DD251788A5 - Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert, das beispielsweise zur Behandlung von Anaemie angewandt wird. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Klonierung eines Gens, das eine ueberraschend hohe Menge von menschlichem Erythropoietin exprimiert. Das erfindungsgemaesse Verfahren wird in der Weise ausgefuehrt, dass a) gereinigtes Erythropoietin-Protein durch Trypsin verdaut wird.

Description

Hierzu 11 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung\

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin j

exprimiert. Dieses wird angewandt als Arzneimittel, beispielsweise zur Behandlung von Anämie.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung klonierte Gene des menschlichen Erythropoietins, die überraschenderweise hohe Expressionsraten liefern, die Expression der genannten Gene und die in-vitro Produktion des menschlichen Erythropoietins.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Erythropoietin (im folgenden EPO abgekürzt) ist ein zirkulierendes Glycoprotein, das die Erythrozytenbildung in höheren Organismen stimuliert (vgl. Carnot et al., Compt. Rend. 143,384 [1906]). Deshalb wird EPO manchmal auch als Elektropoesestimulierender Faktor bezeichnet.

Die Lebenszeit von menschlichen Erythrozyten beträgt ungefähr 120 Tage. Dies bedeutet, daß ungefähr V120 der gesamten Erythrozyten täglich im retikuloendothelialen System zerstört werden. Gleichzeitig wird eine relativ konstante Anzahl von Erythrozyten täglich produziert, um die Konzentration von Erythrozyten konstant zu halten (Guyton, Textbock of Medical Physiology, S.55-60, W.B.SaundersCo., Philadelphia [1976]).

Erythrozyten werden bei'der Reifung und Differenzierung der Erythroblasten im Knochenmark gebildet. EPO ist ein Faktor, der auf weniger differenzierte Zellen wirkt und deren Differenzierung zu Erythrozyten induziert (Guyton, s.o.). EPO ist ein vielversprechendes therapeutisches Mittel für die klinische Behandlung von Anämie oder im speziellen von renaler Anämie. Der Gebrauch von EPO ist leider in der praktischen Therapie aufgrund seiner geringen Verfügbarkeit noch nicht geläufig. Um EPO als therapeutisches Mittel anwenden zu können, sollte Rücksicht auf die mögliche Antigenwirkung genommen werden, und deshalb sollte EPO vorzugsweise aus Rohmaterial menschlichen Ursprungs hergestellt werden. Beispielsweise können menschliches Blut oder Urin von Patienten verwendet werden, die an aplastischer Anämie oder ähnlichen Krankheiten leiden und hohe Mengen an EPO ausscheiden. Diese Rohmaterialien jedoch sind nur in begrenzter Menge verfügbar (vgl. beispielsweise White et al., Rec. Progr. Horm. Res. 16,219 [1960]; Espada et al., Biochem. Med. 3,475 [1970]; Fisher, Pharmacol. Rev. 24,459 [1972] und Gordon, Vitam. Horm. [N. Y.] 31,105 [1973]).

Die Herstellung von EPO-Produkten erfolgte im allgemeinen durch Konzentrierung und Reinigung von Urin von Patienten mit hohem EPO-Spiegel, die beispielsweise an aplastischer Anämie oder ähnlichen Krankheiten leiden (vgl. US-PS 4,397,840, 4,303,650 und 3,865,801). Die begrenzte Verfügbarkeit von solchem Urin ist ein Hindernis für die praktische Verwendung von EPO. Deshalb ist es wünschenswert, EPO-Produkte aus dem Urin von gesunden Menschen herzustellen. Das Problem bei der Verwendung von Urin von gesunden Menschen liegt in dem geringen Gehalt von EPO im Vergleich zu dem von anämischen Patienten. Zusätzlich enthält der Urin von gesunden Menschen gewisse Inhibiermigsfaktoren, die in ausreichend hohen ο». Konzentrationen gegen Elektropoese wirken, so daß ein befriedigender therapeutischer Effekt nur nach gründlicher Reinigung des EPO erhalten werden kann.

EPO kann ebenfalls aus dem Blutplasma von Schafen erhalten werden. Die Trennung von EPO aus dem Blutplasma ergibt ausreichend starke und stabile wasserlösliche Präparationen (vgl. Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., Part A, S. 487-494, Alan R.Liss, Inc., N. Y. [1981]). EPO von Schafen jedoch könnte im Menschen eine Antigen-Wirkung besitzen.

Obwohl EPO ein Wünschenwertes therapeutisches Mittel darstellt, sind die bisherigen Isolierungs- und Reinigungstechniken aus natürlichen Quellen für eine Massenproduktion dieser Verbindung nicht angemessen. Sugimoto et al. beschreiben im US-PS 4,377,51.3 ein Methode für die Massenproduktion von EPO, die die in-vivo Vermehrung von menschlichen lymphoblastischen Zellen, wie Namalwa, BALL-1, NALL-1,TALL-1 und JBL umfaßt.

Die Produktion von EPO über andere gentechnologische Methoden ist in der Literatur beschrieben. Jedoch ist weder eine vollständige Enthüllung noch die chemische Natur des Produktes bisher veröffentlicht. Die vorliegende Anmeldung liefert die vollständige Enthüllung für die Massenproduktion von Proteinen und zeigt die biologischen Eigenschaften der Proteine und des menschlichen EPO auf. Durch solche Techniken ist es ebenso möglich, Proteine zu produzieren, die sich chemisch vom authentischen menschlichen EPO unterscheiden, jedoch ähnliche (und in manchen Fällen bessere) Eigenschaften aufweisen. Solche Proteine, die biologische Eigenschaften von menschlichem EPO aufweisen, sollen im folgenden als EPO bezeichnet werden, unabhängig davon, ob sie chemisch mit EPO identisch sind oder nicht.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert. -

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Klonierung eines Gens zu ermöglichen, das eine überraschend hohe Menge von menschlichem EPO exprimiert, dessen Expression und die in-vitro Massenproduktion von aktivem menschlichem EPO. Die geeigneten Expressionsvektoren fürdie Produktion von EPO, Expressionszellen, Reinigungsschemata und damit verwandte Prozesse werden erfindungsgemäß beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert ist dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein gereinigtes Erythropoietin-Protein durch Trypsin verdaut wird.

Erfindungsgemäß wird in der Weise verfahren, daß Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezüchtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb.3B dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. Bevorzugt wird so verfahren, daß eukaryontische Wirtszellen in einem entsprechenden Medium gezüchtet werden, die eine wie im wesentlichen in Abb.4C dargestellte DNA-Sequenz enthalten, die wirksam an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist, und das auf diese Weise von den Zellen und dem Medium produzierte Erythropoietin abgetrennt wird. Erfindungsgemäß sind die Wirtszellen Säugerzellen, beispielsweise 3T3-Zellen oder Ovarien-Zellen des China-Hamsters (CHO).

Weiterhin ist erfindungsgemäß die betreffende DNA-Sequenz in einem Vektor beinhaltet, der auch die Rinder-Papilloma-Virus-DNA enthält.

Wie im folgenden näher beschrieben wird, wurde EPO in teilweise gereinigter Form erhalten, vollständig gereinigt und mit Trypsin verdaut, um spezifische Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente wurden gereinigt und sequenziert. Aus diesen Sequenzen wurden EPO-Oligonucleotide zugeordnet und synthetisiert. Diese Oligonucleotide wurden zum Screening einer menschlichen Genkartei benutzt, aus der ein EPO-Gen isoliert wurde.

Die Richtigkeit des EPO-Gens wurde aufgrund seiner DNA-Sequenz, die mit vielen sequenzierten tryptischen Protein-Fragmenten übereinstimmen, festgestellt. Ein Teil des genomischen Klons wurde dann verwendet, um durch Hybridisierung zu zeigen, daß EPO in menschlicher fötaler, 20 Wochen alter mRNA nachgewiesen werden konnte. Eine cDNA-Bibliothek der menschlichen fötalen Leber wurde aufgestellt und im Screening-Verfahren getestet. Drei EPO-cDNA-Klone wurde erhalten (nach dem Screening von 750000 Rekombinanten). Zwei dieser Klone besaßen die volle Länge, wie aus der kompletten Codierungssequenz und der im wesentlichen unübersetzten Sequenz des 3'- und 5'-Endes gefolgert wurde. Diese cDNA wurde sowohl in SV-40 virustransformierten Affenzellen (COS-1-Zellinie; Gluzman, Cell 23,175-182 [1981]) und in Ovarien des Chinahamsters (CHO-Zellinie; Urlaub G. und Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4216-4280 [1980]) exprimiert. Das von COS-Zellen produzierte EPO ist in-vitro und in-vivo biologisch aktives EPO. Das von CHO-Zellen produzierte EPO ist in-vitro biologisch aktiv und wurde Γη-vivo nicht getestet.

DerEPO-cDNA-Klon hat einen interessanten offenen Ableserahmen von 14-15 Aminosäuren (aa) mit Initiator und Terminator von 20-30 Nucleotiden (nt) oberhalb der Codierungsregion. Eine repräsentative mit dem klonierten EPO-Gen transferierte Probe von E. coli wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 40153 erhältlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 stellt die Basissequenz eines Exons von 87 Basenpaaren des menschlichen EPO-Gens dar.

Abbildung 2 zeigt den Nachweis des EPO-mRNA in der menschlichen fötalen Leber-mRNA.

Abbildung 3a zeigt die Aminosäuresequenz eines EPO-Proteins, die von der Nucleotidsequenz von Lambda-HEPOFL13 abgeleitet wurde.

Abbildung 3 b zeigt die Nucleotidsequenz der EPO-cDNA in Lambda-HEPOFLI 3 und die davon abgeleitet Aminosäuresequenz.

Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschüben von vier unabhängigen menschlichen EPO-Genomklonen.

Abbildung 4b zeigt eine Karte der aparenten Intron- und Exonstrukturen des menschlichen EPO-Gens.

Abbildung 4c zeigt eine DNA-Sequenz des EPO-Gens, das in Abbildung 4b dargestellt ist.

Abbildungen 5a, 5b und 5c zeigen die Konstruktion des Vektors 91023(B).

Abbildung 6 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse des in COS-1-Zellen produzierten EPO im Vergleich zum nativen EPO.

Abbildung 7 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons, Lambda-HEPOFL6.

Abbildung 8 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEPOFL8.

Abbildung 9 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEPOFL13.

Abbildung 10 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pRKL-4.

Abbildung 11 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pdBPV-MMTneo(342-12).

Nähere Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von EPO-Genen und die Produktion von EPO durch die in-vitro Expression dieser Gene.

