DE10163883A1

DE10163883A1 - Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease

Info

Publication number: DE10163883A1
Application number: DE10163883A
Authority: DE
Inventors: Susanne Schmitz; Angela Hellebrandt; Angrit Weber; Karl-Heinz Maurer; Beatrix Kottwitz
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-12-22
Filing date: 2001-12-22
Publication date: 2003-07-10
Also published as: US20050009167A1; EP1456384A2; HUP0402429A2; AU2002361062A8; HK1071770A1; AU2002361062A1; CN100366746C; CN1606626A; WO2003056017A2; JP2005525794A; HUP0402429A3; WO2003056017A3

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft eine neue Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus sp. (DSM 14390) sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit dieser neuen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie weitere technische Einsatzmöglichkeiten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ aus Bacillus sp. (DSM 14390) sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit dieser neuen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie weitere technische Einsatzmöglichkeiten.
Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62), insbesondere Subtilisine werden aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet. Sie werden natürlicherweise von Mikroorganismen, insbesondere von Bacillus-Spezies gebildet und sekretiert. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel "Subtilases: Subtilisinlike Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilisine eignen sich für eine Vielzahl von technischen Verwendungsmöglichkeiten, als Bestandteile von Kosmetika und insbesondere als aktive Inhaltsstoffe von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Enzyme sind etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Proteasen bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut, wie beispielsweise Textilien oder harten Oberflächen. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Dies ist beispielsweise in US 6008178 dargestellt. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilisine aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH-Optimum eine herausragende Stellung ein. Im folgenden werden die wichtigsten davon und die wichtigsten Strategien für ihre technische Weiterentwicklung aufgeführt.
Die Entwicklung von Waschmittelproteasen beruht auf natürlicherweise, vorzugsweise mikrobiell gebildeten Enzymen. Solche werden über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren, beispielsweise Punktmutagenese, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert.
So ist beispielsweise nach der Anmeldung WO 93/07276 die aus Bacillus spec. 164-A1 erhältliche Protease 164-A1 der Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, und Vista Chemical Company, Austin, TX, USA, für den Gebrauch in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet. Andere Beispiele sind die Alkalische Protease aus Bacillus sp. PD138, NCIMB 40338 der Firma Novozymes (WO 93/18140), die aus Bacillus sp. ferm. BP-3376 stammende Proteinase K-16 der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, (US 5344770) und gemäß WO 96/25489 (Firma Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA) die Protease aus dem psychrophilen Organismus Flavobacterium balustinum. Weitere Proteasen mikrobiellen Ursprungs, die sich für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln eignen, sind auch aus der Patentliteratur bekannt: beispielsweise aus Pseudomonas (WO 00/05352), aus Metarrhizium (EP 601005), aus Bacillus alkalophilus DSM 6845 oder DSM 5466 (DE 44 11 223) und diversen anderen Mikroorganismen (WO 95/07350, EP 1029920, EP 578712, WO 01/00764, US 6197740, WO 01/16285).
Das Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise B. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11, S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine. In der Anmeldung CA 2049097 werden Mehrfachmutanten dieses Moleküls, insbesondere hinsichtlich ihrer Stabilität in Wasch- und Reinigungsmitteln offenbart. Durch Punktmutationen in den Loop-Regionen dieses Enzyms erhaltene Varianten mit verringerter Bindung an das Substrat bei gleichzeitig erhöhter Hydrolyserate werden beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 95/07991 und WO 95/30010 vorgestellt. Waschmittel mit derartigen BPN'-Varianten werden beispielsweise in der Patentanmeldung WO 95/29979 offenbart.
Die Protease Subtilisin Carlsberg wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191, und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 vorgestellt. Sie wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet und war, beziehungsweise ist unter dem Handelsnamen Maxatase® von der Firma Genencor International Inc., Rochester, New York, USA, sowie unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsværd, Dänemark, erhältlich. Durch Punktmutationen erhältliche Varianten davon mit verringerter Bindung an das Substrat bei gleichzeitig erhöhter Hydrolyserate sind beispielsweise aus der Anmeldung WO 96/28566 bekannt. Hierbei handelt es sich um Varianten, in denen Ein- oder Mehrfachaustausche in den Loop-Regionen des Moleküls vorgenommen worden sind.
