电荷差异(C-N)：-2.5
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：13
    UR峰值：3.38
    CR净电荷：1
    辨别评分：10.02
GvH：检测信号肽序列(yon Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：2.56
    可能的切割位点：15
>>>似乎含有可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算16
ALOM新计数：2**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：1B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：1值：-14.75域值：-2.0
    内部可能性＝-14.75跨膜101-117(95-120)
    外围可能性＝6.63
    修饰的ALOM评分：3.05
>>>似乎含有Ia型膜蛋白
    胞质尾自118至122(5残基)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(15)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：15
    不可切割？Ipos设为：25
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(0.73)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置25)从：3至：12 评分：8.5
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(122)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：2.46
    不从N-末端计的AAC，修改的评分
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.115
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：-0.40状态：阴性
Ia型尾中的GY基序？(溶酶体)
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & DingWall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号    状态：阴性(0.00)
Ia型为质膜蛋白质优选
核实NPXY基序.
核实YXRF基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实GPI锚.
>>>似乎是GPI-锚(0.85)
-----最终结果-----
质膜---确定性＝0.919(肯定的)<成功>
溶酶体(膜)---确定性＝0.200(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.115(肯定的)<成功>
内质网(膜)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
在表22中鉴定了SEQ ID NO：6048的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：9132-9308的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：9132-9308的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6049或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。预测的SEQ ID NO：6049的跨膜区或疏水区经鉴定如下。
内向外螺旋：发现1个
从             至              评分            中心
13(13)         30(28)          3532            20
外向内螺旋：发现1个
从             至              评分            中心
9(11)          29(26)          3395            19
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6049的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6049是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6049蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6049位于以下部位之一：外侧、微体(过氧化物酶体)、内质网(膜)和内质网(腔)。最高定位级别表明SEQ ID NO：6049位于细胞外。因此，SEQ ID NO：6049可能是暴露于表面的蛋白质。
因此，SEQ ID NO：6049可被用于引发抗SARS病毒的免疫应答的免疫原性组合物。它还可用于产生SARS病毒的特异性抗体。这种抗体可用于治疗或预防SARS病毒感染的方法。这种抗体还可用于诊断试验来鉴定生物样品中是否存在SARS病毒。
本发明包括含有SEQ ID NO：6049或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ IDNO：6049的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6049的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6049。本发明包括含有SEQID NO：6049的融合蛋白。预测的SEQ ID NO：6049的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                            版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：1
    最N-端位置TMS：11，i＝1
MTOP：膜表面结构(Hartmann等)
    I(中部)：18电荷差异(C-N)：-2.0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：24
    UR峰值：3.69
    CR净电荷：-2
    辨别评分：13.56
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：0.52
    可能的切割位点：25
>>>似乎含有可切割的N-末端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算26
ALOM新计数：1**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：1B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：0值：14.80 域值：-2.0
    外围可能性＝14.80
    修饰的ALOM评分：-3.86
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
(2)或不可切割？
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：2
    不可切割？Ipos设为：12
靶向线粒体序列的辨别：
    不清楚(1.42)
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
作用：泡囊通路
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
潜在的N-糖基化位点数：0
外：评分0.800
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置12)从：44至：73 评分：30.0
>>>似乎含有线粒体内信号肽
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(44)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：9.47
    不从N-末端计的AAC，修改的评分
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.320
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：-6.47状态：阴性
NX(S/T)基序数：0
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号  状态：阴性(0.00)
核实CaaX基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实CaaX基序.
-----最终结果-----
外侧---确定性＝0.820(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.320(肯定的)<成功>
内质网(膜)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
内质网(腔)---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
在表23中鉴定了SEQ ID NO：6049的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：9309-9437的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：9309-9437的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6050或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。预测的SEQ ID NO：6050的跨膜区或疏水区经鉴定如下。
内向外螺旋：发现1个
从            至                评分       中心
13            (15)32(30)        558        23
外向内螺旋：发现1个
从             至               评分       中心
16(16)         30(30)           364        23
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6050的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测SEQ ID NO：6050是假想的SARS病毒蛋白质。对SEQ ID NO：6050蛋白质定位的预测如下。预测SEQ ID NO：6050位于以下部位之一：溶酶体(腔)、线粒体基质间隙、线粒体内膜和线粒体膜间间隙。SEQ ID NO：6050可能在病毒复制循环期间与受感染细胞内的细胞器相结合。
因此，SEQ ID NO：6050是筛选SARS病毒化学抑制剂的靶。本发明包括含有SEQ IDNO：6050或其片段的多肽。本发明包括编码SEQ ID NO：6050的多肽序列或其片段的多核苷酸。本发明包括筛选SEQ ID NO：6050的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6050。本发明包括防止SEQ ID NO：6050多肽与受感染细胞内的细胞器结合或与宿主细胞膜相互作用的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6050的融合蛋白。预测的SEQ ID NO：6050的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                            版本6.4(WWW)
MYSEQ    84残基
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：3
    UR峰值：1.46
    CR净电荷：2
    辨别评分：-5.73
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：-0.12
    可能的切割位点：29
>>>似乎没有N-端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
从位计算1
ALOM新计数：0**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：0B
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：0值：8.43    域值：-2.0
    外围可能性＝8.43
    修饰的ALOM评分：-2.59
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：61
    ARCWYL
靶向线粒体序列的辨别：
    正电(1.66)
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
作用：线粒体蛋白质
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
    (Gavel位置61)从：52至：58评分：6.0
线粒体基质？评分：0.38
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(84)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：1.47
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.263
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：2.86状态：阳性
对溶酶体的修改评分：0.850
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
核实RNA结合基序(核或胞质)
核信号  状态：阴性(0.00)
核实CaaX基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实CaaX基序.
-----最终结果-----
溶酶体(腔)---确定性＝0.850(肯定的)<成功>
线粒体基质间隙---确定性＝0.544(肯定的)<成功>
线粒体内膜---确定性＝0.266(肯定的)<成功>
线粒体内膜空隙---确定性＝0.266(肯定的)<成功>
在43号残基上鉴定到SEQ ID NO：6050的一个预测的N-糖基化位点：
位置      可能性       同意      NGlyc结果
43NVTI    0.6713       (9/9)     ++        (SEQ ID NO：7269)
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6050的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明还包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：6050的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码这种片段的多核苷酸。
在表24中鉴定了SEQ ID NO：6050的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：9438-9538的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：9438-9538的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SEQ ID NO：6051或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽序列。本发明包括含有SEQ ID NO：6052或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽序列。
SEQ ID NO：6051和SEQ ID NO：6052被证实与冠状病毒的核衣壳蛋白功能上同源。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含SEQ ID NO：6051、SEQ ID NO：6052或其片段的多肽。本发明包括诊断试剂盒，盒中装有编码SEQ ID NO：6051、SEQ ID NO：6052或其片段的多核苷酸。本发明包括含有SEQ ID NO：6051、SEQ ID NO：6052或其片段的免疫原性组合物。本发明包括能识别包含SEQ ID NO：6051、SEQ ID NO：6052或其片段的多肽的抗体。
预测SEQ ID NO：6051在Ser-79；Thr-92；Ser-106；Thr-116；Thr-142；Ser-184；Ser-188；Ser-202；Ser-236；Thr-248；Ser-251；Ser-256；Thr-377上被磷酸化。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6051的片段的多肽，其中所述片段包括SEQ IDNO：6051的以下一个或多个氨基酸残基：Ser-79；Thr-92；Ser-106；Thr-116；Thr-142；Ser-184；Ser-188；Ser-202；Ser-236；Thr-248；Ser-251；Ser-256；Thr-377。本发明还包括含有SEQ ID NO：6051的片段的多肽，其中所述片段不包含SEQ IDNO：6051的以下一个或多个氨基酸残基：Ser-79；Thr-92；Ser-106；Thr-116；Thr-142；Ser-184；Ser-188；Ser-202；Ser-236；Thr-248；Ser-251；Ser-256；Thr-377。N蛋白其它两个有关的片段(例如用于免疫沉淀)是SEQ ID NOS：9783&9784，它们富含赖氨酸并可用于区别SARS病毒和其它冠状病毒。
预测的SEQ ID NO：6051的跨膜区经鉴定如下。
内向外螺旋：发现1个
从              至           评分           中心
304(304)        323(319)     495            312
外向内螺旋：发现1个
从               至          评分           中心
304(304)         319(319)    597            312
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6051的片段的多肽，其中所述片段不包含上面鉴定的一个或多个疏水氨基酸序列。本发明还包括编码上面鉴定的任何多肽的多核苷酸序列。
预测的SEQ ID NO：6051的蛋白质定位如下所示。预计SEQ ID NO：6051位于细胞核、溶酶体(腔)、线粒体基质间隙和微体(过氧化物酶体)附近。最高定位级别位于细胞核附近。已知冠状病毒的核衣壳蛋白结合病毒RNA。还认为冠状病毒核衣壳蛋白对于细胞介导的免疫力很重要。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6051的多核苷酸。本发明还包括适合体内输送包含SARS病毒核衣壳多核苷酸序列或其片段的多核苷酸序列的病毒载体或颗粒。一实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID N0：6051或其片段。本发明还包括引发细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物输送编码SARS病毒核衣壳蛋白或其片段的多核苷酸。
本发明包括筛选SEQ ID NO：6051的抑制剂的方法。本发明包括在宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：6051。本发明包括能防止病毒复制期SEQ ID NO：6051多肽与SARS病毒RNA结合的小分子。本发明包括含有SEQ ID NO：6051的融合蛋白。预测的SEQ IDNO：6051的蛋白质定位如下。
PSORT---蛋白质定位位点预测
                            版本6.4(WWW)
物种分类：4
***推理步骤：1
初步计算ALOM(域值：0.5)
    计数：0
McG：检测信号肽序列(McGeoch)
    UR长度：3
    UR峰值：0.19
    CR净电荷：0
    辨别评分：-15.98
GvH：检测信号肽序列(von Heijne)
    信号肽评分(-3.5)：-6.36
    可能的切割位点：58
>>>似乎没有N-端信号序列
预计的成熟形式的氨基酸组成：
    从位计算1
ALOM新计数：0**域电荷至-2
在ALOM中检测到可切割信号肽？：OB
ALOM：发现跨膜区(Klein等)
    计数：0值：5.04 域值：-2.0
    外围可能性＝5.04
    修饰的ALOM评分：-1.91
Gavel：检测靶向线粒体序列的边界
    基序位于：17
    PRITFG
靶向线粒体序列的辨别：
    阴性(-3.97)
***推理步骤：2
KDEL  计数：0
核查线粒体内分拣的非极性信号肽
线粒体基质？评分：0.10
SKL基序(过氧化物酶体信号肽)：
    位置：-1(399)，计数：0
过氧化物酶体倾向性氨基酸组成：0.04
过氧化物酶体蛋白质？状态：不清楚
    AAC评分(过氧化物酶体)：0.072
溶酶体蛋白质倾向性氨基酸组成
    评分：0.96状态：不清楚
对溶酶体的修改评分：0.246
核实碱性残基的量(核)
核实靶向核的4残基模式
    发现：位置：256(4)KKPR
    发现：位置：372(5)KKKK
核实靶向核的7残基模式
核实Robbins & Dingwall共有序列(核)
    发现：位置：372(3)KK KKTDEAQPLP QRQKK
    发现：位置：373(3)KK KTDEAQPLPQ RQKKQ
最终Robbins评分(核)：0.80
核实RNA结合基序(核或胞质)
核修改   评分：0.90
核信号   状态：阳性(0.90)
核实CaaX基序.
核实N-肉豆蔻酰化.
核实CaaX基序.
-----最终结果-----
核---确定性＝0.980(肯定的)<成功>
溶酶体(腔)---确定性＝0.246(肯定的)<成功>
线粒体基质间隙---确定性＝0.100(肯定的)<成功>
微体(过氧化物酶体)---确定性＝0.072(肯定的)<成功>
预测的SEQ ID NO：6051的N-糖基化位点经鉴定如下。
位置       可能性         同意             NGlyc结果
48NNTA     0.6879         (9/9)    ++     (SEQ ID NO：7270)
270NVTQ    0.7684         (9/9)    +++    (SEQ ID NO：7271)
残基        编号      可能性        阈值         意见
Thr        166        0.8547        0.6439        T
Thr        367        0.5575        0.5403        T
Thr        394        0.8217        0.5821        T
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：6051的氨基酸序列片段的多肽，其中所述片段包含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码上面鉴定的一个或多个多肽的多核苷酸。
本发明还包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：6051的片段的多肽，其中所述片段不含一个或多个上面鉴定的N-糖基化位点。本发明还包括编码这种片段的多核苷酸。
在表25中鉴定了SEQ ID NO：6052的T-表位。本发明包括用作抗原的多肽，其中所述多肽包含：(a)选自被鉴定为SEQ ID NOS：9539-9752的T-表位序列的氨基酸序列；(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明还包括编码(a)或(b)的多肽的多核苷酸序列。本发明还包括通过病毒载体和/或病毒颗粒表达或输送这种多核苷酸的方法。本发明还包括含有一个或多个被鉴定为SEQ ID NOS：9539-9752的T-表位序列的多肽，或编码这种多肽的多核苷酸。
包括在本发明范围之内的SEQ ID NO：6052的一个变体是SEQ ID NO：9964。与SEQID NO：6052相比，该序列第54位残基Ile代替了Thr。
抗原优选被用于：(1)作为T-细胞抗原；(2)在I类MHC蛋白(例如I类HLA)和所述抗原片段之间形成复合体；(3)作为引发细胞介导的免疫应答的抗原；和/或(4)作为引发CTL应答的抗原。所述用途优选可预防或治疗SARS病毒引起的疾病和/或感染。本发明提供了多肽在制造用于免疫哺乳动物(尤其是人)抵抗SARS病毒感染的药物中的应用，其中所述多肽如上文所定义。
本发明提供了在哺乳动物(尤其是人)中引发免疫应答的方法，该方法包括给予所述哺乳动物上文所定义的多肽的步骤，其中所述免疫应答是细胞介导的免疫应答，且优选CTL应答。所述免疫应答优选是保护性或治疗性的。
本发明包括含有SARS病毒核衣壳蛋白或其片段并且还含有SARS病毒膜蛋白或其片段的组合物。所述组合物还可包括一种或多种下述佐剂。
本发明还包括一种组合物，其中包括含有SEQ ID NO：6051或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽，并且还包括含有SEQ ID NO：6040或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽。这种组合物可用作，例如，疫苗。这种组合物还可包括一种或多种下述佐剂。
本发明包括含有SARS病毒核衣壳蛋白或其片段和SARS病毒刺突蛋白或其片段的组合物。一实施方案中，所述核衣壳蛋白包含含有SEQ ID NO：6051或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽序列。一实施方案中，所述刺突蛋白包含含有SEQ IDNO：6042或其片段或与其具有序列相同性的序列的多核苷酸。所述组合物还可包括一种或多种下述佐剂。
本发明还包括含有SARS病毒核衣壳蛋白特异性抗体和含有SARS病毒刺突蛋白特异性抗体的组合物。一实施方案中，所述核衣壳蛋白特异性抗体包含含有SEQ IDNO：6051或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽序列。一实施方案中，所述刺突蛋白特异性抗体包含含有SEQ ID NO：6042或其片段或与其具有序列相同性的序列的多核苷酸。
本发明还包括SARS病毒在冠状病毒中保守的多核苷酸序列及其片段，以及它所编码的多肽。在图7所示的对比中鉴定了这种保守序列。这种保守序列可用于本发明的疫苗或用于本发明的诊断剂、试剂盒和方法。
本发明还包括SARS病毒特异的与冠状病毒中不共有的多核苷酸序列及其片段。这种SARS特异序列被鉴定为SEQ ID NOS：6040、6043、6044、6047、6048、6049和6050。这种SARS特异序列可用于本发明的疫苗或用于本发明的诊断剂、试剂盒和方法。
本发明还包括可用作诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)中以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法中作为探针或引物的多核苷酸序列。本发明包括的该多核苷酸序列中包含SEQ ID NOS：6076-6265中经鉴定为一个或多个引物序列(表5)。本发明还包括含有SEQ ID NOS：6076-6265中经鉴定为一个或多个引物序列互补物的多核苷酸序列。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针或引物的多核苷酸序列。本发明包括的该多核苷酸序列中包含SEQ ID NOS：6266-6343中经鉴定为一个或多个引物序列(表6)。本发明还包括含有SEQ ID NOS：6266-6343中经鉴定为一个或多个引物序列的互补物的多核苷酸序列。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针或引物的多核苷酸序列。本发明包括的该多核苷酸序列中包含SEQ ID NOS：6344-6392中经鉴定为一个或多个引物序列(表7)。本发明还包括含有SEQ ID NOS：6344-6392中经鉴定为一个或多个引物序列的互补物的多核苷酸序列。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针或引物的多核苷酸序列。本发明包括的该多核苷酸序列中包含SEQ ID NOS：6393-6559中经鉴定为一个或多个引物序列(表8和表9)。本发明还包括含有SEQ ID NOS：6393-6559中经鉴定为一个或多个引物序列的互补物的多核苷酸序列。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针或引物的多核苷酸序列。本发明包括的该多核苷酸序列中包含SEQ ID NOS：6560-6568中经鉴定为一个或多个引物和探针序列。本发明还包括含有SEQ ID NOS：6560-6568中经鉴定为一个或多个引物序列的互补物的多核苷酸序列。
本发明包括含有SEQ ID NOS：7272-7290中任一偶数编号序列或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽序列。本发明还包括编码SEQ ID NOS：7272-7290中任一偶数编号序列或其片段或与其具有序列相同性的序列多核苷酸序列。这种多核苷酸序列的例子是SEQ ID NOS：7273-7291中的奇数编号的序列。
本发明包括含有SARS病毒各个开放读框所共有的基因间序列的多核苷酸序列。认为SARS病毒利用这种序列作为信号来翻译开放读框。所述基因间序列包括10聚物SEQ ID NO：7292，或任选包含六聚物SEQ ID NO：7293。当病毒将其正(+)RNA链转录成(-)RNA链时，正在复制的病毒结构利用(-)链模板来转录第一个基因间序列之前5’末端的核苷酸，然后转录基因间序列，再然后转录所选的开放读框。病毒然后产生多个包含该5’末端、基因间序列和编码序列的mRNA。为了解巢病毒纲病毒复制(包括冠状病毒)的更多细节可参见，例如，Ziebuhr等，“巢病毒纲病毒中病毒编码的蛋白酶和蛋白水解过程”(Virus-encoded proteinases and proteolytic processingin the Nidovirales)，Journal of General Virology 81：853-879(2000)，其内容纳入本文作为参考。
本发明包括含有SEQ ID NO：7292或其互补物的多核苷酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：7293或其互补物的多核苷酸序列。本发明还包括含有SARS病毒基因组5’末端核苷酸或其反向互补物，并且还包含基因间序列或其反向互补物的多核苷酸序列。该多核苷酸还可包含一个或多个SARS病毒开放读框。包含SARS病毒基因组5’末端然后是基因间序列的核苷酸的多核苷酸序列的例子是SEQ ID NOS：7294-7301。本发明包括多核苷酸序列，其中包含选自下组的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ IDNO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，或其片段，或与其具有序列相同性的序列。一实施方案中，所述多核苷酸不完整由已知的SARS病毒序列构成。
SARS病毒基因间序列可用来产生RNAi分子。这种SARS病毒特异性RNAi分子可用来治疗SARS病毒感染。本发明包括含有双链RNA分子的RNAi分子，该双链中一条RNA链包含选自下组的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，或其片段。优选所述RNA链含有选自SEQ IDNO：7292和SEQ ID NO：7293的序列。优选另一条RNA链含有第一条链的反向互补物或与能第一条链杂交的多核苷酸序列。
在本发明利用RNAi治疗SARS病毒感染的方法中，包括给予哺乳动物有效量的siRNA分子。优选所述RNAi分子包含上述分子。本说明书第IV部分进一步讨论了基因间序列在RNAi方面的应用。
本发明还包括SARS病毒反义核苷酸序列—优选SARS病毒基因间序列的反义序列—的应用。这种反义序列可用来治疗受SARS病毒感染的个体。可设计能与SARS病毒多核苷酸结合的SARS病毒基因间序列的反义序列以阻止病毒复制机制进入该基因间序列。这种反义序列还可用于鉴定生物样品中是否存在SARS病毒。反义序列自身可被标记，或者可用此领域已知的方法来检测与病毒多核苷酸结合的反义序列。设计的反义核酸能与RNA特异性结合，这将导致形成RNA-DNA或RNA-RNA杂交体，从而阻止DNA复制、逆转录或信使RNA的翻译。基于所选序列的反义多核苷酸可妨碍相应基因的表达。反义多核苷酸将结合和/或妨碍相应mRNA的翻译。
本发明还包括带有核酶的基因间区域的应用。
反式切割催化性RNA(核酶)是具有核糖核酸内切酶活性的RNA分子。核酶是为特定靶专门设计的，靶信使RNA必须含有特定的核苷酸序列。它们可经基因工程修饰而能特异性切割任何种类的RNA位点—尤其是细胞RNA主链中的位点。这种切割使mRNA变得不稳定并阻止蛋白质表达。重要的是，核酶可用来抑制未知功能基因的表达，从而可通过检测表型效应来确定该基因在体外或体内的功能。
一种常用的核酶基序是锤头状核酶，这种核酶对底物序列的要求最低。锤头状核酶的设计描述在Usman等，Current Opifz.Struct.Biol.(1996)6：527-533。Usman还论述了核酶的治疗用途。也可按照以下描述来制备和使用核酶：Long等，FASEBJ.(1993)7：25；Symons，Ann.Rev.Biochem.(1992)61：641；Perrotta等，Biochem.(1992)31：16-17；Ojwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1992)89：10802-10806；和美国专利5254678。美国专利5144019描述了核酶对HIV-I RNA的切割；美国专利5116742描述了用核酶切割RNA的方法；美国专利5225337和Koizumi等，Nucleid Acid Res.(1989)17：7059-7071描述了提高核酶特异性的方法。Koizumi等，Nucleid Acid Res.(1989)17：7059-7071还描述了锤头状结构的核酶片段的制备和使用。Chowrira和Burke，Nucleid Acid Res.(1992)20：2835描述了发夹结构的核酶片段的制备和使用。也可通过滚环转录制造核酶，如Daubendiek & Kool，Nat.Biotechnol.(1997)15(3)：273-277所述。
核酶的杂交区域可经修饰或制作成分支结构，如Horn & Urdea，Nucleid AcidRes.(1989)17：6959-67所述。也可用精通此领域的技术人员熟悉的方法通过化学过程来改变核酶的基础结构，并将化学合成的核酶作为用单体单元修饰的合成的寡核苷酸衍生物来施用。在治疗中，脂质体介导的核酶的输送改善了细胞摄取，如Birikh等，Eur.J.Biochem.(1997)245：1-16所述。
核酶的治疗性和功能性基因组应用开始于对要被抑制的基因编码序列部分的了解。在本发明中，靶序列优选包括SARS病毒的基因间序列。优选所述序列选自SEQ IDNO：7292和SEQ ID NO：7293。靶切割位点选自靶序列，并以切割位点两侧的5’和3’核苷酸序列为基础来构建核酶。优选5’核苷酸序列包括SARS病毒的5’非翻译区。然后可从一个或多个选自下组的多核苷酸序列来构建核酶：SEQ ID NO：7294、SEQ IDNO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301。
下列参考文献中描述了HIV感染的反义治疗，这些文献被全文纳入作为参考。(反义RNA与gag、tat、rev、env的mRNA互补)(Sezakiel等，1991，J.Virol.65：468-472；Chatterjee等，1992，Science 258：1485-1488；Rhodes等，1990，J.Gen.Virol.71：1965；Rhodes等，1991，AIDS 5：145-151；Sezakiel等，1992，J.Virol.66：5576-5581；Joshi等，1991，J.Virol.65：5524-5530)。
本发明包括利用衰变RNA来破坏SARS病毒的复制和生命周期。制造和利用这种衰变RNA治疗病毒感染的方法是此领域已知的。本发明包括向被感染的细胞输送编码(例如)SARS病毒基因间序列的基因。优选所述序列包括一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ IDNO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301。优选所述序列包括一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO：7292和SEQ ID NO：7293。优选所述序列包括SEQ ID NO：7293。
在本发明中，输送与SARS病毒开放读框不相连的基因间序列可破坏病毒RNA的翻译过程并减少病毒蛋白质产生。已经描述了治疗HIV病毒感染的类似方法。以下参考资料叙述了利用HIV TAR或RRE的衰变RNA来治疗HIV感染。这些参考资料的内容纳入本文作为参考。(Sullenger等，1990，Cell 63：601-608；Sullenger等，1991，J.Virol.65：6811-6816；Lisziewicz等，1993，New Biol.3：82-89；Lee等，1994，J.Virol.68：8254-8264)，核酶(Sarver等，1990，Science 247：1222-1225；Wecrasinghe等，1991，J.Virol.65：5531-5534；Dropulic等，1992，J.Virol.66：1432-1441；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10802-10806；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：6340-6344；Yu等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：699-703；Yamada等，1994，GeneTherapy 1：38-45)。
本发明包括SARS病毒基因间序列在诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法中的应用。这种诊断剂、试剂盒和方法将在说明书第II部分进一步叙述。
本发明包括用来扩增SARS多核苷酸序列的引物对，其中包括(i)第一引物，其中包含与选自下组的序列部分基本相同的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，以及(ii)第二引物，其中包含与选自序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2的一部分序列基本互补的序列，这样，引物对(i)和(ii)便在序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2构成的序列中确定了一模板序列。优选(i)第一引物包含与选自SEQ ID NO：7292和SEQ ID NO：7293的一部分序列基本相同的序列。优选(i)第一引物包含与SEQ ID NO：7293的一部分序列基本相同的序列。所述第一和第二引物确定的扩增子的长度优选在50和250个核苷酸之间。这些引物可任选加以标记以利于其检测。用来标记引物的方法和组合物将在本申请的第III部分进一步讨论。
本发明还包括用来扩增SARS多核苷酸序列的引物对，其中包括(i)第一引物，其中包含与选自下组的序列部分的互补物部分基本相同的序列：SEQ ID NO：7292、SEQID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，以及(ii)第二引物，其中包含与选自序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2互补物的一部分基本互补的序列，这样，引物对便在由序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2构成的序列中确定了一模板序列。由所述第一和第二引物确定的扩增子的长度优选在50和250个核苷酸之间。引物可任选被标记以便于检测。用来标记引物的方法和组合物将在本申请的第III部分进一步讨论。
本发明包括一试剂盒，其中包括(i)第一引物，其中包含与选自下组的序列部分基本相同的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，以及(ii)第二引物，其中包含与选自序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2的一部分基本互补的序列，这样，引物对(i)和(ii)便在由序列SEQ IDNO：1和序列SEQ ID NO：2构成的序列中确定了一模板序列。优选(i)第一引物包含与选自SEQ ID NO：7292和SEQ ID NO：7293的序列的一部分基本相同的序列。优选(i)第一引物包含与SEQ ID NO：7293的序列的一部分基本相同的序列。引物可任选被标记以便于检测。用来标记引物的方法和组合物将在本申请的第III部分进一步讨论。
其它优选的试剂盒包括(i)第一引物，其中包含与选自下组的序列的一部分的互补物部分基本相同的序列：SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301，以及(ii)第二引物，其中包含与选自序列SEQ IDNO：1和序列SEQ ID NO：2的互补物部分基本互补的序列，这样，引物对便在由序列SEQ ID NO：1和序列SEQ ID NO：2构成的序列中确定了一模板序列。
本发明还包括用作疫苗的减毒SARS病毒，该病毒中的基因间区域已突变从而病毒结构蛋白或非结构蛋白的表达降低。这种减毒SARS病毒可在病毒基因组的一个或多个基因间区域内有一个或多个添加、缺失或插入。优选该减毒SARS病毒在选自SEQID NO：7292和SEQ ID NO：7293的序列中有一个或多个添加、缺失或插入。优选在SEQ ID NO：7293中有一个或多个添加、缺失或插入。
本发明还包括能抑制SARS病毒复制机构如核糖核蛋白与病毒基因组基因间区域结合或缔合的小分子。优选所述小分子能抑制SARS病毒机构与选自SEQ ID NO：7292和SEQ ID NO：7293的序列结合或缔合。优选所述小分子能抑制SARS病毒机构与SEQID NO：7293结合或缔合。本发明还包括筛选用于治疗SARS病毒感染的小分子的方法，所述方法包括采用一种测定方法来鉴定干扰SARS病毒复制机构与SARS病毒基因组的基因间区域相结合的小分子。
本发明还提供了一种新的SARS多核苷酸序列SEQ ID NO：9968。该690mer的序列的所有6个阅读框示于图113。图113的组成氨基酸序列中有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ ID NOS：9969-10032列出。
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：9968的多核苷酸序列。本发明还提供了与SEQID NO：9968具有序列相同性的多核苷酸序列。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％，70％，80％，85％，88％，90％，92％，95％，99％或更高)。
本发明包括由SEQ ID NO：9968的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括选自SEQID NOs：9969-10032的氨基酸序列。优选所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：9997或包括SEQ ID NO：9998。
本发明还提供了与SEQ ID NO：9968编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明提供了与选自SEQ ID NOS：9969-10032的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％，70％，80％，85％，88％，90％，92％，95％，99％或更高)。
SEQ ID NO：9968的一部分以约98％的相同性与先前发表的通常被称为“BNI-1”(SEQ ID NO：10033)的SARS多核苷酸序列相匹配。BNI-1已在德国汉堡的国家热带传染病参考中心(National Reference Center for Tropical Infectious Diseases)热带医学Bernhard Nocht研究所被测序。BNI-1序列于2003年4月4日被公布于WHO网站http：//www.who.int/csr/sars/primers/en，并被公布在Dorsten等，“鉴定严重急性呼吸道综合征患者内的新冠状病毒”(Identification of a NovelCoronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome)，New EnglandJournal of Medicine，于2003年4月10日在线出版于http：//www.nejm.org。这两份参考资料被全部纳入本文作为参考。该302mer序列的6个阅读框示于图114(也可参见图129)。图114的组成氨基酸序列中有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ IDNOS：10034-10065列出。SEQ ID NO：10034与SEQ ID NO：9997的对比示于图130。
本发明提供了包含SEQ ID NO：9968片段的多核苷酸序列。一实施方案中，该片段并非完全由SEQ ID NO：10033或已知冠状病毒的序列构成。
本发明提供了包含由SEQ ID NO：9968编码的氨基酸序列的片段的氨基酸序列。一实施方案中，所述片段并非完全由SEQ ID NO：10033编码的氨基酸序列或已知冠状病毒的序列构成。
本发明提供了包含选自SEQ ID NOS：9969-10032的氨基酸序列的片段的氨基酸序列。一实施方案中，所述片段并非完全由SEQ ID NO：10033的多核苷酸序列编码的氨基酸序列或已知冠状病毒的序列构成。
SEQ ID NO：9968的5’末端约有100个核苷酸不与BNI-1多核苷酸序列(SEQ IDNO：10033)的任何部分匹配。这种不匹配的部分列在SEQ ID NO：10066中。因此，本发明还提供了包含含有SEQ ID NO：10066序列的多核苷酸、与SEQ ID NO：10066具有序列相同性的多核苷酸序列或含有SEQ ID NO：10066的片段的多核苷酸序列。
本发明还包括由SEQ ID NO：10066编码的氨基酸序列，与SEQ ID NO：10066编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列，或包含由SEQ ID NO：10066编码的氨基酸序列片段的氨基酸序列。优选所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：10067。
SEQ ID NO：9997/9998被证实与几种冠状病毒的pol1ab区域同源。图115显示了SEQ ID NOS：9997/9998与牛冠状病毒pol 1ab的氨基酸序列(SEQ ID NO：10068)。鸟传染性支气管炎病毒pol 1ab的氨基酸序列(SEQ ID NO：10069)和鼠肝炎病毒pol 1ab的氨基酸序列(SEQ ID NO：10070)的对比。SEQ ID NOS：9997/9998、SEQ ID NO：10068、SEQ ID NO：10069和SEQ ID NO：10070的共有氨基酸序列显示在图115对比的最后一行(例如SEQ ID NO：10071)。
如图113所示，编码的SEQ ID NO：9997的多核苷酸序列在密码子205之后、SEQID NOS：9997和9998之间有一个终止密码子。该终止密码子可任选被除去并使该氨基酸序列连续(SEQ ID NO：10072)。因此，本发明提供了含有SEQ ID NO：9997和/或SEQ ID NO：9998，或SEQ ID NO：10072，并且还包含编码冠状病毒pol1ab基因或其片段C-末端的氨基酸序列的氨基酸序列。
如图115所示，SEQ ID NOS：10068、10069、10070和10071在SEQ ID NO：9997含有的氨基酸位于N-末端之前。本发明提供的氨基酸序列还含有SEQ ID NO：9997并且还包含编码冠状病毒pol1ab蛋白或其片段N-末端的氨基酸序列。
图115的pol1ab序列包含一编码区，该区域在图117中用“*”表示。在图115中，用穿过共有序列SEQ ID NO：10071氨基酸6080之前的箭头表示该基因组区域的起点。该基因组区域的终点用穿过该共有序列氨基酸6604之前的箭头表示。本发明提供的氨基酸序列含有SEQ ID NO：9997和/或SEQ IID NO：9998，或SEQ ID NO：10072，并且还包含所述SEQ ID NO：9997和/或SEQ ID NO：9998，或SEQ ID NO：10072N-末端之前的第一氨基酸序列，其中所述第一个氨基酸序列与已知冠状病毒pol1ab“*”蛋白或其片段的N-末端序列具有同源性。
本发明还提供了含有SEQ ID NO：9997和SEQ ID NO：9998的氨基酸序列，其中，SEQ ID NO：9971之后的终止密码子被除去(即SEQ ID NO：10072)，并且还包含SEQ IDNO：9998C末端之后的第二氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列与已知冠状病毒pol1ab“*”蛋白或其片段的C末端同源。
这种蛋白质的例子在图118中比较示出，它们是SEQ ID NOS：10073-10077。SEQ IDNO：10073包含SEQ ID NO：9997，并且还包含鸟传染性支气管炎病毒pol1ab“*”蛋白N-末端之前和C-末端之后的氨基酸。SEQ ID NO：10074包含SEQ ID NO：9997，并且还包含牛冠状病毒pol1ab“*”蛋白N-末端之前和C-末端之后的氨基酸。SEQ IDNO：10075包含SEQ ID NO：9997，并且还包含鼠肝炎病毒pol1ab“*”蛋白N-末端之前和C-末端之后的氨基酸。SEQ ID NO：10076包含SEQ ID NO：9997，并且还包含鸟传染性支气管炎病毒、牛冠状病毒和鼠肝炎病毒pol1ab“*”蛋白共有序列N-末端之前和C-末端之后的氨基酸(图115)。SEQ ID NO：10077包含SEQ ID NOS：10073-10076的共有序列。
本发明包括选自SEQ ID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的氨基酸序列。本发明还包括含有选自SEQ ID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的氨基酸序列片段的氨基酸序列。本发明还包括与选自SEQ ID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明包括编码选自SEQ ID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的氨基酸序列的多核苷酸。本发明包括与编码选自SEQ ID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的氨基酸序列的多核苷酸具有序列相同性的多核苷酸。本发明包括编码SEQID NOS：10073、10074、10075、10076和10077的多核苷酸的片段。
如图113所示，SEQ ID NO：9968包括编码SEQ ID NO：10020的序列，其之后的一终止密码子，给定的C-末端苏氨酸(Thr)残基。BNI-1编码的氨基酸序列的相应序列是SEQ ID N0：10078，它延续直到SEQ ID NO：10020的C-末端。因此，本发明包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：10020或与SEQ ID NO：10020具有序列相同性的氨基酸序列或含有SEQ ID NO：10020的片段的氨基酸序列的蛋白质，其中，所述蛋白质的C-末端残基是苏氨酸。优选所述蛋白质的C-末端是-ST。更优选所述蛋白质的C-末端是-EST。本发明还包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：10078或与SEQ ID NO：10078具有序列相同性的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO：10078的片段的氨基酸序列的蛋白质，其中，所述蛋白质的C-末端残基是Thr。优选所述蛋白质的C-末端是-ST。更优选所述蛋白质的C-末端是-EST。
SEQ ID NO：9968还编码一个54mer氨基酸序列SEQ ID NO：10015。这个编码SEQ IDNO：10015的多核苷酸在其C-末端有两个终止密码子(图113)。BNI-1序列的相应区域不含这个54mer序列。因此，本发明包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：10015或与SEQ ID NO：100015具有序列相同性的氨基酸序列或含有SEQ ID NO：10015的片段的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括含有SEQ ID NO：10015并且还含有SEQ IDNO：10015N-末端之前第一氨基酸序列的多肽。
SEQ ID NO：9968编码氨基酸序列SEQ ID NO：9969。该多核苷酸序列在SEQ IDNO：9969的C-末端含有一终止密码子。因此，本发明包括含有氨基酸序列SEQ IDNO：9969或与SEQ ID NO：9969具有序列相同性的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括含有SEQ ID NO：9969并且还含有SEQ ID NO：9969N-末端之前的第一个氨基酸序列的多肽。本发明还包括含有序列SEQ ID NO：10079的多肽。
SEQ ID NO：9968编码氨基酸序列QRT(图113)，其后为一终止密码子。因此，本发明包括含有氨基酸序列QRT的蛋白质。本发明还包括含有氨基酸序列QRT并且还含有序列QRT N-末端之前第一氨基酸序列的多肽。
SEQ ID NO：9968编码氨基酸序列SEQ ID NO：10022，随后为其C-末端的终止密码子。因此，本发明包括含有氨基酸序列SEQ ID NO：10022或与SEQ ID NO：10022具有序列相同性的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括含有SEQ ID NO：10022并且还含有SEQ ID NO：10022N-末端之前第一氨基酸序列的多肽。
SEQ ID NO：9968编码氨基酸序列SEQ ID NO：10027。SEQ ID NO：10027编码序列内有至少3个起始密码子，在图119中用下划线表示。第一个起始密码子指出的开放读框是SEQ ID NO：10081。第二个起始密码子指出的开放读框是SEQ ID NO：10082。第三个起始密码子指出的开放读框是SEQ ID NO：10083。
本发明提供了一种新的SARS多核苷酸序列SEQ ID NO：10084。该1463mer序列的所有6个阅读框示于图120(也可参见图122)。图120的组成氨基酸序列中有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ ID NOS：10085-10209列出(参见图120A-120F)。
本发明包括含有SEQ ID NO：10084的多核苷酸序列。本发明还提供了与SEQ IDNO：10084具有序列相同性的多核苷酸序列。本发明还提供了含有SEQ ID NO：10084的片段的多核苷酸序列。一实施方案中，该多核苷酸片段并非完全由SEQ ID NO：10033或已知冠状病毒多核苷酸序列或已知SARS多核苷酸序列构成。
本发明包括由SEQ ID NO：10084的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括图120A-120F的氨基酸序列，例如选自SEQ ID NOS：10085-10209的序列。优选所述氨基酸序列包含SEQID NO：10149。
本发明还提供了与SEQ ID NO：10084编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明提供了与图120A-120F的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸，例如选自SEQ ID NOS：10085-10209的序列。
本发明还提供了SEQ ID NO：10084编码的氨基酸序列的片段。本发明还提供了选自SEQ ID NOS：10085-10209的氨基酸序列的片段。一实施方案中，该片段并非完全由SEQ ID NO：10033编码的氨基酸序列或已知冠状病毒的氨基酸序列或已知SARS病毒的氨基酸序列构成。SEQ ID NO：10033和SEQ ID NO：10084相匹配部分的对比示于图121。
一实施方案中，本发明包括含有SEQ ID NO：10149的氨基酸序列。多核苷酸序列SEQ ID NO：10084与编码的SEQ ID NO：10149的比较示于图122(5’3’读框3)。通过预测甲硫氨酸起始密码子的计算机程序(NetStart 1.0)分析5’3’读框3翻译物(图123)显示了SEQ ID NOS：10210-10215。
本发明包括含有选自SEQ ID NO：10210、SEQ ID NO：10211、SEQ ID NO：10212、SEQ ID NO：10213、SEQ ID NO：10214和SEQ ID NO：10215氨基酸序列的蛋白质。本发明包括与选自SEQ ID NO：10210、SEQ ID NO：10211、SEQ ID NO：10212、SEQ IDNO：10213、SEQ ID NO：10214和SEQ ID NO：10215氨基酸序列具有序列相同性的蛋白质。一实施方案中，该蛋白质并非完全由已知SARS病毒或已知冠状病毒的氨基酸序列构成。
本发明包括含有选自SEQ ID NO：1021O、SEQ ID NO：10211、SEQ ID NO：10212、SEQ ID NO：10213、SEQ ID NO：10214和SEQ ID NO：10215氨基酸序列的蛋白质的片段。一实施方案中，该片段并非完全由已知SARS病毒或已知冠状病毒的氨基酸序列构成。
一实施方案中，本发明包括含有选自SEQ ID NO：10210、SEQ ID NO：10211和SEQID NO：10212的氨基酸序列的多肽。图124包括对GenBank进行SEQ ID NO：10210的BLAST算法的部分结果。这些结果表明，SEQ ID NOS：10210、10211和10212与冠状病毒RNA聚合酶，尤其是鼠肝炎病毒、牛冠状病毒和鸟传染性支气管炎的RNA聚合酶在功能上相似。
一实施方案中，本发明涉及含有选自SEQ ID NO：10210、SEQ ID NO：10211和SEQID NO：10212的第一氨基酸序列和冠状病毒ORF1ab序列C-末端的第二氨基酸序列的多肽。优选该第二氨基酸序列来自牛冠状病毒。该实施方案的一个例子是SEQ IDNO：10216。SEQ ID NO：10216的第1-481个氨基酸是SEQ ID NO：10210的第一氨基酸序列，第482-1152个氨基酸是牛冠状病毒orf1ab多蛋白C-末端的第二氨基酸序列(Gi 26008080)(NP_150073.2)(SEQ ID NO：10217)。
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：10216的多肽。本发明还包括含有SEQ IDNO：10210的第一氨基酸序列和SEQ ID NO：10217的第二氨基酸序列的多肽。本发明还包括含有与SEQ ID NO：10210相同性大于x％的第一氨基酸序列和与SEQ IDNO：10217相同性大于y％的第二氨基酸序列的多肽，其中，x大于或等于85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，y大于或等于60％(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高)。
本发明还包括含有SEQ ID NO：10210的片段的多肽，其中所述片段含有一表位。使用17mer窗口，通过计算机预测的SEQ ID NO：10210的表位示于图125A(Hopp&Woods)和图125B(Kyte & Doolittle)。
SEQ ID NO：10210的氨基酸序列还在氨基酸81-84(NNTE；SEQ ID NO：10218)和180-183(NHSV；SEQ ID NO：10219)上含有两个预测的糖基化位点。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：10210的片段的多肽，其中所述片段含有糖基化位点。本发明还包括含有SEQ ID NO：10210的片段的多肽，其中所述片段在第81位有Asn。优选该Asn是被糖基化的。本发明还包括含有SEQ ID NO：10210的片段的多肽，其中所述片段在第180位有Asn。优选该Asn是被糖基化的。
一实施方案中，本发明包括含有来自图120D中的氨基酸序列和/或来自SEQ IDNOS：10150-10160的氨基酸序列(例如来自SEQ ID NOS：10154、10155、10158和10160的氨基酸序列)的多肽。SEQ ID NO：10154中经鉴定含有一下开始于Met并终止于一终止密码子的氨基酸序列：SEQ ID NOS：10220-10227。
因此，本发明包括含有选自SEQ ID NO：10220、SEQ ID NO：10221、SEQ ID NO：10222、SEQ ID NO：10223、SEQ ID NO：10224、SEQ ID NO：10225、SEQ ID NO：10226和SEQ IDNO：10227的氨基酸序列，或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。
一实施方案中，本发明包括含有图120E中的氨基酸序列，例如来自SEQ IDNOS：10161-10182，尤其是SEQ ID NOS：10171和10176的氨基酸序列的多肽。在SEQID NOS：10171-10176中可鉴定出以下开始于Met并终止于一终止密码子的氨基酸序列：SEQ ID NO：10228和SEQ ID NO：10229。
因此，本发明包括含有选自SEQ ID NO：10228和SEQ ID NO：10229的氨基酸序列，或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。
一实施方案中，本发明包括含有图120F的氨基酸序列(例如SEQ ID NOS：10183-10209)的多肽。在图120F中可鉴定出以下开始于Met并终止于一终止密码子的氨基酸序列：SEQ ID NO：10187。因此，本发明包括含有SEQ ID NO：10187的氨基酸序列或其片段或与其具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。
一实施方案中，本发明的多核苷酸不含下列引物之一，这些引物公开于http：//content.nejnz.org/cgi/reprint/NEJMoa030781v2.pdf：
5’GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3’(SEQ ID NO：10230)
5’TAACACACAACICCATCATCA3’(SEQ ID NO：10231)
5’CTAACATGCTTAGGATAATGG3’(SEQ ID NO：10232)
5’GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC3’(SEQ ID NO：10233)
5’CAGGTAAGCGTAAAACTCATC3’(SEQ ID NO：10234)
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针的多核苷酸序列。本发明包括表31所鉴定的多核苷酸引物(SEQ ID NOS：10235-10258)，正向引物SEQ ID NOS：10259-10281和反向引物SEQ ID NOS：10282-10298。本发明还包括与这里所揭示的任一引物序列互补的多核苷酸序列。
本发明提供了SARS多核苷酸序列SEQ ID NO：10299。图126包括该序列的所有6个阅读框(也可参见图131)。图126的组成氨基酸序列中有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ ID NOS：10300-10337列出。
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：10299的多核苷酸序列。本发明还提供了与SEQID NO：10299具有序列相同性的多核苷酸序列。本发明还提供了含有SEQ ID NO：10299片段的多核苷酸序列。一实施方案中，该多核苷酸片段并非完全由SARS病毒的已知多核苷酸序列或冠状病毒的已知多核苷酸序列构成。
本发明包括由SEQ ID NO：10299的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括图126所示的氨基酸序列，以及选自SEQ ID NOS：10300-10337的氨基酸序列。优选所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：10316。
本发明还提供了与由SEQ ID NO：10299编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明提供了与选自SEQ ID NO：10300-10337的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明还提供了由SEQ ID NO：10299所编码的氨基酸序列的片段。本发明还提供了选自SEQ ID NOS：10300-10337的氨基酸序列的片段。一实施方案中，该片段并非完全由SARS病毒的已知氨基酸序列或冠状病毒的已知氨基酸序列构成。
一实施方案中，本发明包括含有SEQ ID NO：10316的氨基酸序列。SEQ ID NO：10316内的编码开放读框包括SEQ ID NO：10338和SEQ ID NO：10339。
一实施方案中，本发明包括含有来自SEQ ID NO：10299 5’3’读框1翻译物的序列的氨基酸序列。在该翻译物中发现了以下编码的开放读框：SEQ ID NO：10340。
一实施方案中，本发明包括含有来自SEQ ID NO：102995’3’读框1翻译物的序列的氨基酸序列。在该翻译物中发现了以下编码的开放读框：SEQ ID NO：10341。
一实施方案中，本发明包括含有来自SEQ ID NO：102995’3’读框1翻译物的序列的氨基酸序列。在该翻译物中发现了以下编码的开放读框：SEQ ID NO：10342。
本发明包括含有选自SEQ ID NO：10338、SEQ NO：10339、SEQ NID NO：10340、SEQID NO：10341和SEQ ID NO：10342的氨基酸序列的多肽。本发明包括与选自SEQ IDNO：10338、SEQ NO：10339、SEQ NID NO：10340、SEQ ID NO：10341和SEQ ID NO：10342的氨基酸序列具有序列相同性的多肽。本发明包括含有选自SEQ ID NO：10338、SEQNO：10339、SEQ NID NO：10340、SEQ ID NO：10341和SEQ ID NO：10342的氨基酸序列的多肽的片段。一实施方案中，该片段并非完全由已知SARS病毒的氨基酸序列或已知冠状病毒的氨基酸序列构成。
一实施方案中，SEQ ID NOS：10338-10342被用于融合蛋白。因此，起始密码子甲硫氨酸被除去。本发明包括氨基酸序列选自SEQ ID NO：10343、SEQ ID NO：10344、SEQ ID NO：10345、SEQ ID NO：10346和SEQ ID NO：10347。
一实施方案中，本发明包括选自SEQ ID NO：10338和SEQ ID NO：10339的氨基酸序列。以下是对GenBank进行SEQ ID NO：10338检索的部分BLAST结果：
>gi|133593|sp|P18457|RRPB_CVPFS  RNA指导的RNA聚合酶(ORF1B)
gi|93934|pir||A43489  RNA指导的RNA聚合酶(Ec 2.7.7.48)-猪传染性胃肠炎病毒(片段)
gi|833161|emb|CAA37284.1|聚合酶[传染性胃肠炎病毒]
长度＝533
评分＝131位(329)，估计值＝3e-30
相同性＝55/89(61％)，阳性＝69/89(77％)，空隙＝1/89(1％)
询问：1    MLWCKDGHVETFYPKLQASQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGENAVIPKGIMMN 60
            MLWC++ H++TFYP+LQ+++ W PG +MP LYK+QRM LE+C+L NYG    +P GI  N
目标：217  MLWCENSHIKTFYPQLQSAE-WNPGYSMPTLYKIQRMCLERCNLYNYGAQVKLPDGITTN 275
询问：61   VAKYTQLCQYLNTLTLAVPSNMRVIHFGA 89
            V KYTQLCQYLNT TL VP MRV+H GA
目标：276  VVKYTQLCQYLNTTTLCVPHKMRVLHLGA 304
这些结果表明SEQ ID NO：10338与猪传染性胃肠炎病毒RNA指导的RNA聚合酶在功能上相似。
对GenBank进行SEQ ID NO：10339检索的部分BLAST结果如下：
>gb|AAL57305.1|复制酶[牛冠状病毒]
    长度＝7094
评分＝139位(351)，估计值＝7e-33
相同性＝64/108(59％)，阳性＝78/108(72％)
询问：1    MSVISKVVKVTIDYAEISFMLWCKDGHVETFYPKLQASQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEK 60
            M++SKVV V  +D+ +  FMLWC D  V TFYP+LQA+  W+PG +MP LYK    +E+
目标：6760 LNCVSKVVNVNVDFKDFQFMLWCNDEKVMTFYPRLQAASDWKPGYSMPVLYKYLNSPMER 6819
询问：61   CDLQNYGENAVIPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPSNMRVIHFGA 108
              L NYG+   +P G MMNVAKYTQLCQYLNT TLAVP NMRV+H GA
目标：6820 VSLWNYGKPVTLPTGCMMNVAKYTQLCQYLNTTTLAVPVNMRVLHLGA 6867
这些结果表明SEQ ID NO：10339与牛冠状病毒的复制酶在功能上相似。
SARS病毒在SEQ ID NO：10338的Glu-20残基上具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：10338具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自ASQAW(SEQ ID NO：10348)和ASRAW(SEQ ID NO：10349)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：10338的多肽的片段，其中所述片段包含选自SEQ ID NO：10348和SEQID NO：10349的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：10338的Ser-80残基上具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：10338具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自VPSNM(SEQ ID NO：10350)和VPTNM(SEQ ID NO：10351)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQID NO：10338的多肽的片段，其中所述片段包含选自SEQ ID NO：10350和SEQID NO：10351的氨基酸序列。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针的多核苷酸序列。本发明包括含有表32所鉴定的一个或多个引物序列的多核苷酸序列。本发明还包括含有表32所鉴定的一个或多个引物序列的互补序列的多核苷酸序列。
本发明提供了SARS多核苷酸序列SEQ ID NO：10505。图127显示了该序列的所有6个阅读框(也可参见图132)。图127的组成氨基酸序列含有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ ID NOS：10506-10570列出。
本发明包括含有SEQ ID NO：10505的多核苷酸序列。本发明还提供了与SEQ IDNO：10505具有序列相同性的多核苷酸序列。本发明还提供了含有SEQ ID NO：10505片段的多核苷酸序列。一实施方案中，该多核苷酸片段并非完全由已知SARS病毒多核苷酸序列或已知冠状病毒多核苷酸序列构成。
本发明包括由SEQ ID NO：10505的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括图127所示的氨基酸序列，尤其是那些选自SEQ ID NOS：10506-10570的氨基酸序列。优选所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：10532和/或SEQ ID NO：10533。
本发明还提供了与由SEQ ID NO：10505编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明提供了与选自图127所示序列的氨基酸序列，尤其是SEQ IDNOS：10506-10570具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明还提供了由SEQ ID NO：10505所编码的氨基酸序列的片段。本发明还提供了选自SEQ ID NOS：10506-10570的氨基酸序列的片段。一实施方案中，该片段并非完全由SARS病毒的已知氨基酸序列或冠状病毒的已知氨基酸序列构成。
一实施方案中，本发明包括含有来自图127的5’3’读框3的氨基酸序列的多肽。该翻译物中一些编码的开放读框是：SEQ ID NO：10533；SEQ ID NO：10571；SEQ IDNO：10572；SEQ ID NO：10573；SEQ ID NO：10574。
本发明包括含有选自SEQ ID NO：10533、SEQ ID NO：10571、SEQ ID NO：10572、SEQ ID NO：10573和SEQ ID NO：10574的氨基酸序列的多肽序列。本发明包括与选自SEQ ID NO：10533、SEQ ID NO：10571、SEQ ID NO：10572、SEQ ID NO：10573和SEQ IDNO：10574的氨基酸序列具有序列相同性的多肽。本发明包括含有选自SEQ IDNO：10533、SEQ ID NO：10571、SEQ ID NO：10572、SEQ ID NO：10573和SEQ ID NO：10574的氨基酸序列的多肽序列的片段。
对GenBank进行SEQ ID NO：10533检索的部分BLAST结果如下：
>gi|7739601|gb|从F68926.1|AF207902_11核衣壳蛋白[鼠肝炎病毒ML-11毒株]
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>gi |3132999|gb|AAc16422.1|核衣壳蛋白[鼠肝炎病毒毒株2]
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>gi|127877|sp|P03417|NcAP_CVMJH  核衣壳蛋白
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>gi|6625766|gb|AAF19389.1|AF201929_7  核衣壳蛋白[鼠肝炎病毒毒株2]
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评分＝146位(368)，估计值＝5e-34
相同性＝102/252(40％)，阳性＝137/252(54％)，空隙＝18/252(7％)
询问：49   SWFTALTQHGK-EELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRR-VRGGDGKMKELSPRW 106
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询问：227  QLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASK----KPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQG 282
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询问：283  NFGDQDLIRQGT 294
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目标：291  NFGGSEMLKLGT 302
>gi|21734854|gb|AAM77005.1|AF481863_7磷酸化的核衣壳蛋白N[猪血凝性脑脊髓炎病毒]
    长度＝449
评分＝145位(366)，估计值＝8e-34
相同性＝107/253(42％)，阳性＝145/253(57％)，空隙＝18/253(7％)
询问：49   SWFTALTQHGK-EELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRR-VRGGDGKMKELSPRW 106
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询问：226  NQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASK----KPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQ 281
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目标：237  ASLVLAKLGK-DATKPQQVTKQTAKEVRQKILNKPRQKRSPNKQCTVQQCFGKRGPNQ-- 293
询问：282  GNFGDQDLIRQGT 294
             NFG  ++++GT
目标：294  -NFGGGEMLKLGT 305
>gi|23295765|gb|AAL80036.1|核衣壳蛋白[猪血凝性脑脊髓炎病毒]
    长度＝449
评分＝145位(365)，估计值＝1e-33
相同性＝107/253(42％)，阳性＝145/253(57％)，空隙＝18/253(7％)
询问：49   SWFTALTQHGK-EELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRR-VRGGDGKMKELSPRW 106
            SWF+ +TQ  K +E  F  GQGVPI       +  GY+ R  RR  +  DG  ++L PRW
目标：64   SWFSGITQFQKGKEFEFAEGQGVPIAPGVPSTEAKGYWYRHNRRSFKTADGNQRQLLPRW 123
询问：107  YFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGA-LNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTL 165
            YFYYLGTGP A   YG + +G +WVA + A +NTP D I  R+P+++ A   + P GT L
目标：124  YFYYLGTGPHAKDQYGTDIDGVFWVASNQADINTPAD-IVDRDPSSDEAIPTRFPPGTVL 182
询问：166  PKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRL 225
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目标：183  PQGYYIEGS-GRSAPNSRSTSRA-PNRAPSAGSRSRANSGNRTSTPGVTPDMA----DQI 236
询问：226  NQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASK----KPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQ 281
              L     GK    + Q VTK++A E  +    KPRQKR+  KQ  V Q FG+RGP Q
目标：237  ASLVLAKLGK-DATKPQQVTKQTAKEVRQKILNKPRQKRSPNKQCTVQQCFGKRGPNQ-- 293
询问：282  GNFGDQDLIRQGT 294
            NFG   ++++GT
目标：294-NFGGGEMLKLGT 305
这些结果表明SEQ ID NO：10533与冠状病毒核衣壳蛋白功能上相似。
一实施方案中，本发明包括图127的5’3’读框3的氨基酸序列，例如SEQ IDNOs：10506-10514。该区域内一些编码的开放读框是SEQ ID NO：10575-10578。
因此，本发明包括含有选自SEQ ID NO：10575、SEQ ID NO：10576、SEQ ID NO：10577和SEQ ID NO：10578的氨基酸序列的多肽。本发明包括与选自SEQ ID NO：10575、SEQID NO：10576、SEQ ID NO：10577和SEQ ID NO：10578序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有选自SEQ ID NO：10575、SEQ ID NO：10576、SEQ IDNO：10577和SEQ ID NO：10578的氨基酸序列的多肽序列的片段。
一实施方案中，本发明包括含有图127的3’5’读框2的氨基酸序列，例如SEQ IDNOs：10547-10559的多肽。该区域内的一开放读框是SEQ ID NO：10579。
本发明包括含有SEQ ID NO：10579氨基酸序列的多肽。本发明包括含有与SEQ IDNO：10579具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有SEQ ID NO：10579的氨基酸序列的多肽的片段。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针的多核苷酸序列。本发明包括含有表33所鉴定的一个或多个引物序列的多核苷酸序列。本发明还包括含有表33所鉴定的一个或多个引物序列的互补序列的多核苷酸序列。
本发明包括含有SEQ ID NO：11323的多核苷酸序列。由SEQ ID NO：11323编码的一个多肽是SEQ ID NO：11324。
本发明包括含有SEQ ID NO：11324、与SEQ ID NO：11324和SEQ ID NO：11324的片段具有序列相同性的序列的多肽。本发明包括SEQ ID NO：11324的片段，其中所述多肽片段开始于甲硫氨酸。
因此，本发明包括含有SEQ ID NO：11323的多核苷酸序列。本发明还提供了与SEQ ID NO：11323具有序列相同性的多核苷酸序列。本发明还提供了含有SEQ ID NO：11323片段的多核苷酸序列。一实施方案中，该多核苷酸片段并非完全由已知SARS病毒多核苷酸序列或已知冠状病毒多核苷酸序列构成。
本发明包括由多核苷酸序列SEQ ID NO：11323编码的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：11324的氨基酸序列。
本发明还提供了与SEQ ID NO：11323编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。本发明提供了与SEQ ID NO：11324具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明提供了由SEQ ID NO：11323编码的氨基酸序列的片段。本发明还提供了SEQ ID NO：11324的氨基酸序列的片段。一实施方案中，该片段并非完全由构成已知SARS病毒的氨基酸序列或已知冠状病毒的氨基酸序列构成。
本发明还包括可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法的探针的多核苷酸序列。本发明包括含有被鉴定为SEQID NO：11325-11440(左边部分)和SEQ ID NOS：11441-11551(右边部分)的一个或多个引物序列的多核苷酸序列。本发明还包括含有被鉴定为SEQ ID NO：11325-11551的一个或多个引物序列互补序列的多核苷酸序列。
本发明包括含有SEQ ID NO：11552的多肽。SARS病毒在异亮氨酸残基Ile-324上有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11552具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包括选自下组的氨基酸序列：YSYAI(SEQ ID NO：11553)、SYAIH(SEQ ID NO：11554)、YAIHH(SEQ ID NO：11555)、IHHDK(SEQ ID NO：11556)、SYAI(SEQ ID NO：11557)、YAIH(SEQ ID NO：11558)、AIHH(SEQ ID NO：11559)、IHHD(SEQID NO：11560)、YAI、AIH和IHH。本发明包括含有SEQ ID NO：11552的多肽的片段，其中所述片段包括选自下组的氨基酸序列：YSYAI(SEQ ID NO：11553)、SYAIH(SEQ IDNO：11554)、YAIHH(SEQ ID NO：11555)、IHHDK(SEQ ID NO：11556)、SYAI(SEQ IDNO：11557)、YAIH(SEQ ID NO：11558)、AIHH(SEQ ID NO：11559)、IHHD(SEQ IDNO：11560)、YAI、AIH和IHH。
本发明包括含有选自SEQ ID NO：11561和SEQ ID NO：11562的氨基酸序列的多肽。本发明包括选自SEQ ID NO：11561和SEQ ID NO：11562的氨基酸序列的多肽的片段。
本发明包括诊断试剂盒，盒中装有含至少一种选自SEQ ID NOS：11561和11562的氨基酸序列的多肽。本发明包括含有编码多肽的多核苷酸序列的诊断试剂盒，其中所述多肽含有至少一个选自SEQ ID NO：11561-11562的氨基酸序列。本发明包括一种免疫原性组合物，其中包含含有至少一种选自SEQ ID NOS：11561和11562的氨基酸序列的多肽。本发明包括能识别含有至少一种选自SEQ ID NOS：11561和11562的氨基酸序列的多肽的抗体。
本发明包括多核苷酸序列SEQ ID NO：11563或其片段或与其具有序列相同性的序列。可从SEQ ID NO：11563翻译的多肽序列示于图128。图128的组成氨基酸序列中有至少4个氨基酸，它们被作为SEQ ID NOS：11564-11617列出。
本发明包括选自图128的序列的多肽序列，或其片段或与其具有序列相同性的序列，例如SEQ ID NOS：11563-11617。
SEQ ID NO：11600中的一多肽序列是SEQ ID NO：11618。本发明包括含有SEQ ID NO：11618或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽。
SEQ ID NO：11602中的一多肽序列是SEQ ID NO：11641。本发明包括含有SEQ IDNO：11641或其片段或与其具有序列相同性的序列的多肽。
SEQ ID NO：11609中的一多肽序列是SEQ ID NO：11619。
本发明包括编码以下序列的多核苷酸：(i)选自下组的氨基酸序列：(1)图128的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NOS：11564-11617；(2)SEQ ID NO：11618；和(3)SEQ IDNO：11619，或(ii)其片段。本发明包括含有一种或多种这些蛋白质的诊断试剂盒。本发明包括含有编码一种或多种这些多肽序列的多核苷酸序列的诊断试剂盒。本发明包括能识别一种或多种多肽序列的抗体。
SARS病毒在SEQ ID NO：11620(Chi-PEP3)的异亮氨酸残基Ile-326上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11620具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自YA IHH(SEQ ID NO：11621)和YA THH(SEQ ID NO：11622)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11620的多肽的片段，其中所述片段包含选自YA IHH(SEQ ID NO：11621)和YA THH(SEQ ID NO：11622)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11620的谷氨酰胺残基Gln-830上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11620具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自AS QAW(SEQ ID NO：11623)和AS RAW(SEQ ID NO：11624)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11620的多肽的片段，其中所述片段包含选自AS QAW(SEQ IDNO：11623)和AS RAW(SEQ ID NO：11624)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11620的天冬氨酸残基Asp-935上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11620具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自DA DST(SEQ ID NO：11625)和DA YST(SEQ ID NO：11626)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11620的多肽的片段，其中所述片段包含选自DA DST(SEQ IDNO：11625)和DA YST(SEQ ID NO：11626)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11627(Chi-PEP4)的丝氨酸残基Ser-577上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11627具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自PC SFG(SEQ m NO：11628)和PC AFG(SEQ ID NO：11629)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11627的多肽的片段，其中所述片段包含选自PC SFG(SEQ ID NO：11628)和PC AFG(SEQ ID NO：11629)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11630(Chi-PEP8)的缬氨酸残基Val-68上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11630具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自LA VVY(SEQ ID NO：11631)和LA AVY(SEQ ID NO：11632)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11630的多肽的片段，其中所述片段包含选自LA VVY(SEQID NO：11631)和LA AVY(SEQ ID NO：11632)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11633(Chi-PEP13)的异亮氨酸残基Ile-50上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11633具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自NN IAS(SEQ ID NO：11634)和NN TAS(SEQ ID NO：11635)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11633的多肽的片段，其中所述片段包含选自NN IAS(SEQ ID NO：11634)和NN TAS(SEQ ID NO：11635)的氨基酸序列。
SARS病毒在SEQ ID NO：11636的丝氨酸残基Ser-943上可具有多态性。本发明包括含有与SEQ ID NO：11636具有序列相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含选自AV SAC(SEQ ID NO：11637)和AV GAC(SEQ ID NO：11638)的氨基酸序列。本发明包括含有SEQ ID NO：11636的多肽的片段，其中所述片段包含选自AV SAC(SEQ IDNO：11637)和AV GAC(SEQ ID NO：11638)的氨基酸序列。
本发明包括多核苷酸SEQ ID NO：11639，或其片段或与其具有序列相同性的序列。本发明包括由SEQ ID NO：11639所列多核苷酸序列编码的多肽，或其片段或与其具有序列相同性的多肽序列。
本发明包括SEQ ID NO：11640所列多核苷酸，或其片段或与其具有序列相同性的序列。本发明包括由SEQ ID NO：11640所列多核苷酸序列编码的多肽，或其片段或与其具有序列相同性的多肽序列。
本发明包括上面鉴定的各个多核苷酸。本发明包括序列表中所列的各个多核苷酸。本发明还包括与上面鉴定的各个多核苷酸具有序列相同性的多核苷酸。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
本发明包括含有上面鉴定的各个多核苷酸序列片段的多核苷酸序列。所述片段应含有特定SEQ ID NO：至少n个连续性多核苷酸，根据序列，n可以是7或更多(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多)。
本发明包括由上面鉴定的编码各多核苷酸序列的各个氨基酸序列。本发明包括由序列表中所列各多核苷酸序列的各个氨基酸序列。本发明还包括与由上面鉴定的各个多核苷酸序列编码的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。本发明还包括由上面鉴定的各个多核苷酸序列编码的氨基酸序列的片段。所述片段应含有特定SEQ ID NO：至少n个连续的氨基酸，根据序列，n可以是7或更多(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多)。
本发明包括上面鉴定的各个氨基酸序列。本发明包括序列表中所列的各个氨基酸序列。本发明还包括与上面鉴定的各个氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
本发明还包括上面鉴定的氨基酸序列的片段。所述片段应含有特定SEQ ID NO：至少n个连续的氨基酸，根据序列，n可以是7或更多(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多)。
本发明包括编码上面鉴定的各个氨基酸序列编码的多核苷酸。本发明包括编码序列表中所列的各个氨基酸序列编码的多核苷酸。本发明还包括与编码上面鉴定的各个氨基酸序列的多核苷酸具有序列相同性的多核苷酸。序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
本发明还包括编码上面鉴定的各个氨基酸序列的多核苷酸的片段。所述片段应含有特定SEQ ID NO：至少n个连续的多核苷酸，根据序列，n可以是7或更多(例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或更多)。
如下文更详细地描述，用作引物和/或探针的多核苷酸可含有来自本发明多核苷酸序列的至少4个或8个毗连核苷酸，例如至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个毗连核苷酸，并可多至约50、75、100、200个毗连核苷酸或更多。由于6-8个核苷酸是可工作的长度，10-12个核苷酸的序列是优选的，约13、14、15、16、17、18、19、20或21或更多的核苷酸对于杂交是最佳的。
一实施方案中，本发明涉及并非完全由已知的SARS病毒的多核苷酸或氨基酸序列，或已知冠状病毒多核苷酸或氨基酸序列构成的多核苷酸和氨基酸序列。一实施方案中，本发明的多核苷酸和氨基酸序列并非完全由序列SEQ ID NO：1构成。在另一实施方案中，本发明的多核苷酸和氨基酸序列并非完全由序列SEQ ID NO：2构成。SEQ ID NO：9967是Frankfurt(FRA)分离物的SARS基因组序列(GenBank：AY310120)。与SEQ ID NO：1相比，它在核苷酸2546、2590、11437、18954、19073、20585、20899、23209、24922、26589和28257上不同；与SEQ ID NO：2相比，它在核苷酸2560、7922、11451、16625、18968和19067上不同。自从本申请最初提交以来，其它基因组序列已经可以以下登录号从GenBank获得：AY559097、AY559096、AY559095、AY559094、AY559093、AY559092、AY559091、AY559090、AY559089、AY559088、AY559087、AY559086、AY559085、AY559084、AY559083、AY559082、AY559081、AY274119、AY323977、AY291315、AY502932、AY502931、AY502930、AY502929、AY502928、AY502927、AY502926、AY502925、AY502924、AY502923、AY291451、AY390556、AY395003、AY395002、AY395001、AY395000、AY394999、AY394998、AY394997、AY394996、AY394995、AY394994、AY394993、AY394992、AY394991、AY394990、AY394989、AY394987、AY394986、AY394985、AY394983、AY394979、AY394978、AY508724、AY394850、AY463059、AY463060、AY313906、AY310120、AY461660、AY485278、AY485277、AY345988、AY345987、AY345986、AY282752、AY357076、AY357075、AY350750、AY304495、AY304488、AY304486、AY427439、AY283798、AY278491、AY278489、AY362699、AY362698、AY283797、AY283796、AY283795、AY283794、AY278741、AY351680、AP006561、AP006560、AP006559、AP006558、AP006557、AY278554、AY348314、AY338175、AY338174、AY321118、AY279354、AY278490、AY278487、AY297028、AY278488和NC_004718。
在另一实施方案中，本发明涉及编码不与小鼠肝炎病毒、牛冠状病毒或鸟传染性支气管炎病毒的蛋白质发生免疫交叉反应蛋白质的多核苷酸。在另一实施方案中，本发明涉及不与小鼠肝炎病毒、牛冠状病毒或鸟传染性支气管炎病毒的蛋白质发生免疫交叉反应的蛋白质。
上面鉴定的各个多核苷酸可用于编码部分融合蛋白。因此，本发明包括一个或多个上面鉴定的多核苷酸，其中，编码起始密码子的多核苷酸被除去。本发明还包括一个或多个上面鉴定的氨基酸，其中，起始甲硫氨酸被除去。
上述任何多核苷酸或氨基酸序列可用于治疗或预防SARS病毒感染的疫苗，包括作为SARS病毒抗原。此外，上述任何多核苷酸或氨基酸序列可用于诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法。
本发明的SARS病毒抗原包括与下列蛋白质中的一种或多种具有99％、95％、90％、85％或80％同源性的多肽：非结构蛋白2(NS2)；血凝素-酯酶糖蛋白(HE)(也称为E3)，刺突糖蛋白(S)(也称为E2)，非结构区4(NS4)，包膜(小膜)蛋白(E)(也称为sM)，膜糖蛋白(M)(也称为E1)，核衣壳磷蛋白(N)或依赖于RNA的RNA聚合酶(pol)。
对冠状病毒生物学的详细叙述可见Fields Virology(第二版)，Fields等(编)，B.N.Raven Press，New York，NY.，第35章。
下面的实施例1中列出了SARS病毒分离物的其它例子。本发明包括实施例1中鉴定的各个多肽和多核苷酸序列。此外，本发明包括含有实施例1中鉴定的一个或多个多肽或多核苷酸序列的疫苗制剂。本发明包括使用一个或多个实施例1中鉴定的多肽或多核苷酸序列的诊断剂、试剂盒(包含这种试剂)以及用来诊断或鉴定生物样品中是否存在SARS病毒的方法。本发明包括用小分子病毒抑制剂以及小分子病毒抑制剂和试剂盒的组合来治疗或预防SARS病毒感染以治疗SARS的方法。所述小分子抑制剂可特异性靶向一个或多个实施例1中鉴定的多肽或多核苷酸。
下面是对本发明所用术语的进一步叙述。
″呼吸道病毒″在这里是指能够感染人类呼吸道的病毒。适用于本发明的呼吸道病毒抗原包括严重急性呼吸道综合征病毒、冠状病毒、流感病毒、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、超级肺病毒和鼻病毒。
术语″多肽″、″蛋白质″和″氨基酸序列″在这里通常是指氨基酸残基聚合物，没有最小产物长度限制。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在定义内。全长蛋白和其片段都包含在定义内。对本发明有用的最小多肽片段可有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或甚至15个氨基酸。通常，对本发明有用的多肽可有适合所需应用的最大长度。通常，所述最大长度没有严格标准，并且是精通此领域的技术人员不难选择的。
本发明的多肽可通过各种方法制备，例如通过化学合成(至少部分)，通过用蛋白酶消化较长多肽，通过RNA的翻译，通过从细胞培养物(例如重组表达)、从生物体自身(例如从病毒培养物或直接从患者)、从细胞系来源等纯化。制造长度小于40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成(Bodanszky(1993)《肽合成原理》(Principles of Peptide Synthesis)(ISBN：0387564314)；Fields等(1997)酶学方法289：固相肽合成.ISBN：0121821900)。特别优选固相肽合成法，如基于t-Boc或Fmoc(Chan & White(2000)《Fmoc固相肽合成》(Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis)ISBN：0199637245)的化学方法。也可部分或全部使用酶合成法(Kullmann(1987)《利用酶合成肽》(Enzymatic Peptide Synthesis)，ISBN：0849368413)。除化学合成法，也可使用生物合成法，例如可通过翻译来制造多肽。这可在体外或体内进行。生物学方法通常仅限于制造基于L-氨基酸的多肽，但可用多种翻译机制(例如氨酰基tRNA分子)来引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮高丙氨酸等)(Ibba(1996)Biotechizol Geizet Eng Rev 13：197-216)。当包括D-氨基酸时，优选使用化学合成法。本发明多肽的C-末端和/或N-末端可被共价修饰，尤其当将它们用于体内施用时，例如可像FuzeonTM产品那样通过加入乙酰基或氨甲酰基来进行修饰。
当提及多肽时也包括本发明氨基酸序列的衍生物。这种衍生物可包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。氨基酸衍生物也可包含对天然序列的修饰，如缺失、插入和取代(一般在性质上保守)，只要蛋白维持所需活性。这些修饰可以是人为的，如通过定点突变，或可以是偶然的，如通过生成蛋白的宿主突变或PCR扩增导致的差错。此外，修饰可造成一种或多种以下效应：降低毒性；易于细胞加工(例如，分泌、抗原呈递等)；以及易于呈递B-细胞和/或T-细胞。
″片段″或″蛋白质″在这里是指只由天然发现的完整的全长多肽序列和结构的一部分组成的多肽。例如，片段可包括某蛋白质的C-末端缺失和/或N-末端缺失。
″重组″蛋白是通过这里所述的重组DNA技术制造的蛋白质。通常，感兴趣的基因被克隆然后在转化的生物体中表达，如下所述。宿主生物在表达条件下表达外源基因以生产蛋白质。
术语″多核苷酸″在本领域中通常是指一种核酸分子。″多核苷酸″可包括双链和单链序列，它包括但不限于病毒的cDNA、原核生物或真核生物的mRNA、病毒的基因组RNA和DNA序列(例如RNA病毒和DNA病毒以及逆转录病毒)或原核生物的DNA以及尤其是合成的DNA序列。该术语还包括含有任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，并包括对天然序列的修饰，如删除、加入和取代(天然情况下通常是保守的)，只要该核酸分子能编码治疗性或抗原性蛋白质。这些修饰可以是人为的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，如通过生成抗原的宿主的突变。对多核苷酸的修饰可产生多种效应，包括例如利用多肽产物在宿主细胞中表达。
本发明的多核苷酸可通过多种方法制备，例如可从基因组文库或cDNA文库完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成法)，用核酸酶(例如限制性酶)消化较长的核酸，将较短的核酸或核苷酸连接起来(例如用连接酶或聚合酶)等。
多核苷酸可编码生物活性(例如，免疫原性或治疗性)蛋白质或多肽。根据由多核苷酸编码的多肽的性质，多核苷酸可包含少至10个核苷酸，例如编码抗原的多核苷酸。
当用于多核苷酸或多肽时，″分离的″是指所提及的分子是从天然含有该分子的完整生物体中分离和解离得到的，或者，当该多核苷酸或多肽不是天然的时，分离的指基本上不含其它生物大分子，因而所述多核苷酸或多肽便可用于所需目的。本发明的多核苷酸和多肽宜为分离的多核苷酸和分离的多肽。