Die Patentliteratur und die wissenschaftliche Literatur sind überfüllt mit Prozessen, die für die Produktion von rekombinaten Produkten anwendbar sind. Diese Techniken enthalten im allgemeinen die Isolierung oder Synthese der gewünschten Gensequenz und die Expression dieser Sequenz in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, indem die vom Fachmann üblichen Techniken angewendet werden. Sobald ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert (d.h. kloniert) wurde, ist seine Verfügbarkeit in größeren Mengen sichergestellt. Der Vektor wird mit seinem klonierten Gen in einen passenden Mikroorganismus oder eine Zellinien transferiert, z. B. in Bakterien, Hefe, Säugerzellen, wie z. B. COS-1 (Affenniere), CHO (Ovarium des Chinahamsters), Zellinie von Insekten, und dergleichen, in denen der Vektor repliziert wird, sobald der Mikroorganismus oder die Zellinie sich vermehrt, und von denen der Vektor durch konventionelle Methoden isoliert werden kann. Auf diese Weise wird eine kontinuierlich erneuerbare Quelle des Gens geliefert und damit weitere Manipulationen, Modifikationen und der Transfer zu anderen Vektoren oder anderen Orten innerhalb des gleichen Vektors ermöglicht. Die Expression kann oft erreicht werden durch Transfer des klonierten Gens (in korrekter Richtung und Ableserahmen) in die entsprechende Stelle eines Transfervektors, so daß die Übersetzung von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Gen zu der Synthese eines Protein-Precursors führt. Damit ist die Aminosäuresequenz mitumfaßt, die vom klonierten Gen kodiert wird, das an Methionin oder an einer aminoterminalen Sequenz des prokaryontischen oder eukaryontischen Gens angeknüpft ist. In anderen Fällen können die Signale für die Initiierung der Transkription und Translation durch ein entsprechendes Genomfragment des klonierten Gens geliefert werden. Eine Vielzahl von spezifischen Proteinspaltungstechniken kann angewendet werden, um den Protein-Precursor an einem gewünschten Punkt zu spalten, um so die gewünschte Aminosäuresequenz abzuspalten, die dann durch konventionelle Methoden gereinigt werden kann. In einigen Fällen wird das Protein, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, ohne die Notwendigkeit spezifischer Spaltungstechniken produziert und kann somit auch von Zellen in das extrazelluläre Nährmedium abgegeben werden.

Isolierung eines Genklons des menschlichen EPO

Menschliches EPO wurde aus Urin von Patienten mit aplastischer Anämie in hochreiner Form isoliert, wie im folgenden beschrieben wird. Dieses gereinigte EPO wurde durch Trypsin vollständig verdaut. Dabei wurden Fragmente erhalten, die durch reversed-phase-HPLC getrennt wurden. Aus den Gradient-Fraktionen wurden die einzelnen Fragmente gewonnen und der Mikroanalyse unterworfen. Die Sequenzen der tryptischen Fragmente sind in Abbildung 3 unterstrichen und werden im folgenden näher diskutiert. Zwei Aminosäuresequenzen, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys und Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg wurden für die Konstruktion von Oligonucleotidproben ausgewählt (dies ergibt einen 17 Nucleotide langen und 32fach entarteten Pool von Oligonucleotiden bzw. einen 18 Nucleotide langen und 128fach entarteten Pool von Oligonucleotiden, aus den früheren tryptischen Fragmenten, sowie zwei 14 Nucleotide lange, jeweils 48fach entartete Pools aus den letzteren tryptische Fragmenten). Der 32fach entartete 17-mer-Pool wurde verwendet für das Screening einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek in einem Ch4A-Vektor (22), indem für die Herstellung der Filter für das Screening eine Modifizierung des Woo-und-0'Malley-insitu-Verstärkungsverfahrens (47) angewendet wurde.

Die im Text verwendeten arabischen Nummern (1 )-(61) beziehen sich auf die Publikationen, die am Ende dieser Anmeldung in numerischer Reihenfolge aufgelistet sind.

Die Phagen, welche mit den 17-mer Nucleotiden hybridisieren, wurden gesammelt, in kleine Gruppen zusammengegeben und mit den 14-mer und 18-mer Pools überprüft. Die Phagen, welche mit den 17-mer, 18-merund 14-mer-Pools hybridisieren, wurden mittels der Plaque-Technik gereinigt und Fragmente wurden in M13-Vektorensubkloniert für die Sequenzierung mittels der Dideoxy-Kettenterminierungs-Methode von Sanger und Coulson (23) (1977). Die Sequenz der Region, die mit dem 32fach entarteten 17-mer-Nucleotid in einem der Klone hybridisiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese DNA-Sequenz enthält innerhalb eines offenen Ableserahmens die Nucleotide, die genau das tryptischen Fragment codieren konnten, das für die Ableitung des 17-mer-Pools der Oligonucleotide verwendet wurde. Weiterhin zeigte die Analyse der DNA-Sequenz, daß die 17-mer-Hybridisierungsregion innerhalb eines 87 bp-Exons enthalten war, das durch potentielle Spleißakzeptoren und Donorstellen eingegrenzt war. Die positive Bestätigung, daß diese beiden Klone (im folgenden als Lambda-HEP01 und Lambda-HEP02 bezeichnet) EPO-Genomklone sind, wurde durch Sequenzierung zusätzlicher Exons erhalten, die weitere Code-Informationen beinhalten, die über tryptische Fragmentierung gewonnen wurden.

Isolierung von EPO-cDNA-Klonen

Die Northern-Analyse (56) menschlicher fötaler (20 Wochen alter) Leber-mRNA wurde durchgeführt, indem eine 95 nucleotidlange einsträngige Probe verwendet wurde, die aus einem M13-Klon hergestellt wurde, der ein Teil des in Abbildung 1 beschriebenen 87 bp-Exons enthält. Wie in Abbildung 2 gezeigt ist, konnte ein starkes Signal in fötaler Leber-mRNA entdeckt werden. Die genaue Identifizierung dieser Bande als EPO-mRNA gelang, indem die qleiche Probe für das Sreaning der Bakteriophagen-Lambda-cDNA-Bibliothek der fötalen Leber-mRNA verwendet wurde (25). Mehrere Hybridisierungsklone wurden mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 pro 250000 Rekombinanten erhalten. Die komplette Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für diese Klone (Lambda-HEPOFL13 und Lambda-HEPOFL8) sind in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt. Die EPO-codierende Information ist innerhalb 594 Nucleotiden in der 5'-Hälfte der cDNA enthalten, die ein sehr hydrophobes, 27 Aminosäuren-langes Anfangsstück und das fertige Protein mit einer Länge v.on 166 Aminosäuren beinhalten. Die Zuordnung des N-Terminus des fertigen Proteins beruht auf der N-terminalen Sequenz des Proteins, das im Urin von Personen mit aplastischer Anämie ausgeschieden wird (vgl. Abbildung 1; Goldwasser [26], Sue and Sytkowski [27] und Yanagawa [21]). Ob dieser N-Terminus (Ala-Pro-Pro-Arg—) den aktuellen N-Terminus des zirkulierenden EPO darstellt, oder ob Spaltungen in der Leber oder im Urin stattfinden, ist zur Zeit unbekannt.

Die Aminosäuresequenzen, die in Abbildung 3 unterstrichen sind, weisen auf diejenigen tryptischen Fragmente oder Teile des N-Terminus hin, für die die Proteinsequenz erhalten wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt exakt mit den tryptischen Fragmenten überein, die sequenziert wurden, womit bestätigt wird, daß die isolierten Gene menschliches EPO codieren.

Struktur und Sequenz von menschlichen EPO-Genen

Die Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschüben von 4 unabhängigen menschlichen EPO-Genomklonen. Hybridisierungsanalysen von diesen klonierten DNA's mit Oligonucleotidproben und mit verschiedenen Proben, die von zwei verschiedenen Klassen der EPO-cDNA-Klonen hergestellt wurden, belegen die Position des EPO-Gens schätzungsweise innerhalb der 3,3kb-Region, wie in Abbildung 4a durch die dunklen Linien gezeigt wird. Vollständige Sequenzanalysen von dieser Region (vgl. Beispiel 4) und Vergleich mit den cDNA-Klonen ergeben die Karte der Intron- und Exonstrukturen der EPO-Gene (vgl. Abbildung 4b). Das EPO-Gen ist in fünf Exons unterteilt. Ein Teil von Exon I, die gesamten Exons II, III und IV und ein Teil von Exon V enthalten die Proteincodierungsinformation. Der Rest von Exon I codiert die 5'- und 3'- unübersetzten Sequenzen.

Vorübergehende Expression von EPO in COS-Zellen

Um zu zeigen, daß biologisch aktives EPO in einem in-vitro Zellkultursystem exprimiert werden kann, wurden COS-Zellexpressionsstudien durchgeführt (58). Der Vektor p91023(B), der für die vorübergehenden Studien verwendet wurde, ist in Beispiel 5 beschrieben. Dieser Vektor enthält den Adenovirus-major-late-Promotor, eine SV40-Polyadenylierungs-Sequenz, einen SV40-Ursprung der Replikation, einen SV40-Enhancer und das Adenovirus-VA-Gen. Der cDNA-Einschub Lambda-HEP0FL13 (vgl. Abbildung 8) wurde in'einenp91023(B)-Vektor inseriert, unterhalb des Adenovirus-major-late-Promotors. Dieser neue Vektor wird als pPTFL13 identifiziert.

24 Stunden nach derTransfektion dieser Konstruktion in den M6-Stamm von COS-1-Zellen (Horowitz et al., J. Mol. Appl. Genet. 2,147-149 [1983]) wurden die Zellen gewaschen und das Medium gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Die Zellen werden 48 Stunden später geerntet. Der Grad der Abgabe von EPO in den Kulturüberstand wurde dann mit Hilfe eines quantitativen RadioimunoassaysfürEPO (55) untersucht. Wie Tabelle 1 (Beispiel 6) zeigt, wurde immunologisch reaktives EPO exprimiert. Die biologische Aktivität des EPO, das von COS-1 -Zellen erzeugt wurde, wurde ebenfalls untersucht. In einem getrennten Experiment wurde der Vektor, der EPO-cDNA von Lambda-HEP0FL13 enthält, in COS-1-Zellen transferiert und die Medien, wie oben beschrieben, geerntet. EPO wurde dann im Medium quantitativ durch einen von zwei in-vitro biologischen Assays bestimmt, ³H-Trymidin und CFU-E (12,29), und durch einen der beiden in-vivo Assays (bei hypoxischen Mäusen und bei hungernden Ratten [30,31]) (vgl. Tabelle 2, Beispiel 7).