Die Protease PB92 wird natürlicherweise von dem alkaliphilen Bakterium Bacillus nov. spec. 92 produziert und war unter dem Handelsnamen Maxacal® von der Firma Gist-Brocades, Delft, Niederlande, erhältlich. In ihrer ursprüglichen Sequenz wird sie in der Patentanmeldung EP 283075 A2 beschrieben. Durch Punktmutation erhaltene Varianten dieses Enzyms, die sich für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln eignen, werden beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/02618 und EP 328229 offenbart.
Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus Bacillus-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 offenbart werden. Durch Punktmutagenese in Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln weiterentwickelte Varianten dieser Enzyme werden beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/02618 (siehe oben), WO 89/06279, WO 95/30011 und WO 99/27082 offenbart. Die Anmeldung WO 89/06279 verfolgte das Ziel, höhere Oxidationsstabilität, erhöhte Proteolyserate und verbesserte Waschleistung zu erzielen. Aus ihr geht hervor, daß Austausche in bestimmten Positionen die physikalischen oder chemischen Eigenschaften der Moleküle Subtilisin 147 oder 309 ändern. In der Anmeldung WO 95/30011 werden Varianten von Subtilisin 309 vorgestellt, die in den Loop-Bereichen des Moleküls Punktmutationen aufweisen und damit verringerte Adsorption an das Substrat bei gleichzeitig erhöhter Hydrolyserate zeigen. In der Anmeldung WO 99/27082 werden am Beispiel von Subtilisin 309 Varianten entwickelt, deren Waschleistung dadurch verbessert wird, daß die aktiven Loops durch Insertion von mindestens einer Aminosäure vergrößert werden.
Bei den Alkalischen Proteasen aus B. lentus handelt es sich um hochalkalische Proteasen aus Bacillus species. Das Wildtypenzym stammt aus einem alkaliphilen Bacillus-Stamm und zeigt selbst bereits eine vergleichsweise hohe Stabilität gegenüber Oxidation und dem Einwirken von Detergenzien. Dieser Stamm ist gemäß der Anmeldung WO 91/02792 (EP 493398 und US 5352604) unter der Nummer DSM 5483 hinterlegt worden. Nach derselben Anmeldung kann das Enzym in dem Wirt Bacillus licheniformis heterolog exprimiert werden. Dessen dreidimensionale Struktur wird in der Veröffentlichung Goddette et al. (1992), J. Mol. Biol., Band 228, S. 580-595: "The crystal structure of Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 Å resolution" beschrieben. Durch Punktmutation zu erhaltende, für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignete Varianten dieses Enzyms werden in WO 92121760 (US 5340735, US 5500364 und US 5985639) und WO 95/23221 (US 5691295, US 5801039 und 5855625) offenbart. Die der WO 95/23221 zugrundeliegende Strategie, nämlich gezielt die Ladungsverhältnisse nahe der Substrat- Bindungstasche zu verändern, verdeutlicht US 6197589. Weitere Varianten dieser Protease werden in den bislang noch nicht veröffentlichten Anmeldungen DE 10 12 1463 und DE 10 15 3792 beschrieben.
Das Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben worden. Beispielsweise nach der Anmeldung WO 96/28557 kann es über gezielte Punktmutationen in den aktiven Loops für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln optimiert werden. Daraus gehen Varianten mit verringerter Adsorption und erhöhter Hydrolyserate hervor.
Das von Thermoactinomyces vulgaris natürlicherweise gebildete, den Subtilasen, jedoch nicht mehr den Subtilisinen zuzuordnende Enzym Thermitase (vergleiche R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996) ist ursprünglich von Meloun et al. (FEBS Lett. 1983, S. 195-200) beschrieben worden. Varianten mit verringerter Absorption und erhöhter Hydrolyserate aufgrund von Substitutionen in den Loop-Regionen gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 96/28558 hervor. Allerdings handelt es sich bei Thermitase um ein Molekül, das insgesamt erhebliche Sequenzabweichungen gegenüber den übrigen Subtilisinen aufweist.