如本领域所知，″抗体″包括一种或多种通过化学或物理方法可与感兴趣多肽一个表位结合的生物部分。本发明的抗体包括特异性结合SARS病毒抗原的抗体。术语″抗体″包括获自多克隆和单克隆制品的抗体，以及：杂交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等(1991)Nature 349：293-299；和美国专利No.4816567；F(ab’)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异质二聚体，参见例如，Inbar等(1972)Proc Natl Acad Sci USA69：2659-2662；和Ehrlich等(1980)Biochem 19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5897-5883)；二聚和三聚抗体片段构建物；小体(minibody)(参见例如，Pack等(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等(1992)J Immunology 149B：120-126)；人源化抗体分子(参见例如，Riechmann  等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyan  等(1988)Science239：1534-1536；和1994年9月21日公开的英国专利申请GB 2276169)；以及这些分子的任何功能片段，其中，这种片段保留了亲代抗体分子的免疫结合特性。术语″抗体″还包括通过非常规方法，例如噬菌体展示获得的抗体。
术语″单克隆抗体″在这里是指包含同源性抗体群的抗体组合物。该术语不受抗体种类或来源的限制，而且也不受抗体的制造方法限制。因此，该术语包括获自鼠类杂交瘤的抗体，也包括用人而不是鼠杂交瘤获得的人单克隆抗体。参见例如，Cote等，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，AlanR.Liss，1985，p77。
″免疫原性组合物″在这里是指含有抗原性分子的组合物，将这种组合物用于受试者将导致受试者对感兴趣抗原分子产生体液和/或细胞免疫应答反应。免疫原性组合物可被直接引入受试者，例如通过注射、吸入、口服、鼻内或其它非肠道施药途径、粘膜或透皮(例如直肠内或阴道内)施药途径。
术语″衍生自″用来表示分子的来源(例如，该分子可衍生自多核苷酸、多肽，无限增殖细胞系可衍生自任何组织，等等)。如果第一多核苷酸含有与第二多核苷酸、其cDNA或其互补序列某一区域相同或基本相同的碱基对序列，或者如果具有上述序列相同性，则该第一多核苷酸“衍生自”第二多核苷酸。因此，如果第一多核苷酸具有(i)与第二序列相同或基本相同的序列，或(ii)与该序列的多肽具有序列相同性，则该第一多核苷酸序列“衍生自”第二序列。
如果第一多肽(i)由衍生自第二多核苷酸的第一个多核苷酸所编码，或(ii)显示与第二多肽具有上述的序列相同性，则该第一多肽“衍生自”第二多肽。因此，如果某多肽(蛋白质)(i)由SARS病毒多核苷酸的某开放读框编码，或(ii)显示出与SARS病毒多肽具有上述的序列相同性，则说该多肽(蛋白质)“衍生自”该特定的SARS病毒。
多核苷酸和多肽分子都可通过物理方法衍生自SARS病毒，或者，例如，可根据已知序列用重组方法或合成方法产生。
培养的细胞或细胞系“衍生自”另一细胞或组织如果它最初得自己有的细胞或组织。用来获得细胞的组织的非限制性的例子包括皮肤、视网膜、肝、肾、心、脑、肌肉、肠、卵巢、乳房、前列腺、癌组织、受一种或多种病原体(例如病毒、细菌等)感染的组织等。这里所述的细胞也可衍生自其它细胞，包括但不限于原代培养物、已有的无限增殖细胞系和/或其它分离的细胞。
″抗原″指含有一个或多个将刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原-特异性应答的表位(可以是线性或构象性表位，或这两者)的分子。该术语可与术语“免疫原”替换使用。通常，一表位将包含约3-15，通常约5-15个氨基酸。B-细胞表位通常含有约5个氨基酸，但也可含有较少的如3-4个氨基酸。T-细胞表位，如CTL表位，将含有至少7-9个氨基酸，辅助T-细胞表位含有至少约10-20个氨基酸。通常，一表位将含有约7-15个氨基酸，如9、10、12或15个氨基酸。术语″抗原″表示亚单位抗原(即从天然与该抗原结合的完整生物体分离和解离的抗原)，以及杀死的、减毒的或灭活细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物以及肿瘤抗原，包括细胞表面受体的胞外结构域以及含有T-细胞表位的胞内部分。抗体，如抗-独特型抗体，或其片段，以及合成的肽模拟表位(可模拟抗原或抗原决定簇)也包含在这里所用的抗原定义内。类似地，能在体内(例如在基因疗法和DNA免疫法中)表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸也包含在这里的抗原定义内。
对某抗原或组合物的″免疫应答″是受试者对感兴趣的组合物中的该抗原产生体液和/或细胞免疫应答反应。出于本发明的目的，″体液免疫应答″指抗体分子介导的免疫应答，包括分泌性(IgA)或IgG分子，而“细胞免疫应答”是T-淋巴细胞和/或其它自细胞介导的。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T-细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对与主要组织相容性复合体(MHC)编码在细胞表面表达的蛋白质相结合而提呈的肽抗原具有特异性。CTL有助于诱导和促进破坏胞内微生物或溶解受到这种微生物感染的细胞。细胞免疫力的另一方法涉及辅助T-细胞的抗原特异性应答。″细胞免疫应答″还指产生活化T-细胞和/或其它白细胞产生的细胞因子、趋化因子和其它这类分子，包括那些衍生自CD4+和CD8+T-细胞的分子。此外，在对所给予的抗原反应中各种白细胞或内皮细胞可诱导产生趋化因子。
II.疫苗制剂
本发明涉及用于治疗或预防严重急性呼吸道综合征(SARS)的疫苗制剂。本发明的疫苗制剂包括灭活(或杀死的)SARS病毒、减毒SARS病毒、裂解SARS病毒制品以及一种或多种SARS病毒抗原的重组体或纯化的亚单位制品。本发明包括编码SARS病毒抗原及其免疫原性片段的多肽和多核苷酸。通过病毒载体和/或病毒颗粒，包括病毒样颗粒(VLP)，有益于本发明多核苷酸的表达和输送。
A.灭活(或杀死的)SARS疫苗
本发明包括含有灭活(或杀死的)SARS病毒的组合物及其制造方法。灭活SARS病毒组合物可用于预防性或治疗性SARS病毒疫苗。优选所述灭活SARS病毒疫苗组合物包含一定量的灭活SARS病毒，该量相当于在灭活之前病毒滴度约为每毫升4-7log嗜菌斑形成单位(PFU)或4-7log半数组织培养物感染量(TCID50)。更优选灭活之前病毒滴度为4-11、7-11或9-11PFU或TCID50。更优选所述灭活SARS病毒疫苗组合物包含一定量的灭活SARS病毒，该量相当于在灭活之前病毒滴度约为每毫升5-9PFU或5-9TCID50。一实施方案中，培养的SARS病毒的PFU或TCID50在收获时为6-8，更优选约为每毫升7.5PFU或TCID50。就病毒收获时的浓度而言，PFU或TCID50优选为8-11，更优选为每毫升约9PFU或TCID50。所述疫苗组合物含有足以在灵长类动物中产生免疫应答量的SARS病毒抗原。
本领域已知的灭活或杀死病毒的方法是破坏病毒感染哺乳动物细胞的能力。这种方法包括化学方法或物理方法。灭活SARS病毒的化学方法包括用有效量的下列一种或多种试剂处理病毒：去污剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或UV光。其它化学灭活方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(carboxyfullerene)(C60)或它们的组合进行处理。其它病毒灭活方法是此领域已知的，如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基吖丙啶或γ射线照射。
例如，可以以下浓度使用甲醛，如0.1-0.02％，优选地0.02-0.1％，更优选地0.04-0.05％。在从用于传播病毒的容器中收获培养物上清之前或之后在所述培养物上清中加入灭活剂，收获之前可破坏或破坏细胞以释放与细胞结合的病毒。此外，灭活剂可在所述培养物上清已被冷冻保存并解冻之后加入，或在一步或多步纯化以除去细胞污染物之后进行。然而，优选在除去细胞和细胞碎片之后或一步或多步纯化之后加入甲醛。加入甲醛之后，将含有病毒的混合物转移到培养容器并在冷藏温度(例如+2至8℃)或在较高温度如约20-30℃或33-37℃的室温下培育12小时至7天，其中，所选温度应该与培育时间相适应。优选的条件是，例如在+2至8℃下培养3-7天(优选3-7天)，在室温下培养16小时至3天(优选24-48小时)，或在35-37℃下培养12-36小时。如果需要除去过量的福尔马林，可在灭活过程结束之后加入等摩尔或1.5倍摩尔浓度(相对甲醛)的硫代硫酸钠或焦亚硫酸钠。
例如，可以以下浓度使用β-丙内酯，如0.01-0.5％，优选0.5％-0.2％，更优选0.025-0.1％。在从用于传播病毒的容器中收获培养物上清之前或之后在含有病毒的所述培养物上清(病毒材料)中加入灭活剂，收获之前可进行或不进行破坏细胞以释放与细胞结合的病毒的步骤。此外，灭活剂可在所述培养物上清已被冷冻保存并解冻之后加入，或在一步或多步纯化以除去细胞污染物之后进行。将β-丙内酯加入病毒材料，用氢氧化钠(例如1N NaOH)、Tris缓冲液或碳酸氢钠溶液来控制会产生不良影响的pH向酸性变化。将混合物转移到另一灭活容器之后，将灭活剂-病毒材料混合物在4-37℃下培育一段时间，优选24-72小时。
可用的其它灭活剂是二元吖丙啶(BEI，binary ethyleneimine)。将等体积0.2摩尔的溴乙胺氢溴化物溶液和0.4摩尔的氢氧化钠溶液混合并在约37℃培育60分钟。所得环化的灭活剂便是二元吖丙啶，以体积比0.5-4％，优选1-3％将其加入病毒材料。灭活的病毒材料在约4-37℃下放置24-72小时，间以搅拌。培养结束时加入20ml 1摩尔的无菌硫代硫酸钠溶液以确保BEI被中和。
一实施方案中，本发明包括一种灭活方法，这种方法被设计成使病毒最大程度暴露于灭活剂并使温敏SARS病毒颗粒在升高的温度下暴露时间最短。本发明包括一种灭活方法，该方法包括使病毒在冷藏温度下与灭活剂(如BPL)接触12-24小时，然后升高温度3小时来水解任何剩余的灭活剂。优选所述冷藏温度为0-8℃，更优选约4℃。优选所述升高的温度为33-41℃，更优选约37℃。对每份10ml灭活制剂中残余的感染病毒进行评估可知，该方法能够灭活原始细胞培养收获物中的SARS-CoV，使其降至0.03感染单位/ml的理论值以下。
在易感细胞(组织)培养物(如VERO)中加入稀释和未稀释的灭活病毒材料样品以检测任何未灭活的病毒。使培养的细胞传代多次并用例如细胞病变效应(CPE)和抗原检测(例如通过对SARS病毒特异的荧光素抗体偶联物)等方法中的任何一种来检验SARS病毒的存在情况。这种检测能够确定完整的病毒灭活情况。
在灭活之前，在哺乳动物细胞培养物中培养SARS病毒。细胞培养物可以是贴壁生长的细胞或生长在悬液中的细胞。优选细胞是哺乳动物来源的，但也可以来自鸟类(例如鸡细胞，如鸡胚细胞(CEF细胞))、两栖动物、爬行动物、昆虫或鱼类。细胞的哺乳动物来源包括，但不限于，人类或非人灵长类细胞(例如，MRC-5(ATCCCCL-171)，WI-38(ATCC CCL-75)，HeLa细胞，人二倍体细胞，恒河猴胎肺细胞(例如ATCC CL-160)，人胚胎肾细胞(293细胞，通常被剪切的腺病毒5型DNA转化)，Vero细胞(如猴肾Vero细胞)，马、牛(如MDBK细胞)、羊、狗(例如狗肾MDCK细胞，ATCCCCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016，如WO 97/37001所述保藏编号为DSM ACC 2219)、猫和鼠(例如仓鼠细胞，如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自各个发育阶段，包括例如成人、新生儿、胎儿或胚胎。
在一些实施方案中，所述细胞是无限增殖的(比如在例如WO 01/38362和WO02/40665中所述并以编号96022940保藏于ECACC的PERC.6细胞，这两个文献被全文纳入本文作为参考)，或用这里所述的技术使其无限增殖的任何其它细胞类型。
在优选的实施方案中使用了哺乳动物细胞，这种细胞可选自和/或来自以下一种或多种非限定性的细胞类型：成纤维细胞(例如真皮细胞、肺细胞)，内皮细胞(例如主动脉细胞、冠状细胞、肺细胞、血管细胞、皮肤微血管细胞、脐带细胞)，肝细胞、角质细胞、免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突细胞)，乳房细胞(例如，上皮细胞)，平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、宫颈细胞、视网膜周细胞)，黑色素细胞，神经细胞(例如，星形胶质细胞)，前列腺细胞(例如，前列腺上皮、平滑肌细胞)，肾细胞(例如，上皮细胞、肾小球细胞、近端小管细胞)，骨骼细胞(例如，软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)，肌肉细胞(例如，成肌细胞、骨骼细胞、平滑细胞、支气管细胞)，肝细胞，成视网膜细胞和基质细胞。WO 97/37000和WO 97/37001(被全文纳入本文作为参考)描述了制造能够在悬液和无血清培养基中生长、并能用于制造和复制病毒的动物细胞和细胞系。
优选本发明的SARS病毒培养在VERO细胞或恒河猴胎肾细胞中。
上述细胞类型的培养条件已在各种出版物中详细描述，或者替代培养基、添加物和培养条件可通过商业途径购买，例如Cambrex Bioproducts(East Rutherford，NJ)的目录和其它文献。
一些实施方案中，用于这里所述方法的宿主细胞培养在无血清和/或蛋白质的培养基中。本文中，当培养基中不含人或动物来源的血清添加物时称为无血清培养基。无蛋白质是指细胞在没有蛋白质、生长因子或其它蛋白质添加物和非血清蛋白质的情况下发生增殖的培养物。生长在这种培养物中的细胞自然自身含有蛋白质。
已知的无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。常规的含有血清的培养基包括Eagle基本培养基(BME)或极限必需培养基(MEM)(Eagle，Science，130，432(1959))或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM)，其中通常含有最多10％胎牛血清或类似的添加物。任选地，可使用不含任何血清添加物的极限必需培养基(MEM)(Eagle，Science，130，432(1959))或Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM或EDM)。无蛋白质的培养基，如PF-CHO(JHRBioscience)、化学成分明确的培养基如ProCHO 4CDM(BioWhittaker)或SMIF7(Gibco/BRL Life Technologies)，以及促有丝分裂肽如Primactone、Pepticase或HyPepTM(都来自Quest International)或乳清蛋白水解产物(Gibco以其它制造商)也是现有技术中已知的。采用以植物水解产物为基础的培养基添加物的特殊优点是可排除病毒、支原体或未知感染因子的污染。
用于所需目的的细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)在很大范围内是不同的，以适应本发明所用细胞系以及适应SARS病毒的需求。
在培养的细胞(如哺乳动物细胞)中增殖SARS病毒的方法包括以下步骤：在培养的细胞中接种SARS病毒，将感染的细胞培养所需时间以使病毒增殖，培养时间将由例如SARS病毒滴度或SARS病毒抗原表达而定(例如在接种后约24-168小时)，并收集增殖的病毒。以病毒(通过PFU或TCID50测定)细胞比为1∶10000-1∶10的比例在培养的细胞中接种SARS病毒。可采用较低的比例范围，例如1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10。将SARS病毒加入细胞悬液或细胞单层，病毒被吸附到细胞上需要至少60分钟，通常少于300分钟，优选25-40℃90-240分钟，更优选28-37℃，最优选33℃。将感染的细胞培养物(例如，单层)通过冷冻-解冻或通过酶作用处理以提高收获的培养上清中的病毒浓度。然后可灭活收获的液体或冷冻保存。
图26A是在有和没有胎牛血清(“FCS”)时培养的SARS感染的Vero细胞的比较。简言之，在感染前的一天将Vero细胞分装并在T175烧瓶中培养。第二条用含或不含3％FCS的SARS-SoV贮液(FRA毒株，第4代，登录号AY310120)感染90％铺满的Vero细胞单层。在细胞培养基中加入FCS显示对病毒产量几乎没有影响。
可以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选的，以约0.01的m.o.i.感染细胞。不同m.o.i.水平下病毒产量的比较示于图26B。
感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。见图26C。
纯化灭活病毒的方法是本领域已知的，其中包括以下一种或多种，例如梯度离心、超速离心、连续流动超速离心和层析法，如离子交换层析、尺寸排阻层析和液相亲和层析。其它纯化方法包括超滤和渗滤。参见JP Gregersen“Herstellung vonVirussimpfstoffen aus Zellkulturen”，Pharmazeutische Biotecnologie第4.2章节(O.Kayser和RH Mueller编)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft，Stuttgart，2000。也可参见O’Neil等，“病毒收获和液相亲和层析。浓缩和纯化病毒的方法”(Virus Harvesting and Affinity Based Liquid Chromatography.AMethod for Virus Concentration and Purification)，Biotechnology(1993)11：173-177；Prior等，“制造灭活HIV-1的改进方法”(Process Developmentfor Manufacture of Inactivated HIV-1)，Pharmaceutical Technology(1995)30-52；以及Majhdi等，“腹泻Elk小牛的冠状病毒的分离和特性”(Isolation andCharacterization of a Coronavirus from Elk Calves with diarrhea)Journal ofClinical Microbiology(1995)35(11)：2937-2942。
适合用于本发明的其它纯化方法的例子包括聚乙二醇沉淀或硫酸铵表面沉淀(参见Trepanier等，“用硫酸铵、聚乙二醇或中空纤维超滤浓缩人呼吸道合胞病毒”(Concentration of human respiratory syncytial virus using ammonium sulfate，polyethylene glycol or hollow fiber ultrafiltration)Journal of VirologicalMethods(1981)3(4)：201-211；Hagen等，“聚乙二醇沉淀肝炎病毒用于制备高纯度灭活疫苗VAQTA的优化”(Optimization of Poly(ethylene glycol)Precipitation ofHepatitis Virus Used to prepare VAQTA，a Highly Purified InactivatedVaccine)Biotechnology Progress(1996)12：406-412；和Carlsson等，“通过阴离子交换层析纯化传染性胰坏死病毒提高比传染性”(Purification of InfectiousPancreatic Necrosis Virus by An Iron Exchange Chromatography Increases theSpecific Infectivity)Journal of Virological Methods(1994)47：27-36)，以及超滤和微滤(参见Pay等，Developments in Biological Standardization(1985)60：171-174；Tsurumi等，“用于除去病毒的改进的铜铵再生纤维素中空纤维(改进的BMM中空纤维)的结构和过滤性能”(Structure and filtrationperformances of improved cuprammonium regenerated cellulose hollowfibre(improved BMM hollow fibre)for virus removal)Polymer Journal(1990)22(12)：1085-1100；和Makino等，“用再生纤维素中空纤维BMM浓缩肝逆转录病毒”(Concentration of live retrovirus with a regenerated cellulose hollow fibre，BMM)，Archives of Virology(1994)139(1-2)：87-96.)。
优选用层析法纯化病毒，例如离子交换层析。层析纯化能够产生大量含有病毒的悬液。感兴趣的病毒产物可通过简单的吸附/解吸机制与层析介质相互作用，一次操作可处理大体积样品。对吸附剂没有亲和力的杂质则流过柱子。病毒材料可以浓缩形式被洗脱。
优选的用于本发明的阴离子交换树脂包括DEAE、EMI)TMAE。优选的阳离子交换树脂可具有磺酸修饰的表面。一实施方案中，第一个步骤用含有强阴离子交换树脂(例如EMD TMAE)进行离子交换层析，第二个步骤用EMD-SO3(阳离子交换树脂)纯化病毒。可任选用金属结合亲和层析法进一步纯化(参见例如，WO 97/06243)。
优选用于本发明的树脂是FractogelTM EMD。这种合成的甲基丙烯酸酯树脂具有共价结合的长的线形聚合物链(所谓的“触手”)。这种“触手化学物(tentaclechemistry)”允许大量空间上可接近的配体与生物分子结合而无空间障碍。这种树脂还具有改进的压力稳定性。
基于柱子的液相亲和层析法是另一种优选的用于本发明的纯化方法。用于这种纯化方法的树脂的例子是MatrexTM CellufineTM Sulfate(MCS)。MCS由刚性球形(直径约45-105μm)纤维素基质构成，其排阻极限为3000道尔顿(其孔结构所允许的最大分子)，在纤维素的6位上有低浓度的硫酸酯功能基。由于功能性配体(硫酸酯)相对高度分散，其提供的阳离子交换密度不足以使大多数可溶性蛋白质吸附于珠表面。因此，典型病毒液(细胞培养上清，例如热原和大多数的污染蛋白质，以及核酸和内毒素)中可见的大量蛋白质被从柱子上洗了下来，而实现了对结合的病毒的一定程度纯化。
刚性高强度MCS珠有抗压趋势。MCS树脂的压力/流动特性允许高线性流速从而可高速处理，即便是在大的柱子中，这使其容易放大单元操作。MCS层析纯化步骤除提高了安全性和产品的无菌度，还避免了过多的产品处理和安全问题。由于内毒素不与其结合，MCS纯化步骤能够快速且不造成污染地进行除热原。温和的结合洗脱条件提供了高容量和产品产量。因此，MCS树脂是一种简单、快速、有效且经济的浓缩、纯化和除热原方法。此外，MCS树脂可重复使用。
灭活的病毒也可通过梯度离心进一步纯化，优选密度梯度离心。对商业规模的操作而言，连续流动蔗糖梯度离心是优选的。这种方法被广泛用于纯化抗病毒疫苗并且是精通此领域的技术人员熟知的(参见JP Gregersen“Herstellung vonVirussimpfstoffen aus Zellkulturen”，Pharmazeutische Biotecnologie第4.2章节(O.Kayser和RH Mueller编)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft，Stuttgart，2000。)
密度梯度离心步骤可用实验室规模或商业规模的梯度离心设备进行。例如，浮桶式转头、固定角转头或竖直管转头特别适合实验室规模生产病毒。优选所述梯度离心步骤是用浮桶式转头进行的。这种类型的砖头有足够长的通道长度以提供高质量的分离，尤其是对多组分样品。此外，浮桶式转头具有大大降低的管壁效应，内容物在加速和减速期间不用再定向。由于它们较长的通道长度，与固定角转头或竖直管转头相比分离需要较长时间。可通过折光计控制制备的蔗糖溶液的蔗糖浓度。
用于密度梯度离心，如浮桶式离心管，的蔗糖梯度可在离心之前通过梯度仪形成(连续/线形)。加入浮桶式转头离心管内梯度液上的样品的体积是接触样品的梯度液横截面积的函数。如果样品体积过大，则离心管没有足够的径向长度来有效分离多组分样品中的各组分。
用于浮桶式转头SW 28的样品体积约为每管1-5ml(管直径为2.54cm)。通过移液管将样品施加到梯度液顶端。将移液管的平端与管壁呈45-60°角，在梯度液上方约2-3毫米。缓缓注入样品并使其沿着管壁流到梯度液上。离心后回收诸梯度液组分，方法是小心插入计量注射针直至管底，并将液体从管中泵入falcon管开始收集2ml各组分。
适合用于密度梯度离心纯化步骤的蔗糖密度梯度包括0-60％、5-60％、15-60％、0-50％、5-50％、15-50％、0-40％、5-40％和15-40％。优选蔗糖密度梯度15-40％、5-40％或0-40％。
或者可采用不连续蔗糖密度梯度进行纯化。不连续蔗糖密度法采用不同浓度的蔗糖分离、重叠层。在一个例子中，第一层为50％蔗糖，其上覆盖第二层40％蔗糖，第二层上覆盖第三层20％蔗糖，第三层上覆盖第四层10％蔗糖，而第四层上覆盖含有待纯化病毒的溶液。
一实施方案中，灭活的病毒的纯化方法包括第一步层析纯化和第二步梯度离心。优选第一步包括液相亲和层析，如MCS。优选第二步包括用浮桶式转头进行密度梯度离心。
纯化灭活SARS病毒的其它纯化方法包括采用核酸降解剂，优选核酸降解酶，如具有DNA酶和RNA酶活性的核酸酶，或内切核酸酶，如粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)的内切核酸酶，商品名为BenzonaseTM，含阴离子官能团的膜吸附剂(例如SartobindTM)或含阴离子官能团填料的其它层析步骤(例如DEAE或TMAE)。超滤/渗滤和最后的无菌过滤步骤也可被加入纯化方法。
优选纯化方法包括用一种或多种核酸降解酶处理SARS病毒分离物。这些酶可用来在病毒纯化处理中减少宿主细胞核酸的水平。用于细胞培养物的核酸降解酶是本领域已知的，包括例如BenzonaseTM。
用核酸降解酶和灭活剂处理病毒可依次进行或以组合方式或同时方式进行。优选核酸降解剂在加入灭活剂之前被加入病毒制品。
本发明的纯化的病毒制品基本上不含来自细胞或细胞培养物的受污染的蛋白质，优选每微克病毒抗原含有少于约1000、500、250、150、100或50pg的细胞核酸，优选每剂含有少于约1000、500、250、150、100或50pg细胞核酸。更优选所述纯化的病毒制品含有少于约20pg，更优选少于约10pg细胞核酸。检测病毒样品中宿主细胞核酸水平的方法的此领域已知的。WHO或FDA等管理机构批准或推荐的标准方法是优选的。
本发明包括一种灭活疫苗组合物，其中含有预防有效量的SARS病毒抗原，优选刺突或其免疫原性片段。所述SARS病毒抗原优选以0.1-50μg抗原/剂的浓度量存在，更优选为0.3-30mg抗原/剂。更优选抗原量约为15μg/剂。
一实施方案中，本发明的灭活疫苗组合物中采用了较低浓度的SARS病毒抗原。这种较低浓度的疫苗可任选含有佐剂以引发宿主对抗原的免疫应答。在这种“低剂量”疫苗中，SARS病毒抗原优选以低于15μg抗原/剂的浓度存在，即低于10、7.5、5或3μg抗原/剂。
本发明的灭活疫苗制品还含有稳定剂以保持灭活病毒制品中免疫原性蛋白质的完整性。适合用于疫苗的稳定剂是本领域已知的，可包括，例如，缓冲液、糖、糖醇和氨基酸。宜将稳定性缓冲液调至生理pH范围，并可包含磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、TE(Tris/EDTA)、TEN(Tris/Nacl/EDTA)S和Earle盐溶液。稳定性糖可包括，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、葡聚糖、硫酸葡萄糖和海藻糖。稳定性糖醇可包括，例如，木糖醇、甘露醇、山梨醇和甘油。适用于本发明的氨基酸包括，例如，L-谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸和赖氨酸、可用于本发明的其它稳定剂包括酒石酸、PluronicF 68和吐温80。
可用于本发明的灭活病毒制品的SARS病毒分离物可通过上述任何方法获得和鉴定。例如，SARS分离物可从临床样品和纯化的嗜菌斑获得。这种分离病毒的方法是本领域已知的。
可采用其它纯化方法以确保用于制备疫苗的病毒种子不含，例如不需要的外来试剂。一实施方案中，来自病毒分离物的病毒RNA可从病毒中分离、纯化(并任选随后通过PCR或其它方法来证实)，然后将其引入合适的细胞培养物。
作为这种技术的一个例子，临床病毒样品经过嗜菌斑纯化并在vero细胞上增殖产生足量病毒样品以供分析。离心除去上清中的细胞碎片。然后可超速离心沉淀病毒并将病毒团重悬于PBS。再次离心纯化之后，用DNA酶(也可任选RNA酶)处理含有病毒的组分。然后从该组分分离得到病毒RNA并将其转染入宿主细胞。
实施例2和3例举了一种纯化灭活的完整SARS病毒的方法，该方法采用MCS层析法树脂纯化然后进行密度梯度超速离心。
免疫接种本发明疫苗的途径和方法将在下面的章节中详细叙述。实施例4和5提供了用本发明的灭活SARS病毒对小鼠进行免疫接种的例子。
B.SARS减毒疫苗
本发明包括一种含有减毒SARS病毒的组合物。这种组合物可作为预防性或治疗性SARS病毒疫苗。使病毒减毒的方法是本领域已知的。这些方法包括将SARS病毒在培养的细胞(例如，哺乳动物细胞培养物，优选恒河猴胎肾细胞或Vero细胞—见A部分中有关培养SARS病毒的叙述)中连续传代直到证明SARS病毒的毒性减弱。病毒生长温度可以是组织培养物能够发生传代减毒作用的任何温度。在细胞培养物中一次或多次传代后SARS病毒的毒性减弱程度可由精通此领域的技术人员来检测。减毒作用在这里是指SARS病毒在人体中毒力降低。毒性减弱的证据可以表现为病毒复制水平降低或在动物模型中的毒力降低。
制造减毒SARS病毒的其它方法包括在次佳或“冷”温度下在细胞培养物中传代病毒并通过随机诱变(例如化学诱变)或定点诱变在SARS病毒基因组中引入使毒性减弱的突变。制备和产生减毒REV疫苗的方法(这种方法对于SARS病毒通常也是适用的)揭示在，例如，EP 0 640 128，美国专利No.6284254，美国专利No.5922326，美国专利No.5882651。
SARS病毒的减毒衍生物可用几种方法制造，例如，在有或没有化学诱变剂(例如5-氟尿嘧啶)时通过在“冷”温度下培养物中传代引入温度敏感性突变。这种冷适应过程包括在约20-32℃，优选在约22-30℃，最优选在约24-28℃下传代。冷适应或减毒可在逐渐降低的温度下进行传代以引入其它生长限制性突变。获得安全的、免疫减毒病毒所需的传代数至少部分取决于所采用的条件。在动物(例如小鼠、灵长类)中对SARS病毒培养物的毒力和免疫能力进行定期测试可容易地确定组织培养物与温度的特定组合所需要的参数。通常将减毒疫苗配制成每剂的最大效力约103-106PFU或TCID50或以上。
也可通过创建病毒嵌合体来制造SARS-CoV的减毒病毒疫苗，所述嵌合体中包含来自至少两种不同冠状病毒的序列，其中一种是SARS-CoV。例如，制造了一种含有来自第一种冠状病毒(例如，鼠、牛、猪、犬、猫、鸟类冠状病毒)的编码非结构蛋白的基因和一个或多个来自SARS-CoV的编码结构蛋白的基因(例如，刺突、E、M)的病毒嵌合体。或者，这种病毒嵌合体可含有来自非SARS-CoV的人冠状病毒(例如，OC43、229E)的序列以及来自SARS-CoV的序列。本发明的嵌合冠状病毒可通过各种方法产生，例如包括使天然RNA在真核(如哺乳动物)细胞中重组，所述真核细胞中含有各自亲本冠状病毒的RNA(例如在感染之后)，或者用精通此领域的技术人员已知的标准分子生物学技术来工程构建所需病毒嵌合体(或其部分)作为cDNA克隆，然后用它们来制造传染性病毒(参见例如，US 6593111 B2；Yount等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(22)：12995-13000)。这里所述的冠状病毒嵌合体的减毒表型是精通此领域的技术人员容易检测的。
减毒的病毒也可通过删除一个或多个病毒复制不必需的开放读框(ORF)产生。优选这些删除发生在基因组的结构区域中，如ORF 3a、3b、6、7a、7b、8a、8b、9b。参见，例如，Haijema BJ，Volders H，Rottier PJ.J Virol.(2004)78(8)：3863-71；以及de Haan，C.A.，P.S.Masters，X.Shen，S.Weiss和P.J.Rottier，“组特异性鼠冠状病毒基因是非必需的，但通过反向遗传学将它们删除可在天然宿主中产生减毒作用”(The group-specific murine coronavirus genes are not essential，but their deletion，by reverse genetics，is attenuating in the natural host)Virology(2002)296：177-189。删除SARS等冠状病毒内的这种区域可通过，例如，反向遗传学方法或“定向重组”实现，见例如Masters，P.S.，“最大RNA病毒的反向遗传学”Adv.Virus Res.(1999)53：245-264。
纯化减毒病毒的方法是本领域已知的，可包括以下一种或多种方法，例如梯度离心和层析法。参见Gregersen“Herstellung von Virussimpfstoffen ausZellkulturen”，Pharmazeutische Biotecnologie第4.2章节(O.Kayser和RHMueller编)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft，Stuttgart，2000。
C.SARS裂解疫苗
本发明包括含有裂解SARS病毒制剂的组合物及其制造方法。这种组合物可用作预防性或治疗性SARS病毒疫苗。
裂解包膜病毒的方法是本领域已知的。裂解包膜病毒的方法叙述在，例如，WO02/28422，其内容纳入本文作为参考，并特别包括其中所述的裂解剂和方法。裂解流感病毒的方法描述在，例如，WO 02/067983、WO 02/074336和WO 01/21151，它们被分别全文纳入本文作为参考。
裂解病毒是用破裂浓度的裂解剂来破裂或片段化完整病毒，该病毒可以是传染性(野生型或减毒的)或非传染性(例如灭活的)病毒。断裂导致病毒蛋白质全部或部分溶解，改变了病毒了完整性。
优选所述裂解剂是非离子型或离子型表面活性剂。因此，本发明的裂解SARS病毒制剂还包含至少一种非离子型表面活性剂或去污剂。用于本发明的裂解剂的例子包括：胆汁酸及其衍生物、非离子型表面活性剂、烷基糖苷或烷基硫代糖苷及其衍生物、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(N，N-dialkyl-Glucamide)、Hecameg、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲基铵)或塞太弗伦(Cetavlon)。
优选所述离子型表面活性剂是阳离子去污剂。适用于本发明的阳离子去污剂包括含有具有下式的化合物的去污剂：
其中，
R1、R2和R3可以相同或不同，各自表示烷基或芳基，或
R1和R2以及它们所结合的氮原子一起形成5或6元杂环，和
R3表示烷基或芳基，或
R1、R2和R3与它们所结合的氮原子一起形成氮原子上不饱和的5或6元杂环，
R4表示烷基或芳基，和
X表示阴离子
这种阳离子去污剂的例子有十六烷基三甲基铵盐，如溴化十六烷基三甲铵(CTAB)和十四烷基三甲基铵盐。
适用于本发明的其它阳离子去污剂包括lipofectine、脂转染胺(lipofectamine)和DOT-MA。
适用于本发明的非离子型表面活性剂包括以下一种或多种：辛基苯氧基或壬基苯氧基聚氧化醇类(polyoxyethanol)(例如市售的Triton系列)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯类(Tween系列)和聚氧乙烯醚类或具有以下通式的酯类：
                          O(CH2CH2O)n-A-R
其中，n是1-50，A是一个键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基；以及其中两个或多个的组合。
本发明包括制造SARS裂解病毒的方法，该方法包括使SARS病毒接触足量的裂解剂以破坏病毒包膜。裂解后病毒丧失了完整性使病毒不具传染性。一旦病毒包膜蛋白被破坏就不再与完整的病毒颗粒结合，其它病毒蛋白便会完全或部分溶解，从而在裂解后不与仅部分与完整的病毒颗粒结合。
制造SARS裂解病毒的方法还可包括除去裂解剂以及部分或大部分病毒脂类物质。此过程还包括一些差别性过滤步骤和/或其它分离步骤，如超速离心、超滤、区带离心和层析步骤的各种组合。该过程还可任选包括灭活步骤(如上所述)，该灭活步骤可在裂解之前或之后进行。裂解步骤可以分批、连续或半连续方式进行。
本发明的SARS裂解病毒疫苗可包含结构蛋白、膜片段和膜包膜蛋白。优选本发明的SARS裂解病毒制品包含至少一半病毒结构蛋白。
制造SARS裂解病毒制剂的方法的一个例子包括以下步骤：
(i)在MRC-5细胞(ATCC CCL-171)、WI-38细胞(ATCC CCL-75)、恒河猴胎肾细胞或vero细胞等细胞培养物中增殖SARS病毒(参见上文A部分有关SARS病毒培养的叙述)；
(ii)从细胞培养物中收获含有SARS病毒的物质；
(iii)澄清收获的物质以除去非SARS病毒物质；
(iv)浓缩收获的SARS病毒；
(v)使完整的SARS病毒与非病毒物质分离；
(vi)在密度梯度离心步骤中用合适的裂解剂裂解完整的SARS病毒；和
(vii)过滤以除去不需要的物质。
上述步骤宜按照顺序进行。
澄清步骤宜通过中等速度离心完成。或者，过滤步骤可使用例如0.2μm的膜。
浓缩步骤宜采用吸附方法，例如，使用CaHPO4。或者可采用过滤，例如超滤。
其它分离步骤也可用于本发明的方法。其它分离步骤宜为区带离心分离，并可任选采用蔗糖梯度。蔗糖梯度中还可含有防腐剂以防止微生物生长。
裂解步骤也可在蔗糖梯度中进行，其中，所述蔗糖梯度中含有裂解剂。
该方法还可包括无菌过滤步骤，该步骤可任选在处理结束时进行。优选最后的过滤步骤之前有一灭活步骤。
制备SARS裂解病毒制剂的方法还可包括用DNA消化酶处理该病毒制剂。这些酶可用来在病毒纯化步骤中降低宿主细胞DNA的水平。用于细胞培养物的DNA消化酶是本领域已知的，其中包括，例如，Benzonase_。
用DNA消化酶处理SARS病毒制剂可在纯化处理和裂解处理的任何时候进行。然而优选在使用去污剂之前用DNA消化酶处理SARS病毒制剂。更优选在用阳离子去污剂如CTAB处理之前用Benzonas之类的DNA消化酶处理SARS病毒制剂。
纯化裂解病毒的方法是本领域已知的。参见JP Gregersen“Herstellung vonVirussimpfstoffen aus Zellkulturen”，Pharmazeutische Biotecnologie第4.2章节(O.Kayser和RH Mueller编)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft，Stuttgart，2000。
本发明包括裂解疫苗组合物，其中含有预防有效量的SARS病毒抗原，优选其裂解片段或免疫原性片段。所述SARS病毒抗原的浓度优选0.1-50μg抗原/剂，更优选0.3-30μg抗原/剂。更优选所述抗原约为15μg/剂。
一实施方案中，在本发明的裂解疫苗组合物中使用了较低浓度的SARS病毒抗原。这种较低浓度的疫苗可任选含有一种佐剂以增强宿主对抗原的免疫应答。在这种“低剂量”疫苗中，SARS病毒抗原的浓度优选低于15μg抗原/剂，即低于10、7.5、5或3μg抗原/剂。
D.SARS亚单位疫苗
本发明包括含有分离的纯化SARS病毒抗原或其衍生物的组合物。这种组合物还可含有一种或多种佐剂。
SARS病毒抗原可从生长在细胞培养物中的SARS病毒中分离或纯化。或者，SARS病毒抗原可用本领域已知的方法重组产生。
用于本发明的SARS病毒抗原可在许多不同的表达系统中制造，这些表达系统是本领域已知的；例如使用哺乳动物细胞、杆状病毒、细菌和酵母的表达系统。这种表达系统通常使用编码本发明病毒抗原的多核苷酸。这种序列可用标准分子生物学技术获得，其中包括翻译这里列出的氨基酸序列。因此，本发明包括编码本发明病毒抗原的多核苷酸。此外，本发明的病毒抗原可通过化学合成法制造(至少部分，宜为整体)。
昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，是精通此领域的技术人员已知的，并描述在例如Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。杆状病毒/插入的细胞表达系统所用的材料和方法可通过市售的试剂盒获得，其中包括Invitrogen，San Diego CA。类似地，细菌和哺乳动物细胞细胞表达系统也可本领域已知是，并描述在例如《酵母遗传工程》(Yeeat GeneticEngineering)(Barr等编，1989)Butterworths，London。
已知许多可用于上述系统的合适的宿主细胞。例如，哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括获自美国模式培养物保藏所(ATCC)的无限增殖细胞系，例如，但不限于，中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞、猴肾细胞(例如，HepG2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞以及其它细胞。细胞的哺乳动物来源包括，但不限于，人类或非人灵长类细胞(例如，MRC-5(ATCC CCL-171)，WI-38(ATCC CCL-75)，恒河猴胎肺细胞(例如ATCC CL-160)，人胚胎肾细胞(293细胞，通常被剪切的腺病毒型5DNA转化)，Vero细胞(如猴肾Vero细胞)，马、牛(如MDBK细胞)、羊、狗(例如狗肾MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，如WO 97/37001所述保藏编号为DSM ACC 2219)、猫和鼠(例如仓鼠细胞，如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自各个发育阶段，包括例如成人、新生儿、胎儿或胚胎。
类似地，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属等细菌宿主也可用于本发明的表达构建物。用于本发明的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenuala polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichiaguillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和甘兰尺蠖(Trichoplusia ni)。
可用此领域熟知的各种基因输送技术将含有本发明病毒抗原或抗体编码核苷酸序列的核酸分子稳定整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中保持在稳定的附加体元件。参见，例如，美国专利No.5,399,346。
根据所选择的表达系统和宿主，在蛋白质表达的条件下使表达载体转化的宿主细胞增殖而产生所需分子。然后从宿主细胞分离表达的蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，则可从培养基直接纯化产物。如果未被分泌则可从细胞裂解物中分离。选择合适的培养条件和回收方法是精通此领域的技术人员已知的。
本发明包括含有分离或纯化的SARS病毒抗原或其衍生物的组合物。本发明还包括含有至少两种分离或纯化的SARS病毒抗原或其衍生物的组合物，这两种物质已被共同纯化或被单独纯化然后再合并。一实施方案中，所述SARS病毒抗原是刺突(S)蛋白。再在另一实施方案中，所述SARS病毒抗原是核衣壳(N)蛋白、膜(M)糖蛋白或包膜(E)蛋白。优选所述组合物中SARS病毒抗原的纯度大于75％(例如，78％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、98％)。
本发明包括一种疫苗组合物，其中含有预防有效量的SARS病毒抗原，优选刺突或其免疫原性片段。所述SARS病毒抗原的浓度优选为0.1-50μg抗原/剂，更优选为0.3-30μg抗原/剂。再优选地是，抗原约15μg/剂。
一实施方案中，在本发明的疫苗组合物中使用了较低浓度的SARS病毒抗原。这种较低浓度的疫苗可任选含有一种佐剂以引发宿主对抗原的免疫应答。在这种“低剂量”疫苗中，SARS病毒抗原的浓度优选低于15μg抗原/剂，即低于10、7.5、5或3μg抗原/剂。
以下实施例例举了制备SARS病毒刺突(S)蛋白亚单位疫苗的方法。
可用多种方法从多种来源分离并纯化SARS病毒S抗原，这些方法包括，但不限于，在培养的真核细胞(例如哺乳动物细胞，如VERO、CHO)或细菌(例如大肠杆菌)中表达S抗原。表达可通过各种方法实现，例如，从被SARS病毒感染的细胞培养物或细胞培养物上清表达，从编码SARS病毒S蛋白的DNA表达盒(例如，操作性连接于SARS病毒S基因的RNA聚合酶II启动子)稳定转化的培养细胞表达，或从编码SARS病毒S蛋白的可复制或不可复制病毒的表达载体(例如，腺病毒载体、痘病毒载体、α病毒载体、逆转录病毒载体)感染的培养细胞表达，这样便不需要使用传染性SARS病毒。
1.从SARS病毒培养物生产SARS亚单位疫苗
SARS病毒可生长在培养的哺乳动物细胞，如Vero细胞中，然后从培养的细胞分离得到。然后可使SARS病毒抗原，如S蛋白溶解与SARS病毒分离，再进一步分离和纯化。
一实施例中，可按照SARS灭活疫苗实施例的方法来制造SARS病毒，然后用此领域已知的技术从终产物进一步纯化所需的SARS抗原，如刺突蛋白。
另一实施例中，SARS亚单位疫苗可按照以下方法制造。在大型可控发酵罐内微载体珠上所需哺乳动物细胞系来生产SARS病毒。例如，将浓度为105细胞/mL的疫苗级非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)加入60-75升CMRL 1969培养基，pH 7.2，在含有360克Cytodex-1微载体珠的150升生物反应器中，并搅拌2小时。加入CMRL1969至总体积150升。加入胎牛血清(FBS)至最终浓度为3.5％。加入葡萄糖至最终浓度为3.0g/L，并加入谷氨酰胺至最终浓度为0.6g/L。控制溶解氧、pH、搅拌和温度，监测细胞生长、葡萄糖水平、乳酸盐水平和谷氨酰胺水平。当细胞处于对数期时(通常在第3-4天，密度达到约1.0-2.5×106细胞/mL)，倒出发酵罐中的培养基并加入120升CMRL 1969，pH 7.2(无FBS)，然后将培养物搅拌10分钟。排空和填装通常重复一次，但也可重复多达3次。洗涤细胞后，排空发酵罐并加入50升含有0.1％(v/v)FBS的CMRL 1969。以0.001-0.01的感染复数(m.o.i)添加SARS病毒接种物。可加入胰蛋白酶以促进有效感染。加入含有0.1％FBS的CMRL 1969至最终体积为150升。在34℃连续培养。一次发酵可获得一种病毒收获物，通常在感染后2-7天。一次发酵也可获得多次收获物。
可用下述各种方法分离并纯化S蛋白。例如，收集溶解的SARS病毒包膜蛋白从离子交换层析流出的含有S蛋白的流出液；将此流出液加样到羟基磷灰石基质上，并从羟基磷灰石基质选择性洗脱S蛋白。选择性洗脱的S蛋白可通过正切流动超滤进一步浓缩。
或者，可通过以下方法进行分离和纯化：收集溶解的SARS病毒包膜蛋白从离子交换层析流出的含有S蛋白的流出液；将流出液加样到羟基磷灰石基质上并收集含有S蛋白的流出液，从羟基磷石灰基质流出液中选择性除去溶解步骤所用的去污剂，以得到分离并纯化的S蛋白。分离并纯化的S蛋白随后可通过正切流动超滤浓缩。可用上面灭活部分所述的核酸降解剂进行处理以除去分离并纯化的S蛋白中的核酸污染物。优选所述核酸降解剂是核酸酶，如Benzonase。
可将分离并纯化的S蛋白用于凝胶过滤介质并随后从其中收集S蛋白以将S蛋白与其它分子量的污染物分离。
或者，分离和纯化可通过以下方法完成：将S蛋白加样到第一离子交换介质，允许污染物通过该介质，从第一离子交换介质洗脱S蛋白，将S蛋白与其它分子量的污染物分离。将洗脱的S蛋白加样到第二离子交换介质，并使污染物通过第二离子交换介质。随后从其中洗脱S蛋白以得到分离并纯化的S蛋白。洗脱的S蛋白可通过正切流动超滤浓缩。
或者，可从感染的细胞裂解物制备适合可用作亚单位疫苗制剂免疫原的基本纯化的SARS病毒S蛋白，例如使用含有1％Triton X-100和脱氧胆酸盐的非变性去污剂缓冲液来溶解被感染的细胞。细胞裂解物通过离心澄清并通过免疫亲和纯化从细胞裂解物纯化得到S蛋白。产生抗S蛋白的单克隆抗体，使其与珠偶联并用这些珠来装柱。将被SARS感染的细胞裂解物施加到该柱，并用含有0.1％Triton X-100的PBS来洗涤该柱。结合到柱上的蛋白质用0.1M甘氨酸，pH 2.5，0.1％Triton X-100洗脱。用例如Trix缓冲洗脱的样品并分析其中蛋白质的存在。合并含有蛋白质的组分并用PBS透析。
如上所述，本发明包括分离并纯化的SARS病毒S蛋白。一实施例中，将该病毒培养在疫苗级细胞系，如Vero细胞上，收获培养的病毒。过滤病毒收获物，然后用具有所需截留分子量的膜渗滤进行正切流动超滤浓缩。可将病毒收获浓缩物离心并弃去上清。然后用去污剂从离心沉淀物中提取溶解的S蛋白，例如，将沉淀重悬于含有去污剂(如非离子型去污剂，包括TRITON X-100)的提取缓冲液至最初收获浓缩物的体积。
离心除去未溶解的蛋白质之后，通过层析纯化S蛋白提取物。可先将提取物加到离子交换层析柱，如平衡的TMAE-fractogel或S-fractogel柱，使S蛋白流过而杂质保留在柱子上。
然后将流出液加样到经过平衡的羟基磷灰石柱上，使S蛋白结合到基质而使污染物通过柱。然后用合适的洗脱液从柱子上洗脱结合的S蛋白。可进一步处理所得纯化的S蛋白溶液以提高其纯度。首先可用具有所需截留分子量的膜通过正切流动超滤浓缩洗脱液。可使滤液与具有所需分子量(例如约6000-8000)的聚乙二醇接触以沉淀蛋白质。离心并弃去上清之后可将沉淀物重悬于PBS并透析以除去聚乙二醇。最后可将经过透析的S蛋白溶液无菌过滤。经过无菌过滤的液体可被吸附到明矾上。如果需要，在纯化操作的早期阶段进行聚乙二醇沉淀和重悬纯化步骤。
或者，在培养和收获病毒之后回收SARS病毒，例如用PEG沉淀或正切流动过滤得到浓缩物。使病毒与去污剂接触以溶解S蛋白。离心之后回收上清以进一步纯化S蛋白并弃去不溶性蛋白质。
将上清加样到离子交换层析柱，如TMAE-fractogel或S-fractogel柱，该柱已经过适当平衡以将S蛋白保留在柱子上。在合适的条件下将S蛋白从离子交换柱上洗脱下来。然后使洗脱液通过凝胶过滤柱，如Sephacryl S-300柱，以将S蛋白与其它分子量的污染物分离。可用羟基磷灰石柱代替Sephacryl柱。
可从柱子上洗脱S蛋白以得到纯化的S蛋白溶液。洗脱液可用具有所需截留分子量的膜通过正切流动超滤浓缩。浓缩的S蛋白溶液然后可无菌过滤。
或者，病毒收获物可通过超滤浓缩，并可对浓缩的病毒收获物进行最初的纯化步骤，例如，通过凝胶过滤层析、聚乙二醇沉淀或硫酸Cellufine层析。然后可用去污剂处理纯化的病毒以溶解S蛋白。溶解S蛋白之后可将上清加样到离子交换柱，如硫酸Cellufine层析柱，该柱已经过平衡以使蛋白质结合到柱子上而使污染物流过。类似地，可用TMAE-fractogel或S-fractogel柱来代替硫酸Cellufine柱。也可将这两个柱子组合成顺序纯化步骤。将S蛋白从柱子上洗脱下来以得到纯化的蛋白质溶液。然后可用具有所需截留分子量的膜通过正切流动超滤和渗滤来浓缩该溶液。
具体地说，在一种纯化S蛋白的方法中，病毒收获浓缩物于4℃在28,000×g离心30分钟。弃去上清并将沉淀重悬于含有10mM Tris-HCl(pH 7.0)、150mM NaCl、2％(w/v)Triton X-100的提取缓冲液至原始收获浓缩物体积。加入Pefabloc至最终浓度为5mM。将悬液在室温下搅拌30分钟。含有可溶性S蛋白的上清在4℃下以28,000×g离心30分钟以使其澄清。TMAE-Fractogel柱用10mM Tris-HCl(pH 7.0)、150mM NaCl(其中含有0.02％Triton X-100)平衡。将含有可溶性S蛋白的TritonX-100上清直接加样到TRAE-Fractogel柱。收集总加样体积和2倍柱体积的10mMTris-HCl，pH 7.0，150mM NaCl(含0.02％Triton X-100)。将含有S蛋白的TMAE-Fractogel流出液用10mM Tris-HCl，pH 7.0(含有0.02％Triton X-100)稀释3倍。
羟基磷灰石柱用10mM Tris-HCl，pH 7.0，50mM NaCl，0.02％Triton X-100平衡。加入TMAE流出液后用2倍柱体积的10mM Tris-HCl，pH 7.0，50mM NaCl，0.02％Triton X-100和4倍柱体积的5mM磷酸钠，pH 7.0，1M NaCl，0.02％TritonX-100洗涤该柱。蛋白质用4倍柱体积的20mM磷酸钠，pH 7.0，1M NaCl，0.02％TritonX-100洗脱。根据A280和蛋白质含量收集各组分测定抗原浓度。纯化的S蛋白用300kDa NMWL膜通过正切流动超滤来超滤。
2.重组制造SARS亚单位疫苗
如上所述，SARS病毒蛋白质可通过重组表达来制造。适合重组表达的宿主细胞包括细菌、哺乳动物、昆虫、酵母等。重组表达可用来制造全长SARS蛋白、其片段或其融合产物。
融合肽可用来便于重组SARS蛋白的表达和纯化。例如，在待表达的SARS抗原中加入标记蛋白作为含有标记蛋白和SARS抗原的融合蛋白进行表达有助于重组制造SARS多肽。这种标记蛋白有助于表达的蛋白质的纯化、检测和稳定性。适用于本发明的标记蛋白包括聚精氨酸标记(Arg-tag)、聚组氨酸标记(His-tag)、FLAG-tag、Strep-tag、c-myc-tag、S-tag、钙调蛋白结合肽、纤维素结合域、SBP-tag、壳多糖结合域、谷胱甘肽S转移酶标记(GST)、乳糖结合蛋白、转录终止抗终止因子(transcription termination anti-terminiantion factor)(NusA)、大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)和蛋白质二硫键异构酶I(DsbA)。优选的标记蛋白包括His-tag和GST。关于标记蛋白质的详细讨论可参见Terpe等，“标记蛋白融合综述：从分子和生化基础到商业体系”(Overview of tag protein fusions：from molecular and biochemicalfundamentals to commercial systems)，Appl Microbiol Biotechnol(2003)60：523-533。
纯化之后，标记蛋白可任选从表达的融合蛋白中除去，即通过此领域已知的特异性剪切酶处理。通常使用的蛋白质包括肠激酶、烟草蚀纹病毒(TEV)、凝血酶和Xa因子。
因此，本发明还包括含有融合蛋白的SARS病毒亚单位疫苗。优选所述融合蛋白包含由SARS病毒多核苷酸序列编码的第一氨基酸序列。编码所述第一氨基酸序列的SARS病毒多核苷酸序列包括本说明书中鉴定的一种或多种SARS病毒多核苷酸序列及其片段。
所述融合蛋白可包含SARS病毒蛋白质的氨基酸序列或其片段。所述SARS病毒蛋白选自以下SARS病毒蛋白中的一种或多种：P28、P65、Nsp1、Nsp2(3CL蛋白酶)、Nsp3、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp8s Nsp9(RNA聚合酶)、Nsp10(解螺旋酶)、Nsp11、Nsp12、Nsp13、刺突蛋白、Orf3、Orf4、包膜蛋白、基质蛋白、Orf7、Orf8、Orf9、Orf10、Orf11、核衣壳蛋白和Orf13。
一实施方案中，所述融合蛋白包括含有SARS病毒抗原或其片段的第一氨基酸序列。所述SARS病毒氨基酸序列可含有一个或多个上面鉴定的T-表位序列。
优选所述融合蛋白包含SARS病毒刺突蛋白的氨基酸序列或其片段。可用于融合蛋白的刺突蛋白特异性片段包括S1结构域和S2结构域。可用于融合蛋白的其它刺突蛋白片段包括S1和S2结构域的各个区域，包括S1结构域的受体结合区、S2结构域的寡聚化区域、S2结构域的亮氨酸拉链区、S2结构域的膜锚定区域、S2结构域的疏水结构域区域、S2结构域富含半胱氨酸的区域以及S2结构域的胞质尾区域(参见图19)。与这些区域相对应的刺突蛋白的氨基酸序列可由精通此领域的技术人员鉴定，包括例如使用本申请中早先提出的功能预测(预测的跨膜螺旋、预测的N-末端信号区、预测的卷曲螺旋区域等)以及与其它已知杆状病毒的序列进行同源性比较(参见图4F和5)。
所述融合蛋白还可包含第二氨基酸序列。所述第二氨基酸序列可包含有助于S蛋白表达或纯化的多肽序列，优选这种标记序列之一已在上文讨论。或者，所述第二氨基酸序列可包含SARS病毒的第二氨基酸序列。或者，所述第二氨基酸序列可包含其它病毒或细菌(包括一种或多种在下面的I部分鉴定的病毒或细菌)的氨基酸序列。
所述第二氨基酸序列可包含其它呼吸道病毒的氨基酸序列。所述第二氨基酸序列可螯合选自下组的病毒的氨基酸序列：冠状病毒、流感病毒、鼻病毒、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒和超级肺病毒。
一实施方案中，所述第二氨基酸序列可包含佐剂的氨基酸序列，所述佐剂包括一种或多种在下面的I部分鉴定的佐剂。
一实施方案中，本发明包括融合蛋白包括SARS病毒刺突蛋白的氨基酸序列或其片段。所述融合蛋白还可包含第二氨基酸序列和佐剂，所述第二氨基酸序列含有选自第二SARS病毒蛋白、非SARS病毒蛋白、细菌蛋白质的氨基酸序列。
(a)SARS亚单位疫苗的细菌表达
一实施方案中，细菌宿主细胞被用来重组表达SARS病毒蛋白。适用于本发明的细菌宿主细胞包括，例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属。
SARS病毒蛋白可被修饰以有利于细菌重组表达。具体地说，SARS刺突蛋白可被修饰以有利于刺突蛋白转运到细菌宿主细胞表面。
申请人已经揭示了SARS病毒刺突蛋白和脑膜炎奈瑟氏球菌NadA蛋白之间有强烈的结构同源性。这两种蛋白质都具有N-末端球形“头”结构域(氨基酸24-87)、非常倾向于形成卷曲螺旋结构的中间的α螺旋区域(氨基酸88-350)以及由4个两性跨膜β链形成的C-末端膜锚定结构域(NadA的氨基酸351-405)。此外，卷曲螺旋区段中存在一亮氨酸拉链基序。参见图19，其中示出了SARS刺突蛋白的结构，Comanducci等，“NadA—脑膜炎奈瑟氏球菌新的疫苗候选物”(NadA，a Novel Vaccine Candidateof Neisseria meningitidis)，J.Exp.Med.195(11)：1445-1454(2002)。此外，NadA的亮氨酸拉链基序存在于卷曲螺旋区段内。NadA蛋白也形成高分子量的锚定在脑膜炎球菌外膜的暴露于表面的寡聚物(相应于三个或四个单体)。
当NadA在大肠杆菌中表达时，全长蛋白质装配或锚定于大肠杆菌外膜的寡聚物，这与脑膜炎球菌中存在的蛋白质的装配途径类似。缺乏预测的膜锚定结构域的NadA蛋白质然后被分泌到培养物上清中。这种分泌的蛋白质是可溶的，并仍旧组织成三聚体形式。
因此，本发明包括一种融合蛋白，其中包含SARS病毒刺突蛋白的氨基酸序列或其片段以及细菌黏着蛋白的第二氨基酸序列或其片段的融合。优选所述黏着蛋白选自NadA、YadA(来自肠道病原性耶尔森氏菌属)和UspA2(来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis))。其它NadA样蛋白包括杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)的血清耐性蛋白DsrA、大肠杆菌的免疫球蛋白结合蛋白EibA、C、D和F、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)的外膜蛋白100、大肠杆菌志贺产毒菌株的大毒力质粒携带的saa基因(STEC)、以及英国专利申请No.0315022.4(2003年6月26日提交，其内容纳入本文作为参考)中所述的各种细菌黏着蛋白。
优选所述黏着蛋白包括NadA或其片段。
这种融合蛋白可用来促进SARS表面抗原免疫原性部分，如刺突的重组表达。这些融合构建物可使SARS S1和/或S2结构域采取天然构象。这些融合蛋白也能够寡聚化形成二聚体或三聚体，使S1和/或S2结构域相结合，采取天然SARS刺突蛋白的构象。此外，这些表达构建物有助于SARS刺突蛋白暴露于表面。
本发明的融合蛋白优选含有NadA样蛋白优选NadA的前导肽、刺突蛋白免疫原性“头”区域的多肽以及NadA样蛋白或刺突蛋白的柄区域。在表达和加工融合蛋白时，可切除或除去，如前导肽或膜锚定结构域的一个或多个氨基酸。
柄区域有助于表达蛋白的寡聚化。任选地，本发明的融合蛋白还可包含NadA样蛋白的锚区域。这种锚区域使得表达的融合蛋白锚定并装配到细菌细胞表面。
本发明的融合蛋白含有以下构建物：
(i)NadA前导肽(还可任选含有成熟NadA蛋白的前6个氨基酸以有利于前导肽的加工和蛋白质的适当成熟)，之后是刺突S1结构域。优选该构建物含有NadA的氨基酸1-29(与NadA前导肽和成熟NadA蛋白的前6个氨基酸相对应，如图22所示并在下文中列出)，其后是SARS病毒刺突蛋白的氨基酸14-662(与S1结构域相对应，见图19和SEQ ID NO：6042，并在下面列出)。具体地说，构建物(i)包含SEQ ID NO：7302。
(ii)NadA前导肽(还可任选含有成熟NadA蛋白的前6个氨基酸以有利于前导肽的加工和蛋白质的适当成熟)，之后是刺突S1结构域，之后是NadA的柄和锚膜结构域。优选该构建物含有NadA的氨基酸1-29(与NadA前导肽和成熟NadA蛋白的前6个氨基酸相对应，如图22所示并在下文中列出)，其后是SARS病毒刺突蛋白的氨基酸14-662(与S1结构域相对应，见图19和SEQ ID NO：6042，并在下面列出)，之后是NadA的氨基酸88-405(与柄和锚膜结构域相对应)。具体地说，构建物(ii)包含SEQ ID NO：7303。
(iii)NadA前导肽(还可任选含有成熟NadA蛋白的前6个氨基酸)，之后是SARS病毒刺突蛋白S1结构域，之后是NadA柄结构域。优选该构建物含有NadA的氨基酸1-29，其后是SARS病毒刺突蛋白的氨基酸14-662(与S1结构域相对应)，之后是NadA的氨基酸88-350(与柄和锚膜结构域相对应)。具体地说，构建物(iii)包含SEQ IDNO：7304。
(iv)NadA前导肽(还可任选含有成熟NadA蛋白的前6个氨基酸)，之后是SARS病毒刺突S1和S2结构域(不包括假定的跨膜区)，之后是NadA的锚结构域。优选该构建物含有NadA的氨基酸1-29，其后是SARS病毒刺突蛋白的氨基酸14-1195(相应于S1和S2，不包括假定的跨膜区)，之后是NadA的氨基酸351-405(相应于NadA锚结构域)。具体地说，构建物(iii)包含SEQ ID NO：7305。或者，NadA锚结构域可包含NadA的氨基酸332-405。
(v)NadA前导肽(还可任选含有成熟NadA蛋白的前6个氨基酸)，之后是SARS病毒刺突S1和S2结构域(不包括假定的跨膜区)。优选该构建物含有NadA的氨基酸1-29，其后是SARS病毒刺突蛋白的氨基酸14-1195。具体地说，构建物(v)包含SEQID NO：7306。
在构建物(i)-(v)的每一个中，前23个氨基酸是NadA前导肽的，残基679-680中的GS二肽是从限制性内切酶位点插入的。
在构建物(i)、(ii)和(iii)中，NadA“头”被刺突S1结构域替代，该融合蛋白被分别锚定到大肠杆菌外膜上或分泌到培养物上清中。在构建物(iv)和(v)中，NadA的“头”和“柄”结构域被S1和S2刺突结构域替代；此时，这两个融合蛋白被分别锚定到大肠杆菌外膜上或分泌到培养物上清中。
因此，本发明还包括含有SARS病毒刺突蛋白氨基酸序列或其片段以及细菌黏着蛋白第二氨基酸序列或其片段融合蛋白。优选与粘着蛋白的“头”相对应的氨基酸被对应于SARS病毒刺突S1结构域的氨基酸替代。或者，与细菌粘着蛋白的“头”和“柄”结构域相对应的氨基酸被对应于SARS病毒刺突蛋白S1和S2结构域的氨基酸替代。
如上所述以及图19所示，刺突蛋白的S1结构域被鉴定为球形受体结合“头”区域。刺突蛋白的S1结构域宜包含SEQ ID NO：6042约14-662位的氨基酸。S1结构域可包含从N-末端或C-末端区域除去了一些氨基酸的较短的氨基酸序列。优选有3、5、7、9、13、15、20或25个氨基酸被从N-末端或C-末端区域除去。S1结构域还包含与SEQ ID NO：6042的S1区域具有序列相同性的氨基酸序列。S1结构域的一个例子是SEQ ID NO：7307。
如上所述和图19所示，刺突蛋白的S2结构域被鉴定为“柄”区域。该“柄”区域包含寡聚化结构域区域、亮氨酸拉链结构域区域、膜锚定区域、疏水结构域区域、富含半胱氨酸的结构域区域和胞质尾区域。刺突蛋白的S2结构域宜不包含跨膜区，并包含SEQ ID NO：6042约663-1195位的氨基酸。S2结构域可包含从N-末端或C-末端区域除去了一些氨基酸的较短的氨基酸序列。优选有3、5、7、9、13、15、20或25个氨基酸被从N-末端或C-末端区域除去。S2结构域还包含与SEQ ID NO：6042的S2区域具有序列相同性的氨基酸序列。S2结构域(不包括跨膜区)的一个例子是SEQ ID NO：7308。
上述NadA蛋白的一个例子是SEQ ID NO：7309。如上所述，用于融合蛋白的NadA的前导序列宜包含NadA前29个氨基酸(包括前导序列和NadA头蛋白的约6个氨基酸)。这种前导序列的例子列在下面的SEQ ID NOS：7310和7311中。融合蛋白可使用含有从N-末端或C-末端区域除去了一些氨基酸的较短的氨基酸序列。优选有1、2、3、4或5个氨基酸被从该序列的N-末端或C-末端区域除去。用于融合蛋白的前导序列还可包含与SEQ ID NO：7310或SEQ ID NO：7311具有序列相同性的氨基酸序列。优选所述前导序列包含SEQ ID NO：7311。
任选地，该融合肽包含成熟NadA蛋白约前6个氨基酸，以利于前导肽的加工和蛋白质的适当成熟。成熟NadA蛋白前6个氨基酸的一个例子是SEQ ID NO：7312。
如上所述，用于融合蛋白的NadA的柄和锚序列宜包含NadA约88-405位的氨基酸。包含NadA柄和锚区域的氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：7313。含有NadA柄区域(不含锚区域)的氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：7314。含有NadA锚区域的氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：7315。使用柄(和/或锚)序列的融合蛋白包含从N-末端或C-末端区域除去了一些氨基酸的较短的氨基酸序列。优选有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸被从该序列的N-末端或C-末端区域除去。用于融合蛋白的前导序列还可包含与7313具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白(包括上述那些)可按照，例如，以下方法制备。可用下表列出的寡核苷酸引物通过PCR扩增单个片段(如上述区域)。(S1L表示与NadA的前导肽融合的刺突蛋白；S2表示含或不含终止密码子的刺突蛋白的柄区域)。根据脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitides)B 2996菌株NadA的DNA序列以及SARS病毒分离物FRA1刺突的DNA序列设计了寡核苷酸。每种寡核苷酸包含一限制性位点作为尾以将克隆引导入表达载体pET21b中。
                SEQ ID NO：限制性位点
S1L        For        7316        NdeI
S1L        Rev        7317        BamHI
S2             For    7318            BamHI
S2             Rev    7319            HindIII
S2-终点        Rev    7320            XhoI
NadA88        For    7321            BamHI
NadA350       Rev    7322            XhoI
NadA332       For    7323            HindIII
NadA405       Rev    7324            XhoI
将单个片段依次克隆入pET21b载体，在可诱导的T7启动子控制下表达蛋白质。使用引物S1L-For和S1L-Rev通过PCR获得了融合到NadA前导肽的刺突蛋白的S1结构域(S1L)。正向寡核苷酸引物含有NdeI限制性序列和编码NadA前导肽的序列以及成熟蛋白质的前6个氨基酸。将PCR片段克隆成用相同的限制性酶打开的pET21b载体中的NdeI/BamHI片段。然后用该克隆(pET-S1L)来依次克隆其它不同结构域，如BamHI/XhoI、BamHI/HindIII或HindIII/XhoI片段。BamHI和HindIII限制位点可分别引入氨基酸GS和KL。
PCR扩增方案如下：将200ng来自脑膜炎奈瑟氏球菌2996的基因组DNA或10ng质粒DNA制品(质粒pCMVnew，含有完整的编码刺突蛋白的基因)用作模板，扩增反应中寡核苷酸引物40μM，采用400-800μM dNTPs溶液，1x PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2)，2.5单位TaqIDNA聚合酶(使用Perkin-Elmer AmpliTaQ或Invitrogen Platinum PfxDNA聚合酶)。
将全部混合物在95℃预先培育3分钟后，将每份样品进行两步的扩增：用排除引物限制酶尾的杂交温度(Tm1)进行前5轮。然后，根据全长寡核苷酸计算的杂交温度(Tm2)进行30轮。在68℃或72℃进行的延伸的时间根据要扩增的片段的长度各不相同。循环在68℃或72℃的10分钟延伸步骤中完成。
扩增的DNA直接加样到琼脂糖凝胶上，并按制造商说明，用QiagenTM GelExtraction Kit从凝胶纯化相应于正确大小条带的DNA片段。
用合适的限制性酶消化与扩增片段相对应的纯化的DNA和质粒载体，用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(按照制造商的说明)进行纯化并进行连接反应。
将连接产物转化入感受态大肠杆菌DH5α，并通过使随机选择的克隆生长并按制造商的说明用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取质粒DNA来筛选重组克隆。
将重组质粒引入用作表达宿主的大肠杆菌BL21(DE3)。将单重组集落接种入LB+氨苄青霉素中，在37℃培育14-16小时。细菌可通过离心(非诱导条件)直接回收，或将其稀释到新鲜的培养基并在37℃培育，直到OD600在0.4-0.80之间。加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达3小时(诱导条件)。
将细菌重悬于SDS-样品缓冲液1X并煮沸5-10分钟获得全细胞裂解产物。按照制造商的说明用NuPAGE(Invitrogen)或BIORAD凝胶系统分离等量蛋白质。蛋白质通过考马斯蓝染色显现或转移到硝酸纤维素膜进行western印迹分析来显现。Wester印迹用抗纯化的NadA351-405的兔多克隆抗血清(1∶3000稀释)和过氧化物酶-偶联的第二抗体(DAKO)进行。
图38和39显示了S1L、S1L-NadA和S1L-NadAΔ锚在大肠杆菌中表达的结果。图37显示了融合构建物。
细菌表达的SARS病毒抗原也可用来制备含有外膜囊泡的组合物，其中所述外膜囊泡包含一种或多种SARS病毒抗原。
外膜囊泡(“OMV”)也称为泡，是指由革兰氏阴性菌的外膜片段形成或由其衍生出来的囊泡。OMV通常包含外膜蛋白(OMP)、脂质、磷脂、周质物质和脂多糖(LPS)。在称之为泡化的处理中，革兰氏阴性菌在被烈性感染时通常形成OMV。也可通过一些化学变性过程，如去污剂提取，从革兰氏阴性菌获得OMV。也可用本发明的SARS病毒抗原来制备脂双层包裹着一个含水核心的合成的OMV或脂质体。
本发明的OMV宜为含有脂双层围绕的含水核心的脂质小泡。该脂质小泡通常有单层结构(即一个脂双层围绕的含水核心)，尽管多层脂质小泡也可用于本发明的组合物。OMV的大小通常在纳摩尔至微摩尔范围，例如从约1nM至100μM，更通常从约10nM至10μM，优选从30nM至1μM。
本发明的OMV宜从革兰氏阴性菌制备。革兰氏阴性菌是那些在熟知的革兰氏染色法中不能抵抗脱色处理的细菌。革兰氏阴性菌以复杂的多边细胞壁为特征，并通常具有外层多糖荚膜。适合用来制造OMV的革兰氏阴性菌包括，例如，奈瑟菌属、莫拉菌属、金氏菌属、不动杆菌属、布鲁菌属、博德特菌属、衣原体属、真菌属、放线杆菌属、疏螺旋体属(Borelia)、沙雷氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、嗜血菌属、埃希氏菌属、军团菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和耶尔森氏菌属。
本发明的OMV宜含有一种或多种SARS病毒抗原或其片段。SARS病毒抗原可在革兰氏阴性菌宿主细胞中重组表达，然后和OMV一起收获。
抗原性组分，如重组表达的SARS病毒抗原，可位于脂质小泡三个主要区室中的任何一个或所有区室内，这些区室包括通过例如膜锚定结构域附于脂质小泡内表面或外表面的区室；插入脂双层的区室，例如其中所述抗原性组分自身是疏水性或基于脂质的实体；或位于脂质小泡含水中心或核心的区室。
合成制备的OMV或脂质体可用于本发明。这种脂质体包含许多不同的脂质或脂肪酸。适合含在本发明脂质体内的脂质包括但不限于磷脂酰肌醇-(4，5)-二磷酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、胆固醇、β-油酰-γ-棕榈酰、脂多糖和半乳糖脑苷脂(galactocerbroside)。
从细菌原料提取OMV的合适方法包括脱氧胆酸盐提取、Tris/HCl/EDTA提取和醋酸锂提取。优选所述提取过程包括用物理和/或化学方法来破坏细菌细胞外膜以使OMV充分释放以进行纯化和分离。参见例如，WO 03/051379。
可通过本领域已知的方法将本发明的OMV富集和/或在其中添加抗原性组分，如SARS病毒抗原，这些方法包括，例如，直接在体外混合，其中可任选进行高能混合以便于抗原性组分整合入脂质体的一个区室。适用于本发明的高能混合法包括匀化、超速破碎、挤压以及它们的组合。
优选抗原性组分，如SARS病毒抗原，是用获得OMV的宿主细胞重组制造的。一实施方案中，这种OMV是通过将编码SARS病毒抗原的核酸序列引入重组宿主细胞来制造的。优选编码SARS病毒抗原的核酸序列受强启动子序列控制。优选编码SARS病毒抗原的核酸序列还包含外膜定向信号。例如，编码SARS病毒抗原的核酸序列可融合到编码细菌宿主天然产生的外膜蛋白的序列。优选编码SARS病毒抗原的核酸序列被融合到细菌宿主天然产生的外膜蛋白的信号肽序列上。
制造用于疫苗的最佳OMV的方法描述在，例如，Filip等，J.Bact.(1973)115：717-722；Davies等，J.Immunol.Method(1990)143：215-225；和WO 01/09350。
一实施方案中，细菌宿主细胞，如大肠杆菌，被转化以表达SARS刺突蛋白。如上所述，刺突蛋白可被修饰以利于细菌表达和将刺突蛋白转运到宿主细胞表面。上述各种刺突/NadA融合构建物可用于制备本发明的OMV。优选含有融合到NadA柄区域的刺突S1球形头结构域的构建物被用来产生OMV。这种构建物可任选含有NadA前导肽以及NadA锚定肽。这些优选的OMV构建物的结构示意图示于图49。
实施例6描述了制备本发明OMV的一种方法。
(b)SARS亚单位疫苗的哺乳动物表达
如上所述，哺乳动物宿主细胞被用来重组表达SARS病毒蛋白。适用于本发明的哺乳动物宿主细胞包括，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞、猴肾细胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞以及其它细胞。细胞的哺乳动物来源包括，但不限于，人类或非人灵长类细胞(例如，MRC-5(ATCCCCL-171)，WI-38(ATCC CCL-75)，人胚胎肾细胞(293细胞，通常被剪切的腺病毒型5DNA转化)，猴肾Vero细胞(包括COS7细胞)，马、牛(如MDBK细胞)、羊、狗(例如狗肾MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016(如WO 97/37001所述保藏编号为DSM ACC 2219)、猫和鼠(例如仓鼠细胞，如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自各个发育阶段，包括例如成人、新生儿、胎儿或胚胎。
编码SARS病毒蛋白的多核苷酸可被修饰以利于或增强表达。例如，此领域已知市售的前导序列，如tPA或IgK或白细胞介素-2，可用于重组构建物。然而，优选使用天然SARS前导序列。使用天然前导序列能够确保蛋白质将以与正常病毒感染相同的途径进入人类细胞，这对于例如原位表达抗原的DNA疫苗是有利的。
如上所述，可将标记序列用于表达构建物以便于纯化、检测和稳定表达的蛋白质。适用于本发明的标记蛋白包括聚精氨酸标记(Arg-tag)、聚组氨酸标记(His-tag)、FLAG-tag、Strep-tag、c-myc-tag、S-tag、钙调蛋白结合肽、纤维素结合域、SBP-tag、壳多糖结合域、谷胱甘肽S转移酶标记(GST)、麦芽糖结合蛋白、转录终止抗终止因子(transcription termination anti-terminiantion factor)(NusA)、大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)和蛋白质二硫键异构酶I(DsbA)。优选的标记蛋白包括His-tag和GST。关于标记蛋白质的详细讨论可参见Terpe等，“标记蛋白融合综述：从分子和生化基础到商业体系”，Appl Microbiol Biotechnol(2003)60：523-533。
纯化之后，标记蛋白可任选从表达的融合蛋白中除去，即通过此领域已知的特异性剪切酶处理。通常使用的蛋白质包括肠激酶、烟草蚀纹病毒(TEV)、凝血酶和Xa因子。
刺突蛋白的一个或多个氨基酸序列或氨基酸结构域可被除去以便于哺乳动物重组表达。例如，整个S2结构域或刺突跨膜区可被除去。适合哺乳动物表达的全长或截短的刺突糖蛋白的一些表达构建物的代表性例子见图40。代表每个构建物的多核苷酸序列见SEQ ID NOS 6578-6583。每个符号的含义如下：
克隆名称            描述                    表达构建物
nShA                天然前导序列            SEQ ID NO：6578
                    全长刺突
                    组氨酸标记
nS                  天然前导序列            SEQ ID NO：6579
                    全长刺突
nShΔTC             天然前导序列            SEQ ID NO：6580
                    无跨膜序列的刺突
                    组氨酸标记
nShΔTC           天然前导序列            SEQ ID NO：6581
                  无跨膜序列的刺突
nS1h              天然前导序列            SEQ ID NO：6582
                  S1结构域
                  组氨酸标记
nS1               天然前导序列            SEQ ID NO：6583
                  S1结构域
将包含全长刺突编码序列以及删除跨膜结构域和胞质结构域的刺突构建物(TM-Cy-删除刺突)的克隆的cDNA片段插入表达载体pCMVIII中分别形成分泌性nSh和nShΔTC。这两种刺突蛋白都在C-末端含有六个组氨酸标记以帮助初步定性表达的刺突蛋白。类似的编码全长刺突或删除跨膜结构域和胞质结构域的刺突、但不含组氨酸“标记”的序列是精通此领域的技术人员容易替代的。
用图48所示的方法将表达的蛋白质分离成含水部分(AF)和去污剂部分(DF)来评估所表达的刺突构建物的可能定位，图43显示了western印迹分析的结果。将上述载体构建物转染入COS7细胞后评价了它们的表达。表达全长刺突蛋白的构建物保留在细胞膜，而表达截短的刺突蛋白的构建物则位于胞质溶胶(图43)或被分泌到细胞培养基中(图44)。如图43所示，发现全长刺突蛋白以凝聚形式出现在DF(膜)，而截短的蛋白质以单体形式出现在AF(胞质溶胶)。如图44所示，删除的蛋白质(ShΔTC)被分泌，并用兔血清在培养基中检测到了全长刺突蛋白的一个小组分。
重组表达的刺突蛋白可以寡聚。当刺突蛋白被用于疫苗或产生对刺突蛋白特异性抗体时，它们优选是寡聚的。为获得寡聚的刺突蛋白，优选将跨膜结构域保留在重组表达构建物中。例如，图41比较了使用抗-his tag和兔抗-SARS抗体得到的COS7细胞裂解物与表达的nSh和nShΔTC的Western印迹结果。如图所示，全长(nSh)形成了凝聚，而截短的(nShATC)刺突蛋白则不会。抗His-标记的蛋白质的抗体鉴定天然形式和还原形式的全长和截短的刺突蛋白。兔抗血清仅在非还原条件下鉴定刺突蛋白。刺突凝聚体或寡聚物大量出现在表达的nSh构建物的细胞裂解物中。优选所述寡聚的刺突蛋白形成同型三聚体，如图47所示。
另一个试验，如图42所示，证明表达的nSh构建物的寡聚化可能是由于非共价连接(而不是由于，例如，二硫键)。这种寡聚物在升高的温度(80-100℃)下离解成单体，但如果不加热的话在还原条件下是稳定的。
重组表达的刺突蛋白还优选被糖基化。可用衣霉素和糖苷酶来评估糖基化。图45说明，表达的刺突蛋白的糖基化不会受除去跨膜结构域区域的影响。全长(Sh)和截短的(ShΔTC)SARS刺突蛋白都被糖基化。
优选表达本发明的构建物对哺乳动物宿主细胞无毒性。图46证明，表达所示刺突构建物对COS7宿主细胞无毒性。
转染、表达、培养、分离和纯化哺乳动物细胞培养物中重组蛋白的方法是本领域已知的。例如，本发明的SARS刺突构建物可在293细胞中表达。这些细胞可在静置培养物或单层培养物中培养和转染。为快速大规模制造足量的SARS蛋白抗原以进行体外或体内评价，包括免疫原性研究，可大规模短暂转染293(人胚肾)细胞以获得毫克数量级的重组抗原。或者，可在悬浮培养物中大规模转染293细胞。优选表达的SARS蛋白是在转染后48-72小时或者甚至转染后72-96小时或更多时间从转染的细胞收获的。
当用截短的刺突表达构建物转染宿主细胞时，表达的刺突蛋白被宿主细胞分泌并从细胞培养基收集。浓缩之后可采用例如GNA凝集素然后通过DEAE和陶瓷羟基磷灰石柱层析从培养基纯化刺突蛋白。
当用全长刺突表达构建物转染宿主细胞时，表达的刺突蛋白仍然保留在细胞内，可从用triton X-100去污剂提取的细胞纯化。然后可用GNA凝集素捕获全长刺突蛋白，再通过羟基磷灰石和SP层析纯化。
也可产生稳定表达本发明SARS病毒抗原的中国仓鼠卵巢(CHO)或其它真核(例如，哺乳动物)细胞(例如图73)。优选所述细胞是CHO细胞，这些构建物将含有一种或多种标记物或选择基因以选择所需CHO细胞。一实施方案中，出于筛选目的，所述构建物包含CMV增强子/启动子、氨苄青霉素抗性基因和融合的DHFR以及减毒新霉素基因。然后可用新霉素选择系统在CHOK-1细胞中产生稳定的细胞系。筛选的克隆然后可被测序以验证鉴定插入物的完整性，然后可用Trans-LT1聚胺转染试剂(PanVeraCorp.，Madison，WI)进行短暂转染以评价表达水平，并通过ELISA和western印迹分析评价表达蛋白质的完整性。
衍生稳定表达本发明SARS病毒抗原的CHO细胞的方法包括转染步骤和用选择性培养基初步筛选的步骤。任选地，这些步骤之后可进行亚克隆以确保细胞系的纯度。可用抗原捕获ELISA测定细胞培养物上清以定量选择和扩增所有阶段的表达水平。
对于全长刺突表达构建物而言，可用兔抗SARS抗体进行免疫荧光染色筛检甲醇固定细胞的胞内表达。在T75烧瓶扩增阶段进行连续测量以确保表达水平的稳定性。可通过PAGE(天然条件和还原变性条件)然后通过免疫探测来核查表达蛋白质的分子量和完整性。
一实施方案中，用Trans-LT-1试剂将表达全长或截短形式SARS-CoV刺突蛋白的pCMV3载体引入CHOK-1细胞。第1天，将1×106细胞接种在100mm平皿上，平皿中含有非选择性F12培养基+10％胎牛血清+4mM谷氨酰胺。第2天，用DNA：LT-1混合物转染细胞，并用完全F12培养基代替原来的培养基。根据细胞密度，在24-48小时后，将每个100mm平皿分成4-6个100mm平皿。将培养基换成含有500μg/ml遗传霉素(新霉素)的完全选择性培养基。所有用于这些方法的牛血清都无TSE来源，符合FDA的现行标准。24小时后将培养基换成添加500μg/ml新霉素的完全选择性培养基。10-14天后，挑选单个菌落，将其转移到96孔板并在不含G418的完全选择性培养基中培养。当大约80％的孔被铺满时，将刺突捕获ELISA阳性克隆选择的24小时上清液被转移到24孔板。为启动表达全长刺突蛋白，用兔抗-SARS抗体作免疫荧光染色筛检甲醇固定的细胞。剔除低表达细胞系后还有不到20-30个细胞系，细胞裂解后用捕获ELISA和western测定表达水平。沉淀各细胞系的一部分、称重，以细胞与裂解缓冲液相同重量比例的1％triton裂解缓冲液(含有MOPS、NaCl和MgCl2)裂解。裂解后收集上清测定表达水平。将3-4个以最高水平产生结构和构象正确的刺突蛋白的克隆在3升的生物反应器中培养扩增和适应低血清悬浮培养条件，以扩大规模。
可按此领域的描述对SARS刺突蛋白进行抗原捕获ELISA测定。对这种测定方法的简述如下。在96孔平底平板(Corning，Corning，NY)的每个孔中涂布250ng纯化的获自用灭活SARS病毒免疫的兔血清的免疫球蛋白。然后用含有16％NaCl和1％Triton X100的缓冲液洗涤平板。加入100μL上清或裂解物样品(稀释在含有100mMNaPO4、0.1％酪蛋白、1mM EDTA、1％Triton X100、0.5M NaCl和0.01％硫柳汞，pH 7.5的缓冲液中)并在37℃培育2小时。结合的抗原与收集的SARS+ve血清或高亲和性人或鼠抗SARS刺突蛋白单克隆抗体反应(37℃培育1小时)，并用合适的物种特异性过氧化物酶缀合第二抗体检测(37℃培育30分钟；TAGO，Burlingame，CA)。平板在室温下用TMB(Pierce，Rockford，IL)显色并用4N磷酸终止反应。在450nm阅读平板，根据已知浓度重组刺突蛋白连续稀释液制作的标准曲线(OD对蛋白质浓度)产生每毫升样品中蛋白质的浓度。
在本领域已经描述的标准方法之后也可进行免疫探测分析。简述如下。在非还原/变性条件下温和加热的4-20％SDS PAGE上分析10-20μl样品。在100V恒压下跑1.5-2.0小时凝胶。然后按照制造商的说明，使用半干western转移系统(BioRad，Hercules，CA)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Millipore，Bedford，MA)，历时45分钟。使膜与多克隆兔抗刺突血清反应，再与缀合于Alexa 688的抗-兔Ig(MolecularProbes，Oregon)反应。用红外线成像系统(LI-Cor，Inc.，Lincoln，Nebraska)扫描印迹。
筛选出刺突蛋白表达最高和在小规模(3升)悬浮培养物中稳定性最高的候选细胞系。扩增后进一步评价该候选克隆的表达水平和表达蛋白质的完整性，并随后检测无选择物时的表达稳定性。还可以监测所选克隆维持完整SARS刺突蛋白基因DNA序列完整性的能力。为快速监控小烧瓶(T25或T75)和3升评价培养物中的表达水平，可用基于凝集素的方法(Gluvanthus Nivalis凝集素)将SARS刺突蛋白分离成能对CHO上清中的蛋白质进行半定量和定性的纯度。对全长刺突蛋白而言，可从tritonX-100去污剂提取的细胞获得。全长刺突蛋白然后被捕获到GNA凝集素上，然后进行羟基磷灰石和SP层析。通过以下方法定性洗脱的蛋白质：1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和考马斯染色，2)用兔抗-SARS血清免疫探测，3)用尺寸排阻层析(SEC)进行结构分析，并用MALDI-TOF进行质谱分析。
用本发明的疫苗进行免疫的途径和方法将在以下部分详细叙述。实施例7-9例举了重组刺突蛋白免疫接种的方案。
疫苗测试
用于人体之前，通常需要在动物模型中测试疫苗。已知SARS冠状病毒感染的小鼠模型(Subbarao等(2004)J Virol 78：3572-77)，可用作感染和/或疾病模型的其它动物包括雪貂和猴子。因此，本发明提供了SARS冠状病毒感染的非人动物，其中，所述动物优选雪貂或灵长类动物(例如猴子或猕猴)。动物可以是无菌动物。优选动物不是猫(Felis domesticus)。该动物可以显示或不显示SARS疾病症状，如雪貂(Mustela furo)在感染后显示出明显的肺部病理学。参见：Martina等(2003)Nature425：915。
E.编码本发明SARS抗原的多核苷酸
本发明包括编码本发明SARS抗原的多核苷酸。此外，本发明包括最优化(如通过密码子最优化)重组制造SARS抗原的多核苷酸，包括编码上述各个SARS融合构建物的多核苷酸。
F.输送本发明SARS抗原的病毒载体或病毒颗粒
本发明的抗原可由编码抗原的多核苷酸在体内或体外表达。通过病毒载体和/或病毒颗粒有助于本发明多核苷酸的表达和输送。
可用病毒(如α病毒)产生的基因输送系统体外和体内给予异源基因，包括一种或多种具有治疗或预防用途的SRAS基因。也可用这些系统在培养的细胞中制造源自SARS病毒重组蛋白。本发明所述的基于基因的输送系统包括病毒载体(例如，腺病毒载体、痘病毒载体、α病毒载体)和编码一个或多个SARS病毒抗原的非病毒核酸载体(例如，DNA、RNA)。编码SARS病毒抗原的多核苷酸被单独或组合(例如作为双顺反子构建物)掺入到该基因疫苗中。
1.α病毒
α病毒是披膜病毒科的成员具有共同的结构和复制特性。辛德比斯病毒(SIN)是对其它α病毒进行分子研究的原型病毒，与委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)和Semliki森林病毒(SFV)一起是最广泛采用的能产生异源基因表达载体的α病毒(Schlesinger和Dubensky(1999)Curr Opin.Biotechnol.10：434-439；Schlesinger(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1：177-91)。
α病毒具有相对较小的正向极性单链RNA基因组，其长度约为12kb，被加帽并被聚腺苷化。RNA与病毒衣壳蛋白单体相互作用形成核衣壳，然后核衣壳又被宿主细胞衍生的脂质包膜围绕，两个病毒糖蛋白E1和E2便会从其中凸出形成异质性二聚体亚单位的“刺突”三聚体。有两个开放读框(ORF)编码的多蛋白，是具有酶活性的非结构性复制酶蛋白质(5’ORF)和病毒颗粒结构性蛋白质(3’ORF)。结构性多蛋白从高度丰富的亚基因组mRNA翻译，所述亚基因组mRNA是从内部α病毒强效启动子转录的(Strauss和Strauss(1994)Microbiol.Rev.58：491-562)。该基因组的复制像RNA一样仅在宿主细胞的胞质内发生。
最常用的α病毒表达载体利用RNA基因组的正链特性和模块结构。由于这些载体具有自发扩增的特性而被称为“复制子”，它们允许异源序列插入替代该结构性多蛋白基因，同时保留5’-和3’-末端顺式复制信号、非结构性复制酶基因和亚基因组结合区启动子(Xiong等，(1989)Science 243：1188-1191；Liljestrom(1991)Bio/Technology 9：1356-1361)。趋异性病毒家族序列衍生的嵌合性α病毒载体(和颗粒)也已经被描述。(参见，例如，美国专利申请系列号09/236,140；也可参见美国专利5,789,245、5,842,723、5,789,245,5,842,723和6,015,694；以及WO95/07994、WO 97/38087和WO 99/18226)。2002年12月12日提交并被全文纳入本文作为参考是共有国际出版物WO 02/099035描述了嵌合α病毒分子和具有改进的生物安全性水平的改进的α病毒分子。
缺乏结构蛋白基因使α病毒复制子载体缺陷，从而RNA扩增和高水平异源基因的表达发生在靶细胞内，但由于无法形成后代病毒颗粒从而不可能发生该载体的细胞-细胞的传播。近年来，出现了一些用来描述α病毒复制子颗粒的含义相同的术语。这些术语包括重组病毒颗粒、重组α病毒颗粒、α病毒复制子颗粒和复制子颗粒。然而，这些术语在这里都表示含有α病毒衍生的RNA载体复制子的病毒颗粒样单位。此外，这些术语可表示载体、载体构建物或基因输送载体。
通过将复制子RNA引入允许的细胞(例如，RNA或DNA转染，或颗粒转染)可将复制子RNA包装入颗粒，所述允许的细胞中含有一种或多种编码α病毒结构蛋白的结构蛋白表达盒或“缺陷辅助者”构建物。这些编码构建物的结构蛋白自身可通过转染RNA或DNA被引入细胞，并通常保留天然α病毒亚基因组启动子，以及5’-和3’-末端顺式信号以与复制子共扩增，但缺乏任何复制酶基因和RNA包装信号(Liljestrom(1991)Bio/Technology 9：1356-1361；Pushko等，(1997)Virology239：389-401；Polo等，(1999)PNAS 96：4598-4603)。用表达α病毒结构蛋白的构建物稳定转化的无限增殖细胞系(例如，包装细胞系)提供了一种避免短暂转染进行生产的方法(Polo等，(1999)PNAS 96：4598-4603)。
本发明包括用来制造复制缺陷病毒载体颗粒(例如，α病毒复制子颗粒)的组合物和方法，以用于体外和体内施用编码具有治疗或预防用途的蛋白质的异源基因，包括编码一种或多种SARS病毒抗原的基因。
一方面，本发明包括制造复制缺陷病毒载体颗粒(例如，α病毒复制子颗粒)的方法，该方法包括在能够与病毒载体(例如，α病毒复制子RNA)互补和制造病毒载体颗粒(例如，α病毒复制子颗粒)的条件下将至少一种含有病毒载体(例如，α病毒复制子RNA)的核酸分子引入本发明的无限增殖细胞，并从细胞或细胞培养物上清分离病毒载体颗粒的步骤。一些实施方案中，所述无限中细胞生长在悬液中，例如PERC.6细胞。在其它实施方案中，该方法是在较大体积下进行的，例如以升为单位的体积或更大体积，如在摇瓶中、大烧瓶中、Nunc Cell Factories、Corning Cell Cubes、发酵罐中等)。
一些实施方案中，所述病毒载体是需要在无限增殖细胞内提供一种或多种反式α病毒结构蛋白作补充的α病毒复制子。此时，通过补充产生α病毒复制子颗粒的方法包括在无限增殖细胞内引入一种或多种编码所述α病毒结构蛋白(例如，衣壳和/或包膜糖蛋白)的核酸(例如，RNA、DNA)，这可以是暂时或永久的，并且可以与引入α病毒复制子RNA同时进行或之前进行。一些实施方案中，通过转染体外转录复制子RNA的RNA将α病毒复制子RNA引入细胞。在其它实施方案中，通过转染能够在细胞内转录的DNA(例如，ELVIS)将α病毒复制子RNA引入细胞。再在另一实施方案中，通过用α病毒复制子颗粒种液感染将α病毒复制子RNA引入细胞。一些实施方案中，编码所述病毒结构蛋白的核酸是缺陷辅助性RNA或是能够在细胞内转录缺陷辅助性RNA的DNA。
“α病毒RNA复制子载体”、“RNA复制子载体”、“复制子载体”或“复制子”在这里是指能够在靶细胞内引导其自身扩增或体内自复制的RNA分子。为引导其自身的扩增，这种RNA分子应该编码催化RNA扩增必需的聚合酶(例如，α病毒非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)并同时含有被编码的聚合酶鉴定和利用的复制所需的顺式RNA序列。α病毒RNA载体复制子应含有以下顺序的元件：非结构蛋白介导扩增所需的5’病毒序列或细胞序列(也称为5’CSE，或5’顺式复制序列，或复制所需的顺式5’病毒序列，或能够启动α病毒转录的5’序列)，在表达后编码生物活性α病毒非结构蛋白(例如，nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，以及非结构蛋白扩增所需的3’病毒序列或细胞序列(也称为3’CSE，或复制所需的顺式3’病毒序列，或α病毒RNA聚合酶鉴定序列)。α病毒RNA载体复制子还包含一种组分来表达一种或多种异源序列，比如IRES或病毒(例如，α病毒)亚基因组启动子(例如，结合区启动子)，在一些实施方案中，该启动子可被修饰以增强或降低病毒转录亚基因组片段，或降低与缺陷辅助辅助者或结构蛋白表达盒以及一种或多种待表达异源序列的同源性。所述异源序列优选包含编码蛋白质的基因，它是载体复制子内最接近3’端的基因。所述复制子还包含聚腺苷酸序列。
“重组α病毒颗粒”、“α病毒复制子颗粒”和“复制子颗粒”在这里表示含有α病毒RNA载体复制子的病毒颗粒样单位。通常，所述重组α病毒颗粒包含一种或多种α病毒结构蛋白、脂质包膜和RNA载体复制子。优选所述重组α病毒颗粒包含核衣壳结构，该结构含在宿主细胞衍生的脂双层中，如胞质膜，其中嵌有一个或多个α病毒包膜糖蛋白(例如，E2、E1)。该颗粒还可含有其它组分(例如，靶向元件如生物素、其它病毒结构蛋白或其部分、杂交包膜、或其它受体结合配体)，这些组分能引导衍生的α病毒颗粒的嗜性。通常，有效形成α复制子颗粒或核衣壳所必需的α病毒RNA和结构蛋白之间的相互作用可能是衣壳蛋白与RNA内所含包装信号或包装序列间的RNA-蛋白质相互作用。
“α病毒包装细胞系”是指含有一种或多种α病毒结构蛋白表达盒、并在引入α病毒RNA载体复制子、真核分层载体启动系统或重组α病毒颗粒后制造重组α病毒颗粒的细胞。亲本细胞可以来自哺乳动物或非哺乳动物。在优选的实施方案中，所述包装细胞系是被结构蛋白表达盒稳定转化的。
“缺陷辅助性RNA”是指能够经扩增能在也含有功能性α病毒非结构“复制酶”蛋白的真核细胞中表达一种或多种α病毒结构蛋白的RNA分子。所述α病毒非结构蛋白可通过α病毒RNA复制子载体或其它手段在细胞内表达。为进行扩增和表达结构蛋白(由α病毒非结构蛋白介导)，所述缺陷辅助性RNA分子应含有可被非结构蛋白鉴定和利用的扩增所需的5’-末端和3’-末端RNA序列，以及表达一种或多种α病毒结构蛋白的组分。因此，α病毒缺陷辅助性RNA因含有以下顺序的元件：α病毒非结构蛋白的RNA扩增所需的5’病毒序列或细胞序列(也称为5’CSE，或5’顺式复制序列，或复制所需的顺式5’病毒序列，或能够启动α病毒转录的5’序列)，表达一种或多种α病毒结构蛋白的组分，在表达后编码一种或多种α病毒结构蛋白(例如，C、E2、E1)的基因序列，α病毒非结构蛋白扩增所需的3’病毒序列或细胞序列(也称为3’CSE，或复制所需的顺式3’病毒序列，或α病毒RNA聚合酶鉴定序列)，并优选含有聚腺苷酸序列。通常，所述缺陷辅助性RNA自身不编码或完整表达所有四种α病毒非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)，但可编码或表达这些蛋白质的亚类或其一部分，或含有来自一种或多种非结构蛋白基因的序列，但含在缺陷辅助者内的这些序列不表达非结构蛋白或其部分。作为一种表达α病毒结构蛋白的手段，所述缺陷辅助性RNA可含有病毒(例如，α病毒)亚基因组启动子，在一些实施方案中，这种启动子可被修饰以调节亚基因组片段的转录，或降低与复制子RNA的同源性，或包含影响α病毒结构蛋白表达的其它组分(例如，内部核糖体进入位点、核糖体通读元件)。优选α病毒结构蛋白基因是缺陷辅助者内最接近3’端的基因。此外，还优选该缺陷辅助性RNA不含能促进RNA-蛋白质与α病毒结构蛋白相互作用而包装入核衣壳、病毒颗粒样颗粒或α病毒复制子颗粒的序列。缺陷辅助性RNA是α病毒结构蛋白表达盒的一个特殊实施方案。
用于本发明的α病毒可生长在上述任何一个适合SARS病毒的细胞系中。
可按照本发明的方法，通过使用上述细胞系(例如无限增殖细胞系)和许多已经公开并被接受的α病毒载体方法来制造α病毒复制子颗粒。这种方法包括，例如，短暂包装发，例如共转染体外转化的复制子和缺陷辅助性RNA(Liljestrom，Bio/Technology 9：1356-1361，1991；Bredenbeek等，J.Virol.67：6439-6446，1993；Frolov等，J.Virol.71：2819-2829，1997；Pushko等，Virology 239：389-401，1997；美国专利5,789,245和5,842,723)，或共转染质粒DNA复制子和缺陷辅助性构建物(Dubensky等，J.Virol.70：508-519，1996)，以及将α病毒结构蛋白表达盒(例如，DNA缺陷辅助者)引入本发明的无限增殖细胞系中产生稳定的包装细胞系(PCL)(Polo等，PNAS 96：4598-4603，1999；美国专利5,789,245，5,842,723，6,015,694；WO 97/38087，WO 99/18226，WO 00/61772，和WO 00/39318)。稳定的包装细胞系然后可用于制造α病毒复制子颗粒。PCL可用体外转录的α病毒复制子RNA转染，用质粒DNA复制子(例如，ELVIS载体)转染，或用α病毒复制子颗粒种液转染，然后在一定条件下培育足够在培养物上清中制造子代α病毒复制子颗粒的时间。此外，随后可通过感染在其它天然PCL培养物中传代子代复制子颗粒，这将导致进一步扩增并得到商业规模的制品。重要的是，通过使用基于“缺口”结构基因构型的缺陷辅助性RNA或稳定的PCL，可生成出不含可检测污染RCV的复制子颗粒贮液。
收获之后，可使收获物通过滤膜(例如，孔径0.2uM、0.45uM、0.65uM、0.8uM)来澄清含有嵌合α病毒复制子颗粒的粗制培养物上清。在过滤之前可任选对粗制上清进行低速离心以除去较大细胞碎片。在一个实施方案中，在层析纯化步骤之前或之后在α病毒复制子颗粒制品中加入了内切核酸酶(例如，Benzonase，Sigma#E8263)以消化外源核酸。此外，在纯化之前可用任何一种广为所知的方法(例如，正切流动超滤)来浓缩该制品。可通过层析技术(例如，离子交换层析，尺寸排阻层析，疏水相互作用层析、亲和层析)来浓缩并纯化粗制或经过澄清的α病毒复制子颗粒，如WO01/92552所述，该申请被全文纳入本文作为参考。可依次使用两种或多种此类纯化方法。
编码SARS病毒刺突蛋白抗原的α病毒复制子颗粒的例子
本发明包括制造复制缺陷病毒载体颗粒(例如，α病毒复制子颗粒)的组合物和方法，所述载体颗粒可用于体外和体内给予编码的蛋白质具有治疗或预防用途的异源基因，包括编码一种或多种SARS病毒抗原的基因。
以下实施例例举了制备编码SARS病毒刺突抗原的α病毒复制子颗粒的方法。
SARS病毒刺突基因可被掺入来自各种α病毒(如辛德比斯病毒、Semliki森林病毒(US 5739026)、委内瑞拉马脑炎病毒(US 6531135)、以及来自一种以上α病毒的复制子颗粒嵌合体(US 6376236，WO 02/99035))的α病毒复制子颗粒。此外，SARS病毒刺突基因可以其完整形式(编码编码全长刺突蛋白)或以修饰形式掺入，所述修饰形式包括，例如，序列删除或截短，故而编码的刺突蛋白的长度小于全长(例如，C-末端被截去一个或多个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30个等)氨基酸，删除了跨膜区或胞质尾)。
例如，可通过标准RT-PCR条件或通过标准亚克隆，从这里所述的其它质粒之一，使用市售的限制性内切核酸酶，将刺突基因可作为全长基因克隆入VCR-chim2.1载体(WO 02/99035)。为进行RT-PCR中的逆转录步骤，使用了Superscript预扩增试剂盒(InvitrogenTM)和引物SEQ ID NO：7325(sp-RT-R)：
扩增步骤使用cDNA聚合酶优势试剂盒(Clonetech)和两个引物Sp-F-BbvCI(SEQID NO：7326)和Sp-R-NotI(SEQ ID NO：7327)：
设计的正向引物在ATG密码子之前含有序列ccacc(Kozak，1991 JBC 19867-70)以使刺突基因的翻译效率最优。同时，正向引物含有BbvCI限制位点，反向引物含有NotI限制位点以便随后克隆PCR扩增的基因。
PCR产物用QIAquick Nucleotide Removal试剂盒(QIAgen)纯化，用BbvCI和NotI消化，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAgen)凝胶纯化，并连接到用相同的酶预消化的质粒VCR-Chim2.1上。含有SARS刺突序列的克隆通过测序来检验，新的构建物被称为VCR-Chim2.1-SARSspike。
为产生VEErep/SINenv-SARSspike复制子颗粒，用限制性酶PmeI将质粒VCR-Chim2.1-SARSspike、VCR-DH-Scap(WO 02/99035)和VCR-DH-Sglydl160(WO02/99035)线性化，并按上面的描述(Polo等，1999，PNAS 96：4598-603；WO02/99035)进行体外转录。并按上面的描述(Polo等，1999，同上；WO02/99035)将转录物共转染入BHK细胞。转染的细胞在34℃培育，电穿孔后20-30小时后收集上清，通过离心澄清，并通过层析纯化，如上所述(WO 01/92552)。
用纯化的VEErep/SINenv-SARSspike或VEErep/SINenv-GFP(WO 02/99035)复制子颗粒感染BHK细胞过夜验证复制子颗粒载体的SARS刺突蛋白表达。此外，BHK细胞还用体外转录的VCR-Chim2.1-SARSspike复制子RNA平行转染。感染后16小时裂解感染细胞，并用能识别SARS病毒刺突蛋白的抗体通过western印迹分析裂解物样品。凝胶上的蛋白质被染色或转移到膜上以进行Western印迹分析，分析采用康复患者的血清或者抗SARS病毒的鼠或兔抗血清进行。如本发明其它部分的描述，将VEErep/SINenv-SARSspike复制子颗粒给予疫苗受体(例如，啮齿动物、非人灵长类、人类)。
图67显示了在非还原条件下使用SARS病毒特异性兔多克隆抗血清得到的western印迹分析结果的数据。western数据证实，SARS刺突蛋白不仅在被α病毒复制子颗粒感染或被复制子RNA转染的细胞内表达，而且刺突蛋白的优势形式是同型三聚体(图67A)。在从SARS病毒感染的VERO细胞上清纯化的SARS病毒颗粒的western印迹中观察到了类似的刺突蛋白的同型三聚连接，这种同型三聚体是热不稳定的，它在80℃和100℃离解成单体形式说明了这一点(图67B)。
为进一步表征SARS刺突蛋白的表达和从α病毒复制子载体表达后的加工，用表达全长刺突的α病毒复制子颗粒感染BHK-21细胞。以5MOI感染6小时后，感染的细胞用L-[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸标记1小时。[35S]-标记的刺突蛋白用兔抗SARS血清免疫沉淀并用Endo-H消化。消化和未消化的蛋白质都用4％聚丙烯酰胺-SDS PAGE在还原条件下分析。如图55所示，合成了全长刺突蛋白，它是Endo-H敏感型高甘露糖糖蛋白(gp170，ER形式)，被修饰成带有复杂寡糖的Endo-H抗性糖蛋白(gp180，高尔基体形式)。gp170转变为gp180形式在2小时内完成。
将表达一种或多种SARS蛋白的α病毒复制子颗粒(例如，VEErep/SINenv-SARSspike复制子颗粒)给予疫苗受体以诱导SARS特异性免疫应答(例如，啮齿类、雪貂、非人灵长类、人类)，如本发明其它部分所述。免疫接种可通过多种途径进行，其中包括，例如，肌肉内、皮下、真皮内和鼻内。此外，所述α病毒复制子颗粒可单独使用或与本发明的其它免疫方法联合使用(例如“初次免疫-强化免疫(prime-boost)”)，或者，所述α病毒复制子颗粒可以共表达来自其它呼吸病原体的抗原，或与表达来自其它呼吸病原体(例如，流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人超级肺病毒)的抗原的α病毒复制子颗粒共施用。例如，在小鼠中证实了用VEErep/SINenv-SARSspike复制子颗粒免疫动物诱导出了抗-刺突蛋白抗体(图68)。这些对小鼠进行的研究还包括用来比较的其它疫苗组，包括本文其它部分所述的SARS灭活病毒和重组截短的刺突蛋白疫苗，以及用作引物的质粒DNA，然后用α病毒复制子颗粒作加强免疫。数据清楚显示所有疫苗组都有非常强的免疫应答，其中包括α病毒复制子颗粒组。应该注意，这些试验所用的SARS灭活病毒疫苗诱导的抗体水平在SARS病毒动物攻击模型中显示是保护性的。
类似地，按照本发明的方法并采用标准分子生物学技术，将编码其它SARS病毒抗原(例如，核衣壳蛋白，膜糖蛋白)的基因单独或组合克隆入α病毒复制子载体以产生α病毒复制子颗粒。
表达SARS病毒刺突α病毒质粒的例子
本发明包括制造表达SARS病毒抗原的质粒DNA以进行抗SARS病毒感染的预防性或治疗性免疫。一实施方案中，所述SARS病毒抗原是刺突(S)蛋白。一实施方案中，所述质粒DNA是基于α病毒的。
以下实施例例举了一种制造表达SARS病毒刺突(S)的基于α病毒的质粒DNA的方法。
SARS刺突基因可用任何一种基于α病毒的质粒DNA复制子来输送，如ELVS(Dubensky等，1996J Virol.70：508-19)、SINCP(WO 01/81609)或VCP(PCT WO02/99035)。
例如，用标准RT-PCR技术将SARS刺突基因克隆入SINCP。反转录步骤采用寡聚Sp-RT-R和Superscript预扩增试剂盒(Invitrogen)。扩增步骤采用cDNA聚合酶优势试剂盒(Clonetech)以及引物Sp-R-NotI和Sp-F-XhoI(SEQ ID NO：7328)。
设计的Sp-F-XhoI引物在ATG密码子之前含有序列ccacc(Kozak 1991，同上)以使刺突基因的翻译效率最优。同时，该引物含有XhoI限制位点以便随后克隆PCR扩增的基因。
PCR产物用QIAquick Nucleotide Removal试剂盒(QIAgen)纯化，用XhoI和NotI消化，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAgen)凝胶纯化，并连接到用相同的酶预消化的质粒SINCP上。含有SARS刺突序列的克隆通过测序来检验，新的构建物被称为SINCP-SARSspike.