Diese Ergebnisse zeigen, daß biologisch aktives EPO in COS-1-Zellen produziert wird. In Western-Blots konnte mit Hilfe eines polyklonalen Anti-EPO-Antikörpers gezeigt werden, daß EPO, das von COS-Zellen produziert wird, eine Mobilität auf SDS-Polyacrylamidgelen besitzt, die identisch mit derjenigen des nativen EPO ist, das aus menschlichem Urin hergestellt wurde (Beispiel 8). Daher kann geschlossen werden, daß das Ausmaß der Glycosilierung von COS-1 produziertem EPO ähnlich der des nativen EPO ist.

Unterschiedliche Vektoren, die andere Promotoren enthalten, können ebenso in COS-Zellen oder in anderen Säugerzellen oder eukaryontischen Zellen verwendet werden. Beispiele von solchen anderen Promotoren im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten SV40-Früh- und Spätpromotoren, den Mäuse-Metallothionein-Gen-Promotor, den Promotor, der in Retroviren von Vögeln oder Säugern gefunden wird, der Bacculovirus-Polyeder-Gen-Promotor und andere. Beispiele von anderen Zelltypen im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten E. coli, Hefe, Säugerzellen, wie z.B. CHO (Ovarium des Chinahamsters), C127 (Affenpithelium), 3T3 (Mäusefibroblasten), CV-1 (african green monkey kidney) und Insektenzellen, wie z. B. diejenigen von Spodoptera frugiperda und Drosophila metanogaster. Diese wechselnden Promotoren und/oder Zelltypen können die Regulation hinsichtlich der Zeit oder des Grades der EPO-Expression bewirken, indem Sie einen zellspezifischen Typ von EPO produzieren oder das Wachstum von großen Mengen von EPO-produzierenden Zellen unter weniger teuren, aber leichter kontrollierbaren Bedingungen ermöglichen.

Ein Expressionssystem, das die Vorzüge einer Expression bei Säugern besitzt, aber wenig Zeit benötigt, um eine hochgradige Expressionszellinie zu produzieren, setzt sich zusammen aus einer Insektenzellinie und einem DNA-Virus, der sich in dieser Zellinie vermehrt. Der Virus ist ein Nuclear-polyhedrosis-Virus. Er besitzt ein doppelsträngiges zirkuläres DNA-Genom von 128kb. Das Nucleokapsid ist stäbchenförmig und liegt in zwei Formen vor, der nichtokkludierten Form im membrangebundenen Virus und in einer okkludierten Form, die im infizierten Zellkern von einem Proteinkristall eingehüllt wird. Diese Viren können üblicherweise in in-vitro Insektenzellkulturen fortgepflanzt werden und sind durch alle routinemäßigen tierisch-virologischen Methoden abänderbar. Das Zellkulturmedium ist üblicherweise eine Nährsalzlösung von 10%igem fötalem Kälberserum. Das Viruswachstum wird in-vitro iniziiert, wenn ein nichtokkludierter Virus (NOV) in eine Zelle eindringt und sich zum Kern hinbewegt, in dem er sich fortpflanzt. Die Replikation findet im Kern statt. Während der Anfangsphase (8-18 Stunden nach der Infektion) werden Nucleokapside im Zellkern angesammelt und keimen daraufhin als NOV durch die Plasmamembran und verbreiten somit die Infektion durch die Zellkultur. Einige Nucieokapside verbleiben daraufhin zusätzlich (mehr als 18 Stunden nach der Infektion) im Zellkern und werden in einer Proteinmatrix okkludiert (bekannt als polyhedrale Inclusions-Körper, [PIB]). Diese Form wirkt nicht infektiös in der Zellkultur. Die Matrix setzt sich zusammen aus einem Protein, das als Polyhedrin bekannt ist (Molmasse 33 kd). Jeder PIB besitzt einen ungefähren Durchmesser von 1 mm und es können mehrere hundert PIB pro Nucleus vorkommen. Es wird sicherlich eine große Menge von Polyhedrin erst spät im Infektionszyklus produziert (ungefähr 25% der gesamten zellulären Proteinmenge).

Da die PIB keine Rolle in den in-vitro-Replikationszyklen spielen, kann das Polyhedrin-Gen ohne nachhaltigen Effekt auf die in-vitro Lebensfähigkeit vom Viruschromosom gelöscht werden. Durch Verwendung des Virus als Expressionsvektor haben wir die codierende Region für das Polyhedrin-Gen mit derfremden zu exprimidierenden DNA ersetzt, indem wir es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors stellten. Dies ergibt einen nicht-PIB-bildenden Virus-Phänotyp.

Dieses System wurde von vielen Forschern verwendet, insbesondere von Pennock et al. und Smith et al. Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker und Lois K. Miller, Mol. Cell. Biol. 3,399-406 [1984]) berichteten über den hohen Expressionsgrad eines bakteriellen Proteins, 0-Galactosidase, wenn es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt wird. Ein anderer nuclearer vom Polyhedrosisvirus abgeleiteter Expressionsvektor wurde von Smith et al. vorgestellt (GaIe E.Smith, Mas. D.Summers und M. J. Fräser, Mol. Cell. Biol., 16. Mai, 2156-2165 [1983]). Die Autoren demonstrierten die Effektivität ihres Vektors durch die Expression von menschlichem /3-lnterferon. Das synthetisierte Produkt wurde als glycosilierte Form gefunden und wie erwartet von Insektenzellen sekretiert. In Beispiel 14 werden Modifizierungen des Plasmides beschrieben, welches das Polyhedron-Gen des Autographa-californica-nucleare-polyhedrosis-Virus (AcNPV) enthält, das eine einfache Insertion des EPO-Gens in das Plasmid erlaubt, so daß es unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedron-Promotors steht. Die resultierende DNA wird in Insektenzellen co-transfektiert mit intakter chromosomaler DNA des Wildtyps AcNPV. Ein genetischer Rekombinationsversuch ergibt die Ersetzung der AcNPVC-Polyhedrin-Gen-Region durch die DNA des Plasmides. Der

-b- ίθI/OO

resultierende rekombinate Virus kann aus der viralen Nachkommenschaft durch das Vorhandensein der DNA-Sequenzen des EPO-Gens identifiziert werden. Dieser rekombinante Virus sollte erwartungsgemäß nach Reinfektion von Insektenzellen EPO produzieren.

Beispiele der EPO-Expression in CHO, CI27 und 3T3 und Insektenzellen sind in den Beispielen 10 und 11 (CHO), 13 (C127 und 3T3) und 14 (Insektenzellen) gegeben.

Das biologisch aktive EPO, das durch prokaryontische oder eukaryontische Expression der klonierten EPO-Gene der vorliegenden Erfindung produziert wurde, kann von Ärzten und/oder Veterinären für die in-vivo Behandlung von Säugern angewendet werden. Die Menge von aktiven Bestandteilen wird natürlich von der Schwere des zu behandelnden Zustandes abhängen, vom Weg der gewählten Verarbreichung, von der spezifischen Aktivität des aktiven EPO und wird letztendlich vom behandelnden Arzt oder Veterinärmediziner entschieden werden. Diejenige Menge von aktivem EPO, die vom behandelnden Arzt festgelegt wird, wird im folgenden als „EPO-behandlungseffektive Menge" bezeichnet. Beispielsweise wurde für die Behandlung von induzierter hydroproliferativer Anämie, die bei Schafen von einer chronischen renalen Schwäche begleitet wird, über den Zeitraum von 15 bis 40 Tagen eine tägliche effektive Menge von EPO von 10 U/kg gefunden (vgl. Eschbach et al, J. Clin. Invest. 74,434 [1984]). Das aktive EPO kann auf jedem, vom zu behandelnden Zustand abhängigen Weg verabreicht werden. ' Vorzugsweise wird das EPO in die Blutbahn des zu behandelnden Säugetieres injiziert. Es kann leicht durch den Fachmann abgeschätzt werden, daß der bevorzugte Verabreichungsweg je nach Art des zu behandelnden Zustandes variieren kann. Obwohl es möglich ist, das aktive EPO in reiner Form oder als nahezu reine Verbindung zu verabreichen, wird es vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Verbindungen, sowohl für die Anwendung im Veterinär- als auch im Humanbereich, umfassen das aktive EPO-Protein, wie oben beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen verträglichen Trägerstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Beimischungen. Die Trägerstoffe müssen verträglich sein mit anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung und für den Patienten nicht schädlich. Die Zusammensetzung sollte keine Oxidationsmittel und andere Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie mit Peptiden unverträglich sind. Die Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise in einheitlichen Dosierungsformen abgepackt werden und können durch viele in der Pharmazie bekannten Methoden hergestellt werden. Alle Methoden beinhalten den Schritt des Mischens von aktivem Inhaltsstoff mit dem Trägermaterial, das sich aus einem oder mehreren Hilfsstoffen zusammensetzt. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch einheitliches und intensives Mischen von aktivem Inhaltsstoff mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägerstoffen oder beidem hergestellt und dann, falls notwendig, wird das Produkt in die gewünschte Form der Zusammensetzung überführt.

Die Zusammensetzungen für parenterale Verabreichungen umfassen zweckmäßigerweise sterile wäßrige Lösungen des aktiven Inhaltstoffes und Lösungen, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des Empfängers sind. Solche Zusammensetzungen können zweckmäßigerweise hergestellt werden durch Lösen des festen aktiven Inhaltsstoffes in Wasser, um eine wäßrige Lösung zu erzeugen, und unter sterilen Bedingungen kann diese Lösung in einheitlichen oder mehrfach dosierbaren Darreichungsformen, z. B. in versiegelten Ampullen oder Gefäßen, abgepackt werden.

Die hier verwendete EPO-cDNA beinhaltet das reife EPO-cDNA-Gen, dem ein ATG-Codon vorausgeht, und EPO-cDNA, die für allelomorphische Variationen des EPO-Proteins codiert. Eine allelomorphische Variation ist in den Abbildungen 3a und 3 b dargestellt. Das EPO-Protein enthält das 1-Methionin-Derivat des EPO-Proteins (Met-EPO) und allelomorphische Variationen des EPO-Proteins. Das reife EPO-Protein, das durch die Sequenz in Abbildung 3 a dargestellt ist, beginnt mit der Sequenz Ala-Pro-Pro-Arg ...,deren Anfang durch die Zahl „1" in Abbildung 3 gekennzeichnet wird. Das Met-EPO würde mit der Sequenz Met-Al-Pro-Pro-Arg ... beginnen.