Auch bei der Proteinase K handelt es sich um eine Subtilase, die beispielsweise zu der Alkalischen Protease aus B. lentus eine vergleichsweise geringe Homologie aufweist. Die Proteinase K stammt ursprünglich aus dem Mikroorganismus Tritirachium album Limber und ist von K.-D. Jany und B. Mayer 1985 in Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Band 366, S. 485-492 beschrieben worden. In der Anmeldung WO 96/28556 werden für die Proteinase K zahlreiche durch Punktmutagenese erhältliche Varianten mit verringerter Adsorption ans Substrat und mit erhöhter Hydrolyserate offenbart.
WO 88/07581, schließlich, offenbart die einander sehr ähnlichen Proteasen TW3 und TW7 unter anderem für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Weitere für den technischen Einsatz, insbesondere in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignete Proteasen werden beispielsweise in den Anmeldungen EP 199404, EP 251446, WO 91/06637 und WO 95/10591 beschrieben. Die Proteasen der Anmeldung EP 199404 sind verschiedene BPN'-Varianten, die auf dem Patent EP 130756 beruhen. In EP 251446 werden zahlreiche, durch den Austausch einzelner Aminosäuren erhältliche BPN'-Varianten offenbart. Die Proteasen der Anmeldung WO 91/06637 zeichnen sich durch Punktmutationen von BPN' in den Positionen 123 und/oder 274 aus. Aus WO 95/10591 gehen Varianten, in erster Linie von der Protease aus Bacillus lentus hervor, die Mutationen in der Position 76 und zusätzlich anderen Positionen tragen.
Weitere bekannte Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, unter den Handelsnamen, Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® und Properase® von der Firma Genencor, unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien und unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, erhältlichen Enzyme.
Eine Strategie, um die Waschleistung der Subtilisine zu verbessern, besteht darin, statistisch oder gezielt in den bekannten Molekülen einzelne Aminosäuren gegen andere zu substituieren und die erhaltenen Varianten auf ihre Beiträge zur Waschleistung zu überprüfen. Diese Strategie verfolgen einige der oben jeweils angegebenen Weiterentwicklungen, beispielsweise EP 130756. Beispielsweise gemäß WO 99/49056, WO 99/49057 und WO 01/07575 können die Enzyme mit bestimmten Aminosäureaustauschen oder Deletionen auch hinsichtlich ihrer Allergenizität verbessert werden.
Um die Waschleistung der Subtilisine zu verbessern, wurde in zahlreichen Anmeldungen die Strategie der Insertion zusätzlicher Aminosäuren in die aktiven Loops verfolgt, so neben der bereits genannten WO 99127082 beispielsweise auch für die Anmeldungen, die unter den Nummern WO 00/37599, WO 00/37621 bis WO 00/37627 und WO 00/71683 bis WO 00/71691 veröffentlicht worden sind. Sie soll demnach prinzipiell auf alle Subtilisine anwendbar sein, die einer der Untergruppen I-S1 (wahre Subtilisine) oder I-S2 (hochalkalische Subtilisine) angehören.
Eine andere Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verändern. Derartige Variationen werden beispielsweise in dem Patent US 5665587 und den Anmeldungen EP 405901 A1, EP 945502 A1, WO 91/00334 und WO 91/00345 offenbart. Punktmutationen zur Verringerung der pH-Wert-abhängigen Molekülladungsvariation werden in WO 92/11348 offenbart. Die Anmeldung WO 00/24924 leitet aus diesem Prinzip ein Verfahren zur Identifizierung von Varianten ab, die für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sein sollen; dabei weisen alle offenbarten Varianten mindestens einen Austausch in Position 103 auf, bevorzugt sind Vielfachvarianten mit keinem für die vorliegende Anmeldung relevanten Austausch. Nach der WO 96/34935 kann zum Zweck der Leistungsverbesserung in Wasch- und Reinigungsmitteln auch die Hydrophobizität der Moleküle erhöht werden, was einen Einfluß auf die Stabilität des Enzym haben kann.
Aus der Anmeldung WO 99/20727 gehen Subtilisinvarianten hervor, wie sie nach einem Verfahren der Anmeldung WO 00/24924 erhalten werden: sie alle enthalten mindestens einen Austausch in Position 103, kombiniert mit einer Vielzahl anderer möglicher Austausche. Dieselben Mutanten werden in den Anmeldungen WO 99/20723 und WO 99/20726 für Wasch- und Reinigungsmittel offenbart, die zusätzlich eine Amylase, beziehungsweise Bleiche enthalten.