在低血清培养基Optimem(Life Technologies)中加入5μl TransIT聚胺试剂(Mirrus)用2μg质粒DNA SINCP-SARSspike或SINCP预培育5分钟短暂转染BHK细胞验证SARS刺突基因的表达。转染后48小时裂解细胞并对细胞裂解物样品进行8％SDS-PAGE。凝胶上的蛋白质被染色或转移到膜上以进行Western印迹分析，分析采用康复患者的血清或者抗SARS病毒的鼠或兔抗血清进行。
将SINCP-SARSspike质粒复制子作为经过配制或未经配制的质粒疫苗给予疫苗受体(例如，啮齿动物、非人灵长类、人类)，可以单独使用或与本发明的其它疫苗联合使用(例如“初次免疫-强化免疫”)，如本文其它地方所述。
类似地，编码其它SARS病毒抗原(例如，核衣壳蛋白，膜糖蛋白)的基因被克隆入α病毒质粒复制子载体。
2.质粒表达载体
表达SARS病毒刺突(S)的质粒DNA的例子
以下实施例例举了制造表达SARS病毒刺突(S)的质粒DNA的方法。
SARS病毒刺突抗原也可用其它质粒DNA表达载体(有时被称为“常规”DNA疫苗)来输送，该表达载体基于聚合酶II启动子，如CMV启动子。刺突抗原基因的DNA疫苗在小鼠内诱导抗体应答(Zhao等，(2004)Acta Biochim et Biophysica Sinica36：37-41)，并被发现可在小鼠内诱导病毒中和以及保护性免疫力(Yang等，(2004)Nature 428：561-564)，尤其是当C-末端被截短时。
例如，使用标准RT-PCR技术将SARS刺突基因克隆入pCMVKm2(Zur Megede等，J.Virol.，74：2628-2635，2000；SEQ ID NO：9923)。逆转录步骤使用寡聚Sp-RT-R和Superscript预扩增试剂盒(Invitrogen)。扩增步骤使用cDNA聚合酶优势试剂盒(Clonetech)和引物Sp-F-EcoRI(SEQ ID NO：7329)及Sp-R-XbaI(SEQ ID NO：7330)。
设计的正向引物在ATG密码子之前含有序列CCACC(Kozak，1991，同上)以使刺突基因的翻译效率最优。同时，正向引物含有EcoRI限制位点，反向引物含有XbaI限制位点以便随后克隆PCR扩增的基因。
PCR产物用QIAquick Nucleotide Removal试剂盒(QIAgen)纯化，用XhoI和NotI消化，用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAgen)凝胶纯化，并连接到用相同的酶预消化的质粒pCMVKm2上。含有SARS刺突序列的颗粒通过测序来检验，新的构建物被称为pCMVKm2-SARSspike。
在低血清培养基Optimem(Life Technologies)中加入5μl TransIT聚胺试剂(Mirrus)用2μg质粒DNA pCMVKm2-SARSspike或pCMVKm2预培育5分钟短暂转染BHK或293细胞验证SARS刺突基因的表达。转染后48小时裂解细胞并对细胞裂解物样品进行8％SDS-PAGE。凝胶上的蛋白质被染色或转移到膜上以进行Western印迹分析，分析采用康复患者的血清或者抗SARS病毒的鼠或兔抗血清进行。
将质粒pCMVKm2-SARSspike作为经过配制或未经配制的质粒疫苗给予疫苗受体(例如，啮齿动物、非人灵长类、人类)，如本文其它地方所述。
类似地，编码其它SARS病毒抗原(例如，核衣壳蛋白，膜糖蛋白)的基因被克隆入质粒表达载体。
3.含有SARS抗原的病毒样颗粒
本发明的SARS病毒抗原可被配制成病毒样颗粒(“VLP”)。因此，本发明包括含有一种或多种SARS病毒抗原的病毒样颗粒(或VLP)。优选所述VLP包括一种或多种选自下组的SARS病毒抗原：刺突(S)、核衣壳(N)、膜(M)和包膜(E)。优选VLP至少包含M和E。
本发明的VLP包含至少一种形成颗粒的多肽。所述形成颗粒的多肽宜选自冠状病毒结构蛋白。一实施方案中，所述形成颗粒的多肽选自一种或多种SARS病毒抗原。在另一实施方案中，所述形成颗粒的多肽选自非SARS冠状病毒(例如小鼠肝炎病毒)的结构蛋白。
当病毒结构蛋白在真核或原核表达系统中表达时可形成VLP。通过表达，结构蛋白自装配形成颗粒。或者，病毒结构蛋白可从完整病毒分离并与磷脂一起配制。这种病毒结构蛋白在这里被称为“形成颗粒的多肽”。由于不存在病毒基因组，VLP是非感染性的，然而，这些非复制的病毒衣壳能模拟天然病毒颗粒的结构。
由于它们的结构，VLP能在其表面展示许多抗原位点(类似于天然病毒)。VLP对活疫苗或减毒疫苗是有益的，由于它们不具有感染性，它们的生产和使用都非常安全。已知VLP可诱导抗体中和和T细胞应答，并且能够通过I类和II类MHC途径呈递。
先前创建冠状病毒VLP的工作表明，E和M蛋白单独就足以形成冠状病毒VLP。参见Fischer等，J.Virol.(1998)72：7885-7894和Vennema等，EMBO J.(1996)15：2020-2028。
本发明也包括含有来自非SARS冠状病毒的形成颗粒的多肽或其部分的嵌合VLP。这种形成颗粒的多肽可包含非SARS冠状病毒的全长多肽。或者也可使用形成颗粒的的片段。
一实施方案中，非SARS颗粒形成多肽的片段以及SARS病毒抗原的片段被融合在一起。例如，这种嵌合多肽可含有非SARS颗粒形成多肽的胞内域和跨膜结构域以及SARS病毒抗原的胞外域。在一个实施例中，本发明的VLP包括含有小鼠肝炎病毒(MHV)刺突蛋白的胞内域和跨膜结构域的嵌合刺突蛋白，且所述嵌合刺突蛋白还含有SARS刺突蛋白的胞外域。这种VLP还含有冠状病毒的M蛋白和E蛋白。所述M和E蛋白可选自任何冠状病毒，包括小鼠肝炎病毒(MHV)或SARS。图中包含MHV S、M和E蛋白的样本序列，如上。
融合到MHV刺突蛋白胞内域和跨膜结构域的来自猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)刺突蛋白胞外域的嵌合刺突蛋白已经被揭示。参见WO 98/49195和WO 02/092827。在这些嵌合VLP结构中，MHV的M和E蛋白形成了VLP的衣壳结构。嵌合刺突蛋白使FIPV刺突蛋白的胞外域暴露于表面。
术语“病毒样颗粒”或“VLP”在这里是指非复制的空的病毒外壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白质构成，例如，但不限于，那些被称为衣壳蛋白、外被蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的蛋白质或这些蛋白质的能形成颗粒的多肽。通过在合适的表达系统中重组表达这些蛋白质可自发形成VLP。或者，病毒结构蛋白可分离自完整病毒并与磷脂一起配制。制造颗粒VLP的方法是本领域已知的并将在下面更详细地叙述。可用本领域已知的常规技术来检测组合物中是否存在VLP，这些技术如电镜检测、x-射线晶体学等。参见，例如，Baker等，Biophys.J.(1991)60：1445-1456；Hagensee等，J.Virol.(1994)68：4503-4505。例如，可对被玻化的待检VLP制品的含水样品进行冷冻电镜术，并在适当的暴露条件下记录图象。
短语“形成颗粒的多肽”包括全长或接近全长的病毒蛋白质，及其片段，或具有内部缺失的病毒蛋白质，这种蛋白质能够在有利于VLP形成的条件下形成VLP。因此，所述多肽可包括全长序列、片段、截短的序列和部分序列、以及所提及分子的类似物和前提形式。因此，该术语包括对序列进行删除、添加和取代，只要该多肽仍能形成VLP即可。既然病毒分离物之间通常发生外被蛋白的变异，因此该术语包括特定多肽的天然变体。该术语还包括在所提及的蛋白质中不会自然发生的缺失、添加和取代，只要该蛋白质仍能形成VLP。
优选的取代是那些在自然状况下保守的取代，即在一类氨基酸内发生的涉及其侧链的取代。具体地说，氨基酸通常可被分为4类：(1)酸性氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)非极性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被归为芳香性氨基酸。例如，可以合理预计，单独用异亮氨酸或缬氨酸代替亮氨酸，用甘氨酸代替天冬氨酸，用丝氨酸代替苏氨酸，或用结构相关的氨基酸保守性代替一种氨基酸，将不会对生物活性造成很大影响。与所提及的分子具有几乎相同氨基酸序列，但具有很少氨基酸取代的蛋白质基本不会影响蛋白质的免疫原性，因此也包含在所提及的多肽范围之内。
本发明的VLP可由任何下述物质形成：病毒蛋白质、来自病毒蛋白质的形成颗粒的多肽、或病毒蛋白质的组合或其片段，它们能在适当条件下形成颗粒。对于形成颗粒的病毒蛋白质的要求是，如果颗粒是宿主细胞胞质内形成，则该蛋白质在表达它的宿主细胞内必须足够稳定，这样才能形成病毒样结构，并且多肽将在所用重组表达系统的细胞内才能自发装配成病毒样结构。如果蛋白质被分泌到培养基中，可调节培养条件使VLP能够形成。此外，形成颗粒的蛋白质在表达宿主中不应具有细胞毒性，并且不能在将使用VLP的宿主中复制。
优选的形成颗粒的多肽包括冠状病毒M和E蛋白，优选SARS的M和E蛋白。
从各种病毒蛋白质形成颗粒的方法和合适条件是本领域已知的。例如，可从以下来源的蛋白质制造VLP：流感病毒(如HA或NA)，乙肝病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛德比斯病毒，轮状病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，诺瓦克病毒，人乳头瘤病毒，HIV，RNA噬菌体，Qβ噬菌体(如外被蛋白)，GA噬菌体，fr噬菌体，AP205噬菌体，以及Ty(如逆转录转座子Ty蛋白p1)。VLP已被进一步叙述在WO 03/024480，WO 03/024481，以及Niikura等，Virology(2002) 293：273-280；Lenz等，J.Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，J.InfectiousDiseases(2003)188：327-338；和Gerber等，J.Virology(2001) 75(10)：4752-4760。
如上所述，当感兴趣的形成颗粒的蛋白质在合适的宿主细胞内重组表达时VLP可自发形成。因此，用于本发明的VLP可用本领域熟知的重组技术制造。此时，可使用已知技术从DNA文库或直接从含有它们的细胞和组织分离所提及的编码形成颗粒的多肽的基因。也可基于已知序列通过合成制造编码形成颗粒的多肽的基因。可设计含合适密码子的核苷酸序列以得到所需的特定氨基酸序列。通常，选择用来表达该序列的宿主偏爱的密码子(例如对人类DNA疫苗选择人类密码子)。完整序列通常是从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配的，并被装配成完整的编码序列。参见，例如，Edge，Nature(1981)292：756；Nambair等，Science(1984)223：1299；Jay等，J.Biol.Chem.(1984)259：6311。
一旦所需颗粒形成多肽的编码序列被分离或合成，便可将它们克隆入任何合适的载体或复制子以进行表达。精通此领域的技术人员已知许多克隆载体，选择合适的克隆载体是一项选择工作。通常可参见Sambrook等的著作。载体然后被用来转化合适的宿主细胞。合适的表达系统包括，但不限于，本领域熟知的细菌、哺乳动物、杆状病毒(bacuolvirus)/昆虫、牛痘、Semliki森林病毒(SFV)、酵母和非洲爪蟾表达系统。
许多适合用作用来制造本发明VLP的宿主细胞的细胞系是本领域已知的。合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞以及其它细胞。细胞的哺乳动物来源包括，但不限于，人类或非人灵长类动物(例如，MRC-5(ATCC CCL-171)，WI-38(ATCC CCL-75)，人胚胎肾细胞(293细胞，通常被剪切的腺病毒型5DNA转化)，猴肾Vero细胞(包括COS7细胞)，马、牛(如MDBK细胞)、羊、狗(例如狗肾MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016，如WO 97/37001所述保藏编号为DSM ACC 2219)、猫和鼠(例如仓鼠细胞，如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自各个发育阶段，包括例如成人、新生儿、胎儿或胚胎。
适合制造本发明VLP的细菌宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和链球菌属。适合制造本发明VLP的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichiaguillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。适合生产本发明VLP的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和甘兰尺蠖(Trichoplusia ni)。
病毒载体可用来在真核细胞内制造颗粒，例如那些来自痘病毒科的病毒，包括牛痘病毒和禽痘病毒。此外，基于感染/转染系统的牛痘苗，如Tomei等，J.Virol(1993)67：4017-4026和Selby等，J.Gen.Virol.(1993)74：1103-1113中所述的那些，也可用来生产本发明的VLP。在这种系统中，细胞首先被编码T7噬菌体RNA聚合酶的牛痘病毒重组体体外转染。这种聚合酶仅转录带有T7启动子的模板。细胞感染之后用T7启动子驱动的感兴趣的DNA转染。表达在胞质内的来自牛痘病毒重组体的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，RNA然后通过宿主的翻译机制被翻译成蛋白质。该方法可高水平地短暂地在胞质内制造大量RNA及其翻译产物。
根据所选表达系统和宿主，可通过使被表达载体转化的宿主细胞在形成颗粒的多肽得以表达并能VLP的条件下生长来制造VLP。对适当生长条件的选择是精通此领域的技术人员已知的。如果VLP在细胞内形成，然后要用化学、物理或机械方法破坏细胞，这些方法将使细胞裂解但保持VLP基本完整。这种方法是精通此领域的技术人员并描述在，例如，《蛋白质纯化应用实践方法》(Protein PurificationApplications：A Practical Approach)，(E.L.V.Harris和S.Angal编，1990)。
然后用保持颗粒完整性的方法将其分离，如通过梯度离心，例如，氯化锶(CsCl)梯度和蔗糖梯度，等等(参见，例如，Kirnbauer等，J.Virol.(1993)67：6929-6936)；离子交换层析(包括阴离子交换层析，如DMAE和TMAE)，羟磷灰石层析(参见WO00/09671)，疏水相互作用层析，凝胶过滤层析和其它过滤方法，如纳米(nanometric)过滤和超滤。优选在纯化过程中进行至少一次阴离子交换步骤，更优选使用至少两次阴离子交换步骤。
还可通过本领域已知的方法使用高浓度还原剂进一步处理本发明的VLP制剂使其去装配成较小的含有蛋白质的部分，然后再通过除去还原剂或加入过量氧化剂来重新装配CLP。所得重装配的VLP可具有改进的均匀性、稳定性和免疫原性。此外，可通过重装配在VLP中加入其它治疗剂或预防剂。参见McCarthy等，J.Virology(1998)72(1)：32-41。也可参见WO 99/13056和WO 01/42780。适合用来使VLP去装配的还原剂包括巯基还原剂(如谷胱甘肽、β巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓唐醇、半胱氨酸、硫化氢以及它们的混合物)，它们宜含在中等离子强度至低离子强度的缓冲液中。需要将VLP暴露于还原剂足够长的时间以使适量VLP去装配。
可在本发明的VLP中加入佐剂以增强SARS病毒抗原的免疫原性。适合用于VLP的抗原包括上述那些。例如，本发明的VLP可被吸附到铝佐剂上。
本发明的VLP可经过配制以增强其稳定性。可增强VLP制剂稳定性的其它组分包括盐、缓冲液、非离子表面活性剂和其它稳定剂，如聚合的聚阴离子稳定剂。参见WO 00/45841。
可通过盐来保持含有VLP颗粒的溶液的离子强度。几乎所有能控制离子强度的盐都可使用。优选的可用来调节离子强度的盐包括生理上可接受的盐类，如NaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、磷酸钠和柠檬酸钠。盐组分的浓度优选为约0.10M至1M。由于实践中限制使用高盐浓度进行肠胃外注射，所以非常高的浓度是不优选的。相反，非常适中的盐浓度，如更适宜的生理浓度，例如约0.15M至约0.5M(其中含有0.15M-0.32M NaCl)，是优选的。
缓冲液也可增强本发明VLP制剂的稳定性。缓冲液宜使VLP的稳定性最佳同时维持一定的pH范围使疫苗制剂对接受者无刺激。缓冲液宜将疫苗制剂的pH维持在pH5.5-7.0的范围，更优选为6.0-6.5。适合用于疫苗制剂的缓冲液是本领域已知的，其中包括，例如，组氨酸和咪唑。缓冲液的浓度范围优选为约2mM至约100mM，更优选5mM-20mM。当VLP被铝化合物吸附或用其它方法与铝化合物一起配制时，含有磷酸盐的缓冲液通常不是优选的。
非离子性表面活性剂可用来增强本发明VLP制剂的稳定性。适合用于疫苗制剂的表面活性剂是本领域已知的，其中包括，例如，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯类)，如聚山梨醇酯80(例如，TWEEN 80)，聚山梨醇酯20(例如，TWEEN 20)，聚氧乙烯烷基醚(例如，Brij 35，Brij 58)，此外还包括Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Span 85和Pluronic系列的非离子表面活性剂(例如，Pluronic 121)。表面活性剂的浓度优选约为0.0005％至约0.5％(重量/体积)。
聚合的聚阴离子稳定剂可用来增强本发明VLP制剂的稳定性。适用于本发明的聚合的聚阴离子稳定剂含有单个长链或多个交联的链；当在溶液中时，任何一种类型的链上都带有多个负电荷。合适的聚阴离子聚合物包括蛋白质、聚阴离子、肽类和聚核酸。具体的例子包括羧甲基纤维素、肝素、聚氨基酸(如聚(Glu)、聚(Asp)和聚(Glu，Phe))、氧化的谷胱甘肽、多核苷酸、RNA、DNA和血清白蛋白。聚合的聚阴离子稳定剂的浓度优选为约0.01％至约0.5％，尤其是约0.05-0.1％(重量百分比)。
G.通过本发明SARS抗原的抗体被动免疫
本发明包括本发明SARS抗原的特异性抗体以及通过给予哺乳动物对象有效量的SARS抗体来治疗或预防SARS病毒相关疾病的方法。SARS病毒的特异性抗体可由精通此领域的技术人员制造。优选所述抗体是SARS病毒刺突(S)蛋白的特异性抗体。已经报道了用人单克隆抗-刺突抗体有效中和SARS冠状病毒(Sui等，(2004)PNAS USA101：2536-2541)。单克隆抗体的IgG1形式显示出高于scFv形式(32.3nM)的亲和力(1.59nM)。
本发明的抗体对于SARS抗原是特异性和选择性的。
一实施方案中，本发明的抗体是通过给动物施用SARS抗原产生的。该方法还包括从动物分离抗体。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体制品，单特异性抗血清，人类抗体，或者可以是杂交抗体或嵌合抗体，如人源化抗体，变异抗体(Fab’)2片段，F(ab)片段，Fv片段，单结构域抗体，二聚或三聚抗体片段或构建物，微体，或与所提及抗原结合的其功能性片段。
抗体是用精通此领域的技术人员熟知的技术制造的，这些技术描述在，例如，美国专利Nos.4,011,308；4,722,890；4,016,043；3,876,504；3,770,380和4,372,745中。例如，多克隆抗体是通过用感兴趣的抗原免疫合适的动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)产生的。为增强免疫原性，可先将抗原结合到载体上然后在免疫。这种载体是本领域的一般技术人员熟知的。免疫通常这样进行：将抗原以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的抗原注射动物一次或多次加强免疫。也可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。然后从免疫的动物获得多克隆抗血清。
用Kohler和Milstein的方法[(1975)Nature  256：495-497]或其改进方法制得单克隆抗体。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。也可使用家兔。然而，并非是对动物取血提取血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分散成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后对所得B细胞或所有分离的脾细胞进行诱导，使其与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。
人源化抗体和嵌合抗体也可用于本发明。杂交(嵌合)抗体分子通常叙述在Winter等，(1991)Nature  349：293-299和美国专利No.4,816,567。人源化抗体分子通常叙述在Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyan等，(1988)Science239：1534-1536；和英国专利申请No.GB 2,276,169(1994年9月21日公开)。一种工程构建人源化抗体的方法包括克隆含有启动子、前导区、以及小鼠抗体基因可变区序列和人抗体基因恒定区外显子的重组DNA，以产生鼠-人嵌合体，即人源化抗体。通常可参见Kuby，《免疫学》(Immunology)，第三版，W.H.Freeman and Company，New York(1998)，第136页。
能够鉴定SARS抗原的抗体片段也包括在本发明范围之内。许多含有能够显示完整抗体分子免疫结合特性的抗原结合位点的抗体片段是本领域已知的。例如，可通过用例如胃蛋白酶切除抗体分子中不负责抗原结合的恒定区来制造功能性抗体片段如产生F(ab’)2片段。这些片段将含有两个抗原结合位点，但缺乏每条重链的部分恒定区。类似地，如果需要的话，可制造含有单个抗原结合位点的Fab片段，例如，通过用木瓜蛋白酶消化多克隆或单克隆抗体。也可使用标准技术来制造仅包括重链和轻链的可变区的功能性片段，这些技术如重组法或优先蛋白水解切割免疫球蛋白分子。这些片段被称为Fv。参见，例如，Inbar等，(1972)Proc.Nat.Acad.Sci USA69：2659-2662；Hochman等，(1976)Biochem  15：2706-2710；以及Ehrlich等，(1980)Biochem  19：4091-4096。
单链Fv(“sFv”或scFv”)多肽是一种共价连接的VH-VL异质二聚体，它是由包含肽编码接头连接的VH-和VL-编码基因的融合基因表达的。Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA  85：5879-5883。已经描述过许多鉴定和建立化学结构(接头)的方法，这些结构用来将天然凝聚但可通过化学方法分离的抗体V区域的轻链和重链多肽转变为sFy分子，sFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本类似的三维结构。参见，例如，美国专利Nos.5,091,513；5,132,405；和4,946,778。可用在本领域已经描述过的方法来制造sFv分子。参见，例如，Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci USA  85：5879-5338；美国专利Nos.5,091,513；5,132,405和4,946,778。设计标准包括确定一条链的C-末端与另一条链的N-末端之间距离的大致长度，其中所述接头通常由不会卷曲或形成二级结构的小的亲水氨基酸残基形成。这种方法在本领域已经被描述过。参见，例如，美国专利Nos.5,091,513；5,132,405和4,946,778。合适的接头通常包括甘氨酸和丝氨酸可相互替换的多肽链，并可包括插入谷氨酸和赖氨酸残基以增强溶解性。抗-刺突scFv抗体已被报道(Sui等，(2004)PNAS USA101：2536-2541)。
“微小抗体(Mini-antibody)”或“微体(Minibody)”也可用于本发明。微体是sFv多肽链，在它们的C-末端包含通过绞链区与sFv分隔的寡聚化区域。Pack等，(1992)Biochem  31：1579-1584。寡聚化区域包括自联合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，可通过其它二硫键使其更加稳定。寡聚化区域被设计成与跨膜方向性折叠相一致，该过程被认为有利于多肽体内折叠成功能性结合蛋白。通常，微体是用本领域熟知的重组方法制造的。参见，例如，Pack等，(1992)Biochem  31：1579-1584；Cumber等，(1992)J.Immunology  149B：120-126。
也可用非常规方法来产生和鉴定本发明的抗体。例如，可筛检噬菌体展示文库在能结合本发明SARS抗原的抗体。通常可参见Siegel，“重组单克隆抗体技术”(Recombinant Monoclonal Antibody Technology)，Transfus.Clin.Biol.(2002) 9(1)：15-22；Sidhu，“将噬菌体展示用于药物生物技术”(Phage Display inPharmaceutical Biotechnology)，Curr.Opin.Biotechnol.(2000) 11(6)：610-616；Sharon等，“重组多克隆抗体文库”(Recombinant Polyclonal AntibodyLibraries)，Comb.Chem.High Throughput Screen(2000) 3(3)：185-196；和Schmitz等，“噬菌体展示：产生抗体的分子工具—回顾”(Phage Display：A Molecular Toolfor the Generation of Antibodies-Review)，Placenta，(2000) 21 SupplA：S106-12。
可通过给予动物编码SARS抗原的多核苷酸序列来制造本发明的抗体。SARS抗原然后在体内表达，并在体内生成SARS抗原特异性抗体。用多核苷酸输送本发明SARS抗原的方法将在下面第4部分讨论。
本发明的抗体宜特异于SARS病毒。
H.一种或多种上述疫苗的组合
本发明的组合物还包含一种或多种上述组合物的组合。例如，本发明包括含有减毒SARS病毒和亚单位SARS病毒抗原的组合物。
L.SARS抗原和其它呼吸道病毒抗原的组合
本发明还涉及含有一种或多种SARS病毒抗原以及一种或多种其它呼吸道病毒抗原的疫苗制剂。适用于本发明的其它呼吸道病毒抗原包括来自下列病毒的抗原：流感病毒、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、超级肺病毒和鼻病毒。其它呼吸道病毒抗原可来自SARS冠状病毒之外的冠状病毒，如NL63人冠状病毒(van der Hoek等，(2004)Nature Medicine 10：368-373)。优选其它呼吸道病毒抗原是流感病毒抗原。
本发明还包括与SARS病毒抗原组合的一种或多种细菌或病毒抗原。所述抗原可以单独使用或以任何方式组合使用。(参见，例如，WO 02/00249，其中描述了细菌抗原组合的应用)。这种组合物可包括来自同一病原体的多种抗原，来自不同病原体的多个抗原或来自相同和不同病原体的多个抗原。因此，细菌、病毒和/或其它抗原可含在同一种组合物中，或者可以分别给予同一对象。通常宜将用来引发免疫应答的抗原组合使用。
可用于本发明的细菌病原体的非限制性例子包括：白喉(参见，例如，《疫苗》第3章，1998，Plotkin和Mortimer编(ISBN 0-7216-1946-0)，葡萄球菌属(例如，Kuroda等[(2001)Lancet 357：1225-1240]所述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))，霍乱，结核病，破伤风梭菌(C.tetani)，也称为破伤风(参见，例如，《疫苗》第4章，1998，Plotkin和Mortimer编(ISBN 0-7216-1946-0)，A组和B组链球菌(包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，叙述于例如Watson等，(2000)Pediatr.Infect.Dis.J.19：331-332；Rubin等，(2000)Pediatr Clin.North Am.47：269-284；Jedrzejas等，(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207；Schuchat(1999)Lancet 353：51-56；英国专利专利申请0026333.5；0028727.6；015640.7；Dale等，(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-1243；Ferretti等，(2001)PNASUSA 98：4658-4663)，百日咳(参见，例如，Gusttafsson等，(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355；Rappuoli等，(1991)TIBTECH9：232-238)，脑膜炎，粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(参见，例如，McMichael(2000)Vaccine 19Suppl.1：S101-107)以及其它疾病状态，其中包括，但不限于，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)(A，B，C，Y)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)(参见例如WO 99/24578；WO 99/36544；和WO 99/57280)，幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)(例如，CagA、VacA、NAP、HopX、HopY和/或脲酶，如例如WO 93/18150；WO 99/53310；WO 98/04702所述)以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)。B型流感嗜血杆菌(HIB)(参见例如Costantino等，(1999)Vaccine 17：1251-1263)，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)(Ross等，(2001)Vaccine19：4135-4132)及其组合。
可用于本发明的病毒病原体的非限制性例子包括：脑膜炎，鼻病毒，流感(Kawaoka等，Virology(1990)179：759-767；Webster等，“甲型流感病毒的抗原性变异”(Antigenic variation among type A influenza viruses)，第127-168页，收于P.Palese和D.W.Kingsbury(编)，《流感病毒遗传学》(Genetics of influenzaviruses。Springer-Verlag，纽约)，呼吸道合胞病毒(RSV)，副流感病毒(PIV)，轮状病毒(例如，VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP2、NSP3、NSP4或NSP5，以及其它轮状病毒抗原，如WO 00/26380所述)，等等。衍生自其它病毒的抗原也可用于本发明，非限制性的例子包括来自以下病毒科成员的蛋白质：小RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒等，描述在例如Sutter等(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308；Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59：113-118；125-126)；杯状病毒科；披膜病毒科(例如风疹病毒等)；黄病毒科，包括普通黄病毒(例如，黄热病毒，日本脑炎病毒，登革病毒的血清型，蜱传脑炎病毒，西尼罗病毒，圣路易脑炎病毒)；瘟病毒(例如，经典型猪发热病毒，牛病毒性腹泻病毒，边境病病毒)；和丙型肝炎病毒(例如美国专利Nos.4,702,909；5,011,915；5,698,390；6,027,729和6,297,048中所述的甲型、乙型和丙型肝炎)；细小细小病毒(例如细小病毒B19)；冠状病毒科；呼肠孤病毒科；Bimaviridae；弹状病毒科(例如狂犬病毒等，描述于Dressen等(1997)Vaccine 15Suppl：s2-6；MMWR Morb Mortal Wkly Rep.1998Jan16：47(1)：12，19)；线状病毒科；副粘病毒科(例如，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒等，如《疫苗》[1998，Plotkin和Mortimer编(ISBN 0-7216-1946-0)]第9-11章所述；正粘病毒科(例如，A、B和C型流感病毒等，如《疫苗》[1998，Plotkin和Mortimer编(ISBN 0-7216-1946-0)]第19章所述)；本扬病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(例如，HTLV-1；HTLV-11；HIV-1(也称为HTLV-III，LAV，ARV，HTI，R等))，包括但不限于HIVIllb、HIVSF2、HIVLAV、HIVI-AL、I-IIVMN、SF162分离物的抗原)；HIV-I CM235，HIV-I US4；HIV-2；猴免疫缺陷病毒(SIV)。此外，抗原也可衍生自人乳头瘤病毒(HPV)和蜱传脑炎病毒。为了解有关这些病毒以及其它病毒的叙述，可参见例如《病毒学》(Virology)，第三版(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)。
蛋白质可衍生自疱疹病毒科，包括衍生自1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)的蛋白质，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；衍生自带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的抗原，包括CMV gB和gH(见美国专利No.4,689,225和PCT公开W089/07143)；以及衍生自其它人类疱疹病毒的抗原，如HHV6和HHV7。(见例如Chee等[《巨细胞病毒》(Cytomegaloviruses)(J.K.McDougall编，Springer-Verlag1990)，125-169页]以了解巨细胞病毒的蛋白质编码内容；McGeoch等[J.Gen.Virol.(1988) 69：1531-1574]以了解各种HSV-1编码的蛋白；美国专利No.5,171,568，以了解HSV-1以及HSV-2gB和gD蛋白以及编码它们的基因；Baer等[Nature(1984) 310：207-211]以鉴定EBV基因组的蛋白质编码序列；以及Davison和Scott [J.Gen.Virol.(1986) 67：1759-1816]以了解VZV)。单纯疱疹病毒(HSV)rgD2是经基因工程改造的中国仓鼠卵巢细胞产生的一种重组蛋白。这种蛋白质的正常锚定区被截短，导致糖基化的蛋白质被分泌到组织培养基中。可将CHO培养基中的gD2纯化至纯度大于90％。人免疫缺陷病毒(HIV)env-2-3是经基因工程改造的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)产生的HIV包膜蛋白的重组形式。这种蛋白质具有HIVgp120完整的蛋白质区域，但是非糖基化的在从酵母中纯化时已变性。HIV gpl20是gp120完全糖基化的分泌形式，以上述gD2类似的方式在CHO细胞中产生。适合用于免疫原性组合物的其它HSV抗原描述在PCT公开WO 85/04587和WO 88/02634中，它们被全文纳入本文作为参考。gB和gD抗原(缺乏锚定区的截短的表面抗原)的混合物是特别优选的。
来自下述肝炎病毒科的抗原也可方便地用于这里所述的技术，这些病毒包括甲型肝炎病毒(HAV)(参见例如Bell等，(2000)Pediatr Infect Dis.J.19：1187-1188；Iwarson(1995)APMIS 103：321-326)、乙型肝炎病毒(HBV)(参见例如Gerlich等，(1990)Vaccine 8 Suppl：S63-68 & 79-80)、丙型肝炎病毒(HCV)(参见例如PCT/US88/04125，公开的欧洲申请第318216号)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)。例如，已知HCV的病毒基因组序列，同时知道获得序列的方法。参见，例如，国际公开号为WO 89/04669、WO 90/11089和WO 90/14436的申请。本发明还包括这种多肽的分子变体，例如PCT/US99/31245；PCT/US99/31273和PCT/US99/31272所述。编码几种病毒蛋白质的HCV基因组包括E1(也称为E)和E2(也称为E2/NSI)以及N-末端核衣壳蛋白(称为“核心”(core))(见Houghton等[Hepatology(1991) 14：381-388]以了解关于HCV蛋白的叙述，包括E1和E2)。类似地，HDV δ-抗原的序列也是已知的(见例如美国专利No.5,378,814)，这种抗原可方便地用于本发明的组合物和方法。此外，还可以使用来自HBV的抗原，如核心抗原、表面抗原、SAg、以及前表面序列(presurface sequences)pre-S1和pre-S2(以前称为pre-S)还有上述抗原的组合，如SAg/pre-S1、SAg/pre-S2、SAg/pre-S1/pre-S2和pre-S1/pre-S2。见例如，“HBV疫苗一从实验室到许可：病例分析”(HBV Vaccines-from the laboratory to license：a case study)，选自Mackett，M.和Williamson，J.D.，《人类疫苗和免疫接种》(Human Vaccines and Vaccination)，第159-176页，以了解HBV的结构；以及美国专利Nos.4,722,840,5,098,704，5,324,513，它们被全文纳入本文作为参考；Beames等，J.Virol.(1995) 69：6833-6838，Birnbaum等，J.Virol.(1990) 64：3319-3330；和Zhou等，J.Virol.(1991) 65：5457-5464。这些蛋白质以及它们的抗原性片段都可用于本发明的组合物和方法。
流感病毒是本发明将特别有效的病毒的另一个例子。具体地说，为产生免疫应答，人们特别关注甲型流感的包膜糖蛋白HA和NA。甲型流感的许多HA亚型也被鉴定(Kawaoka等，Virology(1990) 179：759-767；Webster等，“甲型流感病毒的抗原变异”(Antigenic variation among type A influenza viruses)，127-168页，选自P.Palese和D.W.Kingsbury(编)，《流感病毒遗传学》(Genetics of influenzaviruses。Springer-Verlag，纽约)。因此，衍生自这些分离物中任何一种的蛋白质可用于这里所述的组合物和方法。
寄生虫抗原的非限制性例子包括那些引起疟疾和莱姆病的生物体的抗原。
本发明的方法包括给予动物一种含有SARS病毒抗原(包括一种或多种灭活SARS病毒，减毒SARS病毒，SARS裂解病毒制品或一种或多种SARS病毒抗原的重组体或纯化的亚单位制剂)的免疫原性组合物。用于本发明的免疫原性组合物可包含免疫有效量的SARS病毒抗原。“免疫有效量”是指足以使动物产生抗SARS抗原的免疫应答的量。
所述免疫应答优选包括产生SARS抗原特异性抗体。产生的抗体的量将视所用动物、是否存在佐剂等因素而不同。
本发明的免疫原性组合物还含有一种或多种佐剂。
本发明的免疫原性组合物可粘膜用药。合适的粘膜用药途径包括口服、鼻内、胃内、肺部、肠内、直肠、眼和阴道途径。免疫原性组合物可被制成适合粘膜用药的形式。例如，当口服使用组合物时，它可被制成片剂或胶囊(任选包有肠衣)、液体、转基因植物等形式。当该组合物被用于鼻内给药时，它可以是鼻喷雾、鼻滴液、凝胶或粉末的形式。
本发明的免疫原性组合物可肠胃外用药。合适的肠胃外用药途径包括肌肉内(IM)、皮下、静脉内、腹膜内、真皮内、经皮和透皮(参见例如WO 98/20734)途径，以及输送到组织间隙。免疫原性组合物可被制成适合肠胃外用药的形式，例如无菌或无热原的可注射形式。
本发明的疫苗可与其它免疫调节剂联合施用。具体地说，组合物将通常包含佐剂。其它优选的佐剂包括，但不限于，一种或多种下述物质：
A.含有矿物质的组合物
适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐类，如铝盐和钙盐。本发明包括以下矿物盐类，如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(例如可见《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Vaccine design：thesubunit and adjuvant approach)第8和9章，(1995)Powell和Newman.ISBN0-306-44867-X.)，或者不同矿物质与所述化合物的混合物，可以采取任何合适形式(如胶状、晶体、无定形等)，最好被吸附。含有矿物质的组合物可被制成金属盐颗粒。参见WO 00/23105。
B.油性乳剂
适合用作本发明佐剂的油性乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，如MF59(5％鲨烯，0.5％Tween 80和0.5％Span 85，用微量流化器制成亚微型颗粒)。参见WO90/14837。也可参见Frey等，“在非老年成人中比较MF59佐剂流感疫苗和无佐剂的流感疫苗的安全性、耐受性和免疫原性“(Comparison of the safety，tolerability，andimmunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvantedinfluenza vaccine in non-elderly adults”，Vaccine(2003) 21：4234-4237。
特别优选用于组合物的佐剂是亚微型水包油乳剂。用在这里的优选的亚微型水包油乳剂是任选地含有不同量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，如亚微型水包油乳剂，其中含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v Tween 80TM(聚氧乙烯山梨糖单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85TM(去水山梨糖醇三油酸酯)，以及任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)，例如称为“MF59”的亚微型水包油乳剂(WO 90/14837；美国专利6,299,884和6,451,325，它们被全文纳入本文作为参考；和Ott等，“MF59—设计和评价安全且有效的人类疫苗佐剂”(MF59—Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines)，选自《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)Plenum Press，New York，1995，277-296)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/v Tween 80TM和0.5％w/v Span 85TM，并任选含有不同量的MTP-PE，用微量流化器如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微型颗粒。例如，MTP-PE的含量约为0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选为0-100μg/剂。术语“MF59-0”在这里表示不含MTP-PE的上述亚微型水包油乳剂，而术语MF59-MTP表示含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/剂，如此类推。这里使用的另一种亚微型水包油乳剂MF69含有4.3％w/v鲨烯、0.25％w/v Tween 80TM和0.75％w/v Span 85TM，并任选含有MTP-PE。另一种亚微型水包油乳剂是MF75，也称为SAF，含有10％鲨烯、0.4％Tween 80TM、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP，也被微流体化成亚微型乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的制剂，例如100-400μg MTP-PE/剂。
亚微型水包油乳剂，制造这种乳剂方法，以及用于本发明组合物的免疫刺激剂(如胞壁酰肽)详细描述在WO 90114837以及美国专利Nos.6,299,884和6,451,325，它们被全文纳入本文作为参考。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可被用作本发明的佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是一种在许多植物种类的树皮、叶、茎、根甚至花中发现的甾醇苷和三萜苷的异源组。来自Quillaia saponaria Molina树树皮的皂苷已经被广泛研究作为佐剂。皂苷也可通过通过商业获自Smilaxornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)和Saponariaofficianalis(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，如QS21，以及液体制剂，如ISCOM。
可用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。使用这些技术得到的具体的纯化组分已经被鉴定，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选所述皂苷是QS21。一种制造QS21的方法揭示于美国专利No.5,057,540。皂苷制剂中也可含有固醇，如胆固醇(参见WO 96/33739)。
皂苷和胆固醇的组合可用来形成被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还含有磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM。优选ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM还描述在EP 0109942、WO 96/11711和WO 96/33739。任选地，ISCOM可不含其它去污剂。参见WO00/07621。
为了解皂苷基佐剂的制造可参见Barr等，“ISCOM和其它皂苷基佐剂”(ISCOMs andother saponin based adjuvants”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271。也可参见Sjolander等，“口服皂苷和ISCOM疫苗的摄取和佐剂活性”(Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and ISCOMvaccines”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998) 32：321-338。
D.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如：
(1)肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A和4、5或6个酰化链的混合。优选的3-O-脱酰单磷酰脂质A的“小颗粒”形式揭示在EP 0 689 454。3dMPL的这种“小颗粒”足够小以至能通过0.22微米无菌过滤膜(参见EP 0 689 454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如RC-529。见Johnson等，(1999)BioorgMedChem Lett 9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描述于，例如，Meraldi等，“一种新的有可能用于人类的佐剂OM-174与合成的柏格鼠疟原虫环孢子蛋白的C-末端片段242-310一起施用后诱导保护性应答”(OM-174，a NewAdjuvant with a Potential for Human Use，Induces a Protective Response withAdministered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from thecircumsporozoite protein of Plasmodium berghei)，Vaccine(2003) 21：2485-2491；和Pajak等，“OM-174佐剂在体内诱导鼠树突细胞的迁移和成熟”(The AdjuvantOM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cellsin vivo”，Vaccine(2003) 21：836-842。
(3)免疫刺激寡核苷酸
适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序(一段含有未甲基化的胞嘧啶之后是鸟嘌呤并通过磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。已证明含有回文序列或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸具有免疫刺激活性。
CpG可包括核苷修饰/类似物，如硫代磷酸脂修饰，并可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可被其类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷替代。例如可参见Kandimalla等[“趋异合成的核苷酸基序识别模式：设计和建立具有不同细胞因子诱导特性的强效免疫调节性寡脱氧核糖核酸制剂”(Divergent synthetic nucleotide motif recognitionpattern：design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles)，NucleicAcids Research(2003) 31(9)：2393-2400]；WO 02/26757和WO 99/62923叙述了可能的类似物例子。CpG寡核苷酸的佐剂功效还描述在Krieg，“CpG基序：细菌提取物中的活性成分？”(CpG motifs：the active ingredient in bacterial extracts？)，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie等，“在小鼠中通过肠胃外和粘膜用乙肝表面抗原和CpG DNA加强免疫的策略”(Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen andCpG DNA)，FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002) 32：179-185；WO98/40100；美国专利No.6,207,646；美国专利No.6,239,116和美国专利No.6,429,199。
CpG序列可定向TLR9，如GTCGTT或TTCGTT基序。见Kandimalla等，“Toll样受体9：通过新的合成CpG DNA调节鉴定和细胞因子诱导”(Toll-like receptor9：modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpGDNAs)，Biochemical Society Transactions(2003) 31(第3部分)：654-658。CpG序列可特异于诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或者它可能更加特异于诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN叙述于Blackwell等，“CpG-A诱导的单核细胞IFN-γ-可诱导蛋白质由浆细胞样树突细胞衍生的IFN-α调节”(CpG-A-InducedMonocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated byPlasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha)，J.Immunol.(2003) 170(8)：4061-4068；Krieg，“CpG A-Z”(From A to Z on CpG)，TRENDS in Immunology(2002)23(2)：64-65和WO 01/95935。优选所述CpG是CpG-A ODN。
优选CpG寡核苷酸是构建的以使5’末端可被受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可在它们的3’末端相连以形成“免疫子(immunomer)”。参见例如Kandimalla等，“影响免疫刺激活性的CpG寡核苷酸的二级结构”(Secondarystructures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity)，BBRC(2003) 306：948-953；Kandimalla等，“Toll样受体9：通过新的合成CpG DNA调节鉴定和细胞因子诱导”，Biochemical Society Transactions(2003) 31(第3部分)：664-658；Bhagat等，“CpG五-和六脱氧核糖核酸是有效的免疫调制剂”(CpGpenta-and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents)BBRC(2003) 300：853-861和WO 03/035836。
(4)ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物
细菌ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选所述蛋白质衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。WO 95/17211描述了使用脱毒ADP核糖基化毒素作为粘膜佐剂，WO 98/42375描述了将其作为肠胃外佐剂。优选佐剂是脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LTRl92G。可在以下参考资料中找到将ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72，用作佐剂，这些参考文献内容纳入本文作为参考：Beignon等，“大肠杆菌不耐热肠毒素的LTR72突变体共施用于Bare皮肤后增强肽抗原激发CD4+T细胞及分泌γ干扰素的能力”(The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin ofEscherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigen to Elicit CD4+Tand Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin)，Infectionand Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，“粘膜疫苗：作为粘膜佐剂的LT和CT的无毒衍生物”(Mucosal vaccines：non-toxic derivatives of LT and CT asmucosal adjuvants)，Vaccine(2001) 19：2534-2541；Pizza等，“LTK63和LTR72，两种将进行临床试验的粘膜佐剂”(LTK63and LTR72，two mucosal adjuvants readyfor clinical triais)Int.J.Med.Microbiol  (2000) 290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，“用细菌ADP核糖基化外毒素、亚单位和无关佐剂经皮免疫”(Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylat ing Exotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants)，Infection and Immunity(2000) 68(9)：5306-5313；Ryan等，“大肠杆菌不耐热毒素的突变体作为经鼻输送无细胞百日咳疫苗的有效粘膜佐剂：无毒AB复合体的不同作用以及在Th1和Th2细胞上的酶活性”(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective MucosalAdjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1and Th2 Cells)Infection and Immunity(1999) 67(12)：6270-6280；Partidos等，“大肠杆菌不耐热肠毒素及其定点突变体LTK63增强对鼻内共免疫合成肽的增殖反应和细胞毒T细胞反应”(Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and itssite-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cellresponses to intranasally co-immunized synthetic peptides)，Immunol.Lett.(1999) 67(3)：209-216；Peppoloni等，“大肠杆菌不耐热肠毒素突变体是鼻内输送疫苗安全有效的佐剂”(Mutants of the Escherichia coli heat-labileenterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery ofvaccines)，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine等，(2002)“用流感疫苗和大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒突变体(LTK63)鼻内免疫”(Intranasal immunizationwith influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxinfrom Escherichia coli(LTK63))J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸替代优选基于ADP核糖基化毒素A和B亚单位的序列对比，参见Domenighini等，Mol.Microbiol(1995) 15(6)：1165-1167，该文献被全文纳入作为参考。
E.免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括各种细胞因子，如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)，干扰素(例如干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
F.生物粘附剂和粘膜粘着剂
生物粘附剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球体(Singh等，(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。脱乙酰壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。例如，WO99/27960。
G.微粒
微粒也可被用作本发明的佐剂。由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、正聚酯类、聚酐、聚己酸内酯等)与聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径为约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的颗粒)是优选的，可任选进行处理以使其表面带有负电荷(如用SDS处理)或正电荷(如用阳离子去污剂，如CTAB处理)。
H.脂质体
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述在美国专利No.6,090,406，美国专利No.5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚类和聚氧乙烯酯类。WO99/52549。这类制剂还包括与辛苯聚醇混合的聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(WO01/21207)，以及与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇混合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。
优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
J.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于，例如，Andrianov等，“通过凝聚聚磷腈水溶液来制备水凝胶微球体”(Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueouspolyphophazene solutions)，Biomaterials(1998) 19(1-3)：109-115；和Payne等，“从聚磷腈基质释放蛋白质”(Protein Release from Polyphosphazene Matrices)，Adv.Drug.Delivery Review(1998) 31(3)：185-196。
K.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹诺酮化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物，进一步描述于Stanley，“咪喹莫特和咪唑并喹诺酮类的作用机制和治疗潜能”(Imiquimod and the imidazoquinolones：mechanism of action andtherapeutic potential)Clin Exp Dermatol(2002) 27(7)：571-577；以及Jones，“瑞喹莫德3M”(Resiquimod 3M)，Curr Opin Investig Drugs(2003) 4(2)：214-218。
M.病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可被用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种病毒蛋白质，并任选与磷脂组合或配制。它们通常是非致病和不复制的，且通常不含任何天然病毒基因组。这种病毒蛋白质可通过重组制造或从完整病毒分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白质包括以下来源的蛋白质：流感病毒(如HA或NA)，乙肝病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛德比斯病毒，轮状病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，诺瓦克病毒，人乳头瘤病毒，HIV，RNA噬菌体，Qβ噬菌体(如外被蛋白)，GA噬菌体，fr噬菌体，AP205噬菌体，以及Ty(如逆转录转座子Ty蛋白p1)。VLP还被叙述在以下文献中：WO 03/024480，WO 03/024481，以及Niikura等，“作为口服疫苗载体的嵌合重组戊型肝炎病毒样颗粒呈递外源表位”(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral VaccineVehicle Presenting Foreign Epitopes)，Virology(2002) 293：273-280；Lenz等，“乳头瘤病毒样颗粒诱导树突细胞极性激活”(Papillomarivurs-Like ParticlesInduce Acute Activation of Dendritic Cells)，Journal of Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，“用重组HPV-16L1病毒样颗粒免疫的健康志愿者对人乳头瘤病毒(HPV)-16L1的细胞免疫应答”(Cellular Immune Responses to HumanPapillomavirus(HPV)-16L1Healthy Volunteers Immunized with RecombinantHPV-16 L1 Virus-Like Particles)，Journal of Infectious Diseases(2003)188：327-338；和Gerber等，“人乳头瘤病毒病毒样颗粒当与大肠杆菌不耐热肠毒素突变体R192G或CpG共同施用时是有效的口服免疫原”(Human PapillomavrisuVirus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered withEscherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG)，Journal ofVirology(2001) 75(10)：4752-4760。病毒体还叙述在，例如，Gluck等，“将来开发疫苗的新技术平台”(New Technology Platforms in the Development of Vaccinesfor the Future)，Vaccine(2002) 20：B10-B16。
本发明还包括上述一种或多种佐剂类型的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：
(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO 94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；
(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(见欧洲专利申请0835318，0735898和0761231)；
(6)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普卢兰尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，经微流化制成亚微型乳剂或剧烈搅拌形成较大颗粒乳剂。
(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80以及选自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；和
(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)。
铝盐和MF59是肠胃外免疫接种的优选佐剂。细菌毒素突变体是优选的粘膜佐剂。
如上所述，适用于本发明的佐剂可包含以下一种或多种：
-大肠杆菌不耐热肠毒素(“LT”)，或其脱毒突变体，如K63或R72突变体；
-霍乱毒素(“CT”)，或其脱毒突变体；
-由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、正聚酯类、聚酐、聚己酸内酯等)形成的微粒(即直径为约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的颗粒)；
-聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见国际专利申请WO 99/52549)；
-与辛苯聚醇混合的聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(WO01/21207)，或与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇混合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)；
-脱乙酰壳多糖(例如国际专利申请WO 99/27960)
-免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)和皂苷(参见国际专利申请WO00/62800)
-免疫刺激性双链RNA。
-铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝、羟基磷酸铝、羟基氯氧化铝、正磷酸铝、硫酸铝等(例如可参见《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Powell和Newman编，PlenumPress，1995(ISBN 0-306-44867-X))(以后称为“疫苗设计”)第8和9章，或不同铝化合物的混合物，所述化合物可采取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形等)，且优选是被吸附的；
-MF59(5％鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85，用微量流化器配制成亚微型颗粒)(见《疫苗设计》第10章；也可参见国际专利申请WO 90/14837)；
-脂质体(见《疫苗设计》第13和14章)；
-ISCOM(见《疫苗设计》第23章)；
-SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普卢兰尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，被微流化成亚微型乳剂或剧烈搅拌形成较大粒度的乳剂(见《疫苗设计》第12章)；
-RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80以及选自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；
-皂苷佐剂，如QuilA或QS21(见《疫苗设计》第22章)，也叫做StimulonTM；
-ISCOM，可以不含其它去污剂(WO 00/07621)；
-完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；
-细胞因子，如自细胞介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12等)，干扰素(例如干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子等(见《疫苗设计》第27和28章)；
-单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)(见《疫苗设计》第21章)；
-3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(欧洲专利申请0835318，0735898和0761231)；
-含有CpG基序的寡核苷酸(参见Krieg(2000)Vaccine，19：618-622；Krieg(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.，2001，3：15-24；WO 96/02555，WO 98/16247，WO 98/18810，WO 98/40100，WO 98/55495，WO 98/37919和WO 98/52581等)，即含有至少一个CG二核苷，
-聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(国际专利申请WO99/52549)；
-与辛苯聚醇混合的聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(WO01/21207)，或与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇混合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)；
-免疫刺激寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)和皂苷(WO00/62800)；
-免疫刺激剂和金属盐颗粒(国际专利申请WO00/23105)；
-皂苷和水包油乳剂(WO 99/11241)；
-皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO 98/57659)。
还可得到适合粘膜或肠胃外用药的其它(例如见《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Powell和Newman编，Plenum Press，1995(ISBN 0-306-44867-X))第7章)。
LT的突变体是优选的粘膜佐剂，尤其是“K63”和“R72”突变体(例如见国际专利申请WO 98/18928)，它们将增强免疫应答。
微粒也是优选的粘膜佐剂。它们优选衍生自聚(α-羟酸)，尤其是衍生自聚(丙交酯)(″PLA″)，D，L-丙交酯和乙交酯或羟乙酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)，或D，L-丙交酯与己内酯共聚物。微粒可衍生自不同聚合原料，这些原料具有各种分子量，并且当是共聚物如PLG时，这些原料有不同的丙交酯∶乙交酯比例，如何选择将是一项巨大的选择工作，这部分取决于将同时施用的抗原。
本发明的SARS病毒(灭活的或减毒的)、病毒抗原、抗体或佐剂可被包埋入微粒或被吸附到其中。包埋在PLG微粒内是优选的。PLG微粒详细叙述于Morris等，(1994)，Vaccine，12：5-11；《粘膜疫苗》(Kiyono等编，Academic Press 1996(ISBN012410587))第13章，以及《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Powell和Newman编，Plenum Press，1995(ISBN 0-306-44867-X))第16和18章)。
LT突变体与埋入微粒的抗原一起使用是有利的，这将显著增强免疫应答。
铝化合物和MF59是肠胃外用药的优选佐剂。
所述组合物可包含抗生素。
本发明的免疫原性组合物可以单剂量施用，或作为用药方案的一部分。该方案可包括初次剂量和强化剂量，它们可通过粘膜、肠胃外或它们的各种组合来施用。
本发明的方法还包括给予动物含有有效量本发明抗体的组合物来治疗或预防SARS病毒相关疾病。本发明抗体的“有效量”是足以为动物提供被动免疫保护或治疗的量。优选本发明的抗体特异于SARS病毒抗原。
治疗方法可将免疫原性组合物和抗体组合物相组合。因此，本发明包括治疗或预防SARS病毒相关疾病的方法，所述方法包括施用含有免疫有效量SARS病毒抗原的免疫原性组合物并施用有效量的SARS病毒抗原的特异性抗体。免疫原性组合物和抗体可同时施用或单独施用。本发明还包括一种组合物，其中包含含有免疫有效量SARS病毒抗原的免疫原性组合物，并且还含有有效量的SARS病毒抗原的特异性抗体
本发明的SARS病毒抗原和抗体可以多核苷酸形式施用。SARS病毒抗原和/或抗体蛋白然后在体内表达。
本发明的SARS病毒抗原和抗体可用一种或多种基因载体来输送，采用标准基因输送方法通过核酸免疫接种来给予。输送基因的方法是本领域已知的。参见例如美国专利Nos.5,399,346，5,580,859，5,589,466。所述构建物可通过皮下、表皮、真皮内、肌肉内、静脉内、粘膜(如鼻、直肠和阴道)、腹膜内、口服途径或其组合来输送(例如注射)。Yang等[(2004)Nature 428：561-564]已经描述过在第0、3和6周对小鼠肌肉内注射25μg编码刺突抗原的质粒DNA(用200μl PBS pH 7.4配制)。
可用于本发明实践的复制缺陷基因输送载体的一个例子是任何α病毒载体，描述于例如美国专利Nos.6,342,372；6,329,201和WO 01/92552。
已经开发了许多将基因输送到哺乳动物细胞的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒是基因输送系统的一个便捷平台。可将所选序列插入载体并用本领域已知的技术包装入逆转录病毒。然后分离重组病毒并将在体内或体外将其输送到受试者细胞。已经描述过许多逆转录病毒系统(美国专利No.5,219,740；Miller & Rosman，BioTechniques(1989)7：980-990；Miller，A.D.，Human Gene Therapy(1990)1：5-14；Scarpa等，Virology(1991)180：849-852；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：8033-8037；和Boris-Lawrie & Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3：102-109。
许多腺病毒载体也已被描述。与被整合入宿主基因组的逆转录病毒不同，腺病毒保留在染色体外，因此可使与插入诱变有关的风险最小(Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)57：267-274；Bett等，J.Virol.(1993)67：5911-5921；Mittereder等，Human Gene Therapy(1994) 5：717-729；Seth等，J.Virol.(1994)68：933-940；Barr等，Gene Therapy(1994)1：51-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6：616-629；和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4：461-476)。已在猕猴中研究腺病毒输送编码SARS冠状病毒结构性抗原刺突S1、膜蛋白和核衣壳蛋白的基因的密码子最优模式，并发现这将引发强烈的中和抗体应答(Gao等，(2003)Lancet 362(9399)：1895-1896)。
此外，各种腺伴随病毒(AAV)载体系统也可用于基因输送。用本领域熟知的技术易于构建AAV载体。参见例如美国专利Nos.5,173,414和5,139,941；WO92/01070(1992年1月23日公开)和WO 93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.(1988)8：3988-3996；Vincent等，Vaccines90(1990)(ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Carter，B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3：533-539；Muzyczka，N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158：97-129；Kotin，R.M.Human Gene Therapy(1994)5：793-801；Shelling和Smith，Gene Therapy(1994)1：165-169；和Zhou等，J.Exp.Med.(1994)179：1867-1875。
用于通过粘膜或其它途径输送多核苷酸的其它载体系统是肠道施用的重组痘病毒疫苗，描述于小Small，P.A.等(美国专利No.5,676,950，1997年10月14日发表，纳入本文作为参考)以及牛痘病毒和禽痘病毒。例如，表达所述基因的牛痘病毒重组体可通过以下方法构建。首先将编码SARS抗原或抗体的DNA或抗体编码序列插入合适的载体中使其毗邻牛痘启动子并位于牛痘DNA序列，如编码胸苷激酶(TK)序列的侧翼。然后用该载体来转染同时用牛痘感染的细胞。可通过同源重组将牛痘启动子和编码感兴趣序列的基因插入到该病毒基因组中。可在存在5-溴脱氧鸟苷时培养细胞并挑选其中的抗性病毒嗜菌斑来选择所得TK-重组体。
或者也可用禽痘病毒(如鸡痘和金丝雀痘病毒)来输送编码本发明SARS病毒抗原或抗体的基因。已知将表达哺乳动物病原体免疫原的重组禽痘病毒施用于非禽类物种能提供保护性免疫。由于禽痘仅在易感禽类中有结果地复制因此不会感染哺乳动物细胞，在人类和其它哺乳动物中采用禽痘载体特别理想。制造重组禽痘病毒的方法是本领域已知的，可按照上述制造牛痘病毒的方法用遗传重组体来制造。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；和WO 92/03545。也可使用小RNA病毒衍生的载体。(参见，例如，美国专利Nos.5,614,413和6,063,384)。
分子偶联载体，如Michael等[J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869]和Wagner等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103]所述的腺病毒嵌合载体也可用于基因输送。
可方便地采用牛痘感染/转染系统在宿主细胞内提供感兴趣编码序列的可诱导性短暂表达(例如，SARS病毒抗原或抗体表达盒)。在这种系统内，首先用编码T7噬菌体RNA聚合酶的牛痘病毒重组体体外感染细胞。这种聚合酶显示巧妙的特异性，即它仅转录带有T7启动子的模板。感染之后，感兴趣的多核苷酸在T7启动子驱动之下转染细胞。在胞质内表达的来自牛痘病毒重组体的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后通过宿主细胞的翻译机制将RNA翻译成蛋白质。该方法可高水平地短暂地在胞质内制造大量RNA及其翻译产物。参见，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。
作为用牛痘或禽痘病毒重组体进行感染，或用其它病毒载体输送基因的替代方法，可使用扩增系统，将其引入宿主细胞后将得到高水平的表达。具体地说，可工程构建位于T7RNA聚合酶编码区之前的T7RNA聚合酶启动子。翻译来自这种模板的RNA将产生T7RNA聚合酶，进而转录出更多的模板。同时产生其表达受T7启动子控制的cDNA。因此，一些通过翻译该扩增模板RNA而产生的T7RNA聚合酶将导致所需基因的转录。由于一些T7RNA聚合酶为启动此扩增所必需，可与模板一起将T7RNA聚合酶引入细胞以引发转录反应。可将聚合酶作为蛋白质或在编码RNA聚合酶的质粒上引入。关于T7系统以及它们在转化细胞中的应用可参见，例如，WO 94/26911；Studier和Moffatt，J.Mol.Biol.(1986)189：113-130；Deng和Wolff，Gene(1994)143：245-249；Gao等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1994)200：1201-1206；Gao和Huang，Nuc.Acids Res.(1993)21：2867-2872；Chen等，Nuc.Acids Res.(1994)22：2114-2120；和美国专利No.5,135,855。
本发明的免疫原性组合物还可含有稀释剂，如水、盐水、甘油、酒精等。此外，所述免疫原性组合物中还可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
用于本发明的免疫原性组合物可施用于动物。适合本发明方法的动物包括人和其它灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩，以及其它猿类和猴类；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物，如狗和猫；试验动物，包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养鸟类、野生鸟类和游戏鸟类，如鸡、火鸡以及鹑鸟、鸭、鹅等。适用于本发明的动物可以是任何年龄，包括成年动物和新生动物。转基因动物也可用于本发明。
本发明的免疫原性组合物可用来治疗或预防SARS病毒相关疾病。
本发明的组合物宜为药学上可接受的或药理上可接受的。具体地说，所述组合物宜为并非是生物学或其它方面不需要的，即该物质可以制剂或组合物的形式施用于个体而不会造成任何不希望的生物效应，或以有害方式与它所含的组合物组分相互作用。
药学上可接受的盐可用于本发明的组合物，例如，矿物盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸盐)以及有机酸的盐(如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐)。特别有用的蛋白质物质是血清白蛋白、钥孔_血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风毒素和精通此领域的技术人员熟知的其它蛋白质。本发明的组合物也可含有液体或赋形剂，如水、盐水、甘油、葡萄糖、酒精等(它们可以单独存在或组合存在)，以及润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂之类的物质。也可用脂质体作为本发明组合物的载体。
可用SARS特异性试剂或分析测定法来制造和检测本发明的疫苗。这种分析测定法包括例如：1)病毒滴定和嗜菌斑测定以量化传染性病毒颗粒，2)用恒量病毒和可变血清稀释度进行中和测定，3)两步RT-PCR系统(Light Cycler-Roche)以检测负链病毒RNA，使靶序列位于N基因内，提供可能的最高敏感性，和4)ELISA和western印迹分析，以检测和纯化病毒蛋白质。
此外，可生成兔多克隆抗血清以获得抗SARS-CoV的抗体试剂(并证实对中和抗体的诱导)。生成这种试剂的取样方案如下。首先在合适的培养细胞(如Vero细胞)内培养病毒，并通过20％蔗糖(w/v)垫沉淀。沉淀物然后用甘油-酒石酸钾梯度处理以进一步纯化。然后将含有病毒的部分稀释并通过超速离心沉淀。然后将沉淀物溶于PBS并用C3H4O2(β-丙内酯，BPL)灭活病毒。在第0、14和28天用佐剂IFA混合的1×109灭活病毒颗粒皮下(SC)免疫两只兔子。在第0(接种前)、13、28和35(第三次免疫1周后)天采集兔子血液。通过western印迹检测该方案所得血清的抗SARS-CoV蛋白反应性，结果发现与主要结构蛋白刺突(S)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白发生反应。
J.正出现的冠状病毒疫苗
SARS流行导致人们对由冠状病毒造成的病毒感染了解增加。本发明的疫苗可用于预防或治疗将出现的冠状病毒株，包括将出现的SARS病毒。
本发明提供了一种疫苗，其中包含灭活的(或杀死的)人冠状病毒、减毒人冠状病毒、裂解人冠状病毒制品、或重组或纯化的一种或多种人冠状病毒抗原的亚单位制剂，其中所述人冠状病毒不是SARS冠状病毒。任选地，所述人冠状病毒不是229E冠状病毒。任选地，所述人冠状病毒是OC43冠状病毒。任选地，所述人冠状病毒不是NL63冠状病毒。因此，本发明提供了如上文所定义的疫苗，其中，所述人冠状病毒不是SARS冠状病毒，不是229E冠状病毒，不是OC43冠状病毒，且不是NL63冠状病毒。这种疫苗可用于预防和/或治疗将出现的人冠状病毒感染。
本发明还提供了含有以下组分的疫苗：(a)灭活的(或杀死的)人冠状病毒，减毒人冠状病毒，裂解人冠状病毒制品，或重组或纯化的一种或多种人冠状病毒抗原的亚单位，其中所述人冠状病毒不是SARS冠状病毒，如上文的定义；和(b)灭活的(或杀死的)人冠状病毒，减毒人冠状病毒，裂解人冠状病毒制品，或重组或纯化的一种或多种人冠状病毒抗原的亚单位制剂，其中所述人冠状病毒是SARS冠状病毒。这种疫苗可用于预防和/或治疗SARS和其它人冠状病毒。
除了提供含有来自一种以上冠状病毒类型的抗原的疫苗，本发明还提供了一种疫苗，其中含有来自同种冠状病毒多种毒株的抗原，如SARS冠状病毒的不同毒株或SARS冠状病毒之外的冠状病毒的不同毒株的抗原。一实施方案中，所述疫苗包含至少来自两种冠状病毒毒株，或至少三种冠状病毒毒株的抗原。一实施方案中，所述疫苗包含来自至少两种冠状病毒类型的抗原。一实施方案中，所述疫苗包含各种已知冠状病毒类型(I型、II型和III型)至约的至少一种抗原。这种疫苗具有目前流感疫苗的模式。
对用于本发明疫苗的冠状病毒和/或冠状病毒的选择可基于各种标准。例如，选择可基于在疫苗将投放的地理区域(如北半球或南半球，具体国家等)已经检测过的病毒和/或毒株。选择可基于动物监(视例如在因呼吸道感染而住院治疗的患者中检测的病毒)结果。可每年进行选择，例如在入冬之前。也可每年接种疫苗，同样也以流感疫苗的模式。
优选的疫苗应有充分的免疫原性以提供中和性免疫应答反应，更佳的是提供保护性和/或治疗性免疫应答。特别优选的疫苗应符合WHO届时指定的效力要求。
本发明的疫苗所含的优选的亚单位抗原是纯化的刺突蛋白，更优选以寡聚(例如三聚)形式。刺突蛋白可被切割成其S1和S2产物，或者不被切割。
上述选择病毒和/或毒株制造疫苗的技术也可用来选择可获得的合适病毒和/或毒株的HR1和HR2序列以提供上述治疗性肽。
III.本发明的诊断组合物和方法
本发明提供了检测SARS冠状病毒的方法。检测患者样品可用于检测和诊断病毒感染。检测捐献血液可用于防止输血过程中发生的不慎病毒传播。检测方法主要包括三个方面：检测SARS病毒核酸；检测SARS病毒蛋白；和检测抗-SARS病毒的免疫应答。本发明提供了所有这三种方法。
当本文提及核苷酸序列具体寡核苷酸探针和引物时，“类似的”序列包括那些与已知SARSV基因组序列至少90％相同的序列，并包括在探针或引物长度上与SARSV基因组序列至少95％相同、至少99％相同和100％相同的序列。
术语″靶核酸区域″或″靶核酸″在这里表示带有要被扩增的“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是单链或双链的，并可包含靶序列以外不被扩增的其它序列。术语″靶序列″表示将被扩增的靶核酸的特定核苷酸序列。靶序列可包括含在靶分子内的与探针杂交的区域，在合适条件下探针将与该区域稳定杂交。″靶序列″还可包括结合寡核苷酸引物并以靶序列作为模板延伸的复合序列。所述靶核酸原本可以是单链的，术语″靶序列″还指与靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。如果″靶核酸″原本是双链的，则术语″靶序列″同时表示正(+)链和负(-)链。
术语″引物″或″寡核苷酸引物″在这里表示当置于诱导合成引物延伸产物的条件下—即存在核苷酸和聚合诱导剂(如DNA或RNA聚合酶)并有合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度—引发互补DNA链合成的寡核苷酸。引物优选为单链的以最有效地进行扩增，但也可以是双链的。如果是双链的，首先要对引物进行处理以分离它的两条链，然后在用来制备延伸产物。变性步骤通常通过加热完成，但也可用碱处理，然后再中和。因此，″引物″与模板互补，并通过氢键或杂交与模板复合以得到引物/模板复合体，从而在聚合酶的作用下引发合成，在DNA合成过程中通过加入共价连接在引物3’末端的与模板互补的碱基来延伸引物。
术语″探针″或″寡核苷酸探针″是指由上述多核苷酸构成的结构，所述多核苷酸含有与靶核酸分析物中存在的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区域可由DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷类似物构成。当将″寡核苷酸探针″用于5’核酸酶测定时，如TaqManTM技术，探针将含有至少一种荧光剂和至少一种被用于该反应的5’内切核酸酶活性消化的猝灭物以检测任何扩增的靶寡核苷酸序列。在本文中，所述寡核苷酸探针在毗连其5’末端将含有足够数量的磷酸二酯腱，这样所用5’至3’核酸酶活性可有效降解结合的探针以分离荧光剂和猝灭物。当寡核苷酸探针被用于TRA技术时，它将被适当标记，如下所述。
杂交序列不必具有提供稳定杂交的良好的互补性。多数情况下，忽略四个或更多核苷酸形成的环，当错配碱基少于约10％时便可形成稳定的杂交体。因此，术语″互补″在这里表示在试验条件下与其“互补物”形成稳定双链体的寡核苷酸通常有约90％或更高的同源性。
术语″杂交″和″杂交形成″表示在充分互补而通过Watson-Crick碱基配对形成复合体的核苷酸序列之间形成复合体。当引物与靶(模板)″杂交″时，这种复合体(或杂交体)足够稳定，起着例如引发DNA合成的DNA聚合酶所需引物的功能。
严格杂交条件通常包括以下要求：盐浓度低于约1M，更通常低于约500mM，优选低于约200mM；杂交温度可低至5℃，但通常高于22℃，更通常高于约30℃，优选高于约37℃。较长的片段可能需要较高的杂交温度以特异性杂交。影响杂交严格性的其它因素包括互补链的碱基组成和长度，是否存在有机溶剂以及碱基错配的程度，所使用参数的组合比任何单一参数的绝对数值更加重要。可控制的其它杂交条件包括缓冲剂类型和浓度、溶液pH、是否存在降低背景结合(如重复序列)的封闭试剂或封闭性蛋白质溶液以及它们的浓度、去污剂种类和浓度、能提高多核苷酸相对浓度的聚合物类分子、金属离子及其浓度、螯合剂及其浓度，以及本领域已知的其它条件。可使用严格性较低和/或更符合生理要求的杂交条件，此时在PCR扩增监测的实时测定如分子标记测定(molecular beacon assay)过程中，标记的多核苷酸扩增循环开关底物与互补的探针多核苷酸结合。这种严格性较低的杂交条件还包括对该方法的其它方面例如逆转录或PCR有效的溶液条件。
″生物样品″在这里指分离自对象的组织、细胞或体液样品，其中通常包括由该对象制造的抗体。典型的样品包括但不限于血液、血浆、血清、排泄物、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道、眼泪、唾液、痰、粘膜、乳汁、血细胞、器官、组织、活组织(例如肺、肝、肾)，以及体外细胞培养物样品，其中包括但不限于细胞和组织在培养基中生长得到的条件培养基，例如重组细胞和细胞组分。其它样品也可用于诊断，包括粪便样品和鼻咽抽吸物。
术语″抗体″包括多克隆和单克隆抗体制品，以及包含杂交抗体、变异抗体、嵌合抗体和人源化抗体，以及杂交(嵌合)抗体分子(参见，例如，Winter等，(1991)Nature349：293-299；和美国专利4,816,567)；F(ab’)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异质二聚体，参见，例如，Inbar等，(1972)Proc Natl Acad Sci USA  69：2659-2662；和Ehrlich等，(1980)Biochem  19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见，例如，Huston等，(1988)Proc Natl Acad Sci USA  85：5879-5883)；寡聚物；二聚和三聚抗体片段构建物；微体(参见，例如，Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等，(1992)J Immunology  149B：120-126)；人源化抗体分子(参见，例如，Riechmann等，(1988)Nature  332：323-327；Verhoeyan等，(1988)Science  239：1534-1536；和英国专利公开No.GB 2,276,169，1994年9月21日公开)；以及获自这种分子的任何功能性片段，其中所述片段保留亲本抗体分子的特异性结合特性。
术语″单克隆抗体″在这里是指含一群同质性抗体的抗体组合物。该术语不受抗体种类或来源的限制，且不受其制备方式的限制。该术语包括所有免疫球蛋白。
制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的。多克隆抗体是通过用感兴趣的抗原免疫合适的动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)产生的。为增强免疫原性，免疫之前可使抗体与载体连接。合适的载体通常是大的代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟乙酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质凝聚物(如油滴或脂质体)以及灭活病毒颗粒。这种载体是精通此领域的技术人员熟知的。此外，可将抗原缀合到细菌类毒素上，如白喉、破伤风、霍乱毒素等，以增强其免疫原性。
当需要大体积血清时，用兔、绵羊和山羊来制备多克隆抗血清较佳。同时因为可得到标记的抗-兔、抗-绵羊和抗-山羊抗体，所以这些动物是较好的设计选择。免疫通常这样进行：将抗原以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂(“FCA”))混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂(“FIA”))配的抗原注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。然后从免疫的动物获得多克隆抗血清。
如上所述，通常按照Kohler和Milstein的方法[(1975)Nature 256：495-497]或其改进方法来制造单克隆抗体。
核酸检测方法
已知许多扩增靶序列的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)以及基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)。这些方法通常描述在以下参考文献中：(PCR)美国专利4,683,195,4,683,202和4,800,159；(RT-PCR)美国专利5,310,652，5,322,770；(LCR)EP申请No.，320,308(1989年6月14日公开)；(SDA)美国专利Nos.5,270,184和5,455,166，以及G.T.Walker的“链置换扩增的实际应用”(Empirical Aspects of Strand DisplacementAmplification)，选自《PCR方法和应用》(PCR Methods and Applications)，3(1)：1-6(1993)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；(TMA)美国专利No.5,399,491；(NASBA)L.Malek等“基于核酸序列的扩增(NASBATM)”，选自《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，第28卷36章：通过非放射性探针分析核酸的方法，1994编P.G.Isaac，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.。PCR方法可包括一些变化以量化靶序列，例如通过实时PCR分析(尤其如美国专利5,210,015、5,487,972、5,994,056、6,171,785所述)。(上述参考资料被全文纳入本文作为参考)。
本发明的一个用来检测样品中是否存在SARS病毒的实施方案包括以下步骤：提供怀疑含有SARS病毒核酸靶的样品；使用这里所述的寡核苷酸引物，尤其是含有这里所述试剂盒的那些引物，用任何已知的核酸扩增技术(包括这里提到的任何技术)来扩增含在所述SARS病毒核酸靶中的模板序列；以及检测扩增的模板序列，其中存在扩增的模板序列说明所述样品中存在SARS病毒。
扩增技术通常包括使用两种引物。当靶序列是单链时，该技术通常包括制造互补链以得到双链靶的预备步骤。使两种引物与双链靶的不同链杂交，然后再延伸。延伸产物可作为靶以进一步杂交/延伸。净作用是扩增靶内的模板序列，模板的5’和3’末端可由靶中两个引物的位置确定。或者，如果引物之一或两者含有启动子序列，则可使用RNA聚合酶来扩增(通过转录)靶(如同TMA)。
本发明提供了扩增和/或检测SARSV病毒核酸中的模板或靶序列的方法和试剂盒。本发明提供了含有用来扩增SARSV核酸靶中所含模板序列的引物的试剂盒，所述试剂盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物含有与所述模板序列的一部分基本互补的序列，而所述第二引物含有与所述模板序列的互补物的一部分基本互补的序列，其中，所述引物内基本互补的序列确定了要被扩增的模板序列的两个末端。本发明的试剂盒还装有与模板序列和/或其互补物基本互补并可与之杂交的探针。这种探针可用于杂交技术以检测扩增的模板，或用来分离(即捕获)扩增的模板或最初的靶核酸。
本发明的试剂盒还装有用来产生并检测内标的引物和/或探针，以帮助量化测量结果(例如，Fille等，1997 Biotechniques 23：34-36)。
本发明的试剂盒还装有DNA聚合酶，它通常是热稳定性DNA聚合酶，此时将使用非等温扩增过程。该试剂盒还可包括提供dNTP、镁盐(例如MgCl2)、缓冲液等。
本发明的试剂盒还包括一对以上引物(例如用于嵌套扩增)，当一种引物比一个以上引物对参见。所述试剂盒还可含有多个探针。
寡聚探针和引物
结合上述本发明的核酸检测方法，可用SARSV基因组具有序列类似性或互补性的寡聚物。这里提到的SARSV基因组序列来产生探针和引物，用于检测试验样品中的核酸的试验中。可根据感兴趣多核苷酸的保守性核苷酸区域或感兴趣多核苷酸的非保守性核苷酸区域来设计探针。设计能使测定最优化的探针的方法是精通此领域的技术人员已知的。通常，当需要最高特异性时可根据非保守性区域或独特区域产生核酸探针，当对(例如)多基因家族不同成员或如小鼠和人等相关动物内关系最密切的核苷酸区域进行检测时，可根据保守性区域产生核酸探针。
可以如本文所示根据SARSV基因组和/或优选SARSV基因组的保守区，和/或尤其是这里所述的引物和探针序列，可制备含有大约8个或更多核苷酸的寡聚物，这种寡聚物可与SARSV RNA的正链或其互补物杂交，以及与SARSV cDNA杂交。这些寡聚物可作为检测(包括分离和/或标记)含有SARSV核苷酸序列的多核苷酸的探针，和/或作为转录和/或复制靶SARSV序列的引物。所述寡聚物含有靶向多核苷酸序列，该序列由与靶SARSV核苷酸序列互补的核苷酸构成；该序列足够长并与SARSV序列互补可形成此目的所需的足够稳定的双链体。例如，如果目的是通过固定来分离含有靶SARSV序列的分析物，所述寡聚物可含有足够长并与靶SARSV序列足够互补的多核苷酸区域，以在分离条件下通过分析物与寡聚物的结合获得能将分析物固定在固体表面的双链体充分稳定性。同样，例如，如果该寡聚物是作为引物来转录和/或复制分析物多核苷酸中的靶SARSV序列，则该寡聚物中将含有足够长与靶SARSV序列充分互补的多核苷酸区域，以在聚合条件下使聚合剂从含有该靶序列的稳定双链体形式的引物连续复制。还例如，如果该寡聚物被用作标记探针或将与多聚体结合，靶向多核苷酸区域将足够长并有充分的互补性以与标记探针和/或多聚体形成稳定的杂交双链体结构以能够检测该双链体。所述寡聚物最少含有约4个与靶SARSV序列互补的连续核苷酸；通常，所述寡聚物含有至少约8个与靶SARSV序列互补的连续核苷酸，优选含有与靶SARSV序列互补的至少约14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，高达有约50、75、100、200个连续核苷酸或更多。
通常，在基于扩增的方法(例如PCR、RT-PCR、TMA)中，寡聚物将被用作引物组，这种引物组中的一成员与SARSV基因组更加保守的部分(在冠状病毒中)具有序列类似性或互补性，而该引物组的其它成员与不十分保守的部分具有序列类似性或互补性。该引物组可用来以此领域熟知的方式扩增靶区域。通常，5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)是最保守的区域。图8显示了几种冠状病毒5’UTR的对比。图10显示了几种冠状病毒3’UTR的对比。图9和11分别示出了用来扩增5’UTR和3’UTR优选引物的序列。基于这里提供的序列对比容易设计其它引物和探针。
然而，所述寡聚物不需要仅由与靶SARSV序列互补的序列构成。此外它还含有适合该寡聚物使用目的的核苷酸序列(例如启动子)或其它部分。例如，如果该寡聚物被用作通过例如PCR扩增SARSV序列的引物，它们可含当为双链体形式时形成限制性酶切位点的序列，该位点有利于颗粒扩增的序列。再例如，如果该寡聚物将被用作杂交测定的“捕获探针”，它们还将包含与含有与靶SARSV序列互补的寡核苷酸序列的寡聚物偶联的结合伴侣。所述寡聚物可包含或偶联于本领域已知的其它有用类型的分子或序列，并适合用于各种目的，包括标记核苷酸探针。
表4(SEQ ID NOS：1021-6020)显示了用于诊断和筛选方法的有效扩增SARSV核酸的正向和反相引物。
为诊断和筛选，优选的检测SARS核酸的引物和探针是SEQ ID NOS：7332-7336(正向引物)、SEQ ID NOS：7337-7341(反向引物)和SEQ ID NOS：7342-7352(探针)。这些引物和探针可有效检测3’UTR序列。
上述任何正向引物可与上述任何反向引物组合使用以扩增SARSV核酸。扩增产物可用上述任何探针检测(或捕获)。特别优选的正向和反向引物以及用来检测扩增产物的探针的组合是：正向SEQ ID NO：7332，反向SEQ ID NO：7337、7338、7339或7341，探针SEQ ID NO：7342；正向SEQ ID NO：7333或7334，反向SEQ ID NO：7340以及SEQID NO：7343-7351中任一作为探针；正向SEQ ID NO：7335，反向SEQ ID NO：7340或7341，探针可为SEQ ID NO：7342-7352中任一。正向和反向引物以及合适探针的其它组合是精通此领域的技术人员通过上面的信息不难确定的。
用于诊断和筛选的其它优选的检测SARS核酸的引物和探针是SEQ ID NOS：7353-7362(正向引物)、SEQ ID NOS：7363-7373(反向引物)和SEQ ID NOS：7374-7385(探针)。这些引物和探针可有效检测5’UTR中的序列。
上述引物可组合使用以扩增SARSV核酸，组合如下：正向引物为SEQ IDNO：7353-7356中任一，反向引物为SEQ ID NO：7363-7366、7368中任一，扩增产物用探针SEQ ID NO：7374检测(或捕获)；正向引物为SEQ ID NO：7357-7362中任一，反向引物为SEQ ID NO：7367、7369-7373中任一，扩增产物用探针SEQ ID NO：7375-7385检测(或捕获)。特别优选的正向和反向引物以及探针的组合是：正向引物是SEQ IDNO：7353-7356，反向引物为SEQ ID NO：7363-7366中任一，探针是SEQ ID NO：7374；正向引物是SEQ ID NO：7357-7358，反向引物是SEQ ID NO：7367、7369，探针是SEQID NO：7375或7376；正向引物是SEQ ID NO：7357-7359，反向引物是SEQ ID NO：7367、7369或7370，探针是SEQ ID NO：7375或7376。更优选的组合是SEQ ID NO：7353或7354与SEQ ID NO：7363或7364，探针是SEQ ID NO：7374。正向和反向引物以及合适探针的其它组合是精通此领域的技术人员通过上面的信息不难确定的。在SARS和一些其它冠状病毒的3’UTR(从3’端开始的约70-80个碱基)中有一个特别保守的八个核苷酸的序列(SEQ ID NO：7386)在鉴定SARSV时特别有用。含有该区域的引物宜与SARS更具特异性的序列区域的反向引物相组合。
除上文所述，在SARSV中已经鉴定到冠状病毒特征性的基因间序列(IS)(见上文)。IS至少包括序列ACGAAC(SEQ ID NO：7293)，该序列出现在病毒基因组各个开放读框(ORF)上游。包含IS的5’UTR在各个病毒mRNA的5’末端或毗邻IS的部位被剪接。因此，含有IS或其互补物的引物可用来扩增病毒核酸，包括从病毒RNA制造的cDNA。因此，本发明包括一组引物，其中一个引物包含ACGAAC(SEQ ID NO：7293)或其互补物(SEQ ID NO：7387)，一个引物包含来自SARS基因组的任何合适序列或互补序列。用来检测和/或捕获病毒RNA或从病毒RNA制造的cDNA的有用的探针可包含IS序列，或其互补物，如上所述。
一组用来扩增SARS序列(尤其是通过RT-PCR)的引物采用SEQ ID NOs 6562、6563、6564和6565。当然，6562是6564是正义引物，6563和6565是反义引物。引物SEQID NOS：6562和6565可用于第一次扩增，而第二次嵌套扩增采用了引物SEQ IDNOS：6563和6564。在本发明的一些实施方案中，这四种引物都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列(尤其是通过RT-PCR)的试剂盒采用SEQ ID NOs6567和6568作为引物，SEQ ID NO 6566作为探针(尤其是用例如TAMRA和/或FAM标记的)来扩增序列。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列(尤其是通过RT-PCR)的试剂盒采用SEQ ID NOs7395和6568作为引物，SEQ ID NO 6566作为探针(尤其是用例如TAMRA和/或FAM标记的)来扩增序列。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增SARS序列(尤其是核衣壳基因)的试剂盒采用SEQ ID NOs 6560和6561作为引物。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增SARS序列的试剂盒采用SEQ ID NOs 6496、6497、6562、6563、6564和6565作为引物。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增SARS序列的试剂盒采用SEQ ID NOs 6562、6563、6564和6565作为引物。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增SARS序列的试剂盒采用SEQ ID NOs 6500、6501、6502和6503作为引物。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增SARS序列的试剂盒采用SEQ ID NOs 6496、6497、6500、6501、6502、6503、6562、6563、6564和6565作为引物。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列(尤其是通过实时PCR，例如TaqManTM)的试剂盒采用SEQ ID NOs 6567和6568作为引物，SEQ ID NO 6566作为探针(尤其是用例如TAMRA和/或FAM标记的)来扩增序列。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列(尤其是通过实时PCR，例如TaqManTM)的试剂盒采用SEQ ID NOs 7395和6568作为引物，SEQ ID NO 6566作为探针(尤其是用例如TAMRA和/或FAM标记的)来扩增序列。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列的试剂盒采用SEQ ID NOs 6562、6565和6568作为引物，SEQ ID NO 7396和7397作为探针(尤其是用例如TAMRA和/或FAM标记的)来扩增序列。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
一种用来扩增和检测SARS序列的试剂盒用含有SEQ ID NO：9780的寡核苷酸作为正向引物，用含有SEQ ID NO：9781的寡核苷酸作为反向引物，并用含有SEQ ID NO：9782的寡核苷酸作为探针。
优选的用于RT-PCR和LightCycler分析的序列包括SEQ ID NOs 6562、6568、6565、7396和7397。在本发明的一些实施方案中，这些引物和探针都被排除在外。
通过本领域已知的制备这种寡聚物的方法，其中包括例如包括切除、转录或化学合成方法。根据目的选择寡聚物的靶向多核苷酸与之互补的基因组的靶序列和/或区域。例如，如果目的是要筛选生物样品(例如血液、呼吸道材料、肝、肺)中是否存在SARSV，优选将寡聚物作为探针和/或引物并将其与SARSV基因组的保守性区域杂交。所述寡聚物可结合的SARSV基因组的一些保守性区域已在本文中叙述，例如5’UTR和3’UTR。
在基础核酸杂交试验中，单链分析物核酸(DNA或RNA)与核酸探针杂交，并检测所得双链体。SARSV多核苷酸(天然的或延伸的)探针的长度能够通过杂交检测独特的病毒序列。虽然6-8个核苷酸是可工作的长度，但含有10-12个核苷酸的序列是优选的，含有约13、14、15、16、17、18、19、20或21个或更多核苷酸似乎是最佳的。优选这些序列将来自缺乏异质性的区域。可用常规方法制备这些探针，其中包括自动寡核苷酸合成法。有用的探针例如可以是那些衍生自SARSV基因组不十分保守的区域的探针。通过这里提供的序列对比以及其它熟知的技术不难确定SARS基因组中不十分保守的区域。与SARSV基因组任何独特部分互补的序列也令人满意。为用作探针，最好是完全互补的，但当片段长度增加时这不是必需的。
为使用这种探针来检测SARSV多核苷酸的存在情况(例如筛选被污染的血液或诊断被感染的个体)，如果需要可对待分析的生物样品(包括但不限于血液、血清、肺、肝、粘膜、肾、唾液或痰)进行处理以提取其中所含的核酸。可对所得样品核酸进行凝胶电泳或其它根据分子量大小进行分离的技术；或者，可对核酸进行斑点印迹而无需按大小分离。为与探针的寻靶序列形成杂交双链体，核酸分析物的靶区域必需为单链形式。当该序列天然以单链形式存在时将不需要进行变性。然而，当序列以双链形式存在时，需要将该序列变性。变性可用本领域已知的各种技术进行。变性之后，将核酸分析物和探针在促进探针中的靶序列与分析物中假定的靶序列形成稳定杂交体的条件下培育，并检测所得含有探针的双链体。
所得双链体(如果存在)的检测通常用标记的探针完成；或者，探针也可不被标记，但可通过与被标记的配体特异性结合来直接或间接检测。合适的标记物以及标记探针和配体的方法是本领域已知的，其中包括例如放射性标记(可用已知方法(例如缺口平移或激酶)掺入)、生物素、荧光基团、化学发光基团(例如二氧杂环丁烷，尤其是触发的二氧杂环丁烷)、酶、抗体等。
用来结合分析物的探针区域可制成与SARSV基因组完全互补。因此，通常需要高严格条件以防止假阳性。然而，只有当探针与缺乏异质性的病毒基因组区域互补时才需要使用高严格条件。杂交的严格性是由杂交过程和洗涤过程中的多种因素确定的，其中包括温度、离子强度、时间长短和甲酰胺浓度。这些因素列在列入ManiatisT.(1982)。
也可使用这种基础方法的变化，这些变化是本领域已知的，其中包括那些有利于从外源物质分离待检测的双链体的变化和/或从标记的部分放大信号的变化。为了解这些改变可参阅，例如：Matthews和Kricka(1988)，Analytical Biochemistry 169：1；Landegren等，(1988)，Science 242：229；和Mittlin(1989)，Clinical Chem.35：1819。这些文献和下列公开描述了测定模式，被纳入本文作为参考。适合在这些测定方法中检测SARSV的探针包括与靶SARSV多核苷酸序列杂交形成带有分析物链双链体的序列，其中该双链体在所述检测系统中足够稳定以待检测。
一个合适的变化叙述在，例如，美国专利No.4,868,105(1989年9月9日提交)和EPO公开No.225,807(1987年6月16日公开)中。这些公开描述了一种溶液相核酸杂交检测法，其中，核酸分析物与标记探针组和捕获探针组杂交。探针-分析物复合体通过与固体支持的捕获探针(与捕获探针组互补)杂交而偶联。这样可将核酸分析物作为固相复合体从溶液中除去。分析物为固相复合体形式有利于该测定法中随后的分离步骤。标记探针组与通过与固相/分析物复合体杂交而结合的标记的探针互补。
聚合酶链式反应(PCR)是一种扩增核酸中所含所需核酸序列(靶)或其混合物的技术。在PCR中，使用一对过量引物与靶核酸的互补链杂交。引物将以靶核酸作为模板在聚合酶的作用下各自延伸。延伸产物自身又变为靶序列，然后从原始靶链上解离。新的引物然后被杂交并在聚合酶的作用下延伸，该循环被重复以几何级地增加靶序列分子的数量。PCR揭示在美国专利Nos.4,683,195和4,683,202，它们被纳入本文作为参考。
连接酶链式反应(LCR)是核酸扩增的另一种方法。在LCR中，使用含有两种一级(第一和第二)探针以及两种二级(第三和第四)探针的探针对，这些探针都以超过靶的摩尔量使用。第一探针与靶链的第一区段杂交，第二探针与靶链的第二区段杂交，第一和第二区段是毗连的，所以一级探针以5’磷酸-3羟基的关系相互毗连，从而连接酶可将这两个探针共价融合或连接形成融合产物。此外，第三(二级)探针可与第一探针的一部分杂交，第四(二级)探针可以类似的毗连方式与第二探针的一部分杂交。当然，如果靶最初为双链，则第一种情况下二级探针也将与靶的互补链杂交。一旦连接的一级探针链与靶链分离，它将与第三和第四探针杂交，使它们连接形成互补的二级连接产物。重要的是要认识到，连接产物与靶或其互补物功能等价。通过多轮反复杂交和连接循环可实现靶序列的扩增。该技术更详细叙述于K.Backman的EP-A-320 308(1989年6月16日公开)和K.Backman等的EP-A-0439182(1991年7月31日公开)，它们被纳入本文作为参考。
为扩增mRNA，在本发明范围内是将mRNA逆转录成cDNA，然后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增；或在两个步骤中都采用单个酶，如美国专利No.5,322,770所述，该专利本纳入本文作为参考；或将mRNA逆转录成cDNA，然后进行不对称的缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)，如R.L.Marshall等所述[PCR Methods and Applications4：80-84(1994)]，也被纳入本文作为参考。
TMA详细描述于，例如，美国专利No.5,399,491，其内容被全文纳入本文作为参考。在一个常规测定法的实施例中，将怀疑含有SARSV靶序列的分离的核酸样品与含有缓冲液、盐、楣、核苷酸三磷酸、引物、二硫苏糖醇和亚精胺的缓冲浓缩物混合。将反应物任选在约100℃下培育约2分钟以使所有的二级结构变性。冷却至室温后，加入逆转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H，并将混合物在37℃培育2-4个小时。然后可通过以下过程测定反应：使产物变性，加入探针溶液，在60℃培育20分钟，加入能选择性水解未杂交探针的溶液，将反应物在60℃培育6分钟并在光度计中测量剩余的化学发光。
通常，TMA包括以下步骤：(a)从怀疑被SARSV感染的感兴趣的生物样品分离核酸，包括RNA；和(b)将以下物质混合形成反应混合物：(i)分离的核酸，(ii)第一和第二寡核苷酸引物，第一引物具有和与之复合的RNA靶序列(如果存在的话，例如(+)链)的3’末端部分充分互补复杂序列，第二引物具有和与之复合的互补物(例如(-)链)的靶序列的3’末端部分充分互补的复杂序列，其中所述第一寡核苷酸还含有5’到所述复杂序列的序列，其中包含启动子，(iii)逆转录酶或RNA和DNA依赖性DNA聚合酶，(iv)选择性降解RNA-DNA复合体的RNA链的酶活性(如RNA酶H)和(v)能识别该启动子的RNA聚合酶。
反应混合物的组分可逐步混合或一次性混合。将反应混合物在形成寡核苷酸/靶序列(包括引发DNA和合成核酸的条件(包括核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核酸三磷酸))的条件下培育足够长的时间以提供靶序列的多拷贝。反应宜在适合维持酶组分等反应组分稳定性的条件下发生，且在扩增反应过程中不需要改变或控制反应条件。因此，反应可在基本等温且离子强度和pH基本恒定的条件下发生。该反应通常不需要变性步骤来分离第一次DNA延伸反应生成的RNA-DNA复合体。
合适的DNA聚合酶包括逆转录酶，如鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶(获自例如Seikaaku America，Inc.)和莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(获自例如Bethesda Research Laboratories)。
适合掺入引物的启动子或启动子序列是被RNA聚合酶特异性识别的核酸序列(可以是天然产生的、通过合成方法制造的或是限制性消化的产物)，该酶识别并结合该序列并启动转录过程，从而制得RNA转录物。该序列可任选含有延伸超过RNA聚合酶实际识别位点的核苷酸碱基，这样可增加对降解处理的稳定性或敏感性或提高转录效率。有用的启动子的例子包括那些被某些噬菌体聚合酶识别的启动子，如噬菌体T3、T7或SP6启动子或大肠杆菌启动子。这些RNA聚合酶可通过商业来源获得，如New England Biolabs和Epicentre。
适合用于这里所述方法的一些逆转录酶具有RNA酶H活性，如AMV逆转录酶。然而，宜添加外源RNA酶H，如大肠杆菌RNA酶H，即便当使用AMV逆转录酶时。RNA酶H可购自，例如，Bethesda Research Laboratories。
用这些方法制得的RNA转录物可被作为模板以通过上述机制制造靶序列的其它拷贝。该系统是自催化的并通过自催化发生扩增，不需要重复修饰或改变温度、pH、离子强度等反应条件。
检测可用各种方法完成，其中包括直接测序、与序列特异性寡聚物杂交、凝胶电泳和质谱。这些方法可采用异质或同质模式，同位素或非同位素标记，或根本就没有标记。
与用于本发明方法的引物和/或探针结合的合适的标记物包括，但不限于：5-FAM(也称为5-羧基荧光素；也称为螺(异苯并呋喃-1(3H)，9’-(9H)呫吨)-5-羧酸，3’，6’-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素)；5-六氯-荧光素([4，7，2’，4’，5’，7’-六氯-(3’，6’-双特戊酰基荧光素基)-6-羧酸])；6-六氯-荧光素([4，7，2’，4’，5’，7’-六氯-(3’，6’-双特戊酰基荧光素基)-5-羧酸])；5-四氯-荧光素([4，7，2’，7’-四氯-(3’，6’-双特戊酰基荧光素基)-5-羧酸])；6-四氯-荧光素([4，7，2’，7’-四氯-(3’，6’-双特戊酰基荧光素基)-6-羧酸])；四甲基若丹明(TAMRA)，包括(i)5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明；Xanthylium，9-(2，4-二羧基苯基)-3，6-双(二甲氨基)和(ii)6-TAMRA(6-羧基四甲基若丹明；Xanthylium，9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-双(二甲氨基)；EDANS(5-((2-氨乙基)氨基)萘-1-磺酸)；1，5-IAEDANS(5-((((2-碘代乙酰)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)；DABCYL(4-((4-(二甲氨基)苯基)azo)苯甲酸)；Cy5(碘代二羰花青-5)；Cy3(碘代二羰花青-3)；和BODIPYTM FL(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸)。优选同时用FAM(例如在5’标记)和TAMRA(例如在3’标记)标记探针。
本发明的核酸可以溶液形式使用或与固体基质或支持物结合，例如以DNA阵列的模式。
显见，这里所述测定方法的设计可有多种变化和多种模式，这是本领域已知的。上面的叙述仅作为一种指导，精通此领域的技术人员可使用本领域熟知的技术方便地对所述方法进行改进。
SARS病毒的一种302nt扩增子被称为“BNI-1”(SEQ ID NO：9927)。已在德国汉堡的Bernhard Nocht Institute对其进行测序。2003年4月，BNI-1序列被公布与WHO网站(http：//www.who.int/csr/sars/primes/en/)以及Dorsten等，“鉴定到严重急性呼吸道综合征患者内的一种新冠状病毒”(Identification of a NovelCoronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome)，NewEnglandJournal of Medicine，在线公布于http：//www.nejm.org。这两个参考治疗被全文纳入本文作为参考。本发明的一些实施方案不包括含有SEQ ID NO：9927的核酸。本发明的一些其它实施方案不包括含有SEQ ID NO：9927的核酸。本发明的一些实施方案不包括含有SEQ ID NOs：9928-9959中任一的核酸。本发明的一些其它实施方案不包括含有SEQ ID NOs：9928-9959中任一的核酸。本发明的一些实施方案不包括这些排除部分。
免疫测定
本发明使用了各种免疫测定技术来鉴定接触过SARSV的个体，和/或含有SARSV或SARSV抗体的生物样品。
免疫测定模式
事实上，SARSV抗原可用于任何采用已知抗原来检测抗体的检测模式。所有这些检测一个共同特征是，使抗原与怀疑含有SARSV抗体的生物样品在允许抗原结合组分中存在的任何此类抗体的条件下接触。这种条件通常是生理温度、pH和离子强度，并使用过量抗原。将抗原与样本一起培育然后检测由抗原构成的免疫复合体。或者，可使用抗-SARSV抗体来检测生物样品中存在的SARSV抗原。也可将抗原/抗体检测相结合；例如，如美国专利6,630,298中所述的HCV检测。
免疫测定模式的设计有许多变化，并有多种模式，这是本领域已知的。例如，方案可使用固体支持物或免疫测定作用。许多测定法使用了标记的抗体或多肽；标记可以是，例如，酶标记、荧光标记、化学发光标记、放射性标记或染料分子。还已知放大免疫复合物信号的测定法，例如使用生物素和抗生物素蛋白的测定法以及酶标记和介导的免疫测定，如ELISA测定。
免疫测定可以是，但不限于，异质或同质模式，并且可以是标准类型或竞争类型。在异质模式中，通常使多肽与固体基质或支持物结合以便于在培育之后将样品与多肽分离。可以使用的固体支持物的例子包括硝基纤维素(例如，固定在膜上或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(例如，在片层或微量滴定孔中)、聚苯乙烯乳胶(例如，微珠或微量滴定板中)、聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidine fluoride)、重氮化纸、尼龙膜、微芯片、高密度或低密度生物芯片、重组免疫测定(RIBA)、微流化装置、微磁珠、活化珠和蛋白质A珠。例如，Dynatech Immunlon或Immunlon 2微量滴定板或0.25英寸的聚苯乙烯珠(Precision Plastic Ball)可以异质模式使用。将含有抗原性多肽的固体支持物与检测样品分离后通常需要洗涤，然后再检测结合的抗体。标准模式和竞争性模式都是本领域已知的。
在同质模式中，将检测样品与抗原混合物在溶液中培育。例如，可在将沉淀所形成的任何抗原-抗体复合体的条件下培育。这些测定的标准模式和竞争性模式是本领域已知的。
在标注模式中，将直接监控抗体-抗原复合体中SARSV抗体的量。这可通过确定标记的识别抗-SARSV抗体表位的抗-异基因(例如，抗-人)抗体是否由于形成复合体而结合来完成。在竞争性模式中，可通过监测复合体中已知量的标记的抗体(或其它竞争配体)的竞争效应来推论出样品中SARSV抗体的量。
可通过众多已知技术中的任何一种，根据所采用的模式，来检测所形成的含有抗-SARSV抗体的复合体(竞争性测定中为检测竞争抗体的量)。例如，可用与标记(例如酶标记)复合的抗异基因Ig的缀合物来检测复合体中未标记的SARSV抗体。
在免疫沉淀或凝集测定模式中，SARSV抗原与抗体反应形成从溶液或悬液中沉淀的网络，形成可见的沉淀层或沉淀膜。如果检测样品中无抗-SARSV抗体，则不会形成可视沉淀。
颗粒凝集(PA)测定至少有三种具体类型。这些测定法被用于检测涂布在支持物上的各种抗原的抗体。这种测定法的一种类型是血细胞凝集测定，使用通过将抗原(或抗体)被动吸附到红血细胞(RBC)而致敏的RBC。如果身体组成中存在其它特异性抗原的抗体，则会使涂布有纯化抗原的RBC凝聚。
为消除血凝试验中可能存在的非特异性反应，在PA中可用两种人工载体代替RBC。最参见的是乳胶颗粒。然而也可使用明胶颗粒。使用这些颗粒中任何一种的测定可基于涂有纯化抗原的颗粒的被动凝集。
SARSV抗原通常被包装成用于这些免疫测定的试剂盒的形式。这些试剂盒通常含有置于独立容器中的天然SARSV抗原、对照抗体制剂(阳性和/或阴性)、测定模式所需的标记抗体、并且当标记不直接产生信号时还含有信号发生剂(如酶底物)。天然SARSV抗原可已与固体基质结合或用结合基质的试剂分离。试剂盒中通常还包括进行测定的说明(例如纸件、磁带、CD-ROM等)。
使用天然SARSV抗原的免疫测定还被用于筛选血液以制备不存在潜在感染性SARASV的血液供给。制备血液供给的方法包括以下步骤。使献血者的身体组成，优选血液或血液组分，与天然SARSV抗原接触，以使SARSV抗体(如果存在)与SARSV抗原之间发生免疫反应。检测反应是否形成抗SARSV抗体-SARSV抗原复合体。未出现天然SARSV抗原抗体的供体血液形成血液供给。
抗体制备
如上所述，测定可使用结合于固体支持物的各种抗体，当样品中存在SARSV感染时检测抗原或所形成的抗原/抗体复合体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体制品，单特异性抗血清，人抗体，或者可以是杂交或嵌合抗体，如人源化抗体，变异抗体，F(ab’)2片段，F(ab)片段，Fv片段，单域抗体，二聚或三聚抗体片段构建物，微体，或结合待检抗原的其功能性片段。
抗体是用精通此领域的技术人员熟知的技术制造的，例如，美国专利Nos.4,011,308；4,722,890；4,016,043；3,876,504；3,770,380；和4,372,745。例如，多克隆抗体是通过用感兴趣的抗原免疫合适的动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)产生的。为增强免疫原性，可先将抗原结合到载体上然后在免疫。这种载体是本领域的一般技术人员熟知的。免疫通常这样进行：将抗原以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。2-6周后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以加强免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。然后从免疫的动物获得多克隆抗血清。
如上文所述，单克隆抗体通常可用Kohler和Milstein的方法[(1975)Nature256：495-497]或其改进方法制造。
如上所述，能够识别SARS抗原的抗体片段也包括在本发明范围之内。许多含有能够显示完整抗体分子免疫结合特性的抗原结合位点的抗体片段是本领域已知的。例如，可通过用例如胃蛋白酶切除抗体分子中不负责抗原结合的恒定区产生F(ab’)2片段来制造功能性抗体片段。这些片段将含有两个抗原结合位点，但缺乏每条重链的部分恒定区。类似地，如果需要的话，可制造含有单个抗原结合位点的Fab片段，例如，通过用木瓜蛋白酶消化多克隆或单克隆抗体。也可使用标准技术来制造仅包括重链和轻链的可变区的功能性片段，这些技术如重组法或优先蛋白水解切割免疫球蛋白分子。这些片段被称为Fv。参见，例如，Inbar等，(1972)Proc.Nat.Acad.Sci USA  69：2659-2662；Hochman等，(1976)Biochem  15：2706-2710；以及Ehrlich等，(1980)Biochem  19：4091-4096。
单链Fv(“sFv”或scFv”)多肽是一种共价连接的VH-VL异质二聚体，它是由包含通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码基因的融合基因表达的。Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA  85：5879-5883。已经描述过许多分辨和建立化学结构(接头)的方法，这些结构用来将天然凝聚但可通过化学手段分离的抗体V区域的轻和重多肽链转变为sFv分子，sFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本类似的三维结构。参见，例如，美国专利Nos.5,091,513；5,132,405；和4,946,778。可用在本领域已经描述过的方法来制造sFv分子。参见，例如，Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci USA  85：5879-5338；美国专利Nos.5,091,513；5,132,405和4,946,778。设计标准包括确定一条链的C-末端与另一条链的N-末端之间距离的大致长度，其中所述接头通常由不会卷曲或形成二级结构的小的亲水氨基酸残基形成。这种方法在本领域已经被描述过。参见，例如，美国专利Nos.5,091,513；5,132,405和4,946,778。合适的接头通常包括甘氨酸和丝氨酸交替设置的多肽链，并可包括插入的谷氨酸和赖氨酸残基以增强溶解性。
“微小抗体”或“微体”也可用于本发明。微体是sFv多肽链，在它们的C-末端包含通过绞链区与sFv分隔的寡聚化区域。Pack等，(1992)Biochem  31：1579-1584。寡聚化区域包括自联合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，可通过其它二硫键使其更加稳定。寡聚化区域被设计成与跨膜方向性折叠相匹配，该过程被认为有利于多肽体内折叠成功能性结合蛋白。通常，微体是用本领域熟知的重组方法制备。参见，例如，Pack等，(1992)Biochem  31：1579-1584；Cumber等，(1992)J.Immunology  149B：120-126。
制造SARS抗原
用于本发明的SARSV抗原通常是通过重组方法制造的。因此，用于本发明的编码SARSV抗原的多核苷酸可用标准分子生物学技术制造。例如，编码上述分子的多核苷酸序列可用重组方法获得，如从表达基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或从已知含有该基因的载体衍生出该基因。此外，可用在本领域描述过的技术，例如Houghton等的美国专利No.5,350,671中所述的用于HCV的技术，从病毒核酸分子直接分离所需基因。除克隆之外，编码感兴趣抗原的基因也可通过合成制造。可用特定序列的合适密码子(优选表达所选宿主的最佳密码子)来设计分子。完整序列通常是从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配的，并被装配成完整的编码序列。参见，例如，Edge，Nature(1981)292：756；Nambair等，Science(1984)223：1299；Jay等，J.Biol.Chem.(1984)259：6311。
因此，可从载体获得特定核苷酸序列，该载体中含有所需序列或用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术(较为合适的有定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术)全部或部分合成的序列。参见，例如，Sambrook，同上。具体地说，一种获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是使在常规自动化多核苷酸合成仪中制造的合成性重叠寡核苷酸的互补物组退火，然后用合适的DNA连接酶连接并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见，例如，Jayaraman等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4084-4088。此外，本发明也可采用寡核苷酸定向合成(Jones等，(1986)Nature 54：75-82)，现有寡核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327，和Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-1536)，以及用T4DNA聚合酶通过酶补平缺口寡核苷酸(Queen等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033)，以提供具有改变或增强的抗原结合能力和/或降低的免疫原性的分子。
一旦编码序列被制备或分离，可将该序列克隆入任何合适的载体或复制子中。精通此领域的技术人员已知许多克隆载体，选择合适的克隆载体只是一种选择问题。合适的载体包括，但不限于，质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体(包括人造染色体，如BAC或YAC)、或是当与合适控制元件结合时能够复制的病毒。