Ausführungsbeispiel

Die folgenden Beispiele sollen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren wahre Reichweite in den anliegenden Patentansprüchen dargelegt wird. Ebenso sind Abänderungen der dargelegten Verfahren möglich, die von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt werden. Alle Temperaturen werden in ⁰C angegeben und sind unkorrigiert. Das Symbol für Micron oder Micro, z.B. Microliter, Micromol usw., ist „u",z.B. ul, um usw.

Beispiel 1: Isolierung eines Genom-Klons von EPO

EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anämie wurde im wesentlichen nach der von Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977) entwickelten Methode gereinigt, mit der Ausnahme, daß die Phenolbehandlung nicht durchgeführt wurde und durch eine Hitzebehandlung bei 8O⁰C (fünf Minuten) ersetzt wurde, um die Neuraminidase zu inaktivieren. Der letzte Schritt der Reinigung erfolgte durch Fraktionierung auf einer C-4 Vydac HPLC-Säule (The Separatious Group), indem ein 0-95%iger Acetonnitril-Gradient mitO,1%Trifluoressigsäure (TFA) für eine Dauer von 100 Minuten angelegt wurde. Die EPO-Fraktion wurde durch Gelelektrophorese und N-terminale Sequenzanalyse (21,26,27) der Hauptfraktionen bestimmt. Das EPO wurde bei etwa 53% Acetonitril eluiert und stellte ungefähr 40% des Proteins dar, das durch reversed-phase-HPLC getrennt wurde. Die EPO enthaltenden Fraktionen wtrnden zu ΙΟΟμ.1 einrotiert, mit Ammoniumbicarbonat auf pH 7,0 eingestellt und mit 2% TPCK-behandelten Trypsin (Worthington) 18 Stunden lang bei 37°C vollständig verdaut. Die tryptischen Verdauungsprodukte wurden dann einer reversed-phase-HPLC, wie oben beschrieben, unterworfen. Die optische Dichte bei 280nm und 214nm wurde gemessen. Gut separierte Peaks wurden bis fast zur vollständigen Trockne einrotiert und direkt der N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse (59) unterworfen (Applied Biosystems Model 480A Gas phase sequenator). Die erhaltenen Sequenzen sind in Abbildung 3 unterstrichen . Wie zuvor beschrieben, wurden zwei dieser tryptischen Fragmente für die Synthese von Oligonucleotidproben ausgewählt. Aus der Sequenz Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (Aminosäuren 46-52 in Abbildung 3) wurde 17mer mit 32facher Entartung

AAA

TTCCANGCGTAGAAGTT und ein 18mer mit 128facher Entartung

AAA

CCANGCGTAGAAGTTNAC hergestellt. Aus der Sequenz Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (Aminosäuren 144-150 in Abbildung 3) wurden zwei Pools von

14mers, jeweils 32fach entartet

TTGN T T

TACACCTAACTTCCT und TTGN TT

TACACCTAACTTCTT

hergestellt, die sich in der ersten Position des Leucincodons unterscheiden. Die Oligonucleotide wurden am 5'-Ende mit ³²P durch Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und ³²P-ATP (New England Nuclear) markiert. Die spezifische Aktivität der Oligonucleotide variierte zwischen 1000 und SOOOCi/mmol. Im Screening-Verfahren der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek im Bakteriophagen-Lambda (Lawn et al., [22]) wurde eine Modifizierung der in-situ-Vermehrungsmethode vorgenommen, wie ursprünglich von Woo et al. (47) (1978) beschrieben. Ungefähr 3,5 χ 10^s Phagen wurden mit einer Dichte von 6000 Phagen auf Petrischalen mit 150mm Durchmesser (NZTYM-Medium) platiertund bei 37⁰C inkubiert, bis Plaques von ca. 0,5 mm sichtbar wurden. Nach einstündigem Abkühlen auf 4°C wurden doppelte Replika der Plaques-Muster auf Nylonmembranen (New England Nuclear) übertragen und über Nacht bei 37 ⁰C auffrischen NZCYM-Platten inkubiert. Die Filter wurden dann denaturiert und durch lOminütiges Waschen mit 0,5n NaOH/1 m NaCI und 0,5m Tris (pH8)/1 m NaCI neutralisiert. Nach darauffolgendem Erhitzen im Vakuum bei 8O⁰CfUr zwei Stunden wurden die Filter gewaschen (5 x SSC, 0,5% SDS; 1 h) und der Zellrückstand auf die Filteroberfläche durch vorsichtiges Ankratzen mit einem feuchten Tuch entfernt. Dieses Ankratzen reduziert das Anhaften der Probe auf den Filtern. Die Filter wurden dann mit Wasser gewaschen und für eine Dauer von 4-8 Stunden bei 48⁰C in 3 m Tetramethylammonium-chlorid, 1OmM NaPO₄ (pH6,8), 5 x Denhardts, 0,5% SDS und 1OmM EDTA prehybridisiert. Das ³²P-markierte 17mer wurde dann mit einer Konzentration von 0,1 pmol/ml zugegeben und die Hybridisierung wurde bei 48⁰C 72 Stunden lang durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter intensiv mit 2 x SSC (0,3 m NaCI/0,03 m Na-Citrat, pH7) bei Raumtemperatur gewaschen, dann für eine Stunde in 3mTMACI/10mM NaPO₄ (pH 6,8) bei Raumtemperatur und anschließend für eine Dauer von 5—15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur. Nach zweitägiger Autoradiographie mit einem verstärkenden Schirm wurden ungefähr 120 starke Duplett-Signale aufgenommen. Die Positiven wurden herausgesucht, in Pools zu acht zusammengegeben, replatiert und ein Screening-Verfahren durchgeführt, indem eine Hälfte des 14mer-Pools auf jedem der beiden Filter und die 17merauf dem dritten Filter verwendet wurden. Die Bedingungen für das Auftragen auf die Platten und die Hybridisierung sind weiter oben beschrieben, allerdings wurde die Hybridisierung des 14mer bei 37°C durchgeführt. Nach der Autoradiographie wurde die Probe vom 17mer-Filter in 5O⁰C Formamid überführt, und nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Filter bei 52⁰C mit der 18mer-Probe rehybridisiert. Zwei unabhängige Phagen hybridisierten in allen drei Proben. Die DNA einer dieser Phagen (im folgenden als Lambda-HEPO1 bezeichnet) wurde mit Sau3A vollständig verdaut und in M13 für die DNA-Sequenzanalyse subkloniert, indem die Dideoxy-Kettenterminierungsmethode von Sanger und Coulson (23) (1977) verwendet wurde. Die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Ableserahmens, der für das EPO tryptischen Fragment (unterstrichene Region) codiert, ist in dieser Anmeldung beschrieben. Die Intron-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben, die Exon-Sequenzen (87 Nucleotide) werden in Großbuchstaben angegeben. Übereinstimmende Sequenzen zwischen Spleiß-Akzeptor-(a) und Donor-(d)-Stellen sind unterstrichen (vgl. Abbildung 4c).

Beispiel 2: „NortherrT-Analyse der menschlichen fötalen Leber-mRIMA

5/xg der menschlichen fötalen Leber-mRNA (aus einer 20 Wochen alten fötalen Leber hergestellt) und eine Leber-mRNA eines Erwachsenen wurden in einem 0,8%igen Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterworfen und mit Hilfe der Methode von Derman et al., Cell, 23,731 (1981) auf Nitrocellulose transferiert. Eineeinsträngige Probe wurde dann aus dem M13-Templat hergestellt, das den in Abbildung 1 dargestellten Einschub enthält. Der Primer war ein 20-mer, der aus dem gleichen tryptischen Fragment wie die ursprüngliche 17mer-Probe abgeleitet wurde. Die Probe wurde, wie bereits von Anderson et al., PNAS, (50) (1984) beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß nach der Verdauung mit Smal (womit die gewünschte Probe mit einer Länge von 95 Nucleotiden hergestellt wurde, die 74 Nucleotide der Codierungssequenz enthält), die kleinen Fragmente vom M13-Templatdurch Chromatographie an einer Sepharose-CI4B-Säulemit0,1 η NaOH/0,2m NaCl gereinigt wurden. Der Filter wurde zu ungefähr 5 x 10⁶cpm dieser Probe 12 Stunden lang bei 68⁰C hybridisiert, zweimal mit SSC bei 68°C gewaschen und sechs Tage lang einem verstärkenden Schirm ausgesetzt. Eine einzelne Marker-mRNA von 1 200 Nucleotiden (durch einen Pfeil gekennzeichnet) wurde als Vergleich in der benachbarten Reihe (siehe Abbildung 2) mitlaufen gelassen.

Beispiel 3: Flötale Leber-cDNA

Eine zu Beispiel 2 identische Probe wurde hergestellt und für das Screening einer fötalen Leber-cDNA-Bibliothek benutzt, die durch dasStandard-PIaques-Sreening-Verfahren (Benton Davis, Science [54] [1978]) im Vektor Lambda-Ch21A(Toole et al., Nature, [25] [1984]) hergestellt wurde. Drei unabhängige positive Klone (im folgenden als Lambda-HEPOFL6 [1350 bp], Lambda-HEPOFL8 [700bp] und Lambda-HEPOFL13 [1 400 bp]) wurden isoliert und anschließend erfolgte ein Screening der 1 χ 10⁶ Flecken. Der gesamte Einschub von Lambda-HEPOFL13 und Lambda-HEPOFL6 wurde sequenziert und anschließend in M13 subkloniert (vgl. Abbildung 9 bzw. 7). Von Lambda-HEPOFL8 wurden nurTeile sequenziert und der Rest als identisch zu den anderen beiden Klonen angenommen (vgl. Abbildung 8). Die 5'- und 3'-unübersetzten Sequenzen werden durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Die Codierungsregion wird durch Großbuchstaben dargestellt.

Bezüglich der Abbildungen 3 a und 3 b wird die abgeleitete Aminosäuresequenz, die unterhalb der Nucleotidsequenz abgebildet ist, beginnend mit Nummer 1 für die erste Aminosäure des fertigen Proteins durchnumeriert. Das mutmaßliche Vorläuferpeptid wird ebenso angegeben. Cystein-Reste im fertigen Protein werden zusätzlich durch die Bezeichnung SH und mögliche N-Glycosilierungsstellen durch einen Stern angegeben. Die unterstrichenen Aminosäuren weisen auf solche Reste hin, die durch N-terminale Proteinsequenzierung oder durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente von EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, identifiziert wurden. Teilweise durchgezogene Linien weisen auf Reste in der Aminosäuresequenz von gewissen tryptischen Fragmenten hin, die nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die cDNA-Klone Lambda-HEPOFL6, Lambda-HEPOFL8 und Lambda-HEPOFL13 wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummem ATCC 40156, ATCC 40152 und ATCC 40153 erhältlich.

