DD248279A1 - Antiphytovirale therapie mit biogenen mitteln - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft biogene Mittel zur antiphytoviralen Therapie. Diese enthalten ein Monorhamnolipid und/oder Dirhamnolipid, das im Rahmen biotechnologischer Prozesse aus dem Kulturfiltrat von Pseudomonas aeruginosa gewonnen wird. Auf entsprechender Basis hergestellte Spritzbruehen, die sich infolge der oberflaechenaktiven Eigenschaften des erfindungsgemaessen Mittels durch ausgepraegte Tensid- oder Haftmittelwirkung auszeichnen, verhindern oder verlangsamen, auf virusgefaehrdete Pflanzen aufgebracht, u. a. die Infektion mit oder die Vermehrung von Viren, die in Kulturen von oekonomisch bedeutsamen Nachtschattengewaechsen, z. B. Kartoffel, Tomate oder Tabak, schaedigend auftreten. Auch Leguminosen schaedigende Viren werden gehemmt. Kombinierte Ausbringung zusammen mit hydrierten Triazinen steigert die antiphytoviralen Wirkungen. Kombinierte und alternierende Anwendung mit verschiedenen anderen antiphytoviralen Praeparationen beugt der Ausbildung praeparatenresistenter Virusstaemme vor.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Mittel zur Chemotherapie pflanzlicher Virosen. Diese ermöglicht es, die nur unzureichend wirksamen sog. klassischen antiviralen Maßnahmen, zu denen z.B. Bekämpfung der Virusvektoren, u.a. der virusübertragenden Blattläuse, Selektion erkrankter Pflanzen und Resistenzzüchtung gehören, durch direkte Bekämpfungsmaßnahmen zu ergänzen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In den letzten Jahren ist eine größere Anzahl von Präparaten aufgefunden bzw. entwickelt worden, die die Vermehrung von Pflanzenviren hemmen. Zu diesen gehören Analoga von Purin- und Pyrimidinbasen bzw. von entsprechenden Nucleosiden und Nucleotiden, Antibiotika aus Mikroorganismen oder Inhaltsstoffe aus höheren Pflanzen, ferner Polyanionen, substituierte Triazine bzw. hydrierte Triazine, Harnstoffe und Carbamate, Thioharnstoffe, Guanidine, bestimmte Verbindungen mit Azinstruktur, Thiadiazole, Oxazole, a-Benzylthio-carbonyliminoverbindungen, Lysolecithine sowie Fraktionen biogener Lipide. Eine Übersicht hierüber ist u.a. in der Patentschrift DD-PS 157662 gegeben. Noch immer bedarf die antiphytovirale Chemotherapie jedoch sowohl bezüglich antiphytoviraler Aktivität als auch der Wirkungsspektren dringend der Weiterentwicklung. Ebenso ist es notwendig, verschiedene Präparate mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen zur Verfügung zu haben, um durch aufeinanderfolgende (Präparatenrotation) oder gleichzeitige Anwendung (Präparatekombination) der Ausbildung präparatenresistenter Virusstämme vorzubeugen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die antiphytovirale Chemotherapie im Hinblick auf das erfaßbare Wirtsspektrum und die erreichbaren antiphytoviralen Aktivitäten weiter zu verbessern sowie Resistenzerscheinungen vorzubeugen. Ein weiteres Ziel ist die Nutzung umweltfreundlicher biotechnologischer Prozesse für die Gewinnung antiphytoviraler Mittel aus Mikroorganismen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,biogene, nicht zu den Antibiotika zählende Wirkstoffe aufzufinden, die aufgrund ihrer chemischen Konstitution von den Pflanzen aufgenommen werden und in diesen die Virusreplikation beeinträchtigen. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur antiphytoviralen Therapie Rhamnolipide aus Pseudomonas aeruginosa verwendet werden. Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Mono- oder Dirhamnosylderivate darstellen, die esterartig mit geradkettigen Fettsäuren der Kettenlänge zwischen C10 und C14 verknüpft sind.