Eine andere Methode, die Leistungsfähigkeit von Proteasen zu modulieren, besteht in der Bildung von Fusionsproteinen. So werden beispielsweise in den Anmeldungen WO 98/13483 und WO 00/01831 Fusionsproteine aus Proteasen und einem Inhibitor wie dem Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor offenbart. Eine andere Möglichkeit ist beispielsweise gemäß WO 97/28243 oder WO 99/57250 die Kopplung an die von Cellulasen abgeleitete Cellulosebindungsdomäne (CBD) zur Erhöhung der Konzentration an aktivem Enzym in unmittelbarer Nähe zum Substrat. Gemäß WO 99/48918 wird durch eine Kopplung eines Peptidlinkers und daran von Polymeren die Allergenizität, beziehungsweise Immunogenizität herabgesetzt.
Durch statistisch erzeugte Aminosäureaustausche und anschließende Selektion leistungsverbesserte Varianten gehen beispielsweise aus WO 99/20769 hervor. Eine statistische, auf dem Phage display-System beruhende Methode, Proteasen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmittel zu evolvieren, geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 97/09446 hervor.
Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen zu kombinieren, die bislang nicht erreichte Eigenschaften aufweisen. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise folgende Verfahren: Die StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band 16, S. 258-261), Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), DNA-Shuffling (Stemmer, W. P. C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391) oder Recursive sequence recombination (RSR; WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625) oder die Methode RACHITT (Coco, W. M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., Band 19, S. 354-359). Einen Überblick über derartige Methoden vermittelt auch der Aufsatz "Gerichtete Evolution und Biokatalyse" von Powell et al. (2001), Angew. Chem., Band 113, S. 4068-4080.
Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Stabilisierung über Kopplung an ein Polymer ist für Proteasen, die in Kosmetika eingesetzt werden, beispielsweise in US 5230891 beschrieben worden; sie geht mit einer besseren Hautverträglichkeit einher. Insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel sind dagegen Stabilisierungen durch Punktmutationen geläufiger. So können gemäß US 6087315 und US 6110884 Proteasen dadurch stabilisiert werden, daß man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht. In WO 89/09819 und WO 89/09830 werden thermostabilere, ebenfalls durch Aminosäure-Austausch erhaltene BPN'-Varianten beschrieben. Andere beschriebene Möglichkeiten zur Stabilisierung über Punktmutagenese sind beispielsweise:

- Austausch bestimmter Aminosäurereste gegen Prolin gemäß WO 92/19729, beziehungsweise EP 583339 und US 5858757 und gemäß EP 516200;
- Einführung polarerer oder geladenerer Gruppen auf der Oberfläche des Moleküls gemäß EP 525610, EP 995801 und US 5453372;
- Verstärkung der Bindung von Metallionen, insbesondere über Mutagenese der Calcium- Bindungsstellen, beispielsweise gemäß der Lehre der Anmeldungen WO 88/08028 und WO 88/08033;
- Blockade der Autolyse durch Modifikation oder Mutagenese, beispielsweise gemäß WO 98/20116 oder US 5543302.
- Kombination mehrerer Stabilisierungsstrategien gemäß der Anmeldung EP 398539 A1.
- Gemäß US 5340735, US 5500364, US 5985639 und US 6136553 können die zur Stabilisierung relevanten Positionen über eine Analyse der dreidimensionalen Struktur ermittelt werden.

Beispielsweise aus den Dokumenten EP 755999 und WO 98/30669 geht hervor, daß Proteasen zur Verbesserung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit α-Amylasen und weiteren Waschmittelenzymen eingesetzt werden können. Beispielsweise EP 791046 offenbart die Kombinierbarkeit mit Lipasen. Beispielsweise aus der Anmeldung WO 95/10592 geht hervor, daß die bereits in WO 95/10591 für den Einsatz in Waschmitteln beschriebenen Varianten auch für den Einsatz in Bleichmitteln geeignet sind. Beispielsweise US 6121226 offenbart den gleichzeitigen Einsatz von Protease und Soil-Release-Wirkstoffen in Waschmitteln.