Beispiel 4: Genom-Strukturen der EPO-Gene

Die relativen Größen und Positionen der vier unabhängigen Genom-Klonen (Lambda-HEPO1, 2,3, und 6) von der Haeill/Alul-Bibliothek sind durch die überlappenden Linien in Abbildung 4a dargestellt. Die stärker durchgezogene Linie weist auf die Position des EPO-Gens hin. Eine Skalierung (in Kb) und die Positionen der bekannten Spaltungsstellen für die Restriktions-Endonucleasen sind angegeben. Die das EPO-Gen enthaltende Region wurde vollständig von beiden Strängen sequenziert, indem durch Exonuclease-IM erzeugte Serien von Auslöschungen innerhalb dieser Region verwendet wurden. Eine schematische Darstellung von fünf Exons, die für EPO-mRNA codieren, ist in Abbildung 4 b dargestellt. Die genaue 5'-Grenze des Exons I ist zur Zeit nicht bekannt. Der proteincodierende Teil dieser Exons ist schattiert. Die komplette Nucleotidsequenz dieser Region ist in Abbildung 4c dargestellt. Die bekannten Grenzen jedes Exons sind durch vertikale Balken skizziert. Die Genomklone Lambda-HEPO1, Lambda-HEPO2, Lambda-HEPO3 und Lambda-HEPO6 wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 und ATCC 40151 erhältlich.

Beispiel 5: Konstruktion des Vektors p91023(B)

Der verwendete Transformationsvektor war pAdD26SVpA(3), wie von Kauf man et al., Mol. Cell. Biol. 2,1304 (1982) beschrieben. Die Struktur dieses Vektors ist in Abbildung 5a dargestellt. Dieses Plasmid enthält ein Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-cDNA-Gen, das unter der Transkriptionskontrolle des Adenovirus-2-(Ad2)-major-late-Promotors steht. Eine 5'-Spleiß-Stelle ist in der Adenovirus-DNA angegeben und eine 3'-Spieiß-Stelle, von einem Immunglobulin-Gen abgeleitet, befindet sich zwischen dem Ad2-major-late-Promotor und der DHFR-Codierungssequenz. Die SV40-early-Polyadenylierungsstelle befindet sich im Strang unterhalb der DHFR-Codierungssequenz. Die prokaryontisch abgeleitete Sektion von pAdD26SVpA(3) stammt von pSVOd (Mellon et al., Cell 27, 279 [1981]) und enthält nicht die pBR322-Sequenzen, die bekannt sind für die Inhibierung der Replikationin Säugerzellen (Lusky et al., Nature 293,79 [1981]).

pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pCVSVL2 überführt, (vgl. Abbildung 5a). pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pAdD26SVpA(3)(d) durch Löschen einer der beiden Pst1-Stellen in pAdD26SVpA(3) überführt. Dies wurde durch teilweise Verdauung mit Pst1 erreicht, indem ein Unterschuß von Enzym verwendet wurde, so daß eine Subpopulation von linearisierten Plasmiden erhalten wurde, in denen nur eine einzige Pst1-Stelie gespalten wurde, anschließend erfolgte eine Behandlung mit Klenow, die Ligation, um zu rezirkularisieren, und das Screening bzgl. Auslöschungen der Pst1-Stelle, die sich am 3'-Ende der SV40-Polyadenylations-Sequenz befindet.

Der Adenovirus-Tripartit-Leaderund die virusassoziierten Gene (VA-Gene) wurden in pAdD26SVpA(3)(d) inseriert (vgl. Abbildung 5a). Zuerst wurde pAdD26SVpA(3)(d) mit Pvull gespalten, um ein lineares Molekül zu erhalten, das innerhalb der 3'-Region der drei Elemente, die den Tripartit-Leader umfassen, geöffnet ist. Dann wurde pJAW43 (Zain et al., Cell 16,851 [1979]) mitXhoi verdaut, mit Klenow behandelt, mit Pvull verdaut und die 140 bp-Fragmente, die den zweiten Teil des dritten Leaders enthalten, wurden durch Elektrophorese auf Acrylamidgel (6% in Tris-Borat-Puffer; Maniatis et al., s.u.) isoliert. Das 140 bp-Fragment wurde dann mit dem Pvull-verdauten pAdD26SVpA(3)(d) verbunden. Das verbundene Produkt wurde dazu verwendet, E.coli Tetracyclinresistenz zu transformieren, und die Kolonien wurden nach dem Grunstein-Hoguess-Verfahren g.escreent, indem eine ³²p-markierte Probe verwendet wurde, die zu dem 140 bp-Fragment hybridisiert. Eine DNA aus positiv hybridisierten Kolonien wurde hergestellt, um zu testen, ob die rekonstruierte Pvull-Stelle ein 5'-oder 3'-Ende der inserierten 140 pb-DNA war, die spezifisch für die zweiten und dritten Adenovirus-Iate-Leaders ist. Die richtige Orientierung der Pvull-Stelle ist das.5'-Ende des 140 bp-Einschubes. Dieses Plasmid wird als pTPL in Abbildung 5a bezeichnet.

Das AvallD-Fragment von SV40, das die SV40-Enhancer-Sequenz enthält, wurde durch Verdauung von SV40-DNA mit Avail erhalten, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment in Poll in glatte Enden überführt, Xho1-Linker mit den Fragmenten verbunden, mit Xho1 verdaut, um die Xho1-Stellen zu öffnen, und die vier größten (D)-Fragmente durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit aus Xho1 geschnittener pTPL verknüpft und somit das Plasmid pCVSVL2-TPL erhalten. Die Orientierung des SV40-D-Fragmentes in pCVSVL2-TPL war derart, daß der SV40-late-Promotor in der gleichen Orientierung war wie der Adenovirus-major-late-Promotor.

Um die Adenovirus-assoziierten (VA)-Gene) in die pCVSVL2-TPL zu überführen, wurde zuerst ein Plasmid pBR322 konstruiert, dasdas Adenovirus-Typ-2-HINDIII-B-Fragment enthielt. Die Adenovirus-Typ-2-DNA wurde mit Hindlll verdaut und das B-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in pBR322 inseriert, das zuvor mit Hindlll verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli zur Ampicillin-Resistenz wurden die Rekombinationen hinsichtlich der Insertion des Hindill- B-Fragmentes gescreent und die inserierte Orientierung durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestimmt. pBR322-AdHindlll-B enthält das Adenovirus-Typ-2-Hindlll-B-Fragment in der in Abbildung 5 b gezeigten Orientierung. Wie in Abbildung 5 b dargestellt wird, werden die VA-Gene üblicherweise aus dem Plasmid pBR322-AdHindlll-B durch Verdauung mit Hpal erhalten, indem EcoR1-Linker zugegeben werden und mit EcoR1 verdaut wird, und anschließend das 1.4 kb-Fragment zurückgewonnen wird. Das Fragment mit den überstehenden EcoR1 -Enden wird dann mit der EcoR1 -Stelle von PTL verknüpft, das zuvor mit EcoR1 verdaut wurde. Nach der Transformati on von E.coli HB101 und Selektion hinsichtlich Tetracyclin-Resistenz wurde mit den Kolonien ein Screening-Verfahren für Fiiterhybridisierung zur DNA durchgeführt, die für die VA-Gene spezifisch ist. Die DNA wurde aus positiv hybridisierten Klonen hergestellt und durch Verdauung mit Restriktionsendonucleasen charakterisiert. Das erhaltene Plasmid wird als p91023 bezeichnet.

Wie in Abbildung 5c dargestellt ist, werden die zwei EcoR1-Stellen in p91023 durch vollständiges Schneiden von p91023 mit EcoR1 entfernt, so daß zwei DNA-Fragmente erzeugt werden, eines mit ungefähr 7 kb, das andere mit ungefähr 1,3kb. Das letztere Fragment enthielt die VA-Gene. Die Enden von beiden Fragmenten wurde mit Hilfe des Klenow-Fragmentes von Poll aufgefüllt, und die beiden Fragmente wurde dann zusammengefügt. Ein Plasmid p91023(A), das die VA-Gene enthält und zu p91023 ähnlich ist, jedoch die beiden EcoR1-Stellen nicht enthält, wurde sowohl nach dem Grunstein-Hogness-Screening-Verfahren mit dem VA-Gen-Fragment als auch durch konventionelle Restriktionsstellen-Analyse identifiziert. Die einzelne Pst1-Stelle in p91023(A) wurde entfernt und durch eine EcoR1-Stelle ersetzt. p91023(A) wurde vollständig mit Pst1 geschnitten und dem Klenow-Fragment von Poll behandelt, um frische Enden zu erhalten. EcoR1-Linker wurden mit den glatten Pst1-Stellen von p91023(A) verknüpft. Die lineare p91023(A) mit den EcoR1-Linkern an den glatten Pst1-Stelien wurde von den unverknüpften Linkern abgetrennt und vollständig mit EcoR1 verdaut und wieder neu verknüpft. Ein Plasmid p91023(B) wurde erhalten (vgl. Abbildung 5 c) und mit einer zu p91023(A) ähnlichen Struktur charakterisiert, jedoch mit einer EcoR1-Stelle anstelle der früheren Pst1 -Stelle. Das Plasmid p91023(B) wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39754 erhältlich.

Beispiel 6:

Die cDNA-Klone (Lambda-HEPOFL6 und Lambda-HEPOFL13, vgl. Beispiel 3) wurden in das Plasmid p91023(B) inseriert, so daß pPTFL6 und pPTFU3 erhalten wurden, 8/Kj jeder gereinigten DNA wurden dann dazu verwendet, 5 x 10⁶COS-Zellen mit Hilfe derDEAE-Dextran-Methode (siehe unten) zu transfektieren. Nach 12 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit Chlorochin (0,1 mM) zwei Stunden lang behandelt, wieder gewaschen und für 24 Stunden 10 ml Medium ausgesetzt, das 10% fötales Kälberserum enthält. Das Medium wurde dann gegen 4 ml serum-freies Medium ausgetauscht und 48 Stunden später geerntet. Die Produktion von immunologisch aktivem EPO wurde mit Hilfe eines Radioimmunoassays nach der Methode Sherwood und Goldwasser (55) quantifiziert. Der Antikörper wurde von Dr.Judith Sherwood zur Verfugung gestellt. Der jodierte Tracer wurde aus dem gereinigten EPO (vgl. Beispiel 1) hergestelt. Die Empfindlichkeit des Assays beträgt ungefähr 1 ng/ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 Vektor Konz. an in das Medium

abgegebenem EPO (ng/ml)

pPTFL13 330

pPTFL6 31

pPTFL13wurde hinterlegt und ist von der America η Type Culture CoI lection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 3999 erhältlich.