Die Kultivierung von Pseudomona aeruginosa, die Isolierung des Dirhamnolipids und die Reinigung erfolgen nach den beschriebenen Verfahren. Die Oberflächenspannung des zellfreien Kulturfiltrates beträgt etwa 26-29 mN/m, die Grenzflächenspannung gegen Hexadecan etwa 0,5mN/m. Die Konzentration während der Produktionsphase beträgt 10 bis 20 x CMC"¹, die Ausbeute an reinem Dirhamnolipid liegt zwischen 1,5g/l—4,0 g/l. Die Oberflächenspannung des reinen Dirhamnolipids in 0,1 M NaHCO3 bei der kritischen Micellbildungskonzentration beträgt 34mN/m. Das umkristallisierte Dirhamnolipid schmilzt einheitlich bei 82^CC.

Das erfindungsgemäße Mittel, das infolge seiner oberflächenaktiven Eigenschaften die Haft- und Benetzungsfähigkeitvon Präparationen beachtlich erhöht, zeigt eine ausgeprägte antivirale Wirkung, insbesondere gegenüber wirtschaftlich bedeutsamen Kartoffelvirosen, z. B. verschiedenen Mosaikerkrankungen (Erreger: u. a. Kartoffel-X- und Kartoffel-A-Virus) und der Blattrollkrankheit der Kartoffel (Erreger: Blattrollvirus der Kartoffel). Ferner lassen sich verschiedene Viruskrankheiten der Tomate und des Tabaks bekämpfen. So übt es gute Wirkung gegenüber dem schwer bekämpfbaren Tabakmosaikvirus aus. Auch Leguminosenviren, die bei wichtigen für Futter- oder Ernährungszwecke angebauten Hülsenfrüchten erhebliche Schäden hervorrufen, z. B. das multikomponente Rotkleescheckungsvirus, werden durch die erfindungsgemäße Verbindung gehemmt. Diese bedeutet eine bedeutsame Vergrößerung der bisherigen Palette der antiphytoviralen Präparate, die es u. a. ermöglicht, die Präparaterotation zu erweitern und somit der Selektion von Virusstämmen, die gegen bestimmte antiphytovirale Präparationen resistent sind, entgegenzuwirken. Zusammen mit hydrierten Triazinen ausgebracht, erhöht sich die antiphytovirale Wirkung des erfindunqsgemäßen Mittels beträchtlich.

Zur Erzielung eines für die Praxis ausreichenden Schutzes gegen Ertragsminderungen durch Virusbefall genügen im allgemeinen Aufwandmengen von 1 bis 1Okg/ha. Die Formulierung und Applikation der erfindungsgemäßen Mittel kann nach den bekannten und praxisüblichen Methoden erfolgen. So kann der Wirkstoff mit inerten Verdünnungsmitteln und geeigneten Formulierungsmitteln versetzt und zu Spritzpulvern, Pasten, Emulsionskonzentraten usw. verarbeitet werden. Da das erfindungsgemäße Di- bzw. Monorhamnolipid Tensid- und Haftmittelwirkung ausübt, erübrigen sich jedoch entsprechende Zusätze.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Wirkstoffgehalt 10 bis 90% des Mittels ausmacht. Die Mittel können vorder Anwendung mit Wasser zu Spritzbrühen dispergiert und mit den gebräuchlichen Spritz-, Sprüh-und Nebelgeräten ausgebracht werden. . ' . · ·

Ausführungsbeispiele

Für die Kennzeichnung der antiphytoviralen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindung(en) fand schwerpunktmäßig Dirhamnolipid technischer Qualität Verwendung, das nach den angegebenen Verfahren gewonnen worden ist. Es sind noch Spuren (<1 %) von Aktivkohle vorhanden. Die Substanz ist bei schwach alkalischem pH-Wert (pH 7-pH 8) gut wasserlöslich, z. B. in 0,05-0,1 M NaHCO₃.