然后将编码序列置于合适控制元件控制之下，这取决于用来表达的系统。因此，可使编码序列处于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)控制之下，并任选使其处于操纵子控制之下，从而感兴趣的DNA序列被通过合适的转化子转录成RNA。编码序列可以含有或不含信号肽或前导序列，该序列随后可通过宿主的翻译后加工被除去。参见，例如，美国专利Nos.4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除了控制序列，还可以加入调控序列以根据宿主细胞的生长调节序列的表达调控序列是精通此领域的技术人员已知的，其例子包括那些根据化学或物理刺激(包括存在调节化合物)使基因表达开或关的序列。载体中也可存在其它类型的调控元件。例如，这里可使用增强子元件以提高构建物的表达水平。其例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等，(1985)EMBO J.4：761)、来自Rous肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子(Gorman等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777)以及来自人CMV的元件(Boshart等，(1985)Cell 41：521)，比如CMV内含子A序列中所含的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞内自发复制的复制起始序列的一种或多种可选标记、一个或多个限制性位点、高拷贝数潜能和强启动子。
构建了一种表达载体使特定编码序列位于含有合适调控序列的载体中，相对控制序列，编码序列的位置和方向应能使该编码序列在控制序列的“控制”之下得到转录(即，RNA聚合酶结合DNA分子的控制序列而转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰以达到最终目的。例如，某些情况下必须对序列进行修饰以使其能够以合适的取向结合控制序列；即为了维持阅读框。可在插入载体之前将控制序列和其它调控序列与编码序列连接。或者，可将编码序列直接克隆入已经含有控制序列和合适限制性位点的表达载体。
如上所述，可能需要制造感兴趣抗原的突变体或类似物。其方法描述在，例如，Dasmahapatra等，美国专利No.5,843,752和Zhang等，美国专利No.5,990,276。可通过删除编码感兴趣多肽的部分序列、或插入序列、和/或取代序列内的一个或多个核苷酸来制造用于所述测定的SARSV突变体或类似物。修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变等，是精通此领域的技术人员熟知的。参见，例如，Sambrook等，同上；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：448；Geisselsoder等，(1987)BioTechniques 5：786；Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100：468；Dalbie-McFarland等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79：6409。
分子可在许多系统内内表达，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统，这些都是本领域熟知的。
例如，昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，是精通此领域的技术人员已知的，并描述在，例如，Summers和Smith，《得克萨新农业试验现状公报》(TexasAgricultural Experiment Station Bulletin)No.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式购自Invitrogen，San DiegoCalif.(″MaxBac″试剂盒)。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统是本领域熟知的并描述在，例如，Sambrook等，同上。酵母表达系统也是本领域已知的，并描述在，例如，《酵母遗传工程》(Yeast Genetic Engineering)(Barr等编，1989)Butterworths，London。
许多用于上述系统的合适的宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系是本领域已知的并包括获自美国模式培养物保藏所(ATCC)的无限增殖细胞系，例如，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚胎肾细胞、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞，以及其它细胞。类似地，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链球菌属等细菌宿主也可用于本发明的表达构建物。用于本发明的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenuala polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Sodoptera frugiperda)和甘兰尺蠖(Trichoplusia ni)。
使用本领域熟知的各种基因输送技术可将含有感兴趣核苷酸序列的核酸分子稳定整合入宿主细胞基因组或在合适的宿主细胞内维持在稳定的附加体元件，。参见，例如，美国专利No.5,399,346。
根据所选表达系统和宿主，可通过使被上述表达载体转化的宿主细胞在表达蛋白质的条件下生长来制造分子。然后从宿主细胞分离表达的蛋白质并将其纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，可直接从培养基纯化产物。如果是非分泌的，则可从细胞裂解物分离产物。对合适的生长条件和回收方法的选择是精通此领域的技术人员已知的。
实施例
为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、昆虫细胞以及哺乳动物细胞内有效表达SARSV抗原，将下表所列的结构域克隆入表达载体。nt序列数来自SEQ ID NO：1的SARSV序列。
-RNA聚合酶1a：SARS nt 250-13398
-RNA聚合酶1b：SARS nt 13399-21470
-ORFns.包膜(与ns2、血凝素-酯酶包膜糖蛋白和刺突糖蛋白同源)：SARS nt21477-25244
-膜：SARS nt 27849-28103
-核衣壳：SARS nt 28105-29373
用PCR和合成寡聚物的组合来产生上述结构域，通过限制性位点连接入下述表达载体：
限制位点的两端   载体              启动子                 表达宿主
HindIII/SaiI     pBS24.1           ADH2/GAPDH             AD3/酿酒酵母
EcoRI/Sal||\     pBS24.1           ADH2/GAPDH/SOD融合     AD3/酿酒酵母
XbaI/SalI        pAO815            AOXI                   GS115/巴斯德毕赤酵母
EcoRI/BamHI      pCMVkm2           CMVp/增强子/内含子A    HVK-293/短暂转染
EcoRI/XmaI        pCMVIII    CMVp/增强子/内含子A      CHO稳定细胞系
                                                      Chiron采用的细胞系，
NheI/SalI         pBluBac4.5 多角体蛋白               包括：Sf9、Sf21、Tn5
IV.用RNAi治疗SARS感染
RNA干扰或″RNAi″是最初由Fire和其同事创造的术语，用来描述将双链RNA(dsRNA)引入蠕虫时可阻断基因表达的现象(Fire等，Nature 391，806-811(1998))。RNAi最可能涉及mRNA的降解，而在多生物体中导致序列特异性的转录后基因沉默。RNAi是一种引入双链RNA所引发的转录后加工，以序列特异性方式导致基因沉默。据报道，RNAi在线虫、锥虫、植物和真菌等多种物种中可自然产生。它很可能会保护生物体免遭病毒感染、调节转座子活性以及排除异常转录产物。
dsRNA可通过RNAi实现有效基因沉默的第一个证据来自对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的研究(Fire等，(1998)Nature，391：806-811和美国专利No.6,506,559)。随后在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的研究证实RNAi是一种两步机制(Elbashir等，(2001)Genes Dev.，15(2)：188-200)。首先，长dsRNA被一种称为切酶的酶切割成21-23个核苷酸(nt)的片段，称为小干扰RNA(siRNA)。然后，siRNA与核糖核酸酶复合体(称为RISC，即RNA诱导的沉默复合体)结合，使该复合体靶向互补的mRNA。RISC然后切割靶mRNA对立的互补siRNA，使该mRNA对其它RNA降解途径敏感。
RNAi是一种现象，此时，与靶DNA或RNA序列相对应的dsRNA可抑制或沉默基因表达。即便在某些情况下dsRNA可介导哺乳动物细胞内的基因特异性干扰(Wianny和Zernicka-Goetz(2000)Nature Cell Biol.2：70-75；Svoboda等，(2000)Development17：4147-4156)，但在哺乳动物体细胞内使用RNAi通常是受限的，这是由于dsRNA引发ds依赖于RNA的蛋白激酶(PKR)，进而灭活翻译因子eIF2a造成蛋白质合成的全面抑制，且经常会造成细胞凋亡(Gil和Esteban(2000)Apoptosis 5：107-114)。
今年采用对应于靶RNA或DNA序列的长度约21或22个碱基对的siRNA进行基因特异性抑制，显示可中断这些靶序列在哺乳动物细胞内的表达(Elbashir，S.M.等，Nature 411：494-498(2001))。然而，还不清楚哺乳动物细胞基因组的所有RNA或DNA序列是否都对siRNA敏感。而且也未能确定是否每种哺乳动物细胞类型都具有用siRNA导致基因特异性抑制所必需的机制。此外，限制使用siRNA至少有以下两个原因：在施用siRNA的细胞内观察到这种抑制效应的短暂特性；以及在某些情况下必需在使用之前化学合成siRNA(Tuschl T.，Nature Biotechnol.，20：446-448(2002))。同时，这些短的合成RNA不稳定也使得将这些siRNA用作长时间药物成为问题。
为克服这些限制，本发明提供了一种能对抗核酸酶降解提高稳定性同时仍保留其通过RNA干扰抑制病毒复制能力的修饰的siRNA。这种对siRNA核糖核苷酸的修饰是通过化学合成或体外转录加入一化学基团，或者可用这些方法之一制备较长的修饰的RNA并用切酶将其切割成siRNA。
尽管其它基因特异性抑制方法使用了化学修饰的核酸，如反义技术和核酶技术，但这种修饰破坏了使这些技术发挥作用所必须的关键性酶活性。就反义技术而言，对核糖核苷酸的修饰破坏了RNA酶H活性，而这样的修饰将废除核酶的催化活性。
本发明提供了一种经过修饰的能抵抗核酸酶降解的双链RNA(dsRNA)分子，其长度约为10-30个核苷酸，能够在哺乳动物细胞内灭活病毒。本发明还提供了一种通过给予经过修饰的小干扰RNA(siRNA)来灭活病毒的方法，所述siRNA经过修饰以使它们具有核酶或RNA酶抗性，并保留能够通过寻靶病毒的RNA序列而抑制病毒复制的生物学活性。
本发明还涉及制造靶向病毒RNA序列的修饰siRNA的方法，该方法包括制备在至少一条跨越病毒基因组的链中含有至少一个修饰的核糖核苷酸的修饰的双链RNA(dsRNA)；并用重组人切酶切割修饰的dsRNA片段得到一个以上修饰的siRNA。
本发明提供了含有约10-30个核苷酸的修饰的dsRNA分子，所述分子可在肝细胞或SRAS感染细胞内介导靶RNA干扰。
RNA干扰或RNAi在本文中表示序列特异性、或基因特异性异质基因的表达(蛋白质合成)，而不会造成含有该siRNA的细胞蛋白质合成全面抑制。本发明不受RNAi作用机制具体理论的限制。例如，RNAi可能参与RNA诱导的沉默复合体(RISC)中信使RNA(mRNA)的降解，阻止转录的mRNA翻译，或者它可能参与基因组DNA的甲基化、改变基因的转录。RNAi引起的基因表达缺乏可以是暂时的、持续较短时间或者可以是稳定的、永久的、持续无限长的时期。
术语RNA具有本领域公认的含义。此外，RNA在本文中还用来表示双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA)或含有单链突出端的dsRNA。dsRNA在本发明中表示短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和小发夹RNA(shRNA)，此外，RNA还用来表示信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)。
本发明涉及经过化学修饰以提供增强的抗核酸酶降解稳定性的小干扰RNA(siRNA)，但这些siRNA仍然能够结合细胞中可能存在的靶RNA。当靶RNA是病毒特异性RNA时，修饰的siRNA能够结合病毒特异性RNA并灭活病毒。本发明的修饰的siRNA含有修饰的核糖核苷酸，其中所述siRNA能抵抗酶降解，如RNA酶降解，并仍保留抑制病毒复制的能力。更具体地，修饰的siRNA在siRNA的核糖2’位置被修饰。修饰发生在所述siRNA至少一个核糖核苷酸的2’位。可利用受体结合配体与siRNA分子的结合使siRNA靶向所需类型细胞。例如，使胆固醇结合于siRNA分子的5’-末端或3’-末端得到胆固醇基siRNA，可增强其对肝细胞的寻靶。用于靶向肝脏的受体介导的siRNA的配体包括HBV表面抗原、LDL等。
更具体地说，siRNA在至少一个嘧啶、至少一个嘌呤或其组合上被修饰。然而，通常siRNA所有的嘧啶或所有的嘌呤或所有嘧啶和所有嘌呤的组合都被修饰。更优选嘧啶被修饰，这些嘧啶是胞嘧啶、胞嘧啶衍生物、尿嘧啶、尿嘧啶衍生物或其组合。还可以修饰siRNA至少一条链中的经过选择的核糖核苷酸，或者siRNA所有两条链中的核糖核苷酸都可被修饰。
含有RNA的嘧啶碱基(胞嘧啶和尿嘧啶)的核苷酸可用化学方法修饰，方法是在核糖分子的2’位加入一个能抑制RNA降解或分解的分子。可用多种不同方法形成2’-修饰的嘧啶核苷酸。该2’修饰通过使siRNA不受核酸酶活性影响或对其产生抗性而提高siRNA的稳定性。因此，该2’修饰的siRNA具有较长的血清半衰期，与未修饰的siRNA相比能抵抗降解。siRNA也可被完全或部分修饰。
当化学修饰siRNA时，优选将卤化物化学基团加入siRNA的核糖核苷酸。在卤化物中，氟是优选的分子，但氟-之外的其它化学分子，如甲基-、甲氧基乙基-和丙基-修饰也可使用。但优选的修饰是氟-修饰，如2’-氟-修饰或2’，2’-氟-修饰。因此，在本发明的一个优选实施方案中，通过在嘧啶核糖核苷酸的2’碳上加入氟分子来修饰siRNA。siRNA可被完全或部分氟化。例如，只有胞嘧啶核苷酸需要被氟化。或者，只有尿嘧啶核苷酸需要被氟化，但尿嘧啶和脆嘧啶都可被氟化。此外，只有siRNA的一条链(正义或反义链)可被氟化。即便siRNA部分2’氟化也能抵抗核酸降解。此外，需要指出的是，2’氟化的siRNA对细胞无毒，鉴于氟化学物质对活的生物体通常是有毒的，所以这是一个意外的结果。
设计本发明的siRNA能与靶核苷酸序列相互作用。最优选这种靶核苷酸序列是希望抑制其基因表达的致病因子或病原体的序列。更优选这种靶核苷酸序列是病毒基因组中的序列，此外这种病毒基因组来自选自下组的RNA病毒或DNA病毒：丙肝病毒(HCV)、甲肝病毒、乙肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、埃博拉病毒、流感病毒、轮状病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、超级肺病毒和冠状病毒。最优选的病毒是SARS病毒。
修饰的siRNA可用许多方法制备，如通过化学合成、T7聚合酶转录、或用切酶修饰用上述两种方法之一制备的修饰的长双链RNA(dsRNA)。切酶可用来切割含有约500-1000个碱基对的dsRNA，产生长度约21-23个碱基对的dsRNA混合群。此外，采用切酶方法的一个意想不到的结果是，切酶将切割经过修饰的dsRNA链，如2’氟化修饰的dsRNA。建立这种方法之前，曾认为切酶不能切割修饰的siRNA。切酶法可用购自Gene Therapy Systems(San Diego，CA)的Dicer siRNA Generation Kit进行。
小干扰RNA(siRNA)在这里被定义为长度约为10-30个核苷酸，更优选有12-28个核苷酸，更优选有15-25个核苷酸，再更优选有19-23个核苷酸，最优选有21-23个核苷酸的双链-或单链RNA。用于本文的siRNA的长度是用RNA一条链的长度确定的。例如，长度为21个核苷酸(21-mer)的siRNA可含有两条相对的RNA链，它们一起退火得到19个毗连的碱基对。该分子一端残留的两个核苷酸不会与相对的链一起退火，从而形成“突出端”。突出端可以在dsRNA的5’或3’端。优选突出端在RNA的3’端。相对的两条链长度不同的双链RNA将以两条链中较长的一条来表示。例如，由长21个核苷酸的一条链与长20个核苷酸的相对链退火形成的dsRNA在本文认为是21-聚体(21-mer)。
优选本发明的siRNA将含有约2-4个碱基的3’突出端。更优选该3’突出端长度为2个核苷酸。更优选3’突出端所含的2个核苷酸是尿嘧啶(U)。
一实施方案中，本发明提供的RNA分子含有与靶致病因子或病毒的核苷酸序列至少80％相同的核苷酸序列。优选本发明的RNA分子与靶制剂或病毒的核苷酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在实践中，采用已知的计算机程序，如Bestfit程序(Wisconsin序列分析软件包，Unix版本8，遗传学计算机组，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)，来测定任何特定核酸分子是否与靶致病因子或病毒的核苷酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))可发现两个序列之间同源性的最佳区段。当使用Bestfit或任何其它序列对比程序来测定某具体序列是否与本发明的参考序列例如95％相同，需要设定参数，当然，相同百分比是用参考核苷酸序列全长来计算的，此时，同源性缺口多至参考序列核苷酸总数的5％是允许的。
本发明提供了一种灭活患者中靶致病因子(优选病毒)的方法，所述方法包括给予患者灭活该靶致病因子或病毒有效量的修饰的siRNA。通过给予细胞dsRNA分子或siRNA可实现对细胞中靶DNA区段的RNA干扰，其中，dsRNA分子的核苷酸序列与该靶DNA区段的核苷酸序列相对应。优选用来诱导靶RNAi的RNA分子是siRNA。
基因抑制、寻靶抑制、序列特异性抑制、寻靶RNAi或序列特异性RNAi在这里可互换使用。此外，序列特异性抑制在这里是通过分别测定含有siRNA的细胞(试验细胞)和不含相同siRNA的细胞(对照细胞)中受抑制的蛋白质的水平，并比较这两个测定值而确定的。此外，试验细胞和对照细胞必需来自同一来源和同一动物。例如，对照细胞和试验细胞可以是(但不限于)人肝细胞以及体外的细胞培养物，或者它们可衍生自肝细胞癌。此外，用于测定基因抑制水平或基因抑制量的对照细胞和试验细胞必须在相似(如果不相同)条件下测定。
短语“靶DNA区段”本文用来表示为需要抑制的编码靶蛋白质的全部或部分mRNA的DNA序列，包括内含子或外显子。DNA区段也可表示通常调节靶蛋白质表达的DNA序列，包括但不限于靶蛋白质的启动子。此外，所述DNA区段可以是或不是细胞基因组的一部分，或者可以是染色体外DNA，如质粒DNA。
本发明还涉及灭活患者体内某种病毒的方法，包括给予患者灭活该病毒有效量的修饰的siRNA。所述siRNA的长度优选约为10-30个核苷酸，更优选12-28个核苷酸，更优选15-25个核苷酸，再优选19-23个核苷酸，最优选21-23个核苷酸。该方法优选使用在所述siRNA至少一个核糖核苷酸的2’位被修饰的2’修饰的siRNA。该方法使用用选自氟-、甲基-、甲氧基乙基-和丙基-修饰的化学基团修饰的siRNA。氟-修饰是优选的，2’-氟-修饰或2’，2’-氟-修饰在本中也是有用的并且也是优选的。
修饰可以是siRNA嘧啶、嘌呤或其组合上的修饰。更优选嘧啶被修饰，如胞嘧啶、胞嘧啶衍生物、尿嘧啶、尿嘧啶衍生物或其组合。一实施方案中，至少siRNA的一条链含有至少一个修饰的核苷酸，在另一个实施方案中，siRNA的两条链都含有至少一个修饰的核苷酸。
本方法用于的致病因子或病原体，更具体说是病毒，可以是RNA病毒或DNA病毒，它们可选自下组：丙肝病毒(HCV)、甲肝病毒、乙肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、埃博拉病毒、流感病毒、轮状病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、超级肺病毒和冠状病毒。更优选的靶病毒是SARS病毒。该方法利用通过以下方法制备的siRNA：(a)鉴定病毒基因组尤其是SARS病毒中的靶核苷酸序列，以设计小干扰RNA(siRNA)；和(b)制造经过修饰以含有至少一个修饰的核苷酸的siRNA。更优选，所述siRNA包含dsRNA分子，其第一条链的核糖核苷酸序列与对应于所述病毒靶核苷酸序列的核苷酸序列相对应，第二条链含有与所述靶核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列，其中所述第一和第二条链是分离的互补链，它们相互杂交形成所述dsRNA分子，此外，其中所述第一链核糖核苷酸序列、第二链核糖核苷酸序列或第一和第二链核糖核苷酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。在该方法中，靶核苷酸序列包含SARS病毒复制必需的保守性核苷酸序列，所述保守性核苷酸序列选自SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293、SEQ ID NO：7294、SEQ ID NO：7295、SEQ ID NO：7296、SEQ ID NO：7297、SEQ ID NO：7298、SEQ ID NO：7299、SEQ ID NO：7300和SEQ ID NO：7301。优选所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：7292和SEQ ID NO：7293。更优选，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：7293。
本申请所述的siRNA可用这里所述的修饰的核糖核苷酸来制造。此外，可通过化学合成或酶合成将用于本发明方法的siRNA的修饰的核糖核苷酸掺入所述siRNA。
本申请所述的siRNA可以含有或不含5’三磷酸基团。
修饰的siRNA是通过选自静脉内注射、皮下注射、口服以及脂质体输递的方法给予的。修饰的siRNA在患者的器官、组织或肝脏、肠胃道、呼吸道、宫颈或皮肤等身体系统内凝聚。
本发明还提供了异质SARS病毒阳性细胞内病毒(如SARS病毒)复制的方法，包括用能指导经过修饰的SARS特异性siRNA表达的载体转染SARS阳性细胞。对细胞进行评价以确定细胞内的标记物是否已被修饰的siRNA抑制。
术语患者在这里可以是动物，优选哺乳动物。更优选的对象是灵长类动物，包括非人灵长类和人。术语“对象”和“患者”可互换使用。
本发明假想的处理方法可用于之前已被病毒感染的对象，或用于之前有SARS病毒感染倾向的对象。此外，本发明的方法可用于更正或补偿与使患者对病毒感染易感有关的细胞或生理异常，和/或用于减轻患者的病毒感染症状，或作为患者的预防措施。
治疗病毒感染患者的方法包括给予该对象组合物。组合物在这里可表示纯的化合物、试剂或物质，或两种或多种化合物、试剂或物质的混合物。术语“制剂、物质或化合物”在这里是指蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、聚合物或小分子，如药物。
在本发明的一实施方案中，给予对象的组合物是药物组合物。此外，所述药物组合物可经口、经鼻、肠胃外、系统内、腹膜内、局部(如通过滴剂或透皮途径)、含服或作为口腔喷雾或鼻喷雾施用。术语″肠胃外″在这里表示给药模式，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。本发明所述的药物组合物也可含有药学上可接受的载体。
″药学上可接受的载体″是指，但不限于，无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包膜物质或任何类型的配方辅料，如脂质体。
供肠胃外注射的本发明的药物组合物可含有药学上可接受的无菌的水溶液或非水溶液、分散液、悬液或乳剂，以及在使用前用可注射的无菌溶液或分散液重建的无菌粉末。合适的含水或不含水载体、稀释剂、溶剂或运载体包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯类如油酸乙酯。例如，可采用包衣材料如卵磷脂，维持分散液中所需的粒度，以及用表面活性剂维持适当的流动性。
本发明的组合物还可含有佐剂，例如，但不限于，防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。加入各种抗菌剂和抗真菌剂可确保防止微生物的作用，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。还可含有等渗剂，如蔗糖、氯化钠等。加入延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶可延缓可注射药物制剂的吸收。
一些情况下，为延长药效，可减缓从皮下或肌肉内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性较差的晶体或无定形物质的液体悬液实现。药物的吸收率取决于其溶解速度，继而可取决于晶粒大小和结晶形式。或者，可通过将药物溶解或悬浮于油性运载体来延迟肠胃外施用的药物形式的吸收。
可注射的长效形式可通过形成包含在生物可降解性的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯内的药物的微胶囊材料来制造。根据药物与聚合物的比例以及所用颗粒聚合物的性质，可控制药物释放速度。其它生物可降解性的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可将药物包入与身体组织相容的脂质体或微乳剂来制造可注射的长效制剂。
可注射制剂可被灭菌，例如通过截留细菌的滤器过滤或加入可溶解或分散在无菌水中的无菌固体组合物形式的杀菌剂或在使用前加入其它可注射无菌介质。
供口服的固体剂型包括，但不限于，胶囊剂、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物可与至少一种药学上可接受的赋形剂或载体，例如柠檬酸钠或或磷酸二钙相混合，和/或a)填充剂或增容剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液滞留剂，如石蜡，f)吸收促进剂，如季铵化合物，g)湿润剂，如乙酰基乙醇和甘油的单硬脂酸酯，h)吸附剂，如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，以及它们的混合物。如果是胶囊剂、片剂和丸剂，此剂型中还可含有缓冲剂。
类似的固体组合物也可作为软和硬明胶胶囊的填充剂，使用乳糖以及高分子量聚乙二醇等作为赋形剂。
片剂、锭剂胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型可含有包衣或外壳，如肠衣以及制药领域熟知的其它涂层。它们可任选含有遮光剂，也可以是仅通过或优先通过肠道的某一部分(可任选以缓释方式)释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合的物质和蜡。
活性化合物也可以是微胶囊形式，如果合适的话还含有一种或多种上述赋形剂。
供口服施用的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物，所述液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃甲醇，聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂，口服组合物中还可含有佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香基。
悬液中除了活性化合物还可含有悬浮剂，如乙氧基化的异硬酯醇、聚氧乙烯的山梨醇酯和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，以及它们的混合物。
或者，所述组合物可被增压或含有压缩气体，如氮气或液化气推进剂。液化推进介质，实际上是所有组合物是优选的，这样活性成分就不会以任何实质性程度溶于其中。增压的组合物还可含有表面活性剂。表面活性剂可以是液态或固态非离子表面活性剂，或者可以是固态阴离子表面活性剂。优选使用钠盐形式的固态阴离子表面活性剂。
本发明的组合物还可以脂质体的形式施用。如本领域已知，脂质体通常来自磷脂或其它脂类物质。可将单层或多层水合液晶分散在含水介质中来形成脂质体。可使用任何能够形成脂质体的生理上可接受并可代谢的无毒脂质。除本发明的化合物外，脂质体形式的本发明的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域已知的(参见，例如，Prescott编，Meth.Cell Biol.14：33参照以下(1976))。
精通此领域的技术人员应该知道，本发明试剂的有效量可据经验确定，并可以纯化形式或以药学上可接受的盐、酯或前药形式(如果存在这种形式)使用。所述试剂可作为与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合的药物组合物施用于需要治疗病毒感染的对象。还应该理解，当给予人类患者时，本发明试剂或组合物的日总用量将由主治医生在合理范围内确定。用于任何特定患者的特定治疗有效量将取决于各种因素：需要达到的细胞或生理反应的类型和程度；所用具体试剂或组合物的活性；所使用的具体试剂和组合物；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径，以及药物排泄速度；治疗持续时间；用于组合物或与特定试剂同时使用的药物；以及医学领域熟知的其它类似因素。例如，精通此领域的技术人员都知道以低于获得所需疗效所需剂量的水平开始给予试剂，然后逐渐升高剂量直到达到所需效果。
给药可以患者特异的方式进行，以提供用可接受的技术和本领域惯例预先确定的药剂的血液浓度。因此可改变患者的给药方案以实现对进行性血液水平的调节，该水平通过HPLC测量，级别为50-1000ng/ml。
相关领域的普通技术人员将不难理解，在不超出本发明及其任何实施方案范围的情况下，可对这里所述的方法和应用进行其它适当修改和改进。
修饰的siRNA是由Dharmacon在Lafayette CO.用常规的化学合成法制备的。siRNA双链体(GL2)中的每个C和U都被2’-F-U和2’-F-C取代，但3’-末端突出端dTdT除外。
为测试与未修饰的siRNA(siRNA)相比，2’化学修饰的siRNA的稳定性进行了以下试验。将4纳克siRNA加入体积为20μL的来自健康供体的80％人血清。将该混合物在37℃培育1分钟-10天的不同时间。对2’氟修饰的siRNA(2’-F siRNA)进行同样的处理。当培育过程结束后，将混合物置于冰上并立即通过PAGE分离，使用32P-siRNA对照。与未修饰的siRNA相比，2’修饰的siRNA是稳定的。
V.鉴定用于治疗SARS病毒感染的治疗活性剂
本发明提供了通过给予哺乳动物治疗活性剂(如小分子化合物)来治疗SARS的方法，以及鉴定用于治疗SARS病毒感染的治疗活性剂(如有效小分子)的方法。
本发明一个方面提供了鉴定治疗活性剂的方法，该方法包括：(a)使治疗活性剂接触被SARS病毒感染的细胞；(b)测定SARS相关酶的减毒作用。
在一更加具体的实施方案中，所述治疗活性剂是小分子。在其它更具体的实施方案中，所述治疗活性剂是核苷类似物(例如利巴韦林)。在其它更具体的实施方案中，所述小分子是SMIP或肽类免疫调节化合物。在其它更具体的实施方案中，所述治疗活性剂是类肽、寡肽或多肽。在另一实施方案中，SARS相关酶是SARS蛋白酶。在另一实施方案中，SARS相关酶是SARS聚合酶。再在其它实施方案中，SARS相关酶是一种激酶。再在其它实施方案中，SARS相关酶是一种蛋白酶。弗林蛋白酶抑制剂肽基氯甲基酮能阻止MHV感染后的细胞-细胞融合(de Haan等，(2004)J Virol)，这为SARS治疗提供了指导。
本发明包括一种可用来筛选和鉴定治疗SARS病毒感染的治疗活性剂的基于细胞的测定。本发明的治疗活性剂包括抑制、防止或降低SARS病毒复制的试剂。可用SARS病毒感染培养的细胞(例如VERO细胞)并评价可能的抗病毒化合物对SARS病毒感染的影响来鉴定这种试剂。测定可能的抗病毒化合物对病毒复制的作用的测定方法是本领域熟知的并可基于多种参数。
基于细胞的测定可用于高通量筛选以从含有潜在抗病毒化合物的化学品库中鉴定治疗活性化合物。适用于本发明的治疗活性化合物可抑制病毒在全细胞内复制所必需的任何SARS病毒靶。治疗剂的功效(化合物抑制或灭活靶病毒或细胞，导致培养物内病毒减少的能力)可通过评价被SARS病毒感染的细胞培养物内存活细胞的活力和/或增殖来测量。
本领域已知许多用来测量细胞存活力的方法，如测定细胞的酶、蛋白质、核苷酸三磷酸(如ATP)、核酸(如宿主细胞的mRNA(例如GAPDH)或rRNA序列)或细胞代谢物如MTT或MTS的测定法。此外，可用荧光染料(包括例如HSV纸)或非荧光染料(例如二碘化丙锭)或标记的DNA来测定细胞存活力和/或增殖现象。
或者，可通过直接测量培养物中病毒或病毒产物的量来确定化合物或测试样品的效果。测定病毒、病毒基因组或病毒产物的量的方法包括：PCR、RT-PCR、TMA、具有荧光或发光特性或酶功能(如萤光素酶、碱性磷酸酶、GFP)的报告蛋白，或可被抗体检测的蛋白质(如EGF)，它们可在细胞培养物被感染之前掺入病毒基因组。此外，病毒产物如病毒蛋白质可通过ELISA或酶活性来测定。鉴定病毒多核苷酸、病毒蛋白质和病毒蛋白质特异性抗体的方法已在上文中叙述。
潜在的抗病毒化合物以约10μM的浓度用于基于细胞的测定，并通过测量所选参数(如细胞存活力/增殖或病毒或病毒基因组或病毒或非病毒来源的病毒产物)来鉴定具有治疗功效的化合物类型。一旦认为化合物具有活性，它们可被重新合成和模拟。从被鉴定的化合物开始，在连续的最佳合成、生物增殖和建模循环中合成了许多类似物和新的化合物以使代表性结构最佳，直到体内活性被阐明并被最优化。
适用于这种测定的细胞包括上述适合生产疫苗的细胞。优选所述细胞是非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞。人胚肺成纤维细胞或正常人二倍体成纤维细胞也可用于本发明。
一实施方案中，本发明包括一种基于荧光的致细胞病性测定法来测量潜在的抗病毒化合物对基于细胞的测定的影响。这种基于荧光的致细胞病性测定法的一个例子如下所述。
微量滴定板(MTP)每孔1×104Vero细胞用确定量的SARS病毒感染，SARS病毒具有以下最佳MOI范围：5-10、10-25、25-50、50-100、100-500或500-1000PFU，培养基(补充5％FCS、2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养基)总体积为200μl，其中存在或不存在潜在的抗病毒化合物，并在37℃、5％CO2培育至少1、2、3、4、5、6或7天。MTP的每个孔用PBS(200μl)洗涤，然后加入200μl含有10μg/ml醋酸荧光素的PBS。室温培育45分钟后，以485nm激发波长和538nm发射波长测量荧光。绘制作为药物浓度函数的抗病毒活性的非线性图确定IC50值。
其它基于细胞的测定是本领域已知的，其中包括GFO检测法和Luc检测法。此外，也可用通过商业获得的Promega试剂盒来测量细胞存活力。
一实施方案中，本发明包括测量潜在的抗病毒化合物功效的方法，该方法使用RT-PCR在基于细胞的测定中检测SARS病毒RNA的水平。使用RT-PCR的方法在本领域已知。这种测定方法的一个例子如下所述。
将5×106Vero细胞接种于组织培养物。将含有细胞的烧瓶在37℃、5％CO2培育过夜。在存在和不存在潜在抗病毒化合物时用SARS病毒感染(m.o.i.＝1)细胞。任选地，可在感染之前用潜在的化合物处理细胞。无论何种情况都进行了合适的对照细胞测定。
感染后2小时(UL54)、12小时(UL8)和16小时(UL13)纯化被感染细胞的RNA，定量测定(Qiagen)RNA纯度(Rneasy试剂盒；40μl洗脱)(260nm吸收)。按照SuperscriptII方案(Invitrogen)，用特异性引物(2pmol，用上述引物对之一)将RNA(2μg)逆转录成cDNA。通过PCR扩增逆转录等份反应物(2μl)。合适的靶SARS基因片段，即编码酶的基因，通过PCR(Taq聚合酶，Stratagene)扩增30轮(UL54和UL8：94℃热启动，3分钟；94℃变性，1分钟，55℃退火，1分钟；72℃聚合，1分钟。UL13：94℃热启动，3分钟；94℃变性，1分钟，60℃退火，1分钟；72℃聚合，1分钟)，反应体积为100μl，含有上述合适的寡核苷酸，每种0.1nmol。20-30轮PCR循环扩增8μl等分量样品(泳道2-12)按照制造商的说明用2％琼脂糖凝胶(Invitrogen)分析。
本发明的基于细胞的测定可任选使用在人和/或动物模型(例如小鼠、非人灵长类等)中毒力降低或减毒的野生型SARS病毒的变体或衍生物。在筛选方法中使用这种减毒SARS病毒可减少与安全有关的问题以及可减少对SARS病毒致病性的警惕，并且可以消除或减少测定和筛选化合物时进行高水平控制的需求。
本发明包括一种可用来筛选和鉴定治疗SARS病毒感染的治疗活性剂的基于酶的测定方法。
本发明的一个实施方案是一种包括以下步骤的测定方法：使溶液中已知量的SARS蛋白酶与含有可检测标记和SARS蛋白酶切割位点的肽接触，其中，SARS蛋白酶活性通过测量切割产物的标记物密度来监控。
在一个更加具体的实施方案中，提供了一种测定SARS蛋白酶的方法，该方法包括使含有SARS蛋白酶的样品溶液与含有荧光供体、荧光猝灭剂和SARS蛋白质切割位点的肽接触，当所述肽被切割后可通过荧光计检测，其中，样品中的SARS蛋白酶活性通过荧光计检测的荧光量确定。
可用基于直接测量SARS蛋白酶抑制作用的测定法来筛选SRAR治疗剂。用于这种测定的蛋白质，如3C样蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶可被分离和纯化，如以下文献所述：Seybert等，J.Gen.Virol.，78：71-75，1997，Ziebuhr等，Adv.Exp.Med.Biol.，440：115-120，1998，Sims等，Adv.Exp.Med.Biol.440：129-134，1998，Ziebuhr等，J.Virol.，73：177-185，1999，Teng等，J.Virol.，73：2658-2666，1999，Herold等，J.Biol.Chem.274：14918-14925，1999；和Ziebuhr等，J.Biol.Chem.276：33220-33232，2001。此外，实施例30描述了一种用柱层析纯化SARS蛋白酶的新方法。实施例31描述了荧光共振能量转移(FRET)测定法以测量SARS蛋白酶活性。实施例31表明，基于蛋白酶的测定法如FRET测定法适用于高通量筛选，并可用来筛选候选抗病毒化合物。当存在SARS蛋白酶抑制剂化合物时，蛋白酶测定法的结果显示，与非抑制性对照化合物上不含测试化合物的阴性对照相比，某一给定时间的荧光量降低。这种方法将包括以下步骤：(a)提供含有SARS蛋白酶的测试溶液；(b)在测试溶液中加入测试化合物；(c)在测试溶液中加入SARS蛋白酶底物；和(d)测量测试溶液的蛋白水解活性。在优选的实施方案中，蛋白水解活性是通过由SARS蛋白酶的酶活性制造的荧光团产物的荧光测量的。
减毒SARS病毒变体在蛋白质的编码区或编码区通常包含一种或多种基因组修饰或突变(例如，取代、缺失、插入)。减毒突变体的具体例子包括，例如，5’-末端非编码区、前导序列、基因间区域、3’-末端非编码区、ORF 1a、ORF 1b、S基因、E基因、M基因、N基因、或ORF 1a/1b区之外的任何非结构蛋白基因中的遗传修饰。优选的减毒突变位于SARS病毒结构蛋白(例如，刺突(S))、蛋白酶或聚合酶结构域或非编码序列(例如，5’-末端非编码区、基因间序列)。此外，可在刺突蛋白中掺入或删除切割位点(参见例如，Gombold等，J.Virol.67：4504-4512，1993；Bos等，Virology 214：453-463，1995)，这样的修饰对于优化重组刺突蛋白抗原的表达也是有用的(例如，用于疫苗)。
如本发明所述，使用了多种方法以获得减毒的SARS病毒变体。这些方法包括在培养细胞(例如，哺乳动物细胞培养物，如恒河猴胎肾细胞或VERO细胞)中连续传代SARS病毒直到证实SARS病毒被减毒。病毒的连续传播可在组织培养物传代减毒能够发生的任何温度下进行，并可结合一种或多种其它诱变步骤(如化学诱变)。一次或多次细胞培养物传代后获得的SARS病毒突变体的减毒表型是精通此领域的技术人员不难测定的。减毒作用在这里是指SARS病毒在人类对象中的毒力降低。减毒作用的证据表现为病毒复制水平降低或在动物模型内毒力降低。
制造减毒SARS病毒的其它方法包括在次佳温度细胞培养物传代病毒(冷传代)，以及通过随机诱变(例如用5-氟尿嘧啶进行化学诱变)或用定点诱变将减毒突变体引入SARS病毒基因组。减毒RSV疫苗的制造和产生(其方法通常适用于SARS病毒)描述在，例如，EP 0640128，美国专利No.6,284,254，美国专利No.5,922,326，美国专利No.5,882,651。
获得安全的可免疫接种的减毒病毒所需的传代数至少部分取决于所采用的条件。定期检测SARS病毒培养物在动物(如小鼠、灵长类)中的毒力和免疫能力可方便地确定特定组织培养物和温度具体组合的参数。
在另一实施方案中，用来筛选抗病毒化合物的基于细胞的测定基于并非来自SARS病毒的基因产物(例如报道基因产物)表达的读数。特别适合本发明的基因产物包括但不限于上述测定中所用的那些。
为获得这类读数，编码所述基因报告基因产物的感兴趣的基因(GOI)必需被掺入正在复制的SARS病毒基因组或来自SARS病毒基因组的构建物(例如，SARS病毒复制子、SARS病毒缺损干扰(DI)RNA)。图13示出了报告基因掺入SARS病毒基因组的位置。优选感兴趣的异源报告基因被插入如图13所示的已有SARS病毒基因之间。例如，GOI可被插入紧跟SARS病毒基因终止密码子之后的位置(例如，ORF 1b、S、E、M、N)。插入应被定位以使SARS病毒基因mRNA转录中断最小。GOI也可被作为框内“融合子”与已有SARS病毒基因一起插入，这样可保持GOI足够的功能以进行检测。为使表达最优，也可将其它SARS病毒基因间序列(例如，SEQ ID NO：7388，含或不含其它侧翼SARS病毒序列)构建入插入的GOI之前的位置。
将GOI掺入SARS病毒可有精通此领域的技术人员用各种技术完成。例如，一个优选的方法是目标RNA重组，其优点在于能够在细胞内重组冠状病毒RNA(参见例如Fischer等，J.Virol.71：5148-5160，1997；Koljesar等，J.Vet.Sci.2：149-157，2001)。制造了含有GOI及侧翼SARS病毒序列(例如，基因间序列)的所需构型(例如，SARS病毒缺损干扰RNA的cDNA)的构建物，从而可在真核细胞内或在体外直接转录RNA，并将其转染入也被SARS病毒感染的易感细胞。根据GOI编码标记的表达来鉴定含有GOI的重组病毒。
或者，将GOI掺入SARS病毒可由精通此领域的技术人员完成，方法是首先装配SARS病毒的全长cDNA，它可用来在体内(例如从RNA聚合酶II启动子)或体外(例如从噬菌体启动子)制造感染性RNA转录物。尽管基因组长度相对较长，精通此领域的技术人员用标准分子生物学和反向遗传学技术以及SARS病毒的基因组序列现在已不难获得这类全长cDNA克隆的装配物(参见例如，Thiel等，J.Gen.Virol.，82：1273-1281，2001；Almazan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5516-5521，2000；Thiel等，(2003)J Gen Virol 82：1273-1281；Yount等，(2003)PNAS USA 100：12995-13000)。可用各种技术将异源GOI插入全长SARS病毒基因组cDNA，例如，连接入天然或合成的限制位点、PCR(例如重叠PCR)和重组。
还可以用含有感兴趣基因的较小的SARS病毒重组体来进行抗病毒筛选，但是，需要进一步修饰以最大程度减少或消除病毒诱导的细胞病变(例如CPE)。SARS病毒的非细胞病变衍生物可由精通此领域的技术人员用各种方法获得。例如，可将可选择标记(例如药物抗性标记)作为GOI掺入SARS病毒基因组以制造上述感染性病毒(参见例如，Perri等，J.Virol.，74：9802-9807，2000)。含有GOI的感染性SARS病毒或感染性基因组RNA/cDNA然后可用来感染/转染细胞(例如VERO)，之前可进行诱变或不进行诱变，然后用合适的选择法选择感染的细胞。只有那些含有同时具有可选择标记和一种或多种使病毒呈非细胞病变性的突变的SARS病毒的细胞才能在选择过程中存活并生长。用各种检测技术(例如PCR、Northern印迹)容易检测这些细胞内活性SARS病毒的复制，这种细胞可作为基于细胞的筛选测定的底物。导致所需非细胞病变性SARS病毒表型的突变可包括核苷酸取代、删除或添加，它们可发生在基因编码区或非编码区(例如，5’或3’-末端非编码区、基因间区域、ORF1a、ORF1b、蛋白酶结构域、聚合酶结构域)。通过与野生型(如亲代)SARS病毒的序列交换和显示的表型变化，以及对合适的基因组区域进行测序，不难鉴定这种突变。能减少或消除细胞病理作用的类似突变也可用于SARS病毒衍生的复制子载体中，通过用SARS病毒复制子进行类似的直接筛选，或根据上述感染性SARS病毒章节中鉴定的突变来特异性构建复制子。此外，这种突变体可作为本申请其它地方所述减毒SARS病毒衍生物的基础。
或者，除了使用感染性SARS病毒或其衍生物来进行基于细胞的筛选测定，可构建并使用繁殖缺陷型“复制子”。这种复制子保留所有蛋白质编码序列和RNA复制及在细胞内表达所必需的顺式复制序列，但删除了一个或多个包装后代SARS病毒所需的序列或基因(参见例如Curtis等，J.Virol.，76：1422-1434，2002)。图14描述了本发明所述SARS病毒复制子的代表性例子。例如产生了一种SARS病毒cDNA构建物，该构建物缺乏一个或多个(或所有)结构性蛋白质编码基因，其中缺少的SARS病毒基因被GOI代替，同时保留表达GOI所必需的所有转录信号。操作性连接于SARS病毒复制子cDNA构建物的是RNA聚合酶启动子，它可被用来在体内(例如，RNA聚合酶II启动子)或体外(例如，噬菌体启动子)转录复制子RNA。可通过转染将SARS复制子作为RNA或DNA(取决于所选启动子)引入易感细胞，并用转染的细胞来评价抗病毒化合物。通过掺入一种或多种突变以使复制子对细胞没有细胞病变作用(见上文)，就不需要在每次测定时都进行核酸转染。
或者，SARS病毒复制子可被包装入能够感染细胞的病毒样颗粒，而不需要转染核酸分子。对复制子包装的要求是，从复制子删除的实质性SARS病毒基因功能(例如一种或多种结构蛋白)在含有该复制子的细胞内以反式提供。精通此领域的技术人员可用各种方法来包装复制子RNA(参见例如，Curtis等，同上：Ortego等，J.Virol.，76：11518-11529，2002)。例如，可使用组成型或诱导型表达所需SARS病毒基因功能的稳定转化的细胞系。或者，所需SARS病毒基因功能可通过被掺入含有复制子的细胞的病毒载体表达。或者，含有所需基因的缺损干扰(DI)SARS病毒衍生的RNA可被掺入含有复制子的细胞。用于弥补丧失的复制子功能的这种DI构建物通常称为缺损辅助性RNA或缺损辅助者(defective helper)。
对本发明所述基于细胞的抗病毒筛选测定法有用的另一种构型利用编码GOI的SARS病毒衍生的DI RNA(参见例如Stirrups等，J.Gen.Virol.，81：1687-1698，2000；Liao等，Virology 208：319-327，1995)。将SARS DI，作为与RNA聚合酶II启动子连接的cDNA或作为体外转录的RNA，导入到亦被SARS感染的易感细胞中而得以在测定中得到GOI报告基因产物的读数。
用来快速鉴定冠状病毒复制酶抑制剂的基于复制子的系统描述于Hertzig等，(2004)J Gen Virol DOI 10.1099/vir/0/80044-0。简言之，该系统采用可稳定维持在真核细胞内的非细胞病变性可选择复制子RNA。该复制子RNA介导的报告基因表达可作为冠状病毒复制标记，同时报告基因的表达可用来在体外检测测试化合物的抑制作用，从而无需培养感染性病毒便能够高通量筛选复制酶抑制剂。优选的复制子RNA在复制酶基因中含有新霉素抗性基因，其下游的报告基因(例如GFP)可通过复制酶介导的亚基因组mRAN合成而表达。
VI.治疗SARs病毒感染的组合物和方法
本发明涉及治疗和/或预防SARS的组合物和方法。本发明还包括通过给予治疗有效量的至少一种抗病毒化合物来治疗和/或预防SARS的方法，这些化合物描述在表1和表2所列的美国专利和公开的国际专利申请中。在该方法的一个实施方案中，所述抗病毒化合物是小分子。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。再在一实施方案中，所述抗病毒蛋白酶抑制剂是3C样蛋白酶抑制剂和/或木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂。洛匹那韦/利托那韦(Kaletra)蛋白酶抑制剂与利巴韦林联合治疗显示出良好的临床效果(Chu等，(2004)Thorax 59：252-256)。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂。在另一实施方案中，第一抗病毒化合物蛋白酶抑制剂是与第二抗病毒化合物依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂一起施用。本发明还提供了与至少一种抗病毒化合物(例如来自表1和表2所列文献中叙述的抗病毒化合物)组合施用甾类消炎药。类固醇与利巴韦林组合治疗已经描述于Fujii等，(2004)J Infect Chem其它10：1-7。皮质激素与干扰素α-1组合治疗也已被报道(Loutfy等，(2003)JAMA 290：3222-3228)。
本发明还提供了通过吸入施用治疗有效量的至少一种抗病毒化合物来治疗和/或预防SARS的方法，这些化合物描述在表1和表2所列的美国专利和公开的国际专利申请中。另一方面，所述抗病毒化合物可与SMIP、SMIS或其它免疫调节化合物(如表32和表33中的那些)组合施用。在该方法的一个实施方案中，所述抗病毒化合物是小分子。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。再在一实施方案中，所述抗病毒蛋白酶抑制剂是3C样蛋白酶抑制剂和/或木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂。在另一实施方案中，第一抗病毒化合物蛋白酶抑制剂是与第二抗病毒化合物依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂一起施用。本发明还提供了与至少一种抗病毒化合物(例如来自表1和表2所列文献中叙述的抗病毒化合物)组合施用甾类消炎药。所述甾类消炎药可通过吸入施用以达到局部效果，或者例如通过口服或静脉内途径实现全身吸收给药。
本发明还提供了一种治疗SARS感染的方法，包括单独施用或与抗病毒化合物组合或与SARS疫苗组合施用小分子免疫增强剂(SMIP)化合物。再在一实施方案中，所述SMIP是这里所述的化合物或表32中所列的化合物。
本发明还提供了一种治疗SARS感染的方法，包括单独施用或与抗病毒化合物组合施用一种免疫抑制剂化合物，任选小分子抑制剂(SMIS)化合物。再在一实施方案中，所述免疫抑制剂化合物如本文所述或列在表33中。
本发明还提供能够影响患者炎症反应的肽类免疫调节组合物，包括寡肽和多肽。一实施方案中，所述肽类免疫调节组合物能够刺激人细胞制造细胞因子。在另一实施方案中，所述肽类免疫调节组合物能够降低人体内的细胞因子水平。优选的肽类免疫调节组合物的例子包括表35中列出的那些，以及TGFβ2、TGFβ1、TGFβ3、胸腺五肽(TP5)、β-巯丙酰-精氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-缬氨酰-酪氨酰-半胱氨酸酰胺、初乳激肽、乳铁蛋白(LF)、Cyclolinopeptide A(CLA)和促吞噬肽(TKPR)。本发明的肽类免疫调节组合物可单独使用或与其它制剂优选抗病毒化合物组合使用治疗SARS。
本发明还提供了一种供消费者使用以治疗和/或预防SARS的药盒。这种药盒中装有：a)含有治疗有效量的至少一种抗病毒、SMIP、SMIS或其它免疫调节化合物(来自表1、表2、表34和表35所列美国专利和公开的国际专利申请中描述的那些)以及药学上可接受的载体、运载体或稀释剂的药物组合物；b)容纳所述药物组合物的容器；并任选包含，c)描述使用该药物组合物来治疗和/或预防SARS的方法的说明。所述药盒可任选含有多种治疗SARS的化合物，其中，所述抗病毒化合物选自3C样蛋白酶抑制剂和木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂。再在一实施方案中，所述药盒含有的抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂。当该药盒含有一种以上抗病毒、SMIP、SMIS或其它免疫调节化合物时，该药盒中所含的化合物可任选组合成一种药物组合物。
本发明另一方面提供了至少一种抗病毒、SMIP、SMIS或表1、表2、表34和表35所列美国专利和公开的国际专利申请中描述的其它免疫调节化合物在制造用于治疗或预防SARS的药物中的应用。
本发明的另一方面提供了至少一种SMIP化合物、或至少一种免疫抑制剂化合物或至少一种SMIS化合物在制造用于治疗或预防SARS的药物中的应用。优选的SMIP、免疫抑制剂和SMIS化合物如本文所述。
除非另有说明，以下术语将用于本申请的第VI部分：“治疗SARs病毒感染的组合物和方法”，其含义如下：
“限制”、“处理”和“治疗”在这里可互换使用，包括预防性治疗(例如预防用药)和缓解性治疗，或提供预防性治疗或缓解性治疗的作用。该术语包括延缓SARS症状发展和/或减轻SARS病毒感染之后将要发生或预计要发生的此类症状的严重程度。该术语还包括缓解已有SARS症状、预防其它症状出现、缓解或预防症状潜在的代谢因素。
本发明的代表性组合物和方法包括：消除或降低脊椎动物(包括人)体内SARS病毒的病毒负荷，消除或减轻与SARS有关的症状，以及降低与SARS有关的发病率。在SARS患者群中，使用本发明的组合物和方法将导致与SARS有关的高死亡率降低。
通过施用本发明的组合物可治疗SARS病毒感染以及与SARS有关的症状。本发明的组合物可全身施用。对全身给药而言，可根据常规方法将这里所述的化合物制成适合肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内或透皮)或肠内(例如，口服或直肠)输送的形式。静脉内给药可通过一系列注射或在较长时期内连续灌输。通过注射或其它离散分配途径给药可以一定时间间隔进行，该间隔可从每周一次到每天一次或三次或更多。或者，这里所述的组合物可以循环方式施用(施用所述组合物，然后停药，然后再施用所述组合物，依此类推)。治疗将持续直至获得所需结果。
“对象”是需要用本发明的组合物、方法和试剂盒治疗的脊椎动物，包括人。除非有性别说明，术语“对象”包括雄性和雌性。
″共施用″多种抗病毒化合物的组合表示这些组分可作为一种组合物或其一部分以单一剂型的形式一起施用。″共施用″还包括单独施用多种抗病毒化合物，但作为一种治疗程序或方案的一部分。″共施用″还包括施用多种其它试剂，例如寡肽、多肽、肽类免疫调节剂、核酸、抗体或疫苗，其中所述化合物或试剂是单独施用的但是作为一种治疗程序或方案的一部分。这些组分不必同时施用，尽管如果需要的话也可以这样做。″共施用″还包括在不同时间以任何顺序单独给药。例如，患者可在早上用一种或多种组分并在晚上用一种或多种其它组分。
″抗病毒化合物″在这里表示如表1和表2所列的美国专利和公开的国际专利申请中所述的抗病毒化合物。表1、表2和表35所列的美国专利和公开的国际专利申请被纳入本文作为参考。一实施方案中，所述抗病毒化合物是依赖于RNA的RNA聚合酶。在其它优选的实施方案中，所述抗病毒化合物是3C样蛋白酶抑制剂或木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂。所述抗病毒化合物可以酸或可溶性碱金属盐或碱土金属盐的形式施用。
抗病毒化合物的精确剂量将根据给药方案而变化，特定抗病毒化合物口服效能的选择取决于对象的年龄、体重、性别和症状、待治疗病症的严重性以及其它相关医学和身体因素。因此，精确的药物有效量无法进一步具体化，并可由护士或临床医生方便确定。
通常，可选择合适的抗病毒化合物的量以降低对象的SARS病毒负荷，和/或降低与SARS有关的症状。对人类而言，抗病毒化合物的有效口服剂量通常约为每天每千克体重1.5-6000μg，优选为每天每千克体重约10-2000μg。
本领域的一般技术人员将了解，本发明的某些包含3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂和依赖于RNA的RNA聚合酶抑制剂的抗病毒、SMIP、SMIS和免疫调节化合物将含有一种或多种以呈特定立体化学、互变异构或几何构型的原子，这就产生了立体异构体、互变异构体和构型异构体。所有这些异构体及其混合物当有活性时都包括在本发明之内。本发明抗病毒化合物的晶体和无定形形式也包括在内，还包括本发明抗病毒化合物的水合物、溶剂合物和同晶形体。
本发明的SMIP化合物包括公开的美国专利Nos.4,547,511和4,738,971中描述的化合物，具有以下通式(a)：
杂环基
用来治疗对增强细胞介导的免疫的试剂有反应的疾病。
免疫刺激寡核苷酸和多核苷酸描述于PCT WO 98/55495和PCT WO 98/16247。美国专利申请No.2002/0164341描述的佐剂包括未甲基化的CpG二核苷酸(CpG ODN)和非核酸佐剂。美国专利申请No.2002/0197269描述了含有抗原、抗原性CpG-ODN和聚阳离子聚合物的组合物。
此外，公开的美国专利Nos.4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784，5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944、5,525,612、WO99/29693和U.S.Ser.No.09/361,544揭示了通式(b)的化合物：
被用作“免疫应答修饰剂”。
具有SMIP和抗病毒活性的其它化合物描述在2003年12月29日提交的题为《作为抗病毒剂和免疫增强剂的缩氨基硫脲》(Thiosemicarbazones as Anti-Virals andImmunopotentiators)的美国专利申请中，该申请的案卷编号为PP19814.004US，这些化合物具有以下结构：
式c的化合物：
其中：E不存在或选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基或取代的杂芳基；
L不存在或选自氧、氨基、烯基、取代的烯基、烷氧基、烷基氨基、氨基烷基、杂环基、碳环基或羰基；
W不存在或选自环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基或取代的杂芳基；
X不存在或选自氧、氨基、烯基、取代的烯基、烷氧基、烷基氨基、氨基烷基、杂环基、碳环基或羰基；
Y选自环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基或取代的杂芳基；
Y’不存在或选自F、Cl、Br、I、硝基、烷基、取代的烷基或任选取代的杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基；
Y”不存在或选自F、Cl、Br、I、硝基、烷基、取代的烷基或任选取代的杂环基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基；
R’是H、烷基或取代的烷基；
R”是H，或
R’和R”一起形成一杂环；
Z和Z’独立选自氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基羰基、烷氧基羰基、羧基磺酰基、甲磺酰基、取代或未取代的烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、杂芳基羰氧基、杂芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、亚磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、杂芳基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳基羰基氨基、环脒基、环烷基、环亚氨基、芳基磺酰基或芳基亚磺酰氨基；或
Z和Z’一起形成可任选被取代的杂环，
及其互变体和药学上可接受的盐、酯、或前药。
其它SMIP化合物描述于下文以及2004年1月21日提交的题为“用于增强免疫的色胺酮化合物”(Use of Tryptanthrin Compounds for Immune Potentiation)的美国专利申请1O/762873中，其中揭示了式(d)表示的化合物的通用实施方案：
Figure A20048001629002121
其中，
A、B、C、D、E、F、G和H独立选自碳和氮，或A和B和/或C和D可一起表示氮或硫；
R1、R2、R3、R4、R8和R10独立选自氢、卤素、低级烷基、烷基、取代的烷基、环烷基、杂环基、烷基杂环基、取代的杂环基、取代的烯基、氨基、(取代的烷基)(烷基)氨基、亚氨基、卤代低级烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、羟基烷硫基、硝基、烷基磺酰基、N-烷基磺酰胺、芳基烷基、芳基烷基芳基、芳基芳基、芳氧基、芳基氨基、酰基氨基、酰氧基氨基、烷基氨基酰基氨基、烷基氨基磺酰基氨基、烷基氨基、烯基氨基、二烷基氨基、烷氧基烷基氨基、烷氧基烷基杂环基、巯基烷氧基烷基、氰基、甲酰基、-COOR11(其中R11是氢、低级烷基、芳基、杂环基、单糖或二糖)或-CONR12R13(其中R12和R13独立选自氢、低级烷基、芳基、杂环基、糖类、肽或氨基酸残基)；或R2和R3一起形成一六元芳香环；
R7和R9独立选自氢、卤素、低级烷基、卤代低级烷基、环烷基、杂环基、取代的杂环基或杂环基烷基；和
R1、R2、R3、R4、R7、R8、R9和R10当它们连接的环原子是硫或双键氮时不存在；或其药学上可接受的盐、酯、或前药，
条件是，当A、B、C、D、E、F和H是碳时，R1、R2、R3、R4、R7、R8、R9和R10不全是氢。
一实施方案中，式(I)的化合物具有主链结构，其中，D是氮，A-C和E-H是碳。
一实施方案中，当D是碳时，至少R1-R4和R7-R10之一或之二不是氢。
一实施方案中，R1-R4和R8和R10独立选自下组基团中的至少两个：氢、卤素、低级烷基、环烷基、杂环基、取代的杂环基、烷基杂环基、氨基、亚氨基、卤代低级烷基、烷氧基、硝基、烷基磺酰基、芳基烷基、芳基烷基芳基、芳基芳基、芳氧基、芳基氨基、酰基氨基、酰氧基氨基、烷基氨基酰基氨基、烷基氨基磺酰基氨基、烷基氨基、烯基氨基、二烷基氨基、烷氧基烷基氨基、烷氧基烷基杂环基、巯基烷氧基烷基、氰基、甲酰基、-COOR11(其中R11是氢、低级烷基、芳基、杂环基、单糖或二糖)和-CONR12R13(其中R12和R13独立选自氢、低级烷基、芳基、杂环基、糖类、肽或氨基酸残基)；且当D是氮时R4不存在。
在另一实施方案中，4A、B、C、D、E、F、G和H独立选自碳和氮；
R1、R2、R3、R4、R8和R10独立选自氢、卤素、低级烷基、烷基、取代的烷基、杂环基、取代的杂环基、取代的烯基、(取代的烷基)(烷基)氨基、卤代低级烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、羟基烷硫基、硝基、N-烷基磺酰胺、氰基、-COOR11(其中R11是氢、低级烷基、芳基、杂环基、单糖或二糖)或-CONR12R13(其中R12和R13独立选自氢、低级烷基、芳基、杂环基、糖类、肽或氨基酸残基)。
对于这里所述的化合物：
术语″低级烷基″是指含有1-10个碳原子的支链或直链无环烷基，包括，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、n-丁基、t-丁基、新戊基等。
术语“烷基”是指不含杂原子的烷基。因此，该术语包括直链烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。该短语还包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于以下例子：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)，等等。该术语还包括环烷基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基以及被上述直链和支链烷基取代的这类环。该术语还包括多环烷基，例如，但不限于，金刚烷基、降冰片基、二环[2.2.2]辛基以及被上述直链和支链烷基取代的这类环。因此，短语未取代的烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代的烷基可结合母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子。优选的未取代的烷基包括含有1-20个碳原子的直链和支链烷基和环烷基。更优选的这类未取代的烷基含有1-10个碳原子，再优选的此类基团含有1-5个碳原子。最优选的未取代的烷基包括含有1-3个碳原子的直链和支链烷基，包括甲基、乙基、丙基和-CH(CH3)2。
短语“取代的烷基”是指未取代的上文所定义的烷基，其中一个或多个连接碳或氢的键被连接非氢和非碳原子的键替代，所述非氢和非碳原子例如，但不限于，卤化物中的卤原子，如F、Cl、Br和I；磷酸酯和烷基磷酸二烷基酯等基团中的磷原子；羟基、烷氧基、芳氧基和酯基等基团中的氧原子；硫醇基、烷基硫化物和芳基硫化物、砜基、磺酰基和亚砜基等基团中的硫原子；氨基、酰胺基、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、二酰亚胺和烯胺等基团中的氮原子；三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基等基团中的硅原子；以及各种其它基团中的其它杂原子。取代的烷基还包括其中一个或多个连接碳原子或氢原子的键被连接杂原子的键替代，所述杂原子如羰基、羧基和酯基中的氧；亚胺、肟、腙和腈等基团中的氮。优选的取代的烷基包括一个或多个连接碳或氢原子的键被一个或多个连接氟原子的键替代的烷基。取代的烷基的一个例子是三氟甲基和其它含有三氟甲基基团的烷基。其它烷基那些其中一个或多个连接碳或氢原子的键被连接氧原子的键替代的基团，因此，取代的烷基含有羟基、烷氧基、芳氧基或杂环氧基。其它烷基包括含有胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、(烷基)(芳基)胺、二芳基胺、杂环基胺、(烷基)(杂环基)胺、(芳基)(杂环基)胺或二杂环基胺基团的烷基。
术语″烷氧基″是指RO-，其中，R例如是烷基，如上文定义的低级烷基。低级烷基烷氧基的代表性例子包括甲氧基、乙氧基、t-丁氧基等。
短语“取代的烷氧基”是指RO-，其中R是例如被例如卤素取代的烷基。RO是例如OCF3。
术语″烯基″是指含有2-20个碳原子同时含有一个或多个碳-碳双键的支链或直链基团。代表性的烯基包括异戊二烯基、2-丙烯基(即烯丙基)、3-甲基-2-丁烯基、3，7-二甲基-2，6-辛二烯基、4，8-二甲基-3，7-壬二烯基、3，7，11-三甲基-2，6，10-十二烷三烯基等。
短语“取代的烯基”是指被取代的烯基，例如己-5-烯基膦酸二乙酯(diethylhex-5-enylphosponate)，以及其它被烷基或取代的烷基如二烷基磷酸酯或酯如乙酸酯取代的烯基。
短语“二烷基氨基”是指被两个烷基如C1-20烷基取代的氨基。
短语“取代的二烷基氨基”是指被例如羧酸酯、羟基或烷氧基取代的二烷基氨基。
术语“羟基烷硫基”是指连接有羟基烷基的硫代基团，其中的烷基是例如低级烷基。例子有羟基乙硫基、-SCH2CH2OH。
术语“N-烷基磺酰胺”是指-SO2NH烷基，其中烷基是，例如，辛基。
术语″炔基″是指含有2-20个碳原子并含有一个或多个碳-碳三键的支链或直链基团。代表性的炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
术语“芳基”是指不含杂原子的芳基。因此，该术语包括但不限于以下基团，如苯基、二苯基、蒽基、萘基。尽管短语“未取代的芳基”包括含有稠环的基团，例如萘，但它不包括环成员之一连接有其它基团如烷基或卤代基团的芳基，例如甲苯基在这里被认为下文所述的取代的芳基。优选的未取代的芳基是苯基。然而，未取代的芳基在母体化合物中可结合一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子。
短语“取代的芳基”具有与芳基相同的含义，而取代的烷基与烷基的含义相同。然而，取代的芳基还包括其中一个芳香性碳与上述一个非碳或非氢原子结合的芳基，还包括其中一个或多个芳基的芳香性碳与这里所定义的取代和/或未取代的烷基、烯基或炔基结合的芳基。这包括以下键排列，其中，芳基的两个碳原子与烷基、烯基或炔基的两个原子结合形成一稠环系统(例如二氢萘基或四氢萘基)。因此，短语“取代的芳基”包括，但不限于，甲苯基和羟苯基。
术语″芳基烷基″是指连接有芳基的低级烷基。代表性的芳基烷基包括苄基、苯乙基、羟苄基、氟苄基、氟苯乙基等。
短语“非稠合的芳基芳基”是指两个芳基不相互稠合或连接的基团或取代基。非稠合的芳基芳基化合物的例子包括，例如，苯联苯、二苯基二氮烯、4-甲硫基-1-苯联苯、苯氧基苯、(2-苯基乙炔基)苯、二苯酮、(4-苯基丁-1，3-二烯基)苯、苯基苄基胺、(苯基甲氧基)苯等。优选的取代的非稠合的芳基芳基包括：2-(苯基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、1，4-二苯联苯、N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]-2-[苄基氨基]乙酰胺、2-氨基-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]丙酰胺、2-氨基-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-(环丙基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-(乙基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-[(2-甲基丙基)氨基]-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、5-苯基-2H-苯并[d]1，3-二噁烯(5-phenyl-2H-benzo[d]1，3-dioxolene)、2-氯-1-甲氧基-4-苯联苯、2-[(咪唑基甲基)氨基]-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、4-苯基-1-苯氧基苯、N-(2-氨乙基)[4-(2-苯基乙炔基)苯基]羧酰胺、2-{[(4-氟苯基)甲基]氨基}-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-{[(4-甲基苯基)甲基]氨基}-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、4-苯基-1-(三氟甲基)苯、1-丁基-4-苯联苯、2-(环己基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-(乙基甲基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、2-(丁基氨基)-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙酰胺、N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]-2-(4-吡啶基氨基)乙酰胺、N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]-2-(奎宁-3-基氨基)乙酰胺、N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]吡咯烷-2-基羧酰胺、2-氨基-3-甲基-N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]丁酰胺、4-(4-苯基丁-1，3-二烯基)苯基胺、2-(二甲氨基)-N-[4-(4-苯基丁-1，3-二烯基)苯基]乙酰胺、2-(乙基氨基)-N-[4-(4-苯基丁-1，3-二烯基)苯基]乙酰胺、4-乙基-1-苯联苯、1-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]乙基-1-酮、N-(1-氨甲酰基-2-羟基丙基)[4-(4-苯基丁-1，3-二烯基)苯基]羧酰胺、N-[4-(2-苯基乙炔基)苯基]丙酰胺、4-甲氧基苯联苯基酮、苯基-N-苯甲酰胺、(叔-丁氧基)-N-[(4-苯联苯基)甲基]羧酰胺、2-(3-苯联苯氧基)乙基异羟肟酸、3-苯联苯基丙酮酸酯、1-(4-乙氧基苯基)-4-甲氧基苯和[4-(2-苯基乙炔基)苯基吡咯。
短语“非稠合的杂芳基芳基”是指非稠合的芳基芳基，其中一个芳基是杂芳基。杂芳基芳基的例子包括，例如，2-苯基吡啶、苯基吡咯、3-(2-苯基乙炔基)吡啶、苯基吡唑、5-(2-苯基乙炔基)-1，3-二氢嘧啶-2，4-二酮、4-苯基-1，2，3-噻二唑、2-(2-苯基乙炔基)吡嗪、2-苯基噻吩、苯基咪唑、3-(2-哌嗪基苯基)呋喃、3-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡咯等。优选的取代的非稠合的杂芳基芳基包括：5-(2-苯基乙炔基)嘧啶-2-基胺、1-甲氧基-4-(2-噻吩基)苯、1-甲氧基-3-(2-噻吩基)苯、5-甲基-2-苯基吡啶、5-甲基-3-苯基异噁唑、2-[3-(三氟甲基)苯基]呋喃、3-氟-5-(2-呋喃基)-2-甲氧基-1-丙-2-烯基苯、(羟基亚氨基)(5-苯基(2-噻吩基))甲烷、5-[(4-甲基哌嗪基)甲基]-2-苯基噻吩、2-(4-乙基苯基)噻吩、4-甲硫基-1-(2-噻吩基)苯、2-(3-硝基苯基)噻吩、(叔-丁氧基)-N-[(5-苯基(3-吡啶基))甲基]羧酰胺、羟基-N-[(5-苯基(3-吡啶基))甲基]酰胺、2-(苯基甲硫基)吡啶和苄基咪唑。
短语“非稠合的杂芳基杂芳基”是指非稠合的芳基芳基，其中两个芳基都是杂芳基。杂芳基杂芳基的例子包括，例如，3-吡啶基咪唑、2-咪唑基吡嗪等。优选的取代的非稠合的杂芳基杂芳基包括：2-(4-哌嗪基-3-吡啶基)呋喃、二乙基(3-吡嗪-2-基(4-吡啶基))胺和二甲基{2-[2-(5-甲基吡嗪-2-基)乙炔基](4-吡啶基)}胺。
短语“稠合的芳基芳基”是指与芳基稠合并完全共轭的如上文定义的芳基。代表性的稠合的芳基芳基包括二苯基、4-(1-萘基)苯基、4-(2-萘基)苯基等。
短语“稠合的杂芳基芳基”是指与杂芳基稠合并完全共轭的如上文定义的芳基。代表性的稠合的杂芳基芳基包括喹啉、喹唑啉等。
短语“稠合的杂芳基杂芳基″是指与杂芳基稠合并完全共轭的如上文定义的杂芳。代表性的稠合的杂芳基杂芳基包括吡唑并嘧啶(pyrazalopyrimidine)、咪唑并喹啉等。
术语″芳氧基″是指RO-，其中，R是芳基。代表性的芳基烷氧基包括苄氧基、苯基乙氧基等。
术语″芳基烷氧基″是指连接有芳基的低级烷氧基。代表性的芳基烷氧基包括苄氧基、苯基乙氧基等。
术语″芳氧基芳基″是指连接有芳氧基的芳基。代表性的芳氧基芳基包括4-苯氧基苯基、3-苯氧基苯基、4-苯氧基-1-萘基、3-苯氧基-1-萘基等。
术语″芳氧基芳基烷基″是指连接有芳氧基的芳基烷基。代表性的芳氧基芳基烷基包括4-苯氧基苯基甲基、3-苯氧基苯基甲基、4-苯氧基苯基乙基、3-苯氧基-苯基乙基等。
术语″芳基烷氧基芳基″是指连接有芳基烷氧基的芳基。代表性的芳基烷氧基芳基包括4-苄氧基苯基、3-苄氧基苯基等。
术语″芳基烷氧基芳基烷基″是指连接有芳基烷氧基的芳基烷基。代表性的芳基烷氧基芳基烷基包括4-苄氧基苄基、3-苄氧基苄基等。
术语″环烷基″是指含有3-7个碳原子的脂环基，包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语″环烷基烷基″是指连接有环烷基的低级烷基。环烷基烷基的代表性例子包括环丙基甲基、环己基甲基、2-(环丙基)乙基等。
术语″卤素″是指碘、溴、氯或氟；″卤代″是指碘代、溴代、氯代或氟代。
术语″卤代烷基″是指带有至少一个卤素取代基的如上文定义的低级烷基，例如，氯甲基、氟乙基或三氟甲基等。
术语“杂环基”(或杂环的、杂环)表示芳香性和非芳香性环状化合物，包括单环、二环和多环的环状化合物，例如，但不限于，奎宁环基，含有3个或更多环原子，其中一个或多个是杂原子，例如但不限于N、O和S。尽管短语“未取代的杂环基”包括稠合杂环，如苯并咪唑基，但它不包括环原子之一连接有其它基团如烷基或卤代基团的杂环基，如2-甲基苯并咪唑基或取代的杂环基。杂环基的例子包括，但不限于：含有1-4个氮原子的不饱和3-8元环，例如，但不限于，吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(如4H-1，2，4-三唑基、1H-1，2，3-三唑基、2H-1，2，3-三唑基等)、四唑基(如1H-四唑基、2H-四唑基等)；含有1-4个氮原子的饱和3-8元环，例如，但不限于、吡咯烷基、咪唑啉基、哌啶基、哌嗪基；含有1-4个氮原子的稠合不饱和的杂环，例如，但不限于，吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、吲哚嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和3-8元环，例如，但不限于，噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(例如1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基等)；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的饱和3-8元环，例如，但不限于，吗啉基；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环，例如，苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(例如2H-1，4-苯并噁嗪基等)；含有1-3个硫原子和1-3个氮原子的不饱和3-8元环，例如，但不限于，噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(例如1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)；含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3-8元环，例如，但不限于，噻唑烷基；含有1-2个硫原子的饱和及不饱和3-8元环，例如，但不限于，噻吩基、二氢二硫杂环己二烯基(dihydrodithiinyl)、二氢二硫代基(dihydrodithionyl)、四氢噻吩、四氢噻喃；含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环，例如，但不限于，苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(例如2H-1，4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(例如2H-3，4-二氢苯并噻嗪基等)；含有氧原子的不饱和3-8元环，例如，但不限于，呋喃基；含有1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，例如苯并二氧代基(benzodioxolyl)(例如1，3-苯并二氧代基等)；含有一个氧原子和1-2个硫原子的不饱和3-8元环，例如，但不限于，二氢氧硫杂环己二烯基；含有1-2个氧原子和1-2个硫原子的饱和3-8元环，如1，4-氧硫杂环己烷；含有1-2个硫原子的不饱和稠环，如苯并噻吩基、苯并二硫杂环己二烯基；以及含有一个氧原子和1-2个氧原子的不饱和稠合杂环，如苯并氧硫杂环己二烯基。杂环基还包括上述基团，其中，环中的一个或多个S原子与一个或两个氧原子双键结合(亚砜和砜)。例如，杂环基包括四氢噻吩、四氢噻吩氧化物和四氢噻吩1，1-二氧化物。优选的杂环基含有5或6个环原子。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、四唑、硫代吗啉、硫代吗啉(其中，硫代吗啉的硫原子与一个或多个氧原子结合)、吡咯、高哌嗪、噁唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、噁唑、奎宁环、噻唑、异噁唑、呋喃和四氢呋喃。
短语“取代的杂环基”是指上文定义的杂环基，其中一个环成员与上文在取代的烷基和取代的芳基中所述的非氢原子结合。其例子包括，但不限于，2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯吡啶基。″氨基磺酰基″是指基团-S(O)2-NH2。″取代的氨基磺酰基″是指基团-S(O)2-NRR’，其中R是低级烷基，R’是氢或低级烷基。术语″芳烷基氨基磺酰基芳基″是指基团-芳基-S(O)2-NH-芳烷基，其中所述芳烷基是低级芳烷基。
″羰基″是指二价基团-C(O)-。
″羰氧基″通常指基团-C(O)-O-。这种基团包括包括酯-C(O)-O-R，其中R是低级烷基、环烷基、芳基或低级芳烷基。术语″羰氧基环烷基″通常指″羰氧基碳环烷基″和″羰氧基杂环烷基″，即，其中R分别是碳环烷基或杂环烷基。术语″芳基羰氧基″是指基团-C(O)-O-芳基，其中芳基是单环或多环的碳环芳基或杂环芳基。术语″芳烷基羰氧基″是指基团-C(O)-O-芳烷基，其中芳烷基是低级芳烷基。
术语″磺酰基″是指基团-SO2-。″烷基磺酰基″是指具有结构-SO2R-的取代的磺酰基，其中R是烷基。用于本发明化合物的烷基磺酰基通常是主链中含有1-6个碳原子的低级烷基磺酰基。因此，用于本发明化合物的烷基磺酰基通常包括，例如，甲基磺酰基(即R是甲基)、乙基磺酰基(即R是乙基)、丙基磺酰基(即R是丙基)等。术语″芳基磺酰基″指基团-SO2-芳基。术语″芳烷基磺酰基″是指基团-SO2-芳烷基，其中芳烷基是低级芳烷基。术语″亚磺酰氨基″是指-SO2NH2。
术语″羰基氨基″是指二价基团-NH-C(O)-，其中，羰基氨基中酰胺氮的氢原子可被低级烷基、芳基或低级芳烷基取代。这种基团包括氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-R)和酰胺-NH-C(O)-O-R两部分，其中R是直链或支链低级烷基、环烷基或芳基或低级芳烷基。术语″低级烷基羰基氨基″是指烷基羰基氨基，其中R是主链结构中含有1-6个碳原子的低级烷基。术语″芳基羰基氨基″是指基团-NH-C(O)-R，其中R是芳基。类似地，术语″芳烷基羰基氨基″是指羰基氨基，其中R是低级芳烷基。
术语″胍基″是指衍生自胍H2N-C(＝NH)-NH2的部分。这种部分包括结合于带有正式双键的氮原子上的部分(胍的″2″-位，例如，二氨基亚甲基氨基(H2N)2C＝NH-)以及结合于带有正式单键的两个氮原子之一上的部分(胍的″1-″和/或″3″-位，例如，H2N-C(＝NH)-NH-)。氮原子之一上的氢原子可被合适的取代基，如低级烷基、芳基或低级芳烷基取代。
代表性的环亚氨基和杂环亚氨基包括，例如，下面示出的那些。这些环亚氨基和杂环亚氨基还可被取代并可结合在不同位置，结合这里的描述，这对于精通有机化学和药物化学领域的技术人员而言是显而易见的。
Figure A20048001629002201
Figure A20048001629002202
和
代表性的取代的脒基和杂环脒基包括，例如，下面示出的那些。这些脒基和杂环脒基还可被取代，结合这里的描述，这对于精通有机化学和药物化学领域的技术人员而言是显而易见的。
和
Figure A20048001629002205
代表性的取代的烷基羰基氨基、烷氧基羰基氨基、氨烷氧基羰基氨基和芳基羰基氨基包括，例如，下面示出的那些。这些基团还可被取代，结合这里的描述，这对于精通有机化学和药物化学领域的技术人员而言是显而易见的。
Figure A20048001629002212
和
Figure A20048001629002213
代表性的取代的氨基羰基包括，例如，下面示出的那些。这些杂环基也可被取代，结合这里的描述，这对于精通有机化学和药物化学领域的技术人员而言是显而易见的。
Figure A20048001629002214
Figure A20048001629002215
和
代表性的取代的烷氧基羰基包括，例如，下面示出的那些。这些烷氧基羰基也可被取代，结合这里的描述，这对于精通有机化学和药物化学领域的技术人员而言是显而易见的。
Figure A20048001629002217
Figure A20048001629002218
和
Figure A20048001629002219
“取代的”是指用一个或多个单价或二价基团明确代替氢。合适的取代基包括本文对具体基团所述的那些基团，以及羟基、硝基、氨基、亚氨基、氰基、卤代、硫代、硫代氨基、脒基、亚氨基、氧代、草酰胺基、甲草酰胺基、亚氨基、胍基、亚磺酰氨基、羧基、甲酰基、烷基、取代的烷基、卤代低级烷基、低级烷氧基、卤代低级烷氧基、低级烷氧基-烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷硫基、氨基烷基、氰基烷基、苄基、吡啶基、吡唑基、吡咯、噻吩、咪唑基等。
术语“连接部分”是指共价键或非环化二价基团，例如、-CO-、-O-、-S-、-CH2-、-NH-、以及如这里所定义的取代或未取代的烷基、烯基、炔基、羰基、烷氧基羰基。
术语“SMIP化合物”是指小分子免疫增强化合物，包括分子量低于约MW 1000g/mol，优选MW 800g/mol的能够刺激或调节患者促炎症应答的小分子化合物。一实施方案中，所述SMIP化合物能够刺激人外周血单核细胞制造细胞因子。优选的SMIP化合物及其衍生物包括，例如，氨基氮杂乙烯化合物、氮茚化合物、酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、蒽醌化合物、茚满二酮化合物、邻苯二酰亚胺(pthalimide)化合物、苯并环二酮化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(aminobenzimidazole quinolinone)(ABIQ)化合物、羟基邻苯二酰亚胺(hydraphthalimide)化合物、吡唑嘧啶化合物、喹唑酮化合物、喹噁啉化合物、三嗪化合物、四氢吡咯烷并喹噁啉化合物、吡咯化合物、联苯酮化合物、甾醇类化合物和异噁唑化合物。
术语“SMIS化合物”是指小分子免疫抑制剂化合物，包括分子量低于约MW 1000g/mol，优选MW 800g/mol的能够抑制或调节患者促炎症应答的小分子化合物。
本申请中所描述的酰基哌嗪化合物包括式(III)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002221
其中，
R9选自取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷基、芳基烯基、杂芳基烷基和杂芳基烯基；
R10是取代或未取代的烷基；
n是0-2的整数；和
如果D1是碳，则D2是氧，D3不存在，且D4选自取代或未取代的芳基、杂芳基、碳环基、烷氧基芳基、稠合的芳基芳基、稠合的芳基杂芳基和稠合的杂芳基芳基；或，
如果D1是氮，则D2是氮，D4不存在，且D3选自取代或未取代的芳基、杂芳基、碳环基，烷氧基芳基、稠合的芳基芳基、稠合的芳基杂芳基和稠合的杂芳基芳基。
本申请中所描述的吲哚二酮化合物包括式(IV)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002231
其中，
R11和R12独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸(carboxcyclic acid)以及取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基；和
R13选自取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环基、杂环基烷基和烷基苄基。
本申请中所描述的四氢异喹啉(THIQ)化合物包括式(V)的化合物，如下所述：
其中，
L是共价键或选自-CH2-。-CO-、-O-、-S-、CHF、-NH-、-NR20-，其中R20是低级烷基；
R14选自氢、卤素或取代或未取代的烷基；
R15选自取代或未取代的碳环基、芳基、芳基烷基、烷氧基芳基、杂芳基、杂环基；
R16选自氢、卤素或取代或未取代的烷基；
R17选自氢、卤素或取代或未取代的烷基；和
R18和R19独立选自H、羟基、卤素、烷氧基、氨基、未取代的烷基、取代的烷基和烷基氨基。
本申请中所描述的苯并环二酮化合物包括式(VI)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002241
其中，
E选自NR25或CR26R27；
R21、R23和R24独立选自H、羟基、卤素、烷氧基、氨基、未取代的烷基、取代的烷基和烷基氨基；
R22选自H、羟基、卤素、烷氧基、氨基和未取代或取代的烷基和烷基氨基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、芳基羰基、杂环基、杂环基烷基和杂芳基羰基；
R25选自取代或未取代的芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂环烷基；
R26选自H、卤素、羟基、氨基和取代或未取代的烷基、羰基烷基和烷基羰基烷基；和
R27选自芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环基、杂环基烷基、碳环基、芳基羰基烷基和芳基烷基羰基。
本申请中所描述的氨基氮杂乙烯化合物包括式(VII)的化合物，如下所述：
其中，
G是S或NH；
R28选自H、以及取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、芳基烷基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基；
Q选自氢、取代的烷基、未取代的烷基和芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、稠合或非稠合的芳基芳基、取代的芳基芳基、芳基杂芳基、取代的芳基杂芳基、杂芳基杂芳基和取代的杂芳基杂芳基；
V1选自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基羰基、烷氧基羰基、羧基磺酰基、甲磺酰基和取代或未取代的烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、杂芳基羰氧基、杂芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、亚磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、杂芳基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳基羰基氨基、环脒基、环烷基、环亚氨基、芳基磺酰基或芳基亚磺酰氨基；和
V2选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基羰基、烷氧基羰基、羧基磺酰基、甲磺酰基和取代或未取代的烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、杂芳基羰氧基、杂芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、亚磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、杂芳基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳基羰基氨基、环脒基、环烷基、环亚氨基、芳基磺酰基and芳基亚磺酰氨基。
本申请中所描述的内酰胺化合物包括式(VIII)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002261
其中，
W1选自-OH、-OR36、-NR37R38；
W2选自O、S、NR39
R29和R30一起形成一取代或未取代的5-6元环，该环全部都是碳原子或含有至少一个O、N或S原子；
R35和R39可以相同或不同，并选自H、-OH、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、-C(＝O)H、-C(＝O)-烷基或-C(＝O)-芳基；
R31、R32、R33和R34可以相同或不同，并独立选自H、Cl、Br、F、I、-NO2、-CN、-OH、-OR40、-NR41R42、-C(＝O)R43、-SH、取代和未取代的脒基、取代和未取代的胍基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的烯基、取代和未取代的炔基、取代和未取代的杂环基、取代和未取代的烷基氨基烷基、取代和未取代的二烷基氨基烷基、取代和未取代的芳基氨基烷基、取代和未取代的二芳基氨基烷基、取代和未取代的(烷基)(芳基)氨基烷基、取代和未取代的杂环基烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的杂环基氨基烷基、取代和未取代的二杂环基氨基烷基、取代和未取代的(烷基)(杂环基)氨基烷基、取代和未取代的(芳基)(杂环基)氨基烷基、取代和未取代的羟基烷基、取代和未取代的烷氧基烷基、取代和未取代的芳氧基烷基和取代或未取代的杂环氧基烷基；
R36选自取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂环基、取代和未取代的杂环基烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)-烷基、-C(＝O)-芳基、-C(＝O)O-烷基、-C(＝O)O-芳基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)NH(芳基)、-C(＝O)N(烷基)2、-C(＝O)N(芳基)2、-C(＝O)N(烷基)(芳基)、-NH2、-NH(烷基)、-NH(芳基)、-N(烷基)2、-N(烷基)(芳基)、-N(芳基)2、-C(＝O)NH(杂环基)、-C(＝O)N(杂环基)2、-C(＝O)N(烷基)(杂环基)或-C(＝O)N(芳基)(杂环基)；
R37选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基或取代和未取代的杂环基；
R38选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂环基、-OH，烷氧基、芳氧基、-NH2、取代和未取代的杂环基烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基氨基烷基、取代和未取代的二烷基氨基烷基、取代和未取代的芳基氨基烷基、取代和未取代的二芳基氨基烷基、取代和未取代的(烷基)(芳基)氨基烷基、取代和未取代的烷基氨基、取代和未取代的芳基氨基、取代和未取代的二烷基氨基、取代和未取代的二芳基氨基、取代和未取代的(烷基)(芳基)氨基、-C(＝O)H、-C(＝O)-烷基、-C(＝O)-芳基、-C(＝O)O-烷基、-C(＝O)O-芳基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)NH(芳基)、-C(＝O)N(烷基)2、-C(＝O)N(芳基)2、-C(＝O)N(烷基)(芳基)、-C(＝O)-杂环基、-C(＝O)-O-杂环基、-C(＝O)NH(杂环基)、-C(＝O)-N(杂环基)2、-C(＝O)-N(烷基)(杂环基)、-C(＝O)-N(芳基)(杂环基、取代和未取代的杂环基氨基烷基、取代和未取代的二杂环基氨基烷基、取代和未取代的(烷基)(杂环基)氨基烷基、取代和未取代的(芳基)(杂环基)氨基烷基、取代和未取代的羟基烷基、取代和未取代的烷氧基烷基、取代和未取代的芳氧基烷基或取代和未取代的杂环氧基烷基；
R41选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基或取代和未取代的杂环基；
R42选自H、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、取代和未取代的杂环基、-C(＝O)H、-C(＝O)-烷基、-C(＝O)-芳基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)NH(芳基)、-C(＝O)N(烷基)2、-C(＝O)N(芳基)2、-C(＝O)N(烷基)(芳基)、-C(＝O)O-烷基、-C(＝O)O-芳基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基氨基烷基、取代和未取代的二烷基氨基烷基、取代和未取代的芳基氨基烷基、取代和未取代的二芳基氨基烷基、取代和未取代的(烷基)(芳基)氨基烷基、取代和未取代的杂环基烷基、-C(＝O)-杂环基、-C(＝O)-O-杂环基、-C(＝O)NH(杂环基)、-C(＝O)-N(杂环基)2、-C(＝O)-N(烷基)(杂环基)、-C(＝O)-N(芳基)(杂环基)、取代和未取代的杂环基氨基烷基、取代和未取代的二杂环基氨基烷基、取代和未取代的(杂环基)(烷基)氨基烷基、取代和未取代的(杂环基)(芳基)氨基烷基、取代和未取代的羟基烷基、取代和未取代的烷氧基烷基、取代和未取代的芳氧基烷基或取代和未取代的杂环氧基烷基；和
R43选自H、-NH2、-NH(烷基)、-NH(芳基)、-N(烷基)2、-N(芳基)2、-N(烷基)(芳基)、-NH(杂环基)、-N(杂环基)(烷基)、-N(杂环基)(芳基)、-N(杂环基)2、取代和未取代的烷基、取代和未取代的芳基、-OH，取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的杂环基、取代和未取代的芳氧基、杂环氧基、-NHOH、-N(烷基)OH、-N(芳基)OH、-N(烷基)O-烷基、-N(芳基)O-烷基、-N(烷基)O-芳基或-N(芳基)O-芳基。
优选R29和R30一起形成一取代或未取代的苯环。
本申请中所描述的羟基酞酰胺(Hydropthalamide)化合物包括式(IX)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002281
其中，
R44选自取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、稠合的芳基芳基、非稠合的芳基芳基、稠合的杂芳基芳基、非稠合的杂芳基芳基、稠合的芳基杂芳基或非稠合的芳基杂芳基；
R45、R47、R49和R51可以相同或不同，并独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、以及取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基或碳环基；和
R46、R48、R50和R52可以相同或不同，并独立选自H、卤素以及取代或未取代的烷基。
本申请中所描述的联苯酮化合物包括式(X)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002282
其中，
R53独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基、碳环基；
R54独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基、碳环基；和
o和p是0-4的整数。
本申请中所描述的异噁唑化合物包括式(XI)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002291
其中，
R55选自取代或未取代的芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
R56选自取代或未取代的芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；和
R57选自H、卤素、羟基、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、杂环基和羰基。
本申请中所描述的类固醇化合物包括式(XII)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002292
其中，
R58选自取代或未取代的芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基。
优选R58是吡喃酮取代基。
本申请中所描述的喹唑酮化合物包括式(XIII)的化合物，如下所述：
Figure A20048001629002301
其中，
R59选自H、卤素，羟基和取代或未取代的烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、烷氧基、二烷基氨基烷基、羟基烷基、烯基、炔基、碳环基、碳环基烷基、杂环基和杂环基烷基；
R60选自取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基；和
R61、R62、R63和R64可以相同或不同，并独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基。
本申请中所描述的吡咯化合物包括式(XIV)的化合物，如下所述：
其中，
R65选自H、羟基和取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、芳基烷基、杂芳基氨基烷基、芳基氨基烷基、杂芳氧基烷基和芳氧基烷基；
R66、R67、R68和R69可以相同或不同，并独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基。
其它优选的吡咯化合物包括式(XV)所示的化合物：
其中：
K1是氮、氧或任选取代的碳；
W不存在或选自-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-NH-、-NH-CO-、-NR’CO-、-NHSO2-、-NR’SO2-、-CO-、-CO2-、-CH2-、-CF2-、CHF、-CONH-、-CONR’-或-NR’-，其中R’是烷基、取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环；
Ar是任选取代的芳基、杂芳基或保护基；
R70和R70’独立选自氢和甲基；
R71、R72、R73和R74独立选自氢、羟基、和任选取代的低级烷基、环低级烷基、环氨基烷基、烷基氨基烷基、低级烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、芳基或杂芳基；
R75和R78独立选自氢、卤代、和任选取代的低级烷基、环烷基、烷氧基、氨基、氨基烷氧基、羰氧基、氨基羰氧基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、环亚氨基、杂环亚氨基、脒基、环脒基、杂环脒基、胍基，芳基、杂芳基、杂环烷基、杂环羰氧基、杂芳基羰氧基和芳基亚磺酰氨基；
R76选自氢、芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基；
R77选自氢、羟基、卤代、羧基、硝基、氨基、酰氨基、脒基、亚氨基、氰基、磺酰基、甲磺酰基、或取代或未取代的烷基、烷氧基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、杂芳烷基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、芳烷基羰氧基、杂芳基羰氧基、杂芳烷基羰氧基、烷基氨基羰氧基、芳基氨基羰氧基、甲酰基、低级烷基羰基、低级烷氧基羰基、氨基羰基、氨基芳基、烷基磺酰基、亚磺酰氨基、氨基烷氧基、烷基氨基、杂芳基氨基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基氨基、芳基氨基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基环酰氨基，环硫代胺基、环脒基、杂环脒基、环烷基、环亚氨基、杂环亚氨基、胍基，芳基、杂芳基、杂环、杂环烷基、芳基磺酰基和芳基亚磺酰氨基；
本发明的蒽醌化合物包括，例如，式(XVI)的化合物：
Figure A20048001629002321
其中，
R79、R80、R81和R82可以相同或不同，并独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸，and取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基；和
R83和R84一起形成取代或未取代的5-6元环，该环全部都是碳原子或含有1-2个选自O、S或N的杂原子。
本申请所述的喹噁啉化合物包括部分非共轭的三环化合物，并可任选被氮杂原子取代，喹噁啉的优选实施方案如(XVII)所示：
Figure A20048001629002322
其中，
J1是C或N，
J1’选自H、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基和未取代的杂芳基；
J2是C或N，
J2’选自H、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基和未取代的杂芳基；
J3选自-CO-、-NH-或-N＝；
如果J4是-O-，则J4’不存在；或，
如果J4是＝C-，则J4’选自H和取代或未取代的烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、芳基烷基、氨基烷基、烷基氨基和烷硫基；和
R85、R86、R87、R88和R89可以相同或不同，并独立选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基。
三嗪化合物是指取代的6元杂环，整个环被3个氮原子取代。本发明的优选实施方案包括结构式(XVIII)、(XIX)和(XX)所显示的那些：
Figure A20048001629002331
其中，
R90选自取代或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、芳基烷基和芳基烯基；
R91和R93独立选自H和未取代的烷基；
R91是芳基；优选苯基，
Figure A20048001629002332
其中，
R94选自H、氨基、烷基、氨基烷基和卤素；
R95选自取代或未取代的芳基、芳基氨基、芳基烷基氨基、杂芳基、杂芳基氨基和杂烷基氨基；
R96和R97独立选自H、卤素或烷基，优选甲基；或，
R96可直接与氮原子形成双键，如上述结构式中的虚线所指出的；和
其中，
R98选自H、取代的烷基或未取代的烷基；优选甲基，
R99选自H、取代的烷基或未取代的烷基；优选乙基，
R100选自取代或未取代的芳基、杂芳基、烷氧基芳基、芳基烷基或杂芳基烷基。
本申请所述的氮茚化合物包括下式(XXI)所述的化合物：
其中，
A选自-O-、-S-、-NH-或-NR8-；
W选自-CH2-、-O-、-S-、-NH-或-NR8-；
R7选自碳环基、非稠合的碳环基碳环基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的稠合的芳基杂芳基、未取代的稠合的芳基杂芳基、取代的非稠合的芳基芳基或未取代的非稠合的芳基芳基；
R6选自取代或未取代的芳基和杂芳基；和
R8独立为取代或未取代的烷基。
本申请所述的吡唑并嘧啶化合物包括下式(XXII)所示的化合物：
Figure A20048001629002343
其中，
R101选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基；
R102选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、或取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基；
R103选自H、硝基、卤素、氨基、羟基、氰基、碳环酸、三氟甲基和取代或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基氨基羰基、氨基羰基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、烷基氨基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基和碳环基；
R104选自H和取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基、碳环基烷基、碳环基；
R105选自H或取代或未取代的芳基、杂芳基、芳基烷氧基、杂芳基烷氧基、芳基烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基氨基烷基、杂环基、杂环基烷氧基、杂环基烷基、碳环基烷基、碳环基；
其中，R104和R105中至少有一个不是H。
通过体外(细胞或非细胞试验法)或体内方法鉴别的SMIP化合物的描述见下面的方法1和2。
含有本发明化合物的药物组合物可以是任何适合预定给药方法的剂型，包括例如，溶液、悬液或乳剂。通常用液体运载体来制备溶液、悬液和乳剂。实施本发明所用的液体运载体包括，例如，水、盐水、药学上可接受的有机溶剂、药学上可接受的油或脂肪等，以及其中两种或多种的混合物。液体运载体可含有其它合适的药学上可接受的添加剂，如增溶剂、乳化剂、营养素、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂包括，例如，一元醇如乙醇，和多元醇如甘油。合适的油包括，例如，大豆油、花生油、橄榄油、红花油、棉籽油等。对于肠胃外给药，所述运载体还可含有油酸酯，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等。本发明的组合物还可以是微粒、微胶囊、脂质体胶囊等形式，以及其中两种或多种的混合物。
其它添加剂包括本领域已知的免疫刺激剂。免疫刺激寡核苷酸和多核苷酸描述于PCT WO 98/55495和PCT WO 98/16247。美国专利申请No.2002/0164341描述了包括非甲基化CpG二核苷酸(CpG ODN)的佐剂和非核酸佐剂。美国专利申请No.2002/0197269描述了含有抗原、抗原性CpG-ODN和聚阳离子聚合物的组合物。可使用本领域已经叙述过的其它免疫刺激性添加剂，例如，如美国专利No.5,026,546；美国专利No.4,806,352；和美国专利No.5,026,543所述。
可使用控释输送系统，如可控制扩散的基质系统或可侵蚀系统，例如描述于：Lee的“扩散控制基质系统”(第155-198页)以及Ron和Langer的“可侵蚀系统”(第199-224页)，刊登在《受控药物输送的论述》(Treatise on Controlled DrugDelivery)，A.Kydonieus编，Marcel Dekker，Inc.，New York 1992。所述基质可以是，例如，可通过例如水解或酶切割(如蛋白酶切割)在原位或体内自发降解的生物可降解性材料。所述输送系统可以是例如天然产生的或合成的聚合物或共聚物，例如以水凝胶形式。具有可切割连接键的聚合物的例子包括聚酯、正聚酯类、聚酐、多糖、聚(磷酸酯)、聚酰胺、聚氨酯、聚(亚氨基碳酸酯)和聚(膦腈)。
本发明化合物可以含有药学上可接受的常规无毒性载体、佐剂和运载体的单位剂量制剂的形式，按需要经肠内、口服、肠胃外、舌下、吸入喷雾、直肠、或局部给药。例如，合适的给药模式包括口服、皮下、透皮、透粘膜、离子电渗、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、皮下、直肠等。局部给药也包括透皮给药，如透皮贴片或离子电渗装置。术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射，或灌输技术。
可注射的制剂，例如无菌注射液或油性悬液，可按照已知技术用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制成。无菌可注射制品也可以是用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂配制的无菌注射液或悬液，如用1，3-丙二醇配制的溶液。可以使用的可接受的运载体和溶剂包括水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可使用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸也可用于可注射制品中。
药物的直肠给药栓剂可将药物与合适的无刺激性赋形剂混合而制成，赋形剂如可可脂和聚乙二醇，它们在常温下是固体但在直肠温度下是液体，因此能在直肠内融化释放药物。
用于口服的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。通常，这种剂型还可含有惰性稀释剂之外的其它物质，例如，润滑剂如硬脂酸镁。如果是胶囊、片剂和丸剂，该剂型中可含有缓冲剂。此外，片剂或丸剂还可有肠衣。
供口服的液体剂型可包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂，其中含有本领域通常使用的惰性稀释剂，如水。这种组合物还可含有佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、环糊精、以及甜味剂、调味剂和香味剂。
提及给药模式时，应该强调它是能够提供协同疗效的治疗剂的组合，无论第一种和第二种药剂是一起或分别给予的。因此，这两种药剂可以在单次剂量中一起给予或以不同的时间和间隔分别给予。
本发明化合物的有效量通常包括足以可检测地治疗病毒感染的任何剂量。
本发明所述的对对象的成功治疗可导致受药物或生物紊乱折磨的对象的症状减轻或缓解，以便例如阻止疾病进一步发展或预防疾病。
可与运载物质混合形成单一剂型的活性成分的量，取决于被治疗的宿主和具体给药模式而不同。然而应该理解，用于任何具体患者的特定剂量水平将取决于各种因素，其中包括所用具体化合物的活性、患者的年龄、体重、健康状况、性别、饮食状况、给药时间、给药途径、排泄速度、药物组成以及正在治疗的具体疾病的严重性。通过常规试验容易确定某一给定情况下的治疗有效量，属于普通临床医生的技能和判断。
本发明化合物可以脂质体的形式给药。如本领域已知，脂质体通常用磷脂或其它脂质物质制备。通过将单层或多层水合液晶分散在水性介质形成脂质体。可使用任何能够形成脂质体的无毒的、生理上可接受并可代谢的脂质。脂质体形式的本发明的组合物除了含有本发明的化合物外，还含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然的以及合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域已知的。参见例如，Prescott，编，《细胞生物学方法》(Mthods in Cell Biology)，第XIV卷，Academic Press，New York，N.W.，p.33，参照以下(1976)。
尽管本发明的SMIP化合物可作为单独的活性药剂给予，但它们也可与一种或多种治疗SARS的其它药剂联合使用。与本发明化合物联合使用以治疗病毒感染的其它代表性药剂包括，例如，干扰素、利巴韦林、gancyclovir等。
当其它活性药剂与本发明化合物联合使用时，其它活性药剂的用量通常可按照《医师案头参考》(PHYSICIANS’DESK REFERENCE，PDR，第53版，1999)一书所指出的治疗量，该书纳入本文参考文献，或按照本领域普通技术人员所直到的治疗有效量。
本发明化合物和其它治疗活性药剂可按照推荐的最大临床剂量或以较低剂量给药。本发明组合物中活性化合物的剂量水平可根据给药途径、疾病的严重性以及患者的反应而改变以获得所需的治疗反应。所述联合给药可作为分开的组合物或作为含有两种药剂的单一剂型给药。当作为联合给药时，该治疗剂可配制成在相同时间或不同时间给予的分开的组合物，或者该治疗剂可作为单一组合物给予。
采用本文所述的方法或本领域熟知的其它方法不难合成本发明的化合物。
所述化合物可以是无机或有机酸的盐形式使用。这些盐包括但不限于：乙酸盐、乙二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、水杨酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。另外碱性含氮基团可被以下试剂季铵化，如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫化物，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫化物；长链卤化物，如癸基、月桂基、肉豆寇基和硬酯基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物，等等。从而可获得水溶性或油溶性、或水或油可分散的产品。
可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括无机酸，如盐酸、硫酸和磷酸，以及有机酸，如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。碱加成盐可在式(I)的化合物最终的分离和纯化步骤中原位制备，或使其羧酸部分分别与合适的碱(如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或与铵或有机伯、仲、叔胺反应来制备。药学上可接受的盐包括但不限于：碱金属或碱土金属的阳离子，如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于：铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。用来形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
各种化合物以及它们合成方法描述于国际专利申请公开号WO02/18327(基于苯甲酰胺和吡啶基酰胺的化合物)；WO0222598和WO02/18383(基于ABIQ的化合物)；和WO 02/81443(基于酞酰胺(pthalamide)的化合物)，这些都在本发明内容之内，可用于增强免疫。这些美国专利和国际公开的完整内容纳入本文作为参考。本发明感兴趣的其它化合物或中间体购自商业来源，用以下方法：将感兴趣的化学结构绘制成图输入ACD-SC数据库(来自MDL Information Systems)。搜查以下公司/研究所，检索经鉴定的化合物供应商和购买信息：ASDI、ASINEX、BIONET、CHEMBRIDGE、CHEMDIV、CHEMEX、CHEMSTAR、COMGENEX、CSC、INTERBIOSCREEN、LABOTEST、MAYBRIDGE、MICROSOURCE/GENESIS、OLIVIA、ORION、PEAKDALE、RYAN SCIENTIFIC、SPECS、TIMTEC、U OF FLORIDA和ZELINSKY。
氮茚化合物
流程1
含有苯并咪唑核心的本发明的化合物可用许多该领域技术人员熟悉的方法制备。在一种方法中，可将适当功能化的二胺与各种硫代异氰酸酯偶联形成硫脲中间体。可在已知条件下，如用碳二亚胺或烷基卤化物处理，环化形成苯并咪唑部分。或者可使二胺依次与羰基二咪唑和磷酰氯反应，然后再与合适的胺偶联。
可按照上述方法或其它已知的常规方法来制备含有噁唑结构的化合物。Haviv等(J.Med.Chem.1988，31，1719)描述了一种装配噁唑核心的方法，其中羟基苯胺用乙基黄原酸钾处理。然后可氯化所得磺酰基苯并噁唑并与胺偶联。
Figure A20048001629002392
含有苯并噻唑核心的化合物也可用已知方法制备。可使邻-卤代硫代异硫氰酸酯与胺反应形成硫脲。然后用NaH还原以形成噻唑环。
苯并噻唑通常用本发明的方法取代，例如通过以下合成途径：
Figure A20048001629002401
          合成4-[(2-{[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}-
          1H-苯并咪唑基-6-基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺
合成以下化合物4-[(2-{[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1H-苯并咪唑基-6-基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(159322)：
Figure A20048001629002402
步骤1.合成4-[(4-氨基-3-硝基苯基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺：将含有4-氨基-3-硝基苯酚(1eq)和双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(2eq)的混合物在二甲基甲酰胺中室温下搅拌2小时。在此混合物中加入(4-氯(2-吡啶基))-N-甲基羧酰胺(1eq)和碳酸钾(1.2eq)90℃搅拌3天。然后浓缩反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机层用盐水洗涤、干燥、过滤并真空浓缩得到棕色固体。通过硅胶纯化(2％三乙胺/50％乙酸乙酯，溶于己烷)得到橙色固体4-[(4-氨基-3-硝基苯基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺。该产物有令人满意的NMR。HPLC，3.39min；MS：MH+=289。
步骤2.合成4-[(3，4-二氨基苯基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺：将含有[4-(3-氨基-4-硝基苯氧基)(2-吡啶基)]-N-的混合物溶于甲醇用催化量的10％Pd/C氢化，直到黄色消失，得到产物胺。HPLC，2.5mins；MS：MH+＝259。
步骤3.合成4-[(2-{[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1H-苯并咪唑基-6-基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺：
将溶于四氢呋喃的含有4-[(3，4-二氨基苯基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(1eq)和4-氯-3-(三氟甲基)苯异硫氰酸酯(1eq)的混合物室温搅拌16小时以得到相应的硫脲。在所得混合物中加入盐酸1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(2eq)再将混合物搅拌10小时。将混合物浓缩并在乙酸乙酯和水之间分配。有机层用盐水洗涤并干燥。通过HPLC纯化得到4-[(2-{[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1H-苯并咪唑基-6-基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺。MS：MH+＝462
            合成4-({2-[(4-溴苯基)氨基]-1-甲基-
         1H-苯并咪唑基-5-基}氧)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺
合成以下化合物4-({2-[(4-溴苯基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑基-5-基}氧)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(161651)：
步骤1.合成4-{[3-氨基-4-(甲基氨基)苯基]氧}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺：4-[(4-氨基-3-硝基苯基)氧]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(1eq)的亚甲基氯溶液用三氟乙酸酐(1eq)处理并在0℃搅拌10分钟。混合物用饱和的NaHCO3溶液猝灭。分离有机层并用水、盐水洗涤，干燥并蒸发。MS：MH+＝385.2
在甲苯、乙腈和氢氧化钠混合液(50％)中的三氟乙酰胺(1eq)溶液中加入氯化苄基三甲基铵(1eq)硫酸二甲酯(1.2eq)。在室温下搅拌该双相混合物过夜并蒸发。将混合物加入乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，干燥并蒸发。粗产品通过柱层析纯化，用1∶1己烷和乙酸乙酯、然后2％三乙胺(用1∶1的己烷和乙酸乙酯配)、再然后2％三乙胺(用1∶1的己烷和乙酸乙酯配)洗脱，得到橙红色固体N-甲基-4-{[4-(甲基氨基)-3-硝基苯基]氧}吡啶-2-羧酰胺。MS：MH+＝303.1。
硝基甲基苯胺的甲醇溶液用5％钯/碳处理并室温在氢气下搅拌15分钟(直到黄色消失)。过滤混合物，浓缩滤液得到0.36克二胺4-{[3-氨基-4-(甲基氨基)苯基]氧}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺。MS：MH+＝273.3。
步骤2.合成4-((2-[(4-溴苯基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑基-5-基}氧)-N-甲基吡啶-2-羧酰胺：将二胺4-{[3-氨基-4-(甲基氨基)苯基]氧}-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(1eq)的甲醇溶液用4-溴苯基异硫氰酸酯(1eq)处理并在60-65℃搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，加入碘代甲烷(1eq)并在60℃搅拌过夜。将反应物冷却至室温、蒸发、倒入乙酸乙酯、用水和盐水洗涤、干燥并减压蒸发。采用梯度溶剂系统(己烷和乙酸乙酯，以及用亚甲基氯配的1∶1亚甲基氯和丙酮或5％甲醇)进行柱层析，得到半白色的粉末状产物。MS：MH+＝452.3
氨基苯并咪唑基喹啉酮
结构I的化合物是从流程1-4所示的简单起始分子合成的并例举在实施例中。如流程1所示，通常用被胺和羧酸基团取代的芳香性化合物制备结构I的化合物。
流程2
Figure A20048001629002421
如流程2所示，取代的芳香化合物如取代或未取代的2-氨基苯甲酸可与酰卤如2-(氯代羰基)乙酸甲酯反应产生酰胺，所得酰胺将与取代或未取代的1，2-二氨基苯反应。所得产物是结构I的4-羟基-取代的化合物。本领域技术人员将知道，可修钙流程1所列的方法，以制造备各种化合物。
制备结构I的4-氨基取代的化合物的方法示于流程3。如流程3所示，可利用胺和腈基取代的芳香化合物来合成结构I的4-氨基取代的化合物。化合物如2-氰基乙酸乙酯可与乙醇反应产生盐酸3-乙氧基-3-亚氨基丙酮酸乙酯。随后与取代或未取代的1，2-苯二胺反应制得取代或未取代的2-苯并咪唑基-2-基乙酸乙酯。取代或未取代的2-苯并咪唑基-2-基乙酸乙酯与含有胺和腈基的芳香化合物，如取代或未取代的2-氨基苯腈以及碱如双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂或路易斯酸如四氯化锡反应，得到结构I的取代或未取代的4-氨基取代的化合物。
流程3
Figure A20048001629002431
流程4示出了合成结构I的4-二烷基氨基和4-烷基氨基化合物的常规合成途径。流程3显示，结构I的4-羟基取代的化合物可通过与氯氧化磷或亚硫酰氯反应转化成4-氯衍生物。该4-氯衍生物然后可与烷基胺或二烷基胺反应制成相应的4-烷基氨基或4-二烷基氨基衍生物。去保护得到最终的结构I的4-烷基氨基或4-二烷基氨基化合物。也可以这种方式与4-氯衍生物反应的其它基团包括但不限于，ROH、RSH和CuCN。
流程4
如流程5所示，可用按流程3和4制备的取代或未取代的2-苯并咪唑基-2-基乙酸酯来合成在4-位具有H、烷基、芳基或杂环基的结构I的化合物。
Figure A20048001629002441
硫代缩氨基脲(THIOSEMCARBAZONE)
制备硫代缩氨基脲的一般方法
流程6
Figure A20048001629002442
将醛(1.0当量)和硫代缩氨基脲(1.05当量)的乙酸溶液搅拌过夜。除去过量的乙酸得到残余物，用乙醇洗涤或通过制备型HPLC纯化得到硫代缩氨基脲。
流程7
将醛(1.0当量)、硫代缩氨基脲(1.05当量)和乙酸(0.1当量)的甲醇溶液搅拌过夜。除去甲醇得到残余物，该残余物可用于流程6。
流程8
在{[(1E)-1-氮杂-2-(4-氟-3-硝基苯基)乙烯基]氨基}-氨基甲烷-1-硫酮的乙醇溶液中加入芳基胺(2.1当量)。该溶液在室温下搅拌直到最初的氟化物消失。将该溶液纯化成产物。
流程9
将乙醇中4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛(1当量)、溴化苄(1.2当量)和粉末碳酸钾的混合物在室温搅拌2天。除去乙醇，将残余物溶于乙酸乙酯和水。有机层用NaHCO3水溶液和盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过硅胶纯化，用乙酸乙酯/己烷洗脱得到4-(二乙基氨基)-2-苯甲酸基-苯甲醛。
按照流程7将醛转化成硫代缩氨基脲。
流程10
将3，4-二氟苯腈(1当量)、胺(1.5当量)和DIEA(2当量)的NMP溶液在Smith微波炉(Personal Chemistry)中加热30分钟。反应混合物通过硅胶纯化得到4-取代的3-氟苯腈。
-78℃下，在腈的甲苯溶液中加入DIBAL-H(1M，溶于甲苯，1.5当量)。使反应混合物加热至室温，并搅拌16小时，用甲醇/乙酸乙酯/盐水(1∶1∶4)猝灭。在室温搅拌30分钟后，溶液用乙酸乙酯萃取(3x)。合并的有机层用NaHCO3水溶液、盐水洗涤，并浓缩。醛通过硅胶纯化或直接转化成硫代缩氨基脲(流程7)。
流程11
将2，4，5-三氟苯腈(1当量)和4-芳基哌嗪(1.2当量)以及DIEA(1.2当量)的THF溶液在80℃加热2小时。混合物通过硅胶纯化得到4-取代的2，5-二氟苯腈。
流程12
在醇(1.0当量)中加入叔-丁氧基钾的THF(1M，1.1当量)溶液。5分钟后，将此溶液加入4-N-取代的-2，5-二氟苯腈(1当量)的THF溶液。反应混合物在室温下搅拌过夜并用氯化铵水溶液猝灭。含水层用乙酸乙酯萃取(3x)。合并的有机层用盐水洗涤，并浓缩以得到残余物，该残余物经纯化得到4-N-取代的-2-O-取代的-5-氟苯腈。
按照流程10的步骤，用DIBAL-H还原4-N-取代的-2-O-取代的-5-氟苯腈得到4-N-取代的-2-O-取代的-5-氟苯甲醛。
用流程7将该醛转化成相应的硫代缩氨基脲。
流程13
将4-N-取代的-2，5-二氟苯腈(1当量)、胺(1.5当量)和DIEA(2当量)的NMP溶液在Smith微波炉(Personal Chemistry)中加热30分钟。反应混合物通过硅胶纯化以得到4-N-取代的-2-N-取代的-5-氟苯腈。
按照流程10的步骤，用DIBAL-H还原4-N-取代的-2-N-取代的-5-氟苯腈得到4-N-取代的-2-N-取代的-5-氟苯甲醛。
制备氨基{3-[5-(3-氯苯基)(2-呋喃基)](2-吡唑啉基)}甲烷-1-硫酮
Figure A20048001629002461
0℃下，在5-(3-氯苯基)呋喃-2-碳醛(5-(3-chlorophenyl)furan-2-carbaldehyde)(1.0当量)的THF溶液中加入溶于醚的MeMgBr(3.0当量)，并搅拌45分钟。反应物用水猝灭，用醚稀释并通过硅藻土(Celite)过滤。将有机层分离并用盐水洗涤，通过MgSO4干燥，并浓缩得到1-[5-(3-氯苯基)-2-呋喃基]乙-1-醇。
在仲醇(1.0当量)的CH2Cl2溶液中加入MnO2(10当量)。将反应物搅拌过夜，通过Celite过滤，并浓缩得到1-[5-(3-氯苯基)-2-呋喃基]乙-1-酮。
在酮(1.0当量)、低聚甲醛(2.0当量)和二甲胺盐酸盐(2.0当量)以及分子筛的乙醇混合液中加入浓盐酸(cat.)。反应物在氮气下回流过夜并浓缩。加入几滴HCl，混合物用DCM和水配制。弃去有机层。将含水层调至碱性并用DCM萃取(3x)。有机层用盐水洗涤，通过MgSO4干燥，并浓缩得到3-(二甲氨基)-1-[5-(3-氯苯基)(2-呋喃基)]丙-1-酮。
将硫代缩氨基脲(1.0当量)溶于MeOH，同时在氮气下加热。在反应物中加入氢氧化钠水溶液(6M，9.0当量)。在反应混合物中逐滴加入3-(二甲氨基)-1-[5-(3-氯苯基)(2-呋喃基)]丙-1-酮(1.0当量)的甲醇溶液。除去溶剂，将残余物溶于DCM并用水、盐水洗涤，通过MgSO4干燥，并浓缩。最终的化合物通过制备型HPLC纯化得到氨基{3-[5-(3-氯苯基)(2-呋喃基)](2-吡唑啉基)}甲烷-1-硫酮；LC/MS m/z306.2(MH+)；Rt＝3.06分钟。
流程14
在4-吡啶基甲胺(1.0当量)和三乙胺(2.0当量)的CHCl3溶液中加入CS2(1.0当量))并搅拌过夜。将反应物冷却至0℃并逐滴加入氯甲酸乙酯(1.0当量)。反应物在0℃搅拌15分钟，然后在室温下搅拌2小时，再加入(叔-丁基)氧碳酰肼(1.2当量)。再搅拌1小时后用柠檬酸水溶液(5％)、饱和NaHCO3和盐水洗涤混合物，通过MgSO4干燥，并浓缩。用柱层析纯化所需Boc保护的硫代缩氨基脲。
在溶于DCM的Boc保护的硫代缩氨基脲(1.0当量)溶液中加入HCl二噁烷(2M，8.3当量)溶液，并搅拌15分钟。然后加入MeOH以溶解沉淀，再加入糖醛和少量乙酸(0.5mL)。将混合物搅拌过夜并除去溶剂以得到残余物，通过制备型-HPLC纯化得到硫代缩氨基脲。
合成4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯氧基甲基]苯甲醛
Figure A20048001629002471
在冷却至0℃的4-哌嗪-1-基苯酚(1当量)的CHCl3溶液中逐滴加入碳酸二叔丁酯(1当量)的CHCl3溶液。溶液在0℃搅拌1小时，然后从冷浴中取出并在室温下搅拌18小时。有机溶液用NaHCO3水溶液和盐水洗涤，通过MgSO4干燥并浓缩，粗物质无需纯化即可使用。
室温氮气下，在所得4-(1-BOC-哌嗪-4-基)苯酚(1当量)的无水CH3CN溶液中缓慢地逐滴加入无水CH3CN中的NaH(1当量)浆液。将该浆液在室温下搅拌2小时，然后过滤固体并用Et2O洗涤。
在无水丙酮中混合4-(1-BOC-哌嗪-4-基)苯酚钠(1当量)与4-溴甲基苯甲酸甲酯(1当量)并在60℃加热回流18小时。将浆液过滤，然后浓缩滤液以得到粗制的4-[4-(1-BOC-哌嗪-4-基)苯氧基甲基]苯甲酸甲酯，该物质无需纯化即可使用。
氮气下，在冷却至0℃的无水THF中的LiAlH4(4当量)浆液中缓慢地逐滴加入4-[4-(1-BOC-哌嗪-4-基)苯氧基甲基]苯甲酸甲酯(1当量)的无水THF溶液。一旦完全加入，将此浆液在80℃加热回流1小时。随后将此浆液冷却至0℃并用水、10％NaOH水溶液处理，然后再用水处理。将所得固体过滤，滤液用氯仿稀释，用盐水洗涤，通过MgSO4干燥并浓缩，得到粗制的4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯氧基甲基]苯甲醇，无需纯化即可使用。
氮气下，在冷却至-78℃的DMSO(2.6当量)的无水DCM溶液中逐滴加入溶于DCM的草酰氯(1.1当量)。溶液在-78℃搅拌5分钟，然后逐滴加入4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯氧基甲基]苯甲醇(1当量)的DCM溶液，并再在-78℃搅拌30分钟。缓慢加入三乙胺(2.5当量)，然后使溶液达到室温。溶液NaHCO3水溶液和盐水洗涤，通过MgSO4干燥，并浓缩得到粗制的4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯氧基甲基]苯甲醛，按照流程7将其转化成硫代缩氨基脲。
吡咯
流程15
吡咯的合成
制备(2E)-3-(2，4-二氯苯基)丙-2-烯酸叔丁酯(2)。
室温氩气下，在充分搅拌的肉桂酸酯(1eq)、叔丁醇(4eq)、DMAP(1.4eq)和CH2Cl2的溶液中加入纯DIC(1.4eq)。(注意—肉桂酸酯必需完全溶于溶液，因此可能需要略微加热。使溶液冷却至室温，然后加入DIC。为避免较大规模的放热，可先用CH2Cl2小心稀释DIC再加入，并准备一冰浴。)搅拌8小时后，反应物中形成白色沉淀。可通过TLC检测反应，用25％EtOAc/己烷洗脱(产物的Rf为0.9)。将所有反应物转移到分液漏斗(用CH2Cl2洗涤)。有机混合物用柠檬酸盐、饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤，并浓缩至干以得到油状粗产品。将粗制的油状物与己烷混合并搅拌30分钟。形成的沉淀通过celite过滤，蒸发滤液。将己烷混合物转移到二氧化硅滤塞芯上用EtOAc/己烷(97∶2v/v)洗脱。收集第一次洗脱的UV活性组分并蒸发以得到纯度＞99％的2(产率75-80％)。
Figure A20048001629002491
制备4-(2，4-二氯苯基)吡咯-3-羧酸叔丁酯(3)。
氩气下在NaH(1.5eq，油性分散相)中加入无水醚。通过注射器倾析除去醚，再在氩气下使NaH悬浮于新鲜的醚。0℃下，用20-30分钟内将溶于醚和DMSO混合物的TOSMIC(1.1eq)和2(1eq)的溶液逐滴加入到搅拌的NaH悬液。加入过程略微放热并有气体生成。加入之后，使反应物回复室温。然后对反应物进行TLC(25％EtOAc/己烷，UV活性产物的Rf＝0.4)和LCMS，直到反应完全(约2-3小时)。反应结束后，用饱和的NH4Cl水溶液小心猝灭反应物(缓慢加入以避免强烈的气体发生和放热)并用醚稀释。分离各层，有机相用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤。粗制的黑色固体可通过重结晶纯化。通过从热的EtOAc/己烷(1∶3v/v)混合物直接重结晶或将粗产物溶于微热的EtOAc然后加入己烷(己烷的体积约为EtOAc体积的两倍)可得到最佳结果。然后使热溶液冷却至室温并老化过夜。首先将结晶过滤，然后用己烷洗涤，得到99％纯的产物，产率为60-70％。
Figure A20048001629002501
制备4-(2，4-二氯苯基)-1-[3-(1，3-二噁苯并[c]唑啉-2-基)丙基]吡咯-3-羧酸叔丁酯(4)。