Beispielsweise aus der Anmeldung WO 97/07770 ist bekannt, daß einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke geeignet sind. Eine wietere technische Einsatzmöglichkeit von Proteasen wird beispielsweise in der Anmeldung EP 380362 A1 vorgestellt. Diese betrifft organisch-chemische Synthesen, wofür dieser Anmeldung zufolge solche Subtilisine geeignet sein sollen, die über Punktmutagenese stabilisiert sind.
Die hier beispielhaft dargestellten, diversen technischen Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. Umgekehrt hängen die technischen Einsatzmöglichkeiten der Proteasen, beispielsweise im Kontext einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur, von weiteren Faktoren wie Stabilität des Enzyms gegenüber hohen Temperaturen, gegenüber oxidierenden Agentien, dessen Denaturierung durch Tenside, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen ab.
Somit besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die aufgrund der Vielzahl ihrer Einsatzgebiete in ihrer Gesamtheit ein breites Spektrum an Eigenschaften bis hin zu sehr subtilen Leistungsunterschieden abdecken.
Die Basis hierfür wird durch neue Proteasen erweitert, welche ihrerseits hinsichtlich spezieller Einsatzgebiete gezielt weiterentwickelt werden können.
Der vorliegenden Erfindung lag also die Aufgabe zugrunde, eine weitere, noch nicht bekannte Protease aufzufinden. Das Wildtyp-Enzym sollte sich vorzugsweise dadurch auszeichnen, daß es bei Verwendung in einem entprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen zumindest nahekommt. Hierbei war insbesondere der Beitrag zur Leistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Interesse.
Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen codieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sollten technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert werden.
Die Lösung der Aufgabe besteht in Alkalischen Proteasen vom Subtilisin-Typ mit Aminosäuresequenzen, die zu der im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,5% identisch sind.
Zunehmend bevorzugt sind jeweils solche mit einem zunehmenden Maß an Identität mit der neuen Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390).
Weitere Lösungen der Aufgabe, beziehungsweise Lösungen der Teilaufgaben und somit jeweils eigene Erfindungsgegenstände bestehen in Nukleinsäuren, deren Sequenzen zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz hinreichend ähnlich sind oder für erfindungsgemäße Proteasen codieren, in entsprechenden Vektoren, Zellen, beziehungsweise Wirtszellen und Herstellverfahren. Ferner werden entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt. Schließlich werden technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert.
Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L- Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Die Kombination einer dieser Bezeichnungen mit einer Nummer bezeichnet für das jeweilige Protein, welchen Aminosäure-Rest es in der jeweiligen Position trägt. Für Punktmutationen sind analoge Bezeichnungen etabliert. Positionsangaben beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf die jeweils maturen Formen der betreffenden Proteine, also ohne die Signalpeptide (siehe unten).
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biochemische Funktion ausübt. Beispielsweise unter proteolytischen Enzymen oder Enzymen mit proteolytischer Funktion sind im allgemeinen solche zu verstehen, die die Säureamidbindungen von Proteinen hydrolysieren, insbesondere solche, die im Inneren der Proteine liegen, und deshalb auch als endo-Peptidasen bezeichnet werden können. Subtilisin-Proteasen sind solche endo-Peptidasen, die natürlicherweise von gram-positiven Bakterien gebildet und zumeist sekretiert werden, oder von diesen, beispielsweise über molekularbiologische Methoden abgeleitet sind und sich über Teilbereiche, wie strukturbildende oder funktionstragende Regionen mit den natürlichen Subtilisin-Proteasen homologisieren lassen. Sie werden den Subtilasen zugeordnet. Diese werden beispielsweise in dem Artikel "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996, dargestellt.
Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so daß dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-terminalen Aminosäuren ausübt.
Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen Peptide, das heißt die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt.
Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Aus ihnen können beispielsweise über reverse Transkription wiederum (c-)DNA-Moleküle abgeleitet werden.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit einer Nukleinsäure wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet. Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann (Degeneriertheit des genetischen Codes). Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen und angegebene Nukleotidsequenzen jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge angesehen werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen vollständige Gene herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1, S. 267-271 und Band 2, S. 227-229, bekannt. Dies ist insbesondere dann möglich, wenn auf einen bei einer Stammsammlung hinterlegten Stamm zurückgegriffen werden kann. Beispielsweise mit PCR-Primern, die anhand einer bekannten Sequenz synthetisierbar sind, und/oder über isolierte mRNA-Moleküle können aus solchen Stämmen die betreffenden Gene synthetisiert, kloniert und gewünschtenfalls weiter bearbeitet, beispielsweise mutagenisiert werden.
Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom übrigen Genom unabhängig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfülllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.
Sowohl Bakterienzellen als auch eukaryontische Zellen, die die genannten Vektoren enthalten, werden ungeachtet ihrer Unterschiede allgemein als Zellen bezeichnet. Solche Zellen, die einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor enthalten und somit zur Expression eines Transgens angeregt werden können, werden als Wirtszellen bezeichnet, denn sie beherbergen das betreffende genetische System.
Homologisierung ist der Vergleich einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit der von bekannten Genen oder Proteinen. Sie wird beispielsweise über ein Alignment vorgenommen. Das Maß für die Homologie ist ein Prozentsatz an Identität, wie er beispielsweise nach der von D. J. Lipman und W. R. Pearson in Science 227 (1985), S. 1435-1441 angegebenen Methode bestimmt werden kann. Diese Angabe kann sich auf das gesamte Protein oder auf den jeweils zuzuordnenden Bereich beziehen. Ein weiter gefaßter Homologie-Begriff, die Ähnlichkeit, bezieht auch konservierte Variationen, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität in die Betrachtung mit ein, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Bei Nukleinsäuren kennt man nur den Prozentsatz an Identität.
Durch Homologisierung lassen sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die Funktionen einzelner Sequenzbereiche sowie die enzymatische Aktivität des betrachteten gesamten Enzyms folgern. Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind solche mit vergleichbaren Funktionen, die sich durch Identität oder konservierte Austausche in der primären Aminosäuresequenz erkennen lassen. Sie umfassen einzelne Aminosäuren, kleinste Bereiche, sogenannte Boxen, die wenige Aminosäuren lang sind, bis hin zu langen Bereichen in der primären Aminosäuresequenz. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind somit auch kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes. Andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen enzymatischen Reaktion beteiligt sind, können sie qualitativ oder quantitativ modifizieren. Dies betrifft beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität.
Unter dem Begriff eines proteolytischen Enzyms oder dem einer Protease sind deshalb über die Funktionen der wenigen Aminosäurereste des katalytisch aktiven Zentrums hinaus alle Funktionen zu verstehen, wie sie sich durch das Einwirken des gesamten übrigen Proteins oder eines Teils oder mehrerer Teile des übrigen Proteins auf die eigentlich katalytisch aktiven Bereiche ergeben. Auch allein solche modifizierenden Funktionen oder Teilaktivitäten werden, sofern sie eine Proteolyse-Reaktion unterstützen, im Sinne der Erfindung als proteolytische Aktivität angesehen. Zu solchen Hilfsfunktionen oder Teilaktivitäten gehören beispielsweise die Bindung eines Substrats, eines Zwischen- oder Endprodukts, die Aktivierung oder die Inhibierung oder Vermittlung eines regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität. Dabei kann es sich beispielsweise auch um die Ausbildung eines Strukturelements handeln, das fern vom aktiven Zentrum liegt. Die zweite Voraussetzung dafür, daß es sich erfindungsgemäß um ein proteolytisches Protein handelt, ist allerdings, daß sich durch das chemische Verhalten der eigentlich aktiven Reste allein oder zusätzlich durch das Einwirken der modifizierenden Teile eine Hydrolyse von Peptid- Bindungen ergibt. Es ist darüberhinaus möglich, daß auch die Aktivitäten anderer Proteasen durch einen oder mehrere Teile, beispielsweise des erfindungsgemäßen Proteins qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Diese Beeinflussung anderer Faktoren wird ebenfalls als proteolytische Aktivität angesehen. Proteolytisch aktive Enzyme sind auch solche Proteasen, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa durch einen Inhibitor blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur entsprechenden Proteolyse- Reaktion.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.
Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die aus Elementen zusammengesetzt sind, die natürlicherweise von verschiedenen Polypeptidketten aus demselben Organismus oder aus verschiedenen Organismen stammen. Dieses Vorgehen wird auch Shuffling oder Fusionsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Fusion besteht beispielsweise darin, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können beispielsweise molekularbiologische Methoden, etwa die Cotransformation mit Genen, die für die betreffende Modifikation sorgen, eingesetzt werden. Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifikationen beeinflussen beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder führen eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbei, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies ist beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente, Fusionsproteine und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.