Beispiel 1:

Das erfindungsgemäße Rhamnolipid wurde 2 Tage vor sowie 2 und 7 Tage nach der Inokulation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum ,Samsun' L.) mit Kartoffel-X-Virus in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Sprosse jeweils bis zur Tropfnässe aufgesprüht bzw. mit einem feinen Haarpinsel aufgetragen. Dabei erübrigte sich infolge der guten oberflächenaktiven Eigenschaften der Zusatz von Netz- oder Haftmittel. Die in den einzelnen Pfianzenteilen erreichte Viruskonzentration wurde zu geeigneter Zeit serologisch im Präzipitationstropfentest, jeweils pflanzenweise getrennt, in 8- bis 1 öfacher Wiederholung ermittelt. Aus den erhaltenen Einzelwerten wu/den die Durchschnittswerte gebildet und mit den Durchschnittswerten (Mittelwerten) der Kontrollen verglichen. In der nachfolgenden Ergebnisaufstellung ist die in den mit Rhamnolipid behandelten Pflanzenteilen vorgefundene Verminderung der Viruskonzentration in Prozenten der jeweiligen Kontrolle angegeben. Je höher die Prozentwerte, desto stärker ist die antiphytovirale Wirkung. Alle erforderlichen Manipulationen und die Verrechnung sind bei G.Schuster (Archiv Phytopath. u. Pflanzenschutz 13,1977, 231-241) sowie z.B. in der Patentschrift DD-PS 157664ausführlich beschrieben. Die Prüfung der Signifikanz der in Form von Relativwerten zum Ausdruck gebrachten Differenzen in der Viruskonzentration erfolgte mittels des t-Testes nach Student (einseitige Fragestellung). Die Prüfungsergebnisse sind neben den Prozentwerten mit den üblichen Signifikanzsymbolen wiedergegeben:

: p>5%

Ergebnistabelle zu Beispiel 1:

Prozentuale Hemmung der Konzentration des Kartoffel-X-Virus (Kontrolle = 0% Hemmung) nach Behandlung von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L ,Samsun') mit dem erfindungsgemäßen Rhamnolipid

Konzentration Hemmung % (Kontrolle = 0%)

desRhamnolipids undSignifikanzderDifferenzzurKontrolle

im inokulierten im sekundär infizierten

Blatt Blatt 0,5 22 6

1 44⁺⁺⁺ 4O⁺

2 13- 46⁺

Die Ergebnistabelle läßt erkennen, daß die antiphytovirale Präparation das Kartoffel-X-Virus konzentrationsabhängig sowohl im inokulierten als auch im sekundär infizierten Blatt hemmt. Für die Beeinflussung der Virusvermehrung im sekundär infizierten Blatt sind etwas höhere Konzentrationen als für die Beeinflussung der Virusvermehrung im inokulierten Blatt erforderlich. Ahnlich wie das Kartoffel-X-Virus reagieren zahlreiche weitere Kartoffelviren, so daß die angeführten Befunde mit geringen Abweichungen z. B. auch für das Kartoffel-S-, -A- und -Y-Virus sowie das Blattrollvirus gültig sind.

Beispiel 2:

Das erfindungsgemäße Rhamnolipid wurde 2 Tage vor und 2 Tage nach der Inokulation von Bauerntabak (Nicotiana glutinosa L.) mit dem Tabakmosaik-Virus (TMV) auf die Blätter dieser Pflanze aufgetragen. Das TMV bildet auf Nicotiana glutinosa ringsum die Infektionsherde lokale, nekrotische Flecken, sog. Lokalläsionen, auf deren Umgebung die Virusausbreitung beschränkt bleibt. Ihre Anzahl gibt Auskunft über die Zahl der Infektionsherde. Je stärker diese verringert ist, um so stärker hat ein Präparat die Infektion mit dem sehr schwer bekämpfbaren Virus beeinträchtigt.

Ergebnistabelle zu Beispiel 2:

Hemmung der Ausbildung von Lokalläsionen des Tabakmosaik-Virus (TMV) auf Nicotiana glutinosa L. nach Behandlung mit dem erfindungsge'mäßen Rhamnoiipid (1 und 2%)

Variante	Anzahl Lokalläsionen	Hemmung (%)zur
	Blatthälfte	Kontrolle und
		Signifikanz der
		Differenz
Kontrolle	81,9 ±5,6	—
Rhamnoiipid (1 %)	8,4 ±1,7	89,7+++
Kontrolle	77,0 ± 8,7	—
Rhamnoiipid (2%)	5,0 ±1,2	93,5+++

Die Ergebnistabelle zeigt, daß das erfindungsgemäße antiphytovirale Rhamnoiipid mikrobieiler Herkunft nach Inokulation des Tabakmosaik-Virus auch die Infektionsherde dieses schwer bekämpfbaren Virus in den geprüften Aufwandmengen erheblich und hochsignifikant vermindert.