室温用氩气下，边搅拌边在小部分溶于DMF的吡咯3(1eq)和3-溴丙基邻苯二酰亚胺(1.2eq)的溶液中加入固体NaH(1.5eq，油性分散相)。注意—有一些气体生成，但温度似乎不会升高超过40-50℃。将反应物在室温氩气下搅拌1.5小时。然后进行TLC(CH2Cl2/乙腈(95∶5v/v)，UV活性产物的Rf＝0.5)和LCMS。反应结束后，用饱和的NH4Cl水溶液小心猝灭反应物(缓慢加入以避免强烈的气体发生和放热)。然后加入饱和的NaHCO3水溶液以避免乳化，并用醚萃取碱性有机混合物。合并的醚层用饱和的NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，通过Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干以得到粗产品。粗产品通过二氧化硅用EtOAc/己烷(1∶4v/v)洗脱纯化。纯化的产品中含有一些残余的3-溴丙基邻苯二酰亚胺，它不会干扰随后的合成步骤。将该物质取出，它不需进一步纯化便可使用。假设产率是一定的。
制备1-(3-氨基丙基)-4-(2，4-二氯苯基)吡咯-3-羧酸叔丁酯(5)。
室温氮气下将邻苯二甲酰亚氨基吡咯(pthalimido吡咯o)4(1eq)溶于乙醇和肼(3eq)。加热回流后反应形成白色沉淀。对反应物进行TLC(CH2Cl2/乙腈(95∶5v/v)，UV活性产物的Rf＝0.2)和LCMS回流搅拌直到反应完全(约2小时)判断。反应结束后，使反应物冷却至室温，并用细孔细烧结玻璃滤器真空滤去媒介。将滤液减压浓缩成黏性固体。将粗产物置于乙醇/EtOAc(1∶1v/v)，搅拌并用与上述同样的方式滤去沉淀。滤液减压浓缩，然后在真空下干燥10-15分钟。加入乙醇/EtOAc、过滤并浓缩的过程被重复一次或多次，或按需进行，以除去大多数白色沉淀和残余的肼。产物然后在真空下干燥过夜。所得物质无需进一步纯化即可使用。一旦干燥，该反应物产生玻璃状的产物(2个步骤的产率约87％)。
Figure A20048001629002511
制备1-{3-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]丙基}-4-(2，4-二氯苯基)吡咯-3-羧酸叔丁酯(7)。
在预混合的吡咯5(1eq)和粉末状的6-氯-3-硝基-2-吡啶基胺(6)(1.1eq)的无水试剂中加入DMA，然后加入Hünig碱(2eq)，随后在室温下搅拌。然后将反应物加热至80℃过夜。然后对反应物进行TLC(EtOAc/己烷(1∶1v/v)，UV活性黄色产物的Rf＝0.25)、HPLC和LCMS。通过HPLC判断反应完全后使反应物冷却至70℃。然后在反应物中加入乙二胺(无水)以破坏任何残余的未反应的氯吡啶6。在70℃搅拌15分钟后，将反应物冷却并加入饱和的NaHCO3水溶液猝灭。混合物水溶液用EtOAc萃取，合并的有机层用饱和的NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，干燥，过滤，并浓缩至干以得到棕黄色固体状的粗产品。粗产品通过闪蒸层析纯化，用EtOAc/己烷(4∶6v/v)洗脱。分离得到纯化的SnAr加合物7，产率58％，其为黄色固体。
制备1-{3-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]丙基}-4-(2，4-二氯苯基)吡咯-3-羧酸(8)。
室温下，在试管中吡咯叔丁酯7(1eq)、水(.1％)和CH2Cl2的混合物中边搅拌边加入TFA(催化量)。在室温下搅拌试管直到反应结束(约12小时)。然后在室温下减压浓缩反应物并在真空下干燥。将粗制残余物再溶于CH2Cl2并在室温下减压浓缩。所得物质无需进一步纯化便可作为TFA盐用于最终的偶合步骤。
制备N-((1S)-2-羟基-异丙基)(1-{3-[(6-氨基-5-硝基(2-吡啶基))氨基]丙基}-4-(2，4-二氯苯基)吡咯-3-基)羧酰胺(9，)。
室温氩气下，在酸(8)(1eq)、HBTU(1.5eq)、Hünig碱(2eq)和DMF(按照该顺序依次在试管中预混合)的混合物中边搅拌边加入(2S)-(+)-2-氨基丙-1-醇(1.5eq)。将反应物搅拌3-4小时直到通过LCMS和HPLC显示反应结束。反应混合物随后用EtOAc稀释，用NaHCO3洗涤并浓缩以得到一种粉末，产率为70％。
用获自Advanced Chemistry Development，Inc的ACD Name软件(版本5.07，2001/11/14)命名实施例中的化合物。一些化合物和起始物质用标准IUPAC命名法命名。
表34中的化合物是用上述实施例和流程中所述的合成方法合成的，并按照下面的方法1和2进行筛选。所用前体是精通此领域的技术人员便于了解的，并可购自Aldrich(Milwaukee，WI)或Acros Organics(Pittsburgh，PA)。
SMIP/SMIS化合物的筛选方法
方法1
可在体外鉴定候选小分子免疫增强剂。根据化合物激活免疫细胞的能力在体外进行筛选。这种活性的一种标记是诱导产生细胞因子(例如产生TNF-α)。诱导凋亡的小分子被鉴定为具有这种活性。这些小分子免疫增强剂具有作为佐剂和免疫疗法的潜在用途。
在小分子免疫增强剂(SMIP)的测定过程(高通量筛选(HTS))中，将人外周血单个核细胞(PBMC)(500,000个/mL，用添加有10％FCS的RPMI 1640培养基配)加入已经含有5μM用DMSO配制的化合物的96孔板中(每孔100,000)。将PBMC在37℃、5％CO2下培育18小时。用改进的夹心ELISA测定它们在对小分子化合物反应中产生细胞因子的能力。
简而言之，采用结合有捕获用的第一抗体的平板，然后用生物素化抗-TNF的第二抗体形成夹心，以测定PBMC培养物上清中分泌的TNF。然后用亲和素-铕检测生物素化的第二抗体，用时间分辨荧光测定铕的结合量。在该实验中证实SMIP化合物的TNF诱导活性，该活性表现为Europim计数比仅在RPMI培养基中培育的细胞增加。根据它们相对于TNF强诱导剂脂多糖LPS(1μg/ml)最佳剂量的TNF诱导活性来选择出“命中者”。该测定的稳健性和低背景使得能常规选出具有约10％LPS活性的命中化合物，通常为背景的5-10倍(仅细胞)。然后需要证实所选出的命中化合物在低浓度时能否诱导多位献血员产生细胞因子。那些在5μM或更低浓度具有恒定活性的化合物被认为符合该测定的目的。容易对该试验进行改进以筛选在较高或较低浓度时有效的化合物。
方法2
表34中的每种化合物都能诱导人外周血单个核细胞产生TNF-α。其中许多化合物在低于20μM时显示诱导产生TNF-α的活性。许多化合物在低于5μM时显示了诱导产生TNF-α的活性。许多化合物在低于1.5μM时显示诱导产生TNF-α的活性。
出于这个原因，表34中所列任何化合物的每个R基团都是优选的。此外，由于每种化合物的优秀活性，这些化合物中的每一个都是优选的，并且优选作为包括任何或所有其它化合物在内的组中的成员，并且在调节免疫增强的方法和治疗与其有关的生物病症的方法中优选的每种化合物，例如可被用作疫苗佐剂。也优选用每种化合物来制造用于疫苗、免疫增强、降低肿瘤生长和治疗其导致的生物病症的药物。除了上述方法外，测定其它细胞因子(例如IL1-β、IL-12、IL-6、IFN-γ、IL-10等)的方法是本领域熟知的，可用来寻找本发明的活性SMIP化合物。
可采用在上述试验中能在较高浓度，如100μM、200μM或300μM时导致TNF-α产生的化合物。例如，罗唑利宾(Loxoribine)在300μM可导致有效产生TNF-α(参见Pope等，免疫刺激化合物7-烯丙基-8-氧鸟苷(罗唑利宾)诱导显著的鼠细胞免疫细胞因子亚组(Immunostimulatory Compound 7-Allyl-8-Oxoguanosine(Loxoribine)Induces a Distinct Subset of Murine Cytokines Cellular Immunology)，162：333-339(1995))。
本发明还包括同位素标记的抗病毒化合物，其结构与上述那些化合物相同，但有一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然界中通常发现的原子量或质量数的原子替代。可被掺入本发明抗病毒化合物的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明的抗病毒化合物、其衍生物、所述化合物和所述衍生物的药学上可接受的盐包含在本发明范围之内。某些同位素标记的本发明的抗病毒化合物，例如其中掺入放射性同位素如3H和14C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布测定中是有用的。由于氚(即3H)和碳-14(即14C)同位素容易制备和检测，所以是特别优选的。此外，用较重的同位素如氘(即2H)取代可能会由于较高的代谢稳定性而提供某些治疗益处，如延长体内半衰期或减少剂量需求，因此在一些情况下是优选的。同位素标记的本发明的抗病毒化合物及其衍生物通常可用已知方法或参考文献中提到的方法来制备，并可用不难得到的同位素标记的试剂来替代非同位素标记试剂。
根据本发明，提供了施用有效量的SMIP化合物作为佐剂的方法。还提供了含SMIP化合物、抗原和任选的其它佐剂的免疫原性组合物。
作为佐剂，可将SMIP化合物与抗原和输送系统组合以形成最终的免疫原性组合物或疫苗产品。
作为免疫疗法，SMIP化合物可单独使用或与治疗SARS的其它疗法组合使用。
本领域的一般技术人员将知道，具有可接近羟基的生理活性抗病毒化合物SMIP或SMIS通常以药学上可接受的酯的形式给药。本发明的抗病毒化合物可作为其羟基形成的酯有效给药，正如药物化学的技术人员所预想的那样。药物化学领域早已熟知的，可通过选择合适的酯基用来调节抗病毒化合物发生作用的速度和持续时间。
可与本文所述的治疗剂组合使用的其它化合物包括，己酮可可碱(PTX)、甲基氢化泼尼松、曲美沙特(Neutrexin)、日达仙(胸腺素α-1)、任选取代的5-氨基甲脒基(aminomethinimino)-3-甲基-4-异噁唑羧酸苯基酰胺、环孢霉素A(CsA)、6-氧-1，4，5-噻嗪[2，3-b]喹唑啉、3-氨基-2(1H)-硫氧-4(3H)-喹唑啉酮、gangciclovir、甘草皂苷、四环素类、氨基糖甙类、喹诺酮、bicyclam(1，4-双(1，4，8，11-四吖环四癸烷-1-基甲基)苯八盐酸二水合物)、雷怕霉素、渥曼青霉素、恩纳普利、罗喹美克/利诺胺、inactivin、DNCB、AG7088、9-氨基喜树碱(CPT-11)、loxorobine、溴匹立明、Ononase_(豹蛙酶)、他汀类药物(如：洛伐他汀--Mevacor_，帕伐他汀--Pravachol_，辛伐他汀--Zocor_，氟伐地汀--Lescol_，阿伐他汀-Lipitor_和罗苏伐他汀--Crestor_)。
术语“有效量”在这里表示能够治疗所述疾病的本发明的组合物、试剂盒和方法中抗病毒化合物的量。当然，给予本发明化合物的具体剂量将由具体情况而定，其中包括，例如，所施用的化合物、给药途径、患者的状况以及被治疗症状的严重性。
给予对象的本发明的抗病毒化合物的剂量是可以不同，并取决于临床医生的判断。应该注意的是，当以盐(如月桂酸盐)的形式施用时有必要调节化合物的剂量，因为盐可以形成一定的分子量变化。
以下剂量以及本说明书其它部分提到的其它剂量是对体重约为65-70kg的人平均而言。精通的医师将能够根据对象的医疗史和对象是否存在某些疾病(如糖尿病)来确定体重在65-70kg范围以外的对象所需的剂量。游离碱形式(如盐或水合物)的其它形式药物剂量的计算可通过将所涉及药物种类的分子量作简单的比例不难完成。
通常，药物组合物将包括至少一种与药学上可接受的运载体，如盐水、缓冲盐水、5％右旋糖水溶液、含有痕量金属的硼酸盐缓冲盐水等，组合的抗病毒化合物。制剂还可包含一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、润滑剂、填充剂、稳定剂等。制备方法是本领域熟知的并描述在，例如，《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，Mack Pub.Co.，新泽西(1991)或《雷明顿药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，LippincottWilliams & Wilkins，Baltimore，马里兰州(2000)，纳入本文作为参考。
用于本发明的药物组合物可以是无菌无热原液体溶液或悬液、包衣胶囊、栓剂、冻干粉末、透皮贴形式，或是本领域已知的其它形式。
已知许多活性成分抗病毒化合物从消化道吸收，因此，出于简便的原因，通常优选口服化合物。然而，如果需要的话，通过静脉内、皮下、经皮或作为直肠或阴道吸收栓剂给予化合物也同样有效。可使用所有常规类型的组合物，包括片剂、咀嚼片、胶囊、溶液、肠胃外溶液、含片、栓剂和悬浮剂。组合物被制成含有日剂量或日剂量的方便部分，采取剂量单位形式，可以是一片药或胶囊，或方便体积的液体。
胶囊是将一种或多种化合物与合适的稀释剂混合物并将适量混合物装入胶囊制备的。常用的稀释剂包括惰性粉末物质，如许多不同类型的淀粉、粉末纤维素(尤其是结晶纤维素和微晶纤维素)、糖类(如果糖、甘露醇和蔗糖)、谷物粉末以及类似的可食粉末。
片剂是通过直接压制，通过湿法造粒或干法造粒制造。其配方中通常包括稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂，以及一种或多种化合物。典型的稀释剂包括，例如，各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐(如氯化钠)和糖粉。也可使用纤维素衍生物粉末。典型的片剂粘合剂有淀粉、明胶和糖类(如乳糖、果糖、葡萄糖等)。也可使用天然和合成的胶质，包括阿拉伯胶、藻酸盐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷等。聚乙二醇、乙基纤维素和蜡也常常被作为粘合剂。
片剂配方中通常需要润滑剂以防止片剂和冲头粘到模具上。润滑剂选自光滑固体，如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。
药片崩解剂是当湿润时会膨胀以破坏片剂并释放一种或多种化合物的物质。它们包括淀粉、粘土、纤维素、藻胶和树胶，更具体地有例如玉米和马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、木纤维素、天然海绵粉、阳离子交换树脂、藻酸、瓜尔胶、柑橘果肉和羧甲基纤维素，也可使用月桂基硫酸钠。
片剂还经常用作为香料和封闭剂的糖包衣，或用膜形成保护剂包衣以改变片剂的溶解特性。所述化合物也可被制成咀嚼片，这需要在配方中使用相对大量的味道愉悦的物质，如甘露醇，这在本领域现在已经很成熟了。
当需要以栓剂施用化合物时，可使用典型的基质。可可脂是一种传统的栓剂基质，可加入蜡进行修饰以略微升高其熔点。易与水混合的栓剂基质被广泛使用，其中尤其包括各种分子量的聚乙二醇。
通过合适的配方可延迟或延长化合物的作用。例如，可制备缓慢溶解的化合物小丸并将其掺入片剂或胶囊。这种技术也可被改进，即制造若干溶出速度不同的小丸并将这些小丸的混合物填装在胶囊中。片剂或胶囊可用能抵抗预定时间内溶解的薄膜包衣。即使是肠胃外制品也可将其制成长效形式，方法是将一种或多种化合物溶解或悬浮于能在血清中缓慢分散的油性或乳化运载体。
本发明的药物组合可以控释制剂(例如缓释或快速释放制剂)施用。本发明药物组合的这种控释制剂可用精通此领域的技术人员熟知的方法制备。给药方法将由临床医师或其它精通此领域的技术人员根据患者病症和需求作评价之后而定。
术语“前药”是指在体内转化(如通过在血液中水解)形成本发明的抗病毒化合物的化合物。转化可通过各种机制发生，如通过在血液中水解。关于前药的详细叙述提供在T.Higuchi和W.Stella，“作为新型输送系统的前药”(Pro-drugs as NovelDelivery Systems)，A.C.S.系列研讨会论文集第14卷，以及《药物设计中的生物学可逆载体》(Bioreversible Carriers in Drug Design)，Edward B.Roche编，AmericanPharmaceutical Association Pergamon Press，1987。术语“前药”还包括互为前体药物中的一种或多种抗病毒化合物组合成单一的分子，这种分子可经转化产生本发明的各种抗病毒化合物。
例如，如果本发明的抗病毒化合物含有羧酸官能团，则前药可包括用以下基团代替羧酸基的氢原子形成的酯，这些基团例如(C1-C8)烷基、(C2-C12)烷酰氧基甲基、含有4-9个碳原子的1-(烷酰氧基)乙基、含有5-10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)-乙基、含有3-6个碳原子的烷氧基羰氧基甲基、含有4-7个碳原子的1-(烷氧基羰氧基)乙基、含有5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰氧基)乙基、含有3-9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨基甲基、含有4-10个碳原子的1-(N-(烷氧基羰基)氨基)乙基、3-苯丙[c]呋喃酮基、4-巴豆酰内酯基(4-crotonolactonyl)、γ-丁酰内酯-4-基、二-N，N-(C1-C2)烷基氨基(C2-C3)烷基(如β-二甲氨基乙基)、氨甲酰基-(C1-C2)烷基、N，N-二(C1-C2)烷基氨甲酰基-(C1-C2)烷基和吡啶并-、吡咯烷并-或吗啉代(C2-C3)烷基。
类似地，如果本发明的抗病毒化合物含有醇官能团，则可通过用以下基团代替醇基团的氢原子而形成前药，这些基团例如(C1-C6)烷酰氧基甲基、1-((C1-C6)烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-((C1-C6)烷酰氧基)乙基、(C1-C6)烷氧基羰氧基甲基、N-(C1-C6)烷氧基羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C1-C6)烯醇基、α-氨基(C1-C4)烯醇基、芳基酰基和α-氨基酰基或α-氨基酰基-α-氨基酰基，其中每个α-氨基酰基独立选自天然产生的L-氨基酸、P(O)(OH)2、-P(O)(O(C1-C6)烷基)2或糖基(除去糖类半缩醛形式中的羟基后产生的残基)。
如果本发明的抗病毒化合物含有胺官能团，则可通过用以下基团代替胺基团的氢原子而形成前药，这些基团例如RX-羰基、RXO-羰基、NRXRX1-羰基，其中RX和RX1分别独立为((C1-C10)烷基、(C3-C7)环烷基、苄基，或RX-羰基是天然的α-氨基酰基或天然α-氨基酰基-天然α-氨基酰基，-C(OH)C(O)OYX(其中YX是H、(C1-C6)烷基或苄基)、-C(OYX0)YX1，其中YX0是(C1-C4)烷基，YX1是((C1-C6)烷基、羧基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C4)烷基或单-N-或二-N，N-(C1-C6)烷基氨基烷基、-C(YX2)YX3，其中YX2是H或甲基，YX3是单-N-或二-N，N-(C1-C6)烷基氨基、吗啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1-基。
按照本发明使用的组合物可用一种或多种生理上可接受的运载体或赋形剂以常规方法配制。按照这里的描述和表1、表2、表34和表38中列出的美国专利和公开的国际专利申请中的描述制备或获得了抗病毒、SMIP、SMIS或其它免疫调节化合物。所述抗病毒化合物可配制在适合输送到肺部的药学上可接受的组合物中。具体的制剂包括适合用作定量吸入器中使用的喷雾剂和喷射剂的干粉、液体溶液或悬液。这种制剂的制备是精通此领域的技术人员熟知的，并描述在美国专利5,814,607和5,654,007以及表3中列出的美国专利和公开的国际专利申请中，它们被纳入本文作为参考。
干粉制剂将含有干燥(任选为冻干形式)的抗病毒化合物，其颗粒大小宜在肺内能沉积的范围之内。供肺内沉积的粒度范围通常在1-5μm之间。当需要以从肺吸收进入血流的方式全身输送抗病毒化合物时，所述抗病毒化合物制剂的粒度通常在0.1和2μm之间。优选的粒度范围可用例如喷射粉碎、喷雾干燥和溶剂沉淀等方法产生。干粉装置通常要求粉末质量在约1mg-100mg之间以产生可雾化的剂量。因此，所述抗病毒化合物将通常与药学上可接受的散装干粉混合。优选的散装干粉包括蔗糖、乳糖、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)、磷脂和甘氨酸，以及表3列出的文献中所述的那些。干粉可用常规的干粉吸入器施用给对象。对于液体制剂，所述抗病毒化合物可溶于任何已知的用来输送可雾化制剂的生理上可接受的载体。这种载体包括缓冲和未缓冲的水溶性化合物的含水溶液，以及生理溶液，其中包括盐水(优选0.2-2NNaCl)。如果抗病毒化合物的溶解度有限，也可使用其它液体运载体，如乙醇、丙二醇和乙醇-丙烯组合物。所述抗病毒化合物也可作为固体悬液施用。
对于吸入给药，按照本发明使用的组合物通常以气溶胶喷雾的形式通过加压包装或喷雾器输送，需要使用推进剂，如空气、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷或其它合适的气体。优选将本发明的抗病毒化合物制剂掺入气溶胶推进剂中，制成如上文干粉制剂中所述的可吸入性的颗粒。这种颗粒悬浮在推进剂中，可任选用表面活性药剂涂布以提高其散布范围。在使用压缩气溶胶时，可提供一个阀门来输送预计量而确定剂量单位。
可获得可通过商业获得的喷射雾化器，并可用它来给对象输送雾化的抗病毒化合物。这种喷射雾化器包括但不限于：AeroTech 11(CIS-US，Bedford，Mass.)提供的产品。此外，为将雾化的抗病毒化合物输送到对象的肺部，喷雾器上可附加氧气来源以提供例如10L/min的流速。通常，在自发呼吸期间，通过口罩吸入的间隔优选为5-40分钟。本发明提供了新的组合物，其中包含合适的载体和剂量足以降低或减轻SARS患者的病毒负荷和SARS症状的雾化的抗病毒化合物。这种剂量可低于用来降低或减轻SARS患者的病毒负荷和SARS症状的相应的全身剂量。
本发明的抗病毒、SMIP、SMIS和免疫调节组合物可与甾醇类抗炎药一起给予来治疗SARS和SARS症状。本发明的甾醇类抗炎药的例子包括氢化可的松、强的松龙地塞米松、曲安缩松、氟轻松、醋酸氟氢可的松、倍他米松等。
本发明组合物的抗病毒化合物大部分被雾化成能将药物输送到终末细支气管和呼吸性细支气管的颗粒。为将抗病毒化合物以气溶胶的形式有效输送到呼吸道的肺支气管空间，形成的气溶胶颗粒的中间平均直径必需主要在1-5μm之间。该制剂还必需不会对呼吸道的功能造成不利影响。因此，该制剂必需含有足量在该条件下配制的药物以有效输送药物同时避免不良反应。
对于液体溶液和悬液，可从市售的喷雾器中选择喷雾器。获自Medicaid and PariLCS，LC Plus的名为Sidestream 0的喷射雾化器以及获自Pari RespiratoryEquipment，Richmond，Virginia的名为eFlow的喷射雾化器都是典型的适合实践本发明的喷雾器的例子。超声喷雾器可制造大小约为1-5μm的颗粒，例如DeVilbiss的Aerosonic和Omron的UltraAire都是适用的。
有利地，本发明的优点还提供给消费者用来治疗和/或预防SARS的试剂盒。这种试剂盒包括：(a)含有治疗有效量的表34和35中所列或表1、表2和表35所列美国专利和公开的国际专利申请中所述的至少一种化合物和药学上可接受的载体、运载体或稀释剂的药物组合物；(b)用于容纳所述药物组合物的容器；以及，任选地；(c)描述使用该药物组合物来治疗和/或预防SARS的方法的说明书。该试剂盒可任选包含多种治疗SARS的抗病毒化合物，其中，所述抗病毒化合物选自3C-样蛋白酶抑制剂和木瓜蛋白酶-样蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，该试剂盒包含一种抗病毒化合物，所述抗病毒化合物是RNA依赖性的RNA聚合酶抑制剂。当该试剂盒包含多种抗病毒化合物时，试剂盒中的抗病毒化合物可任选与同种药物组合物联合给药。
本发明所用的″试剂盒″包括容纳不同组合物的容器，如分装的瓶子或分装的锡箔包装。容器可以是本领域已知的任何常规形状或形式，由药学上可接受的材料制成，例如纸盒或纸板盒、玻璃或塑料瓶或罐、可重新密封的袋子(例如用来将“补充”药片装入不同的容器)或发泡包装(其中含有按照治疗方案挤出单个剂量的包装位置)。所用容器可取决于所涉及的准确剂型，例如常规纸板盒不用来装液体悬液。在一个销售单位剂型的包装中一起使用多个容器是可行的。例如，药片可被装在瓶子中，而瓶子可装在盒子中。
这种试剂盒的一个例子被叫做发泡包装。发泡包装是包装工业熟知的，并被广泛用于包装单位药物剂型(药片、胶囊等)。发泡包装通常由相对较硬的片材和其上覆盖的优选为透明塑料材料的箔材构成。在包装过程中，塑料箔内将形成凹陷。凹陷处有要被包装的单个药片或胶囊的大小和形状，或者可具有与多个要被包装的药片和/或胶囊相符的大小和形状。然后，药片或胶囊被置于相应的凹陷处，并在与形成凹陷的方向相反的塑料箔表面用相对较硬的片材密封塑料箔。其结果是，药片或胶囊被按照需要单独密封或一起密封在塑料箔和片材之间的凹陷内。优选片材的强度应为可通过对凹陷处人工施加压力在凹陷处的片材上形成开口，从而可从发泡包装中移出药片或胶囊。然后可从所述开口中取出药片或胶囊。
可能需要提供一种书写的记忆辅助，该书写的记忆辅助中包含有医生、药师或对象的信息和/或指令，例如靠在药片或胶囊旁的数字形式，这些数字与规定应该服用药片或胶囊的用药天数相对应，或是包含相同类型信息的卡片形式。这种记忆辅助的其它例子有印在卡片上的日程表，例如“第一周，星期一、星期二”，…，“第二周，星期一、星期二，…”等等。不难明白记忆辅助的其它变化。″日剂量″可以是指定天要服用的一个药片或胶囊或数个药片或胶囊。同时，试剂盒一种或多种组分的日剂量可由单个片剂或胶囊构成，而试剂盒一种或多种其它组分的日剂量可由几个药片或胶囊构成。
试剂盒的其它具体实施方案是设计用来在某一时间按照它们的使用顺序来分发日剂量的分配器。优选分配器装备有记忆辅助，以便于遵守治疗方案。这种记忆辅助的例子是机械计数器，它能表示已经被分配的日剂量数。这种记忆辅助的另一个例子是装有液晶显示器或可听到提示信号的电池驱动的微芯片存储器，例如，可显示最后一次服用日剂量的日期和/或提示下一次剂量的服用时间。
实施例
实施例1-SARS病毒分离物的例子
从德国法兰克福的一个患者临床样本中分离出一种SARS病毒(FRA)。分离物在Vero细胞中生长。提取SARS病毒的RNA并通过RT-PCR扩增。病毒基因组的核苷酸序列通过直接测序PCR产物来确定。计算机分析用于预测基因组特征、比较该基因组与先前已知的冠状病毒及不同SARS病毒分离物的序列。
分离和测序更特定如下进行。SARS病毒在Vero细胞中第3次传代后，通过超速离心从3×107细胞上清中纯化病毒粒子。用Triazol方法(Gibco-BRL)提取病毒RNA。病毒RNA(200ng)用禽RNaseH-热稳定反转录酶转录成cDNA，转录遵循厂商说明(ThermoScript RT System，Invitrogen)。简要地，使用50pmol寡(dT)20(SEQ ID NO：7389)或25ng随机六聚体在20μl终体积中引发RT反应。扩增和测序SARS基因组通过直接测序PCR产物完成，获得PCR产物使用：i)来自同源物保守区的特异引物，同源物是通过多重对比已知冠状病毒发现的；ii)在SARS分离物短序列周围设计的寡核苷酸，序列可通过WHO网络实验室在网上获得的；iii)用于扩增cDNA混合物的简并引物，引物与终产物有多个重叠片段。识别Gap关闭是通过用高保真Taq的长距离PCR(Expand High Fidelity system，Roche)，使用在所选片段上设计的引物。通过引物步移(primer walking)收集序列，使用BigDye终止子化学(AppliedBiosystems)和自动DNA测序仪(3700毛细管模式，Applied Biosystems)。通过获得完整基因组的第一个关口后，一组正向和反向引物用于从头扩增和测序基因组，使用平均2kb的模板DNA区段。AutoAssembler(Applied Biosystems)自动汇集来自重叠片段的读数并手动编辑连续29,740bp。
计算机分析序列如下进行。成套GCG Wisconsin软件包(版本10.0)用于计算机分析基因和蛋白序列。PSORT程序(http：//psort.nibb.ac.jp/)用于局部预测。对于二级结构分析，应用PHD软件，PHD软件可在以下网址获得http：//cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/。PSI-BLAST算法用于同源搜索(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，使用非冗余蛋白数据库。ClustalW用于获得基因和蛋白序列的多重序列对比。LearnCoil-VMF程序用于预测刺突蛋白中的卷曲螺旋区(http：//learncoil-vmf.lcs.mit.edu/cgi-bin/vmf)。亮氨酸拉链用程序2ZIP预测，该程序可在http：//2Zip.molgen.mpg.de.获得。
进行系统发生分析，使用系统发生推论软件包(Phylip)中程序NEIGHBOR执行的邻近连接算法(Felsenstein J 1993，由作者分发的程序)。Bootstrap分析通常用100种重复物进行，使用程序Seqboot。处理树状图并用TreeView显示。程序HMMER用于从刺突蛋白S1结构域的多重序列对比中产生序列分布。随后，HMMPFAM程序用于比较SARS刺突S1结构域与这些分布。
SARS病毒分离物基因组的长度为29,740个碱基且基因组总体结构类似于3个已知冠状病毒组的结构。从前导序列5’末端开始，能鉴定非翻译区(UTR)和编码一种多蛋白的2个重叠可读框，多蛋白含复制必需的酶。它们之后是刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核壳(N)结构蛋白和另外8个特异于SARS病毒的ORFs。在基因组的3’-末端，分离出有poly(A)的UTR。与冠状病毒组1、2和3的总同源性较低，因此SARS病毒属于新的冠状病毒组(组4)。更详细的刺突蛋白氨基酸序列分析显示SARS病毒分离物与冠状病毒组2更密切相关。
SARS病毒分离物的完整基因组长度为29,740bp。该序列可在Genbank上获得且GC含量为40.8％，可与相同家族的已知病毒的GC含量相比。基因组结构与其它冠状病毒结构类似。预测有14个可读框。基因组和基因产物的主要结构示于图17和表10。SARS基因组与冠状病毒组1、2和3间的比较报导于图18。
核苷酸1-73包含预测的RNA前导序列，前导序列之后是含197个核苷酸的非翻译区(UTR)。UTR之后是2个重叠可读框(ORF1a，ORF1b)，它们涵盖三分之二的基因组(核苷酸265-21485)。它们编码大多蛋白，预计此多蛋白由病毒蛋白酶加工以产生复制酶复合体。基因组的3’部分包含编码4个结构蛋白(S，刺突蛋白、E，包膜蛋白、M，基质糖蛋白和N，核壳蛋白)的基因和8个具有未知功能的预测ORFs(图17)。最后，在基因组的3’末端，我们发现第2个具有340个碱基的UTR，其后面是poly(A)段。我们鉴定了一个推定的基因间(IG)序列，也称为转录相关序列(TAS)，这是冠状病毒的典型特征。IG序列的特征是在前导序列3’末端存在6-18个核苷酸且可在各基因的前面发现。IG序列在RNA转录和其复制中发挥关键作用。SARS病毒的IG序列特征是序列SEQ ID NO：7293且在基因组中存在9次(图17)。前导序列和IG序列对于各冠状病毒特殊，代表病毒的特异信号。
复制酶区域
复制酶基因ORF1ab(SEQ ID NO：7232)由2个重叠ORFs即ORF1a和ORF1b组成，此基因能翻译成一个单一多蛋白，这是通过在聚合酶编码区内的位置13,393移框核糖体。参见Brierley等，Embo J 1987：6(12)：3779-3785。如所预期的，在此位置下游10个碱基对处存在一个茎环序列(SEQ ID NO：7390；5’- CGGTGTAAGTGCAGCCCGT CTTACACCG-3’)。此多蛋白通过其自身编码的蛋白酶共翻译切割或翻译后切割成多个蛋白。使用切割共有序列和用其它冠状病毒模拟，我们绘制了该多蛋白可能切割位点的图谱并鉴定了14种产物，包括前导蛋白p28、MHV p65蛋白同源物和其它12种从nsp1命名到nsp13的蛋白(nsp，非结构蛋白)(图17和表10)。氨基酸序列分析提示在推定的ORF1ab蛋白内存在一些功能基序。我们特定作了ORF1a内2种潜在蛋白酶(nsp1和nsp2)、1种类生长因子基序的图谱，而在ORF1b中，我们鉴定了RNA聚合酶(nsp9)和预测的解旋酶(nsp10)。其它预测的切割产物(nsp3、nsp4、nsp5、nsp6、nsp11、nsp12和nsp13)是功能未知的蛋白。许多这些蛋白推测存在于RNA复制复合体中，此复合体与受感染细胞中的膜结构相关。nsp3和nsp4特定包含疏水结构域。如图18所示，SARS复制酶区域具有与冠状病毒组1、2和3类似的组成；然而，总体氨基酸保守性低(表11)。大部分保守蛋白是聚合酶和解旋酶。
Nsp1是类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶(PLP)，它切割最初的2个蛋白产物(前导序列蛋白p28和p65同源物)。在MHV的nsp1内，作了2个有类木瓜蛋白酶活性的结构域的图谱(Kanjanahaluethai等(2000)J.Virol 74(17)：7911-21)，这些结构域也在牛传染性肠胃炎病毒(TGV)和人229E冠状病毒中保守。然而，通过用SARS nsp1序列对比，我们鉴定了唯一一个含催化残基Cys833和His994的PLP结构域。
Nsp2是胰凝乳蛋白酶-小核糖核酸病毒类3C蛋白酶(3CLp)，负责其它12种蛋白的翻译后加工，大部分这些蛋白在Q/A或Q/S位点切割(Ziebuhr等(1999)J.virol73(1)：177-85)。Nsp2也具有自我蛋白酶解活性。主要的催化残基在其它冠状病毒中较好地保守且位于位置His41和Cys145。此外，在SARS 3CLp序列中甚至发现了保守氨基酸Tyr161和His163，它们被认为参与底物识别和对于蛋白酶解活性必不可少(Hegyi等(2002)J.Gen Virol 83(Pt3)：581-593)。
发明包括SEQ ID NO：9960的1ab序列和SEQ ID NO：9961的orf1a序列，包含片段、变体、同源物等。
结构区域
分析SARS基因组3’部分的核苷酸序列鉴定出了12个预测可读框。它们在8.2kb内编码并包括4种结构蛋白S、E、M和N，这些蛋白对于所有冠状病毒和8个预测ORFs普遍，它们特异于此病毒。大部分ORFs上游的SARS-特异IG序列(图17&18)提示大部分基因可能独立转录。有趣的是，与组2IG相同的序列也存在于RNA前导序列末端和基质编码基因及ORF的前面。
刺突是I型糖蛋白，它在病毒体表面形成大刺突且负责受体结合和膜融合(Gallagher(2001)Adv Exp Med Biol 494：183-92)。该蛋白长1255个残基，有17个预测N-糖基化位点。它具有13aa前导肽和17aa C-末端膜锚定序列(1202-1218)。一些(MHV、HCoV-OC43、AIBV和BCoV)但不是所有(TGV、FIPV、HCoV-229E)冠状病毒刺突蛋白在2个亚基S1和S2中蛋白酶解切割。假定S1形成球状头，球状头保持与C-末端膜锚非共价连接。切割由碱性氨基酸序列调节，此序列类似弗林蛋白酶切割位点的共有序列(Garten等.，Biochimie 1994；76(3-4)：217-225)。然而，在此SARS病毒分离物的情况中，我们未能鉴定出这种序列，表明此SARS病毒分离物的S蛋白不太可能在成熟过程中切割。二级结构预测指示刺突蛋白的球形结构在所有已知冠状病毒中保守。S1结构域主要由β片层形成且可能采用球状折叠，而在S2结构域中，预测有广泛的α螺旋区。另外，特定设计用于鉴定病毒膜融合蛋白中卷曲螺旋类似区的LearnCoil-VMF程序预测S2内有2个卷曲螺旋，分别横跨氨基酸900-1005和1151-1185(图19)。2个卷曲螺旋区都包含亮氨酸拉链基序，此基序也在所有冠状病毒的刺突中存在。已知亮氨酸拉链促进蛋白寡聚；由于TGV和MHV的刺突蛋白形成异三聚体(Delmas等，J Virol1990；64(11)：5367-5375)(Godeke等.，J Virology2000；74(3)：1566-1571)，可想像它在SARS亮氨酸拉链中起到促进和/或稳定相似四级结构的作用。刺突蛋白在冠状病毒生物学中发挥主要作用，因为S1结构域包含受体结合结构域和病毒中和抗原表位，而S2结构域参与对病毒感染性必需的膜融合过程。如所预期的，不同刺突蛋白的多重序列对比显示S1结构域内的变异性程度大，而S2更保守。
包膜蛋白E是非常短的多肽，有76个氨基酸，参与病毒体包膜的形态发生(Godet等.，Virology 1992；188(2)：666-675)。计算机分析预测有靠近N末端的长跨膜结构域和2个N糖基化位点。与其它冠状病毒的氨基酸类似性很低，最大的同源性是与传染性肠胃炎病毒(TGV)的小包膜蛋白。
基质糖蛋白(M)是有221个残基的多肽，预测分子量为25kDa。计算机分析预测的拓扑结构由短氨基末端胞外域、3个跨膜区段和位于病毒包膜内侧的羧基末端组成。用TGV、禽传染性肠胃炎病毒(AIBV)和超毒力MHV-2菌株的基质糖蛋白模拟，SARS M糖蛋自在N末端N-糖基化。SARS M糖蛋白显示与组2病毒相似性最高(表11)。
最后，核壳蛋白N是长397个残基的磷蛋白，与病毒基因组RNA相互作用以形成核壳。与其它冠状病毒的保守性水平低，范围从与HCoV-229E的26.9％同一性到与牛冠状病毒(BcoV)的37.4％同一性(表11)。核壳蛋白的抗原表位分析已完成(Li等.(2003)Geno Prot&Bioinfo 1：198-206)，其中蛋白C末端的抗原表位位置定位于SEQ ID NO：7394(SEQ ID NO：6052的氨基酸371-407)。
除了上面的基本蛋白外，许多病毒表达一组其它肽，这些肽一般对于成活力不必需，但能影响病毒的感染潜力(de Haan et al.，Virology 2002；296(1)：177-189)。这些蛋白一般在相同血清组的成员中保守，但在组间差异显著。由于这个原因，它们一般称作组特异蛋白(图11)。组1的成员在这里由HcoV-229E作为代表，具有2个组特异基因，位于S和E基因间且有时在N基因下游1或2个ORFs，在基因组的3’UTR区前。组2的病毒以MHV作为原型，具有2个在ORF1b和S间的组特异基因(2a和HE)以及其它2个在S和E基因间的组特异基因。最后，组3病毒由原型AIBV作为代表，具有在S和E基因间的2个组特异基因和其它2个在M和N基因间的组特异基因。
除已证明有血凝和乙酰酯酶酶活性的血凝素酯酶HE以外，所有其它组特异ORFs编码蛋白，蛋白的作用尚未确定。
有趣的是，SARS基因组中特异基因排列独特且预测的ORFs未表现出与其它冠状病毒所存在ORFs有任何显著的同源性，也不与来自不同生物体的任何其它已知蛋白有显著同源性。像组1和3的病毒，SARS缺乏HE血凝素且不包含在ORF1b和S基因间的ORFs。此外，2种预测ORFs(ORF3和ORF4)在S和E间的区域中编码，叠加作用于它们大部分的长度。ORF3具有IG序列，在ATG起始密码子上游2bp。与其它组相反，SARS在M和N基因间的区域包含5个预测ORFs。ORF7位于M基因终止密码子下游10个碱基处，具有的IG序列在ATG起始密码子上游155个核苷酸。类似的，ORF8和ORF10呈现的IG就在ATG起始密码子上游。另一方面，ORF9和ORF11的5’末端与侧翼基因简短叠加，由于这个原因，它们不需IG激活转录。ORF12与N基因完全叠加且与MHV病毒的22kDa蛋白同源性很低，后者在对应区域中编码。
尽管没有可能定位的指示和获得自序列相似性的功能，ORF3、ORF7和ORF8包含疏水区段，提示与膜结构相关。另外，SARS特异基因中最长的ORF3是唯一编码含大量预测O-糖基化位点的肽的ORF(表11)。在ORF3、ORF11和ORF12中鉴定出预测的N-糖基化位点。
非结构区中的2个较短ORFs是SEQ ID NOS：9965和9966。发明包括具有这些序列的多肽，以及片段、变体等。
系统发生分析
过去使用来自3个不同血清组的11种冠状病毒pol基因的922个保守碱基内的取代频率来显示各血清组成员中的变异性比不同血清组间的变异性小许多，确认上述血清学分组(Stephensen等.，Virus Res 1999；60(2)：181-9)。我们使用SARS pol基因的922bp区域并将它与来自其它12种冠状病毒的相同片段进行对比。所得树状图显示SARS病毒不同于其它3个冠状病毒组(图20)。使用来自复制酶区域的pol、3CL-蛋白酶和解旋酶的全长氨基酸序列以及来自结构区域的刺突和基质糖蛋白的全长氨基酸序列，获得类似结果(数据未出示)。这些数据确认在一个新的冠状病毒组(组4)中的SARS病毒簇的完整基因组。
为更清楚了解可能的进化关系，我们使用蛋白预测结构域的共有序列进行了分析。我们特定产生了来自组1和组2的刺突蛋白S1结构域的共有序列，随后我们将它们与SARS刺突的S1结构域相比较。未能从组3产生共有区，因为仅已知AIBV的刺突蛋白。有趣的是，通过对比SARS S1与产生自2组刺突蛋白的共有区而构建的树不同于图20中的树，它显示的SARS与冠状病毒组2间的关系密切许多(图21A)。进一步的分析显示SARS S1结构域中所存在20个半胱氨酸中的19个与组2共有序列在空间上保守，而仅5个维持组1和组3序列内(图21B)。考虑到半胱氨酸在蛋白折叠中发挥的基本作用，可能SARS S1结构域与冠状病毒组2共享一个类似的空间结构。
SARS冠状病毒间的序列变异性
我们比较FRA序列与网上可获得的4种完整SARS基因组。检测到总共30个突变。这些突变中9个沉默，而21个导致氨基酸取代(表12)。在ORF1a内，检测到3个沉默和7个生产性突变(productive mutations)。在ORF1b中，有5个沉默和3个生产性突变。一种生产性突变由2个核苷酸取代引起，2个核苷酸取代导致单个氨基酸变化。5种变化定位于刺突蛋白中，其中4个是生产性且1个是沉默。ORF3和基质糖蛋白M中有2个生产性突变。ORF10和核壳蛋白N中有1个生产性突变。
FRA与TOR2间的总差异是9个核苷酸，产生2个沉默突变和7个氨基酸变化。FRA与Urbani间的总差异是12个核苷酸，产生5个沉默突变和7个氨基酸变化。对于CUHK，有16个核苷酸不同，其中5个是沉默突变。对于FRA和HKU 14，核苷酸变化产生4个沉默和9个生产性突变。
实施例2-生产、灭活和纯化完整SARS病毒，使用MCS层析树脂纯化，接着用密度梯度超速离心
SARS病毒分离物FRA1(EMBL：AY310120)在VERO细胞上传代，细胞培养于DMEM(Gibco：目录号21969-035，批号3078864)、青霉素/链霉素(Gibco：目录号15070-063，批号1120042)和3％FCS(Gibco：目录号10270-106，批号40F6130K)，在37℃，5％CO2。使用胰蛋白酶(Gibco：目录号25300-054，批号3078729)以使细胞脱离。
为生成病毒，第3次传代用于接种VERO细胞，moi为~0.1。细胞在感染性培养基(无PS的DMEM，FCS)中用病毒37℃孵育1小时；1小时后，细胞洗2遍并在3％FCS和抗生素存在时37℃再孵育48小时。感染后(p.i.)48小时收集上清，通过在3000rpm4℃离心10分钟来预清除。
灭活SARS病毒是通过β-丙酸内酯(BPL)在4℃处理(1∶2000)18小时，接着37℃3小时。测试病毒是否成功灭活，VERO细胞用10ml BPL处理的上清在37℃孵育4天；随后，上清转移到新鲜VERO细胞培养物中并再孵育4天。检查细胞的致细胞病变效应(CPE)。
200ml BPL-灭活的SARS病毒收集物随后用0.65μm-孔尺寸滤器(47mm直径)澄清，以使病毒粒子通过并保持细胞碎片。滤器单位连接Masterflex泵，此泵实现40ml/分钟的恒定流速。
A.MCS层析纯化步骤
过滤的病毒悬浮液随后进行MCS层析。MCS柱如下准备。27ml浆液产生14ml沉积树脂，树脂用G_tec Superformance柱(直径1.0cm，高15.7cm，体积12.33ml)填充。1％柱体积的1％丙酮溶液注入柱中且柱以100cm/小时流速跑。随后，HETP、N和As值算作HETP：0.056cm，N/m：1790和As＝1.20。
评估MCS层析步骤后纯化溶液中的蛋白量，用二辛可酸(BCA)方法((Interchim)(参见例如http：www.piercenet.com/files/bca.pdf)和电泳。
SDS-PAGE根据Laemmli，Nature(1970)227：680-685进行。SDS-PAGE的样品稀释到蛋白浓度为77μg/ml。加不同蛋白浓度，这取决于所用凝胶种类(10/12/15孔，Novex/Invitrogen)：
  孔数   蛋白稀释浓度   加样   蛋白/孔
  10孔   77μg/ml   20μl   1μg
  12孔   77μg/ml   15-20μl   0.75-1μg
  15孔   77μg/ml   10μl   0.5μg
用于还原性SDS-PAGE的样品如下准备：
  26μl样品或稀释样品
  +10μl NuPage样品缓冲液(4x)SDS NP0003
  +4μl TCEP Bondbreaker溶液77720(在MilliQ水中1∶2)
  终体积：   40μl
样品在70℃加热10分钟或室温保留1小时(样品留在室温可防止冠状病毒的M蛋白凝结/形成复合体)，随后在台式离心机中以14，000离心约1分钟。
用于凝胶的标记如下准备。含少于1μg蛋白的凝胶带易通过银染过程呈现，使用银染试剂盒蛋白加一种染色操作(Pharmacia Biotech)。
蛋白质印迹如下进行。半干印迹技术用于将蛋白从SDS凝胶转移到硝化纤维膜。转移用0.8mA/cm2的电流进行1小时。抗SARS病毒的兔多克隆抗体用于进行免疫探测，使用Western Breeze，Novex显色蛋白质印迹免疫检测试剂盒(Novex/Invitrogen)。
灭活SARS MCS捕获步骤的层析图示于图27。为估计纯度，通过在NuPage 10％或4-12％ Bis-Tris-凝胶(Novex)上银染来分析MCS层析部分，银染是在还原条件下，70℃加热10分钟(图28)。这些部分也在相同条件下通过蛋白质印迹分析(图29)以估计纯度，使用PAK 11/03 SARS Cov 270603，中和效价1∶512(此抗体用于这次和随后的蛋白质印迹)。纯度估计如下：
样品   体积/ml   [蛋白]/μg/ml   总蛋白/mg   步骤蛋白回收/％
  冠状病毒收集物   100   2547.6   254.76   100
  过滤后＝加样   100   2440.3   244.03   95.8
  流过   85   2321.4   197.32   77.5
  洗   49.32   468.5   23.11   9.1
  峰1   12.12   252.7   3.062   1.2
  总回收   -   -   464.4   86.5
B.密度梯度超速离心步骤
洗脱的SARS病毒部分随后进行密度梯度超速离心，使用吊桶式转头以进一步纯化灭活病毒。3ml MCS峰部分在线性梯度上加样(15-60％蔗糖；17ml 15％和17ml 60％蔗糖，在梯度混合器中)。分离用Beckman SW 28转头以20,000rpm进行2小时。
线性梯度超速离心部分中的蔗糖和蛋白含量示于下表、图30中的图表和图31中的纯度估计：
  部分   部分大小/ml   [蔗糖]/％   [蛋白]/μg/ml
  1   2   61   96.12
  2   2   59.4   98.62
  3   2   57.5   87.63
  4   2   54.5   86.91
  5   2   50.5   79.9
  6   2   47.2   74.3
  7   2   43.7   68.05
  8   2   40.2   60.43
  9   2   37.2   57.38
  10   2   34   53.12
  11   2   30   50.63
  12   2   25.7   35.02
  13   2   22.4   35.33
  14   2   19.5   39.25
  15   2   15.5   69.79
  16   2   8.5   169.03
  17   2   8.5   128.96
相对标准曲线再次测量部分11的蛋白浓度(图31SDS-凝胶)，标准曲线在30％蔗糖中制备且使蛋白浓度为3.67μg/ml(凝胶上0.05μg)。M蛋白似乎在此制品中缺失，这可能是由样品处理过程引起(加热样品)。
由于此测定的蔗糖干扰，表2的蛋白浓度测量可能有差异。
实施例3-生产、灭活和纯化完整SARS病毒，使用MCS层析树脂纯化，接着用密度梯度超速离心
灭活SARS病毒如上面实施例所述制备。
A.MCS层析纯化步骤
在此例子中，200ml灭活SARS病毒收集物进行MCS层析。使用MCS的灭活SARS病毒纯化捕获步骤的层析图示于图32、下表的蛋白回收和图33的纯度估计。
样品   体积/ml   [蛋白]/μg/ml   总蛋白/mg   步骤蛋白回收/％
  冠状病毒收集物   200   2239.2   447.83   100
  过滤后＝加样   200   2245.1   449.02   100.3
  流过   185   2126.3   393.37   87.8
  洗   49.32   450.1   22.2   5.0
  峰1   4.43   1245.6   5.52   1.2
  总回收   -   421.08   93.7
B.密度梯度超速离心步骤
3.5ml MCS峰部分随后加样到线性梯度上(15-40％蔗糖；16ml 15％和16ml 40％蔗糖，在梯度混合器中)。分离用Beckman SW 28转头以20,000rpm进行2小时。
线性梯度超速离心部分中的蔗糖和蛋白含量示于下表和图34中的图表：
  管   部分大小/ml   [蔗糖]/％   [蛋白]/μg/ml
  1   2   40   45.86
  2   2   39   45.68
  3   2   37.5   44.14
  4   2   35.5   37.82
  5   2   33.5   34.48
  6   2   31.5   31.76
  7   2   30.5   29.49
  8   2   28   30.87
  9   2   25.5   31.7
  10   2   23.5   26.74
  11   2   21.75   23.58
  12   2   20   35.33
  13   2   18   96.38
  14   2   14.5   523.79
  15   2   8   941.97
  16   2   8   696.7
蛋白回收示于下表且纯度估计示于图35。密度梯度部分8、9和10的电子显微照片示于图36：
  步骤   体积/ml   蛋白/μg/ml   总蛋白/mg   步骤蛋白％
  加样   3.5ml   1245.6   4359.6   100
  大批蛋白部分   3.5ml   720.8   4324.9   99.2
  病毒蜂部分   8ml   29.7   237.6   5.5
  总回收   4562.5   104.7
实施例4-用灭活SARS病毒免疫小鼠
小鼠在第0、14和28天用5μg BPL-灭活SARS-CoV粒子(BPL-SARS-CoV)皮下免疫，单独或与作为佐剂的Alum或MF59一起。在第0(免疫前)、13(第1次免疫后)、28(第2次后)和35天(第3次免疫后1周)收集血清。评估中和抗体在体外阻断SARS-CoV感染Vero细胞。3次免疫后，中和效价范围在1∶100-1∶1000，水平类似于SARS恢复期病人血清中存在的水平。如下表所示，无佐剂疫苗在第3次免疫后诱导中和抗体，通过包含佐剂可显著提高此疫苗效力，中和抗体在第2次免疫后出现且在随之的第3次免疫后总效价增加。
  免疫原                    中和效价
  之前   第1次后   第2次后  第3次后
  BPL-SARS-CoV+MF59(5μg)  ＜1∶20   ＜1∶20   1∶158  1∶630
  BPL-SARS-CoV+Alum(5μg)  ＜1∶20   ＜1∶20   1∶67  1∶612
  BPL-SARS-CoV(5μg)  ＜1∶20   ＜1∶20   ＜1∶20  1∶71
  PBS  ＜1∶20   ＜1∶20   ＜1∶20  ＜1∶20
实施例5-用灭活SARS病毒免疫Balb/c小鼠
发展了用于SARS感染的Balb/c小鼠模型(Subbarao等.(2004)，J.Virol.，78：3572-77)。在此模型中，Balb/c小鼠用104TCID50病毒鼻内接种。接种后48小时，在感染小鼠肺中能检测到TCID50病毒效价增加2-log。尽管病毒复制易检测，小鼠未显示任何SARS疾病症状并在接种后1周自发清除病毒。先前免疫的动物的病毒效价相较对照动物减少，证明所评估疫苗的保护效果。
在此例子中，每组4只Balb/c小鼠用5μg BPL-灭活SARS-CoV粒子免疫3次(第0、14、28天)，单独或结合MF59，在第43天用104TCID50SARS-CoV攻击。病毒攻击后2天，小鼠安乐死，定量鼻甲(NT)和肺的SARS-CoV并测量各小鼠的平均病毒效价。对照组接受单独PBS，或接受流感病毒(FLU)，有或没有MF59佐剂。数据如下(也参见图51)，其中每组测试4只小鼠且病毒效价表示为log10TCD50每克组织：
免疫原   受攻击小鼠肺中的病毒复制   受攻击小鼠鼻甲中的病毒复制
  #感染/#测试   平均值(±SE)病毒效价   #感染/#测试   平均值(±SE)病毒效价
  PBS   4/4   6.3±0.3   3/4   2.8±0.35
  单独MF-59   4/4   6.1±0.13   3/4   3.0±0.38
  FLU疫苗(5μg)   4/4   6.3±0.07   3/4   2.9±0.36
  FLU疫苗(5μg)+MF-59   4/4   6.0±0.19   4/4   3.0±0.11
  BPL-SARS-CoV(5μg)   _   1.6±0.13*   0/4   未检测到**
  BPL-SARS-CoV(5μg)+MF-59   0/4   未检测到*   0/4   未检测到**
与PBS免疫小鼠相比，双尾斯氏t检验显示：*P＜0.00001或**P＝0.025
如所示，BPL-SARS-CoV免疫小鼠中不能检测到病毒。10％w/v肺匀浆悬浮液中感染性病毒检测的下限是1.5log10TCID50/gm，5％w/v鼻甲悬浮液中界限是1.8log10TCID50/gm。因此，免疫哺乳动物中的病毒效价低于这些起始值。
因此，灭活SARS-CoV疫苗在预防病毒感染中很有效，用疫苗的8只小鼠中仅1只受感染，疫苗有或没有MF59佐剂。在对照组中没有观察到类似保护性，对照组是PBS稀释液、MF59佐剂或流感病毒疫苗，疫苗有或没有MF59佐剂。
在第1次免疫后2周、第2次免疫后1周和第3次免疫后1周评估取自攻击研究中动物血清的中和效价。用具MF59佐剂的疫苗免疫的小鼠在第2次免疫后已发展出1∶71的中和效价，在第3次免疫后增加到1∶588，而接受无佐剂疫苗的小鼠在第2次免疫后没有任何中和活性且第3次免疫后的中和效价为1∶64。各对照组小鼠的血清未显示任何中和活性。这些数据不仅清楚证明灭活SARS-CoV疫苗诱导保护性SARS中和抗体的能力，也证明用佐剂制成疫苗对提高中和效价的有益效果。
实施例6-制备含SARS病毒抗原的OMV
大肠杆菌(E.coli)用感兴趣质粒(编码SARS病毒抗原)转染。有感兴趣质粒的单一菌落在20ml LB/Amp(100μg/ml)液体培养物中37℃过夜生长。细菌在1.0L新鲜培养基中1∶30稀释并在30℃或37℃生长，直到OD550达到0.6-0.8。用终浓度1.0mM的IPTG诱导表达重组蛋白。孵育3小时后，通过在8000×g 4℃离心15分钟来收集细菌并重悬于20ml 20mM Tris-HCl(pH 7.5)和完整蛋白酶抑制剂(Boehringer-MannheimTM)。所有随后的过程都在4℃或冰上进行。
细胞通过超声波降解破裂，使用Branson Sonifier 450，并以5000×g离心20分钟以沉淀未破损细胞和内含体。含膜和细胞碎片的上清以50000g(Beckman Ti50，29000rpm)离心75分钟，用20mM Bis-tris丙烷(pH 6.5)、1.0M NaCl，10％(v/v)甘油洗，再次以50000g 75分钟沉淀。沉淀重悬于20mM Tris-HCl(pH 7.5)、2.0％(v/v)肌氨酰、完整蛋白酶抑制剂(1.0mM EDTA，终浓度)并孵育20分钟以溶解内膜。细胞碎片通过5000g离心10分钟来沉淀且上清以75000g离心75分钟(Beckman Ti50，33000rpm)。外膜用20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗，以75000g离心75分钟或过夜。OMV最终重悬于500μl 20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10％v/v甘油。蛋白浓度通过标准Bradford测定(Bio-Rad)估计，而内膜部分的蛋白浓度用DC蛋白测定(Bio-Rad)确定。来自分离过程的不同部分用SDS-PAGE测定。
实施例7-重组刺突蛋白在小鼠中的免疫原性、剂量和途径安排
评估发明的重组刺突蛋白在小鼠中的免疫原性、途径和剂量，使用下述详细操作。施用的抗原优选至少在1/100-1/1000范围中引起中和抗体。能测试增加剂量的抗原，范围从5到20μg重组刺突抗原，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在100μl接种体中施用SC或IM给麻醉小鼠。BALB/c小鼠组在第0天致敏且在第14和28天加强，每次处理6只。
  组   处理   剂量/途径   取样间隔1   小鼠数
  1-3   Rec-刺突蛋白   20，10，5μg/SC   7，21，35，42天   6只每剂量水平
  4-6   Rec-刺突蛋白   20，10，5μg/SC   7   6只每剂量水平
  7-9   Rec-刺突蛋白   20，10，5μg/IM   7，21，35，42天   6只每剂量水平
  10-12   Rec-刺突蛋白   20，10，5μg/IM   7   6只每剂量水平
  13-15   Rec-刺突-MF59   20，10，5μg/SC   7，21，35，42天   6只每剂量水平
  16-18   Rec-刺突-MF59   20，10，5μg/SC   7   6只每剂量水平
  19-21   Rec-刺突-MF59   20，10，5μg/IM   7，21，35，42天   6只每剂量水平
  22-24   Rec-刺突-MF59   20，10，5μg/IM   7   6只每剂量水平
  25   MF59   NA/SC   7，21，35，42天   6+6(第7和42天杀死)
  27   MF59   NA/IM   7，21，35，42天   6+6(第7和42天杀死)
  29   盐水   NA/SC   7，21，35，42天   6+6(第7和42天杀死)
  31   盐水   NA/IM   7，21，35，42天   6+6(第7和42天杀死)
此操作也能用于评估重组刺突蛋白引起的特异免疫反应的Th1/Th2分布。在第7、21和35天评估中和与刺突特异抗体效价；在第21和35天确定刺突特异抗体的IgG2avs IgG1同种型；分别在第7和42天确定淋巴结和脾T细胞抗重组刺突蛋白的体外增生；在第42天评估脾T细胞抗重组刺突蛋白的IFN-γ和IL-4生成，重组刺突蛋白来自SARS-CoV。在第7、21和35天收集外周血；在第7天收集淋巴结细胞，第42天收集脾细胞。通过SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价及同种型。淋巴结和脾T细胞增生通过3[H]-胸苷吸收确定。T淋巴细胞生成脾IFN-γ和IL-4的频率通过ELISPOT和FACS确定。
实施例8-刺突蛋白在兔中的免疫原性、剂量和途径安排
评估发明的重组刺突蛋白在兔中的免疫原性、途径和剂量，使用下述详细操作。能测试增加剂量的抗原，范围从5到40μg重组刺突抗原，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在200μl接种体中施用SC或IM给麻醉动物。新西兰白色雌兔组如下表所示免疫，每次处理10只。动物在第0天致敏且在第14和28天加强。在第7、21和35天收集外周血。通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价。
  组   处理   剂量/途径   取样间隔   兔数量
  1-4   全长刺突蛋白   40，20，10，5μg/SC   7，21，35天   10只每剂量水平
  5-8   全长刺突蛋白   40，20，10，5μg/IM   7，21，35天   10只每剂量水平
  9-12   截短的刺突蛋白   40，20，10，5μg/SC   7，21，35天   10只每剂量水平
  13-16   截短的刺突蛋白   40，20，10，5μg/IM   7，21，35天   10只每剂量水平
  17-20   全长刺突蛋白-MF59   40，20，10，5μg/SC   7，21，35天   10只每剂量水平
  21-24   全长刺突蛋白-MF59   40，20，10，5μg/IM   7，21，35天   10只每剂量水平
  25-28   截短的刺突蛋白-MF59   40，20，10，5μg/SC   7，21，35天   10只每剂量水平
  29-32   截短的刺突蛋白-MF59   40，20，10，5μg/IM   7，21，35天   10只每剂量水平
  33   MF59   NA/SC   7，21，35天   10
  34   MF59   NA/IM   7，21，35天   10
  35   Saline   NA/SC   7，21，35天   10
  36   Saline   NA/IM   7，21，35天   10
实施例9-重组刺突蛋白在雪貂中的免疫原性和剂量安排
评估发明的重组刺突蛋白在雪貂中的免疫原性和剂量，使用下述详细操作。3组雪貂，6只用于处理，雪貂用来自CHO细胞系的重组SARS-CoV刺突蛋白免疫，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在200μl接种体中施用SC给麻醉动物。重组刺突蛋白疫苗在引起小鼠中最高中和抗体效价时测试，在第2次强化后35天。动物在第0天致敏且在第14和28天加强。在第7、21和35天收集外周血。通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价。
  组   处理   剂量/途径   取样间隔   雪貂数
  1&2   Rec-刺突蛋白 Yμg或2Yμg/SC   7，21，35天   6
  3&4   Rec-刺突蛋白+MF59 Yμg或2Yμg/SC   7，21，35天   6
  5   盐水 NA/SC   7，21，35天   6
用于上面免疫原性研究的3组雪貂，6只每组，随后能用于评估重组刺突蛋白保护免疫动物免于感染和/或疾病的功效。在最后一次气管内强化2周后，用106中间组织培养感染量单位(TCID50)的SARS-CoV Utah菌株攻击麻醉动物。通过在攻击后20天从动物中取鼻、咽(faringeal)和直肠棉拭来评估SARS-CoV感染，如上所述(12)。通过RT-PCR和Vero细胞感染测定来评估样品物质中SARS-CoV的存在。监控动物的SARS临床征兆，这是通过评估睡眠时间、温度、呼吸症状、腹泻、体重和存活。通过病毒释放量和持续时间及疾病症状严重度和存活动物百分比确定保护性。
实施例10-表达用于免疫的刺突蛋白
SARS-CoV刺突糖蛋白以全长和截短形式表达，使用上述nSh和nShΔTC pCMVIII构建，2者都有六组氨酸标记。在转染到293细胞和COS7细胞48小时后评估载体构建的表达。通过蛋白质印迹仅在细胞裂解物中检测到全长刺突蛋白(nSh)，而培养基中没有(图52)。
大部分SARS-CoV全长刺突蛋白在瞬时转染的COS7细胞中表达为高分子糖蛋白，在非还原性凝胶上以540kDa跑(图53)。gp540是热不稳定性，这是由煮沸时完全解离成单体形式(gp170 & gp180)所指示，但它抗DTT处理。这些数据提示重组刺突蛋白非共价联成同三聚体(gp540)。在灭活、纯化SARS-CoV病毒粒子中也确认同三聚体联接中存在刺突蛋白。蛋白质印迹分析病毒体蛋白产生几乎相同的结果，所用条件与确定刺突蛋白特征相同(图54)。
实施例11：刺突蛋白加工
为确定刺突蛋白加工的特征，用表达SARS-CoV全长刺突的甲病毒复制子粒子感染BHK-21细胞。以MOI 5感染6小时后，受感染细胞用L-[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸标记1小时并追踪至4小时。[35S]标记的刺突蛋白通过抗SARS兔血清免疫沉淀并用Endo-H消化。消化和未消化蛋白都通过SDS-PAGE(4％聚丙烯酰胺)分析。如图55所示，全长刺突蛋白合成为Endo-H敏感性高甘露糖糖蛋白(gp170，ER形式)，它经历修饰成为有完整寡糖的Endo-H抗性糖蛋白(gp180，高尔基体形式)。gp170转变成gp180形式在2小时内发生(图56)。
实施例12：高水平蛋白表达
为发展用于迅速表达蛋白抗原的体系，使用DNA转染293(人胚肾)细胞，以获得毫克量的重组抗原。最普通的培养和转染293细胞方法是在静态或单层培养物中。修改这些过程，通过在悬浮液中大规模转染293细胞和扩充悬浮培养物中的转染细胞用于生成分泌或胞内蛋白。一些初始实验在100毫升规模培养物上进行以确定最优条件，如细胞数、转染试剂类型(FuGENE 6，Lipitoid或RO-1538)和DNA与转染试剂的比例。在预实验基础上，FuGENE 6是最佳转染试剂。
比较基因表达的动力学与其它病毒包膜糖蛋白的动力学，数据提示稳定的蛋白表达约在转染后72到96小时达到最高，之后显著减少，达到最高峰取决于感兴趣的基因。因此，使用最优条件，转染方法依比例从100ml到4升。4升培养物能用于迅速生成2-10毫克蛋白抗原。为促进抗原纯化并且最大化纯化蛋白的产量和回收，通过使用无血清培养基来优化转染条件。
大批转染方法用于表达截短和全长刺突蛋白。表达刺突蛋白截短形式的动力学示于图56A。刺突蛋白截短形式的表达在约48小时达到最高并稳定直到72小时，因此在转染后72小时收集培养物。
收集的培养基浓缩20X并用于纯化截短的刺突蛋白，纯化是通过一个很简单的纯化策略，其中在GNA凝集素上捕获刺突截短形式，接着用DEAE和陶瓷羟磷灰石柱层析。纯化蛋白在SDS-PAGE上通过银染分析(图56B)，并也通过蛋白质印迹分析(图56C)。早期努力能纯化＞95％纯度的刺突蛋白截短形式且回收约50％。刺突蛋白截短形式的分子量约为170-180kDa。
全长刺突蛋白在293细胞中表达，使用大批转染策略。表达数据提示像截短形式，表达在转染后约48小时达到最高并保持稳定直到72小时。然而，与截短形式和所预期相反，全长蛋白并未分泌，而是保留在细胞内，如细胞培养物上清的蛋白质印迹中没有任何信号所示。蛋白全长形式从Triton X-100洗涤剂提取的细胞中纯化。随后在GNA凝集素上捕获全长刺突蛋白，接着用羟磷灰石和SP层析。全长刺突蛋白的计算分子量约为600kDa，接近三聚体的理论质量。
实施例13：SARS病毒种子培养物
SARS-CoV参考种子病毒仅在经检验的Vero细胞中增殖，此病毒用于在GMP下产生主要病毒(Master)和工作病毒种子(Working Virus Seeds)。来自SARS-CoV感染患者呼吸道的临床样本接种到有文献证明的Vero细胞中，使用检定培养基。含病毒的培养基在感染后4天收集并命名为传代1(P1)。第2轮病毒增殖再次在合格VERO细胞中进行，用检定培养基，每T-75长颈瓶接种1ml 100倍稀释的P1病毒。培养物上清在感染后3天收集并保存在-80℃作为P2参考储备病毒，没有进行噬斑纯化。
用于进一步生成SARS-CoV的Vero细胞细胞库制备自特定细胞亚群，此亚群自传染性海绵状脑病出现以来未使用过(如自从1980年)。这些细胞的研究细胞库用指定新西兰来源胎牛血清制备。对于此研究细胞库，主细胞库(MCB)在GMP条件下制成且仅使用指定和控制较好的培养基和添加物。测试细胞库是否没有外来试剂，根据可适用的US、EU和国际指导方针(参见Points To Consider“用于生成生物制品的细胞系特征”，FDA/CBER 7/1993；ICH Q5D Draft 6“细胞底物”，1996年10月23日；CPMP/ICH/294/95“生物技术产品质量指南注释：获得用于生成生物技术/生物制品的细胞底物和特征确定”(步骤4，97年7月16日)；WHO终稿“动物细胞用作生成生物制品的体外底物的要求”1997年3月7日)。此细胞库也需要测试致瘤性和同一性。
参考病毒经噬斑纯化并在无FCS的合格Vero细胞中扩增以产生主和工作种子。另一种有助于确保主种子纯度和促进安全性评估的选择是沉淀SARS-CoV并重悬于PBS。病毒悬浮液制成至多60％(w/w)蔗糖，有结晶蔗糖，悬浮液转移到离心管，用PBS中50、40、30和20％(w/w)蔗糖溶液覆盖。梯度离心72小时，随后分级分离。稀释含病毒的部分且通过超速离心再沉淀病毒体。分离来自病毒沉淀的RNA并转染到合格Vero细胞中，其中“感染性”正链RNA会导致感染性病毒生成，此病毒可噬斑纯化并扩增以从纯化病毒RNA产生另外的主和工作种子。
测试病毒种子是否没有外来试剂(参见例如1994年4月1日修订的21CFR，§630.35，《安全性测试》)并测试同一性，使用制备自单独来源的高效中和抗血清。用于疫苗目的的病毒种子安全性测试由服务性实验室常规进行。广谱PCR测试可加入测试和/或作为另一种选择。
实施例14：按比例增加病毒生成和灭活
具有足够结构完整性以在动物模型中引起保护性中和抗体反应的灭活SARS-CoV的生成、灭活和纯化操作包括：Vero细胞用病毒感染，M.O.I.为0.01，没有FCS和抗生素；收集培养基，离心清除，BPL灭活，接着验证性测试是否完全灭活；过滤灭活物质，进行MCS-柱纯化，通过蔗糖梯度离心进一步纯化。
当此基本操作用于更大规模的商业用途时，可发展一些修改和改进。首先，可改变细胞培养和感染方法适应于滚瓶，作为中间步骤以在现有BSL 3+设备内迅速生产用于初步试验。完全商业生产通常使用在封闭系统中的发酵方法，但滚瓶系统能更迅速完成。滚瓶提供Vero细胞真实悬浮培养系统，这相对微载体培养有多种技术和安全优势。悬浮培养能生长到任何所需发酵规模，而没有干扰细胞传代间的封闭系统，因为不需要胰蛋白酶化。
为使滚瓶中的感染方法按比例增加到30-50升每批，应首先确定所选培养基和培养条件的最优M.O.I.和收集段。对于更大的规模，应使用安全收集和处理更大体积高感染性物质的方法，因此经离心的细胞分离可由其它方法取代，如经一次性滤筒过滤。
上述MCS层析和梯度纯化步骤易按比例增加到多至50升的批体积。然而，对于更大的规模，为提高纯度，使用超滤和无菌过滤步骤。也包括去除宿主细胞DNA的核酸酶处理。
实施例15：大规模分析方法
SARS冠状病毒的分析方法包括病毒滴定方法、免疫学和物理化学方法(ELISA、PAGE、用抗纯化完整病毒的特异抗血清的蛋白质印迹等)，用于定量纯化抗原和确定特征。其它分析测试包括：快速产量测试，通过不对称域流分离和激光粒子检测及计数；蛋白质印迹，使用抗单独病毒蛋白的特异抗血清；用于剩余宿主细胞DNA的测试。
剩余DNA测试一般通过杂交完成，如使用极限测试。这种测试根据已确定和其它细胞系验证过的方法进行。另外，可使用ThresholdTM方法。
为生成特异抗体，使用重组蛋白表达所有来自SARS-CoV结构和非结构基因区域的ORFs。ORFs能克隆和表达于大肠杆菌，如果需要，也可在真核载体中如杆状病毒。这提供足够量的纯化稳定蛋白用于免疫小鼠和兔以生成抗SARS蛋白的多克隆和单克隆抗体及建立特定ELISA测定。可测试不同表达载体以最大化可溶形式的重组蛋白产量，例如不同载体，1个含编码6个N末端组氨酸残基的序列且另1个含融合SARS蛋白C末端的谷胱甘肽-S-转移酶蛋白。重组蛋白能通过单步骤柱层析纯化，在镍螯合琼脂糖或谷胱甘肽-琼脂糖4B树脂上。这些过程非常迅速且一般产生60-90％纯度的蛋白，适用于培养特异抗血清(Pizza等.(2000)Science 287：1816-20)。用于各重组蛋白的5只小鼠和2只兔可分别用20和50μg重组蛋白SC免疫，IFA作为佐剂，在第0、14和28天免疫。在第7、21和35天收集血清以评估动物安乐死前的特定效价，动物安乐死用于收集血液和取出脾。
为检测疫苗制品中的杂质(例如获得自Vero细胞的蛋白)，可使用与Vero-获得蛋白反应的兔血清。获得这种抗血清是通过用至少10μg Vero细胞裂解物免疫兔，细胞裂解物有CFA/IFA。可在蛋白质印迹中检验血清与Vero-获得蛋白的反应性。对于抗趋向与病毒共纯化的特异相关细胞-获得蛋白的更特异抗血清，可制备经历纯化过程的模拟感染细胞培养物收集并用于免疫兔。
可发展方法确定来自免疫动物和人的血清中和效价，而没有BSL-3+实验室中使用感染性SARS-CoV的限制。一种这类策略是使用重组抗原，特定是刺突蛋白或获得自刺突的抗原表位，发展ELISA测定用于测量抗靶蛋白的抗体。适当抗原表位能在ELISA值与病毒中和测定值间确立相关性。此方法更迅速且更有效(更高产量)比较特异和保护性抗体效价。此ELISA测试也是在安全性试验中监控特异抗体的理想工具，在安全性试验中必须测试几百种动物血清。
另一种策略是结合来自2种致病SARS-CoV的结构元件与非致病冠状病毒小鼠肝炎病毒(MHV)以构建能标记的嵌合病毒样粒子(VLPs)。测定是基于十八烷基若丹明(R18)标记的VLPs与细胞间的融合(Hoekstra等.(1984)Biochemistry23：5675-81)。方法取决于纳入VLPs的R18在与细胞膜融合时荧光自身淬灭减轻。冠状病毒VLPs显示模拟天然病毒体，涉及它们在电子显微镜(EM)中的外观和其生物学活性。然而，由于它们不含病毒RNA，它们随后不能引起生产性感染(Vennema等.(1996)EMBO J 15：2020-2028)。VLP系统能用于小鼠肝炎病毒(MHV)菌株A59(MHV-A59)(Godeke等.(2000)J Virol 74：1566-15)，该菌株含嵌合S蛋白。蛋白嵌合体由SARS-CoV的胞外域和来自MHV刺突蛋白的跨膜和胞内域(64个C末端氨基酸残基)组成，嵌合体能在OST-7细胞中与MHV M(膜)和E(包膜)蛋白共表达(Godeke等.)。收集上清中分泌的VLPs，纯化并用十八烷基若丹明(R18)标记(Hoekstra等)。恒定量的VLPs用连续血清稀释在96孔板中37℃孵育1小时。随后，表达SARS-CoV受体的细胞中加入血管紧缩素转化酶2(ACE2)，融合程度可用荧光分光光度计测量。
最后的策略是监控血清抑制细胞间细胞-细胞融合相互作用的能力，细胞是表达SARS-CoV S蛋白的细胞与表达血管紧缩素转化酶2(ACE2)的人细胞系，后者是SARS-CoV的功能性受体(Li等.)。这个以报告基因为基础的测定利用荧光底物CCF2/AM(AM＝乙酰氧基甲基)在β-内酰胺酶(Bla)切割时的荧光转换(绿变蓝)作为细胞-细胞融合读出(Zlokarnik等.(1998)Science 279：84-88)。对于此测定，生成获得自BHK的细胞系，它稳定表达Bla和SARS-CoV蛋白。另外，使用在其表面表达ACE2的人细胞系。在其表面表达S蛋白和在胞质表达Bla的BHK细胞用待测试血清的连续稀释37℃孵育1小时。表达ACE2的细胞系用1μM CCF2/AM在22℃负荷1小时，PBS洗2次，与BHK细胞共培养。在细胞-细胞融合的情况中，Bla切割底物，产生绿蓝转换，在409nm激发。因此，通过血清抑制融合提供可检测的变化。
实施例16：稳定灭活SARS-CoV
尽管纯化的灭活SARS-CoV疫苗能在动物中诱导有效中和抗体反应，它相对不稳定且能受益于制剂以提高一段容许时间段的稳定性。适当制剂变化包括使用不同缓冲液体系、pH范围、稳定赋形剂(例如糖和糖醇、氨基酸等)等。稳定性测试可在正常保存温度实时进行，或通过提高温度以加速方式进行。因此，疫苗稳定性能增加到约1年或更长。冻干疫苗制品也能用于延长自身寿命，可在冻干期间用更多添加物增加稳定性。
实施例17：灭活病毒的优化剂量和安排
报导了SARS-CoV感染的动物模型，包括小鼠、雪貂和短尾猿。如上面实施例4所示，用BPL-SARS-CoV疫苗免疫的小鼠达到的中和抗体效价范围在1∶100-1∶1000，与康复期病人中发现的水平类似，并且100％得到保护不受攻击病毒感染。尽管小鼠攻击模型仅限于感染而不是疾病，雪貂和短尾猿是有用的人SARS疾病模型。接种SARS-CoV后2到4天，发现雪貂和短尾猿都从喉咙、鼻和咽流出感染性SARS-CoV粒子，由RT-PCR和/或病毒分离Vero细胞证明。在大约相同时间，感染动物变得瞌睡，表现出呼吸窘迫并最终死亡。在组织学上，这些动物中的SARS-CoV感染与不同严重度的肺部损伤相联，与活检肺组织和来自SARS病人的验尸物质中发现的类似。随着这些模型可用，使用疫苗的潜伏期研究可最先在小鼠中进行用于免疫读数，而最优剂量和安排的功效能在雪貂和短尾猿模型中评估。
小鼠中的初始研究用于确定引起最高中和抗体水平所需的最优剂量和安排，效价至少在1/100-1/1000范围内。与中和活性评估平行，可研究体液免疫反应和细胞免疫反应的其它特征。可特定评估来自免疫小鼠的血清的刺突特异抗体反应同种型(IgG1 vs.IgG2a)。同样，脾CD4+T细胞响应BPL-SARS-CoV粒子生成IFN-γ和IL-4的频率可通过ELISPOT和ELISA评估。这些实验有助于洞察T细胞反应协助引发保护性抗体反应的质量。
能测试增加的疫苗剂量(例如从5到20μg BPL-SARS-CoV，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐)，在100μl接种体中施用SC给麻醉小鼠。BALB/c小鼠组在第0天致敏且在第14和28天加强，每次处理10只。二级终点(Secondary endpoint)比较中和相对刺突特异抗体效价的动力学并评估特异免疫反应的Th1/Th2分布，因此在致敏后第7、21和35天及在2、3、4和5个月后评估中和与刺突特异抗体效价。在致敏后后第21、35天及2、3、4和5个月后确定刺突特异抗体的IgG2a和IgG1效价。在第42天和5个月末端评估脾T细胞抗重组刺突蛋白的增殖及IFN-γ和IL-4生成，重组刺突蛋白来自SARS-CoV。在第7、21和35天及2、3、4和5个月后收集外周血。在第42天和5个月末端收获脾细胞。通过抑制感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价及同种型。脾细胞增生通过3[H]-胸苷吸收确定。CD4+T淋巴细胞生成脾IFN-γ和IL-4的频率通过ELISPOT和FACS分析确定。
以小鼠结果为基础，BPL-SARS-CoV疫苗能在雪貂中测试诱导保护性中和抗体效价。免疫雪貂，根据与小鼠类似的安排且用在小鼠中第2次加强后第35天引起最高中和抗体效价的剂量。3组雪貂用BPL-SARS-CoV免疫，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在200μl接种体中施用SC给麻醉动物，每次处理6只。动物在第0天致敏且在第14和28天加强。在第7、21和35天收集外周血。通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价。各组雪貂用于评估BPL-SARS-CoV保护免疫动物免于感染和/或疾病的功效。在最后一次强化后2周，用106中间组织培养感染量单位(TCID50)的SARS-CoV CDC菌株气管内攻击麻醉动物。通过在攻击后20天从动物中取鼻、咽和直肠棉拭来评估SARS-CoV感染(Martina等.，同上)。通过RT-PCR和Vero细胞感染测定来评估样品物质中SARS-CoV的存在。监控动物的SARS疾病临床征兆，这是通过评估睡眠时间、温度、呼吸症状、腹泻、体重和存活。通过病毒释放量和持续时间、疾病症状持续时间和严重度以及存活动物百分比确定保护性。随后，可测试在第35天引起最高中和抗体效价的制剂，抗剂量高2倍的BPL-SARS-CoV，后者在相同制剂中给出且方案相同。
另外的研究能评估候选疫苗在非人灵长类动物中的免疫原性和功效。3组成年长尾猕猴用BPL-SARS-CoV免疫，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在500μl接种体中施用SC给麻醉动物，每次处理4只。可测试BPL-SARS-CoV疫苗，以雪貂中第2次加强后第35天引起最高中和抗体效价的剂量测试。动物在第0天致敏且在3和6周加强。在第1、4和7周收集外周血。二级终点评估特异免疫反应的Th1/Th2分布。因此，在第1、4和7周评估中和与刺突特异抗体效价和外周血CD4+T细胞响应重组SARS-CoV刺突蛋白生成IFN-γ和IL-4的频率。通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价。胞内细胞因子染色和FACS分析用于定量生成IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞。短尾猿也能用于评估BPL-SARS-CoV保护免疫动物免于感染和/或疾病的功效。在最后一次强化后2周，用106中间组织培养感染量单位(TCID50)的SARS-CoV CDC菌株攻击麻醉动物，菌株在5ml体积内。几滴病毒也能在结膜上施用，0.5ml在鼻中且剩余的在气管中。通过在攻击后20天从动物中取鼻、咽和直肠棉拭来评估SARS-CoV感染(Fouchier等.(200300 Nature 423：240)。通过RT-PCR和Vero细胞感染测定来评估样品物质中SARS-CoV的存在。也能监控动物的SARS疾病临床征兆，这是通过评估睡眠时间、温度、呼吸症状、腹泻、体重和存活。通过病毒释放量和持续时间、疾病症状持续时间和严重度以及存活动物百分比确定保护性。
小鼠
  组   处理   剂量/途径   取样间隔   小鼠数
  1-3   BPL-SARS-CoV   20，10，5μg/SC   7，21，35天；2，3，4，5个月；   10只每剂量水平
  4-6   BPL-SARS-CoV   20，10，5μg/SC   42天   10只每剂量水平
  7-9   BPL-SARS-CoV MF59   20，10，5μg/SC   7，21，35天；2，3，4，5个月；   10只每剂量水平
  10-12   BPL-SARS-CoV MF59   20，10，5μg/SC   42天   10只每剂量水平
  13   MF59   NA/SC   7，21，35天；2，3，4，5个；   10+10(在第42天和5个月末端杀死)
  14   盐水   NA/SC   7，21，35天；2，3，4，5个月；   10+10(在第42天和5个月末端杀死)
雪貂
  组   处理   途经   取样间隔   雪貂数
  1   BPL-SARS-CoV   SC   7，21，35天   6
  2   BPL-SARS-CoV-MF59   SC   7，21，35天   6
  3   盐水   SC   7，21，35天   6
短尾猿
  组   处理   途径   取样间隔   短尾猿数
  1   BPL-SARS-CoV   SC   1，4，7周   4
  2   BPL-SARS-CoV-MF59   SC   1，4，7周   4
  3   盐水   SC   1，4，7周   4
实施例18：人T细胞反应
作为人临床研究开始的先驱，来自有不同HLA单元型的健康供体的外周血T淋巴细胞的反应性可用体外致敏技术评估(Abrignani等.(1990)Proc Natl Acad Sci USA87：6136-40)。此研究的目的是最先指示SARS-CoV蛋白中的免疫优势T细胞抗原表位。简要地，来自20个有不同HLA单元型的健康供体的PBMCs在含5％自身血清的培养基中培养，存在不同浓度的SARS-BPL-CoV粒子，范围从0.5到20μg/ml。在24和48小时后评估活化标记的表达。培养12小时和15天后评估生成IFN-γ和IL-4的T淋巴细胞频率，存在100U/ml重组人IL-2。分类选出生成CD4T淋巴细胞的活化细胞因子并最终作为单细胞克隆，使用FACS技术。来自有不同HLA的人类受试者的CD4+T细胞所有组成成分通过CD4+T细胞系和抗自身EBV-转化细胞系的克隆的增殖测定来评估，转化细胞系加载15聚体的叠加肽，肽来自SARS-CoV的最相关结构和非结构蛋白。
当转向实际人试验时，在肌肉内免疫后评估健康成年人中的安全性和免疫反应，免疫使用增加剂量的BPL-灭活SARS-CoV疫苗，包括MF59佐剂或省略，这取决于临床数据。在第1个群组中，在0、1、6个月给予3/4次免疫，在第2和第3个群组中，分别在0、1、2、6个月和0、2、6周给予免疫。试验采用盲目观察，并以安慰剂作为对照。受试者随机分成各剂量水平。待测量的免疫反应参数包括血清中和抗体、ELISA抗体和生成IFN-γ的外周血CD4+T细胞，通过胞内细胞因子染色。
  组   抗原剂量(μg)   施用安排   治疗的受试者数量   用安慰剂的受试者数量   取样间隔
  A1   10   0，1，6个月   18   6   0，1，2，6，7个月
  A2   20   0，1，6个月   18   6   0，1，2，6，7个月
  B1   10   0，1，2，6个月   18   12   0，1，2，6，7个月
  B2   20   0，1，2，6个月   18   12   0，1，2，6，7个月
  C1   10   0，2，6周   18   12   0，2，6，10，30周
  C2   20   0，2，6周   18   12   0，2，6，10，30周
实施例19：选择用于刺突蛋白表达的CHO细胞系
较好确立了获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的方法用于HIV和HCV，此细胞系稳定表达病毒包膜糖蛋白，蛋白构象完整、适当糖基化且有效结合中和抗体(Srivastava等.(2002)J Virol 76：2835-47；Srivastava等.(2003)J Virol 77：11244-259；Heile等.(2000)J Virol 74：6885-92)。相同的技术能应用于SARS-CoV，用于产生2种不同的稳定CHOK-1细胞系，生成全长或截短SARS刺突蛋白。刺突蛋白能用本文所述构建表达，但没有6-His标记。可比较这些蛋白在免疫动物中生成中和抗体的能力以及它们在CHOK-1细胞中的表达水平。
一个表达刺突的pCMV3载体能用于获得稳定CHOK-1细胞系，细胞系含CMV增强子/启动子、氨卡青霉素抗性、融合的DHFR和用于选择目的弱化新霉素基因。稳定细胞系能用新霉素基选择系统在CHOK-1细胞中生成。可测序克隆以确认插入的完整性，能用Trans-LT1聚胺转染试剂(PanVera Corp.，Madison，WI)进行瞬时转染以评估表达水平并也可通过ELISA和蛋白质印迹分析评估表达蛋白完整性。
初始CHO细胞选择成无TSE/BSE污染，风险依据相关调节标准。为构建细胞系，过程包括转染、用选择性培养基初步筛选，接着亚克隆以确保细胞系纯度。可用抗原捕获ELISA测定细胞上清以定量所有选择和扩增阶段的表达水平。对于全长刺突表达，通过免疫荧光染色筛选甲醇固定细胞的内部表达，使用兔抗SARS抗体。在T-75长颈瓶扩增阶段连续测量可用于确保表达水平。检查表达蛋白的分子量和完整性可通过天然和还原及变性条件下的PAGE，接着是免疫探测。
表达全长或截短形式SARS-CoV刺突蛋白的pCMV3载体可导入CHOK-1细胞，使用Trans-LT-1试剂和非选择性培养基。转染后24-48小时，取决于细胞密度，细胞以1∶5比例分裂且培养基可变成含500μg/ml新霉素的选择性培养基。这些过程中使用的任何牛血清来自无TSE来源，符合调节标准。10到14天后，挑出单独菌落并转移到96孔板，在完全非选择性培养基中培养。当约80％孔铺满时，24小时上清可通过刺突捕获ELISA来筛选。为起始表达全长刺突蛋白，细胞能用甲醇固定并通过免疫荧光染色筛选，使用兔抗SARS抗体。去除低表达细胞系后，细胞系少于20-30个，捕获ELISA和蛋白质印迹可随后用于确定细胞裂解后的表达水平。可沉淀一部分各细胞系，称重且在1％Triton裂解缓冲液中裂解，用于确定表达水平。3到4个生成最高水平结构和构象正确的刺突蛋白的克隆能扩大到3升生物反应器并适应用于扩大的低血清悬浮培养条件。
用于SARS刺突蛋白的抗原捕获ELISA测定可用96孔平底板进行，板包被250ng每孔的纯化免疫球蛋白，免疫球蛋白获得自用灭活SARS病毒免疫的兔血清。加入上清或裂解物样品并在37℃孵育2小时。结合抗原相对汇集的SARS+ve血清或高亲和性单克隆抗体反应，单抗是人或小鼠抗SARS刺突蛋白，用适当种特异过氧化物酶缀合的二抗检测。板用TMB底物(Pierce，Rockford，IL)显色，在450nm波长读数，每ml样品的蛋白浓度获得自标准曲线(OD vs.蛋白浓度)，标准曲线以已知浓度的重组刺突蛋白的连续稀释为基础。
也进行免疫探测分析，遵循的标准方法描述于Srivastava等.(2002)同上。简要地，10-20μl样品在4-20％SDS PAGE上分析，在非还原/适度加热的变性条件下。随后，蛋白转移到硝化纤维膜并与多克隆抗刺突兔血清反应，接着是缀合Alexa688(Molecular Probes，Oregon)的抗兔Ig。用红外线成象系统扫描点。
筛选最高表达的候选细胞系在小规模(3升)灌注生物反应器中的刺突蛋白表达和稳定性。进一步评估候选克隆的表达水平以及表达蛋白完整性，随后在没有选择的情况下测试表达稳定性。测试所选克隆维持整合SARS刺突蛋白基因DNA序列完整性的情况。为快速监控小瓶和3升评估培养中的表达水平，发展了基于凝集素的方法(Gluvanthus Nivalis凝集素)用于分离SARS刺突蛋白到一定纯度水平，此水平允许半定量CHO上清中的蛋白并确定特征。全长刺突蛋白从Triton X-100洗涤剂提取的细胞中获得，随后在GNA凝集素上捕获，接着用羟磷灰石和SP层析。然后确定洗脱蛋白的特征，通过：(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和考马斯染色，(2)用抗SARS兔血清免疫探测，(3)用大小排阻层析(SEC)的结构特征确定以及用MALDI-TOF的质谱分析。
表达SARS刺突蛋白的CHO细胞系的生产力应至少为2mg/L且对于全长刺突蛋白为3mg/100gm细胞，细胞处于稳态细胞密度。来自45天、2.5升生物反应器的产量为~1000mg粗蛋白。
实施例20：纯化用于人疫苗的刺突蛋白
为纯化SARS刺突蛋白用于产生人用GMP级物质的目的，使用下列基本方法，所有步骤在2-8℃进行：起始物质是浓缩的CHO细胞培养物上清(20-30X)，解冻并经0.45μm膜过滤；此物质是来自培养物的严重污染蛋白以及DNA；第1个纯化步骤是使用Gluvanthus Nivalis(GNA)的亲和层析，GNA是优选识别含碳水化合物的末端甘露糖的凝集素；捕获糖基化蛋白，包括SARS刺突蛋白，非糖基化蛋白以及DNA不结合此柱；GNA柱接着进行2个以流通模式操作的层析步骤；阴离子交换剂DEAE和陶瓷羟磷灰石(cHAP)；DEAE结合一些污染上清蛋白和DNA，而cHAP结合任意污染血清蛋白；全长刺突蛋白从细胞沉淀中纯化；细胞用Triton X-100裂解，随后在GNA凝集素上捕获全长刺突蛋白，接着是羟磷灰石和SP层析。
可进一步处理纯化的SARS刺突以去除外来病毒：在pH 3.51小时灭活病毒；随后浓缩样品并渗滤到pH 4的缓冲液中，最后用SP树脂捕获纯化蛋白；刺突蛋白结合此树脂且许多病毒流过。
洗脱刺突蛋白，浓缩并渗滤到缓冲液中。制成的大批产物随后经DV50病毒去除膜过滤，接着经0.2μm膜过滤。制成的大批物质填充到适当容器中，例如3.0ml小瓶、100等级层流净化罩。
各纯化步骤的测试方法包括蛋白浓缩、内毒素(LAL)、生物负载和回收。
人施用前，效力测试可评估疫苗在体外或体内试验中影响特定反应的特异能力。确定体内免疫原性是通过10只小鼠的定量组，用不同剂量的蛋白抗原。用ELISA分析血清中的IgG抗体存在。通过的标准是基于血清反应阳性的疫苗处理动物数量，与参考标准相比较。其它测试包括总体安全性、无菌性、纯度、疫苗同一性(使用特异于刺突蛋白的ELISA)、量&蛋白浓缩(UV分光光度吸收过程，以芳族氨基酸的摩尔吸光率为基础)。
对大批药物物质和终容器产物进行稳定性测试。评估大批产物是在-60℃(推荐储存条件)、25±2℃和40±2℃的温度，保护不受光照，时间点在0、3、6、9和12个月。终容器产物在温度-60℃测试，在5±3℃、25±2℃和40±2℃反向，时间点为0、3、6、9、12个月。稳定性指示测定可包括外观、pH、蛋白含量、SDS-PAGE、大小排阻HPLC、容器/封闭完整性，在大批和三重终容器物质试验的单一样品上进行。
此方法纯化的蛋白能在小鼠、兔和雪貂中评估，如上所述，且以上面实施例4、5、8和9的结果为基础。
初始实验在小鼠中进行以确定引起最高中和抗体水平所需的GMP刺突蛋白最优剂量和安排，效价至少在1/100-1/1000范围内。刺突蛋白在5到40μg的范围中测试，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在100μl接种体中麻醉小鼠。免疫BALB/c小鼠组，每次处理10只。动物在第0天致敏且在第14和28天加强。二级终点比较中和相对刺突特异抗体效价的动力学，用于评估特异免疫反应的Th1/Th2分布。在致敏后第7、21和35天及在2、3、4和5个月后评估中和与刺突特异抗体效价；在致敏后后第21和35天及2、3、4和5个月后确定刺突特异抗体的IgG2a和IgG1效价；在第42天和5个月末端评估脾T细胞抗重组刺突蛋白的增殖及IFN-γ和IL-4生成，重组刺突蛋白来自SARS-CoV；在第7、21和35天及2、3、4和5个月后收集外周血；在第42天和5个月末端收获脾细胞；通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价及同种型。脾细胞增生通过3[H]-胸苷吸收确定。CD4+T淋巴细胞生成脾IFN-γ和IL-4的频率通过ELISPOT和FACS分析确定。
其次，确定重组刺突蛋白在雪貂中的最优剂量和安排。以小鼠结果为基础，引起最高抗体中和效价的刺突疫苗相对剂量高2倍的重组刺突蛋白测试，重组刺突蛋白在相同制剂中给出。3组雪貂在用200μl接种体麻醉状态下SC免疫，每次处理6只。动物在第0天致敏且在第14和28天加强。在第7、21和35天收集外周血。通过抑制SARS-CoV感染Vero细胞和ELISA分别确定中和与刺突特异抗体效价。与前面的雪貂研究类似，各组雪貂用于评估疫苗保护免疫动物免于感染和/或疾病的功效。
候选疫苗的免疫原性和功效也可在非人灵长类动物中评估。3组成年长尾猕猴用重组SARS-CoV刺突蛋白免疫，单独或混合等体积MF59-柠檬酸盐，在500μl接种体中施用SC给麻醉动物，每次处理4只。测试刺突蛋白疫苗，以雪貂中第35天引起最高中和抗体效价的剂量测试。动物在第0天致敏且在3和6周加强。在第1、4和7周收集外周血。二级终点评估特异免疫反应的Th1/Th2分布，如上所述(中和与刺突特异抗体效价，外周血CD4+T细胞响应重组刺突蛋白生成IFN-γ和IL-4的频率，在第1、4和7周评估)。
最后，有MF59佐剂的IM重组SARS疫苗进行人阶段、安慰剂对照、剂量增加、安全性/免疫原性试验。试验评估免疫后健康成年人中的安全性和免疫反应，免疫使用增加剂量的SARS重组疫苗，疫苗有MF59佐剂，肌肉内施用。在0、1、6个月给予3/4次免疫。试验是观察者盲且安慰剂对照。受试者随机分成各剂量水平。待测量的免疫反应参数包括血清中和抗体、ELISA抗体和生成IFN-γ的外周血CD4+T细胞，通过胞内细胞因子染色：
  组   疫苗抗原剂量(μg)   施用安排   治疗的受试者数量   用安慰剂(MF59)的受试者数量   取样间隔
  A1   50   0，1，6个月   18   6   0，1，2，6，7个月
  A2   100   0，1，6个月   18   6   0，1，2，6，7个月
实施例21：比较灭活病毒与纯化刺突蛋白
可在非人灵长类动物中比较灭活病毒与纯化刺突蛋白的免疫原性和功效。3组成年长尾猕猴用来自CHO细胞系的重组SARS-CoV刺突蛋白或用BPL-SARS-COV免疫，每次处理4只，所用剂量和制剂在前面免疫原性攻击实验中引起最高中和抗体效价，在500μl接种体中施用SC给麻醉动物。动物在第0天致敏且在3和6周加强。在第1、4和7周收集外周血。二级终点评估特异免疫反应的Th1/Th2分布，如上所述。
  组   处理   剂量/途径   取样间隔   短尾猿数
  1   Rec-刺突蛋白+或-MF59   Yμg/SC   1，4，7周   4
  2   BPL-SARS-CoV+或-MF59   Yμg/SC   1，4，7周   4
  3   盐水   NA/SC   1，4，7周   4
实施例22：在酵母中表达
酵母是有用且便宜的真核表达系统。酵母表达的蛋白用于重组乙肝病毒疫苗，重组SARS抗原也可在酵母总表达，用于疫苗用途。酵母表达对于抗原生成也较方便，抗原用于制备单克隆和多克隆抗体，或用于血清学测定。
克隆核壳蛋白(N)和来自SARS冠状病毒FRA菌株(AY310120)的2个不同形式刺突糖蛋白(S)，用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达：
SARS N：氨基酸1-422(AY310120菌株的坐标28120-29388)-图65
SARS刺突：氨基酸14-1195(跨膜结构域和胞质尾缺失)-图66
SARS刺突：氨基酸14-662(S1结构域)
为生成S1构建，约3733bp的XhoI-NotI片段作为起始点，它编码全长刺突糖蛋白。PCR用于分2段扩增全长基因：2440bp的XbaI-BlnI和1306bp的BlnI-SalI。这些片段分别亚克隆到商业载体中(Novagen)：pT7Blue2XbaI-BlnI(刺突糖蛋白的5’末端)和pT7Blue2BlnI-SalI(刺突糖蛋白的3’末端；图58)。下列引物用于随后的PCR反应：Spk-1(5’)SEQ ID NO：9785；Spk-2(5’)SEQ ID NO：9786；Spk-3(5’)SEQ ID NO：9787；Spk-4(5’)SEQ ID NO：9788。
大肠杆菌HB101感受态细胞转化PCR连接产物并在含100μg/ml氨卡青霉素的Luria琼脂板上平板培养。所需克隆用微筛选DNA分析来鉴定。在序列确认及质粒扩增所需亚克隆后，需要去除刺突序列XbaI-BlnI部分中存在的内部SalI位点，以有助于将来克隆到酵母表达载体(BamHI-SalI)中。因此，我们从pT7Blue2XbaI-BlnI(5’末端刺突)中制备CelII-MfeI载体以去除含SalI位点的143bp序列。激酶化的寡核苷酸DS1-6(SEQ ID NOS：9789-9794)随后连入CelII-MfeI载体以取代用于突变SalI位点而去除的143bp(无氨基酸变化)，产生pT7Blue2.XbaI-BlnIΔsal。
5’XbaI-BlnI(来自pT7Blue2.XbaI-BlnIΔSal)和3’BlnI-SalI(来自pT7Blue2BlnI-SalI)刺突糖蛋白插入通过凝胶纯化，将它们连入p893-1XbaI-SalI载体(获得自pLitmus 38(New England Biolabs)的载体，α因子前导序列克隆到MCS的BamHI-Sal I位点)。所得全长SARS刺突编码序列命名为p893-1.SARS Spike 1255#9(图58)。
大肠杆菌HB101感受态细胞转化寡核苷酸取代连接产物并在含100μg/ml氨卡青霉素的Luria琼脂板上平板培养。所需克隆用微筛选DNA分析来鉴定。确认阳性克隆序列后，选择pT7Blue2 Xba-BlnΔSal作为PCR反应模板以扩增刺突S1 1967bpXba-Sal片段。随后片段亚克隆到p893-1Xba-Sal载体中，确认序列，并命名为p893-1.Spike S1#11(图59)。
为克隆到酿酒酵母表达载体pBS24.1中，S1序列5’末端必须从XbaI修饰成HindIII，以允许和ADH2/GAPDH BamHI-HindIII启动子片段3’HindIII末端连接。从pT7Blue2Xba-BlnΔSal(上述)中凝胶纯化AgeI-SalI 1943bp片段。此片段与HindIII-AgeI 30bp激酶作用的寡核苷酸(S1-1+S1-2，产生必需的5’HindIII位点)合成对一起连入pSP72HindIII-SalI商业亚克隆载体(命名为pSP72.SARS Spike S1#2；图59)。S1-1具有SEQ ID NO：9795且S1-2具有SEQ ID NO：9796。
确认来自微筛选DNA分析的阳性克隆的序列后，凝胶纯化HindIII-SalI片段。1365bp BamHI-HindIII ADH2/GAPDH启动子片段与1973bp HindIII-SalI S1片段一起连入pBS24.1 BamHI-SalI载体，产生遗传上改造的pd.SARS刺突S1#2表达质粒(图60)。
酿酒酵母菌株AD3转化pd.SARS刺突S1#2，检查单个转化子在培养基中葡萄糖耗尽之后的表达。如考马斯蓝染色所检测到的，重组蛋白在酵母中高水平表达。酵母细胞特定转化SARS S1表达质粒，使用Invitrogen S.c.EasyCompTM转化试剂盒。表达示于图57。
刺突1195蛋白不含全长SARS构建中存在的跨膜(TM)区或胞质尾，为表达此蛋白，进行下面一系列遗传操作：
从pT7Blue2BlnI-SalI#11(上述)中凝胶纯化BlnI-DraI 1056bp片段。此片段与68bp DraI-SalI激酶作用的寡核苷酸(DRS1+2；SEQ ID NOS：9797 & 9798)合成对一起连入pT7Blue2BlnI-SalI载体(图61)。大肠杆菌HB101感受态细胞转化寡核苷酸取代连接产物并在含100μg/ml氨卡青霉素的Luria琼脂板上平板培养。所需克隆用微筛选DNA分析来鉴定。序列确认后，克隆命名为pT7Blue2 BlnI-Sal刺突1195#7。凝胶纯化编码刺突11953’末端的1126bp BlnI-SalI片段。
为产生XbaI-SalI刺突1195片段，3109bp XbaI-PciI片段分离自p893-1.SARS刺突1255#9(上述)且457bp PciI-SalI片段片段来自pT7Blue2.SARS刺突1195#7(上述)。2个片段克隆到p893-1XbaI-SalI载体中，产生p893-1.SARS刺突1195#34质粒(图62)。
为克隆SARS刺突1195到pBS24.1酿酒酵母表达载体中，必需将SARS刺突11955’末端从XbaI修饰成HindIII，如上述刺突S1表达克隆所做。首先，2416bp AgeI-BlnI片段分离自p893-1.SARS刺突1195#34。此片段与合成的HindIII-AgeI 30bp寡核苷酸(如上所述产生S1蛋白，用于在酿酒酵母中表达)一起连入pT7Blue2HindIII-BlnI载体。大肠杆菌HB101感受态细胞转化寡核苷酸取代连接产物并在含100μg/ml氨卡青霉素的Luria琼脂板上平板培养。所需克隆用微筛选DNA分析来鉴定。在确认阳性克隆序列及质粒扩增pT7Blue2.SARS 11955’HindIII-BlnI#10(图63)后，我们分离出402bp HindIII-NcoI片段和2044bp NcoI-BlnI片段(图63)。HindIII-BlnI分离需在2步骤中完成，以避免涉及内部HindIII位点的克隆事件，此位点位于刺突1195蛋白的核苷酸号1319。
为将刺突1195的BamHI-SalI表达盒装配到pBS24.1载体中，大肠杆菌HB101感受态细胞转化BamHI-HindIII(ADH2/GAPDH启动子)、HindIII-NcoI 402bp片段、NcoI-BlnI 2044bp和BlnI-SalI 1126bp片段转化到pBS24.1BamHI-SalI载体中。样品在含100μg/ml氨卡青霉素的Luria琼脂板上平板培养。所需克隆用微筛选DNA分析来鉴定，因而产生遗传改造的pd.SARS刺突1195#10(图64)。
酿酒酵母菌株AD3转化pd.SARS刺突1195#10，检查单个转化子在培养基中葡萄糖耗尽之后的表达。重组蛋白通过考马斯蓝染色检测。酵母细胞特定转化SARS S1表达质粒，使用Invitrogen S.c.EasyCompTM转化试剂盒。
实施例23：在哺乳动物细胞系中表达
含S蛋白ORF的cDNA片段通过RT-PCR从生长于Vero细胞的SARS病毒RNA(法兰克福分离物)中扩增，S蛋白ORF有1255个氨基酸。扩增的PCR片段克隆到pBlueScript载体中，测序，聚集共有刺突序列以产生全长SARS刺突克隆pBSnSh。体外转录pBSnSh，接着在兔网状细胞裂解物中翻译，产生估计分子量~140kDa的单一多肽。
此质粒插入经XhoI和Not I再克隆到哺乳动物表达载体pCMVIII(Srivastava等.(2003)J.Virol.77：11244-11259)以产生构建nSh(图74A)。PCR片段包含具1195个氨基酸的刺突蛋白，它缺失跨膜(TM)结构域和半胱氨酸丰富的胞质尾(Cy)，扩增此片段并克隆pCMVIII载体以产生构建nShΔTC(图74B)。2种构建都用6个组氨酸残基在C末端标记，用于协助特征确定。无组氨酸标记的XhoI/NotI片段亚克隆到甲病毒复制子载体主链pVCRchim2.1，用于生成表达S蛋白的甲病毒复制子粒子嵌合体。复制缺陷型甲病毒载体粒子的生成和特征确定基本如前所述进行(Perri等.(2003)J.Virol.77：10394-10403；Polo等.(1999)PNAS USA.96：4598-4603)。所得甲病毒载体粒子命名为VEE/SIN。
COS7细胞和BHK-21细胞维持在添加10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中，37℃且空气中5％CO2。COS7细胞转染表达质粒(nSh，nShΔTC)，使用转染试剂盒(TransIt-COS，Mirus)，遵循厂商说明。细胞用冰PBS洗1次并用1x裂解缓冲液(20mM MOPS、10mM NaCl、1.5mM MgCl2和1％Triton X-100)裂解，缓冲液含完整蛋白酶抑制剂(Roche)。冰上孵育30分钟后，离心清除碎片。澄清裂解物或纯化或直接用于蛋白质印迹。
为纯化分泌刺突蛋白，从转染细胞中收集培养基并以12,000rpm离心10分钟以去除细胞碎片。澄清培养基应用于ConA-琼脂糖柱(Vector Lab)。柱用20mM磷酸钠缓冲液充分洗，随后用20mM磷酸钠缓冲液中1M甲基α-D-吡喃甘露糖苷(MMP)、1MNaCl洗脱结合蛋白。含SARS-CoV刺突蛋白的柱部分应用于MagneHis蛋白纯化系统(Promega)，遵循厂商建议的操作。
对于蛋白质印迹分析，通过4-20％SDS-PAGE分离蛋白并随之电泳转移到硝化纤维膜(Invitrogen)。膜在封闭缓冲液(PBS中5％脱脂乳和0.1％土温20)中封闭，用指示抗体室温孵育1小时，洗并用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗(Biosource)探测，接着化学发光(ECL体系，Amersham)和曝光X光胶片。所用抗体是小鼠单克隆抗组氨酸抗体(抗His·标记单抗，Novagen)、抗SARS-CoV刺突蛋白的兔多克隆抗肽抗体(SmPab，Abgent)或通过用纯化SARS-CoV病毒体免疫兔获得的兔抗SARS血清(2BE)。后者的细胞培养物中和效价为1/2,500。除非另有说明，对于抗组氨酸抗体和SmPab，抗体以1/1,000使用，对于抗SARS兔血清，抗体以1/10,000使用。
一些刺突蛋白用肽-N糖苷酶F(PNGase F)处理。细胞裂解物在0.5％SDS和1％β-巯基乙醇中稀释并在100℃变性10分钟。用50mM磷酸钠(pH 7.5)中1％NP-40稀释2倍后，样品用PNGase F(NEB)37℃处理1小时。酶处理样品通过4-12％SDS-PAGE在还原条件下分析。对于用PNGase的部分消化，细胞裂解物用含0.75％Triton-X的50mM磷酸钠(pH 6.0)稀释并用PNGase F(Calbiochem)37℃处理3小时。酶处理样品通过4-20％SDS-PAGE在非还原条件下分析。
转染后48小时的细胞蛋白质印迹示于图75。当煮沸裂解物且在还原性SDS-PAGE条件下分析时，细胞裂解物中检测到S蛋白双联体，估计分子量~170~180kDa(图75A，泳道3)。产生此双联体似乎是由于自PNGase F预处理细胞裂解物后1种多肽产物的不同糖基化，PNGase F使双联体还原成~140kDa的单一种类(图75A，泳道4)。这是从全长、完整多肽产物氨基酸序列预测的预期大小。此实验表明全长SARS-CoV在哺乳动物细胞中表达为单一、未切割多肽，但有2种不同糖基化形式，分别为gp170和gp180。不像全长序列编码的2个S糖型都不分泌，在细胞裂解物(图75A，泳道5)以及细胞培养基(图75A，泳道3)中都检测到~160kDa单一种类的SΔ蛋白产物。
为进一步确定S蛋白胞内加工的特征，如上所述，用表达全长S的缺陷型甲病毒粒子感染BHK21细胞。以MOI 5感染6小时后，感染细胞用L-[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲标记1小时并追踪2或4小时。免疫沉淀[35S]标记的S蛋白，使用抗灭活、纯化病毒培养的兔抗血清，随后Endo H消化。Endo H处理包括用样品缓冲液(50mM磷酸钠、0.1％SDS、50mM DTT，pH 6.0)稀释并煮沸5分钟。变性后，进一步用0.75％Triton-X 100稀释和遵循厂商说明(Calbiochem)用内切糖苷酶H(Endo H)37℃处理3小时。酶处理样品加入含0.1％SDS和DTT的加样缓冲液，8％SDS-PAGE分析。
消化和未消化蛋白都在SDS中煮沸并通过还原性SDS-PAGE分析(图55)。1小时脉冲后，S蛋白以gp170单一成分出现，对Endo H敏感(泳道1和2)。2小时脉冲后，新种类(gp180)以约等比例和gp170一起出现(泳道3)。4小时脉冲后，gp180种类是主要的S蛋白成分(泳道5)，目前抗Endo H(泳道5和6)。此数据与gp170是含高甘露糖链的ER-驻留糖蛋白以及gp180对应有含Endo H抗性复合寡糖的高尔基体加工糖蛋白一致。
也测试从细胞培养基中纯化的C末端缺失SΔ蛋白的Endo H敏感性。如图76所示，发现细胞裂解物内观察到的SΔ对Endo H敏感(泳道1和2)，而细胞培养基中的分泌SΔ抗Endo H(泳道3和4)。此结果与该糖蛋白在转移到高尔基体前以未成熟形式在ER中合成相一致，高尔基体加入复合碳水化合物并随后分泌蛋白。
如上所述，在细胞裂解物蛋白质印迹分析中检测到COS7细胞中表达的S蛋白，它是以gp170/gp180双联体形式，细胞裂解物通过在DTT存在时煮沸来充分变性。然而，当相同细胞裂解物在用SDS-PAGE蛋白质印迹分析前没有热变性时，检测到的大部分S蛋白是在440-669kDa范围中的高分子糖蛋白(图77，泳道1)。~500kDa种类抗10mM DTT处理(泳道3)且不解离成单聚体形式，除非裂解物先在100℃热变性(泳道4)。相反，四级结构由二硫键维持的测试蛋白(甲状腺球蛋白)寡聚形式通过10mM DTT处理转变成亚基形式。这些数据提示S蛋白的~500kDa寡聚形式不是二硫键连接且热不稳定。为确定S蛋白~500kDa种类的热敏感性，重复热变性实验，但没有DTT。如图78所示，在100℃单独热变性~500kDa蛋白足以使其转变成gp170/180单聚体形式(泳道4)。使用80℃热变性步骤，检测到比例相似的~500kDa和单聚体形式。
为进一步研究此~500kDa种类是否代表天然构象的S蛋白寡聚体，用获得自病毒体的S糖蛋白比较分析，此蛋白来自Vero细胞培养物。SDS PAGE后，纯化病毒体溶于1％SDS，然后进行蛋白质印迹分析。在病毒体粒子中确认存在~500kDa刺突蛋白寡聚体(图79，泳道1)。另外，热变性溶性病毒体产生的寡聚体到单聚体转变与用全长重组S观察到的相同(泳道2、3)。在交联实验中进一步分析病毒体S的寡聚性质。来自蔗糖梯度部分的等分灭活病毒体用10％SDS以1％终浓度处理并用0.2M三乙醇胺-HCl(pH 8，Sigma)稀释2倍；随后加入来自新鲜制备溶液(10mg/ml，在0.2M三乙醇胺-HCl中)的二甲亚胺(DMS；Pierce Chemical Co.)，终浓度为3.3mg/ml。室温2小时后，样品用Centricon-30浓缩，4％聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过银染分析。未处理和DMS交联病毒体蛋白都热变性，通过SDS-PAGE和银染分析热对维持寡聚结构的作用(图80)。没有交联时，热变性导致单聚体种类取代~500kD刺突蛋白种类。相反，在交联蛋白中，~500kD和单聚体种类在加热后不显著改变。这些数据支持~500kD蛋白是非共价结合的S单聚体蛋白的寡聚体。交联和煮沸后，~500kD种类移动，比未处理形式扩散慢一些。此迁移率转变可能是由于煮沸引起的结构变化。另外，能发现~300kD的小蛋白种类，它可能代表非解离S二聚体。
为更精确估计COS7细胞中表达的重组~500kDS种类的大小，含S蛋白寡聚体的COS7细胞裂解物用大小排阻柱层析分级分离。~500kD寡聚体的主要部分用572kD标记蛋白共洗脱。这些实验一起提示COS7细胞裂解物中观察到的~500kD S种类可能是S蛋白单聚体的同三聚体。
SΔ刺突蛋白的寡聚状态也在COS7细胞表达后检测。如图81所示，当SDS-PAGE和蛋白质印迹分析前没有加热裂解物时，细胞裂解物中存在的重组SΔ蛋白也以~500kDa范围高分子量形式检测到(泳道1)。然而，胞内SΔ蛋白的寡聚效率在相同蛋白质印迹分析条件下似乎比全长S蛋白低许多(＜10％)。此~500kDa蛋白的热敏感性测试显示SΔ寡聚体比全长S寡聚体更热不稳定，这由80℃时所有~500kDa种类＞90％转变成单聚体Sd形式所证明(泳道2)。同样(图82)，大部分分泌SΔ蛋白以单聚体形式发现，而~500kDa种类几乎不能检测到(仅当蛋白过量加样用于蛋白质印迹分析时可检测到)(泳道1)。在高于80℃的温度，检测到的所有分泌SΔ蛋白是单聚体(泳道2、3)。
~500kDa蛋白糖基化，研究去糖基化对其抗体结合的影响。重组COS7裂解物用PNGase F在非变性条件(如上所述)下处理并进行蛋白质印迹分析。如图83所示，去糖基化不影响抗组氨酸Mab抗体结合处理过的S寡聚体(泳道2、3)。然而，它影响了与抗纯化病毒培养的兔抗血清的反应性(泳道6)。仅DTT当从SDS-PAGE样品中省略时，此抗血清在蛋白质印迹分析中结合获得自病毒体的S，指示它主要识别不连续的构象抗原表位。此抗血清也显示有高病毒中和抗体效价。它不结合去糖基化、重组S，提示碳水化合物积极作用于更有序、天然结构的S多肽寡聚体。
重组S与SΔ蛋白间的差异是C末端存在或没有TM-和Cys-丰富结构域。此差异预测在裂解转染细胞时，全长S与膜部分相联而Sd在可溶部分中。因此，nSh或nShΔTC转染细胞在低渗条件下裂解，可溶胞质部分通过离心与不溶膜部分分开(图48)。如图84所示，膜部分(DF)中发现~500kDa和180/170kDa种类的S蛋白(泳道4)，但在可溶胞质部分(AF)不能检测到(泳道3)。然而，在2个部分中都发现单聚体种类(gp170)的截短SΔ蛋白(泳道5、6)。这表明S蛋白锚定于细胞膜需要C末端TM-和Cys-丰富结构域。
通过间接免疫荧光显微镜方法分析COS7细胞中S与SΔ蛋白的细胞定位。转染后48小时，细胞用2％多聚甲醛直接固定，没有用于细胞表面染色的洗涤剂，或用洗涤剂处理，接着是用于胞内染色的Cytofix/Cytoperm溶液。随后用兔抗SARS血清(2BE)和FITC缀合抗体染色固定细胞。nSh转染细胞显示S蛋白转化灶，指示高尔基体定位(图85A)，而nShΔTC转染细胞表现出SΔ蛋白均匀分布于胞质，指示ER定位(图85B)。尽管在非固定细胞中也观察到转染细胞表面上的完整S蛋白(图85D)，但在细胞表面不能检测到SΔ(图85E)。这些结果指示TM-和Cys-丰富结构域在锚定S蛋白到质膜中发挥的作用。尽管单独TM区可能作用于膜锚定，Cys-丰富区的潜在作用仍有待确定。
因此，SARS重组全长S蛋白是N连接的糖蛋白，估计分子量为170-180,000kDa。用PNGase F去糖基化产生预期大小的多肽，用于非切割、编码多肽(140kDa)。在多种哺乳动物细胞包括COS7、293、BHK21和Huh7细胞系中瞬时和稳定表达全长SARS-CoV S基因恒定产生S蛋白双联体(gp170/180)，如蛋白质印迹分析所检测到的。脉冲追踪分析转染细胞证明SARS-CoV S蛋白最初合成为Endo H敏感性gp170种类，接着逐步出现Endo H抗性gp180形式，这可能是由于加入复合碳水化合物与高尔基体。
重组S蛋白不分泌到细胞培养基中，除非含TM区和Cys-丰富尾的C末端60个氨基酸缺失。
研究全长重组S蛋白的四级结构，使用交联处理、热变性和大小分级分离分析。结果数据与重组S蛋白作为~500kDa同三聚体存在一致。类似分析获得自病毒体的S也产生相同结果。其它包膜RNA病毒报导过这种三聚体结构：流感病毒的血凝素HA、甲病毒的E1-E2异二聚体和疱疹性口炎病毒的G蛋白。在还原条件下孵育表明SARS-CoV S三聚体结构非共价相联且很稳定。细胞裂解物中存在的S寡聚体显示抗10mM DTT还原、1％SDS洗涤剂处理和高至60℃的热变性。在＞80℃的温度孵育导致三聚复合体解离，由三聚体减少而同时伴随单聚体带增加所证明。温度诱导出现高甘露糖化的gp170(ER单聚体形式)以及复合体糖基化gp180(高尔基体单聚体形式)，提示三聚体化可在单聚体刺突蛋白运输到中间高尔基体前发生。这与其它关于TGEV、流感病毒HA、疱疹性口炎病毒G蛋白的报导一致。对于这些蛋白，报导三聚体化在复合寡糖加入高尔基体前发生。
在细胞裂解物中发现寡聚和单聚体形式的S的C末端截断形式，频率分别为10％和90％。发现分泌到培养基中的截短蛋白充分糖基化，且几乎都是单聚体形式。我们推断S糖蛋白的C末端60个氨基酸包含影响三聚体化效率的膜锚定区。在S蛋白三聚体化中，可能需要C末端区以起始一系列事件且S2茎结构域中的三链卷曲螺旋结构提供更多的稳定力，如流感病毒HA寡聚体中观察到的。
实施例24：用于刺突蛋白表达的CHO细胞
制备稳定表达全长或截短SARS-CoV刺突蛋白的CHO细胞系。获得一些稳定转染的CHO细胞系，图73显示来自一组代表性克隆的蛋白质印迹数据。
实施例25：在大肠杆菌中表达
所有SARS-CoV ORFs(图17，表10)克隆到pET载体中并在大肠杆菌中表达为C末端His标记融合蛋白。小于16KD的蛋白也表达为N末端GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合蛋白，使用pET载体。
Nsp1和Nsp2是2种具有蛋白裂解活性的SARS-CoV蛋白，由于大肠杆菌中的毒性，它们不表达为全长蛋白。各基因改以不同比例克隆，用于分开所得重组蛋白中的催化残基(对于Nsp1，Cys833/His994；对于Nsp2，His41/Cys145)，所得重组蛋白是：来自AY310120核苷酸2719-5214；来自核苷酸5218-7371的Nsp1B；来自核苷酸7372-9984的Nsp1C；来自核苷酸9985-10416的Nsp2A；来自核苷酸10476-10902的Nsp2B。
Nsp9(SEQ ID NO：9775)分成2部分：来自核苷酸13371-14756的Nsp9A；来自核苷酸14757-16166的Nsp9B。
基质(M)、ORF3和ORF7分别包含3、2和1个跨膜结构域。这些蛋白表达为缺失蛋白，排除最初100个氨基酸(M和ORF3)或包括疏水区的前18个氨基酸(ORF7)。
克隆序列示于表26。
2步骤策略用于扩增克隆序列。在第1个步骤中，扩增含超过1个基因或单一基因的DNA片段，使用测序过的cDNA作为模板。扩增11个cDNA序列：(1)片段，命名为amplC1，包括编码蛋白E、蛋白M、orf 7-8-9-10的基因；(2)片段，命名为amplC2，包括编码orf 3-4的基因；(3)片段，命名为amplC5，包括编码蛋白Nsp12和Nsp13的基因；(4)Nsp11基因；(5)P28和P65基因；(6)Nsp1B和Nsp1C基因部分；(7)片段，命名为amplC9，包括编码蛋白Nsp2和Nsp3的基因；(8)片段，命名为amplNsp4-7，包括编码蛋白Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7和用于扩增Nsp9A基因部分的基因；(9)Nsp 9B基因部分和Nsp10基因；(10)片段，命名为amplCO，包括编码蛋白Orf11、核壳蛋白(N)和Orf12的基因；(11)Nsp1A基因部分。第1个步骤所用引物在表27中给出：
在第2个步骤中，扩增单一基因，使用来自第1个扩增步骤的DNA片段作为模板。引物示于表28。
在可观察到表达的蛋白中，蛋白或在内含体中(不溶)或处于可溶形式。在适当材料上进行纯化。表29显示SARS-CoV ORFs表达片段的分子量，它们是否克隆(+或-)，是否观察到克隆片段表达(+或-)以及选择用于纯化的蛋白形式。
当蛋白是可溶His标记产物时，划线单一菌落并在LB/Amp(100μg/ml)琼脂板上37℃过夜生长。来自此平板的分离菌落接种到20ml LB/Amp(100μg/ml)液体培养基中，37℃振荡过夜生长。过夜培养物1∶30稀释到1.0L LB/Amp(100μg/ml)液体培养基中，在最适温度(30或37℃)生长直到OD550nm达到0.6-0.8。通过加入IPTG(终浓度1.0mM)诱导重组蛋白表达且培养物再孵育3小时。通过8000×g 4℃离心15分钟收集细菌。细菌沉淀重悬于10ml冷缓冲液A(300mM NaCl、50mM磷酸缓冲液、10mM咪唑，pH 8.0)。通过超声波降解(弗氏压碎器)冰上破裂细胞，使用Branson超声波降解器450，40W 30秒4次，并以13000×g 4℃离心30分钟。上清混合150μlNi2+-树脂(前面用缓冲液A平衡过)并室温孵育，温和搅拌30分钟。树脂是高流螯合琼脂糖(Chelating Sepharose Fast Flow)(Pharmacia)，根据厂商说明制备。制品分批在700×g 4℃离心5分钟，弃上清。树脂用10ml缓冲液A洗2次(分批)10分钟，重悬于1.0ml缓冲液A且加样到一次性柱。树脂连续用4℃的缓冲液A洗，直到流过的OD280nm达到0.02-0.01。树脂进一步用冷缓冲液B(300mM NaCl、50mM磷酸缓冲液、20mM咪唑，pH 8.0)洗，直到流过的OD280nm达到0.02-0.01。通过加入700μl冷洗脱缓冲液C(300mM NaCl、50mM磷酸缓冲液、250mM咪唑，pH 8.0)洗脱His融合蛋白，收集各部分直到OD280nm指示获得所有重组蛋白。20μl等分的各洗脱部分通过SDS-PAGE分析。用Bradford测定估计蛋白浓度。
当蛋白是不溶产物时，内含体如下纯化：在25ml 0.1M Tris HCl pH 7、1mM EDTA中4℃匀化细胞(5g湿重)，使用ultraturrax(10000rpm)；加入1.5mg溶菌酶每克细胞；用ultraturrax短暂混合并4℃孵育30分钟；使用超声波降解或高压匀化来破裂细胞；为消化DNA，加入MgCl2到3mM终浓度且加入DNase到10ug/ml终浓度，25℃孵育30分钟，溶液中加入0.5体积的60mM EDTA、6％Triton x-100、1.5M NaClpH 7.0，4℃孵育30分钟；31000g 4°离心10分钟；沉淀重悬于40ml 0.1M Tris HClpH 7.0、20mM EDTA，使用ultraturrax；31000g 4°离心10分钟；IB沉淀保存于-20℃。
表达结果示于图86到105。纯度和产量的例子在表30中给出。
实施例26：在截短刺突抗原上保持关键抗原表位
在ELISA测定中测试有中和活性的人单克隆抗体与纯化截短刺突蛋白的反应性。简要地，ELISA板包被1μg/ml浓度的截短形式刺突蛋白(100μl/孔)，4℃过夜孵育板。冲洗板，封闭非特异结合位点，随后加入不同稀释的抗体且板在室温孵育1小时。孵育结束时，冲洗板并检测结合抗体，使用缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗人IgG和适当底物。各孔最佳密度记录为405nm，使用ELISA读数器。数据示于图69，清楚证明由mAb识别的中和抗原表位保存并暴露于重组截短刺突蛋白上。
实施例27：不同刺突疫苗
纯化的截短刺突蛋白用于免疫小鼠，抗截短刺突蛋白诱导的抗体结合水平通过ELISA测定确定。简要地，1组10只小鼠用3μg截短刺突蛋白免疫，MF59作为佐剂，在0、4和8周间隔免疫。从这些动物中收集血清样品，在ELISA测定中确定截短刺突蛋白诱导的抗体。另外1组8只小鼠用75μg DNA免疫，DNA编码PLG粒子上的截短形式刺突蛋白，在0、4和13周间隔免疫，收集血清并如上分析抗刺突抗体。
各组中诱导的结合抗体分布绘作几何平均效价(GMT)。与表达截短刺突抗原并用PLG微粒制剂传递的质粒DNA疫苗相比较，纯化的截短刺突蛋白显然更有效诱导强抗体反应。进一步比较相同小鼠品系中灭活BPL-SARS-CoV(已显示出保护性)诱导的抗体反应，显示纯化截短刺突蛋白与灭活病毒疫苗诱导的抗体反应大小在相同范围内(图70)。
也评估重组截短刺突蛋白或表达相同刺突抗原的DNA所诱导抗体的中和潜能。2组所得GMT值示于图71。根据这些数据，似乎纯化蛋白更显著有效诱导抗SARS-CoV刺突的中和抗体反应。此外，通常由纯化截短刺突蛋白诱导的中和效价可与灭活SARS-CoV疫苗诱导的中和效价相比。
图72显示抗体结合水平(ELISA，X轴)的比较，有中和效价(Y轴)。一般，结合与中和抗体间有很好的相关性。底部左面组合显示用DNA疫苗第3次免疫后2周的比例；上面右边组合显示用蛋白疫苗第2次免疫后2周的比例。2种疫苗形式都表现出恒定相关性。
在进一步的实验中，研究DNA疫苗在小鼠中引起免疫反应的能力。小鼠用pCMV-nSdTC质粒免疫，质粒没有或有PLG微粒。来自小鼠的血清随后用作染色抗体抗培养的293细胞，细胞转染全长或截短刺突。测试前离心细胞并裂解沉淀。测试抗体，抗培养物上清和抗细胞裂解物。如图112所示，小鼠血清能在表达全长刺突的细胞裂解物和表达截短刺突蛋白的细胞上清中检测刺突蛋白。结果可与用兔血清观察到的染色相比，兔血清是在用完整死疫苗免疫后获得。可使用DNA疫苗接种诱导抗刺突抗体。
实施例28：pCMV中的表达盒
质粒pCMVKm2的序列以SEQ ID NO：9923给出。编码全长形式(pCMVKm2 SARS刺突nS；SEQ ID NO：9921)或ΔTC形式(pCMVKm2SARS刺突nSΔTC；SEQ ID NO：9922)刺突蛋白的基因插入此基本载体。
小鼠用这些载体以及编码N、M或E蛋白的类似载体免疫。也制备编码相同蛋白但有最优密码子选择的载体。最优化密码子用于从FRA序列(GenBank：AY310120)开始有效人表达。最佳序列是：N(SEQ ID NO：9924)；M(SEQ ID NO：9925)；E(SEQ IDNO：9926)。
施用后，在所有情况中可通过免疫荧光检测蛋白表达。例如，图106显示施用编码最优N抗原的载体后免疫荧光(用抗SARS兔血清)结果，表现出高水平表达。接受单独对照载体的小鼠没有显示荧光。
图107比较天然M序列(107A)或密码子最优化M序列(107B)的免疫荧光(用Abgent抗M抗体)。类似的，图108比较天然E序列(108A))或密码子最优化E序列(108B)的免疫荧光(用Abgent抗E抗体)。
免疫4组小鼠(8只每组)，用：(1)SARS nS刺突，nSdTC截短刺突和N蛋白；(2)pCMV-SARS-nSdTC：DNA+DNA-PLG，在0、4和13周；(3)CMV-nS：DNA+DNA-PLG+VEE/SINRep，在0、4和9周；(4)VEE/SIN Rep-SARS-nS，3次，在0、4和13周。来自所有组的血清都识别SARS nS和nSdTC蛋白，也显示病毒结合和中和活性。
实施例29：刺突蛋白切割
为研究蛋白酶切割对SARS-CoV刺突蛋白的作用，蛋白在大肠杆菌中以多种形式表达，包括：(1)全长S1-S2；(2)单独S1；(3)七个HR1和(4)七个HR2。表达的蛋白用于培养免疫兔血清，血清随后用于呈现Vero细胞的蛋白质印迹，细胞感染或未感染SARS-CoV。
图109显示蛋白质印迹，使用1∶10000稀释的抗体，抗体抗S1结构域或未切割的S1-S2结构域培养。图110显示蛋白质印迹，使用1∶10000稀释的抗体，抗体抗各个4种蛋白培养。抗原反应性的差异明显。
图111显示类似数据。各血清测试4个泳道，此4个泳道从左到右是：(a)1∶500稀释的血清，SARS-CoV-感染细胞；(b)1∶500稀释的血清，非感染细胞；(c)1∶2500稀释的血清，SARS-CoV-感染细胞；(d)1∶2500稀释的血清，非感染细胞。再次，抗原反应性的差异明显。
图109-111显示受感染Vero细胞中存在多种刺突蛋白形式，大小约为75kDa、90kDa、180kDa和＞250kDa。切割(只少部分)刺突蛋白，在胞内或在粒子释放后切割。
如果小鼠肝炎冠状病毒刺突蛋白的酶切割受抑制，则细胞-细胞融合(合胞体形式)也受抑制，但病毒-细胞不受抑制(de Haan等.(2004) J Virol)。在SARS感染病人肺中体内观察到合胞体，但在SARS-CoV的Vero细胞培养物中没有发现。因此，抑制刺突蛋白切割可用于预防合胞体形成和相关病理学，即使病毒感染性可能没有阻断。
实施例30：纯化SRAS蛋白酶
细胞在37℃生长到对数中期并用0.2％L-阿拉伯糖诱导。离心收集细胞，细胞重悬于裂解缓冲液(LB)，缓冲液含20mM Tris pH 7.5、500mM NaCl、5％甘油V/V、0.05％Triton X-100、5mM ME、5mM咪唑和完全蛋白酶抑制剂(-)EDTA。Benzonase加入到终浓度50U/ml的裂解物中。随后，通过2次经过预冷微射流均质机来裂解细胞。以44,000×g高速离心来澄清裂解物。澄清的裂解物应用于准备好的Pharmacia螯合FF柱，柱带电，有硫酸镍。应用裂解物后，柱用5个柱体积的LB洗，接着用5个柱体积添加45mM咪唑的LB洗。随后用添加250mM咪唑的LB洗脱柱。分离SARS蛋白酶的纯度是50％。收集含蛋白酶的部分，调整到5mM EDTA，然后应用于Superdex200凝胶过滤柱，柱在20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、5％V/V甘油、0.05％TritonX-100和5mM DTT中平衡过。分离SARS蛋白酶的纯度是70％。再次，收集含蛋白酶的部分，随后-80°保存，直到使用。活性测定、质谱和蛋白质印迹分析用于确实鉴定蛋白(图133)。所有步骤在预冷缓冲液中完成，尽可能保持更多制品在4℃。
SARS蛋白酶纯化部分的蛋白质印迹
操作：简要地，蛋白浓度以280nm吸光率为基础，考马斯染色凝胶估计纯度。蛋白在4-20％梯度凝胶上跑，转至硝化纤维。随后，点用3％BSA封闭，用小鼠IgG抗7His探测，然后用缀合HRP的小鼠IgG二抗探测。点用ECL试剂盒(PharmaciaBiotech)呈现。结果示于图133，其中A是加样50、100和200ng靶蛋白的分级柱集合，B是加样50、100和200ng靶蛋白的固定金属亲和柱集合。
实施例31：连续荧光共振能量转移(FRER)酶测定
含EDANS、荧光供体、DABCYL、荧光淬灭剂(DABCYL-VNSTLQ SGLRK-EDANS)的肽由Syn.Pep.(Dublin，CA)合成。肽在中间包含切割位点Gln-Ser。Meyers等.《蛋白水解酶手册》和Barrett，A等.Academic Press，London，1998，726-728。动力学跟踪SARS蛋白酶的蛋白裂解活性，通过测量含荧光供体SGLRK-EDANS的切割产物的形成水平，使用Hitachi荧光计(F-4500FL Spec.)，设置为340nm激发和490nm发射波长。在DMSO溶液中的5L 5mM肽原液加入反应混合物中，混合物含295l of标准缓冲液(75mM Tris-Hcl、25mM NaOAc、25mM Bis-Tris、25mM甘氨酸、5mM EDTA和1mM EDTA，pH 7.4)和100ul缓冲液或100ul 3.6uM蛋白酶贮存液。跟踪动力学曲线6分钟(反应线性，R2值为0.998(图134))。荧光形成(蛋白裂解反应)可能是酶依赖性，当酶浓度增至三倍时，在6分钟时间框中形成的荧光也增至三倍。
应该理解，本发明仅通过实施例的方式进行了描述，可进行修改而仍保持在发明范围和精神内。
表1.美国专利和公开的国际专利申请
  公开号   标题   公布日
  US-3927216   抑制病毒感染的1，2，4-三唑E-3-羧酰胺(1，2，4-Triazol E-3-Carboxamides For Inhibiting VirusInfections)   12/16/1975
  US-4010269   抗病毒喹唑啉组合物及其用法(Antiviral Quinazoline Compositions And Methods Of Use)   3/1/1977
  US-4065570   抗病毒5-(取代的苯亚甲基)己内酰胺类(Antiviral 5-(Substituted Benzal)Hydantoins)   12/27/1977
  US-4089965   作为抗鼻病毒剂的噻唑基苯基胍(Thiazolylphenylguanidines As Antirhinovirus Agents)   5/16/1978
  US-4122191   抗鼻病毒剂(Antirhinovirus Agents)   10/24/1978
  US-4192895   抗鼻病毒剂(Antirhinovirus Agents)   3/11/1980
  US-4254144   具有抗病毒活性的取代的苯腈(Substituted Benzonitriles Having Antiviral Activity)   3/3/1981
  US-4264617   抗病毒5-(取代的苯亚甲基)己内酰胺类(Antiviral 5-(Substituted Benzal)Hydantoins)   4/28/1981
  US-4287188   嘌呤衍生物(Purine Derivatives)   9/1/1981
  US-4327088   膦酰基氧-或糖基糖基氧-取代的烯丙酰苯，组合物及其用途(Phosphonooxy-OrGlycosyloxy-Substituted Acrylophenones，Compositions And Uses Thereof)   4/27/1982
  US-4332820   具有抗病毒活性的取代的苯腈(Substituted Benzonitriles Having Antiviral Activity)   6/1/1982
  US-4349568   具有抗病毒活性的硫-取代的二苯醚(Sulfur-Substituted Diphenyl Ethers Having Antiviral Activity)   9/14/1982
  US-4352792   3-烷氧基黄铜抗病毒剂(3-Alkoxyflavone Antiviral Agents)   10/5/1982
  US-4371537   具有抗病毒活性的硫-取代的苯氧基吡啶(Sulfur-Substituted Phenoxypyridines Having AntiviralActivity)   2/1/1983
  US-4423053   作为抗病毒剂的2-氨基-5-(O-硫酰胺苯基)-1，3，4-噻二唑衍生物及其制备方法(Derivatives Of2-Amino-5-(O-Sulphamidophenyl)-1，3，4-Thiadiazol As Antiviral Agents And A Process For ThePreparation Thereof)   12/27/1983
  US-4505929   具有抗病毒活性的硫-取代的二苯醚(Sulfur-Substituted Diphenyl Ethers Having Antiviral Activity)   3/19/1985
  US-4526897   高血压药异二氢吲哚-2-基-氨基咪唑啉和异二氢吲哚-2-基-胍(HypertensiveIsoindolin-2-Yl-Aminoimidazolines And Isoindolin-2-Yl-Guanidines)   7/2/1985
  US-4558134   一些具有抗病毒活性的苯氧基-吡啶-腈(Certain Phenoxy-Pyridine-Carbonitriles Having AntiviralActivity)   12/10/1985
  US-4629729   赋予抗-病毒活性2-烷基氨基-4，6-二卤嘧啶(Endowed With Anti-Viral Activity2-Alkylamino-4，6-Dihalo Pyrimidines)   12/16/1986
  US-4636492   用肽卤代甲基酮抑制病毒蛋白质活性(Inhibition Of Viral Protease Activity By Peptide HalomethylKetones)   1/13/1987
  US-4652552   病毒蛋白质的四肽甲基酮抑制剂(Tetrapeptide Methyl Ketone Inhibitors Of Viral Proteases)   3/24/1987
  US-4724233   膦酰基甲氧基烷基腺嘌呤的治疗应用(Therapeutical Application Of Phosphonylmethoxyalkyl Adenines)   2/9/1988
  US-4738984   抗鼻病毒剂(Antirhinovirus Agents)   4/19/1988
  US-4847246   来自萤火虫的抗病毒组合物及其用法(Antiviral Compositions Derived From Fireflies And TheirMethods Of Use)   7/11/1989
  US-4855283   新的药物活性N-(2-氨基酰氨基-2-脱氧-己糖基)-酰胺，-氨基甲酸酯及其应用(NovelPharmaceutically Active N-(2-Aminoacylamido-2-Deoxy-Hexosyl)-Amides，-Carbamates And-Ureas)   8/8/1989
  US-4885285   磷化合物，它们的制造方法和它们的用途(Phosphorus Compounds，Processes For Their Manufacture，And Their Use)   12/5/1989
  US-4956351   含有环糊精的抗病毒药物组合物(Antiviral Pharmaceutical Compositions Containing Cyclodextrins)   9/11/1990
  US-5001125   抗-病毒活性哒嗪哒嗪(Anti-Virally Active Pyridazinamines)   3/19/1991
  US-5036072   抗病毒剂(Antiviral Agent)   7/30/1991
  US-5070090   抗小RNA病毒杂环-取代的吗啉基烷基酚醚(Antipicorpaviral Herterocyclic-Substituted MorpholinylAlkylphenol Ethers)   12/3/1991
  US-5100893   抗小RNA病毒哒嗪(Antipicomaviral Pyridazinamines)   3/31/1992
  US-5112825   抗鼻病毒杂胺-取代的哒嗪(Antirhinoviral Heteroamine-Substituted Pyridazines)   5/12/1992
  US-5157035   抗病毒活性哒嗪(Anti-Virally Active Pyridazinamines)   10/20/1992
  US-5240694   普通感冒的组合抗病毒和抗介质治疗(Combined Antiviral And Antimediator Treatment Of CommonColds)   8/31/1993
  US-5242924   作为抗病毒剂的四唑基-(苯氧基和苯氧基烷基)-哌啶基哒嗪(Tetrazolyl-(Phenoxy AndPhenoxyalkyl)-Piperidinylpyridazines As Antiviral Agents)   9/7/1993