Beispiel 7

Die EPO-cDNA (Lambda-HEPOFL13) wurde in den p91023(B)-Vektor inseriert, in COS-1-Zellen transferiert und wie oben (Beispiel 6) geerntet, mit der Ausnahme, daß die Chlorochinbehandlung weggelassen wurde.

In-vitro biologisch aktives EPO wurde dadurch vermessen, indem entweder ein koloniebildender Assay mit fötalen Leberzellen aus Mäusen als Quelle für CFU-E oder der ³H-Tymidinaufnahmeassay verwendet wurde, bei dem Milzzeilen mit Phenylhydrazin injizierten Mäusen verwendet werden. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise beträgt ungefähr 25mU/ml. Biologisch aktives EPO wurde in-vivo entweder nach der Methode mit hypoxischen Mäusen oder mit hungernden Ratten gemessen. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise beträgt ungefähr 100mU/ml. Bei beiden Nachweisen wurden in Blindversuchen keine Aktivitäten nachgewiesen. Die Ergebnisse des durch den Klon HEP0FL13exprimierten EPO'ssind in Tabelle 2 dargestellt, in der die Aktivitäten in U/ml ausgedrückt sind, wobei kommerzielles EPO (Toyobo Incorp.) als Standard verwendet wurde.

Tabelle 2 Aus den mit Typ l-EPO-cDNA transferierten Zellen ausgeschiedenes EPO

Nachweis	Aktivität	ng/ml
RIA	100	U/ml
CFU-E	2<0,5	U/ml
3H-Thy	3,1 < 1,8	U/ml
hypoxische Maus	1	U/ml
hungernde Ratte	2

Beispiel 8: SDS-Polyacrylamid-Gel-Analyse von EPO aus COS-Zellen

180ng von EPO, das in das Medium von COS-Zellen abgegeben wurde, die mit EPO (Lambda-HEP0FL13)-cDNA im Vektor 91023(B) (siehe oben) transferiert wurden, wurden auf einem 10%igen SDS-Laemlli-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Papier elektrotransferiert (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 76, 4350 [1979]). Der Filter wurde mit Anti-EPO-Antikörpern, wie in Tabelle 1 beschrieben, überprüft, gewaschen und mit¹²⁵l-staph-A-Protein neu überprüft. Der Filter wurde zwei Tage lang autoradiographiert. Natives reines EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde entweder vor (Linie B) oder nach der Jodierung (Linie C) elektrophoretisch getrennt (vgl. Abbildung 6). Die verwendeten Marker beinhalten ³⁵S-Methionin-markiertes Serumalbumin (68000 D) und Ovalbumin (45000 D).

Beispiel 9: Konstruktion von RK1-4 «.

DasBamHI-Pvull-Fragmentausdem Plasmid PSV2DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 [1981]), das den zum Mäuse-Dihydrofolat-Reductase-(DHFR)-Gen benachbarten SV40-early-region-Promotor, einen SV40-Enhancer, das kleine t Antigen-Intron und die SV40-Polyadenylierungssequenz enthält, wurde isoliert'(Fragment A). Die verbleibenden Fragmente wurden aus dem Vektor p91023(A) (siehe oben) wie folgt erhalten: p91023(A) wurde mit Pstl an der einzelnen Pstl-Seite neben dem Adenovirus-Promotor verdaut, um das Plasmid zu iinearisieren, und entweder mit synthetischem Pstl oder mit EcoRI-Konvertern verknüpft und rezirkularisiert (dabei werden die Stellen Pstl-EcoRI-Pstl an der ursprünglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023[B']) oder mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I behandelt, um die Pstl-Stellen zu zerstören, und mit den synthetischen EcoR1-Linker verknüpft und rezirkularisiert (dabei werden eine EcoRI-Stelle an der ursprünglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023[B]). Jedes der beiden resultierenden Plasmide 91023(B) und 91023(B') wurden mit Xba und EcoRI verdaut, wobei zwei Fragmente (F und G) gebildet werden. Durch Verbinden von Fragment F aus p91023(B) und Fragment G aus p91023(B') und Fragment G aus p91023(B) und Fragment F aus p910_v23(B') wurden zwei neue Plasmide erzeugt, die entweder eine EcoRI-Pstl-Stelle oder eine Pstl-EcoRI-Stelle an der ursprünglichen Pstl-Stelle enthielten. Das Plasmid, das die Pstl-EcoRI-Stelle enthielt, wo die Pstl-Stelle dem Adenovirus-major-late-Promotor am nächsten ist, wurde als p910'23(C) bezeichnet.

Der Vektor p91023(C) wurde mitXhol vollständig verdaut und die resultierende linearisierte DNA mit überstehenden Enden wurde mit einem großen Fragment von E.coliDNAPolymerase 1 in eine DNA mit glatten Enden überführt. An diese DNA wurde ein 340 bp Hindlll-EcoRI-Fragment gebunden, das den SV40-Enhancer enthält, der wie folgt hergestellt wurde: Das Hindlll-Pvull-Fragment aus SV40, das den SV40-Ursprung oder die Replikation und den Enhancer enthält, wurde in das Plasmid c-lac inseriert (Little et al., Mol. Biol. Med. 1,473-488 [1983]). Der c-lac-Vektor wurde durch Verdauung von c-lac-DNA mit BamHI hergestellt, anschließend die überstehenden Enden mit einem großen Fragment von DNA-Poiymerase 1 aufgefüllt und die DNA mit Hindill verdaut. Das resultierende Plasmid (c-SVHPIac) regenerierte die BamHI-Stelle durch Verknüpfen der glatten Enden von Pvull. Das EcoRI-Hindlll-Fragment wurde aus c-SVHPIac hergestelt und an das EcoRI-Hindlll-Fragment von PSVOd gebunden (Mellou et al., siehe oben), das den Plasmid-Ursprung der Replikation enthielt, und das resultierende Plasmid PSVHPOd wurde selektioniert. Das 340 bp EcoRI-Hindlll-Fragment von PSVHOd₁ das den SV40-Ursprung/Enhancer enthält, wurde dann hergestellt, beide Enden mit einem großen Fragment von DNA-Polymerasein glatte Enden überführt und an den Xho1-verdauten p91023(c)-Vektor, wie oben beschrieben, gebunden. Das resultierende Plasmid (p91023[C]/Xho/glattes Ende plus EcoRI/Hindlll/glattes Ende, SV40-Ursprung plus Enhancer), in dem die Orientierung des Hindlll-EcoRI-Fragmentes derart war, daß die BamHI-Stelle innerhalb dieses Fragmentes dem VA-Gen am nächsten war, wurde als pES105 bezeichnet. Das Plasmid pES105 wurde mit BamHI und Pvull und ebenso mit Pvull allein verdaut, und das BamHI-Pvu-ll-Fragment, das den Adenovirus-major-late-Promotor (Fragment B) enthält, und das Pvull-Fragment, das das Plasmid innerhalb der Resistenzgene (Tetracyclinresistenz) enthaltend andere Sequenzen (Fragment C) wurden isoliert. Die Fragmente A, B und C wurden verknüpft und das in Abbildung 10b dargestellte Plasmid wurde isoliert und als RK1-4 bezeichnet. Das Plasmid RK1-4 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort unter der Zuordnungsnummer ATCC 39940 erhältlich. **

Beispiel 10: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode I)

Die DNA (20^g) aus dem Plasmid pPTFL13 (vgl. Beispiel 6) wurde mit der Restriktions-Endonuclease CIaI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und wurde mit Cla-l-verdauter DNA aus dem Plasmid pAdD26SVp(A)1 (2^g) verknüpft, das ein durch den Adenovirus-major-late-Promotor (Kaufman und Sharp, Mol. and Cell. Biol. 2,1304-1319 [1982]) reguliertes intaktes Dihydrofolatreductase-(DHFR)-Gen enthält. Diese verknüpfte DNA wurde verwendet, um DHFR-negative CHO-Zellen (DUKX-BII, Chasin LA. und Urlaub G., Proc. Natl. Acad. Sei. 77,4216-4220 [1980]) zu transfektieren, und nach zweitätigem Züchten wurden die Zellen, die mindestens ein DHFR-Gen beinhalteten, in nucleosidfreiem Alphamedium seiektioniert und 10%dialysiertes fötales Kälberserum zugegeben. Nach zweiwöchigem Wachstum in selektiven Medien wurden die Kolonien von den Originalplatten entfernt, in Gruppen zu 10 bis 100 Kolonien zusammengefügt, replattiert und in nucleosidfreiem Alphamedium gezüchtet. Die überstehenden Medien der Pools, die vor der Methotrexat-Selektion gewaschen waren, wurden auf EPO mit Hilfe eines RIA getestet. Pools mit positiver EPO-Produktion wurden in Gegenwart von Methotrexat (0,02 UM) gezüchtet, dann subkloniert und wieder getestet. EPO-Cla4alpha4.02-7, ein einzelner Subklon aus dem EPO-Cla4alpha4.02-Pool, gibt 460ng/ml EPO in das Medium ab, das 0,02 uM MTX (vgl. Tabelle 3) enthält. EPO-Cla4alpha4.02-7 ist die Zellinie der Wahl für die EPO-Produktion und wurde bei der American Type Culture Collection (Zuordnungsnummer ATCC CRL8695) hinterlegt. Zur Zeit wird dieser Klon einer schrittweisen Selektion mit steigenden Konzentrationen vom MTX unterworfen und wird voraussichtlich Zellen ergeben, die noch höhere Konzentrationen von EPO produzieren. Für Pools, die im RIA negativ waren, wurden Methotrexatresistente Kolonien, welche aus den Gegenkulturen erhalten wurden, die in der Gegenwart von Methotrexat (0,02uM) gewachsen waren, erneut mittels RIA auf EPO geprüft. Diejenigen Kulturen, die nicht positiv waren, wurden subkloniert und in weiter steigenden Konzentrationen von Methotrexat gezüchtet.

Die schrittweise Methotrexat-(MTX)-Selektion wurde durch sich wiederholende Zyklen des Züchtens von Zellen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Methotrexat und durch die Selektion der überlebenden Zellen erreicht. Nach jedem Durchgang wurde EPO im Kulturüberstand durch RIA und durch in-vitro biologische Aktivität gemessen. Die Konzentrationen von Methotrexat, die in jeder schrittweisen Verstärkung verwendet wurden, waren 0,02 M, 0,1 M und 0,5 M. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurden nach einem Durchgang der Selektion in 0,02 M MTX signifikante Konzentrationen von EPO in das Kulturmedium abgegeben.