Unter der Leistung eines Enzyms wird dessen Wirksamkeit im jeweils betrachteten technischen Bereich, vorzugsweise im Rahmen eines entsprechend ausgerichteten Mittels verstanden. Diese basiert auf der eigentlichen enzymatischen Aktivität, hängt darüberhinaus aber von weiteren, für den jeweiligen Prozeß relevanten Faktoren ab. Dazu gehören beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Wechselwirkung mit dem das Substrat tragenden Material oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen, insbesondere Synergien.
Unter der Waschleistung oder der Reinigungsleistung eines Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung der Effekt zu verstehen, den das betrachtete Mittel auf die verschmutzten Artikel, beispielsweise Textilien oder Gegenstände mit harten Oberflächen ausübt. Einzelne Komponenten solcher Mittel, beispielsweise einzelne Enzyme, werden hinsichtlich ihres Beitrags zur Wasch- oder Reinigungsleistung des gesamten Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittels beurteilt. Denn aus den enzymatischen Eigenschaften eines Enzyms kann nicht ohne weiteres auf seinen Beitrag zur Waschleistung eines Mittels geschlossen werden. Hier spielen als weitere Faktoren beispielsweise Stabilität, Substratbindung, Bindung an das Reinigungsgut oder Wechselwirkungen mit anderen Inhaltsstoffen der Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere Synergien bei der Entfernung der Verschmutzungen eine Rolle.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise gebildete Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden kann, aus dem Kulturüberstand des Stammes Bacillus sp. (DSM 14390) erhältlich.
Dieser Stamm ist gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen vom 28. April 1977 am 1.3.2001 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http:/ / www.dsmz.de), hinterlegt worden. Er trägt dort die Bezeichnung ID 01-191 und die Eingangsnummer DSM 14390. Die maßgeblichen Angaben über die Merkmale dieses biologischen Materials, wie sie von der DSMZ am 19.4.2001 bei der Hinterlegung bestimmt worden sind, werden in Tabelle 1 (Beispiel 1) zusammengestellt.
Die vorliegende Patentanmeldung hat die Strategie verfolgt, aus einem natürlichen Habitat einen Protease-bildenden Mikroorganismus und somit ein natürlicherweise gebildetes Enzym aufzufinden, das die gestellten Anforderungen möglichst vollständig erfüllt.
Solch ein Enzym konnte, wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, mit der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) gefunden werden.
Wie über die von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH angestellte, und in Tabelle 1 von Beispiel 1 angegebene biochemische Charakterisierung hinaus festgestellt werden kann, sekretiert dieser Stamm eine proteolytische Aktivität. Diese ist nach den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung untersucht worden und läßt sich folgendermaßen beschreiben: Es handelt sich gemäß SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese um ein 26 kD-Protein, mit einem gemäß isoelektrischer Fokussierung bestimmten isoelektrischen Punkt von 11. Die spezifische Aktivität für das Substrat AAPF beträgt 69 U/mg. Das bei 50°C bestimmte pH-Optimum liegt bei pH 11.
Die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen neuen Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) ist im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung unter SEQ ID NO. 1 angegeben. Sie umfaßt 1143 bp. Die hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO. 2 angegeben. Sie umfaßt 380 Aminosäuren, gefolgt von einem Stop-Codon. Hiervon sind die ersten 111 Aminosäuren wahrscheinlich nicht im maturen Protein enthalten, so daß sich für das mature Protein voraussichtlich eine Länge von 269 Aminosäuren ergibt.
Wie in Beispiel 2 beschrieben ist, wurden diese Sequenzen mit den aus allgemein zugänglichen Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) und GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) erhältlichen Proteasesequenzen verglichen.
Hierüber wurden auf der Ebene der DNA für das gesamte Gen folgende drei Gene als nächstähnliche identifiziert: (1.) das Subtilisin P92 aus Bacillus alkalophilus (ID ELYA_BACAO) mit 90% Identität, (2.) die Alkalische Elastase aus Bacillus Ya-B (ID ELYA_BACSP) mit 72% Identität und (3.) das Subtilisin Sendai aus Bacillus Sendai (ID Q45522) mit 69% Identität.