  US-5278184   适合治疗鼻病毒感染的吡咯和吡咯烷的缓冲衍生物(Synthetic Derivatives Of Pyrrole And Pyrrolidine   1/11/1994
 Suitable For The Therapy Of Infections Caused By Rhinoviruses)
  US-5364865  作为抗病毒剂的苯氧基-和苯氧基烷基-哌啶(Phenoxy-And Phenoxyalkyl-Piperidines As AntiviralAgents)   11/15/1994
  US-5453433  噻二唑类物质和抗小RNA病毒组合物(Thiadiazoles And Antipicornaviral Compositions)   9/26/1995
  US-5492689  普通感冒的组合抑制病毒抗介质(COVAM)治疗(Combined Virustatic Antimediator(COVAM)TreatmentOf Common Colds)   2/20/1996
  US-5514679  治疗性苯氧基烷基哒嗪及其中间体(Therapeutic Phenoxyalklpyridazines And Intermediates Therefor)   5/7/1996
  US-5514692  用作抗小RNA病毒剂的取代的喹啉衍生物(Substituted Quinoline Derivatives Useful As AntipiconaviralAgents)   5/7/1996
  US-5523312  抗小RNA病毒剂(Antipicornaviral Agents)   6/4/1996
  US-5545653  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   8/13/1996
  US-5552420  治疗性苯氧基烷基吡咯和苯氧基烷基吖嗪(Therapeutic Phenoxyalkylazoles And Phenoxyalkylazines)   9/3/1996
  US-5567719  噻二唑和及其作为抗小RNA病毒剂的应用(Thiadiazoles And Their Use As Antipicornaviral Agents)   10/22/1995
  US-5580897  具有抗真菌活性的1，2-二硫杂环己二烯(1，2-Dithiins Having Antifungal Activity)   12/3/1996
  US-5618821  治疗性苯氧基烷基heterocycles(Therapeutic Phenoxyalkylheterocycles)   4/8/1997
  US-5618849  口服活性抗病毒化合物(Orally Active Antiviral Compounds)   4/8/1997
  US-5648354  具有抗真菌活性的1，2-二硫杂环己二烯(1，2-Dithiins Having Antifungal Activity)   7/15/1997
  US-5650419  噻二唑和及其作为抗小RNA病毒剂的应用(Thiadiazoles And Their Use As Antipicornaviral Agents)   7/22/1997
  US-5693661  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   12/2/1997
  US-5721261  治疗性苯氧基烷基吡咯和苯氧基烷基吖嗪(Therapeutic Phenoxyalkylazoles And Phenoxyalkylazines)   2/24/1998
  US-5725859  具有抑制病毒和抗病毒作用的基于植物的治疗剂(Plant-Based Therapeutic Agent With Virustatic AndAntiviral Effect)   3/10/1998
  US-5750527  噻二唑和及其作为抗小RNA病毒剂的应用(Thiadiazoles And Their Use As Antipicornaviral Agents)   5/12/1998
  US-5750551  病毒学疾病的治疗(Treatment For Viral Diseases)   5/12/1998
  US-5762940  抑制或破坏病毒或逆转录病毒的方法和组合物(Methods And Compositions For Inhibiting OrDestroying Viruses Or Retroviruses)   6/9/1998
  US-5763461  治疗性苯氧基烷基杂环(Therapeutic Phenoxyalkylheterocycles)   6/9/1998
  US-5821242  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   10/13/1998
  US-5821257  噻二唑和及其作为抗小RNA病毒剂的应用(Thiadiazoles And Their Uses As Antipicornaviral Agents)   10/13/1998
  US-5821331  抗-小RNA病毒剂(Anti-Picornaviral Agents)   10/13/1998
  US-5846986  治疗性苯氧基烷基吡咯和苯氧基烷基吖嗪(Therapeutic Phenoxyalkylazoles And Phenoxyalkylazines)   12/8/1998
  US-5856530  抗小RNA病毒化合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds And Methods For TheirUse And Preparation)   1/5/1999
  US-5891874  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compound)   4/6/1999
  US-5962487  抗小RNA病毒化合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds And Methods For TheirUse And Preparation)   10/5/1999
  US-6004933  半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Protease Inhibitors)   12/21/1999
  US-6020371  抗小RNA病毒化合物、含有它们的组合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral CompoundsCompositions Containing Them And Methods For Their Use)   2/1/2000
  US-6087374  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   7/11/2000
  US-6114327  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   9/5/2000
  US-6117844  用于抗病毒治疗的方法和组合物(Method And Composition For Antiviral Therapy)   9/12/2000
  US-6194447  作为钾阻断剂的双(苯并咪唑)衍生物(Bis(Benzimidazole)Derivatives Serving As Potassium BlockingAgents)   2/27/2001
  US-6214799  抗小RNA病毒化合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds And Methods For TheirUse And Preparation)   4/10/2001
  US-6277891  一氧化氮抑制鼻病毒感染(Nitric Oxide Inhibits Rhinovirus Infection)   8/21/2001
  US-6294186  含有苯甲酸类似物和金属盐的抗微生物组合物(Antimicrobial Compositions Comprising A BenzoicAcid Analog And A Metal Salt)   9/25/2001
  US-6331554  抗小RNA病毒化合物，含有它们的组合物，和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds，Compositions Containing Them，And Methods For Their Use)   12/18/2001
  US-6358971  抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   3/19/2002
  US-6362166  抗小RNA病毒化合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds And Methods For Their   3/26/2002
 Use And Preparation)
  US-6414004  具有抗病毒活性3-取代的5-芳基-4-异噁唑腈(3-Substituted 5-Aryl-4-Isoxazolecarbonitriles HavingAntiviral Activity)   7/2/2002
  US-6420591  氨基甲酸酯及其组合物，用它们治疗癌症、炎症或病毒感染的方法(Carbamates And CompositionsThereof，And Methods For Their Use For Treating Cancer，Inflammation，Or A Viral Infection)   7/16/2002
  US-6469018  化合物(Compounds)   10/22/2002
  US-6498178  IMPDH酶抑制剂(Inhibitors Of IMPDH Enzyme)   12/24/2002
  US-6514997  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   2/4/2003
  US-6525043  离子通道调制剂的使用(Use Of Ion Channel Modulating Agents)   2/25/2003
  US-6531452  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   3/11/2003
  US-6534489  有机磷化合物及其使用(Organophosphorus Compounds And The Use Thereof)   3/18/2003
  WO00/06529  作为聚合酶抑制剂的二酮酸-衍生物(Diketoacid-Derivatives As Inhibitors Of Polynerases)   2/10/2000
  WO00/25791  吡啶-4-基或嘧啶-4-基取代的吡嗪(Pyridin-4-Yl Or Pyrimidin-4-Yl Substituted Pyrazines)   5/11/2000
  WO00/27423  治疗普通感冒症状的方法和组合物(Methods And Compositions For Treating Common Cold Symptoms)   5/18/2000
  WO00/34308  蛋白质转导系统及其用法(Protein Transduction System And Methods Of Use Thereof)   6/15/2000
  WO00/39348  鉴定蛋白酶调节子的方法和组合物(Methods And Compositions For Identifying Protease Modulators)   7/6/2000
  WO00/40243  新的化合物(Novel Compounds)   7/13/2000
  WO00/50037  亚硝基化的和亚硝酰基化的质子泵抑制剂，组合物及其用法(Nitrosated And Nitrosylated Proton PumpInhibitors，Compositions And Methods Of Use)   8/31/2000
  WO00/56331  Impdh酶抑制剂(Inhibitors Of Impdh Enzyme)   9/28/2000
  WO00/56757  免疫调节剂类固醇，尤其是16.α.-溴表雄酮的半水合物(Immunomodulatory Steroids，In Particular TheHemihydrate Of 16.Alpha.-Bromoepiandrosterone)   9/28/2000
  WO00/66096  抗癫痫剂的新用法和药物(New Indication For Use Of Antiepileptic Agents And Medicines)   11/9/2000
  WO00/78746  抗病毒剂(Antiviral Agents)   12/28/2000
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  WO01/02551  病毒样颗粒，它们的制备以及它们优选在药物筛选和功能基因组学中的应用(Virus Like Particles，Their Preparation And Their Use Preferably In Pharmaceutical Screening And Functional Genomics)   1/11/2001
  WO01/03681  黄酮类、香豆素类和相关化合物在治疗感染中的应用(Use Of Flavones，Coumarins And RelatedCompounds To Treat Infections)   1/18/2001
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  WO01/10894  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   2/15/2001
  WO01/19322  Csaids用于鼻病毒感染(Use Of Csaids In Rhinovirus Infection)   3/22/2001
  WO01/19822  抗病毒剂(Antiviral Agents)   3/22/2001
  W001/22920  结肠和结肠癌相关多核苷酸和多肽(Colon And Colon Cancer Associated Polynucleotides AndPolypeptides)   4/5/2001
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  WO01/31016  处理的人细胞因子Phc-1和Phc-2(Processed Human Chemokines Phc-1 And Phc-2)   5/3/2001
  WO01/37837  3，4-二氢-(1h)-喹唑啉-2-酮和它们作为Csbp/P38激酶抑制剂的用途(3，4-Dihydro-(1h)-Quinazolin-2-Ones And Their Use As Csbp/P38 Kinase Inhibitors)   5/31/2001
  WO01/38312  3，4-二氢-(1h)喹唑啉-2-酮化合物作为Csbp/P38激酶抑制剂(3，4-Dihydro-(1h)Quinazolin-2-OneCompounds As Csbp/P38 Kinase Inhibitors)   5/31/2001
  WO01/38313  3，4-二氢-(1h)喹唑啉-2-酮化合物作为Csbp/P38激酶抑制剂(3，4-Dihydro-(1h)Quinazolin-2-OneCompounds As Csbp/P38 Kinase Inhibitors)   5/31/2001
  WO01/38314  3，4-二氢-(1h)喹唑啉-2-酮化合物作为Csbp/P38激酶抑制剂(3，4-Dihydro-(1h)Quinazolin-2-OneCompounds As Csbp/P38 Kinase Inhibitors)   5/31/2001
  WO01/40189  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   6/7/2001
  WO01/49303  多价电子活性组合物以及它们的制造和使用方法(Multivalent Electron Active Compositions And   7/12/2001
 Methods Of Making And Using Same)
  WO01/60393  用人免疫缺陷病毒选择性破坏细胞感染(Selective Destruction Of Cells Infected With HumanImmunodeficiency Virus)   8/23/2001
  WO01/62726  2-氧-1-吡咯烷衍生物，它们的制造方法和用途(2-Oxo-1-Pyrrolidine Derivatives，Processes ForPreparing Them And Their Uses)   8/30/2001
  WO01/79167  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   10/25/2001
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  WO01/93885  治疗剂-Ii(Therapeutic Agents-Ii)   12/13/2001
  WO01/96297  抗小RNA病毒化合物和组合物，它们的药物应用，以及它们的合成物质(Antipicornaviral CompoundsAnd Compositions，Their Pharmaceutical Uses，And Materials For Their Synthesis)   12/20/2001
  WO02/04413  手性整联蛋白调节子及其使用方法(Chiral Integrin Modulators And Methods Of Use Thereof)   1/17/2002
  WO02/11743  前列腺癌的治疗(Treatment Of Prostate Cancer)   2/14/2002
  WO02/12477  增强Hcv Rna的复制(Enhanced Replication Of Hcv Rna)   2/14/2002
  WO02/14343  抑制免疫的、抗炎症和止痛的化合物(Immunosuppressive，Antiinflammatory And AnalgeticCompounds)   2/21/2002
  WO02/24145  来自植物角质层和上皮材料的抗病毒物质(Antiviral Substances From Plant Cuticular And EpicuticularMaterial)   3/28/2002
  WO02/28351  来自肺炎链球菌的重组粘蛋白结合蛋白(Recombinant Mucin Binding Proteins From SteptococcusPneumoniae)   4/11/2002
  WO02/30442  治疗细胞因子介导的肝损伤的方法(Method For Treating Cytokine Mediated Hepatic Injury)   4/18/2002
  WO02/34771  来自链球菌组A和B的核酸和蛋白质(Nucleic Acids And Proteins From Streptococcus Groups A&B)   5/2/2002
  WO02/44737  涉及G蛋白-偶联受体(Gpcr)过敏毒素C3a受体的诊断和治疗组合物以及方法(Diagnostic AndTherapeutic Compositions And Methods Related To G Protein-Coupled Receptor(Gpcr)AnaphylatoxinC3a Receptor)   6/6/2002
  WO02/50045  抗病毒剂(Antiviral Agents)   6/27/2002
  WO02/51413  大环抗-病毒化合物(Macrocyclic Anti-Viral Compounds)   7/4/2002
  WO02/53138  抑制瘤损伤的治疗(Treatment For Inhibiting Neoplastic Lesions)   7/11/2002
  WO02/57425  作为RNA依赖型RNA病毒聚合酶抑制剂的核苷衍生物(Nucleoside Derivatives As Inhibitors OfRna-Dependent Rna Viral Polymerase)   7/25/2002
  WO02/59083  新型化合物(Novel Compounds)   8/1/2002
  WO02/60875  用作Pde4异构酶抑制剂的烟酰胺二芳基衍生物(Nicotinamide Biaryl Derivatives Useful As InhibitorsOf Pde4 Isozymes)   8/8/2002
  WO02/60898  用作Pde4异构酶抑制剂的噻唑基-，噁唑基-，吡咯基-和咪唑剂-酸酰胺衍生物(Thiazolyl-，Oxazolyl-，Pyrrolyl-，And Imidazolyl-Acid Amide Derivatives Useful As Inhibitors Of Pde4 Isozymes)   8/8/2002
  WO02/69903  核苷，其制备以及作为RNA病毒聚合酶抑制剂的应用(Nucleosides，Preparation Thereof And Use AsInhibitors Of Rna Viral Polymerases)   9/12/2002
  WO02/72022  作为抗真菌剂的取代的四环素化合物(Substituted Tetracycline Compounds As Antifungal Agents)   9/19/2002
  WO02/72031  作为协同抗真菌剂的取代的四环素化合物(Substituted Tetracycline Compounds As SynergisticAntifungal Agents)   9/19/2002
  WO02/76939  半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Protease Inhibitors)   10/3/2002
  W002/77021  肺炎链球菌的蛋白质和核酸(Streptococcus Pneumoniae Proteins And Nucleic Acids)   10/3/2002
  WO02/79401  新的Rgs9蛋白结合相互作用及其用法(Novel Rgs9 Protein Binding Interactions And Methods Of UseThereof)   10/10/2002
  WO02/82041  制造和使用与双特异性受体一起使用的新的基于肽的试剂(Production And Use Of NovelPeptide-Based Agents For Use With Bi-Specific Antibodies)   10/17/2002
  WO02/87465  病毒感染和癌细胞双靶向组合物和方法(Compositions And Methods Of Double-Targeting Virus   11/7/2002
  Infections And Cancer Cells)
  WO02/87500   病毒酶活化的Prototoxophores以及用它们治疗病毒感染(Viral Enzyme Activated PrototoxophoresAnd Use Of Same To Treat Viral Infections)   11/7/2002
  WO02/88091   抑制人鼻病毒2a半胱氨酸蛋白酶(Inhibitors Of Human Rhinovirus 2a Cysteine Protease)   11/7/2002
  WO02/89832   通过调节Th1/Th2比例预防或治疗Th1和Th2细胞相关疾病的药物组合物(PharmaceuticalCompositions For Preventing Or Treating Th1 And Th2 Cell Related Diseases By Modulating The Th1/Th2Ratio.)   11/14/2002
  WO02/92779   使组织富含长链多不饱和脂肪酸的方法(Method For Enriching Tissues In Long Chain PolyunsaturatedFatty Acids)   11/21/2002
  WO02/94185   用来输送细胞的缀合物和组合物(Conjugates And Compositions For Cellular Delivery)   11/28/2002
  WO02/94868   金黄色葡萄球菌蛋白质和核酸(Staphylococcus Aureus Proteins And Nucleic Acids)   11/28/2002
  WO02/96867   用来治疗疾病的蛋白激酶抑制剂(Inhibitors Of Protein Kinase For The Treatment Of Disease)   12/5/2002
  WO02/98424   新型抗传染剂(Novel Anti-Infectives)   12/12/2002
  WO03/04489   抑制异戊烯转移酶的组合物和方法(Compositions And Methods For Inhibiting Prenyltransferases)   1/16/2003
  WO03/08628   酶核酸肽缀合物(Enzymatic Nucleic Acid Peptide Conjugates)   1/30/2003
  WO03/15744   几丁质微粒及其医疗用途(Chitin Microparticles And Their Medical Uses)   2/27/2003
  WO03/20222   二氧戊环和氧杂硫醇烷衍生物作为依赖于RNA的RNA病毒聚合酶抑制剂(Dioxolane And OxathiolaneDerivatives As Inhibitors Of Rna-Dependent Rna Viral Polymerase)   3/13/2003
  WO03/20270   噁二唑基-苯氧基烷基异噁唑，其组合物以及它们用作抗-小RNA病毒剂的方法(Oxadiazolyl-Phenoxyalkylisoxazoles，Compositions Thereof And Methods For Their Use AsAnti-Picornaviral Agents)   3/13/2003
  WO03/20271   噁二唑基-苯氧基烷基异噁唑，其组合物以及它们用作抗-小RNA病毒剂的方法(Oxadiazolyl-Phenoxyalkylisoxazoles，Compositions Thereof And Methods For Their Use AsAnti-Picornaviral Agents)   3/13/2003
  WO03/20712   噁二唑基-苯氧基烷基异噁唑，其组合物以及它们用作抗-小RNA病毒剂的方法(Oxadiazolyl-Phenoxyalkylisoxazoles，Compositions Thereof And Methods For Their Use AsAnti-Picornaviral Agents)   3/13/2003
  WO86/03412   控制和预防鼻病毒感染治疗的改进(Improvements Relating To The Treatment Control And PreventionOf Rhinovirus Infections)   6/19/1986
  WO86/03971   抗病毒剂(Antiviral Agents)   7/17/1986
  WO88/09669   无毒微生物及其应用(Avirulent Microbes And Uses Therefor)   12/15/1988
  WO92/03475   肠道病毒肽(Enterovirus Peptides)   3/5/1992
  WO92/22520   口服活性抗病毒化合物(Orally Active Antiviral Compounds)   12/23/1992
  WO92/22570   小RNA病毒蛋白酶抑制剂(Inhibitors Of Picornavirus Proteases)   12/23/1992
  WO94/00012   核酸以及用它们控制病毒病原体的方法(Nucleic Acids And Methods Of Use Thereof For ControllingViral Pathogens)   1/6/1994
  WO95/03821   作为治疗剂的Prosaposin和细胞因子衍生肽(Prosaposin And Cytokine-Derived Peptides AsTherapeutic Agents)   2/9/1995
  WO95/09175   环-扩张核苷和核苷酸(Ring-Expanded Nucleosides And Nucleotides)   4/6/1995
  WO95/11992   抗病毒化合物(Antiviral Compounds)   5/4/1995
  WO95/31198   噻二唑和及其作为抗小RNA病毒剂的应用(Thiadiazoles And Their Use As Antipicornaviral Agents)   11/23/1995
  WO95/31438   治疗性苯氧基烷基杂环(Therapeutic Phenoxyalkylheterocycles)   11/23/1995
  WO95/31439   治疗性苯氧基烷基哒嗪及其中间体(Therapeutic Phenoxyalkylpyridazines And Intermediates Therefor)   11/23/1995
  WO95/31452   治疗性苯氧基烷基吡咯和苯氧基烷基吖嗪(Therapeutic Phenoxyalkylazoles And Phenoxyalkylazines)   11/23/1995
  WO95/34595   抗病毒枝状物(Antiviral Dendrimers)   12/21/1995
  WO95/35103   预防和/或治疗病毒感染和任选炎症的药物组合物以及治疗方法(A Pharmaceutical Composition ForThe Prevention And/Or Treatment Of Viral Infections And Optionally Inflammations As Well As AMethod For The Treatment Thereof)   12/28/1995
  WO96/05836   用己酮可可碱治疗感冒症状的方法(Methods Of Treating Cold Symptoms Using Pentoxifylline)   2/29/1996
  WO96/05854   制备含环孢菌素A或Fk506或雷帕霉素和黄嘌呤衍生物的组合物(Combination Preparation，ContainingCyclosporin A Or Fk506 Or Rapamycin And A Xanthine Derivative)   2/29/1996
  WO96/09822   抗小RNA病毒剂(Antipicornaviral Agents)   4/4/1996
  WO96/11211   选择性抑制始于内部的RNA翻译(Selective Inhibition Of Internally Initiated Rna Translation)   4/18/1996
  WO96/22689 多组分RNA催化剂及其应用(Multiple Component Rna Catalysts And Uses Thereof)   8/1/1996
  WO96/40641 作为辅佐调节物的磺胺衍生物(Sulfonamide Derivatives As Cell Adhesion Modulators)   12/19/1996
  WO97/08553 寻靶革兰氏阳性菌细胞壁的蛋白质(Targeting Of Proteins To The Cell Wall Of Gram-Positive Bacteria) 3/6/1997
  WO97/34566 治疗疱疹病毒感染的亲电子酮(Electrophilie Ketones For The Treatment Of Herpesvirus Infections)  9/25/1997
  WO97/41137 花色素和花色素衍生物的应用(Use Of Anthocyanidin And Anthocyanidin Derivatives)   11/6/1997
  WO97/43305 小RNA病毒3C蛋白酶抑制剂以及它们的使用和制备方法(Inhibitors Of Picomavirus 3c Proteases AndMethods For Their Use And Preparation)   11/20/1997
  WO97/47270 新型抗病毒化合物(Novel Anti-Viral Compounds)   12/18/1997
  WO98/03572 线形抗病毒聚合物(Antiviral Linear Polymers)   1/29/1998
  WO98/07745 用Indolicidin类似物治疗感染的组合物和方法(Compositions And Methods For Treating InfectionsUsing Analogues Of Indolicidin)   2/26/1998
  WO98/11778 单纯疱疹病毒和其它感染性疾病的抗微生物治疗(Antimicrobial Treatment For Herpes Simplex VirusAnd Other Infectious Diseases)   3/26/1998
  WO98/22495 抗激肽化合物及其应用(Antikinin Compounds And Uses Thereof)   5/28/1998
  WO98/31363 抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   7/23/1998
  WO98/31374 治疗鼻病毒感染的方法(Method Of Treating Rhinoviral Infections)   7/23/1998
  WO98/32427 用包裹在生物可降解-生物相容性聚合基质内的生物活性物质治疗和预防感染(Therapeutic TreatmentAnd Prevention Of Infections With A Bioactive Material Encapsulated Within ABiodegradable-Biocompatible Polymeric Matrix)   7/30/1998
  WO98/34601 抑制胞内病毒复制的方法(Method For Inhibiting Intracellular Viral Replication)   8/13/1998
  WO98/42188 人免疫缺陷型病毒和其它感染性疾病的抗微生物预防和治疗(Antimicrobial Prevention And TreatmentOf Human Immunedeficiency Virus And Other Infectious Diseases)   10/1/1998
  WO98/43950 抗小RNA病毒化合物，含有它们的组合物，以及它们的使用方法(Antipicornaviral Compouds，Compositions Containing Them，And Methods For Their Use)   10/8/1998
  WO98/49190 取代的噁二唑半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Substituted Oxadiazole Cysteine Protease Inhibitors)   11/5/1998
  WO98/55120 抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   12/10/1998
  WO99/30699 半胱氨酸蛋白酶调节物(Anti-Viral Compounds)   6/24/1999
  WO99/31122 抗小RNA病毒化合物和它们的使用和制备方法(Antipicornaviral Compounds And Methods For TheirUse And Preparation)   6/24/1999
  WO99/54317 半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Protease Inhibitors)   10/28/1999
  WO99/55663 Impdh酶抑制剂(Inhibitors Of Impdh Enzyme)   11/4/1999
  WO99/57135 抗小RNA病毒化合物，它们的制备和使用(Antipicornaviral Compounds，Their Preparation And Use)   11/11/1999
  WO99/59587 抗-病毒化合物(Anti-Viral Compounds)   11/25/1999
  WO99/61437 新型2-烷基取代的咪唑化合物(Novel 2-Alkyl Substituted Imidazole Compounds)   12/2/1999
表2.美国专利和公开的国际专利申请
  公开号  标题   公布日
  WO02/69903  核苷，其制备以及作为RNA病毒聚合酶抑制剂的应用(Nucleosides，Preparation Thereof And Use AsInhibitors Of Rna Viral Polymerases)   9/12/2002
  WO02/48116  丙肝病毒Ns3蛋白酶抑制剂(Inhibitors Of Hepatitis C Virus Ns3 Protease)   6/20/2002
  WO02/48157  作为丙肝病毒Ns3蛋白酶抑制剂的咪唑啉酮及其相关衍生物(Imidazolidinones And Their RelatedDerivatives As Hepatitis C Virus Ns3 Protease Inhibitors)   6/20/2002
  WO02/61048  依赖于RNA的RNA聚合酶(Rdrp)病毒的体外复制系统(In Vitro System For Replication OfRna-Dependent Rna Polymerase(Rdrp)Viruses)   8/8/2002
  WO03/02518  作为抗病毒剂的新型2，4-二氟苯甲酰胺衍生物(Novel 2，4-Difluorobenzamide Derivatives AsAntiviral Agents)   1/9/2003
  WO02/79187 作为抗病毒剂的甲氧基-1，3，5-三嗪衍生物(Methoxy-1，3，5-Triazine Derivatives As Antiviral Agents)   10/10/2002
  WO01/78648  作为抗病毒剂的6-甲基烟酰胺衍生物(6-Methylnicotinamide Derivatives As Antiviral Agents)   10/25/2001
  WO01/12214  霉酚酸酯与PEG-IFN-α结合(MYCOPHENOLATE MOFETIL IN ASSOCIATION WITHPEG-IFN-.Alpha.)   2/22/2001
  WO02/100415  4’-取代的核苷(4′-Substituted Nucleosides)   12/19/2002
  WO02/18404  核苷衍生物(Nucleoside Derivatives)   3/7/2002
 WO02/94289  抗病毒核苷衍生物(Antiviral Nucleoside Derivatives)   11/28/2002
 WO96/39500  丙肝病毒特异性寡核苷酸(Oligonucleotides Specific For Hepatitis C Virus)   12/12/1996
 WO03/00713  HCV的核苷化合物(Nucleoside Compounds In Hcv)   1/3/2003
 WO01/60381  带有甲脒修饰的二环碱基的核苷类似物(Nucleoside Analogs With Carboxamidine-Modified BicyclicBase)   8/23/2001
 WO02/03997  吡啶并[2，3-D]嘧啶和嘧啶并[4，5-D]嘧啶核苷(Pyrido[2，3-D]Pyrimidine AndPyrimido[4，5-D]Pyrimidine Nucleosides)   1/17/2002
 WO97/26883  在激活的T-胸腺依赖性细胞中通过利巴韦林3和利巴韦林3类似物调节Th1/Th2细胞因子表达(Modulation Of Th1/Th2 Cytokine Expression By Ribavirin3 And Ribavirin3 Analogs In ActivatedT-Lymphocytes)   7/31/1997
 WO03/26589  用4’-修饰的核苷治疗丙肝病毒的方法和组合物(Methods And Compositions For Treating HepatitisC Virus Using 4′-Modified Nucleosides)   4/3/2003
 WO03/26675  用4’-修饰的核苷治疗黄病毒和瘟病毒的方法和组合物(Methods And Compositions For TreatingFlaviviruses And Pestiviruses Using 4′-Modified Nucleoside)   4/3/2003
 WO97/30067  糖修饰的缺口寡核苷酸(Sugar-Modified Gapped Oligonucleotides)   8/21/1997
 WO01/47883  稠环化合物及其作为药物的应用(Fused-Ring Compounds And Use Thereof As Drugs)   7/5/2001
 WO03/00254  稠环化合物及其作为药物的应用(Fused Cyclic Compounds And Medicinal Use Thereof)   1/3/2003
 WO02/100354  吡咯并[2，3-D]嘧啶核苷类似物(Pyrrolo[2，3-D]Pyrimidine Nucleoside Analogs)   12/19/2002
 WO01/55111  二芳基化合物，其制备和治疗用途(Biaryl Compounds，Their Preparation And Their Use In Therapy)   8/2/2001
 WO01/16149  2-氮杂嘌呤化合物及其用途(2-Azapurine Compounds And Their Use)   3/8/2001
 WO01/85770  哨病毒Ii(Sentinel Virus Ii)   11/15/2001
 WO02/12263  含有嘌呤-2，6-二胺的吡唑并[3，4-D]嘧啶类似物的核酸结合化合物及其应用(Nucleic Acid BindingCompounds Containing Pyrazolo[3，4-D]Pyrimidine Analogues Of Purin-2，6-Diamine And Their Uses)   2/14/2002
 JP 2001-247550 A2  稠环化合物及其医疗用途(Condensed Ring Compound And Its Medicinal Use)   9/11/2001
 6210675  PT-NANB肝炎多肽(PT-NANB Hepatitis Polypeptides)   4/3/2001
 6451991  糖修饰的缺口寡核苷酸(Sugar-Modified Gapped Oligonucleotides)   9/17/2002
 5830455  用α-干扰素和无基团清除剂的治疗性组合物进行治疗的方法(Method Of Treatment Using ATherapeutic Combination Of α-Interferon And Free Radical Scavengers)   11/3/1998
 5908621  聚乙二醇修饰的干扰素治疗(Polyethylene Glycol Modified Interferon Therapy)   6/1/1999
 5990276  丙肝病毒NS3蛋白酶的合成抑制剂(Synthetic Inhibitors Of Hepatitis C Virus NS3 Prptease)   11/23/1999
 6172046  消除慢性丙肝感染患者中可检测HCV-RNA的联合治疗(Combination Therapy For EradicatingDetectable HCV-RNA In Patients Having Chronic Hepatitis C Infection)   1/9/2001
 6177074  聚乙二醇修饰的干扰素治疗(Polyethylene Glycol Modified Interferon Therapy)   1/23/2001
 6326137  丙肝病毒蛋白酶依赖型嵌合瘟病毒(Hepatitis C Virus Protease-Dependent Chimeric Pestivirus)   12/4/2001
 6434489  丙肝病毒NS5B聚合酶缀合物及其结晶方法(Compositions Of Hepatitis C Virus NS5B Polymerase AndMethods For Crystallizing Same)   8/13/2002
 6461605  连续低剂量细胞因子灌输治疗(Continuous Low-Dose Cytokine Infusion Therapy)   10/8/2002
 6472373  消除慢性丙肝感染患者中可检测HCV-RNA的联合治疗(Combination Therapy For EradicatingDetectable HCV-RNA In Antiviral Treatment Naive Patients Having Chronic Hepatitis C Infection)   10/29/2002
 6524570  聚乙二醇修饰的干扰素治疗(Polyethylene Glycol Modified Interferon Therapy)   2/25/2003
 WO00/37097  利巴韦林-干扰素α诱导HCV联合治疗(Ribavirin-Interferon Alfa Induction Hcv Combination Therapy)   6/29/2000
 WO00/37110  利巴韦林-PEG化干扰素α诱导HCV联合治疗(Ribavirin-Pegylated Interferon Alfa Induction HevCombination Therapy)   6/29/2000
 WO00/62799  HCV联合治疗，含有与抗氧化剂结合的利巴韦林(Hcv Combination Therapy，Containing Ribavirin InAssociation With Antioxidants)   10/26/2000
 WO01/58929  治疗丙肝的氮杂肽类(Azapeptides Useful In The Treatment Of Hepatitis C)   8/16/2001
 WO02/32414  利巴韦林-PEG化干扰素α诱导HCV联合治疗(Ribavirin-Pegylated Interferon Alfa Hcv CombinationTherapy)   4/25/2002
 WO03/24461  HCV联合治疗(Hcv Combination Therapy)   3/27/2003
 WO93/20835  用Gm-Csf治疗肝炎(Treatment Of Hepatitis With Gm-Csf)   10/28/1993
 WO96/36702  可溶性活性丙肝病毒蛋白酶(Soluble，Active Hepatitis C Virus Protease)   11/21/1996
 WO97/16204  连续低剂量细胞因子灌输治疗(Continuous Low-Dose Cytokine Infusion Therapy)   5/9/1997
 WO97/43310  丙肝病毒Ns3蛋白酶合成抑制剂(Synthetic Inhibitors Of Hepatitis C Virus Ns3 Protease)   11/20/1997
  WO98/48840   治疗感染的聚乙二醇-干扰素α缀合物(Polyethylene Glycol-Interferon Alpha Conjugates For TherapyOf Infection)   11/5/1998
  WO99/15194   消除慢性丙肝感染患者中可检测HCV-RNA的联合治疗(Combination Therapy For EradicatingDetectable Hcv-Rna In Patients Having Chronic Hepatitis C Infection)   4/1/1999
  WO99/59621   利巴韦林和干扰素α联合治疗用于初次慢性丙肝感染患者的抗病毒治疗(Combination TherapyComprising Ribavirin And Interferon Alpha In Antiviral Treatment Naive Patients Having G ChronicHepatitis C Infection)   11/25/1999
  WO02/100846   治疗或预防黄病毒感染的化合物和方法(Compounds And Methods For The Treatment Or PreventionOf Flavivirus Infections)   12/19/2002
  WO02/100851   治疗或预防黄病毒感染的化合物和方法(Compounds And Methods For The Treatment Or PreventionOf Flavivirus Infections)   12/19/2002
  5241053   含有HSV-1的糖蛋白Gd和LTB的融合蛋白(Fused Proteins Comprising Glycoprotein Gd Of HSV-1And LTB)   8/31/1993
  5556946   白细胞介素-2/病毒抗原蛋白嵌合体(hterleukin-2/Viral Antigen Protein Chimers)   9/17/1996
  6087484   通过2’-O-取代的易化寡核苷酸增强核酶催化活性(Enhancement Of Ribozyme Catalytic ActivityBy A 2′-O-Substituted Facilitator Oligonucleotide)   7/11/2000
  5830905   治疗丙肝的化合物、组合物和方法(Compounds，Compositions And Methods For Treatment OfHepatitis C)   11/3/1998
  6316492   治疗或预防病毒感染和相关疾病的方法(Methods For Treating Or Preventing Viral Infections AndAssociated Diseases)   11/13/2001
  6440985   治疗病毒感染的方法(Methods For Treating Viral Infections)   8/27/2002
  WO00/10573   治疗或预防病毒感染和相关疾病的化合物、组合物和方法(Compounds，Compositions And MethodsFor Treating Or Preventing Viral Infections And Associated Diseases)   3/2/2000
  WO00/13708   治疗或预防病毒感染和相关疾病的方法(Methods For Treating Or Preventing Viral Infections AndAssociated Diseases)   3/16/2000
  WO00/18231   治疗或预防病毒感染和相关疾病的方法(Methods For Treating Or Preventing Viral Infections AndAssociated Diseases)   4/6/2000
  WO99/51781   丙肝病毒Ns5b组合物及其使用方法(Hepatitis C Virus Ns5b Compositions And Methods Of UseThereof)   10/14/1999
  6323180   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   11/27/2001
  6143715   丙肝抑制剂肽类似物(Hepatitis C Inhibitor Peptide Analogues)   11/7/2000
  6329379   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   12/11/2001
  6329417   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   12/11/2001
  6410531   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   6/25/2002
  6420380   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   7/16/2002
  6448281   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   9/10/2002
  6479508   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   11/12/2002
  6534523   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   3/18/2003
  WO00/09543   丙肝抑制剂三肽(Hepatitis C Inhibitor Tri-Peptides)   2/24/2000
  WO00/09558   丙肝抑制剂肽(Hepatitis C Inhibitor Peptides)   2/24/2000
  WO00/59929   抗丙肝病毒的大环肽活性(Macrocyclic Peptides Active Against The Hepatitis C Virus)   10/12/2000
  WO02/04425   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   1/17/2002
  WO02/70739   HCV聚合酶抑制剂检测(Hcv Polymerase Inhibitor Assay)   9/12/2002
  WO03/07945   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   1/30/2003
  WO03/10140   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   2/6/2003
  WO03/10141   病毒聚合酶抑制剂(Viral Polymerase Inhibitors)   2/6/2003
  WO99/07734   丙肝抑制剂肽类似物(Hepatitis C Inhibitor Peptide Analogues)   2/18/1999
  WO01/16379   丙肝病毒复制抑制剂(Hepatitis C Virus Replication Inhibitors)   3/8/2001
  WO02/07761   抑制病毒病毒的制造和复制(Inhibiting Hepatitis C Virus Processing And Replication)   1/31/2002
  WO02/57287   作为依赖于RNA的RNA病毒聚合酶抑制剂的核苷衍生物(Nucleoside Derivatives As Inhibitors OfRna-Dependent Rna Viral Polymerase)   7/25/2002
  WO02/57425   作为依赖于RNA的RNA病毒聚合酶抑制剂的核苷衍生物(Nucleoside Derivatives As Inhibitors OfRna-Dependent Rna Viral Polymerase)   7/25/2002
 WO02/70651   病毒报告蛋白颗粒(Viral Reporter Particles)   9/12/2002
 WO03/20222PCT/US2003/041493   二氧戊环和氧杂硫醇烷衍生物作为依赖于RNA的RNA病毒聚合酶抑制剂(Dioxolane And OxathiolaneDerivatives As Inhibitors Of Rna-Dependent Rna Viral Polymerase)作为抗病毒剂和免疫增强剂的缩氨基硫脲(Thiosemicarbazones as Anti-Vitals andImmunopotentiators)   3/13/200301/10/2003
表3：涉及输送本发明的抗病毒化合物的吸入技术有关的美国专利和公开的国际专利申请
 公开号   标题   公布日
 5740794   分散干粉药物的装置和方法(Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments)   4/21/1998
 5775320   输送雾化药物的方法和装置(Method and device for delivering aerosolized medicaments)   7/7/1998
 5785049   分散干粉药物的方法和装置(Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments)   7/28/1998
 5814607   肺输送甲状旁腺激素活性片段(Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone)   9/29/1998
 5826633   粉末填装系统、装置和方法(Powder filling systems，apparatus and methods)   10/27/1998
 5458135   输送雾化药物的方法和装置(Method and device for delivering aerosolized medicaments)   10/17/1995
 5607915   肺输送甲状旁腺激素活性片段(Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone)   3/4/1997
 5654007   处理可分散细粉的方法和系统(Methods and system for processing dispersible fine powders)   8/5/1997
 5922354   处理可分散细粉的方法和系统(Methods and system for processing dispersible fine powders)   7/13/1999
 5928469   储存物质的方法(Process for storage of materials)   7/27/1999
 5976574   喷雾干燥疏水药物的有机溶剂悬浮液的方法(Processes for spray drying hydrophobic drugs inorganic solvent suspensions)   11/2/1999
 5985248   喷雾干燥疏水药物及其组合物的方法(Processes for spray drying solutions of hydrophobic drugs andcompositions thereof)   11/16/1999
 5994314   将核酸输送到肺部的组合物和方法(Compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung)   11/30/1999
 5997848   肺输送胰岛素的方法和组合物(Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin)   12/7/1999
 6001336   喷雾干燥疏水药物及其组合物的含水悬液的方法(Processes for spray drying aqueous suspensions ofhydrophobic drugs and compositions thereof)   12/14/1999
 6019968   可分散性抗体组合物及其制备和使用方法(Dispersible antibody compositions and methods for theirpreparation and use)   2/1/2000
 6051256   可分散性大分子组合物以及它们的制备和使用方法(Dispersible maeromolecule compositions andmethods for their preparation and use)   4/18/2000
 6071428   稳定的组合物(Stable compositions)   6/6/2000
 6077543   喷雾干燥含有亲水赋形剂的疏水药物的系统和方法(Systems and processes for spray dryinghydrophobic drugs with hydrophilic extipients)   6/20/2000
 6080721   肺输送甲状旁腺激素活性片段(Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone)   6/27/2000
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  WO 96/32116   输送核酸到肺部的组合物和方法(compositions and methods for nucleic acid delivery to the lung)   10/17/1996
  WO 96/32149   雾化药物的肺输送(pulmonary delivery of aerosolized medicaments)   10/17/1996
  WO 96/32152   干粉α1-抗胰蛋白酶的肺输送(pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin)   10/17/1996
  WO 96/40068   处理可分散细粉的方法和系统(methods and system for processing dispersible fine powders)   12/19/1996
  WO 97/41031   粉末填装系统、装置和方法(powder filling systems，apparatus and methods)   11/6/1997
  WO 97/41833   可分散的大分子组合物及其制备和使用方法(dispersible macromolecule compositions and methodsfor their preparation and use)   11/13/1997
  WO 98/16205   稳定的玻璃态粉末制剂(stable glassy state powder formulations)   4/23/1998
  WO 98/29096   雾化的疏水药物(aerosolized hydrophobic drug)   7/9/1998
  WO 98/29098   喷雾干燥含有亲水赋形剂的疏水药物的含水悬液的方法以及用这种方法制造的组合物(processesfor spray drying aqueous suspensions of hydrophobic drugs with hydrophilic excipients andcompositions prepared by such processes)   7/9/1998
  WO 98/29140   喷雾干燥含有亲水赋形剂的疏水药物的有机溶剂悬液的方法和组合物(processes and compositionsfor spray drying hydrophobic drugs in organic solvent suspensions of hydrophilic excipients)   7/9/1998
  WO 98/29141   喷雾干燥含有亲水赋形剂的疏水药物溶液方法以及用这种方法制造的组合物(processes for spray   7/9/1998
drying solutions of hydrophobic drugs with hydrophilic excipients and compositions prepared by suchprocesses)
  WO 99/19215 粉末填装装置和方法(powder filling apparatus and method)   4/22/1999
  WO 99/42124 环孢菌素的液晶形式(liquid crystal forms of cyclosporin)   8/26/1999
  WO 99/47196 雾化的活性剂的输送(aerosolized active agent delivery)   9/23/1999
  WO 99/62495 干粉分散装置及其用法(dry powder dispersing apparatus and methods for their use)   12/9/1999
  WO 00/21594 流阻调节的雾化的活性剂的输送(flow resistance modulated aerosolized active agent delivery)   4/20/2000
  WO OO/61178 肺输送治疗不育的干粉制剂(pulmonary administration of dry powder formulations for treatinginfertility)   10/19/2000
  WO 00/72904 计量分散雾化药物的装置和方法(apparatus and method for dispensing metered amount of aerosolizedmedication)   12/7/2000
  WO 01/00263 雾化药物制剂的系统和方法(systems and methods for aerosolizing pharmaceutical formulations)   1/4/2001
  WO 01/00312 制造干粉的喷雾干燥方法(spray drying process for preparing dry powders)   1/4/2001
  WO 01/32144 具有改进的分散性的干粉组合物(dry powder compositions having improved dispersivity)   5/10/2001
  WO 01/43529 易于取出粉末的容器(receptacles to facilitate the extraction of powders)   6/21/2001
  WO 01/43530 从容器中取出粉末的系统和方法(systems and methods for extracting powders from receptacles)   6/21/2001
  WO 01/43802 处理包装粉末的系统和方法(systems and methods for treating packaged powders)   6/21/2001
  WO 01/44764 非破坏性质量感知系统和方法(systems and methods for non-destructive mass sensing)   6/21/2001
  WO 01/87393 打开装有待液化粉末的系统、装置和方法(systems，devices and methods for opening receptacleshaving a powder to be fluidized)   11/22/2001
  WO 01/93932 气溶胶药物输递装置的锁定机制(lockout mechanism for aerosol drug delivery devices)   12/13/2001
  WO 02/09669 制造具有窄粒度分布的颗粒的装置和方法以及由此制造的颗粒(apparatus and process to produceparticles having a narrow size distribution and particles made thereby)   2/7/2002
  WO 02/11695 具有最小凝聚的可吸入的喷雾干燥的4-螺旋包扎的蛋白质粉末(inhaleable spray dried 4-helixbundle protein powders having minimized aggregation)   2/14/2002
  WO 02/49619 制造含有亲水活性剂的微粒的诱导相变法(induced phase transition method for the production ofmicroparticles containing hydrophilic active agents)   6/27/2002
  WO 02/49620 制造含有疏水活性剂的微粒的诱导相变法(induced phase transition method for the production ofmicroparticles containing hydrophobic active agents)   6/27/2002
  WO 02/54868 肺输送多烯抗真菌剂(pulmonary delivery of polyene antifungal agents)   7/18/2002
  WO 02/87542 输送大分子至或经过呼吸道的新方法和组合物(novel methods and compositions for deliveringmacromolecules to or via the respiratory tract)   11/7/2002
  WO 02/100548 处理粘性粉末的离心式旋转鼓(centrifuged rotating drum for treating cohesive powders)   12/19/2002
  WO 03/00326 粉末雾化装置和方法(powder aerosolization apparatus and method)   1/3/2003
  WO 03/00329 气溶胶药物输送装置的流速调节器和方法(flow regulator for aerosol drug delivery device andmethods)   1/3/2003
表4：SARSV核酸扩增的正向和反向引物
成对数 正向引物SEQIDNO 正向引物起点 正向引物终点 正向引物Tm 正向引物％GC 反向引物SEQIDNO 反向引物起点 反向引物终点 反向引物Tm 反向引物％GC 引物TmDiff 产物长度 产物Tm 产物％GC 退火评分 最佳退火温度
  1   1021   12726   12746   51.3   47.6   3521   12996   12977   50.2   40   1   271   75   42.8   26   52.6
  2   1022   12236   12256   51.2   42.9   3522   12993   12975   51.4   47.4   0.2   758   76.4   42.5   26   54
  3   1023   12373   12391   50.8   47.4   3523   12993   12975   51.4   47.4   0.6   621   76.4   43   26   53.8
  4   1024   12236   12256   51.2   42.9   3524   12996   12977   50.2   40   0.9   761   76.4   42.3   26   53.6
Figure A20048001629003121
Figure A20048001629003131
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表5：引物
  正向引物SEQ ID NO和共同纵坐标   反向引物SEQ ID NO和共同纵坐标   TM(正向和反向)(℃)   产物长度(bp)
  6076   1-19   6171   199-183   50.1   50.3   199
  6077   149-169   6172   334-315   51.5   52.4   186
  6078   292-310   6173   560-541   50.8   51.1   269
  6079   598-619   6174   749-731   52.6   50.6   152
  6080   721-742   6175   930-912   50.4   50.3   210
  6081   888-912   6176   1077-1058   52.8   51.2   190
  6082   984-1003   6177   1149-1131   51.1   51.1   166
  6083   1157-1175   6178   1479-1460   50.9   51.6   323
  6084   1420-1441   6179   1700-1680   51.2   50.7   281
  6085   1685-1707   6180   1834-1811   53.8   53.7   150
  6086   1740-1764   6181   1987-1963   53.4   52.2   248
  6087   2007-2025   6182   2251-2232   50.3   50.1   245
  6088   2226-2245   6183   2385-2366   50.4   50.1   160
  6089   2428-2446   6184   2749-2728   50.1   50.3   322
  6090   2742-2763   6185   2893-2875   50.6   51.4   152
  6091   2823-2844   6186   3082-3058   50.4   52.3   260
  6092   3007-3031   6187   3185-3164   51.9   51.0   179
  6093   3234-3254   6188   3497-3478   51.1   51.3   264
  6094   3453-3476   6189   3647-3627   51.8   52.1   195
  6095   3601-3622   6190   3877-3853   52.5   53.6   277
  6096   4007-4027   6191   4158-4135   51.1   51.4   152
  6097   4141-4165   6192   4316-4295   51.3   50.8   176
  6098   4366-4387   6193   4567-4544   54.6   55.4   202
  6099   4488-4508   6194   4708-4690   50.7   50.3   221
  6100   4658-4677   6195   4994-4974   50.5   51.2   337
  6101   4902-4922   6196   5115-5092   50.5   51.4   214
  6102   5239-5260   6197   5450-5430   50.8   50.9   212
  6103   5366-5389   6198   5560-5542   50.5   51.8   195
  6104   5593-5612   6199   5860-5836   50.8   51.6   268
  6105   6042-6062   6200   6291-6271   50.4   51.1   250
  6106   6271-6291   6201   6483-6463   51.1   50.2   213
  6107   7017-7040   6202   7171-7153   52.4   52.8   155
  6108   7253-7272   6203   7504-7486   50.3   50.3   252
  6109   7415-7434   6204   7677-7654   54.5   53.6   263
  6110   7615-7635   6205   7821-7798   51.1   52.8   207
  6111   7728-7746   6206   7936-7915   51.7   50.1   209
  6112   7845-7867   6207   7994-7970   52.7   53.4   150
  6113   8011-8029   6208   8189-8170   51.4   50.6   179
  6114   8143-8166   6209   8300-8281   52.2   50.8   158
  6115   8221-8239   6210   8388-8369   51.0   51.1   158
  6116   8553-8575   6211   8931-8915   51.8   50.3   379
  6117   8867-8886   6212   9254-9236   50.7   50.6   388
  6118   9244-9267   6213   9597-9573   51.9   53.4   354
  6119   9620-9640   6214   9990-9969   51.3   51.3   371
  6120   10009-10027   6215   10188-10171   50.2   50.2   180
  6121   10093-10113   6216   10244-10223   52.4   50.6   152
  6122   10242-10265   6217   10608-10589   51.2   51.0   367
  6123   10549-10571   6218   10783-10763   53.7   55.2   235
  6124   10766-10785   6219   10930-10912   52.0   51.1   165
  6125   11065-11085   6220   11305-11287   50.7   50.0   241
  6126   11265-11287   6221   11429-11405   54.5   53.5   165
  6127   11552-11571   6222   11730-11709   52.0   50.4   179
  6128   11705-11726   6223   11869-11848   50.1   50.2   165
  6129   11801-11824   6224   11984-11967   51.5   50.4   184
  6130   12040-12058   6225   12254-12235   52.3   51.9   215
  6131   12235-12253   6226   12406-12388   50.1   50.1   172
  6132   12366-12384   6227   12730-12712   51.7   52.2   365
  6133   12727-12748   6228   12994-12976   50.8   50.3   268
  6134   12948-12966   6229   13224-13201   50.7   51.7   277
  6135   13175-13196   6230   13324-13300   54.3   55.1   150
  6136   13237-13258   6231   13545-13526   52.9   52.9   309
  6137   13790-13810   6232   13963-13945   50.9   50.7   174
  6138   14080-14098   6233   14280-14257   51.5   51.0   201
  6139   14405-14427   6234   14561-14540   50.2   50.9   157
  6140   14882-14906   6235   15046-15024   50.9   51.5   165
  6141   14951-14976   6236   15145-15124   53.1   52.9   195
  6142   15113-15134   6237   15275-15257   51.6   50.8   163
  6143   15211-15230   6238   15383-15363   50.2   50.1   173
  6144   15364-15387   6239   15528-15506   54.0   52.1   165
  6145   15456-15477   6240   15605-15585   52.0   53.2   150
  6146   15513-15532   6241   15897-15876   51.2   50.4   385
  6147   15837-15856   6242   15999-15978   52.3   50.8   163
  6148   16073-16096   6243   16301-16277   51.7   52.8   229
  6149   16245-16266   6244   16404-16380   50.3   52.0   160
  6150   16366-16385   6245   16515-16492   52.9   53.8   150
  6151   16553-16571   6246   16777-16758   53.4   51.5   225
  6152   16832-16852   6247   17026-17004   51.0   51.6   195
  6153   16982-17001   6248   17359-17340   51.2   50.2   378
  6154   17354-17372   6249   17511-17490   51.3   50.4   158
  6155   17422-17443   6250   17573-17552   50.2   51.1   152
  6156   17603-17623   6251   17769-17748   50.7   51.5   167
  6157   17728-17746   6252   17883-17862   50.9   51.2   156
  6158   18011-18030   6253   18163-18140   52.9   51.9   153
  6159   18076-18098   6254   18225-18205   54.4   55.0   150
  6160   18270-18292   6255   18432-18413   51.9   51.4   163
  6161   18352-18373   6256   18648-18629   51.3   50.8   297
  6162   18550-18571   6257   18702-18684   50.4   51.9   153
  6163   18720-18738   6258   19004-18983   50.6   51.0   285
  6164   18960-18981   6259   19109-19085   54.7   54.3   150
  6165   19065-19089   6260   19217-19195   52.8   51.7   153
  6166   19310-19329   6261   19476-19454   50.2   52.1   167
  6167   19569-19589   6262   19719-19701   50.5   51.8   151
  6168   19707-19731   6263   19856-19833   55.7   55.9   150
  6169   19771-19792   6264   19921-19901   50.1   50.2   151
  6170   19833-19851   6265   19986-19966   50.9   50.7   154
表6：引物
 正向引物SEQ ID NO和共同纵坐标   反向引物SEQ ID NO和共同纵坐标   TM(正向和反向)(℃)   产物长度(bp)
  6266   20110-20132   6305   20425-20404   51.9   50.9   316
  6267   20468-20492   6306   20617-20596   53.2   53.5   150
  6268   20557-20578   6307   20891-20871   50.4   50.6   335
  6269   20838-20856   6308   21037-21015   52.5   52.0   200
  6270   21096-21116   6309   21295-21272   50.1   51.7   200
  6271   22173-22194   6310   22414-22395   52.4   51.0   242
  6272   22320-22342   6311   22501-22479   54.8   54.3   182
  6273   22532-22552   6312   22695-22675   50.6   50.0   164
  6274   22712-22736   6313   22873-22852   56.7   55.5   162
  6275   22842-22861   6314   23086-23067   51.0   52.8   245
  6276   23151-23170   6315   23395-23376   51.4   50.3   245
  6277   23307-23326   6316   23524-23501   51.1   51.1   218
  6278   23615-23635   6317   23776-23758   50.7   50.2   162
  6279   23838-23857   6318   23996-23977   50.4   50.6   159
  6280   24030-24051   6319   24407-24386   57.6   55.7   378
  6281   24388-24407   6320   24581-24563   50.4   50.1   194
  6282   24559-24579   6321   24938-24921   52.0   50.4   380
  6283   24922-24941   6322   25184-25166   50.1   51.2   263
  6284   25201-25220   6323   25400-25382   51.1   51.4   200
  6285   25363-25381   6324   25646-25627   51.1   50.5   284
  6286   25656-25681   6325   25839-25814   54.5   56.4   184
  6287   25761-25782   6326   25982-25961   54.6   54.3   222
  6288   26039-26058   6327   26189-26166   54.0   53.0   151
  6289   26184-26205   6328   26333-26310   50.9   51.8   150
  6290   26422-26442   6329   26660-26641   51.3   50.2   239
  6291   26571-26589   6330   26739-26715   51.7   53.2   169
  6292   26733-26752   6331   26960-26941   51.1   52.2   228
  6293   26866-26885   6332   27139-27117   50.7   51.9   274
  6294   27300-27321   6333   27458-27439   51.2   50.2   159
  6295   27361-27380   6334   27579-27558   52.4   51.1   219
  6296   27718-27740   6335   27917-27901   50.7   50.0   200
  6297   28041-28059   6336   28207-28189   50.8   50.8   167
  6298   28166-28189   6337   28411-28393   52.2   52.9   246
  6299   28395-28414   6338   28671-28653   51.5   50.2   277
  6300   28654-28672   6339   28821-28800   50.6   52.3   168
  6301   28867-28885   6340   29184-29166   51.5   51.6   318
  6302   29183-29204   6341   29360-29342   50.4   50.4   178
  6303   29262-29279   6342   29626-29606   50.1   50.2   365
  6304   29538-29559   6343   29690-29670   50.0   50.4   153
表7：引物
  名称   SEQ ID NO：   共同纵坐标   名称   SEQ ID NO：   共同纵坐标
  AB4f   6344   19869-19888   CB1r   6367   28011-28030
  AB5f   6345   20238-20257   CB2r   6368   27671-27690
  BC1f   6346   20581-20600   CB3r   6369   27301-27320
  BC2f   6347   20950-20969   CB4r   6370   26931-26950
  BC3f   6348   21339-21358   CB5r   6371   26575-26594
  BC4f   6349   21708-21727   CB6r   6372   26191-26210
  BC5f   6350   22041-22060   CB7r   6373   25841-25860
  BC6f   6351   22410-22429   CB8r   6374   25476-25495
  BC7f   6352   22759-22778   CB9r   6375   25126-25145
  BC8f   6353   23131-23150   CB10r   6376   24791-24810
  BC9f   6354   23500-23519   CB11r   6377   24422-24441
  BC10f   6355   23841-23860   CB12r   6378   24031-24050
  BC11f   6356   24210-24229   CB13r   6379   23673-23692
  BC12f   6357   24560-24579   CB14r   6380   23298-23317
  BC13f   6358   24941-24960   CB15r   6381   22928-22947
  BC14f   6359   25310-25329   CB16r   6382   22567-22586
  BC15f   6360   25675-25694   CB17r   6383   22196-22215
  BC16f   6361   26044-26063   CB18r   6384   21831-21850
  BC17f   6362   26413-26432   CB19r   6385   21431-21450
  BC18f   6363   26763-26782   CB20r   6386   21073-21092
  BC19f   6364   27132-27151   CB21r   6387   20715-20734
  BC20f   6365   27491-27510   BA1r   6388   20345-20364
  BC21f   6366   27845-27864   BA2r   6389   19969-19988
  BA3r   6390   19599-19618
  BA4r   6391   19228-19247
  BA5r   6392   18852-18871
表8：引物
  名称  SEQ ID NO   共同纵坐标   名称   SEQ ID NO   共同纵坐标
  F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30F31F32F33F34   6393639463956396639763986399540064016402640364046405640664076408640964106411641264136414641564166417641864196420642164226423642464256426   1-19292-310721-742984-10031420-14411740-17642226-22452742-27633007-30313453-34764007-40274366-43874658-46775239-52605593-56126271-62917253-72727615-76357845-78678143-81668553-85759244-926710009-1002710242-1026510766-1078511265-1128711705-1172612040-1205812366-1238412948-1296613237-1325814080-1409814882-1490615113-15134   R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12R13R14R15R16R17R18R19R20R21R22R23R24R25R26R27R28R29R30R31R32R33R34   6441644264436444644564466447644864496450645164526453645464556456645764586459646064616462646364646465646664676468646964706471647264736474   334-315749-7311077-10581479-14601834-18112251-22322749-27283082-30583497-34783877-38534316-42954708-46905115-50925560-55426291-62717171-71537677-76547936-79158189-81708388-83699254-92369990-996910244-1022310783-1076311305-1128711730-1170911984-1196712406-1238812994-1297613324-1330013963-1394514561-1454015145-1512415383-15363
  F35F36F37F38F39F40F41F42F43F44F45F46F47F48   64276428642964306431643264336434643564366437643864396440   15364-1538715513-1553216073-1609616366-1638516832-1685217354-1737217603-1762318011-1803018270-1829218550-1857118960-1898119310-1932919707-1973119833-19851   R35R36R37R38R39R40R41R42R43R44R45R46R47   6475647664776478647964806481648264836484648564866487   15605-1558515999-1597816404-1638016777-1675817359-1734017573-1755217883-1786218225-1820518648-1862919004-1898319217-1919519719-1970119921-19901
表9：引物
  名称   SEQ ID NO：
  1   CB12R   6488
  2   R0010   6489
  3   R0011   6490
  4   R0012   6491
  5   BNI-ED   6492
  6   BNI-EU   6493
  7   SAR1S-U   6494
  8   SAR1As-D   6495
  9   SAR1S   6496
  10   SAR1As   6497
  11   IN2-U   6498
  12   IN4-D   6499
  13   IN-2   6500
  14   IN-4   6501
  15   IN-6   6502
  16   IN-7   6503
  17   COR1-U   6504
  18   COR2-D   6505
  19   COR-1   6506
  20   COR-2   6507
  21   HKUF-U   6508
  22   HKUR-D   6509
  23   HKU-F   6510
  24   HKU-R   6511
  25   1451-D   6512
  26   1451-U   6513
  27   690-D   6514
  28   690-U   6515
  29   690-D2   6516
  30   690-U2   6517
  31   EMC7-D   6518
  32   EMC7-U   6519
  33   EMC7-D2   6520
  34   EMC7-U2   6521
  35   EMC8-D   6522
  36   EMC8-U   6523
  名称   SEQ ID NO：
  37   EMC8-D2   6524
  38   EMC8-U2   6525
  39   EMC11-D   6526
  40   EMC11-U   6527
  41   ORF1B-D   6528
  42   ORF1B-U   6529
  43   ORFS-D   6530
  44   ORFS-U   6531
  45   E7-717F   6532
  46   E8-85R   6533
  47   E8-307F   6534
  48   E11-771F   6535
  49   E11-96R   6536
  50   CON1-F   6537
  51   CON1-U   6538
  52   CON2-F   6539
  53   CON2-R   6540
  54   CON3-F   6541
  55   CON3-R   6542
  56   15-F   6543
  57   15-R   6544
  58   15-F2   6545
  59   15-R2   6546
  60   13-F   6547
  61   13-R   6548
  62   13-F2   6549
  63   13-R2   6550
  64   CONTIG-F   6551
  65   QT3-R   6552
  66   QT3-F   6553
  67   QIN-R   6554
  68   QIN-F   6555
  69   AB1-F   6556
  70   AB2-F   6557
  71   AB3-F   6558
  72   AB1-R   6559
表10：SARS病毒预测蛋白质和开放读框的特征
  SARS ORF(SEQ ID NO)   长度(aa)   作用   切割位点   特征   Consd*
ORF1a   P28(9766)   179   前导区蛋白   179(G/G)#   +
  P65(9767)   639   MHV p65切割产物同系物   818(G/A)   +
  Nsp1(9768)   2422##   木瓜蛋白酶样蛋白酶，切割前两个蛋白质   3240(Q/S)   硫酸酯酶结构域，锌结合域   +
  Nsp2(9769)   306   3C样蛋白酶，切割蛋白nsp1-nsp12   3546(Q/G)   +
  Nsp3(9770)   290   ？   3836(Q/S)   5 TMDs   +
  Nsp4(9771)   83   ？   3919(Q/A)   1 TMD   +
  Nsp5(9772)   198   ？   4117(Q/N)   +
  Nsp6(9773)   113   ？   4230(Q/A)   +
  Nsp7(9774)   139   ？   4369(Q/S)   假想的生长因子样基序   +
ORF1b   Nsp9(9775)   932   RNA聚合酶   5298(Q/A)   +
  Nsp10(9776)   601   假设的解螺旋酶Tanner等，(2003)J Biol Chem 278：39578-82   5899(Q/A)   金属结合域，ATP/GTP结合域   +
  Nsp11(9777)   527   ？   6426(Q/S)   +
  Nsp12(9778)   346   ？   6772(Q/A)   +
  Nsp13(9779)   298   ？   -   +
结构区   刺突(S)(6042)   主要抗原决定簇，含有受体结合域   前导区肽，1 TMD，17 N-糖基化位点   +
  Orf3(6043)   274   ？   2 TMD，1 N-糖基化位点，10 O-糖基化位点   -
  Orf4(6044)   154   ？   -
  包膜(E)(6045)   76   与病毒包膜有关   1 TMD，2 N-糖基化位点   +
  基质(M)(6046)   221   与病毒包膜有关，跨膜蛋白   3 TMD，1 N-糖基化位点   +
  Orf7(6047)   63   ？   1 TMD   -
  Orf8(6048)   122   ？   1 TMD   -
  Orf9(6049)   44   ？   表面关联   -
  Orf10   39   ？   表面关联   -
  Orf11(6050)   84   ？   1 N-糖基化位点   -
  核衣壳(N)(6052)   422   与病毒基因组RNA关联   磷蛋白   +
  Orf13   98   ？   1 O-糖基化位点   -
TMD：预测的跨膜结构域。
Consd*：+表示在至少一种其它冠状病毒中存在相应的蛋白
#：或者在Gly-Gly之后(即在G/A)切割得到一180mer产物
##：该2422mer产物还可在残基1922(SEQ ID NO：6039的Gly-2740)之后被切割得到一包含Zn结合基序
(SEQ ID NO：7254)的1922mer产物Plpro以及一500mer产物。
表11：SARS和其它冠状病毒之间的蛋白质同源性
数字表示SARS蛋白和其它冠状病毒相应基因产物之间氨基酸相同性的比例。更加保守的对用黑体表示；
更加可变的对用下划线表示。
               组1           组2   组3
  蛋白质   229E   TGV   PEDV   MHV   BCoV   AIBV
  复制酶区域
  前导区蛋白p28p65同系物nsp1(PLP蛋白酶)nsp2(3CL蛋白酶)nsp3nsp4nsp5nsp6nsp7   ＜20＜2025.540.43038.648.245.153.8   ＜202325.843.82742.242.938.954.5   ＜202325.444.629.439.843.945.156.1   27＜20295034.247.546.845.156.2   ＜20203048.435.546.147.346.955.4   ＜20＜20254128.537.338.739.858.3
  nsp9(聚合酶)nsp10(解螺旋酶)nsp11nsp12nsp13   59.860.752.343.156.4   59.66253.74354.4   6062.352.345.455.3   67.367.257.645.963   66.968.657.64565   62.458.9 52 40.2 53.4
  结构区
  刺突(S)包膜(E)基质糖蛋白(M)核衣壳(N)   28.833*30.6 26.9   31.6*27.932.530.1   30.32034.829.5   31.12340.837.3   3126.541.937.4   32.7*23.232.531.5
*这三个对比仅在全蛋白的一个片段上获得。
表12：五种SARS分离物核苷酸和氨基酸的差别
  FRA*   TOR2*   Urbani*   CUHK*   HKU*
  位置°   碱基/氨基酸   碱基/氨基酸   碱基/氨基酸   碱基/氨基酸   碱基/氨基酸
ORF1a   2557   A/Thr   G/Ala   G/Ala   G/Ala   G/Ala
  2601   T/Val   C
  7746   G/Pro   T
  7919   C/Ala   T/Val
  7930   G/Asp   A/Asn
  8387   G/Ser   C/Thr
  8416   G/Arg   C/Thr
  9404   T/Val   C/Ala
  9479   T/Val   C/Ala
  11448   T/Ile   C   C   C   C
ORF1b   13494   GT/Val   AG/Ser
  16622   C/Ala   T
  17564   T/Asp   C/Glu
  17846   C/Arg   T
  18065   G/Lys   A
  18965   A/Ile   T   T   T   T
  19064   A/Glu   G   G
  19084   T/Ile   C/Thr   C/Thr   C/Thr   C/Thr
  刺突   21721   G/Gly   A/Asp
  22222   T/Ile   C/Thr
  23220   T/Ser   G/Ala
  24872   T/Leu   C
  24933   T/Phe   C/Leu   C/Leu   C/Leu   C/Leu
ORF3   25298   G/Gly   A/Arg
  25569   T/Met   A/Lys
基质   26600   T/Val   C/Ala   C/Ala   C/Ala
  26857   T/Ser   C/Pro
  ORF10   27827   T/Cys   C/Arg
  核衣壳   28268   T/Ile   C/Thr   C/Thr   C/Thr   C/Thr
*SARS冠状病毒FRA(登录号AY310120)
*SARS冠状病毒TOR2(登录号AY274119)
*SARS冠状病毒Urbani(登录号AY278741)
*SARS冠状病毒CUHK-W1(登录号AY278554)
*SARS冠状病毒HKU-39849(登录号AY278491)
°该位置基于FRA序列。
表13-25：SEQ ID NOS：6039-6050和6052的T表位预测
表位预测在http：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html进行，使用最小记分0.5和BIMAS基质，选择20个结果中最大的一个。该分析揭示了9mer和10mer的表位。
表13：SEQ ID NO：6039的表位
  HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1867   SEQ ID NO：7400   8％   450
  2   4139   SEQ ID NO：7401   5.55％   312.5
  3   88   SEQ ID NO：7402   4％   225
  4   4249   SEQ ID NO：7403   3.55％   200
  5   4059   SEQ ID NO：7404   2.22％   125
  6   2027   SEQ ID NO：7405   1.6％   90
  7   3413   SEQ ID NO：7406   1.11％   62.5
  8   1823   SEQ ID NO：7407   0.88％   50
  9   2798   SEQ ID NO：7408   0.88％   50
  10   220   SEQ ID NO：7409   0.8％   45
  11   3738   SEQ ID NO：7410   0.8％   45
  12   4182   SEQ ID NO：7411   0.8％   45
  13   4174   SEQ ID NO：7412   0.66％   37.5
  14   1940   SEQ ID NO：7413   0.55％   31.25
  15   38   SEQ ID NO：7414   0.48％   27
  16   1231   SEQ ID NO：7415   0.44％   25
  17   1613   SEQ ID NO：7416   0.44％   25
  18   3645   SEQ ID NO：7417   0.44％   25
  19   4192   SEQ ID NO：7418   0.44％   25
  20   378   SEQ ID NO：7419   0.4％   22.5
  HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1867   SEQ ID NO：7420   8％   450
  2   1495   SEQ ID NO：7421   4％   225
  3   3921   SEQ ID NO：7422   2.4％   135
  4   486   SEQ ID NO：7423   2.22％   125
  5   4139   SEQ ID NO：7424   2.22％   125
  6   62   SEQ ID NO：7425   1.6％   90
  7   1190   SEQ ID NO：7426   1.6％   90
  8   1284   SEQ ID NO：7427   1.6％   90
  9   3284   SEQ ID NO：7428   1.6％   90
  10   2921   SEQ ID NO：7429   1.2％   67.5
  11   349   SEQ ID NO：7430   0.8％   45
  12   789   SEQ ID NO：7431   0.8％   45
  13   1185   SEQ ID NO：7432   0.8％   45
  14   4184   SEQ ID NO：7433   0.8％   45
  15   1313   SEQ ID NO：7434   0.64％   36
  16   3948   SEQ ID NO：7435   0.48％   27
  17   149   SEQ ID NO：7436   0.44％   25
  18   941   SEQ ID NO：7437   0.44％   25
  19   1390   SEQ ID NO：7438   0.44％   25
  20   1613   SEQ ID NO：7439   0.44％   25
                                         HLA A3-9 mers
  用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1010   SEQ ID NO：7440   1.48％   180
  2   3155   SEQ ID NO：7441   1.48％   180
  3   1229   SEQ ID NO：7442   1.23％   150
  4   2405   SEQ ID NO：7443   0.88％   108
  5   2   SEQ ID NO：7444   0.74％   90
  6   2304   SEQ ID NO：7445   0.74％   90
  7   2358   SEQ ID NO：7446   0.74％   90
  8   3160   SEQ ID NO：7447   0.74％   90
  9   3771   SEQ ID NO：7448   0.74％   90
  10   4007   SEQ ID NO：7449   0.74％   90
  11   3079   SEQ ID NO：7450   0.66％   81
  12   4045   SEQ ID NO：7451   0.66％   81
  13   1081   SEQ ID NO：7452   0.49％   60
  14   3268   SEQ ID NO：7453   0.49％   60
  15   4144   SEQ ID NO：7454   0.49％   60
  16   614   SEQ ID NO：7455   0.37％   45
  17   728   SEQ ID NO：7456   0.37％   45
  18   1537   SEQ ID NO：7457   0.37％   45
  19   313   SEQ ID NO：7458   0.32％   40
  20   1744   SEQ ID NO：7459   0.32％   40
                                        HLA A3-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   62   SEQ ID NO：7460   4.44％   540
  2   2151   SEQ ID NO：7461   2.46％   300
  3   633   SEQ ID NO：7462   2.22％   270
  4   1158   SEQ ID NO：7463   2.22％   270
  5   2565   SEQ ID NO：7464   2.22％   270
  6   2298   SEQ ID NO：7465   1.77％   216
  7   3159   SEQ ID NO：7466   1.11％   135
  8   640   SEQ ID NO：7467   0.98％   120
  9   2186   SEQ ID NO：7468   0.74％   90
  10   3869   SEQ ID NO：7469   0.74％   90
  11   2308   SEQ ID NO：7470   0.66％   81
  12   786   SEQ ID NO：7471   0.55％   67.5
  13   749   SEQ ID NO：7472   0.49％   60
  14   1080   SEQ ID NO：7473   0.49％   60
  15   2358   SEQ ID NO：7474   0.49％   60
  16   3955   SEQ ID NO：7475   0.49％   60
  17   714   SEQ ID NO：7476   0.37％   45
  18   1081   SEQ ID NO：7477   0.37％   45
  19   1170   SEQ ID NO：7478   0.37％   45
  20   1228   SEQ ID N0：7479   0.37％   45
                                               HLA A24-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   3797   SEQ ID NO：7480   37.57％   600
  2   4202   SEQ ID NO：7481   37.57％   600
  3   3189   SEQ ID NO：7482   25.05％   400
  4   1864   SEQ ID NO：7483   23.14％   369.6
  5   1066   SEQ ID NO：7484   22.54％   360
  6   2143   SEQ ID NO：7485   22.54％   360
  7   2693   SEQ ID NO：7486   22.54％   360
  8   1426   SEQ ID NO：7487   18.78％   300
  9   1238   SEQ ID NO：7488   18.03％   288
  10   3768   SEQ ID NO：7489   18.03％   288
  11   797   SEQ ID NO：7490   15.03％   240
  12   1882   SEQ ID NO：7491   15.03％   240
  13   1490   SEQ ID NO：7492   13.77％   220
  14   2237   SEQ ID NO：7493   13.77％   220
  15   95   SEQ ID NO：7494   12.52％   200
  16   1821   SEQ ID NO：7495   12.52％   200
  17   2289   SEQ ID NO：7496   12.52％   200
  18   3080   SEQ ID NO：7497   12.52％   200
  19   3660   SEQ ID NO：7498   12.52％   200
  20   4354   SEQ ID NO：7499   12.52％   200
  HLA A24-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2143   SEQ ID NO：7500   37.87％   604.8
  2   1159   SEQ ID NO：7501   26.30％   420
  3   1650   SEQ ID NO：7502   26.30％   420
  4   1150   SEQ ID NO：7503   18.78％   300
  5   2763   SEQ ID NO：7504   18.78％   300
  6   3165   SEQ ID NO：7505   18.78％   300
  7   3201   SEQ ID NO：7506   15.03％   240
  8   3694   SEQ ID NO：7507   15.03％   240
  9   4204   SEQ ID NO：7508   15.03％   240
  10   1692   SEQ ID NO：7509   13.77％   220
  11   797   SEQ ID NO：7510   12.52％   200
  12   1610   SEQ ID NO：7511   12.52％   200
  13   1789   SEQ ID NO：7512   12.52％   200
  14   1881   SEQ ID NO：7513   12.52％   200
  15   3090   SEQ ID NO：7514   12.52％   200
  16   3763   SEQ ID NO：7515   12.52％   200
  17   2569   SEQ ID NO：7516   11.27％   180
  18   194   SEQ ID NO：7517   9.39％   150
  19   1771   SEQ ID NO：7518   9.39％   150
  20   2488   SEQ ID NO：7519   9.39％   150
                                                HLA A 0201-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2308   SEQ ID NO：7520   0.20％   8144.13515256
  2   3729   SEQ ID NO：7521   0.10％   4047.23088
  3   3574   SEQ ID NO：7522   0.09％   3547.4996634
  4   3615   SEQ ID NO：7523   0.06％   2722.682592
  5   3159   SEQ ID NO：7524   0.05％   1999.734264
  6   2339   SEQ ID NO：7525   0.03％   1551.92907744
  7   2201   SEQ ID NO：7526   0.03％   1521.53694
  8   3559   SEQ ID NO：7527   0.02％   1174.38939504
  9   3085   SEQ ID NO：7528   0.02％   1146.296448
  10   4070   SEQ ID NO：7529   0.02％   970.4103696
  11   3708   SEQ ID NO：7530   0.02％   958.92888
  12   3098   SEQ ID NO：7531   0.02％   942.678
  13   1362   SEQ ID NO：7532   0.02％   900.6984
  14   3563   SEQ ID NO：7533   0.01％   735.86016
  15   3774   SEQ ID NO：7534   0.01％   687.655656
  16   4242   SEQ ID NO：7535   0.01％   685.78272
  17   2340   SEQ ID NO：7536   0.01％   668.37342936
  18   650   SEQ ID NO：7537   0.01％   640.1983392
  19   3862   SEQ ID NO：7538   0.01％   620.57772
  20   2860   SEQ ID NO：7539   0.01％   607.88448
                                             HLA A 0201-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2307   SEQ ID NO：7540   0.40％   15915.66281448
  2   2201   SEQ ID NO：7541   0.12％   4772.09313
  3   3558   SEQ ID NO：7542   0.05％   2295.04855632
  4   1772   SEQ ID NO：7543   0.04％   1759.6656
  5   3087   SEQ ID NO：7544   0.03％   1215.76896
  6   2339   SEQ ID NO：7545   0.02％   1116.29986272
  7   2308   SEQ ID NO：7546   0.02％   970.14776112
  8   3061   SEQ ID NO：7547   0.02％   836.2525104
  9   2748   SEQ ID NO：7548   0.01％   726.706344
  10   3837   SEQ ID NO：7549   0.01％   720.8292
11 59 SEQ ID NO：7550 0.01％ 650.3112
  12   2877   SEQ ID NO：7551   0.01％   620.22996
13 4114 SEQ ID NO：7552 0.01％ 559.8936
  14   805   SEQ ID NO：7553   0.01％   484.4565072
  15   1655   SEQ ID NO：7554   0.01％   437.48208
  16   611   SEQ ID NO：7555   0.00％   319.9392
  17   1961   SEQ ID NO：7556   0.00％   305.94186
  18   1223   SEQ ID NO：7557   0.00％   289.08792
  19   852   SEQ ID NO：7558   0.00％   285.67242
  20   2139   SEQ ID NO：7559   0.00％   284.845869
                                               HLA A 1101-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4200   SEQ ID NO：7560   50％   18
  2   281   SEQ ID NO：7561   25％   9
  3   3236   SEQ ID NO：7562   25％   9
  4   509   SEQ ID NO：7563   16.66％   6
  5   848   SEQ ID NO：7564   16.66％   6
  6   2193   SEQ ID NO：7565   16.66％   6
  7   3542   SEQ ID NO：7566   16.66％   6
  8   541   SEQ ID NO：7567   15％   5.4
  9   1748   SEQ ID NO：7568   12.5％   4.5
  10   829   SEQ ID NO：7569   11.11％   4
  11   1149   SEQ ID NO：7570   11.11％   4
  12   2027   SEQ ID NO：7571   11.11％   4
  13   2576   SEQ ID NO：7572   11.11％   4
  14   873   SEQ ID NO：7573   8.33％   3
  15   2725   SEQ ID NO：7574   8.33％   3
  16   3541   SEQ ID NO：7575   8.33％   3
  17   1837   SEQ ID NO：7576   7.5％   2.7
  18   2475   SEQ ID NO：7577   7.5％   2.7
  19   2703   SEQ ID NO：7578   7.5％   2.7
  20   1823   SEQ ID NO：7579   6.66％   2.4
                                              HLA A 1101-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   3541   SEQ ID NO：7580   50％   18
  2   281   SEQ ID NO：7581   25％   9
  3   1495   SEQ ID NO：7582   25％   9
  4   2303   SEQ ID NO：7583   25％   9
  5   2616   SEQ ID NO：7584   25％   9
  6   48   SEQ ID NO：7585   16.66％   6
  7   1394   SEQ ID NO：7586   16.66％   6
  8   1499   SEQ ID NO：7587   16.66％   6
  9   1862   SEQ ID NO：7588   16.66％   6
  10   1163   SEQ ID NO：7589   11.11％   4
  11   4006   SEQ ID NO：7590   11.11％   4
  12   4344   SEQ ID NO：7591   11.11％   4
  13   633   SEQ ID NO：7592   10％   3.6
  14   119   SEQ ID NO：7593   8.33％   3
  15   1190   SEQ ID NO：7594   8.33％   3
  16   1195   SEQ ID NO：7595   8.33％   3
  17   1725   SEQ ID NO：7596   8.33％   3
  18   2728   SEQ ID NO：7597   8.33％   3
  19   2895   SEQ ID NO：7598   8.33％   3
  20   3033   SEQ ID NO：7599   8.33％   3
                                           HLA B7-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1335   SEQ ID NO：7600   4.44％   240
  2   2580   SEQ ID NO：7601   4.44％   240
  3   1703   SEQ ID NO：7602   3.70％   200
  4   113   SEQ ID NO：7603   2.22％   120
  5   168   SEQ ID NO：7604   2.22％   120
  6   2842   SEQ ID NO：7605   2.22％   120
  7   4027   SEQ ID NO：7606   2.22％   120
  8   3680   SEQ ID NO：7607   1.66％   90
  9   2085   SEQ ID NO：7608   1.48％   80
  10   2492   SEQ ID NO：7609   1.48％   80
  11   2660   SEQ ID NO：7610   1.48％   80
  12   2906   SEQ ID NO：7611   1.48％   80
  13   3346   SEQ ID NO：7612   1.48％   80
  14   4038   SEQ ID NO：7613   1.48％   80
  15   1163   SEQ ID NO：7614   1.11％   60
  16   1457   SEQ ID NO：7615   1.11％   60
  17   2351   SEQ ID NO：7616   1.11％   60
  18   2471   SEQ ID NO：7617   1.11％   60
  19   3499   SEQ ID NO：7618   1.11％   60
  20   3635   SEQ ID NO：7619   1.11％   60
                                              HLA B7-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1703   SEQ ID NO：7620   3.70％   200
  2   17   SEQ ID NO：7621   2.22％   120
  3   3008   SEQ ID NO：7622   2.22％   120
  4   4106   SEQ ID NO：7623   2.22％   120
  5   3450   SEQ ID NO：7624   1.66％   90
  6   113   SEQ ID NO：7625   1.48％   80
  7   195   SEQ ID NO：7626   1.48％   80
  8   307   SEQ ID NO：7627   1.48％   80
  9   780   SEQ ID NO：7628   1.48％   80
  10   1000   SEQ ID NO：7629   1.48％   80
  11   1072   SEQ ID NO：7630   1.48％   80
  12   1404   SEQ ID NO：7631   1.48％   80
  13   1980   SEQ ID NO：7632   1.48％   80
  14   2262   SEQ ID NO：7633   1.48％   80
  15   2543   SEQ ID NO：7634   1.48％   80
  16   2906   SEQ ID NO：7635   1.48％   80
  17   3077   SEQ ID NO：7636   1.48％   80
  18   3175   SEQ ID NO：7637   1.48％   80
  19   4195   SEQ ID NO：7638   1.48％   80
  20   4251   SEQ ID NO：7639   1.48％   80
表14：SEQ ID NO：6040的表位
                                             HLA A1-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   20   SEQ ID NO：7640   0.04％   2.25
  2   91   SEQ ID NO：7641   0.01％   1
  3   125   SEQ ID NO：7642   0.01％   0.75
  4   56   SEQ ID NO：7643   0.00％   0.5
  5   145   SEQ ID NO：7644   0.00％   0.5
                                               HLA A1-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   20   SEQ ID NO：7645   0.01％   0.9
  2   56   SEQ ID NO：7646   0.00％   0.5
  3   71   SEQ ID NO：7647   0.00％   0.5
  4   144   SEQ ID NO：7648   0.00％   0.5
                                              HLA A3-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   115   SEQ ID NO：7649   0.24％   30
  2   87   SEQ ID NO：7650   0.04％   6
  3   80   SEQ ID NO：7651   0.03％   4.05
  4   125   SEQ ID NO：7652   0.01％   1.8
  5   39   SEQ ID NO：7653   0.01％   1.5
  6   56   SEQ ID NO：7654   0.01％   1.5
  7   135   SEQ ID NO：7655   0.00％   1.2
  8   91   SEQ ID NO：7656   0.00％   1
9 119 SEQ ID NO：7657   0.00％   1
  10   141   SEQ ID NO：7658   0.00％   0.9
  11   150   SEQ ID NO：7659   0.00％   0.6
  12   137   SEQ ID NO：7660   0.00％   0.54