Tabelle 3 Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Probe Test alpha-Medium-Emte 0,02 uM methotrexat in

deralpha-Medium Ernte

4_a4Pool RIA ^g/ml 50ng/ml

4_a4 Single

(.02-7) RIA — 460ng/ml

Beispiel 11: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode 2)

Die DNA des Klons Lambda-HEPOFL13 wurde mit EcoRI verdaut und das kleine Rl-Fragment, das das EPO-Gen enthält, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides RK1-4 (vgl. Beispiel 10) subkloniert. Diese DNA (RKFL13) wurde dann benutzt, um die DHFR-negativen CHO-Zellen direkt zu transfektieren (ohne Verauung). Die Selektion und Verstärkung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.

Die RKFL13-DNA wurde ebenfalls in CHO-Zellen durch Protoblastenfusion und Mikroinjektion inseriert. Das Plasmid RKFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39989 erhältlich.

Kolonie Poo! A	RIA	3ng/ml
	3H-Thy	—
Einzelner
Kolonieklon	RIA	—
3H-Thy	—	5,9 U/ml
Mikroinji-	RIA	60ng/ml
zierterPool
(DEPO-I)

Tabelle 4 Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Probe Test alpha-Medium-Emte 0,02 uM Methotrexat

inderalpha-Medium-Ernte

42 ng/ml (Pool) 150ng/ml(Klon) 1,5 U/ml

90ng/ml (.02C-Z)

160ng/ml

³H-Thy 1,8 U/ml —

Der bevorzugte einzelne Kolonie-Klon wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC CRL8695 erhältlich.

Beispiel 12: Expression des EPO-Genom-Klons in COS-1-Zellen

Der Vektor, der für die Expression des EPO-Genom-Klons verwendet wurde, ist pSVOd (Mellon et. al., s.o.). Die DNA von pSVOd wurde vollständig mit Hindlll verdaut und die Enden mit dem großen Fragment von DNA-Polymerase-I in glatte Enden umgewandelt. Der EPO-Genom-Klon Lambda-HEPO3 wurde mit EcoRI und Hindlll vollständig verdaut und das4,0 kb-Fragment, das das EPO-Gen enthält, wurde isoliert und wie oben beschrieben in glatte Enden umgewandelt. Die Nucelotidsequenz dieses Fragmentes von der Hindlll-Stelle bis zur Regioli oberhalb des Polyadenylierungssignals ist in Abbildung 4 dargestellt. Das EPO-Gen Fragment wurde in das pSVOd-Plasmid-Fragment inseriert. Korrekt konstruierte Rekombinanten in beide Richtungen konnten isoliert und verifiziert werden. DasPlasmidCZ2-1 besitzt das EPO-Gen in der Orientierung „a" (d.h.,daßdas5'-Endevon EPO dem SV40 Ursprung am nächsten liegt) und das Plasmid CZ1-3 besitzt die entgegengesetzte Orientierung (Orientierung „b").

Die Plasmide CZ1-3 und CZ2-1 wurde in COS-1-Zellen, wie in Beispiel 7 beschrieben, transferiert, das Medium geerntet und auf immunologisch aktives EPO getestet. Ungefähr 31 ng/ml von EPO wurde im Kulturüberstand von CZ2-1 nachgewiesen bzw. 16-31 ng/ml von CZ1-3

Die Genom-Klone HEP01, HEP02 und HEP06 können in COS-Zellen zur Expression auf ähnliche Weise inseriert werden.

Beispiel 13: Expression in C127 und CHO-Zellen und Konstruktion von pBPVEPO

Ein Plasmid, das die EPO-cDNA-Sequenz unter derTranskriptions-Kontrolle des Metallothionein-Promotors von Mäusen enthält und das an die komplette Papilloma-virus-DNA von Rindern gebunden ist, wurde wie folgt hergestellt:

pEPO49f .

Das Plasmid SP6/5 wurde von Promega Biotec. käuflich erworben. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI vollständig verdaut und das 1340bp EcoRI-Fragmentvon Lambda-HEP0FL13 wurde durch DNA-Ligase inseriert. Das resultierende Plasmid, in dem das 5'-Ende des EPO-Gens dem SP6-Promotor (durch BgIl und Hindlll-Verdauung bestimmt) am nächsten war, wurde als pEPO49f bezeichnet. In dieser Orientierung ist die BamHi-Stelle im PSP6-5-Poly-Linker dem 5'-Ende des EPO-Gens direkt benachbart.

pMMTneo^ABPV - - ·

Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) Law et al., Mol. and Cell Biol. 3, 2110-2115 [1983]), das in Abbildung 11 dargestellt ist, wurde mit BamHI vollständig verdaut, um zwei Fragmente zu erzeugen: Ein großes Fragment eine Länge von ca. 8kb, das das BPV-Genom enthält, und ein kleineres Fragment der Länge von ungefähr 6,5 kb, das den pML2-Ursprung der Replikation und das Ampicillin-Resistenz-Gen, den Methallothionein-Promotor, das Neomycin-Resistenz-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal enthält. Die verdaute DNA wurde durch DNA-Ligase rezirkularisiert und die Plasmide, die nur das 6,8 kb-Fragment enthielten, wurden durch Verdauung mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen identifiziert. Eines dieser Plasmide wurde als pMMTneo^ABPV bezeichnet

pEP015a

pMMTneo BPV wurde mit BgIII vollständig verdaut. pEP049f wurde mit BamHI und BgIII vollständig verdaut und die ungefähr 700 bp-Fragmente, die die gesamte EPO-Codierungsregion enthielten, wurden durch Gelisolierung hergestellt. Die BgIII verdauten pMMTneo BPV- und die 700bp BamHI/BGIII-EPO-Fragmente wurden verknüpft und die resultierenden Plasmide, die die EPO-cDNA enthielten, wurden identifiziert durch Koloniehybridisierung mit der Oligonucleotidd(GGTCATCTGTCCCCTGTCC)-Probe, die spezifisch für das EPO-Gen ist. Von den F !asmiden, die bei der Hybnrdisierungsanalyse positiv waren, wurdeeines (pEP015a), das die EPO-cDNA in der Orientierung besaß, so daß das 5'-Ende der EPO-cDNA dem Metallothionein-Promotor am nächsten war, durch Verdauung mit EcoRI und Kpnl identifiziert. pBPV-EPO

Das Plasmid pEPO15a wurde vollständig durch BamHI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren. Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) wurde ebenfalls vollständig mit BamHI verdaut, um zwei Fragmente von 6,5 und 8kbzu erzeugen. Das 8 kb-Fragment, das das gesamte Rinder-Papilloma-Virus-Genom enthielt, wurde isoliert (Gel). pEPO15a/BamHI und das 8kb-BamHI-Fragment wurden miteinander verknüpft und ein Plasmid (pBPV-EPO), das das BPV-Fragment enthielt, wurde durch Koloniehybridisierung identifiziert, indem eine Oligonucleotidprobe d(P-CCACACCCGGTACACA-OH) verwendet wurde, die spezifisch für das BPV-Genom ist. Die Verdauung von pBPV-EPO-DNA mit Hindlll wies daraufhin, daß die Richtung der Transkription des BPV-Genoms die gleiche war wie die Richtung der Transkription des Metallothionein-Promotors (wie in pdPBV-MMTneo[342-12], vgl. Abbildung 11). Das Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 37224 erhältlich.

Expression

Die folgenden Methoden wurden für die Expression von EPO verwendet.

Methode I

DNA-pBPV-EPO wurde hergestellt und ungefähr 25μρ wurden verwendet, um ungefähr 10⁶CI27 (Lowy et al., J. of Virol. 26, [1978])-CHO-Zellen zu transfektieren, indem die Standardtechnik der Kalziumphosphatfällung verwendet wurde (Grahm et al..

Virology 52, 456-467 [1973]). Fünf Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsmedium entfernt, die Zellen mit Glycerin abgeschreckt, gewaschen und frisches alpha-Medium mit 10%igem fötalem Rinderserum zugegeben. 48 Stunden später wurden die Zellen trypsiniert und im Verhältnis von 1:10 in DME-Medium von 500/xg/ml G418 (Southern et al., Mol. Appl.

Genet. 1,327-341 [1982]) aufgeteilt und die Zellen für zwei bis drei Wochen inkubiert. G418-resistente Kolonien wurden einzeln auf in Mikrotiterplatten isoliert und in der Gegenwart von G418 gezüchtet. Die Zellen wurden dann gewaschen, frisches Medium mit 10%fötalem Rinderserum zugegeben und die Medien 24 Stunden später geerntet. Die konditionierten Medien wurden durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Versuche getestet und waren positiv für EPO.

Methoden

C127 oder CHO-Zellen wurden cotransfektiert mit25/u.g von pBPV-EPO und 2^g von pSV2neo (Southern et al, siehe oben; vgl.

Methode I). Dies bedeutet einen ungefähr 10f achen molaren Überschuß von pBPV-EPO. Nach der Transfektion ist das Verfahren das gleiche wie in Methode I.

Methodelll

C127-Zellen wurden mit30ug von pBPV-EPO transferiert (vgl. Methode I). Nach der Transfektion und der Aufteilung (1:10) wurde das Medium alle drei Tage gegen frisches ausgetauscht. Nach ungefähr zwei Wochen wurden Punkte von pBPV-transformierten Zellen sichtbar. Einzelne Punkte wurden getrennt in 1 cm Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, zu einem subkonfluenten Monolayer gezüchtet und auf EPO-Aktivitäten oder auf Antigenität im konditionierten Medium getestet.