Beispiel 3:

Erbsenpflanzen (Pisum sativum convar. speciosum Dierb.Alef,Nadja') waren 10 bzw. 12 Tage nach der Aussaat, als sich das erste Fiederblatt voll entwickelt hatte, je einen Tag vor und einen Tag nach der Inokulation mit Rotkleescheckungs-Virus (= RCMV = red clover mottle virus) jeweils 3mal mit Rhamnolipidlösung bis zur Tropf nässe besprüht worden. Die Bestimmung des Virusgehaltes erfolgte 9 Tage nach der Inokulation sowohl serologisch im Ringtest (Kluge, S., Marcinka, K.: Acta viral. 23, 1979,148-152) als auch im Lokalläsionentest auf Phaseolus vulgaris L. ,Alfa'.

Ergebnistabelle zu Beispiel 3:

Hemmung der Konzentration des Rotkleescheckungs-Virus (RCMV) im systemischen Wirt Pisum sativum convar. speciosum (Dierb.) Alef ,Nadja' durch Rhamnoiipid (1 und 2%ig). Virusgehaltsbestimmung serologisch im Ringtest durch Endpunktbestimmung und Lokalläsionentest auf Phaseolus vulgaris L. ,Alfa'

Variante	serologischerTest	Lokalläsionentest
	Hemmung %	Hemmung %
Kontrolle	0	0
Rhamnoiipid (1 %)	+ 12,0'	-21,7'
Rhamnoiipid (2%)	+ 29,3'	+ 43,5+

Die Ergebnistabelle zeigt, daß 2%ige Lösungen des erfindungsgemäßen Rhamnolipids auch die Replikation des RCMV erheblich vermindern.

Beispiel 4:

Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Testmethodik wurde nachgewiesen, daß die antiphytoviralen Aktivitäten des erfindungsgemäßen Rhamnolipids durch gleichzeitige!= kombinierte) Ausbringung zusammen mit sehr geringen Mengen von 2,4-Dioxohexahydro-1,3,5-triazin oder anderweitigen hydrierten Triazinen beachtlich gesteigert werden können. Umgekehrt erhöht das erfindungsgemäße Mittel, insbesondere durch Steigerung der Haft- und Benetzungsfähigkeit der Präparation, auch die antiphytovirale Wirkung der hydrierten Triazine

Ergebnistabelle zu Beispiel 4:

Verstärkte Hemmung des Kartoffel-X-Virus in sekundär infizierten Blättern von Nicotiana tabacum ,Samsun' durch Kombination des erfindungsgemäßen Rhamnolipids (1 %) mit 2,4-Dioxohexahydro-1,3,5-triazin (= DHT; 0,0025%)

Variante	Hemmung % (Kontrolle = 0%)
Rhamnoiipid 1 %	4O+
Kombination Rhamnoiipid 1 %
+ DHT 0,0025%	88+++
DHT 0,0025%	72+++

Claims (4)

1. Biogene Mittel zur antiphytoviralen Therapie, dadurch gekennzeichnet, daß sie neben üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen als Wirkstoff Mono- oder Dirhamnolipid enthalten, die von Pseudomonas aeruginosa an ein Kulturfiltrat abgegeben und aus diesem isoliert werden.

2. Mittel entsprechend Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Präparationen infolge ihrer oberflächenaktiven Eigenschaften der Rhamnolipide auch als Netz- und Haftmittel wirken.

3. Mittel entsprechend Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie neben den erfindungsgemäßen. Wirkstoffen sowie üblichen Hilfs- und Trägerstoffen auch weitere Formulierungshilfsmittel enthalten können.

4. Mittel entsprechend den Punkten 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die antiphytovirale Wirkung durch Kombination mit hydrierten Triazinen synergistisch gesteigert wird.