                                               HLA A3-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   36   SEQ ID NO：7661   0.24％   30
  2   144   SEQ ID NO：7662   0.06％   8
  3   101   SEQ ID NO：7663   0.03％   4
  4   99   SEQ ID NO：7664   0.02％   3.6
  5   80   SEQ ID NO：7665   0.02％   2.7
  6   125   SEQ ID NO：7666   0.01％   1.6875
  7   71   SEQ ID NO：7667   0.01％   1.5
  8   118   SEQ ID NO：7668   0.01％   1.5
  9   40   SEQ ID NO：7669   0.01％   1.35
  10   5   SEQ ID NO：7670   0.00％   0.9
  11   56   SEQ ID NO：7671   0.00％   0.9
  12   107   SEQ ID NO：7672   0.00％   0.6
  13   135   SEQ ID NO：7673   0.00％   0.6
  14   141   SEQ ID NO：7674   0.00％   0.6
  15   148   SEQ ID NO：7675   0.00％   0.6
  16   116   SEQ ID NO：7676   0.00％   0.5
                                                HLA A24-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   153   SEQ ID NO：7677   1.05％   16.8
  2   80   SEQ ID NO：7678   0.75％   12
  3   123   SEQ ID NO：7679   0.50％   8
  4   137   SEQ ID NO：7680   0.50％   8
  5   9   SEQ ID NO：7681   0.45％   7.2
  6   77   SEQ ID NO：7682   0.45％   7.2
  7   112   SEQ ID NO：7683   0.45％   7.2
  8   73   SEQ ID NO：7684   0.41％   6.6
  9   32   SEQ ID NO：7685   0.37％   6
  10   110   SEQ ID NO：7686   0.37％   6
  11   140   SEQ ID NO：7687   0.37％   6
  12   143   SEQ ID NO：7688   0.37％   6
  13   18   SEQ ID NO：7689   0.30％   4.8
  14   54   SEQ ID NO：7690   0.30％   4.8
  15   108   SEQ ID NO：7691   0.30％   4.8
  16   141   SEQ ID NO：7692   0.30％   4.8
  17   92   SEQ ID NO：7693   0.27％   4.4
  18   33   SEQ ID NO：7694   0.25％   4
  19   49   SEQ ID NO：7695   0.25％   4
  20   111   SEQ ID NO：7696   0.25％   4
                                           HLA A24-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   142   SEQ ID NO：7697   12.52％   200
  2   110   SEQ ID NO：7698   0.75％   12
  3   99   SEQ ID NO：7699   0.50％   8
  4   8   SEQ ID NO：7700   0.45％   7.2
  5   140   SEQ ID NO：7701   0.45％   7.2
  6   32   SEQ ID NO：7702   0.37％   6
  7   17   SEQ ID NO：7703   0.30％   4.8
  8   53   SEQ ID NO：7704   0.30％   4.8
  9   76   SEQ ID NO：7705   0.30％   4.8
  10   107   SEQ ID NO：7706   0.30％   4.8
  11   111   SEQ ID NO：7707   0.30％   4.8
  12   72   SEQ ID NO：7708   0.27％   4.4
  13   91   SEQ ID NO：7709   0.27％   4.4
  14   31   SEQ ID NO：7710   0.25％   4
  15   127   SEQ ID NO：7711   0.25％   4
  16   139   SEQ ID NO：7712   0.25％   4
  17   80   SEQ ID NO：7713   0.22％   3.6
  18   38   SEQ ID NO：7714   0.18％   3
  19   118   SEQ ID NO：7715   0.18％   3
  20   49   SEQ ID NO：7716   0.12％   2
                                                     HLA A 0201-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   80   SEQ ID NO：7717   0.00％   171.96732
  2   147   SEQ ID NO：7718   0.00％   51.46848
  3   143   SEQ ID NO：7719   0.00％   11.6146182
  4   56   SEQ ID NO：7720   0.00％   11.304684
  5   10   SEQ ID NO：7721   0.00％   10.34586
  6   6   SEQ ID NO：7722   0.00％   6.56830734
  7   26   SEQ ID NO：7723   0.00％   6.07614
  8   141   SEQ ID NO：7724   0.00％   5.981472
  9   148   SEQ ID NO：7725   0.00％   5.194044
  10   9   SEQ ID NO：7726   0.00％   4.299183
  11   137   SEQ ID NO：7727   0.00％   4.299183
  12   130   SEQ ID NO：7728   0.00％   4.138344
  13   84   SEQ ID NO：7729   0.00％   3.42792
  14   27   SEQ ID NO：7730   0.00％   3.383484
  15   2   SEQ ID NO：7731   0.00％   3.381
  16   62   SEQ ID NO：7732   0.00％   3.251556
  17   23   SEQ ID NO：7733   0.00％   2.9542005
  18   99   SEQ ID NO：7734   0.00％   1982232
  19   33   SEQ ID NO：7735   0.00％   1.86921
  20   111   SEQ ID NO：7736   0.00％   1.76402985
  HLA A 0201-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   5   SEQ ID NO：7737   0.00％   159.9696
  2   25   SEQ ID NO：7738   0.00％   69.552
  3   80   SEQ ID NO：7739   0.00％   36.5148
  4   107   SEQ ID NO：7740   0.00％   21.3624
  5   148   SEQ ID NO：7741   0.00％   17.73576
  6   61   SEQ ID NO：7742   0.00％   13.9104
  7   147   SEQ ID NO：7743   0.00％   11.304684
  8   53   SEQ ID NO：7744   0.00％   8.230458
  9   17   SEQ ID NO：7745   0.00％   7.3086111
  10   110   SEQ ID NO：7746   0.00％   6.174104475
  11   9   SEQ ID NO：7747   0.00％   6.0858
  12   99   SEQ ID NO：7748   0.00％   5.6823984
  13   2   SEQ ID NO：7749   0.00％   3.188283
  14   41   SEQ ID NO：7750   0.00％   2.206413
  15   135   SEQ ID NO：7751   0.00％   2.076624
  16   76   SEQ ID NO：7752   0.00％   2.005692
  17   23   SEQ ID NO：7753   0.00％   1.798209
  18   40   SEQ ID NO：7754   0.00％   1.68996456
  19   39   SEQ ID NO：7755   0.00％   1.516482
  20   118   SEQ ID NO：7756   0.00％   1.2683304
                                 HLA A 1101-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   91   SEQ ID NO：7757   2.77％   1
                                          HLA A 1101-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   101   SEQ ID NO：7758   33.33％   12
  2   71   SEQ ID NO：7759   2.77％   1
  3   90   SEQ ID NO：7760   1.66％   0.6
                                       HLA B7-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   49   SEQ ID NO：7761   2.22％   120
  2   9   SEQ ID NO：7762   1.11％   60
  3   73 SEQ ID NO：7763 0.66％ 36
  4   33   SEQ ID NO：7764   0.37％   20
  5   137   SEQ ID NO：7765   0.37％   20
  6   141   SEQ ID NO：7766   0.37％   20
  7   77 SEQ ID NO：7767 0.22％   12
  8   112   SEQ ID NO：7768   0.22％   12
  9   143   SEQ ID NO：7769   0.22％   12
  10   81   SEQ ID NO：7770   0.14％   8
  11   13   SEQ ID NO：7771   0.09％   5
  12   69   SEQ ID NO：7772   0.09％   5
  13   18   SEQ ID NO：7773   0.07％   4
  14   32   SEQ ID NO：7774   0.07％   4
  15   54   SEQ ID NO：7775   0.07％   4
  16   80   SEQ ID NO：7776   0.07％   4
  17   92   SEQ ID NO：7777   0.07％   4
  18   108   SEQ ID NO：7778   0.07％   4
  19   111   SEQ ID NO：7779   0.07％   4
  20   123   SEQ ID NO：7780   0.07％   4
                                            HLA B7-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   99   SEQ ID NO：7781   0.74％   40
  2   17   SEQ ID NO：7782   0.37％   20
  3   8   SEQ ID NO：7783   0.22％   12
  4   72   SEQ ID NO：7784   0.22％   12
  5   91   SEQ ID NO：7785   0.22％   12
  6   127   SEQ ID NO：7786   0.11％   6
  7   31   SEQ ID NO：7787   0.07％   4
  8   32   SEQ ID NO：7788   0.07％   4
  9   53   SEQ ID NO：7789   0.07％   4
  10   76   SEQ ID NO：7790   0.07％   4
  11   107   SEQ ID NO：7791   0.07％   4
  12   110   SEQ ID NO：7792   0.07％   4
  13   111   SEQ ID NO：7793   0.07％   4
  14   140   SEQ ID NO：7794   0.07％   4
  15   9   SEQ ID NO：7795   0.05％   3
  16   19   SEQ ID NO：7796   0.05％   3
  17   33   SEQ ID NO：7797   0.03％   2
  18   93   SEQ ID NO：7798   0.03％   2
  19   102   SEQ ID NO：7799   0.03％   2
  20   129   SEQ ID NO：7800   0.02％   1.5
表15：SEQ ID NO：6041的表位
                                            HLA A1-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1818   SEQ ID NO：7801   1.6％   90
  2   373   SEQ ID NO：7802   1.33％   75
  3   681   SEQ ID NO：7803   1.33％   75
  4   74   SEQ ID NO：7804   0.88％   50
  5   786   SEQ ID NO：7805   0.88％   50
  6   1495   SEQ ID NO：7806   0.88％   50
  7   88   SEQ ID NO：7807   0.8％   45
  8   357   SEQ ID NO：7808   0.8％   45
  9   1271   SEQ ID NO：7809   0.8％   45
  10   1799   SEQ ID NO：7810   0.8％   45
  11   1393   SEQ ID NO：7811   0.48％   27
  12   386   SEQ ID NO：7812   0.44％   25
  13   2304   SEQ ID NO：7813   0.44％   25
  14   198   SEQ ID NO：7814   0.4％   22.5
  15   840   SEQ ID NO：7815   0.4％   22.5
  16   2359   SEQ ID NO：7816   0.4％   22.5
  17   1194   SEQ ID NO：7817   0.32％   18
  18   1546   SEQ ID NO：7818   0.32％   18
  19   2200   SEQ ID NO：7819   0.22％   12.5
  20   996   SEQ ID NO：7820   0.2％   11.25
                                        HLA A1-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   995   SEQ ID NO：7821   10％   562.5
  2   1303   SEQ ID NO：7822   2.22％   125
  3   1582   SEQ ID NO：7823   2％   112.5
  4   1456   SEQ ID NO：7824   1.6％   90
  5   772   SEQ ID NO：7825   1.11％   62.5
  6   181   SEQ ID NO：7826   0.88％   50
  7   632   SEQ ID NO：7827   0.88％   50
  8   2281   SEQ ID NO：7828   0.88％   50
  9   1586   SEQ ID NO：7829   0.8％   45
  10   2109   SEQ ID NO：7830   0.8％   45
  11   745   SEQ ID NO：7831   0.55％   31.25
  12   1916   SEQ ID NO：7832   0.53％   30
  13   966   SEQ ID NO：7833   0.44％   25
  14   1387   SEQ ID NO：7834   0.44％   25
  15   2263   SEQ ID NO：7835   0.44％   25
  16   2457   SEQ ID NO：7836   0.26％   15
  17   1057   SEQ ID NO：7837   0.22％   12.5
  18   2562   SEQ ID NO：7838   0.22％   12.5
  19   74   SEQ ID NO：7839   0.17％   10
  20   298   SEQ ID NO：7840   0.17％   10
                                            HLA A3-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   536   SEQ ID NO：7841   3.33％   405
  2   986   SEQ ID NO：7842   2.46％   300
  3   805   SEQ ID NO：7843   1.64％   200
  4   2345   SEQ ID NO：7844   1.48％   180
  5   2481   SEQ ID NO：7845   0.55％   67.5
  6   204   SEQ ID NO：7846   0.49％   60
  7   895   SEQ ID NO：7847   0.44％   54
  8   1512   SEQ ID NO：7848   0.44％   54
  9   2491   SEQ ID NO：7849   0.37％   45
  10   436   SEQ ID NO：7850   0.32％   40
  11   917   SEQ ID NO：7851   0.32％   40
  12   1176   SEQ ID NO：7852   0.32％   40
  13   1517   SEQ ID NO：7853   0.29％   36
  14   466   SEQ ID NO：7854   0.24％   30
  15   1784   SEQ ID NO：7855   0.24％   30
  16   2039   SEQ ID NO：7856   0.24％   30
  17   2124   SEQ ID NO：7857   0.24％   30
  18   1049   SEQ ID NO：7858   0.22％   27
  19   2200   SEQ ID NO：7859   0.22％   27
  20   2598   SEQ ID NO：7860   0.22％   27
                                          HLA A3-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   392   SEQ ID NO：7861   2.46％   300
  2   2230   SEQ ID NO：7862   1.48％   180
  3   590   SEQ ID NO：7863   1.11％   135
  4   697   SEQ ID NO：7864   1.11％   135
  5   919   SEQ ID NO：7865   0.74％   90
  6   1354   SEQ ID NO：7866   0.74％   90
  7   1430   SEQ ID NO：7867   0.74％   90
  8   2534   SEQ ID NO：7868   0.74％   90
  9   202   SEQ ID NO：7869   0.49％   60
  10   488   SEQ ID NO：7870   0.49％   60
  11   922   SEQ ID NO：7871   0.49％   60
  12   1735   SEQ ID NO：7872   0.49％   60
  13   2281   SEQ ID NO：7873   0.49％   60
  14   1894   SEQ ID NO：7874   0.44％   54
  15   2552   SEQ ID NO：7875   0.44％   54
  16   555   SEQ ID NO：7876   0.37％   45
  17   1134   SEQ ID NO：7877   0.37％   45
  18   1149   SEQ ID NO：7878   0.29％   36
  19   283   SEQ ID NO：7879   0.24％   30
  20   917   SEQ ID NO：7880   0.24％   30
                                           HLA A24-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2375   SEQ ID NO：7881   36.07％   576
  2   1751   SEQ ID NO：7882   28.93％   462
  3   195   SEQ ID NO：7883   25.05％   400
  4   2306   SEQ ID NO：7884   21.04％   336
  5   806   SEQ ID NO：7885   20.66％   330
  6   1252   SEQ ID NO：7886   18.78％   300
  7   160   SEQ ID NO：7887   15.03％   240
  8   517   SEQ ID NO：7888   15.03％   240
  9   375   SEQ ID NO：7889   12.52％   200
  10   1275   SEQ ID NO：7890   12.52％   200
  11   2175   SEQ ID NO：7891   12.52％   200
  12   2207   SEQ ID NO：7892   12.52％   200
  13   2343   SEQ ID NO：7893   12.52％   200
  14   443   SEQ ID NO：7894   11.27％   180
  15   668   SEQ ID NO：7895   7.51％   120
  16   1825   SEQ ID NO：7896   6.88％   110
  17   1690   SEQ ID NO：7897   4.69％   75
  18   159   SEQ ID NO：7898   3.75％   60
  19   2550   SEQ ID NO：7899   3.75％   60
  20   1949   SEQ ID NO：7900   3.38％   54
                                    HLA A24-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   641   SEQ ID NO：7901   45.09％   720
  2   809   SEQ ID NO：7902   24.80％   396
  3   1209   SEQ ID NO：7903   22.54％   360
  4   216   SEQ ID NO：7904   18.03％   288
  5   159   SEQ ID NO：7905   15.03％   240
  6   528   SEQ ID NO：7906   15.03％   240
  7   799   SEQ ID NO：7907   15.03％   240
  8   1436   SEQ ID NO：7908   15.03％   240
  9   2219   SEQ ID NO：7909   15.03％   240
  10   1065   SEQ ID NO：7910   13.77％   220
  11   1953   SEQ ID NO：7911   13.15％   210
  12   1966   SEQ ID NO：7912   12.52％   200
  13   2600   SEQ ID NO：7913   12.52％   200
  14   71   SEQ ID NO：7914   9.39％   150
  15   380   SEQ ID NO：7915   9.39％   150
  16   1989   SEQ ID NO：7916   9.39％   150
  17   342   SEQ ID NO：7917   8.76％   140
  18   1071   SEQ ID NO：7918   8.76％   140
  19   2570   SEQ ID NO：7919   6.88％   110
  20   2550   SEQ ID NO：7920   6.26％   100
                                          HLA A 0201-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1632   SEQ ID NO：7921   0.09％   3607.31448
  2   1640   SEQ ID NO：7922   0.04％   1748.2560912
  3   1776   SEQ ID NO：7923   0.03％   1492.58592
  4   2512   SEQ ID NO：7924   0.03％   1434.16845
  5   1073   SEQ ID NO：7925   0.03％   1338.876
  6   230   SEQ ID NO：7926   0.01％   685.78272
  7   1001   SEQ ID NO：7927   0.01％   559.8936
  8   716   SEQ ID NO：7928   0.01％   558.27486
  9   2280   SEQ ID NO：7929   0.01％   511.19781048
  10   590   SEQ ID NO：7930   0.01％   469.6692
  11   664   SEQ ID NO：7931   0.01％   442.076389524
  12   1094   SEQ ID NO：7932   0.00％   382.536
  13   1735   SEQ ID NO：7933   0.00％   382.536
  14   1625   SEQ ID NO：7934   0.00％   342.4606344
  15   1974   SEQ ID NO：7935   0.00％   336.885048
  16   2382   SEQ ID NO：7936   0.00％   319.9392
  17   2417   SEQ ID NO：7937   0.00％   319.9392
  18   744   SEQ ID NO：7938   0.00％   256.416670125
  19   108   SEQ ID NO：7939   0.00％   232.52724
  20   390   SEQ ID NO：7940   0.00％   228.0411084
                                       HLA A 0201-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2511   SEQ ID NO：7941   0.38％   15126.90795
  2   1608   SEQ ID NO：7942   0.05％   2049.4656
  3   2572   SEQ ID NO：7943   0.04％   1879.5921264
  4   255   SEQ ID NO：7944   0.03％   1566.6522795
  5   895   SEQ ID NO：7945   0.03％   1338.876
  6   1171   SEQ ID NO：7946   0.02％   1107.960876
  7   1691   SEQ ID NO：7947   0.01％   782.95521024
  8   20   SEQ ID NO：7948   0.01％   549.9372312
  9   1632   SEQ ID NO：7949   0.01％   479.041993296
  10   2280   SEQ ID NO：7950   0.01％   472.418344576987
  11   1963   SEQ ID NO：7951   0.00％   358.73928
  12   1955   SEQ ID NO：7952   0.00％   331.093464
  13   741   SEQ ID NO：7953   0.00％   318.652488
  14   523   SEQ ID NO：7954   0.00％   278.7876
  15   1073   SEQ ID NO：7955   0.00％   266.6988828
  16   2489   SEQ ID NO：7956   0.00％   243.432
  17   777   SEQ ID NO：7957   0.00％   218.5730664
  18   1737   SEQ ID NO：7958   0.00％   218.0785572
  19   589 SEQ ID NO：7959 0.00％ 210.538251
  20   229   SEQ ID NO：7960   0.00％   205.230564
                                     HLA A 1101-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2337   SEQ ID NO：7961   33.33％   12
  2   2156   SEQ ID NO：7962   25％   9
  3   492   SEQ ID NO：7963   20％   7.2
  4   18   SEQ ID NO：7964   16.66％   6
  5   332   SEQ ID NO：7965   16.66％   6
  6   415   SEQ ID NO：7966   16.66％   6
  7   2479   SEQ ID NO：7967   16.66％   6
  8   1495   SEQ ID NO：7968   11.11％   4
  9   2035   SEQ ID NO：7969   11.11％   4
  10   1349   SEQ ID NO：7970   10％   3.6
  11   1194   SEQ ID NO：7971   8.33％   3
  12   1648   SEQ ID NO：7972   8.33％   3
  13   96   SEQ ID NO：7973   6.66％   2.4
  14   764   SEQ ID NO：7974   6.66％   2.4
  15   986   SEQ ID NO：7975   6.66％   2.4
  16   2345   SEQ ID NO：7976   6.66％   2.4
  17   698   SEQ ID NO：7977   5.55％   2
  18   1355   SEQ ID NO：7978   5.55％   2
  19   1987   SEQ ID NO：7979   5.55％   2
  20   2085   SEQ ID NO：7980   5.55％   2
                                               HLA A 1101-10 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   2083   SEQ ID NO：7981   33.33％   12
  2   2123   SEQ ID NO：7982   25％   9
  3   2147   SEQ ID NO：7983   16.66％   6
  4   331   SEQ ID NO：7984   12.5％   4.5
  5   1035   SEQ ID NO：7985   11.11％   4
  6   1064   SEQ ID NO：7986   11.11％   4
  7   2154   SEQ ID NO：7987   11.11％   4
  8   1048   SEQ ID NO：7988   7.5％   2.7
  9   202   SEQ ID NO：7989   6.66％   2.4
  10   721   SEQ ID NO：7990   6.66％   2.4
  11   2109   SEQ ID NO：7991   6.66％   2.4
  12   2230   SEQ ID NO：7992   6.66％   2.4
  13   1306   SEQ ID NO：7993   5.55％   2
  14   1622   SEQ ID NO：7994   5.55％   2
  15   1772   SEQ ID NO：7995   5.55％   2
  16   1796   SEQ ID NO：7996   5.55％   2
  17   186   SEQ ID NO：7997   5％   1.8
  18   414   SEQ ID NO：7998   5％   1.8
  19   697   SEQ ID NO：7999   5％   1.8
  20   1175   SEQ ID NO：8000   5％   1.8
                                             HLA B7-9 mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1447   SEQ ID NO：8001   14.81％   800
  2   642   SEQ ID NO：8002   3.70％   200
  3   34   SEQ ID NO：8003   2.22％   120
  4   186   SEQ ID NO：8004   1.48％   80
  5   244   SEQ ID NO：8005   1.48％   80
  6   459   SEQ ID NO：8006   1.48％   80
  7   1475   SEQ ID NO：8007   1.48％   80
  8   1867   SEQ ID NO：8008   1.48％   80
  9   2032   SEQ ID NO：8009   1.48％   80
  10   2047   SEQ ID NO：8010   1.48％   80
  11   2335   SEQ ID NO：8011   1.48％   80
  12   622   SEQ ID NO：8012   1.11％   60
  13   1375   SEQ ID NO：8013   1.11％   60
  14   1617   SEQ ID NO：8014   0.92％   50
  15   1023   SEQ ID NO：8015   0.83％   45
  16   286   SEQ ID NO：8016   0.74％   40
  17   490   SEQ ID NO：8017   0.74％   40
  18   810   SEQ ID NO：8018   0.74％   40
  19   1420   SEQ ID NO：8019   0.74％   40
  20   1854   SEQ ID NO：8020   0.74％   40
  HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1617   SEQ ID NO：8021   3.70％   200
  2   752   SEQ ID NO：8022   2.22％   120
  3   1552   SEQ ID NO：8023   2.22％   120
  4   154   SEQ ID NO：8024   1.48％   80
  5   165   SEQ ID NO：8025   1.48％   80
  6   383   SEQ ID NO：8026   1.48％   80
  7   1501   SEQ ID NO：8027   1.48％   80
  8   2093   SEQ ID NO：8028   1.48％   80
  9   2564   SEQ ID NO：8029   1.48％   80
  10   622   SEQ ID NO：8030   1.11％   60
  11   1086   SEQ ID NO：8031   1.11％   60
  12   1262   SEQ ID NO：8032   1.11％   60
  13   1556   SEQ ID NO：8033   1.11％   60
  14   845   SEQ ID NO：8034   1％   54
  15   286   SEQ ID NO：8035   0.74％   40
  16   490   SEQ ID NO：8036   0.74％   40
  17   552   SEQ ID NO：8037   0.74％   40
  18   1858   SEQ ID NO：8038   0.74％   40
  19   2107   SEQ ID NO：8039   0.74％   40
  20   2582   SEQ ID NO：8040   0.74％   40
表16：SEQ ID NO：6042的表位
  HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   846   SEQ ID NO：8041   2.22％   125
  2   798   SEQ ID NO：8042   1.6％   90
  3   787   SEQ ID NO：8043   0.88％   50
  4   1178   SEQ ID NO：8044   0.88％   50
  5   637   SEQ ID NO：8045   0.8％   45
  6   557   SEQ ID NO：8046   0.44％   25
  7   1020   SEQ ID NO：8047   0.44％   25
  8   282   SEQ ID NO：8048   0.32％   18
  9   1241   SEQ ID NO：8049   0.24％   13.5
  10   466   SEQ ID NO：8050   0.22％   12.5
  11   727   SEQ ID NO：8051   0.2％   11.25
12 706 SEQ ID NO：8052   0.17％   10
  13   324   SEQ ID NO：8053   0.16％   9
  14   752   SEQ ID NO：8054   0.16％   9
  15   54   SEQ ID NO：8055   0.13％   7.5
  16   554   SEQ ID NO：8056   0.13％   7.5
  17   590   SEQ ID NO：8057   0.12％   6.75
  18   569   SEQ ID NO：8058   0.08％   5
  19   613   SEQ ID NO：8059   0.08％   5
  20   90   SEQ ID NO：8060   0.08％   4.5
  HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1241   SEQ ID NO：8061   4.8％   270
  2   967   SEQ ID NO：8062   0.8％   45
  3   1010   SEQ ID NO：8063   0.48％   27
  4   426   SEQ ID NO：8064   0.44％   25
  5   809   SEQ ID NO：8065   0.44％   25
  6   1178   SEQ ID NO：8066   0.44％   25
  7   787   SEQ ID NO：8067   0.22％   12.5
  8   958   SEQ ID NO：8068   0.22％   12.5
  9   727   SEQ ID NO：8069   0.2％   11.25
  10   610   SEQ ID NO：8070   0.17％   10
  11   12   SEQ ID NO：8071   0.13％   7.5
  12   1181   SEQ ID NO：8072   0.12％   6.75
  13   373   SEQ ID NO：8073   0.11％   6.25
  14   602   SEQ ID NO：8074   0.11％   6.25
  15   20   SEQ ID NO：8075   0.04％   2.5
  16   32   SEQ ID NO：8076   0.04％   2.5
  17   53   SEQ ID NO：8077   0.04％   2.5
  18   400   SEQ ID NO：8078   0.04％   2.5
  19   557   SEQ ID NO：8079   0.04％   2.5
  20   667   SEQ ID NO：8080   0.04％   2.5
  HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   768   SEQ ID NO：8081   0.82％   100
  2   808   SEQ ID NO：8082   0.49％   60
  3   85   SEQ ID NO：8083   0.24％   30
  4   663   SEQ ID NO：8084   0.24％   30
  5   1245   SEQ ID NO：8085   0.14％   18
  6   288   SEQ ID NO：8086   0.09％   12
  7   50   SEQ ID NO：8087   0.08％   10
  8   320   SEQ ID NO：8088   0.07％   9
  9   402   SEQ ID NO：8089   0.07％   9
  10   798   SEQ ID NO：8090   0.07％   9
  11   902   SEQ ID NO：8091   0.06％   8.1
  12   364   SEQ ID NO：8092   0.05％   6.75
  13   297   SEQ ID NO：8093   0.04％   6
  14   992   SEQ ID NO：8094   0.04％   6
  15   38   SEQ ID NO：8095   0.03％   4.5
  16   249   SEQ ID NO：8096   0.03％   4.5
  17   706   SEQ ID NO：8097   0.03％   4.05
  18   1204   SEQ ID NO：8098   0.03％   4.05
  19   1178   SEQ ID NO：8099   0.03％   4
  20   343   SEQ ID NO：8100   0.02％   3.6
  HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   255   SEQ ID NO：8101   1.48％   180
  2   180   SEQ ID NO：8102   0.55％   67.5
  3   768   SEQ ID NO：8103   0.49％   60
  4   1177   SEQ ID NO：8104   0.49％   60
  5   380   SEQ ID NO：8105   0.24％   30
  6   100   SEQ ID NO：8106   0.18％   22.5
  7   786   SEQ ID NO：8107   0.16％   20
  8   1217   SEQ ID NO：8108   0.16％   20
  9   207   SEQ ID NO：8109   0.14％   18
  10   1183   SEQ ID NO：8110   0.14％   18
  11   38   SEQ ID NO：8111   0.09％   12
  12   52   SEQ ID NO：8112   0.09％   12
  13   8   SEQ ID NO：8113   0.06％   8
  14     679   SEQ ID NO：8114     0.06％     8
  15     73   SEQ ID NO：8115     0.05％     6.75
  16     1204   SEQ ID NO：8116     0.05％     6.075
  17     50   SEQ ID NO：8117     0.04％     6
  18     774   SEQ ID NO：8118     0.04％     6
  19     845   SEQ ID NO：8119     0.04％     6
  20     214   SEQ ID NO：8120     0.04％     5.4
  HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分     1596.672
  排序     起始位点     序列     占最大记分的百分比     记分
  1     1118     SEQ ID NO：8121     19.84％     316.8
  2     51     SEQ ID NO：8122     18.78％     300
  3     161     SEQ ID NO：8123     18.78％     300
  4     434     SEQ ID NO：8124     18.78％     300
  5     365     SEQ ID NO：8125     13.77％     220
  6     736     SEQ ID NO：8126     12.52％     200
  7     620     SEQ ID NO：8127     7.51％     120
  8     1068     SEQ ID NO：8128     7.51％     120
  9     817     SEQ ID NO：8129     3.75％     60
  10     336     SEQ ID NO：8130     3.44％     55
  11     687     SEQ ID NO：8131     3.13％     50
  12     254     SEQ ID NO：8132     2.34％     37.5
  13     627     SEQ ID NO：8133     1.87％     30
  14     950     SEQ ID NO：8134     1.75％     28
  15     28     SEQ ID NO：8135     1.56％     25
  16     408     SEQ ID NO：8136     1.56％     25
  17     159     SEQ ID NO：8137     1.31％     21
  18     1166     SEQ ID NO：8138     1.26％     20.16
  19     45     SEQ ID NO：8139     1.25％     20
  20     185     SEQ ID NO：8140     1.25％     20
  HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分     1596.672
  排序     起始位点     序列     占最大记分的百分比     记分
  1     438     SEQ ID NO：8141     27.55％     440
  2     489     SEQ ID NO：8142     22.54％     360
  3     254     SEQ ID NO：8143     18.78％     300
  4     354     SEQ ID NO：8144     11.27％     180
  5     406     SEQ ID NO：8145     11.27％     180
  6     1047     SEQ ID NO：8146     11.27％     180
  7     473     SEQ ID NO：8147     7.51％     120
  8   350   SEQ ID NO：8148   6.26％   100
  9   769   SEQ ID NO：8149   6.26％   100
  10   193   SEQ ID NO：8150   5.63％   90
  11   479   SEQ ID NO：8151   3.13％   50
  12   0   SEQ ID NO：8152   2.70％   43.2
  13   813   SEQ ID NO：8153   1.87％   30
  14   739   SEQ ID NO：8154   1.50％   24
  15   782   SEQ ID NO：8155   1.50％   24
  16   1186   SEQ ID NO：8156   1.31％   21
  17   910   SEQ ID NO：8157   1.05％   16.8
  18   128   SEQ ID NO：8158   0.93％   15
  19   183   SEQ ID NO：8159   0.93％   15
  20   1069   SEQ ID NO：8160   0.93％   15
  HLA A0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   1041   SEQ ID NO：8161   0.01％   484.2379773
  2   981   SEQ ID NO：8162   0.00％   382.536
  3   957   SEQ ID NO：8163   0.00％   342.4606344
  4   896   SEQ ID NO：8164   0.00％   232.6931712
  5   1173   SEQ ID NO：8165   0.00％   201.447432
  6   733   SEQ ID NO：8166   0.00％   171.86796
  7   410   SEQ ID NO：8167   0.00％   135.45252
  8   786   SEQ ID NO：8168   0.00％   119.463012
  9   150   SEQ ID NO：8169   0.00％   102.17550222
  10   1   SEQ ID NO：8170   0.00％   94.98737754
  11   595   SEQ ID NO：8171   0.00％   93.239424
  12   1095   SEQ ID NO：8172   0.00％   89.41779
  13   1166   SEQ ID NO：8173   0.00％   87.58584
  14   845   SEQ ID NO：8174   0.00％   79.642008
  15   734   SEQ ID NO：8175   0.00％   73.47672
  16   802   SEQ ID NO：8176   0.00％   71.872056
  17   1213   SEQ ID NO：8177   0.00％   71.872056
  18   105   SEQ ID NO：8178   0.00％   50.232
  19   939   SEQ ID NO：8179   0.00％   49.13352
  20   130   SEQ ID NO：8180   0.00％   48.732354
  HLA A0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   372   SEQ ID NO：8181   0.04％   1896.33528
  2   410   SEQ ID NO：8182   0.02％   1134.00849744
  3   162   SEQ ID NO：8183   0.01％   685.3897512
  4   1076   SEQ ID NO：8184   0.01％   640.90320525
  5   1196   SEQ ID NO：8185   0.01％   623.742666372
  6   353   SEQ ID NO：8186   0.01％   446.7384576
  7   50   SEQ ID NO：8187   0.00％   375.97824
  8   733   SEQ ID NO：8188   0.00％   271.863864
  9   130   SEQ ID NO：8189   0.00％   235.6873848
  10   415   SEQ ID NO：8190   0.00％   185.679
  11   297   SEQ ID NO：8191   0.00％   177.496704
  12   1   SEQ ID NO：8192   0.00％   152.42160582
  13   56   SEQ ID NO：8193   0.00％   110.013876
  14   732   SEQ ID NO：8194   0.00％   101.0988
  15   6   SEQ ID NO：8195   0.00％   98.26704
  16   261   SEQ ID NO：8196   0.00％   91.60164
  17   1040   SEQ ID NO：8197   0.00％   76.98537
  18   928   SEQ ID NO：8198   0.00％   71.2908
  19   1188   SEQ ID NO：8199   0.00％   69.81282
  20   1094   SEQ ID NO：8200   0.00％   52.5987
  HLA A1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   402   SEQ ID NO：8201   25％   9
  2   902   SEQ ID NO：8202   22.5％   8.1
  3   288   SEQ ID NO：8203   11.11％   4
  4   85   SEQ ID NO：8204   6.66％   2.4
  5   706   SEQ ID NO：8205   6.66％   2.4
  6   456   SEQ ID NO：8206   5.55％   2
  7   920   SEQ ID NO：8207   5.55％   2
  8   535   SEQ ID NO：8208   5％   1.8
  9   364   SEQ ID NO：8209   3.33％   1.2
  10   438   SEQ ID NO：8210   3.33％   1.2
  11   798   SEQ ID NO：8211   3.33％   1.2
  12   808   SEQ ID NO：8212   3.33％   1.2
  13   937   SEQ ID NO：8213   3.33％   1.2
  14   956   SEQ ID NO：8214   3.33％   1.2
  15   557   SEQ ID NO：8215   2.77％   1
  16   1218   SEQ ID NO：8216   2.77％   1
  17   784   SEQ ID NO：8217   2.5％   0.9
  18   249   SEQ ID NO：8218   2.22％   0.8
  19   768   SEQ ID NO：8219   2.22％   0.8
  20   1178   SEQ ID NO：8220   2.22％   0.8
  HLA A1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   38   SEQ ID NO：8221   13.33％   4.8
  2   807   SEQ ID NO：8222   12.5％   4.5
  3   100   SEQ ID NO：8223   11.11％   4
  4   380   SEQ ID NO：8224   11.11％   4
  5   767   SEQ ID NO：8225   10％   3.6
  6   533   SEQ ID NO：8226   8.33％   3
  7   967   SEQ ID NO：8227   6.66％   2.4
  8   919   SEQ ID NO：8228   5.55％   2
  9   305   SEQ ID NO：8229   5％   1.8
  10   211   SEQ ID NO：8230   3.33％   1.2
  11   511   SEQ ID NO：8231   3.33％   1.2
  12   1177   SEQ ID NO：8232   3.33％   1.2
  13   429   SEQ ID NO：8233   2.77％   1
  14   758   SEQ ID NO：8234   2.77％   1
  15   797   SEQ ID NO：8235   2.5％   0.9
  16   255   SEQ ID NO：8236   2.22％   0.8
  17   986   SEQ ID NO：8237   2.22％   0.8
  18   1157   SEQ ID NO：8238   2.22％   0.8
  19   170   SEQ ID NO：8239   1.66％   0.6
  20   893   SEQ ID NO：8240   1.66％   0.6
  HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   200   SEQ ID NO：8241   1.48％   80
  2   1243   SEQ ID NO：8242   1.48％   80
  3   123   SEQ ID NO：8243   0.74％   40
  4   248   SEQ ID NO：8244   0.66％   36
  5   1036   SEQ ID NO：8245   0.66％   36
  6   494   SEQ ID NO：8246   0.37％   20
  7   495   SEQ ID NO：8247   0.37％   20
  8   523   SEQ ID NO：8248   0.37％   20
  9   842   SEQ ID NO：8249   0.37％   20
  10   932   SEQ ID NO：8250   0.37％   20
  11   274   SEQ ID NO：8251   0.33％   18
  12   588   SEQ ID NO：8252   0.22％   12
  13   656   SEQ ID NO：8253   0.22％   12
  14   657   SEQ ID NO：8254   0.22％   12
  15   767   SEQ ID NO：8255   0.22％   12
  16   911   SEQ ID NO：8256   0.22％   12
  17   939   SEQ ID NO：8257   0.22％   12
  18   1007   SEQ ID NO：8258   0.22％   12
  19   1170   SEQ ID NO：8259   0.22％   12
  20   1206   SEQ ID NO：8260   0.22％   12
  HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   505   SEQ ID NO：8261   4.44％   240
  2   312   SEQ ID NO：8262   3.70％   200
  3   141 SEQ ID NO：8263   1.11％   60
  4   1006   SEQ ID NO：8264   0.66％   36
  5   411   SEQ ID NO：8265   0.44％   24
  6   122   SEQ ID NO：8266   0.37％   20
  7   134   SEQ ID NO：8267   0.37％   20
  8   184   SEQ ID NO：8268   0.37％   20
  9   367   SEQ ID NO：8269   0.37％   20
  10   402   SEQ ID NO：8270   0.37％   20
  11   494   SEQ ID NO：8271   0.37％   20
  12   560   SEQ ID NO：8272   0.37％   20
  13   626   SEQ ID NO：8273   0.37％   20
  14   931   SEQ ID NO：8274   0.37％   20
  15   956   SEQ ID NO：8275   0.37％   20
  16   1117   SEQ ID NO：8276   0.37％   20
  17   1169   SEQ ID NO：8277   0.37％   20
  18   1196   SEQ ID NO：8278   0.37％   20
  19   247   SEQ ID NO：8279   0.22％   12
  20   273   SEQ ID NO：8280   0.22％   12
表17：SEQ ID NO：6043的表位
  HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   168   SEQ ID NO：8281   0.2％   11.25
  2   212   SEQ ID NO：8282   0.08％   4.5
  3   223   SEQ ID NO：8283   0.08％   4.5
  4   104   SEQ ID NO：8284   0.04％   2.5
  5   170   SEQ ID NO：8285   0.04％   2.5
  6   99   SEQ ID NO：8286   0.04％   2.25
  7   188   SEQ ID NO：8287   0.02％   1.35
  8   180   SEQ ID NO：8288   0.02％   1.25
  9   219   SEQ ID NO：8289   0.02％   1.25
  10   18   SEQ ID NO：8290   0.01％   1
  11   226   SEQ ID NO：8291   0.01％   1
  12   98   SEQ ID NO：8292   0.01％   0.625
  13   151   SEQ ID NO：8293   0.01％   0.625
  14   10   SEQ ID NO：8294   0.01％   0.6
  15   13   SEQ ID NO：8295   0.00％   0.5
  16   32   SEQ ID NO：8296   0.00％   0.5
  17   70   SEQ ID NO：8297   0.00％   0.5
  18   78   SEQ ID NO：8298   0.00％   0.5
  19   82   SEQ ID NO：8299   0.00％   0.5
  20   145   SEQ ID NO：8300   0.00％   0.5
  HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   99   SEQ ID NO：8301   0.8％   45
  2   223   SEQ ID NO：8302   0.8％   45
  3   188   SEQ ID NO：8303   0.48％   27
  4   206   SEQ ID NO：8304   0.2％   11.25
  5   253   SEQ ID NO：8305   0.17％   10
  6   174   SEQ ID NO：8306   0.13％   7.5
  7   97   SEQ ID NO：8307   0.04％   2.5
  8   257   SEQ ID NO：8308   0.04％   2.5
  9   179   SEQ ID NO：8309   0.04％   2.25
  10   162   SEQ ID NO：8310   0.02％   1.25
  11   196   SEQ ID NO：8311   0.02％   1.25
  12   219   SEQ ID NO：8312   0.02％   1.25
  13   18   SEQ ID NO：8313   0.01％   1
  14   246   SEQ ID NO：8314   0.01％   1
  15   38   SEQ ID NO：8315   0.01％   0.75
  16   33   SEQ ID NO：8316   0.00％   0.5
  17   69   SEQ ID NO：8317   0.00％   0.5
  18   81   SEQ ID NO：8318   0.00％   0.5
19 104 SEQ ID NO：8319 0.00％   0.5
  20   116   SEQ ID NO：8320   0.00％   0.5
  HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   104   SEQ ID NO：8321   0.98％   120
  2   123   SEQ ID NO：8322   0.74％   90
  3   82   SEQ ID NO：8323   0.44％   54
  4   106   SEQ ID NO：8324   0.11％   13.5
  5   99   SEQ ID NO：8325   0.08％   10.8
  6   127   SEQ ID NO：8326   0.08％   10
  7   71   SEQ ID NO：8327   0.07％   9
  8   1   SEQ ID NO：8328   0.06％   8.1
  9   113   SEQ ID NO：8329   0.04％   6
  10   84   SEQ ID NO：8330   0.03％   4.5
  11   109   SEQ ID NO：8331   0.03％   4.05
  12   58   SEQ ID NO：8332   0.02％   3
  13   138   SEQ ID NO：8333   0.02％   3
  14   44   SEQ ID NO：8334   0.02％   2.7
  15   81   SEQ ID NO：8335   0.02％   2.7
  16   226   SEQ ID NO：8336   0.02％   2.7
  17   184   SEQ ID NO：8337   0.01％   1.8
  18   102   SEQ ID NO：8338   0.01％   1.215
  19   39   SEQ ID NO：8339   0.00％   1.2
  20   234   SEQ ID NO：8340   0.00％   0.9
  HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   99   SEQ ID NO：8341   1.33％   162
  2   81   SEQ ID NO：8342   0.44％   54
  3   104   SEQ ID NO：8343   0.24％   30
  4   51   SEQ ID NO：8344   0.16％   20
  5   122   SEQ ID NO：8345   0.11％   13.5
  6   71   SEQ ID NO：8346   0.07％   9
  7   69   SEQ ID NO：8347   0.04％   6
  8   223   SEQ ID NO：8348   0.04％   5.4
  9   84   SEQ ID NO：8349   0.03％   4.5
  10   63   SEQ ID NO：8350   0.02％   3.6
  11   138   SEQ ID NO：8351   0.02％   3
  12   201   SEQ ID NO：8352   0.01％   1.8
  13   44   SEQ ID NO：8353   0.01％   1.35
  14   83   SEQ ID NO：8354   0.01％   1.35
  15   116   SEQ ID NO：8355   0.00％   1.2
  16   46   SEQ ID NO：8356   0.00％   0.9
  17   183   SEQ ID NO：8357   0.00％   0.81
  18   57   SEQ ID NO：8358   0.00％   0.6
  19   93   SEQ ID NO：8359   0.00％   0.6
  20   113   SEQ ID NO：8360   0.00％   0.6
  HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   198   SEQ ID NO：8361   13.15％   210
  2   105   SEQ ID NO：8362   9.39％   150
  3   210   SEQ ID NO：8363   4.69％   75
  4   75   SEQ ID NO：8364   3.15％   50.4
  5   85   SEQ ID NO：8365   2.63％   42
  6   205   SEQ ID NO：8366   2.10％   33.6
  7   77   SEQ ID NO：8367   1.87％   30
  8   158   SEQ ID NO：8368   0.65％   10.5
  9   103   SEQ ID NO：8369   0.56％   9
  10   227   SEQ ID NO：8370   0.55％   8.8704
  11   32   SEQ ID NO：8371   0.54％   8.64
  12   74   SEQ ID NO：8372   0.50％   8
  13   131   SEQ ID NO：8373   0.50％   8
  14   54   SEQ ID NO：8374   0.46％   7.5
  15   99   SEQ ID NO：8375   0.45％   7.2
  16   44   SEQ ID NO：8376   0.37％   6
  17   62   SEQ ID NO：8377   0.37％   6
  18   87   SEQ ID NO：8378   0.37％   6
  19   89   SEQ ID NO：8379   0.37％   6
  20   154   SEQ ID NO：8380   0.37％   6
  HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   105   SEQ ID NO：8381   22.54％   360
  2   204   SEQ ID NO：8382   17.53％   280
  3   209   SEQ ID NO：8383   3.13％   50
  4   75   SEQ ID NO：8384   1.87％   30
  5   85   SEQ ID NO：8385   1.87％   30
  6   77   SEQ ID NO：8386   1.12％   18
  7   74   SEQ ID NO：8387   0.84％   13.44
  8   210   SEQ ID NO：8388   0.56％   9
  9   226   SEQ ID NO：8389   0.55％   8.8704
  10   98   SEQ ID NO：8390   0.54％   8.64
  11   198   SEQ ID NO：8391   0.46％   7.5
  12   67   SEQ ID NO：8392   0.45％   7.2
  13   152   SEQ ID NO：8393   0.43％   7
  14   43   SEQ ID NO：8394   0.37％   6
  15   63   SEQ ID NO：8395   0.37％   6
  16   72   SEQ ID NO：8396   0.37％   6
  17   89   SEQ ID NO：8397   0.37％   6
  18   101   SEQ ID NO：8398   0.37％   6
  19   107   SEQ ID NO：8399   0.37％   6
  20   111   SEQ ID NO：8400   0.37％   6
  HLA A0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   138   SEQ ID NO：8401   0.21％   8532.082944
  2   106   SEQ ID NO：8402   0.10％   3977.8497792
  3   44   SEQ ID NO：8403   0.03％   1243.078056
  4   71   SEQ ID NO：8404   0.00％   348.872832
  5   234   SEQ ID NO：8405   0.00％   243.432
  6   51   SEQ ID NO：8406   0.00％   130.26096
  7   109   SEQ ID NO：8407   0.00％   91.182672
  8   81   SEQ ID NO：8408   0.00％   73.342584
  9   88   SEQ ID NO：8409   0.00％   70.386624
  10   1   SEQ ID NO：8410   0.00％   65.32728732
  11   38   SEQ ID NO：8411   0.00％   47.876409
  12   76   SEQ ID NO：8412   0.00％   36.8637882
  13   46   SEQ ID NO：8413   0.00％   30.889782
  14   211   SEQ ID NO：8414   0.00％   21.616753941
  15   201   SEQ ID NO：8415   0.00％   19.657134
  16   102   SEQ ID NO：8416   0.00％   18.4318941
  17   199   SEQ ID NO：8417   0.00％   16.496865
  18   74   SEQ ID NO：8418   0.00％   15.783256167
  19   62   SEQ ID NO：8419   0.00％   13.9968225
  20   99   SEQ ID NO：8420   0.00％   10.31851392
  HLA A0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   78   SEQ ID NO：8421   0.01％   556.494246
  2   138   SEQ ID NO：8422   0.01％   395.245972224
  3   84   SEQ ID NO：8423   0.00％   201.554244
  4   71   SEQ ID NO：8424   0.00％   143.65707264
  5   44   SEQ ID NO：8425   0.00％   132.54624
  6   76   SEQ ID NO：8426   0.00％   84.78671286
  7   8   SEQ ID NO：8427   0.00％   69.552
  8   211   SEQ ID NO：8428   0.00％   52.7237901
  9   113   SEQ ID NO：8429   0.00％   47.99088
  10   61   SEQ ID NO：8430   0.00％   37.4509575
  11   93   SEQ ID NO：8431   0.00％   31.24872
  12   137   SEQ ID NO：8432   0.00％   31.1384304
  13   37   SEQ ID NO：8433   0.00％   27.531
  14   55   SEQ ID NO：8434   0.00％   22.9153278
  15   98   SEQ ID NO：8435   0.00％   22.1063618985
  16   108   SEQ ID NO：8436   0.00％   21.55457052
  17   63   SEQ ID NO：8437   0.00％   21.3624
  18   45   SEQ ID NO：8438   0.00％   19.657134
  19   200   SEQ ID NO：8439   0.00％   19.657134
  20   104   SEQ ID NO：8440   0.00％   13.87622016
  HLA A1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   58   SEQ ID NO：8441   5.55％   2
  2   125   SEQ ID NO：8442   1.66％   0.6
  3   226   SEQ ID NO：8443   1.66％   0.6
  4   229   SEQ ID NO：8444   1.66％   0.6
  HLA A1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   122   SEQ ID NO：8445   2.22％   0.8
  2   228   SEQ ID NO：8446   2.22％   0.8
  HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   97   SEQ ID NO：8447   0.66％   36
  2   86   SEQ ID NO：8448   0.37％   20
  3   37   SEQ ID NO：8449   0.33％   18
  4   62   SEQ ID NO：8450   0.33％   18
  5   32   SEQ ID NO：8451   0.22％   12
  6   102   SEQ ID NO：8452   0.22％   12
  7   227   SEQ ID NO：8453   0.22％   12
  8   53   SEQ ID NO：8454   0.11％   6
  9   1   SEQ ID NO：8455   0.07％   4
  10   44   SEQ ID NO：8456   0.07％   4
  11   56   SEQ ID NO：8457   0.07％   4
  12   64   SEQ ID NO：8458   0.07％   4
  13   74   SEQ ID NO：8459   0.07％   4
  14   76   SEQ ID NO：8460   0.07％   4
  15   87   SEQ ID NO：8461   0.07％   4
  16   106   SEQ ID NO：8462   0.07％   4
  17   131   SEQ ID NO：8463   0.07％   4
  18   23   SEQ ID NO：8464   0.03％   2
  19   157   SEQ ID NO：8465   0.03％   2
  20   166   SEQ ID NO：8466   0.03％   2
  HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   119   SEQ ID NO：8467   3.33％   180
  2   264   SEQ ID NO：8468   1.48％   80
  3   98   SEQ ID NO：8469   0.66％   36
  4   27   SEQ ID NO：8470   0.37％   20
  5   86   SEQ ID NO：8471   0.37％   20
  6   31   SEQ ID NO：8472   0.22％   12
  7   63   SEQ ID NO：8473   0.22％   12
  8   96   SEQ ID NO：8474   0.22％   12
  9   101   SEQ ID NO：8475   0.22％   12
  10   226   SEQ ID NO：8476   0.22％   12
  11   157   SEQ ID NO：8477   0.14％   8
  12   176   SEQ ID NO：8478   0.14％   8
  13   238   SEQ ID NO：8479   0.14％   8
  14   36   SEQ ID NO：8480   0.11％   6
  15   53   SEQ ID NO：8481   0.11％   6
  16   61   SEQ ID NO：8482   0.11％   6
  17   3   SEQ ID NO：8483   0.07％   4
  18   40   SEQ ID NO：8484   0.07％   4
  19   55   SEQ ID NO：8485   0.07％   4
  20   74   SEQ ID NO：8486   0.07％   4
表18：SEQ ID NO：6044的表位
  HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   69   SEQ ID NO：8487   0.04％   2.5
  2   89   SEQ ID NO：8488   0.02％   1.5
  3   141   SEQ ID NO：8489   0.01％   1
  4   113   SEQ ID NO：8490   0.00％   0.5
  HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   21   SEQ ID NO：8491   0.02％   1.5
  2   88   SEQ ID NO：8492   0.02％   1.5
  3   8   SEQ ID NO：8493   0.02％   1.25
  4   31   SEQ ID NO：8494   0.00％   0.5
  5   112   SEQ ID NO：8495   0.00％   0.5
  HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   60   SEQ ID NO：8496   1.23％   150
  2   77   SEQ ID NO：8497   1.11％   135
  3   141   SEQ ID NO：8498   0.49％   60
  4   95   SEQ ID NO：8499   0.32％   40
  5   128   SEQ ID NO：8500   0.08％   10
  6   113   SEQ ID NO：8501   0.04％   6
  7   69   SEQ ID NO：8502   0.01％   2
  8   22   SEQ ID NO：8503   0.01％   1.8
  9   42   SEQ ID NO：8504   0.01％   1.8
  10   78   SEQ ID NO：8505   0.00％   1.2
  11   32   SEQ ID NO：8506   0.00％   1
  12   54   SEQ ID NO：8507   0.00％   0.9
  13   74   SEQ ID NO：8508   0.00％   0.9
  14   28   SEQ ID NO：8509   0.00％   0.6
  15   36   SEQ ID NO：8510   0.00％   0.6
  16   48   SEQ ID NO：8511   0.00％   0.6
  17   118   SEQ ID NO：8512   0.00％   0.6
  18   4   SEQ ID NO：8513   0.00％   0.5
  HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   94   SEQ ID NO：8514   0.49％   60
  2   48   SEQ ID NO：8515   0.16％   20
  3   128   SEQ ID NO：8516   0.16％   20
  4   60   SEQ ID NO：8517   0.12％   15
  5   127   SEQ ID NO：8518   0.12％   15
  6   25   SEQ ID NO：8519   0.04％   6
  7   95   SEQ ID NO：8520   0.04％   6
  8   141   SEQ ID NO：8521   0.04％   6
  9   41   SEQ ID NO：8522   0.04％   5.4
  10   77   SEQ ID NO：8523   0.04％   5.4
  11   116   SEQ ID NO：8524   0.04％   5.4
  12   91   SEQ ID NO：8525   0.03％   4
  13   4   SEQ ID NO：8526   0.01％   2
  14   112   SEQ ID NO：8527   0.01％   1.8
  15   113   SEQ ID NO：8528   0.01％   1.35
  16   12   SEQ ID NO：8529   0.00％   1.2
  17   31   SEQ ID NO：8530   0.00％   1
  18   32   SEQ ID NO：8531   0.00％   1
  19   15   SEQ ID NO：8532   0.00％   0.9
  20   27   SEQ ID NO：8533   0.00％   0.9
  HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   61   SEQ ID NO：8534   14.46％   231
  2   16   SEQ ID NO：8535   3.13％   50
  3   120   SEQ ID NO：8536   1.87％   30
  4   41   SEQ ID NO：8537   0.60％   9.6
  5   71   SEQ ID NO：8538   0.45％   7.2
  6   21   SEQ ID NO：8539   0.37％   6
  7   53   SEQ ID NO：8540   0.37％   6
  8   65   SEQ ID NO：8541   0.37％   6
  9   121   SEQ ID NO：8542   0.37％   6
  10   74   SEQ ID NO：8543   0.36％   5.76
  11   20   SEQ ID NO：8544   0.35％   5.6
  12   79   SEQ ID NO：8545   0.35％   5.6
  13   105   SEQ ID NO：8546   0.33％   5.28
  14   48   SEQ ID NO：8547   0.30％   4.8
  15   88   SEQ ID NO：8548   0.30％   4.8
  16   106   SEQ ID NO：8549   0.30％   4.8
  17   37   SEQ ID NO：8550   0.27％   4.4
  18   70   SEQ ID NO：8551   0.27％   4.4
  19   18   SEQ ID NO：8552   0.25％   4
  20   57   SEQ ID NO：8553   0.22％   3.6
  HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   120   SEQ ID NO：8554   1.87％   30
  2   73   SEQ ID NO：8555   0.54％   8.64
  3   19   SEQ ID NO：8556   0.52％   8.4
  4   78   SEQ ID NO：8557   0.52％   8.4
  5   104   SEQ ID NO：8558   0.49％   7.92
  6   61   SEQ ID NO：8559   0.46％   7.5
  7   47   SEQ ID NO：8560   0.45％   7.2
  8   36   SEQ ID NO：8561   0.41％   6.6
  9   52   SEQ ID NO：8562   0.37％   6
  10   64   SEQ ID NO：8563   0.30％   4.8
  11   70   SEQ ID NO：8564   0.30％   4.8
  12   105   SEQ ID NO：8565   0.30％   4.8
  13   123   SEQ ID NO：8566   0.30％   4.8
  14   69   SEQ ID NO：8567   0.27％   4.4
  15   20   SEQ ID NO：8568   0.25％   4
  16   66   SEQ ID NO：8569   0.25％   4
  17   83   SEQ ID NO：8570   0.25％   4
  18   86   SEQ ID NO：8571   0.25％   4
  19   101   SEQ ID NO：8572   0.25％   4
  20   119   SEQ ID NO：8573   0.25％   4
  HLA A0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   62   SEQ ID NO：8574   0.00％   136.1646
  2   85   SEQ ID NO：8575   0.00％   69.6969
  3   47   SEQ ID NO：8576   0.00％   60.153786
  4   121   SEQ ID NO：8577   0.00％   52.5182736
  5   74   SEQ ID NO：8578   0.00％   49.13352
  6   23   SEQ ID NO：8579   0.00％   21.99582
  7   78   SEQ ID NO：8580   0.00％   19.42488
  8   114   SEQ ID NO：8581   0.00％   14.6900655
  9   4   SEQ ID NO：8582   0.00％   11.304684
  10   79   SEQ ID NO：8583   0.00％   8.4687081
  11   122   SEQ ID NO：8584   0.00％   6.0996
  12   100   SEQ ID NO：8585   0.00％   5.382
  13   105   SEQ ID NO：8586   0.00％   4.981593
  14   25   SEQ ID NO：8587   0.00％   4.968
  15   115   SEQ ID NO：8588   0.00％   4.966482
  16   24   SEQ ID NO：8589   0.00％   4.4815221585
  17   111   SEQ ID NO：8590   0.00％   4.128201
  18   94   SEQ ID NO：8591   0.00％   3.67632
  19   34   SEQ ID NO：8592   0.00％   3.47553
  20   12   SEQ ID NO：8593   0.00％   3.30993
                                          HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   77   SEQ ID NO：8594   0.00％   147.97188
  2   62   SEQ ID NO：8595   0.00％   143.59176
  3   113   SEQ ID NO：8596   0.00％   106.83684
  4   78   SEQ ID NO：8597   0.00％   83.526984
  5   86   SEQ ID NO：8598   0.00％   83.526984
  6   74   SEQ ID NO：8599   0.00％   69.552
  7   121   SEQ ID NO：8600   0.00％   61.06776
  8   12   SEQ ID NO：8601   0.00％   50.232
  9   44   SEQ ID NO：8602   0.00％   26.082
  10   4   SEQ ID NO：8603   0.00％   18.3816
  11   0   SEQ ID NO：8604   0.00％   17.38386
  12   72   SEQ ID NO：8605   0.00％   17.1396
  13   22   SEQ ID NO：8606   0.00％   16.21914
  14   122   SEQ ID NO：8607   0.00％   14.02908
  15   64   SEQ ID NO：8608   0.00％   11.161854
  16   46   SEQ ID NO：8609   0.00％   10.34586
  17   54   SEQ ID NO：8610   0.00％   8.846145
  18   47   SEQ ID NO：8611   0.00％   7.575080337
  19   131   SEQ ID NO：8612   0.00％   7.452
  20   114   SEQ ID NO：8613   0.00％   6.735366
                                                  HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   69   SEQ ID NO：8614   5.55％   2
  2   22   SEQ ID NO：8615   5％   1.8
  3   77   SEQ ID NO：8616   5％   1.8
  4   141   SEQ ID NO：8617   3.33％   1.2
  5   60   SEQ ID NO：8618   2.22％   0.8
  6   95   SEQ ID NO：8619   2.22％   0.8
  7   36   SEQ ID NO：8620   1.66％   0.6
            HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   41   SEQ ID NO：8621   3.33％   1.2
  2   68   SEQ ID NO：8622   3.33％   1.2
  3   94   SEQ ID NO：8623   3.33％   1.2
  4   31   SEQ ID NO：8624   2.77％   1
  5   127   SEQ ID NO：8625   2.5％   0.9
                                                 HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   48   SEQ ID NO：8626   0.74％   40
  2   20   SEQ ID NO：8627   0.37％   20
  3   121   SEQ ID NO：8628   0.33％   18
  4   18   SEQ ID NO：8629   0.07％   4
  5   21   SEQ ID NO：8630   0.07％   4
  6   37   SEQ ID NO：8631   0.07％   4
  7   41   SEQ ID NO：8632   0.07％   4
  8   53   SEQ ID NO：8633   0.07％   4
  9   65   SEQ ID NO：8634   0.07％   4
  10   70   SEQ ID NO：8635   0.07％   4
  11   71   SEQ ID NO：8636   0.07％   4
  12   74   SEQ ID NO：8637   0.07％   4
  13   79   SEQ ID NO：8638   0.07％   4
  14   88   SEQ ID NO：8639   0.07％   4
  15   105   SEQ ID NO：8640   0.07％   4
  16   106   SEQ ID NO：8641   0.07％   4
  17   124   SEQ ID NO：8642   0.07％   4
  18   1   SEQ ID NO：8643   0.03％   2
  19   120   SEQ ID NO：8644   0.03％   1.8
  20   11   SEQ ID NO：8645   0.02％   1.2
                                                    HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   66   SEQ ID NO：8646   1.48％   80
  2   123   SEQ ID NO：8647   0.74％   40
  3   20   SEQ ID NO：8648   0.37％   20
  4   64   SEQ ID NO：8649   0.22％   12
  5   119   SEQ ID NO：8650   0.11％   6
  6   54   SEQ ID NO：8651   0.09％   5
  7   19   SEQ ID NO：8652   0.07％   4
  8   36   SEQ ID NO：8653   0.07％   4
  9   47   SEQ ID NO：8654   0.07％   4
  10   52   SEQ ID NO：8655   0.07％   4
  11   69   SEQ ID NO：8656   0.07％   4
  12   70   SEQ ID NO：8657   0.07％   4
  13   73   SEQ ID NO：8658   0.07％   4
  14   78   SEQ ID NO：8659   0.07％   4
  15   83   SEQ ID NO：8660   0.07％   4
16 86 SEQ ID NO：8661   0.07％   4
  17   101 SEQ ID NO：8662 0.07％   4
  18   104   SEQ ID NO：8663   0.07％   4
  19   105   SEQ ID NO：8664   0.07％   4
  20   15   SEQ ID NO：8665   0.03％   2
表19：SEQ ID NO：6045的表位
                                              HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4   SEQ ID NO：8666   0.02％   1.35
  2   66   SEQ ID NO：8667   0.02％   1.35
  3   33   SEQ ID NO：8668   0.02％   1.25
  4   44   SEQ ID NO：8669   0.01％   1
  5   50   SEQ ID NO：8670   0.01％   1
  6   14   SEQ ID NO：8671   0.01％   0.75
  7   48   SEQ ID NO：8672   0.01％   0.75
  8   11   SEQ ID NO：8673   0.00％   0.5
                                             HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4   SEQ ID NO：8674   0.12％   6.75
  2   66   SEQID NO：8675   0.12％   6.75
  3   10   SEQ ID NO：8676   0.00％   0.5
  4   28   SEQ ID NO：8677   0.00％   0.5
  5   32   SEQ ID NO：8678   0.00％   0.5
  6   47   SEQ ID NO：8679   0.00％   0.5
                                          HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   17   SEQ ID NO：8680   0.24％   30
  2   44   SEQ ID NO：8681   0.07％   9
  3   19   SEQ ID NO：8682   0.06％   8.1
  4   50   SEQ ID NO：8683   0.04％   5.4
  5   29   SEQ ID NO：8684   0.03％   4
  6   52   SEQ ID NO：8685   0.02％   3.24
  7   54   SEQ ID NO：8686   0.02％   3
  8   11   SEQ ID NO：8687   0.01％   1.8
  9   37   SEQ ID NO：8688   0.01％   1.8
  10   25   SEQ ID NO：8689   0.01％   1.35
  11   10   SEQ ID NO：8690   0.00％   0.9
  12   16   SEQ ID NO：8691   0.00％   0.9
  13   35   SEQ ID NO：8692   0.00％   0.6
                                         HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   49   SEQ ID NO：8693   0.44％   54
  2   17   SEQ ID NO：8694   0.22％   27
  3   10   SEQ ID NO：8695   0.14％   18
  4   16   SEQ ID NO：8696   0.07％   9
  5   32   SEQ ID NO：8697   0.04％   6
  6   19   SEQ ID NO：8698   0.01％   1.8
  7   29   SEQ ID NO：8699   0.00％   1.2
  8   23   SEQ ID NO：8700   0.00％   0.9
  9   26   SEQ ID NO：8701   0.00％   0.9
                                             HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   18   SEQ ID NO：8702   1.87％   30
  2   24   SEQ ID NO：8703   0.65％   10.5
  3   9   SEQ ID NO：8704   0.52％   8.4
  4   12   SEQ ID NO：8705   0.52％   8.4
  5   28   SEQ ID NO：8706   0.52％   8.4
  6   42   SEQ ID NO：8707   0.52％   8.4
  7   57   SEQ ID NO：8708   0.52％   8.4
  8   66   SEQ ID NO：8709   0.52％   8.4
  9   55   SEQ ID NO：8710   0.51％   8.25
  10   0   SEQ ID NO：8711   0.48％   7.7
  11   22   SEQ ID NO：8712   0.45％   7.2
  12   10   SEQ ID NO：8713   0.37％   6
  13   25   SEQ ID NO：8714   0.37％   6
  14   30   SEQ ID NO：8715   0.37％   6
  15   19   SEQ ID NO：8716   0.35％   5.6
  16   40   SEQ ID NO：8717   0.31％   5
  17   3   SEQ ID NO：8718   0.30％   4.8
  18   65   SEQ ID NO：8719   0.30％   4.8
  19   14   SEQ ID NO：8720   0.27％   4.32
  20   56   SEQ ID NO：8721   0.25％   4
                                        HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   55   SEQ ID NO：8722   18.78％   300
  2   18   SEQ ID NO：8723   2.63％   42
  3   21   SEQ ID NO：8724   2.25％   36
  4   2   SEQ ID NO：8725   1.87％   30
  5   24   SEQ ID NO：8726   1.87％   30
  6   11   SEQ ID NO：8727   0.52％   8.4
  7   40   SEQ ID NO：8728   0.52％   8.4
  8   65   SEQ ID NO：8729   0.42％   6.72
  9   9   SEQ ID NO：8730   0.37％   6
  10   8   SEQ ID NO：8731   0.35％   5.6
  11   27   SEQ ID NO：8732   0.35％   5.6
  12   41   SEQ ID NO：8733   0.35％   5.6
  13   57   SEQ ID NO：8734   0.31％   5
  14   17   SEQ ID NO：8735   0.25％   4
  15   29   SEQ ID NO：8736   0.25％   4
  16   64   SEQ ID NO：8737   0.25％   4
  17   16   SEQ ID NO：8738   0.22％   3.6
  18   10   SEQ ID NO：8739   0.18％   3
  19   13   SEQ ID NO：8740   0.18％   2.88
  20   23   SEQ ID NO：8741   0.08％   1.4
                                          HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   19   SEQ ID NO：8742   0.03％   1310.8823136
  2   15   SEQ ID NO：8743   0.02％   1082.4143022
  3   16   SEQ ID NO：8744   0.02％   1040.33238624
  4   49   SEQ ID NO：8745   0.00％   382.536
  5   25   SEQ ID NO：8746   0.00％   342.863529264
  6   56   SEQ ID NO：8747   0.00％   63.28397376
  7   12   SEQ ID NO：8748   0.00％   40.19736105
  8   10   SEQ ID NO：8749   0.00％   21.3624
  9   22   SEQ ID NO：8750   0.00％   19.7762418
  10   26   SEQ ID NO：8751   0.00％   12.6684
  11   20   SEQ ID NO：8752   0.00％   11.544666
  12   37   SEQ ID NO：8753   0.00％   10.4328
  13   32   SEQ ID NO：8754   0.00％   8.4456
  14   23   SEQ ID NO：8755   0.00％   6.2888049
  15   47   SEQ ID NO：8756   0.00％   6.0858
  16   3   SEQ ID NO：8757   0.00％   4.582929078
  17   18   SEQ ID NO：8758   0.00％   4.4855150505
  18   28   SEQ ID NO：8759   0.00％   4.2923589
  19   62   SEQ ID NO：8760   0.00％   2.88098391
  20   27   SEQ ID NO：8761   0.00％   1.699677
                                              HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   17   SEQ ID NO：8762   0.16％   6459.14167272
  2   19   SEQ ID NO：8763   0.01％   607.88448
  3   25   SEQ ID NO：8764   0.00％   126.83304
  4   11   SEQ ID NO：8765   0.00％   63.16728165
  5   15   SEQ ID NO：8766   0.00％   53.54651988
  6   37   SEQ ID NO：8767   0.00％   28.51632
  7   14   SEQ ID NO：8768   0.00％   21.8247414
  8   29   SEQ ID NO：8769   0.00％   21.3624
  9   26   SEQ ID NO：8770   0.00％   19.42488
  10   3   SEQ ID NO：8771   0.00％   17.2167282
  11   48   SEQ ID NO：8772   0.00％   15.7068219
  12   12   SEQ ID NO：8773   0.00％   9.8581266
  13   27   SEQ ID NO：8774   0.00％   7.3086111
  14   39   SEQ ID NO：8775   0.00％   7.10976
  15   23   SEQ ID NO：8776   0.00％   5.7419523
  16   22   SEQ ID NO：8777   0.00％   4.599126
  17   45   SEQ ID NO：8778   0.00％   2.5495155
  18   31   SEQ ID NO：8779   0.00％   2.52747
  19   52   SEQ ID NO：8780   0.00％   2.383605
  20   20   SEQ ID NO：8781   0.00％   2.332847151
                                       HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   44   SEQ ID NO：8782   3.33％   1.2
                        HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
                                      HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   3   SEQ ID NO：8783   0.37％   20
  2   12   SEQ ID NO：8784   0.37％   20
  3   22   SEQ ID NO：8785   0.37％   20
  4   56   SEQ ID NO：8786   0.37％   20
  5   30   SEQ ID NO：8787   0.22％   12
  6   9   SEQ ID NO：8788   0.07％   4
  7   10   SEQ ID NO：8789   0.07％   4
  8   19   SEQ ID NO：8790   0.07％   4
  9   25   SEQ ID NO：8791   0.07％   4
  10   28   SEQ ID NO：8792   0.07％   4
  11   42   SEQ ID NO：8793   0.07％   4
  12   65   SEQ ID NO：8794   0.07％   4
  13   35   SEQ ID NO：8795   0.05％   3
  14   66   SEQ ID NO：8796   0.02％   1.2
  15   15   SEQ ID NO：8797   0.01％   1
  16   47   SEQ ID NO：8798   0.01％   1
  17   20   SEQ ID NO：8799   0.01％   0.6
  18   23   SEQ ID NO：8800   0.00％   0.5
  19   27   SEQ ID NO：8801   0.00％   0.5
                                              HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   27   SEQ ID NO：8802   0.37％   20
  2   8   SEQ ID NO：8803   0.07％   4
  3   9   SEQ ID NO：8804   0.07％   4
  4   11   SEQ ID NO：8805   0.07％   4
  5   17   SEQ ID NO：8806   0.07％   4
  6   29   SEQ ID NO：8807   0.07％   4
  7   41   SEQ ID NO：8808   0.07％   4
  8   52   SEQ ID NO：8809   0.07％   4
  9   64   SEQ ID NO：8810   0.07％   4
  10   65   SEQ ID NO：8811   0.07％   4
  11   3   SEQ ID NO：8812   0.03％   2
  12   23   SEQ ID NO：8813   0.03％   2
  13   21   SEQ ID NO：8814   0.02％   1.2
  14   15   SEQ ID NO：8815   0.01％   1
  15   35   SEQ ID NO：8816   0.01％   0.6
  16   39   SEQ ID NO：8817   0.01％   0.6
  17   12   SEQ ID NO：8818   0.00％   0.5
  18   22   SEQ ID NO：8819   0.00％   0.5
  19   45   SEQ ID NO：8820   0.00％   0.5
表20：SEQ ID NO：6046的表位
                                                HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   186   SEQ ID NO：8821   2.22％   125
  2   156   SEQ ID NO：8822   0.88％   50
  3   14   SEQ ID NO：8823   0.08％   4.5
  4   0   SEQ ID NO：8824   0.04％   2.5
  5   29   SEQ ID NO：8825   0.04％   2.5
  6   85   SEQ ID NO：8826   0.04％   2.5
  7   168   SEQ ID NO：8827   0.04％   2.5
  8   133   SEQ ID NO：8828   0.02％   1.35
  9   111   SEQ ID NO：8829   0.02％   1.125
  10   61   SEQ ID NO：8830   0.01％   1
  11   7   SEQ ID NO：8831   0.01％   0.9
  12   131   SEQ ID NO：8832   0.01％   0.9
  13   211   SEQ ID NO：8833   0.01％   0.625
  14   4   SEQ ID NO：8834   0.00％   0.5
  15   43   SEQ ID NO：8835   0.00％   0.5
  16   95   SEQ ID NO：8836   0.00％   0.5
  17   136   SEQ ID NO：8837   0.00％   0.5
                                      HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   133   SEQ ID NO：8838   0.04％   2.7
  2   84   SEQ ID NO：8839   0.04％   2.5
  3   167   SEQ ID NO：8840   0.04％   2.5
  4   186   SEQ ID NO：8841   0.04％   2.5
  5   131   SEQ ID NO：8842   0.04％   2.25
  6   14   SEQ ID NO：8843   0.03％   1.8
  7   205   SEQ ID NO：8844   0.02％   1.25
  8   111   SEQ ID NO：8845   0.02％   1.125
  9   60   SEQ ID NO：8846   0.01％   1
  10   188   SEQ ID NO：8847   0.01％   0.75
  11   211   SEQ ID NO：8848   0.01％   0.625
  12   26   SEQ ID NO：8849   0.00％   0.5
  13   94   SEQ ID NO：8850   0.00％   0.5
  14   135   SEQ ID NO：8851   0.00％   0.5
  15   168   SEQ ID NO：8852   0.00％   0.5
                                               HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   43   SEQ ID NO：8853   0.24％   30
  2   90   SEQ ID NO：8854   0.14％   18
  3   148   SEQ ID NO：8855   0.09％   12
  4   4   SEQ ID NO：8856   0.05％   6.75
  5   24   SEQ ID NO：8857   0.04％   6
  6   19   SEQ ID NO：8858   0.04％   5.4
  7   136   SEQ ID NO：8859   0.04％   5.4
  8   54   SEQ ID NO：8860   0.03％   4.5
  9   32   SEQ ID NO：8861   0.03％   4
  10   14   SEQ ID NO：8862   0.02％   3.6
  11   59   SEQ ID NO：8863   0.02％   3.6
  12   88   SEQ ID NO：8864   0.02％   3
  13   87   SEQ ID NO：8865   0.02％   2.7
  14   29   SEQ ID NO：8866   0.01％   L 8
  15   48   SEQ ID NO：8867   0.01％   1.8
  16   115   SEQ ID NO：8868   0.01％   1.8
  17   186   SEQ ID NO：8869   0.01％   1.8
  18   106   SEQ ID NO：8870   0.01％   1.5
  19   53   SEQ ID NO：8871   0.01％   1.35
  20   173   SEQ ID NO：8872   0.00％   1.2
                                          HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   24   SEQ ID NO：8873   0.22％   27
  2   54   SEQ ID NO：8874   0.18％   22.5
  3   135   SEQ ID NO：8875   0.08％   10.8
  4   51   SEQ ID NO：8876   0.07％   9
  5   13   SEQ ID NO：8877   0.06％   8.1
  6   26   SEQ ID NO：8878   0.04％   6
  7   31   SEQ ID NO：8879   0.04％   6
  8   90   SEQ ID NO：8880   0.04％   6
  9   43   SEQ ID NO：8881   0.03％   4.5
  10   19   SEQ ID NO：8882   0.03％   4.05
  11   169   SEQ ID NO：8883   0.02％   3
  12   87   SEQ ID NO：8884   0.02％   2.7
  13   84   SEQ ID NO：8885   0.01％   1.8
  14   88   SEQ ID NO：8886   0.01％   1.8
  15   94   SEQ ID NO：8887   0.01％   1.8
  16   64   SEQ ID NO：8888   0.00％   1.2
  17   131   SEQ ID NO：8889   0.00％   1.2
  18   99   SEQ ID NO：8890   0.00％   1
  19   53   SEQ ID NO：8891   0.00％   0.9
  20   85   SEQ ID NO：8892   0.00％   0.9
                                           HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   196   SEQ ID NO：8893   27.55％   440
  2   44   SEQ ID NO：8894   18.78％   300
  3   36   SEQ ID NO：8895   12.52％   200
  4   92   SEQ ID NO：8896   12.52％   200
  5   109   SEQ ID NO：8897   2.70％   43.2
  6   25   SEQ ID NO：8898   1.87％   30
  7   93   SEQ ID NO：8899   1.12％   18
  8   12   SEQ ID NO：8900   0.75％   12
  9   123   SEQ ID NO：8901   0.70％   11.2
  10   7   SEQ ID NO：8902   0.64％   10.368
  11   17   SEQ ID NO：8903   0.52％   8.4
  12   139   SEQ ID NO：8904   0.52％   8.4
  13   193   SEQ ID NO：8905   0.46％   7.5
  14   6   SEQ ID NO：8906   0.45％   7.2
  15   19   SEQ ID NO：8907   0.45％   7.2
  16   110   SEQ ID NO：8908   0.45％   7.2
  17   114   SEQ ID NO：8909   0.45％   7.2
  18   210   SEQ ID NO：8910   0.45％   7.2
  19   46   SEQ ID NO：8911   0.42％   6.72
  20   52 SEQ ID NO：8912 0.37％   6
                                  HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   92   SEQ ID NO：8913   7.51％   120
  2   42   SEQ ID NO：8914   2.63％   42
  3   109   SEQ ID NO：8915   2.25％   36
  4   23   SEQ ID NO：8916   1.87％   30
  5   34   SEQ ID NO：8917   0.75％   12
  6   6   SEQ ID NO：8918   0.64％   10.368
  7   45   SEQ ID NO：8919   0.63％   10.08
  8   196   SEQ ID NO：8920   0.62％   10
  9   44   SEQ ID NO：8921   0.56％   9
  10   40   SEQ ID NO：8922   0.55％   8.8
  11   62   SEQ ID NO：8923   0.46％   7.5
  12   193   SEQ ID NO：8924   0.46％   7.5
  13   18   SEQ ID NO：8925   0.45％   7.2
  14   113   SEQ ID NO：8926   0.45％   7.2
  15   56   SEQ ID NO：8927   0.37％   6
  16   176   SEQ ID NO：8928   0.37％   6
  17   16   SEQ ID NO：8929   0.35％   5.6
  18   138   SEQ ID NO：8930   0.35％   5.6
  19   127   SEQ ID NO：8931   0.33％   5.28
  20   36   SEQ ID NO：8932   0.31％   5
                                             HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   13   SEQ ID NO：8933   0.04％   1793.676528
  2   87   SEQ ID NO：8934   0.03％   1415.3832
  3   24   SEQ ID NO：8935   0.01％   618.0996816
  4   19   SEQ ID NO：8936   0.00％   223.23708
  5   12   SEQ ID NO：8937   0.00％   210.36400875
  6   51   SEQ ID NO：8938   0.00％   198.30859992
  7   53   SEQ ID NO：8939   0.00％   194.477328
  8   88   SEQ ID NO：8940   0.00％   180.58536756
  9   106   SEQ ID NO：8941   0.00％   169.74828
  10   54   SEQ ID NO：8942   0.00％   70.09848
  11   59   SEQ ID NO：8943   0.00％   43.42032
  12   94   SEQ ID NO：8944   0.00％   41.792058
  13   20   SEQ ID NO：8945   0.00％   37.46088108
  14   63   SEQ ID NO：8946   0.00％   35.73520902
  15   22   SEQ ID NO：8947   0.00％   20.5916435109
  16   47   SEQ ID NO：8948   0.00％   12.233222865
  17   66   SEQ ID NO：8949   0.00％   12.2199
  18   56   SEQ ID NO：8950   0.00％   11.486706
  19   67   SEQ ID NO：8951   0.00％   6.416172
  20   117   SEQ ID NO：8952   0.00％   5.827464
                                           HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   43   SEQ ID NO：8953   0.10％   3977.8497792
  2   24   SEQ ID NO：8954   0.02％   836.2525104
  3   51   SEQ ID NO：8955   0.02％   815.616432
  4   49   SEQ ID NO：8956   0.01％   660.3245145
  5   19   SEQ ID NO：8957   0.00％   251.837856
  6   59   SEQ ID NO：8958   0.00％   159.9696
  7   12   SEQ ID NO：8959   0.00％   155.245377
  8   45   SEQ ID NO：8960   0.00％   141.1974531
  9   21   SEQ ID NO：8961   0.00％   117.22672269
  10   53   SEQ ID NO：8962   0.00％   84.55536
  11   87   SEQ ID NO：8963   0.00％   65.5671672
  12   13   SEQ ID NO：8964   0.00％   64.88888616
  13   153   SEQ ID NO：8965   0.00％   49.13352
  14   178   SEQ ID NO：8966   0.00％   26.082
  15   18   SEQ ID NO：8967   0.00％   24.802259691
  16   116   SEQ ID NO：8968   0.00％   21.5616168
  17   65   SEQ ID NO：8969   0.00％   20.77383
  18   86   SEQ ID NO：8970   0.00％   15.7068219
  19   27   SEQ ID NO：8971   0.00％   12.3159135
  20   46   SEQ ID NO：8972   0.00％   11.45624789925
                                     HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4   SEQ ID NO：8973   12.5％   4.5
  2   136   SEQ ID NO：8974   3.33％   1.2
  3   156   SEQ ID NO：8975   3.33％   1.2
  4   140   SEQ ID NO：8976   1.66％   0.6
                                     HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   169   SEQ ID NO：8977   5.55％   2
  2   94   SEQ ID NO：8978   3.33％   1.2
               HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   146   SEQ ID NO：8979   0.74％   40
  2   154   SEQ ID NO：8980   0.74％   40
  3   80   SEQ ID NO：8981   0.66％   36
  4   139   SEQ ID NO：8982   0.33％   18
  5   83   SEQ ID NO：8983   0.22％   12
  6   209   SEQ ID NO：8984   0.22％   12
  7   7   SEQ ID NO：8985   0.11％   6
  8   3   SEQ ID NO：8986   0.07％   4
  9   6   SEQ ID NO：8987   0.07％   4
  10   12   SEQ ID NO：8988   0.07％   4
  11   19   SEQ ID NO：8989   0.07％   4
  12   24   SEQ ID NO：8990   0.07％   4
  13   38   SEQ ID NO：8991   0.07％   4
  14   46   SEQ ID NO：8992   0.07％   4
  15   56   SEQ ID NO：8993   0.07％   4
  16   110   SEQ ID NO：8994   0.07％   4
  17   114   SEQ ID NO：8995   0.07％   4
  18   123   SEQ ID NO：8996   0.07％   4
  19   129   SEQ ID NO：8997   0.07％   4
  20   166   SEQ ID NO：8998   0.07％   4
                                          HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   56   SEQ ID NO：8999   1.48％   80
  2   40   SEQ ID NO：9000   0.74％   40
  3   127   SEQ ID NO：9001   0.74％   40
  4   170   SEQ ID NO：9002   0.74％   40
  5   140   SEQ ID NO：9003   0.27％   15
  6   35   SEQ ID NO：9004   0.22％   12
  7   79   SEQ ID NO：9005   0.22％   12
  8   82   SEQ ID NO：9006   0.22％   12
  9   208   SEQ ID NO：9007   0.22％   12
  10   209   SEQ ID NO：9008   0.22％   12
  11   80   SEQ ID NO：9009   0.16％   9
  12   129   SEQ ID NO：9010   0.14％   8
  13   138   SEQ ID NO：9011   0.11％   6
  14   73   SEQ ID NO：9012   0.09％   5
  15   2   SEQ ID NO：9013   0.07％   4
  16   5   SEQ ID NO：9014   0.07％   4
  17   6   SEQ ID NO：9015   0.07％   4
  18   16   SEQ ID NO：9016   0.07％   4
  19   18   SEQ ID NO：9017   0.07％   4
  20   24   SEQ ID NO：9018   0.07％   4
表21：SEQ ID NO：6047的表位
                                            HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   53   SEQ ID NO：9019   2％   112.5
  2   10   SEQ ID NO：9020   0.08％   4.5
  3   33   SEQ ID NO：9021   0.02％   1.5
  4   3   SEQ ID NO：9022   0.00％   0.5
  5   27   SEQ ID NO：9023   0.00％   0.5
  6   29   SEQ ID NO：9024   0.00％   0.5
                                         HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   10   SEQ ID NO：9025   0.8％   45
  2   52   SEQ ID NO：9026   0.2％   11.25
  3   50   SEQ ID NO：9027   0.04％   2.5
  4   32   SEQ ID NO：9028   0.02％   1.5
  5   48   SEQ ID NO：9029   0.02％   1.35
  6   27   SEQ ID NO：9030   0.00％   0.5
                                              HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   38   SEQ ID NO：9031   1.85％   225
  2   17   SEQ ID NO：9032   0.02％   3.6
  3   2   SEQ ID NO：9033   0.02％   2.7
  4   37   SEQ ID NO：9034   0.01％   1.8
  5   27   SEQ ID NO：9035   0.01％   1.35
  6   13   SEQ ID NO：9036   0.00％   0.675
  7   14   SEQ ID NO：9037   0.00％   0.6
HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   13   SEQ ID NO：9038   0.04％   6
  2   37   SEQ ID NO：9039   0.01％   2.025
  32   SEQ ID NO：9040   0.00％   0.9
  419   SEQ ID NO：9041   0.00％   0.675
  516   SEQ ID NO：9042   0.00％   0.54
                                           HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   20   SEQ ID NO：9043   1.25％   20
  2   6   SEQ ID NO：9044   0.52％   8.4
  3   5   SEQ ID NO：9045   0.51％   8.25
  4   35   SEQ ID NO：9046   0.36％   5.76
  5   31   SEQ ID NO：9047   0.35％   5.6
  6   43   SEQ ID NO：9048   0.27％   4.4
  7   13   SEQ ID NO：9049   0.26％   4.2
  8   32   SEQ ID NO：9050   0.21％   3.36
  9   2   SEQ ID NO：9051   0.11％   1.8
  10   9   SEQ ID NO：9052   0.10％   1.68
  11   8   SEQ ID NO：9053   0.09％   1.5
  12   15   SEQ ID NO：9054   0.09％   1.5
  13   23   SEQ ID NO：9055   0.09％   1.5
  14   27   SEQ ID NO：9056   0.08％   1.4
  15   24   SEQ ID NO：9057   0.07％   1.2
  16   7   SEQ ID NO：9058   0.06％   1
  17   17   SEQ ID NO：9059   0.06％   1
  18   10   SEQ ID NO：9060   0.05％   0.9
  19   39   SEQ ID NO：9061   0.04％   0.792
  20   47   SEQ ID NO：9062   0.04％   0.792
                                               HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   5   SEQ ID NO：9063   2.63％   42
  2   34   SEQ ID NO：9064   0.54％   8.64
  3   30   SEQ ID NO：9065   0.52％   8.4
  4   19   SEQ ID NO：9066   0.50％   8
  5   50   SEQ ID NO：9067   0.33％   5.28
  6   12   SEQ ID NO：9068   0.26％   4.2
  7   31   SEQ ID NO：9069   0.21％   3.36
  8   26   SEQ ID NO：9070   0.15％   2.52
  9   8   SEQ ID NO：9071   0.13％   2.1
  10   22   SEQ ID NO：9072   0.12％   2
  11   23   SEQ ID NO：9073   0.11％   1.8
  12   6   SEQ ID NO：9074   0.09％   1.5
  13   14   SEQ ID NO：9075   0.09％   1.5
  14   16   SEQ ID NO：9076   0.09％   1.5
  15   7   SEQ ID NO：9077   0.06％   1
  16   48   SEQ ID NO：9078   0.04％   0.75
  17   0   SEQ ID NO：9079   0.04％   0.72
  18   9   SEQ ID NO：9080   0.04％   0.72
  19   47   SEQ ID NO：9081   0.04％   0.66
  20   39   SEQ ID NO：9082   0.03％   0.6
                                           HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   15   SEQ ID NO：9083   0.00％   14.1442686
  2   27   SEQ ID NO：9084   0.00％   9.598176
  3   22   SEQ ID NO：9085   0.00％   9.5634
  4   9   SEQ ID NO：9086   0.00％   5.546246013
  5   2   SEQ ID NO：9087   0.00％ 5.526462816
  6   24   SEQ ID NO：9088   0.00％   4.88163753
  7   17   SEQ ID NO：9089   0.00％   3.699285408
  8   31   SEQ ID NO：9090   0.00％   2.29699206
  9   6   SEQ ID NO：9091   0.00％   2.0016040674
  10   7   SEQ ID NO：9092   0.00％   0.91287
  11   49   SEQ ID NO：9093   0.00％   0.71805678
  12   16   SEQ ID NO：9094   0.00％   0.6694257042
  13   12   SEQ ID NO：9095   0.00％   0.6539828625
                                     HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   16   SEQ ID NO：9096   0.00％   34.28765802
  2   19   SEQ ID NO：9097   0.00％   18.9368775
  3   14   SEQ ID NO：9098   0.00％   14.1442686
  4   27   SEQ ID NO：9099   0.00％   11.406528
  5   26   SEQ ID NO：9100   0.00％   10.9304361558
  6   34   SEQ ID NO：9101   0.00％   5.580927
  7   6   SEQ ID NO：9102   0.00％   4.865742
  8   9   SEQ ID NO：9103   0.00％   2.64106953
  9   50   SEQ ID NO：9104   0.00％   2.6275752
  10   30   SEQ ID NO：9105   0.00％   2.29699206
  11   7   SEQ ID NO：9106   0.00％   0.86083641
  12   42   SEQ ID NO：9107   0.00％   0.7049592
  13   22   SEQ ID NO：9108   0.00％   0.6628440357
  14   2   SEQ ID NO：9109   0.00％   0.6530644656
                                            HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   37   SEQ ID NO：9110   15％   5.4
  2   38   SEQ ID NO：9111   2.22％   0.8
                                     HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
1 37 SEQ ID NO：9112   7.5％   2.7
                                             HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   35   SEQ ID NO：9113   3.70％   200
  2   17   SEQ ID NO：9114   0.11％   6
  3   6   SEQ ID NO：9115   0.07％   4
  4   20   SEQ ID NO：9116   0.07％   4
  5   31   SEQ ID NO：9117   0.07％   4
  6   43   SEQ ID NO：9118   0.07％   4
  7   7   SEQ ID NO：9119   0.03％   2
  8   23   SEQ ID NO：9120   0.02％   1.2
  9   24   SEQ ID NO：9121   0.02％   1.2
  10   10   SEQ ID NO：9122   0.01％   0.9
                                   HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   35   SEQ ID NO：9123   0.09％   5
  2   19   SEQ ID NO：9124   0.07％   4
  3   30   SEQ ID NO：9125   0.07％   4
  4   34   SEQ ID NO：9126   0.07％   4
  5   7   SEQ ID NO：9127   0.03％   2
  6   16   SEQ ID NO：9128   0.03％   1.8
  7   23   SEQ ID NO：9129   0.02％   1.2
  8   50   SEQ ID NO：9130   0.02％   1.2
  9   9   SEQ ID NO：9131   0.01％   1
表22：SEQ ID NO：6048的表位
                                         HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   66   SEQ ID NO：9132   0.44％   25
  2   80   SEQ ID NO：9133   0.08％   5
  3   93   SEQ ID NO：9134   0.04％   2.7
  4   11   SEQ ID NO：9135   0.04％   2.5
  5   89   SEQ ID NO：9136   0.04％   2.25
  6   48   SEQ ID NO：9137   0.01％   1
  7   3   SEQ ID NO：9138   0.00％   0.5
  8   9   SEQ ID NO：9139   0.00％   0.5
  9   56   SEQ ID NO：9140   0.00％   0.5
  10   101   SEQ ID NO：9141   0.00％   0.5
  11   106   SEQ ID NO：9142   0.00％   0.5
  12   110   SEQ ID NO：9143   0.00％   0.5
                                          HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   30   SEQ ID NO：9144   0.4％   22.5
  2   88   SEQ ID NO：9145   0.12％   6.75
  3   48   SEQ ID NO：9146   0.04％   2.5
  4   55   SEQ ID NO：9147   0.02％   1.25
  5   13   SEQ ID NO：9148   0.01％   0.9
  6   79   SEQ ID NO：9149   0.01％   0.75
  7   93   SEQ ID NO：9150   0.01％   0.675
  8   2   SEQ ID NO：9151   0.00％   0.5
  9   8   SEQ ID NO：9152   0.00％   0.5
  10   65   SEQ ID NO：9153   0.00％   0.5
  11   66   SEQ ID NO：9154   0.00％   0.5
  12   80   SEQ ID NO：9155   0.00％   0.5
  13   105   SEQ ID NO：9156   0.00％   0.5
  14   109   SEQ ID NO：9157   0.00％   0.5
                                         HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   109   SEQ ID NO：9158   0.74％   90
  2   3   SEQ ID N0：9159   0.24％   30
  3   111   SEQ ID NO：9160   0.12％   15
  4   106   SEQ ID NO：9161   0.07％   9
  5   95   SEQ ID NO：9162   0.05％   6.075
  6   101   SEQ ID NO：9163   0.04％   6
  7   110   SEQ ID NO：9164   0.02％   3.6
  8   84   SEQ ID NO：9165   0.02％   3
  9   80   SEQ ID NO：9166   0.02％   2.7
  10   37   SEQ ID NO：9167   0.01％   2.25
  11   9   SEQ ID NO：9168   0.01％   2
  12   54   SEQ ID NO：9169   0.01％   2
  13   99   SEQ ID NO：9170   0.01％   1.35
  14   1   SEQ ID NO：9171   0.01％   1.215
  15   11   SEQ ID NO：9172   0.00％   0.9
  16   15   SEQ ID NO：9173   0.00％   0.9
  17   69   SEQ ID NO：9174   0.00％   0.6
  18   5   SEQ ID NO：9175   0.00％   0.54
  19   103   SEQ ID NO：9176   0.00％   0.54
                                           HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   75   SEQ ID NO：9177   0.49％   60
  2   109   SEQ ID NO：9178   0.29％   36
  3   22   SEQ ID NO：9179   0.14％   18
  4   15   SEQ ID NO：9180   0.04％   6
  5   110   SEQ ID NO：9181   0.01％   2.25
  6   95   SEQ ID NO：9182   0.01％   1.8
  7   101   SEQ ID NO：9183   0.01％   1.35
  8   43   SEQ ID NO：9184   0.00％   1
  9   2   SEQ ID NO：9185   0.00％   0.9
  10   5   SEQ ID NO：9186   0.00％   0.9
  11   7   SEQ ID NO：9187   0.00％   0.9
  12   107   SEQ ID NO：9188   0.00％   0.9
  13   102   SEQ ID NO：9189   0.00％   0.81
  14   3   SEQ ID NO：9190   0.00％   0.75
  15   8   SEQ ID NO：9191   0.00％   0.6
  16   103   SEQ ID NO：9192   0.00％   0.54
                                     HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   88   SEQ ID NO：9193   1.66％   26.6112
  2   77   SEQ ID NO：9194   0.77％   12.32
  3   18   SEQ ID NO：9195   0.56％   9
  4   108   SEQ ID NO：9196   0.56％   9
  5   92   SEQ ID NO：9197   0.54％   8.64
  6   96   SEQ ID NO：9198   0.54％   8.64
  7   73   SEQ ID N0：9199   0.46％   7.5
  8   40   SEQ ID NO：9200   0.45％   7.2
  9   104   SEQ ID NO：9201   0.42％   6.72
  10   8   SEQ ID NO：9202   0.41％   6.6
  11   21   SEQ ID NO：9203   0.37％   6
  12   102   SEQ ID NO：9204   0.37％   6
  13   22   SEQ ID NO：9205   0.25％   4
  14   68   SEQ ID NO：9206   0.25％   4
  15   106   SEQ ID NO：9207   0.22％   3.6
  16   1   SEQ ID NO：9208   0.18％   3
  17   79   SEQ ID NO：9209   0.18％   3
  18   93   SEQ ID NO：9210   0.18％   3
  19   101   SEQ ID NO：9211   0.18   3
  20   37   SEQ ID NO：9212   0.15％   2.4
                                             HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   100   SEQ ID NO：9213   0.93％   15
  2   18   SEQ ID NO：9214   0.78％   12.6
  3   98   SEQ ID NO：9215   0.52％   8.4
  4   73   SEQ ID NO：9216   0.46％   7.5
  5   91   SEQ ID NO：9217   0.45％   7.2
  6   103   SEQ ID NO：9218   0.42％   6.72
  7   7   SEQ ID NO：9219   0.41％   6.6
  8   21   SEQ ID NO：9220   0.37％   6
  9   46   SEQ ID NO：9221   0.37％   6
  10   93   SEQ ID NO：9222   0.37％   6
  11   96   SEQ ID NO：9223   0.37％   6
  12   101   SEQ ID NO：9224   0.37％   6
  13   77   SEQ ID NO：9225   0.25％   4
  14   92   SEQ ID NO：9226   0.22％   3.6
  15   105   SEQ ID NO：9227   0.22％   3.6
  16   2   SEQ ID NO：9228   0.18％   3
  17   53   SEQ ID NO：9229   0.18％   3
  18   36   SEQ ID NO：9230   0.12％   2
  19   55   SEQ ID NO：9231   0.12％   2
  20   102   SEQ ID NO：9232   0.11％   1.8
  HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   84   SEQ ID NO：9233   0.01％   441.342216
  2   102   SEQ ID NO：9234   0.00％   63.16728165
  3   107   SEQ ID NO：9235   0.00％   51.882640425
  4   1   SEQ ID NO：9236   0.00％   43.8816609
  5   95   SEQ ID NO：9237   0.00％   33.40165248
  6   2   SEQ ID NO：9238   0.00％   24.66305226
  7   92   SEQ ID NO：9239   0.00％   22.64458905
  8   103   SEQ ID NO：9240   0.00％   20.70206586
  9   47   SEQ ID NO：9241   0.00％   11.175953184
  10   94   SEQ ID NO：9242   0.00％   8.452983
  11   15   SEQ ID NO：9243   0.00％   8.1793152
  12   8   SEQ ID NO：9244   0.00％   4.993461
  13   5   SEQ ID NO：9245   0.00％   4.57284528
  14   99   SEQ ID NO：9246   0.00％   3.999468528
  15   105   SEQ ID NO：9247   0.00％   2.231322
  16   20   SEQ ID NO：9248   0.00％   1.3524
  17   62   SEQ ID NO：9249   0.00％   0.8631693
  18   6   SEQ ID NO：9250   0.00％   0.824619
  19   57   SEQ ID NO：9251   0.00％   0.72105
  20   58   SEQ ID NO：9252   0.00％   0.7147572
                                   HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   101   SEQ ID NO：9253   0.03％   1243.078056
  2   3   SEQ ID NO：9254   0.01％   592.944462
  3   106   SEQ ID NO：9255   0.00％   94.2678
  4   5   SEQ ID NO：9256   0.00％   43.42032
  5   107   SEQ ID NO：9257   0.00％   33.30332334
  6   102   SEQ ID NO：9258   0.00％   32.53181778
  7   54   SEQ ID NO：9259   0.00％   27.324
  8   7   SEQ ID NO：9260   0.00％   21.3624
  9   1   SEQ ID NO：9261   0.00％   13.723479
  10   95   SEQ ID N0：9262   0.00％   13.00344192
  11   94   SEQ ID NO：9263   0.00％   10.01276388
  12   99   SEQ ID NO：9264   0.00％   5.6615328
  13   39   SEQ ID NO：9265   0.00％   3.6304212
  14   111   SEQ ID NO：9266   0.00％   2.53368
  15   103   SEQ ID NO：9267   0.00％   2.475394803
  16   14   SEQ ID NO：9268   0.00％   2.4519012
  17   19   SEQ ID NO：9269   0.00％   2.07604992
  18   29   SEQ ID NO：9270   0.00％   1.8179154
  19   57   SEQ ID NO：9271   0.00％   1.52076
  20   47   SEQ ID NO：9272   0.00％   1.27712376
                                  HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   80   SEQ ID NO：9273   3.33％   1.2
  2   69   SEQ ID NO：9274   1.66％   0.6
  3   109   SEQ ID NO：9275   1.66％   0.6
                                       HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   22   SEQ ID NO：9276   11.11％   4
                                              HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   22   SEQ ID NO：9277   3.70％   200
  2   77   SEQ ID NO：9278   2.22％   120
  3   104   SEQ ID NO：9279   0.22％   12
  4   40   SEQ ID NO：9280   0.11％   6
  5   8   SEQ ID NO：9281   0.07％   4
  6   21   SEQ ID NO：9282   0.07％   4
  7   68   SEQ ID NO：9283   0.07％   4
  8   92   SEQ ID NO：9284   0.07％   4
  9   102   SEQ ID NO：9285   0.07％   4
  10   46   SEQ ID NO：9286   0.03％   2
  11   98   SEQ ID NO：9287   0.03％   2
  12   103   SEQ ID NO：9288   0.03％   2
  13   88   SEQ ID NO：9289   0.02％   1.2
  14   105   SEQ ID NO：9290   0.01％   0.9
  15   43   SEQ ID NO：9291   0.01％   0.6
  16   79   SEQ ID NO：9292   0.01％   0.6
  17   95   SEQ ID NO：9293   0.01％   0.6
  18   107   SEQ ID NO：9294   0.00％   0.5
                          HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   46   SEQ ID NO：9295   1.48％   80
  2   98   SEQ ID NO：9296   1.48％   80
  3   91   SEQ ID NO：9297   0.37％   20
  4   103   SEQ ID NO：9298   0.37％   20
  5   7   SEQ ID NO：9299   0.07％   4
  6   21   SEQ ID NO：9300   0.07％   4
  7   101   SEQ ID NO：9301   0.07％   4
  8   107   SEQ ID NO：9302   0.03％   2
  9   67   SEQ ID NO：9303   0.02％   1.2
  10   93   SEQ ID NO：9304   0.02％   1.2
  11   69   SEQ ID NO：9305   0.01％   1
  12   39   SEQ ID NO：9306   0.01％   0.6
  13   77   SEQ ID NO：9307   0.01％   0.6
  14   22   SEQ ID NO：9308   0.00％   0.5
表23：SEQ ID NO：6049的表位
                                      HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   0   SEQ ID NO：9309   0.2％   11.25
  2   35   SEQ ID NO：9310   0.01％   0.9
  3   4   SEQ ID NO：9311   0.00％   0.5
  4   5   SEQ ID NO：9312   0.00％   0.5
  5   10   SEQ ID NO：9313   0.00％   0.5
  6   19   SEQ ID NO：9314   0.00％   0.5
  7   21   SEQ ID NO：9315   0.00％   0.5
                                           HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   0   SEQ ID NO：9316   0.2％   11.25
  2   5   SEQ ID NO：9317   0.04％   2.5
  3   33   SEQ ID NO：9318   0.02％   1.5
  4   3   SEQ ID NO：9319   0.02％   1.25
  5   9   SEQ ID NO：9320   0.00％   0.5
  6   18   SEQ ID NO：9321   0.00％   0.5
  7   20   SEQ ID NO：9322   0.00％   0.5
                                HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4   SEQ ID NO：9323   0.14％   18
  2   16   SEQ ID NO：9324   0.11％   13.5
  3   23   SEQ ID NO：9325   0.06％   8.1
  4   18   SEQ ID NO：9326   0.03％   4.05
  5   21   SEQ ID NO：9327   0.01％   2.025
  6   9   SEQ ID NO：9328   0.01％   1.8
  7   15   SEQ ID NO：9329   0.01％   1.8
  8   25   SEQ ID NO：9330   0.01％   1.8
  9   12   SEQ ID NO：9331   0.00％   0.9
  10   19   SEQ ID NO：9332   0.00％   0.9
  11   20   SEQ ID NO：9333   0.00％   0.9
  12   2   SEQ ID NO：9334   0.00％   0.81
  13   22   SEQ ID NO：9335   0.00％   0.81
  14   10   SEQ ID NO：9336   0.00％   0.6
                                 HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   20   SEQ ID NO：9337   0.16％   20.25
  2   9   SEQ ID NO：9338   0.09％   12
  3   16   SEQ ID NO：9339   0.07％   9
  4   18   SEQ ID NO：9340   0.07％   9
  5   22   SEQ ID NO：9341   0.06％   8.1
  6   4   SEQ ID NO：9342   0.03％   4.05
  7   15   SEQ ID NO：9343   0.03％   4.05
  8   12   SEQ ID NO：9344   0.02％   3.6
  9   3   SEQ ID NO：9345   0.00％   0.9
  10   33   SEQ ID NO：9346   0.00％   0.6
  11   2   SEQ ID NO：9347   0.00％   0.54
  12   24   SEQ ID NO：9348   0.00％   0.54
                                  HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   8 SEQ ID NO：9349   18.78％   300
  2   11 SEQ ID NO：9350   1.87％   30
  3   28   SEQ ID NO：9351   1.50％   24
  4   7   SEQ ID NO：9352   0.75％   12
  5   17   SEQ ID NO：9353   0.56％   9
  6   14   SEQ ID NO：9354   0.46％   7.5
  7   23   SEQ ID NO：9355   0.37％   6
  8   13   SEQ ID NO：9356   0.36％   5.76
  9   2   SEQ ID NO：9357   0.35％   5.6
  10   16   SEQ ID NO：9358   0.35％   5.6
  11   9   SEQ ID NO：9359   0.30％   4.8
  12   21   SEQ ID NO：9360   0.26％   4.2
  13   5   SEQ ID NO：9361   0.25％   4
  14   4   SEQ ID NO：9362   0.22％   3.6
  15   0   SEQ ID NO：9363   0.18％   3
  16   19   SEQ ID NO：9364   0.18％   3
  17   10   SEQ ID NO：9365   0.15％   2.4
  18   18   SEQ ID NO：9366   0.13％   2.1
  19   25   SEQ ID NO：9367   0.06％   1.1
  20   15   SEQ ID NO：9368   0.05％   0.9
                                   HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   8   SEQ ID NO：9369   22.54％   360
  2   7   SEQ ID NO：9370   1.25％   20
  3   17   SEQ ID NO：9371   0.65％   10.5
  4   15   SEQ ID NO：9372   0.52％   8.4
  5   4   SEQ ID NO：9373   0.45％   7.2
  6   22   SEQ ID NO：9374   0.37％   6
  7   12   SEQ ID NO：9375   0.36％   5.76
  8   27   SEQ ID NO：9376   0.30％   4.8
  9   14   SEQ ID NO：9377   0.28％   4.5
  10   20   SEQ ID NO：9378   0.26％   4.2
  11   10   SEQ ID NO：9379   0.25％   4
  12   3   SEQ ID NO：9380   0.18％   3
  13   18   SEQ ID NO：9381   0.18％   3
  14   9   SEQ ID NO：9382   0.15％   2.4
  15   24   SEQ ID NO：9383   0.10％   1.65
  16   16   SEQ ID NO：9384   0.07％   1.2
  17   13   SEQ ID NO：9385   0.06％   1
  18   11   SEQ ID NO：9386   0.05％   0.9
  19   1   SEQ ID NO：9387   0.05％   0.84
                                        HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   12   SEQ ID NO：9388   0.10％   4267.988928
  2   23   SEQ ID NO：9389   0.03％   1360.69088544
  3   9   SEQ ID NO：9390   0.01％   569.948832
  4   16   SEQ ID NO：9391   0.00％   309.0498408
  5   15   SEQ ID NO：9392   0.00％   79.73570448
  6   2   SEQ ID NO：9393   0.00％   51.109542
  7   18   SEQ ID NO：9394   0.00％   45.25539984
  8   25   SEQ ID NO：9395   0.00％   34.28765802
  9   22   SEQ ID NO：9396   0.00％   26.532116325
  10   5   SEQ ID NO：9397   0.00％   25.26691266
  11   21   SEQ ID NO：9398   0.00％   4.72873208445
  12   11   SEQ ID NO：9399   0.00％   2.638538265
  13   8   SEQ ID NO：9400   0.00％   2.4274552038
  14   4   SEQ ID NO：9401   0.00％   1.7415324
  15   20   SEQ ID NO：9402   0.00％   1.6025526
  16   13   SEQ ID NO：9403   0.00％   1.453803297
  17   35   SEQ ID NO：9404   0.00％   1.36878336
  18   3   SEQ ID NO：9405   0.00％   0.824619
  19   33   SEQ ID NO：9406   0.00％   0.513774
                                        HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   22   SEQ ID NO：9407   0.09％   3636.068421648
  2   4   SEQ ID NO：9408   0.02％   1107.960876
  3   15   SEQ ID NO：9409   0.02％   836.2525104
  4   16   SEQ ID NO：9410   0.00％   150.9313176
  5   12   SEQ ID NO：9411   0.00％   76.55002416
  6   1   SEQ ID NO：9412   0.00％   49.0273014
  7   10   SEQ ID NO：9413   0.00％   42.1638414747
  8   20   SEQ ID NO：9414   0.00％   9.29480508
  9   24   SEQ ID NO：9415   0.00％   9.2669346
  10   13   SEQ ID NO：9416   0.00％   7.96581954
  11   21   SEQ ID NO：9417   0.00％   5.051306761875
  12   5   SEQ ID NO：9418   0.00％   2.6941464
  13   11   SEQ ID NO：9419   0.00％   2.3839914
  14   34   SEQ ID NO：9420   0.00％   1.465422
  15   2   SEQ ID NO：9421   0.00％   0.70794
  16   9   SEQ ID NO：9422   0.00％   0.6513048
  17   19   SEQID NO：9423   0.00％   0.51882640425
                               HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
                                       HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   33   SEQ ID NO：9424   1.66％   0.6
                                            HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   13   SEQ ID NO：9425   0.22％   12
  2   2   SEQ ID NO：9426   0.07％   4
  3   9   SEQ ID NO：9427   0.07％   4
  4   16   SEQ ID NO：9428   0.07％   4
  5   23   SEQ ID NO：9429   0.07％   4
  6   5   SEQ ID NO：9430   0.02％   1.2
  7   15   SEQ ID NO：9431   0.01％   1
                                       HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   4   SEQ ID NO：9432   0.07％   4
  2   10   SEQ ID NO：9433   0.07％   4
  3   12   SEQ ID NO：9434   0.07％   4
  4   15   SEQ ID NO：9435   0.07％   4
  5   22   SEQ ID NO：9436   0.07％   4
  6   13   SEQ ID NO：9437   0.02％   1.2
表24：SEQ ID NO：6050的表位
                                             HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   47   SEQ ID NO：9438   0.01％   0.75
  2   21   SEQ ID NO：9439   0.00％   0.5
  3   53   SEQ ID NO：9440   0.00％   0.5
                                         HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   16   SEQ ID NO：9441   0.04％   2.5
  2   71   SEQ ID NO：9442   0.04％   2.5
  3   47   SEQ ID NO：9443   0.02％   1.5
  4   62   SEQ ID NO：9444   0.01％   0.9
  5   20   SEQ ID NO：9445   0.00％   0.5
  6   38   SEQ ID NO：9446   0.00％   0.5
                                       HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   54   SEQ ID NO：9447   0.02％   2.7
  2   17   SEQ ID NO：9448   0.01％   2
  3   3   SEQ ID NO：9449   0.01％   1.8
                                          HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   22   SEQ ID NO：9450   0.09％   12
  2   16   SEQ ID NO：9451   0.01％   2
  3   54   SEQ ID NO：9452   0.00％   0.9
                                     HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   70   SEQ ID NO：9453   2.10％   33.6
  2   7   SEQ ID NO：9454   1.12％   18
  3   60   SEQ ID NO：9455   0.46％   7.5
  4   54   SEQ ID NO：9456   0.37％   6
  5   14   SEQ ID NO：9457   0.31％   5
  6   19   SEQ ID NO：9458   0.30％   4.8
  7   47   SEQ ID NO：9459   0.30％   4.8
  8   12   SEQ ID NO：9460   0.25％   4
  9   15   SEQ ID NO：9461   0.25％   4
  10   67   SEQ ID NO：9462   0.25％   4
  11   21   SEQ ID NO：9463   0.18％   3
  12   37   SEQ ID NO：9464   0.06％   1
  13   27   SEQ ID NO：9465   0.03％   0.5
                                HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   14   SEQ ID NO：9466   12.52％   200
  2   7   SEQ ID NO：9467   0.93％   15
  3   11   SEQ ID NO：9468   0.75％   12
  4   60   SEQ ID NO：9469   0.56％   9
  5   18   SEQ ID NO：9470   0.45％   7.2
  6   46   SEQ ID NO：9471   0.45％   7.2
  7   53   SEQ ID NO：9472   0.37％   6
  8   69   SEQ ID NO：9473   0.35％   5.6
  9   66   SEQ ID NO：9474   0.25％   4
  10   20   SEQ ID NO：9475   0.12％   2
  11   47   SEQ ID NO：9476   0.07％   1.2
  12   36   SEQ ID NO：9477   0.06％   1
  13   26   SEQ ID NO：9478   0.04％   0.75
  14   70   SEQ ID NO：9479   0.04％   0.72
                                   HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   54   SEQ ID NO：9480   0.02％   881.199
  2   26   SEQ ID NO：9481   0.00％   95.013
  3   61   SEQ ID NO：9482   0.00％   93.69648
  4   19   SEQ ID NO：9483   0.00％   40.2894864
  5   74   SEQ ID NO：9484   0.00％   12.6684
  6   35   SEQ ID NO：9485   0.00％   10.34586
  7   69   SEQ ID NO：9486   0.00％   3.3704706
  8   13   SEQ ID NO：9487   0.00％   1.656
  9   15   SEQ ID NO：9488   0.00％   1.47537042
  10   68   SEQ IDNO：9489   0.00％   0.966
  11   22   SEQ ID NO：9490   0.00％   0.942678
  12   12   SEQ ID NO：9491   0.00％   0.7669695
  13   36   SEQ ID NO：9492   0.00％   0.52661835
                                          HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   61   SEQ ID NO：9493   0.00％   93.69648
  2   25   SEQ ID NO：9494   0.00％   63.33035625
  3   34   SEQ ID NO：9495   0.00％   50.232
  4   53   SEQ ID NO：9496   0.00％   45.2838375
  5   26   SEQ ID NO：9497   0.00％   14.35752
  6   27   SEQ ID NO：9498   0.00％   2.8557858
  7   17   SEQ ID NO：9499   0.00％   2.3973222
  8   36   SEQ ID NO：9500   0.00％   1.798209
  9   69   SEQ ID NO：9501   0.00％   1.03521597
  10   67   SEQ ID NO：9502   0.00％   0.966
  11   68   SEQ ID NO：9503   0.00％   0.910938
  12   11   SEQ ID NO：9504   0.00％   0.7669695
                                   HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   17   SEQ ID NO：9505   2.22％   0.8
                                         HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   16   SEQ ID NO：9506   5.55％   2
                                     HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   27   SEQ ID NO：9507   0.37％   20
  2   54   SEQ ID NO：9508   0.22％   12
  3   70   SEQ ID NO：9509   0.22％   12
  4   67   SEQ ID NO：9510   0.11％   6
  5   12   SEQ ID NO：9511   0.07％   4
  6   15   SEQ ID NO：9512   0.07％   4
  7   19   SEQ ID NO：9513   0.07％   4
  8   49   SEQ ID NO：9514   0.03％   2
  9   69   SEQ ID NO：9515   0.03％   1.8
  10   47   SEQ ID NO：9516   0.02％   1.2
  11   5   SEQ ID NO：9517   0.01％   1
  12   9   SEQ ID NO：9518   0.01％   1
  13   35   SEQ ID NO：9519   0.01％   1
  14   37   SEQ ID NO：9520   0.01％   0.6
  15   68   SEQ ID NO：9521   0.01％   0.6
                                            HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   69   SEQ ID NO：9522   0.66％   36
  2   53   SEQ ID NO：9523   0.22％   12
  3   5   SEQ ID NO：9524   0.13％   7.5
  4   66   SEQ ID NO：9525   0.11％   6
  5   11   SEQ ID NO：9526   0.07％   4
  6   27   SEQ ID NO：9527   0.07％   4
  7   46   SEQ ID NO：9528   0.07％   4
  8   18   SEQ ID NO：9529   0.02％   1.2
  9   9   SEQ ID NO：9530   0.01％   1
  10   26   SEQ ID NO：9531   0.01％   1
  11   25   SEQ ID NO：9532   0.01％   0.75
  12   17   SEQ ID NO：9533   0.01％   0.6
  13   36   SEQ ID NO：9534   0.01％   0.6
  14   68   SEQ ID NO：9535   0.01％   0.6
  15   35   SEQ ID NO：9536   0.00％   0.5
  16   42   SEQ ID NO：9537   0.00％   0.5
  17   73   SEQ ID NO：9538   0.00％   0.5
表25：SEQ ID NO：6052的表位
                                           HLA A1-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   365   SEQ ID NO：9539   0.8％   45
  2   397   SEQ ID NO：9540   0.44％   25
  3   229   SEQ ID NO：9541   0.32％   18
  4   103   SEQ ID NO：9542   0.17％   10
  5   338   SEQ ID NO：9543   0.17％   10
  6   251   SEQ ID NO：9544   0.16％   9
  7   79   SEQ ID NO：9545   0.11％   6.25
  8   119   SEQ ID NO：9546   0.10％   6
  9   361   SEQ ID NO：9547   0.08％   5
  10   60   SEQ ID NO：9548   0.04％   2.25
  11   101   SEQ ID NO：9549   0.04％   2.25
  12   278   SEQ ID NO：9550   0.04％   2.25
  13   23   SEQ ID NO：9551   0.02％   1.25
  14   164   SEQ ID NO：9552   0.02％   1.25
  15   165   SEQ ID NO：9553   0.02％   1.25
  16   295   SEQ ID NO：9554   0.02％   1.25
  17   172   SEQ ID NO：9555   0.01％   0.9
  18   0   SEQ ID NO：9556   0.01％   0.75
  19   311   SEQ ID NO：9557   0.01％   0.75
  20   78   SEQ ID NO：9558   0.01％   0.625
                                           HLA A1-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5625
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   114   SEQ ID NO：9559   1.11％   62.5
  2   134   SEQ ID NO：9560   0.8％   45
  3   365   SEQ ID NO：9561   0.8％   45
  4   77   SEQ ID NO：9562   0.66％   37.5
  5   103   SEQ ID NO：9563   0.44％   25
  6   23   SEQ ID NO：9564   0.22％   12.5
  7   338   SEQ ID NO：9565   0.17％   10
  8   361   SEQ ID NO：9566   0.17％   10
  9   324   SEQ ID NO：9567   0.11％   6.25
  10   375   SEQ ID NO：9568   0.11％   6.25
  11   79   SEQ ID NO：9569   0.04％   2.5
  12   295   SEQ ID NO：9570   0.04％   2.5
  13   346   SEQ ID NO：9571   0.04％   2.5
  14   378   SEQ ID NO：9572   0.03％   2
  15   251   SEQ ID NO：9573   0.03％   1.8
  16   214   SEQ ID NO：9574   0.02％   1.125
  17   160   SEQ ID NO：9575   0.01％   1
  18   172   SEQ ID NO：9576   0.01％   0.9
  19   229   SEQ ID NO：9577   0.01％   0.9
  20   376   SEQ ID NO：9578   0.01％   0.9
                                        HLA A3-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   229   SEQ ID NO：9579   0.49％   60
  2   361   SEQ ID NO：9580   0.27％   33.75
  3   330   SEQ ID NO：9581   0.16％   20
  4   218   SEQ ID NO：9582   0.09％   12
  5   338   SEQ ID NO：9583   0.04％   6
  6   352   SEQ ID NO：9584   0.04％   6
  7   103   SEQ ID NO：9585   0.04％   5.4
  8   291   SEQ ID NO：9586   0.01％   2
  9   241   SEQ ID NO：9587   0.01％   1.8
  10   290   SEQ ID NO：9588   0.01％   1.8
  11   316   SEQ ID NO：9589   0.01％   1.8
  12   222   SEQ ID NO：9590   0.01％   1.35
  13   266   SEQ ID NO：9591   0.01％   1.35
  14   53   SEQ ID NO：9592   0.00％   1
  15   100   SEQ ID NO：9593   0.00％   0.9
  16   138   SEQ ID NO：9594   0.00％   0.9
  17   240   SEQ ID NO：9595   0.00％   0.9
  18   119   SEQ ID NO：9596   0.00％   0.675
  19   44   SEQ ID NO：9597   0.00％   0.6
  20   161   SEQ IDNO：9598   0.00％   0.6
                 HLA A3-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   12150
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   338   SEQ ID NO：9599   0.49％   60
  2   160   SEQ ID NO：9600   0.32％   40
  3   352   SEQ ID NO：9601   0.24％   30
  4   361   SEQ ID NO：9602   0.18％   22.5
  5   103   SEQ ID NO：9603   0.13％   16.2
  6   290   SEQ ID NO：9604   0.07％   9
  7   351   SEQ ID NO：9605   0.07％   9
  8   44   SEQ ID NO：9606   0.04％   6
  9   228   SEQ ID NO：9607   0.03％   4.05
  10   394   SEQ ID NO：9608   0.02％   3
  11   240   SEQ ID NO：9609   0.02％   2.7
  12   100   SEQ ID NO：9610   0.01％   1.8
  13   114   SEQ ID NO：9611   0.01％   1.8
  14   93   SEQ ID NO：9612   0.01％   1.5
  15   134   SEQ ID NO：9613   0.01％   1.5
  16   221   SEQ ID NO：9614   0.01％   1.35
  17   330   SEQ ID NO：9615   0.00％   1.2
  18   112   SEQ ID NO：9616   0.00％   0.9
  19   218   SEQ ID NO：9617   0.00％   0.9
  20   55   SEQID NO：9618   0.00％   0.6
                                    HLA A24-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   345   SEQ ID NO：9619   1.50％   24
  2   306   SEQ ID NO：9620   0.75％   12
  3   222   SEQ ID NO：9621   0.54％   8.64
  4   111   SEQ ID NO：9622   0.51％   8.25
  5   159   SEQ ID NO：9623   0.45％   7.2
  6   219   SEQ ID NO：9624   0.45％   7.2
  7   283   SEQ ID NO：9625   0.45％   7.2
  8   266   SEQ ID NO：9626   0.42％   6.72
  9   56   SEQ ID NO：9627   0.41％   6.6
  10   131   SEQ ID NO：9628   0.37％   6
  11   214   SEQ ID NO：9629   0.37％   6
  12   297   SEQ ID NO：9630   0.37％   6
  13   86   SEQ ID NO：9631   0.31％   5
  14   122   SEQ ID NO：9632   0.31％   5
  15   48   SEQ ID NO：9633   0.30％   4.8
  16   105   SEQ ID NO：9634   0.30％   4.8
  17   213   SEQ ID NO：9635   0.30％   4.8
  18   323   SEQ ID NO：9636   0.30％   4.8
  19   338   SEQ ID NO：9637   0.30％   4.8
  20   399   SEQ ID NO：9638   0.30％   4.8
                                      HLA A24-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   1596.672
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   65   SEQ ID NO：9639   0.93％   15
  2   306   SEQ ID NO：9640   0.75％   12
  3   95   SEQ ID NO：9641   0.66％   10.56
  4   36   SEQ ID NO：9642   0.60％   9.6
  5   385   SEQ ID NO：9643   0.50％   8
  6   111   SEQ ID NO：9644   0.46％   7.5
  7   104   SEQ ID NO：9645   0.45％   7.2
  8   214   SEQ ID NO：9646   0.45％   7.2
  9   221   SEQ ID NO：9647   0.45％   7.2
  10   277   SEQ ID NO：9648   0.45％   7.2
  11   150   SEQ ID NO：9649   0.37％   6
  12   152   SEQ ID NO：9650   0.37％   6
  13   158   SEQ ID NO：9651   0.37％   6
  14   171   SEQ ID NO：9652   0.37％   6
  15   343   SEQ ID NO：9653   0.37％   6
  16   110   SEQ ID NO：9654   0.34％   5.5
  17   85   SEQ ID NO：9655   0.31％   5
  18   47   SEQ ID NO：9656   0.30％   4.8
  19   213   SEQ ID NO：9657   0.30％   4.8
  20   218   SEQ ID NO：9658   0.30％   4.8
                                             HLA A 0201-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   222   SEQ ID NO：9659   0.03％   1267.10434728
  2   226   SEQ ID NO：9660   0.00％   69.552
  3   316   SEQ ID NO：9661   0.00％   50.232
  4   351   SEQ ID NO：9662   0.00％   31.24872
  5   159   SEQ ID NO：9663   0.00％   13.6235739
  6   406   SEQ ID NO：9664   0.00％   11.4264
  7   165   SEQ ID NO：9665   O.00％   8.14407
  8   238   SEQ ID NO：9666   0.00％   7.0518
  9   138   SEQ ID NO：9667   0.00％   5.112072
  10   130   SEQ ID NO：9668   0.00％   3.00547233
  11   303   SEQ ID NO：9669   0.00％   2.59578
  12   157   SEQ ID NO：9670   0.00％   2.412585
  13   219   SEQ ID NO：9671   0.00％   2.103255861
  14   305   SEQ ID NO：9672   0.00％   1.86369
  15   158   SEQ ID NO：9673   0.00％   1.646892
  16   331   SEQ ID NO：9674   0.00％   1.614048
  17   399   SEQ ID NO：9675   0.00％   1.442246832
  18   324   SEQ ID NO：9676   0.00％   1.319625
  19   312   SEQ ID NO：9677   0.00％   1.233099
  20   262   SEQ ID NO：9678   0.00％   0.966
  HLA A 0201-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   3925227.1
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   221   SEQ ID NO：9679   0.00％   309.0498408
  2   112   SEQ ID NO：9680   0.00％   98.26704
  3   330   SEQ ID NO：9681   0.00％   98.26704
  4   158   SEQ ID NO：9682   0.00％   36.31608
  5   218   SEQ ID NO：9683   0.00％   24.0754248
  6   124   SEQ ID NO：9684   0.00％   12.2199
  7   55   SEQ ID NO：9685   0.00％   10.467576
  8   315   SEQ ID NO：9686   0.00％   7.7274204
  9   350   SEQ ID NO：9687   0.00％   4.296699
  10   405   SEQ ID NO：9688   0.00％   4.286487
  11   388   SEQ ID NO：9689   0.00％   4.054785
  12   322   SEQ ID NO：9690   0.00％   3.883803
  13   130   SEQ ID NO：9691   0.00％   3.428691903
  14   45   SEQ ID NO：9692   0.00％   3.411230625
  15   132   SEQ ID NO：9693   0.00％   2.99943
  16   410   SEQ ID NO：9694   0.00％   2.63718
  17   316   SEQ ID NO：9695   0.00％   2.48686074
  18   104   SEQ ID NO：9696   0.00％   2.477311485
  19   164   SEQ ID NO：9697   0.00％   2.2011
  20   282   SEQ ID NO：9698   0.00％   2.16591
  HLA A 1101-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   361   SEQ ID NO：9699   16.66％   6
  2   53   SEQ ID NO：9700   2.77％   1
  3   240   SEQ ID NO：9701   1.66％   0.6
  4   241   SEQ ID NO：9702   1.66％   0.6
  HLA A 1101-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   36
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   361   SEQ ID NO：9703   16.66％   6
  2   93   SEQ ID NO：9704   8.33％   3
  3   338   SEQ ID NO：9705   3.33％   1.2
  4   134   SEQ ID NO：9706   2.77％   1
  5   228   SEQ ID NO：9707   2.5％   0.9
  6   160   SEQ ID NO：9708   2.22％   0.8
  7   239   SEQ ID NO：9709   1.66％   0.6
  8   240   SEQ ID NO：9710   1.66％   0.6
  9   257   SEQ ID NO：9711   1.66％   0.6
  10   379   SEQ ID NO：9712   1.66％   0.6
  HLA B7-9mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   105   SEQ ID NO：9713   14.81％   800
  2   66   SEQ ID NO：9714   1.48％   80
  3   93   SEQ ID NO：9715   0.92％   50
  4   257   SEQ ID NO：9716   0.55％   30
  5   323   SEQ ID NO：9717   0.37％   20
  6   211   SEQ ID NO：9718   0.22％   12
  7   219   SEQ ID NO：9719   0.22％   12
  8   403   SEQ ID NO：9720   0.18％   10
  9   343   SEQ ID NO：9721   0.14％   8
  10   12   SEQ ID NO：9722   0.11％   6
  11   113   SEQ ID NO：9723   0.11％   6
  12   48   SEQ ID NO：9724   0.07％   4
  13   56   SEQ ID NO：9725   0.07％   4
  14   150   SEQ ID NO：9726   0.07％   4
  15   153   SEQ ID NO：9727   0.07％   4
  16   159   SEQ ID NO：9728   0.07％   4
  17   213   SEQ ID NO：9729   0.07％   4
  18   216   SEQ ID NO：9730   0.07％   4
  19   222   SEQ ID NO：9731   0.07％   4
  20   283   SEQ ID NO：9732   0.07％   4
  HLA B7-10mers
  使用这种分子类型的最大可能记分   5400
  排序   起始位点   序列   占最大记分的百分比   记分
  1   36   SEQ ID NO：9733   1.48％   80
  2   150   SEQ ID NO：9734   1.48％   80
  3   343   SEQ ID NO：9735   1.48％   80
  4   12   SEQ ID NO：9736   1.11％   60
  5   308   SEQ ID NO：9737   1.11％   60
  6   130   SEQ ID NO：9738   0.37％   20
  7   55   SEQ ID NO：9739   0.22％   12
  8   210   SEQ ID NO：9740   0.22％   12
  9   218   SEQ ID NO：9741   0.22％   12
  10   201   SEQ ID NO：9742   0.18％   10
  11   121   SEQ ID NO：9743   0.14％   8
  12   391   SEQ ID NO：9744   0.13％   7.5
  13   112   SEQ ID NO：9745   0.11％   6
  14   385   SEQ ID NO：9746   0.11％   6
  15   47   SEQ ID NO：9747   0.07％   4
  16   66   SEQ ID NO：9748   0.07％   4
  17   95   SEQ ID NO：9749   0.07％   4
  18   104   SEQ ID NO：9750   0.07％   4
  19   152   SEQ ID NO：9751   0.07％   4
  20   158   SEQ ID NO：9752   0.07％   4
表26：用于大肠杆菌表达的克隆序列
  ORF   DNA长度bp                克隆
  pET   pGEX
  P28   537   NdeI/XhoI
  P65   1917   NheI/HindIII
  Nsp1A   2495   NheI/XhoI
  Nsp1B   2153   NdeI/XhoI
  Nsp1C   2612   NdeI/XhoI
  Nsp2A   431   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  Nsp2B   426   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  Nsp3   870   NdeI/XhoI
  Nsp4   249   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  Nsp5   594   NheI/XhoI
  Nsp6   339   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  Nsp7   417   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  Nsp9A   1385   NheI/XhoI
  Nsp9B   1409   NdeI/XhoI
  Nsp10   1803   NheI/XhoI
  Nsp11   1581   NdeI/XhoI
  Nsp12   1038   NdeI/HindIII
  Nsp13   897   NdeI/XhoI
  刺突(S1)   1946   NdeI/XhoI
  刺突(S2)   1598   NdeI/XhoI
  刺突(S1-S2)   3545   NdeI/XhoI
  HR1   287   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  HR2   146   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  ORF3 100   525   NdeI/XhoI
  ORF4   465   NdeI/XhoI
  包膜(E)   231   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  基质(M) 100   366   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  ORF7 18   137   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  ORF8   369   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  ORF9   135   NdeIzXhoI   BamHI/XhoI
  ORF10   120   NheI/XhoI   BamHI/XhoI
  ORF11   255   NdeI/XhoI   BamHI/XhoI
  核衣壳(N)   1269   NdeI/EcoRI
  ORF12   297   NdeI/EcoRI   BamHI/EcoRI
表27：引物
  ORF   正向引物   反向引物
  P28   9803   9818
  P65   9804   9819
  Nsp1A   9805   9820
  Nsp1B   9806   9821
  Nsp1C   9807   9822
  Nsp2+Nsp3   9808   9823
  Nsp4-Nsp7   9809   9824
  Nsp9A   9810   9825
  Nsp9B   9811   9826
  Nsp10   9812   9827
  Nsp11   9813   9828
  Nsp12-Nsp13   9814   9829
  ORF3-ORF4   9815   9830
  Env-ORF10   9816   9831
  ORF11-ORF12   9817   9832
表28：引物
  ORF   正向引物   反向引物
  Nsp2A   SEQ ID NO：9833   SEQ ID NO：9858
  Nsp2B   SEQ ID NO：9834   SEQ ID NO：9859
  Nsp3   SEQ ID NO：9835   SEQ ID NO：9860
  Nsp4   SEQ ID NO：9836   SEQ ID NO：9861
  Nsp5   SEQ ID NO：9837   SEQ ID NO：9862
  Nsp6   SEQ ID NO：9838   SEQ ID NO：9863
  Nsp7   SEQ ID NO：9839   SEQ ID NO：9864
  Nsp12   SEQ ID NO：9840   SEQ ID NO：9865
  Nsp13   SEQ ID NO：9841   SEQ ID NO：9866
  刺突S1   SEQ ID NO：9842   SEQ ID NO：9867
  刺突S2   SEQ ID NO：9843   SEQ ID NO：9868
  刺突S1-S2   SEQ ID NO：9844   SEQ ID NO：9869
  HR1   SEQ ID NO：9845   SEQ ID NO：9870
  HR2   SEQ ID NO：9846   SEQ ID NO：9871
  Orf3Δ100   SEQ ID NO：9847   SEQ ID NO：9872
  Orf4   SEQ ID NO：9848   SEQ ID NO：9873
  Env E   SEQ ID NO：9849   SEQ ID NO：9874
  基质MΔ100   SEQ ID NO：9850   SEQ ID NO：9875
  Orf7Δ18   SEQ ID NO：9851   SEQ ID NO：9876
  Orf8   SEQ ID NO：9852   SEQ ID NO：9877
  Orf9   SEQ ID NO：9853   SEQ ID NO：9878
  Orf10   SEQ ID NO：9854   SEQ ID NO：9879
  Orf11   SEQ ID NO：9855   SEQ ID NO：9880
  核衣壳N   SEQ ID NO：9856   SEQ ID NO：9881
  Orf12   SEQ ID NO：9857   SEQ ID NO：9882
表29：克隆，纯化和在大肠杆菌中表达
  SARS CoV ORFs   M.WKd   克隆   表达   纯化
  P28   19,7   +   +   his sol
  P65   70,3   +   +   his sol
  Nsp1A(N-末端)   91,6   +   +   his ins
  Nsp1B(核心)   80,8   +   -
  Nsp1C(C-末端)   95,3   +   -
  Nsp2A(N-末端)   15,8   +   +   his ins
  Nsp2B(C-末端)   15,5   +   +   his sol
  Nsp3   31,9   +   -
  Nsp4   9,1   +   +   his sol
  Nsp5   21,8   +   +   his sol
  Nsp6   12,4   +   +   his sol
  Nsp7   15,3   +   +   his ins
  Nsp9A(N-末端)   50,8   +   -
  Nsp9B(C-末端)   51,6   +   +   his ins
  Nsp10   66   -
  Nsp11   58   -
  Nsp12   38   -
  Nsp13   32,7   +   +   his ins
  刺突(S1-his)   71,3   +   +   his ins
  刺突(S2-his)   58,6   克隆   -
  刺突(S1S2-his)   130   +   +   his ins
  HR1   11   +   +   his ins
  HR2   5,4   +   +   his sol
  ORF3Δ1001   19,1   +   -
  ORF4   16,9   +   +   his ins(三体)
  包膜(E)   34,3   +   +   gst ins(IB)
  基质(M)Δ100   13,3   +   +   his ins
  ORF7Δ182   31   +   +   gst sol
  ORF8   39,5   +   +   gst ins(IB)
  ORF9   30,8   +   +   gst sol
  ORF10   30,3   +   +   gst ins(IB)
  ORF11   35,2   +   +   gst ins(IB)
  核衣壳(N)   43,6   +   +   his ins
  ORF12   36,7   +   +   his ins
表30：大肠杆菌表达、纯化和产量
  蛋白质   标记   纯度(％)   产量(mg/l)
  Nsp2A(N-末端)   His   95   1.7
  Nsp2B(C-末端)   His   95   4.1
  Nsp4   His   95   12.6
  Nsp5   His   95   5.88
  Nsp6   His   95   8.1
  P28   His   95   1
  P65   His   80   0.553
  HR2   His   95   11.9
  HR1   His   80   2.64
  Nsp1A   His   95   0.267
  刺突S1-S2   His   80   0.381
  基质M   His   85   12.4
  ORF7   GST   85   4.9
表31：引物
  SEQ ID NO：   排序   模型   局部   (位置)
  10235   F1   1   1   (106)
  10236   F2   2   1   (728)
  10237   F3   3   1   (112)
  10238   F4   5   2   (1331)
  10239   F5   6   1   (12)
  10240   F6   6   1   (346)
  10241   F7   8   1   (904)
  10242   F8   9   1   (1016)
  10243   F9   9   1   (1015)
  10244   F10   9   1   (719)
  10245   F11   9   1   (720)
  10246   F12   10   1   (724)
  10247   R1   2   1   (1283)
  10248   R2   4   1   (756)
  10249   R3   4   1   (758)
  10250   R4   5   2   (259)
  10251   R5   6   1   (54)
  10252   R6   7   1   (648)
  10253   R7   8   1   (948)
  10254   R8   8   1   (260)
  10255   R9   9   1   (1282)
  10256   R10   9   1   (950)
  10257   R11   9   1   (756)
  10258   R12   10   1   (132)
表32：引物
  引物列表：(正向)
  排序        记分   序列   (位置)
  模型   局部
  F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20F21F22F23F24F25   7777799101111121214141617171717202028282929   1111111111111111111111111   SEQ ID NO：10352SEQ ID NO：10353SEQ ID NO：10354SEQ ID NO：10355SEQ ID NO：10356SEQ ID NO：10357SEQ ID NO：10358SEQ ID NO：10359SEQ ID NO：10360SEQ ID NO：10361SEQ ID NO：10362SEQ ID NO：10363SEQ ID NO：10364SEQ ID NO：10365SEQ ID NO：10366SEQ ID NO：10367SEQ ID NO：10368SEQ ID NO：10369SEQ ID NO：10370SEQ ID NO：10371SEQ ID NO：10372SEQ ID NO：10373SEQ ID NO：10374SEQ ID NO：10375SEQ ID NO：10376   (290)(291)(294)(292)(293)(198)(199)(33)(200)(299)(298)(297)(35)(34)(300)(295)(296)(175)(36)(202)(201)(204)(203)(269)(268)
  引物列表(反向)
  排序   模型   局部   序列   (位置)
  R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12R13R14R15R16R17R18R19R20R21R22R23R24R25   791111121213141415161717171718202021222829323536   1111111111111111111111111   SEQ ID NO：10377SEQ ID NO：10378SEQ ID NO：10379SEQ ID NO：10380SEQ ID NO：10381SEQ ID NO：10382SEQ ID NO：10383SEQ ID NO：10384SEQ ID NO：10385SEQ ID NO：10386SEQ ID NO：10387SEQ ID NO：10388SEQ ID NO：10389SEQ ID NO：10390SEQ ID NO：10391SEQ ID NO：10392SEQ ID NO：10393SEQ ID NO：10394SEQ ID NO：10395SEQ ID NO：10396SEQ ID NO：10397SEQ ID NO：10398SEQ ID NO：10399SEQ ID NO：10400SEQ ID NO：10401   (337)(229)(230)(338)(207)(338)(231)(80)(232)(82)(340)(83)(206)(82)(337)(341)(340)(233)(79)(213)(236)(317)(391)(57)(237)
  引物列表(左)：SEQ ID NOs：10402-10433   引物列表(右)：SEQ ID NOs：10434-10464
  引物列表(正向)：SEQ ID NOs：10465-10484   引物列表(反向)：SEQ ID NOs：10485-10504
表33：引物
  引物列表(正向)
  排序        记分   序列   (位置)
  模型   局部
  F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30F31F32F33F34F35F36F37F38F39F40F41F42F43F44F45F46F47F48F49F50   12234445555666666667777777778888888999999101010101010111111   11111111111111111111111111111111111111111111111111   SEQ ID NO：10580SEQ ID NO：10581SEQ ID NO：10582SEQ ID NO：10583SEQ ID NO：10584SEQ ID NO：10585SEQ ID NO：10586SEQ ID NO：10587SEQ ID NO：10588SEQ ID NO：10589SEQ ID NO：10590SEQ ID NO：10591SEQ ID NO：10592SEQ ID NO：10593SEQ ID NO：10594SEQ ID NO：10595SEQ ID NO：10596SEQ ID NO：10597SEQ ID NO：10598SEQ ID NO：10599SEQ ID NO：10600SEQ ID NO：10601SEQ ID NO：10602SEQ ID NO：10603SEQ ID NO：10604SEQ ID NO：10605SEQ ID NO：10606SEQ ID NO：10607SEQ ID NO：10608SEQ ID NO：10609SEQ ID NO：10610SEQ ID NO：10611SEQ ID NO：10612SEQ ID NO：10613SEQ ID NO：10614SEQ ID NO：10615sEQ ID NO：10616SEQ ID NO：10617SEQ ID NO：10618SEQ ID NO：10619SEQ ID NO：10620SEQ ID NO：10621SEQ ID NO：10622SEQ ID NO：10623SEQ ID NO：10624SEQ ID NO：10625SEQ ID NO：10626SEQ ID NO：10627SEQ ID NO：10628SEQ ID NO：10629   (637)(439)(440)(729)(696)(697)(111)(867)(868)(869)(640)(438)(437)(436)(732)(635)(457)(458)(636)(854)(855)(581)(853)(342)(343)(112)(94)(642)(638)(639)(730)(641)(731)(326)(325)(517)(701)(208)(209)(702)(210)(634)(694)(693)(728)(695)(95)(455)(456)(454)
  引物列表(反向)
  排序        记分   序列   (位置)
  模型   局部
  R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12R13R14R15R16R17R18R19R20R21R22R23R24R25R26R27R28R29R30R31R32R33R34R35R36R37R38R39R40R41R42R43R44R45R46R47R48R49R50   11233444445566666677777777888889999101010101011111111111112121212   11111111111111111111111111111111111111111111111111   SEQ ID NO：10630SEQ ID NO：10631SEQ ID NO：10632SEQ ID NO：10633SEQ ID NO：10634SEQ ID NO：10635SEQ ID NO：10636SEQ ID NO：10637SEQ ID NO：10638SEQ ID NO：10639SEQ ID NO：10640SEQ ID NO：10641SEQ ID NO：10642SEQ ID NO：10643SEQ ID NO：10644SEQ ID NO：10645SEQ ID NO：10646SEQ ID NO：10647SEQ ID NO：10648SEQ ID NO：10649SEQ ID NO：10650SEQ ID NO：10651SEQ ID NO：10652SEQ ID NO：10653SEQ ID NO：10654SEQ ID NO：10655SEQ ID NO：10656SEQ ID NO：10657SEQ ID NO：10658SEQ ID NO：10659SEQ ID NO：10660SEQ ID NO：10661SEQ ID NO：10662SEQ ID NO：10663SEQ ID NO：10664SEQ ID NO：10665SEQ ID NO：10666SEQ ID NO：10667SEQ ID NO：10668SEQ ID NO：10669SEQ ID NO：10670SEQ ID NO：10671SEQ ID NO：10672SEQ ID NO：10673SEQ ID NO：10674SEQ ID NO：10675SEQ ID NO：10676SEQ ID NO：10677SEQ ID NO：10678SEQ ID NO：10679   (367)(666)(464)(669)(750)(720)(465)(370)(668)(135)(901)(667)(609)(464)(665)(486)(356)(758)(366)(368)(136)(675)(366)(608)(884)(120)(355)(671)(756)(751)(666)(242)(543)(724)(482)(121)(662)(750)(719)(242)(484)(375)(728)(373)(998)(486)(881)(882)(244)(1003)
  引物列表(左)：SEQ ID NOs：10680-10974   引物列表(右)：SEQ ID NOs：10975-11282
  引物列表(正向)：SEQ ID NOs：11283-11302   引物列表(反向)：SEQ ID NOs：11303-11322
表34
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                               表35
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                                   表35续
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                                   表35续
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                                   表35续
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序列简述
  SEQ ID NO：   描述
  1   来自加拿大大不列颠哥伦比亚省基因组科学中心的TOR2分离物序列的基因组装配草图。TOR2_draft_genome_assembly_120403 Release I
  2   CDC SARS-CoV毒株序列.完整的核苷酸序列(Urbani毒株)
  3-20   组特异性冠状病毒基因产物＞猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)3/4＝ORF 3b；5/6＝ORF 3X；7/8＝ORF 3A＞犬冠状病毒9/10＝ORF 7b；11/12＝ORF 7a＞鸟传染性支气管炎病毒13/14＝ORF 5b；15/16＝ORF 5a；17/18＝ORF 3a；19/20＝ORF 3b
  21-520   左边部分的500个引物
  521-1020   右边部分的500个引物
  1021-3520   表4的正向引物
  3521-6020   表4的反向引物
  6021-6026   图9的引物
  6027-6033   图11的引物
  6034-6038   来自以下网址的引物http：//content.nejm.org/cgi/reprint/NEJMoa030781v2.pdf
  6039-6051   PEP1至PEP13
  6052   延长的PEP13
  6053-6056   229E人冠状病毒序列
  6057-6060   TGV序列
  6061-6064   PEDV序列
  6065-6068   牛冠状病毒序列
  6069-6071   鼠肝炎病毒序列
  6072-6075   AIBV序列
  6076-6170   引物序列(正向)
  6171-6265   引物序列(反向)
  6266-6304   引物序列(正向)
  6305-6343   引物序列(反向)
  6344-6366   引物序列(正向)
  6367-6392   引物序列(反向)
  6393-6440   引物序列(正向)F1-F48
  6441-6487   引物序列(反向)R1-R47
  6488-6559   引物序列
  6560-6568   引物序列
  6569   SARS冠状病毒内的nsp2蛋白酶(3CL-PRO)序列
  6570-72   牛IBV、MHV和BcoV的nsp2蛋白酶(3CLp)
  6573   nsp2蛋白酶共有序列
  6574-6577   图18的IG序列
  6578   pCMVIII中的nSh表达构建物
  6579   pCMVIII中的nS表达构建物
  6580   pCMVIII中的nShΔTC表达构建物
  6581   pCMVIII中的nSΔTC表达构建物
  6582   pCMVIII中的nS1h表达构建物
  6583   pCMVIII中的nS1表达构建物
  6584-6585   cDNA扩增引物
  6585-6587   RT-PCR引物
  6588-6809   图23的组成序列(≥4氨基酸)
  6810-7179   图24的组成序列(≥4氨基酸)
  7180-7187   SEQ ID NO：6039内的N-糖基化位点
  7188-7189   图25的组成序列
  7190   SEQ ID NO：7188的片段
  7191   编码SEQ ID NO：7190的多核苷酸
  7192   SEQ ID NO：6042的氨基酸879-1005
  7193   SEQ ID NO：6042的氨基酸879-980
  7194   SEQ ID NO：6042的氨基酸901-1005
  7195   SEQ ID NO：6042的氨基酸1144-1201
  7196   SEQ ID NO：6042的氨基酸1144-1196
  7197-7199   膜融合肽区域
  7200-7206   基于NadA的多肽
  7207-7223   SEQ ID NO：6042内的N-糖基化位点
  7224-7231   滑动区
  7232   Orflab多蛋白
  7233-7244   Orflab多蛋白
  7245-7247   SEQ ID NOS 7233-7244的X2序列
  7248-7253   Orflab多蛋白
  7254   锌结合区2位
  7255-7271   SEQ ID NOS：6040-41，6043，6045-46，6050-51中的N-糖基化位点
  7272-7291   多肽和多核苷酸
  7292-7293   基因间序列
  7294-7301   SARSV基因组5’末端基因间序列之后的核苷酸
  7302-7306   NadA构建物
  7307-7308   SEQ ID NO：6042的片段
  7309   NadA序列
  7310-7311   NadA前导序列
  7312-7315   NadA的氨基酸序列
  7316-7324   PCR引物
  7325-7330   引物
  7331   CCACC序列
  7332-7336   3′UTR正向引物
  7337-7341   3′UTR反向引物
  7342-7352   3′UTR探针
  7353-7362   5′UTR正向引物
  7363-7373   5′UTR反向引物
  7374-7385   5′UTR探针
  7386   保守的8个核苷酸
  7387   SEQ ID NO：7293的反向组分
  7388   基因间序列
  7389   Poly T
  7390   茎-环序列
  7391-7392   多甘氨酸接头
  7393   多组氨酸标记
  7394   核衣壳表位位点
  7395   反义引物
  7396-7397   探针
  7398-7399   SEQ ID NO：6042的抗原性片段
  7400-7639   SEQ ID NO：6039的T表位分析
  7640-7800   SEQ ID NO：6040的T表位分析
  7801-8040   SEQ ID NO：6041的T表位分析
  8041-8280   SEQ ID NO：6042的T表位分析
  8281-8486   SEQ ID NO：6043的T表位分析
  8487-8665   SEQ ID NO：6044的T表位分析
  8666-8820   SEQ ID NO：6045的T表位分析
  8821-9018 SEQ ID NO：6046的T表位分析
  9019-9131 SEQ ID NO：6047的T表位分析
  9132-9308 SEQ ID NO：6048的T表位分析
  9309-9437 SEQ ID NO：6049的T表位分析
  9438-9538 SEQ ID NO：6050的T表位分析
  9539-9752 SEQ ID NO：6052的T表位分析
  9753-9763 刺突蛋白扩增引物，尤其用于刺突片段
  9764-9765 SEQ ID NO：6039中的N-糖基化位点
  9766-9779 ORFlab切割产物(表10)
  9780-9782 正向引物，反向引物，探针
  9783-9784 富含赖氨酸的区域
  9785-9798 用于酿酒酵母表达的寡核苷酸
  9799-9802 图65和66的序列
  9803-9882 用于大肠杆菌克隆的引物
  9883-9885 图3A，3B，3C的BCV核苷序列
  9886-9891 图4A，4B，4C，4D，4E，4F的BCV氨基酸序列
  9892 BCV 5′UTR
  9893 BCV 3′UTR
  9894-9896 图3A，3B，3C的MHV核苷序列
  9897-9902 图4A，4B，4C，4D，4E，4F的MHV氨基酸序列
  9903-9904 图3A，3B的AIBV核苷序列
  9905-9909 图4A，4B，4D，4E，4F的AIBV氨基酸序列
  9910 AIBV 5′UTR
  9911 AIBV 3′UTR
  9912-9913 图3B，3C的HOBMPRO，HOBHEGA核苷序列
  9914-9918 图4A，4B，4C，4E，4F的人CoV氨基酸序列
  9919 HCoV-OC43 5′UTR
  9920 HCoV-OC43 3′UTR
  9921-9923 pCMVKm2载体
  9924-9926 密码子优选的N、M和E序列
  9927 BNI-1
  9928-9959 从SEQ ID NO：9927推出的≥4aa的组成氨基酸序列
  9960 ORFlab变体
  9961 ORFla变体
  9962 刺突蛋白变体
  9963 膜蛋白变体
  9964 核衣壳蛋白变体
  9965-9966 端ORF
  9967 FRA完整基因组

Claims (119)

1.一种SARS病毒的分离多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽是是刺突(S)多肽、包膜(E)多肽、膜(M)多肽、血凝素-酯酶多肽(HE)、核衣壳(N)多肽、ORF1a多肽、ORF1ab多肽、ORF1a多肽的蛋白水解片段或ORF1ab多肽的蛋白水解片段。
3.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNOs：6039，7232，9766，9767，9768，9769，9770，9771，9772，9773，9774，9775，9776，9777，9778，9779，6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050或6052。
4.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列有＞75％序列相同性的氨基酸序列：SEQ ID NOS：6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050，6052，9766，9767，9768，9769，9770，9771，9772，9773，977，4，9775，9776，9777，9778，9779，9997，9998，10149，10316，10338，10339，10340，10341，10342，10532，10533，10571，10572，10573，10574，10575，10576，10577，10578，10579，11561，11562，11618，11619，11620，11627，11630，11633和11636。
5.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸的片段：SEQ ID NOS：6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050，6052，9766，9767，9768，9769，9770，9771，9772，9773，9774，9775，9776，9777，9778，9779，9997，9998，10149，10316，10338，10339，10340，10341，10342，10532，10533，10571，10572，10573，10574，10575，10576，10577，10578，10579，11552，11561，11562，11618，11619，11620，11627，11630，11633和11636。
6.一种包含与选自下组的氨基酸序列有＞80％序列相同性的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NOS：6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050，6052，9766，9767，9768，9769，9770，9771，9772，9773，9774，9775，9776，9777，9778，9779，9997，9998，10149，10316，10338，10339，10340，10341，10342，10532，10533，10571，10572，10573，10574，10575，10576，10577，10578，10579，11552，11561，11562，11618，11619，11620，11627，11630，11633和11636。
7.一种包括含有选自下组的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NOS：6042，6043，6044，6045，6046，6047，6048，6049，6050，6052，9766，9767，9768，9769，9770，9771，9772，9773，9774，9775，9776，9777，9778，9779，9997，9998，10149，10316，10338，10339，10340，10341，10342，10532，10533，10571，10572，10573，10574，10575，10576，10577，10578，10579，11552，11561，11562，11618，11619，11620，11627，11630，11633和11636。8.一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：6042有＞80％序列相同性的氨基酸序列，和/或包括含有SEQ ID NO：6042至少10个连续氨基酸的片段的氨基酸序列，其中，所述多肽为三聚体形式。
9.编码如权利要求1-8中任一项所述多肽的核酸。
10.如权利要求9所述的核酸，包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOS：7191，7273，7275，7277，7279，7281，7283，7285，7287，7289，7291，7292，7293，9968，10066，10084，10299，10505，11323，11563，11639和11640。
11.一种包含与权利要求9或权利要求10所述核酸有＞80％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸。
12.一种含有权利要求9或权利要求10所述核酸至少10个连续核苷酸的片段的多核苷酸。
13.能识别如权利要求1-8中任一项所述多肽的抗体。
14.如权利要求13所述的抗体，其中，所述抗体能识别含有SEQ ID NO：6042的氨基酸序列或其片段的多肽。
15.如权利要求14所述的抗体，其中，所述抗体能识别含有SEQ ID NO：6042的氨基酸序列或其片段的三聚体形式的多肽。
16.如权利要求13所述的抗体，其中，所述抗体是单克隆抗体、
17.如权利要求13所述的抗体，其中，所述抗体是人抗体。
18.一种检测样品中SARS病毒抗原的免疫测定法，包括使样品与权利要求13-17中任一项所述抗体相接触的步骤。
19.一种检测样品中抗SARS病毒抗原的抗体的免疫测定法，包括使样品与权利要求1-8中任一项所述多肽相接触的步骤。
20.一种检测样品中抗SARS病毒抗原的抗体的方法，包括使所述样品与权利要求1-8中任一项所述的多肽在适合所述多肽结合如果存在的所述抗体的条件下接触，并检测所述多肽与所述抗体的结合。
21.一种检测样品中SARS病毒抗原的方法，包括使所述样品与权利要求13-17中任一项所述的抗体在适合所述抗体结合如果存在的所述抗原的条件下接触，并检测所述抗体与所述抗原的结合。
22.一种治疗或预防严重急性呼吸道综合征(SARS)的疫苗，包含灭活的SARS病毒、杀死的SARS病毒、减毒的SARS病毒、裂解的SARS病毒制品或至少一种纯化的SARS病毒抗原。
23.如权利要求22所述的疫苗，包含如权利要求1-8中任一项所述的纯化的多肽。
24.如权利要求22或权利要求23所述的疫苗，其中，所述抗原是VLP形式的纯化的SARS病毒抗原。
25.如权利要求22-24中任一项所述的疫苗，还包含佐剂。
26.如权利要求25所述的疫苗，其中，所述佐剂是铝盐或是MF59.
27.如权利要求22-26中任一项所述的疫苗，包含一种以上SARS病毒抗原。
28.如权利要求27所述的疫苗，其中，所述抗原选自S、E、N和M。
29.如权利要求22所述的疫苗，包含灭活SARS病毒。
30.如权利要求29所述的疫苗，其中，所述病毒通过化学或物理方法灭活。
31.如权利要求30所述的疫苗，其中，所述灭活包括用有效量的一种或多种选自下组的试剂处理病毒：去污剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯和UV光。
32.如权利要求30所述的疫苗，其中，所述灭活包括用有效量的一种或多种选自下组的试剂处理病毒：亚甲基蓝、补骨脂素和羧基富勒烯(C60)。
33.如权利要求30所述的疫苗，其中，所述灭活包括用有效量的一种或多种选自下组的试剂处理病毒：二元乙胺、乙酰基吖丙啶和γ射线照射。
34.如权利要求31所述的疫苗，其中，所述灭活包括用β-丙内酯处理。
35.如权利要求34所述的疫苗，其中，所述β-丙内酯以0.01-0.5％的浓度使用。
36.如权利要求34所述的疫苗，其中，所述β-丙内酯以0.5-0.2％的浓度使用。
37.如权利要求34所述的疫苗，其中，所述β-丙内酯以0.025-0.1％的浓度使用。
38.一种灭活SARS病毒的方法，包括使病毒在冷藏温度下在灭活剂中暴露12-24小时，然后升高温度3小时来水解任何剩余的灭活剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所述灭活剂是β-丙内酯。
40.如权利要求38所述的方法，其中，所述冷藏温度在0℃和8℃之间。
41.如权利要求38所述的方法，其中，所述升高的温度在33℃和41℃之间。
42.一种制造SARS灭活疫苗的方法，包括：
a.在哺乳动物细胞培养物中接种SARS病毒；
b.培养受感染的细胞；
c.收获含有SARS病毒的上清液；
d.灭活SARS病毒；和
e.纯化灭活的SARS病毒。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养物衍生自一种或多种选自下组的细胞类型：成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞、角质形成细胞、免疫细胞、乳腺细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞、神经细胞、前列腺细胞、肾细胞、骨骼细胞、肝脏细胞、成视网膜细胞和基质细胞。
44.如权利要求42所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养物衍生自选自下组的细胞培养物：人细胞、非人灵长类细胞、HeLa细胞、人二倍体细胞、恒河猴胎肺细胞、人胚肾细胞、Vero细胞、马细胞、牛细胞、绵羊细胞、狗细胞、猫细胞或啮齿动物细胞。
45.如权利要求42所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养物衍生自Vero细胞或恒河猴胎肾细胞。
46.如权利要求42所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞在无血清培养基中培养。
47.如权利要求42所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞在无蛋白质培养基中培养。
48.如权利要求42所述的方法，其中，所述接种步骤包括使SARS病毒附于到细胞培养物60-300分钟。
49.如权利要求42所述的方法，其中，所述接种步骤在25-40℃进行。
50.如权利要求42所述的方法，其中，所述纯化步骤包括一种或多种选自下组的处理：梯度离心、超速离心、连续流动超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀和硫酸铵沉淀。
51.如权利要求42所述的方法，其中，所述纯化步骤包含一种或多种选自下组的处理：超滤和渗滤。
52.如权利要求50所述的方法，其中，所述层析处理包括一种或多种选自下组的层析处理：离子交换层析、尺寸排阻层析和液相亲和层析。
53.如权利要求52所述的方法，其中，所述层析处理包括使用一种或多种选自下组的层析树脂：阴离子树脂和阳离子树脂。
54.如权利要求52所述的方法，其中，所述离子交换层析处理包括使用强阴离子交换树脂的第一步骤和使用强阳离子交换树脂的第二步骤。
55.如权利要求50所述的方法，其中，所述梯度离心纯化步骤包括密度梯度离心。
56.如权利要求42所述的方法，其中，所述纯化步骤包括第一步层析纯化和第二步梯度离心。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述第一步层析纯化包括液相亲和层析。
58.如权利要求56所述的方法，其中，所述第二步梯度离心包括密度梯度离心。
59.一种包含选自下组的核苷酸序列的单链寡核苷酸：SEQ ID NOS：21-6020，6076-6568，6586-6587，7292-7301，7325-7328，7332-7352，7353-7385，10235-10298，10352-10504，10580-11322和11325-11551。
60.一种包含权利要求59所述寡核苷酸的互补序列的单链寡核苷酸。
61.如权利要求59或权利要求60所述的寡核苷酸，其包含10-30个核苷酸。
62.如权利要求61所述的寡核苷酸，包含SEQ ID NO：7292、SEQ ID NO：7293的核苷酸序列、SEQ ID NO：7292的互补序列或SEQ ID NO：7293的互补序列。
63.一种含有用来扩增SARS病毒核酸靶中所含模板序列的引物的试剂盒，该试剂盒包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物含有与所述模板序列的一部分基本互补的序列，而所述第二引物含有与所述模板序列的互补序列的一部分基本互补的序列，其中，所述引物内基本互补的序列确定了待扩增的模板序列的两个末端。
64.如权利要求63所述的试剂盒，其中，所述模板序列含在SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2中。
65.如权利要求63或权利要求64所述的试剂盒，其中，所述第一引物包含SEQ IDNO：1的8个或更多核苷酸的片段，第二引物包含SEQ ID NO：1互补序列的8个或更多核苷酸的片段。
66.如权利要求63或权利要求64所述的试剂盒，其中，所述第一引物包含SEQ IDNO：2的8个或更多核苷酸的片段，第二引物包含SEQ ID NO：2互补序列的8个或更多核苷酸的片段。
67.如权利要求63所述的试剂盒，其中，所述第一引物是权利要求59-62中任一项所述的寡核苷酸，第二引物是权利要求59-62中任一项所述的寡核苷酸。
68.如权利要求63-67中任一项所述的试剂盒，还包括标记的探针，所述探针包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的8个或更多核苷酸的片段，或所述片段的互补序列，该片段位于所述模板序列内。
69.如权利要求63-68中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一引物和/或第二引物包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NOS：21-6020，6076-6568，6586-6587，7292-7301，7325-7328，7332-7352，7353-7385，10235-10298，10352-10504，10580-11322和11325-11551。
70.如权利要求63-68中任一项所述的试剂盒，其中，所述第一引物和/或第二引物包含选自下组的核苷酸序列的互补序列：SEQ ID NOS：21-6020，6076-6568，6586-6587，7292-7301，7325-7328，7332-7352，7353-7385，10235-10298，10352-10504，10580-11322和11325-11551。
71.一种检测样品中是否存在SARS病毒的方法，该方法包括提供怀疑含有SARS病毒核酸靶的样品，用权利要求63-70中任一项所述的试剂盒扩增所述SARS病毒核酸靶中所含的模板序列，并检测扩增的模板序列，其中，存在扩增的模板序列表明所述样品中存在SARS病毒。
72.如权利要求71所述的方法，其中，所述扩增用以下方法完成：聚合酶链式反应、转录介导的扩增、逆转录PCR、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。
73.一种长度约10至约30个核苷酸能够灭活哺乳动物细胞内的SARS冠状病毒的双链RNA分子。
74.如权利要求73所述的双链RNA，其中，一条链的序列与靶序列至少90％相同，其中所述靶序列是SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的片段。
75.如权利要求73或权利要求74所述的双链RNA，其中，所述靶序列包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NOS：7292，7293，7294，7295，7296，7297，7298，7299，7300和7301。
76.如权利要求73-75中任一项所述的双链RNA，其包含至少一个修饰的核苷酸。
77.一种治疗SARS患者的方法，包括给予该患者治疗有效剂量的小于1000g/mol的分子。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述分子具有芳香性区域和一个以上选自O、S或N的杂原子。
79.一种治疗SARS患者的方法，包括给予该患者治疗有效剂量的选自下组的化合物：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C-样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶-样蛋白酶抑制剂或依赖于RNA的RNA聚合酶的抑制剂。
80.一种治疗SARS患者的方法，该方法包括给予该患者类固醇抗炎药和至少一种抗病毒化合物。
81.一种治疗SARS患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效剂量的选自下组的化合物：无环鸟苷、gancyclovir、vidarabidine、foscamet、cidofvoir、amantidine、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、表1所列抗病毒化合物、表2所列抗病毒化合物或干扰素。
82.如权利要求81所述的方法，其中，所述干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
83.如权利要求77-82中任一项所述的方法，其中，所述分子或化合物通过吸入输送。
84.一种鉴定治疗活性剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)使治疗活性剂与被SARS病毒感染的细胞接触；(b)测定与SARS有关的酶的减毒情况。
85.一种用来体内输送权利要求9或权利要求10所述核酸的病毒载体或颗粒。
86.如权利要求85所述的病毒载体，其中，所述载体是腺病毒载体、痘病毒载体或α病毒载体。
87.一种含有一种或多种SARS病毒抗原的α病毒复制子颗粒。
88.如权利要求87所述的复制子颗粒，其中，所述SARS病毒抗原是刺突蛋白。
89.如权利要求87所述的复制子颗粒，其中，所述颗粒包含衍生自委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的复制子，还包含衍生自辛德比斯病毒(SIN)或Semliki森林病毒(SFV)的包膜。
90.一种含有一种或多种SARS病毒抗原和一种或多种呼吸道病毒抗原的疫苗。
91.如权利要求90所述的疫苗，其中，所述呼吸道病毒抗原选自下组：流感病毒、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、超级肺病毒和鼻病毒。
92.如权利要求91所述的疫苗，其中，所述呼吸道病毒抗原来自流感病毒。
93.如权利要求90所述的疫苗，其中，所述呼吸道病毒抗原来自SARS病毒之外的冠状病毒。
94.一种包含氨基酸序列SEQ ID NO：6042的暴露于表面的免疫原性片段的多肽。
95.如权利要求94所述的多肽，其中，所述片段不包括SEQ ID NO：6042 C-末端最后50个氨基酸。
96.如权利要求94所述的多肽，其中，所述片段不包括SEQ ID NO：6042的跨膜结构域。
97.如权利要求94所述的多肽，其中，所述片段不包括SEQ ID NO：6042的C-末端胞质结构域。
98.如权利要求94所述的多肽，其中，所述片段不包括N-末端信号序列。
99.一种包含选自SEQ ID NOS：9968和10066的核酸序列的分离的多核苷酸。
100.如权利要求99所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含与选自SEQ IDNOS：9968和10066的多核苷酸序列有＞80％序列相同性的核酸序列。
101.一种包含选自SEQ ID NOS：9968和10066的核酸序列至少15个连续核酸的片段的分离的多核苷酸，其中，所述片段不含整个SEQ ID NO：10033。
102.一种含有由权利要求99-101中任一项所述序列编码的氨基酸序列的分离的多肽。
103.如权利要求102所述的多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNOS：9969-10032，10067和10015。
104.如权利要求103所述的多肽，其中，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NOS：9997，9998和10015。
105.一种重组表达SARS病毒刺突蛋白的表达构建物，其中，所述构建物包含选自SEQ ID NOS：6578-6583的核酸序列。
106.一种稳定表达SARS病毒抗原的哺乳动物细胞系。
107.如权利要求106所述的细胞系，其中，所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
108.如权利要求106所述的细胞系，其中，所述SARS病毒抗原是刺突蛋白或其片段。
109.如权利要求106所述的细胞系，其中，所述刺突蛋白是截短的以除去跨膜序列。
110.一种鉴定治疗活性剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)使治疗活性剂与含有SARS酶的缓冲液接触；和(b)测定SARS酶的减毒情况。
111.如权利要求110所述的方法，其中SARS酶是SARS蛋白酶。
112.如权利要求111所述的方法，其中，所述缓冲液还包含具有SARS蛋白酶切割位点的肽。
113.如权利要求110所述的方法，其中，所述测定通过荧光测定完成。
114.如权利要求22-37和90-93中任一项所述的疫苗，还包括佐剂。
115.如权利要求114所述的疫苗，其中，所述佐剂是SMIP。
116.如权利要求115所述的疫苗，其中，所述SMIP化合物选自：酰基哌嗪、色胺酮、吲哚二酮、四氢异喹啉、苯并环二酮、氨基氮杂乙烯化合物、硫代缩氨基脲、内酰胺、氨基苯并咪唑喹啉酮、羟基邻苯二酰亚胺、二苯甲酮、异噁唑、固醇、喹唑酮、吡咯(pyrole)、蒽醌、喹噁啉、三嗪、吲哚和吡唑并嘧啶，或它们的药学上可接受的盐、酯或前药。
117.一种给对象接种疫苗的方法，包括给予该对象如权利要求22-37和90-93中任一项所述的疫苗。
118.如权利要求117所述的方法，还包括给予SMIP。
119.如权利要求77-82中任一项所述的治疗患者的方法，还包括给予至少一种SMIP化合物。
120.如权利要求77-82中任一项所述的治疗患者的方法，还包括给予至少一种SMIS化合物。
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