Beispiel 14: Expression in Insektenzellen Konstruktion von pIVEV EPOFLI3

Der Plasmidvektor pIVEV wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39991 erhältlich. Der Vektor wurde wie folgt modifiziert:

pIVEVNI

piVEV wurde mit EcoRI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, durch Verwendung eines großen Fragmentes von DNA-Polymerase I wurden die Enden in glatte Enden umgewandelt und ein einzelner Notl-Linker

GGCGGCCGCC CCGCCGGCGG

wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wird als pIVEVNI bezeichnet.

plVEVSI

pIVEV wurde mit Smal verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und ein einzelner Sfil-Linker

GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG

wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als plVEVSI bezeichnet.

pIVEVSIBgKp

DasPlasmid plVEVSI wurde mit KPnI verdaut, um dasPlasmidzu linearisieren, und ungefährO-IOObpwurden von jedem Ende durch Verdauung mit der doppelsträngigen Exonuclease Bal31 entfernt. Alle resultierenden Enden, die nicht vollständig glatt waren, wurden mit Hilfe des großen Fragmentes von DNA-Polymerase I in glatte Enden umgewandelt und der Poly-Linker

Xho'l Xbal

BgL¹II EcoKI CIaI Kpnl

¹AGAT¹CTbGAGAATTCTAGATCGATGGTACC TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG

wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Der Poly-Linker wurde in beide Richtungen inseriert. Ein Plasmid, in dem der Poly-Linker so orientiert ist, daß die Bglll-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promoter am nächsten ist, wird als pIVEVSIBgKp bezeichnet. Ein Plasmid, in dem Kpnl-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promotor am nächsten liegt, wird als pIVEVSIKpBg bezeichnet. Die Anzahl der Basenpaare, die zwischen der ursprünglichen KPnl-Steile in plVEVSI und dem Polyhedron-Promotor gelöscht wurde, wurde nicht bestimmt.

plEIVSIBgKp wurde hinterlegt und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 39988 von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich.

pIVEVSIBgKpN

pIVEVNI wurde mit KPnI und Pstl vollständig verdaut, um zwei Fragmente zu erhalten. Das größere Fragment, das den Plasmidursprung der Replikation und das 3'-Ende des Polyhedron-Gens enthält, wurde durch Gelisolierung hergestellt (Fragment A). pIVEVSIBgKp wurde vollständig mit Pstl und KPn verdaut, um zwei Fragmente sowie ein kleines Fragment zu erhalten, das den Polyeder-Gen-Promotor enthält. Der Poly-Linker wurde durch Gelisolation hergestellt (Fragment B). Die Fragmente A und B wurden dann durch die DNA-Ligase miteinander verbunden, um das neue Plasmid pIVEVSIBgKpNI zu bilden, das ein teilweise gelöschtes Polyeder-Gen enthält, in das ein Poly-Linker inseriert wurde, und das ebenso die Notl-Stelle (Ersetzen der zerstörten EcoRI-Stelle) und eine Sfil-Stelle enthält, die die Polyhedron-Gen-Region flankiert.

plVEPO

plVEVSI BgKpNI wurde vollständig mit EcoRI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und das 1 340bpEcoRI-Fragment von Lambda-HEPOFL13 wurde inseriert. Die Plasmide, die das EPO-Gen in der Orientierung enthielten, so daßdasB'-Endedes EPO-Gens dem Polyeder-Promotor am nächsten war, und das 3'-Ende des Polyeder-Gens wurden durch Verdauung mit BgIII identifiziert. Eine dieser Plasmide in der obenbeschriebenen Orientierung wurde als plVEPO bezeichnet. Expression von EPO in Insektenzellen

Große Mengen des plVEPO-Plasmides wurden durch Transformation des E.coli Stranges JM101-tgl hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde durch die „cleared-lysate"-Technik isoliert (Maniatis und Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) und weiter durch CsCI-Zentrifugation gereinigt. Die L-1-DNA aus dem Wildtyp autographa-californica-Polyhydrosis Virus (AcANPV) wurde durch Phenolextraktion von Viruspartikeln und darauffolgender CsCI-Reinigung der viralen DNA hergestellt. Diese beiden DNAs wurde dann in spod.-frugiperda-Zelien IPLB-SF-21 (Vaughn et al., in-vitro, Vol. B, S. 213-217 [1977]) cotransfektiert, indem das Verfahren der Kalziumphosphat-Transfektion (Potter und Miller, 1977) verwendet wurde. Für jede Platte der zu cotransfektierenden Zellen wurden 1ju.g des Wild-Typs AcNPV-DNA und 10jug von plVEPO verwendet. Die Platten wurden fünf Tage lang bei 27°C inkubiert. Der Überstand wurde dann geerntet und die EPO-Expression im Überstand wurde durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Methoden bestätigt.

Beispiel 15: Reinigung von EPO

Die mit COS-Zellen konditionierten Medien (121) mit EPO-Konzentration bis zu 200^g/l wurden auf 600 ml konzentriert, indem Ultrafiltrationsmembranen mit einer Ausschlußgrenze eines Molekulargewichts von 10.000 verwendet wurden, z.B. eine Millipore-Pellikan-Membran. Die Tests wurden mit Hilfe eines RIA, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Der Überstand aus der Ultrafiltration wurde gegen 4ml eines 10mM-Natriumphosphatpuffers (pH7,0) diafiltriert. Die konzentrierten und diafiltrierten, konditionierten Medien enthielten 2,5mg EPO (380mg Gesamtprotein). Die EPO-Lösung wurde auf 186ml weiterkonzentriert und die ausgefallenen Proteine wurden 30 Minuten lang bei 120.000xg abzentrifugiert. Der Überstand, der 2,0 mg EPO enthielt, wurde mit 50%iger Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, 30 Minuten bei 4^qC gerührt und der Niederschlag 30 Minuten lang bei 13.000xg abzentrifugiert

Carbonylmethyl-Sepharose-Chromatographie

Der Überstand der Zentrifugation (20 ml), der 200/xg von EPO (24 mg Gesamtprotein) enthielt, wurde auf einer Säule aufgetragen, die mit CM-Sepharose (20 ml) gepackt und mit 1OmM Natriumacetat (pH 5,5) äquilibriert war. Anschließend wurde die Säule mit 40 ml des gleichen Puffers gewaschen. Das an die CM-Sepharose gebundene EPO wurde nach 100 ml eines Gradienten von NaU (0-1) in 1OmM Natriumphosphat (pH 5,5) eluiert. Die Fraktionen, die EPO enthielten (insgesamt 50/xg von 2 mg Gesamtprotein), wurden vereinigt und auf 2ml mit Hilfe einer Amicon-YMIO-Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Reversed-phase-HPLC

Die konzentrierten Fraktionen nach der Säulenchromatographie, die EPO enthielten, wurden weiter durch reversed-phase-HPLC über eine Vydac C-4-Säule gereinigt. Das EPO wurde mit einer Flußrate von 1 ml/min auf die Säule aufgetragen, die mit 10% Lösung B (Lösung A war 0,1% CF₃COOH in Wasser; Lösung B war 0,1% CF₃COOH in CF₃CN) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 10% der Lösung B 10 Minuten lang gewaschen und das EPO wurde mit einem linearen Gradienten von B (10-70%; 60 min) eluiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (ungefähr 40/xg von EPO von 120/xg Gesamtprotein) und lyophilisiert. Das lyophilisierte EPO wurde in 0,1 m Tris-HCI-Pfuffer (pH 7,5) mit 0,15 m NaCI rekonstituiert und auf einer reversed-phase-HPLC rechromatographiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-(10%)-Gel Elektrophorese (Lamelli, U.K. Nature) analysiert. Die vereinigten Fraktionen von EPO enthielten 15,5^g von EPO (25μg Gesamtprotein). .

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Abb. 1

gatcctacgcctgtggccagggccagagccttcagggacccttgactccccgggctgtgtgcatttcag

ACG Thr

GGC GIy

TGT Cys

GCT Ala

GAA GIu

CAC His

TGC Cys

AGC Ser

TTG Leu

GAGgtgagttcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatttgcgagcctg GIu d

AAT. As η

GAG GIu

AAT Asn

ATC He

ACT Thr

GTC . VaI

CCA Pro

GAC Asp

ACC Thr

AAA Lys

GTT VaI

AAT As η

TTC Phe

TAT Tyr

GCC Ala

TGG Trp

AAG Lys

AGG Arg

ATG ' MET

attttggatgaaagggagaatgatc

Abb. 2

Erwachsenen-Leber fötale Leber

Abb. 3 A

TRP

LEU

TRP

LEU

LEU

LEU

SER

LEU

LEU

SER

LEU

PRO

MET

GLY

VAL

•

Leu

HIS

GLU

CYS

PRO

ALA

10

LEU

GLY

LEU

PRO

VAL

LEU

GLY

1

Pro

Pro

Arg

Leu

Me

Cys

Asp

Ser

Arg

VaI

Leu

GIu

20

Ala

Arg

Tyr

Leu

GIu

AIa

Lys

AIa

GIu

As η

He

Thr

Thr

SH GIy

Cys

30 AIa

GIu

His

Cys

Ser

Leu

Asn

GIu

Asn

He

40 Thr

VaI

Pro

Asp

Thr

Lys

VaI

As η

Phe

Tyr

SH 50 AIa

Trp

Lys

Arg

Met

GIu

VaI

GIy

GIn

GIn

60 AIa

VaI

GIu

VaI

Trp

GIn

GIy

Leu

AIa

Leu

70 Leu

Ser

GIu

AIa

VaI

Leu

Arg

GIy

GIn

AIa

80 Leu

Leu

VaI

As η

Ser

Ser

GIn

Pro

Trp

GIu

90 Pro

Leu

GIn

Leu

His

VaI

Asp

Lys

AIa

VaI

100 Ser

GIy

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Leu

110 Arg

AIa

Leu

GIy

AIa

GIn

Lys

GIu

AIa

He

120 Ser

Pro

Pro

Asp

AIa

AIa

Ser

AIa

AIa

Pro

130 Leu

Arg

Thr

He

Thr

AIa

Asp

Thr

Phe

Arg

140 Lys

Leu

Phe

Arg

VaI

Tyr

Ser

Asn

Phe

Leu

150 Arg

GIy

Lys

Leu

Lys

Leu

Tyr

Thr

GIy

GIu

160 AIa

Cys Arg SH

Thr GIy

166 Asp Arg

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons, der biologisch aktives Erythropoietin exprimiert, dadurch gekennzeichnet, daß

a) gereinigtes Erythropoietin-Protein durch Trypsin verdaut wird,

b) ein Pool von Oligonukleotidproben hergestellt wird, der auf der Aminosäuresequenz der in Schritt a) produzierten tryptischen Fragmente basiert,

c) eine menschliche Genom-DNA-Bibliothek mit den Oligonecukieotidproben von Schritt b) gescreentwird,

d) Klone selektioniert werden, die mitden Proben hybridisieren, und die Klone sequenziert werden, um zu bestimmen, ob sie Erythropoietin-Klone darstellen,

e) ein Erythropoietin-Klon von Schritt d) indentifiziert wird,

f) ein Klon von Schritt e) für das Screening einer cDNA-Bibliothek verwendet wird, die aus menschlicher fötaler Leber hergestellt wurde, und

g) ein Erythropoietin-Klon aus derfötalen Leber-cDNA-Bibliothek selektioniert wird.