Auf der Ebene der Aminosäuren für das gesamte Präproprotein wurden als nächstähnliche identifiziert: (1.) das Subtilisin P92 aus Bacillus alkalophilus (ID ELYA_BACAO) mit 98% Identität, (2.) die Alkalische Elastase aus Bacillus Ya-B (ID ELYA_BACSP) mit 80% Identität und (3.) das Subtilisin Sendai aus Bacillus Sendai (ID Q45522) mit 73% Identität.
Auf der Ebene der Aminosäuren für das mature Protein wurden als nächstähnliche identifiziert: (1.) Subtilisin 309 (Savinase®) aus Bacillus lentus (ID SUBS_BACLE) mit 99% Identität das heißt mit lediglich drei unterschiedlichen Aminosäuren innerhalb des maturen Proteins; gefolgt von Subtilisin P92 aus Bacillus alkalophilus (ID ELYA_BACAO) mit 98% Identität oder 5 unterschiedlichen Positionen und (3.) der B. lentus-Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (ID SUBB_BACLE) mit 97% Identität oder 8 unterschiedlichen Aminosäuren.
Weitere ähnliche Enzyme sind in Tabelle 2 in Beispiel 2 zusammengestellt und werden in dem Alignment der Fig. 1 hinsichtlich der Aminosäuresequenzen der maturen Proteine mit der erfindungsgemäßen Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) verglichen.
Aufgrund der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft zu den anderen angegebenen Subtilisinen ist diese Alkalische Protease als ein Subtilisin anzusehen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,5% identisch ist.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu jeweils 98,6%, 98,7%, 98,75%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und zu 100% identisch ist.
Denn es ist zu erwarten, daß deren Eigenschaften denen der Alkalischen Protease aus B. sp. (DSM 14390) zunehmend ähnlich sind.
Wie bereits erwähnt, sind aufgrund eines Vergleichs der N-terminalen Sequenzen vermutlich die Aminosäuren 1 bis 111 als Leaderpeptid anzusehen und erstreckt sich das mature Protein voraussichtlich von den Positionen 112 bis 380 gemäß der SEQ ID NO. 2. Die Position 381 wird demnach von einem Stop-Codon eingenommen, entspricht also eigentlich keiner Aminosäure. Da aber auch die Information über das Ende eines codierenden Bereichs als wichtiger Bestandteil einer Aminosäuresequenz angesehen werden kann, wird diese Position erfindungsgemäß in den Bereich einbezogen, der dem maturen Protein entspricht.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist somit jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 112 bis 381 mindestens zu 99,3% identisch ist.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche, deren Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 112 bis 381 mindestens zu jeweils 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und zu 100% identisch ist.
Sollte sich, beispielsweise durch eine N-terminale Sequenzierung des in vivo von Bacillus sp. (DSM 14390) freigesetzten proteolytischen Proteins herausstellen, daß die Spaltstelle nicht zwischen der 111. und der 112. Aminosäure gemäß SEQ ID NO. 2 sondern an einer anderen Stelle liegt, so beziehen sich diese Angaben auf das tatsächliche mature Protein.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, die sich von einer Nukleotidsequenz ableitet, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 92,5% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Positionen 112 bis 381 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche, die sich von einer Nukleotidsequenz ableiten, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu jeweils 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5% 97%, 97,5%, 98%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und zu 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Positionen 112 bis 381 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.
Denn es ist zu erwarten, daß diese Nukleinsäuren für Proteine codieren, deren Eigenschaften denen der Alkalischen Protease aus B. sp. (DSM 14390), insbesondere dem maturen Protein zunehmend ähnlich sind. Auch hier, wie für alle nachfolgenden Ausführungsformen gilt wiederum, daß sich diese Angaben auf das tatsächliche mature Protein beziehen, falls sich herausstellen sollte, daß die Spaltstelle des Proteins an einer anderen Stelle als oben angegeben liegt.
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist jede Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, deren Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz insgesamt, vorzugsweise in den Positionen 112 bis 381 identisch ist und/oder deren Aminosäuresequenz mit einer von der in SEQ ID NO. 1 angebenen Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz insgesamt, vorzugsweise in den Positionen 112 bis 381 gemäß SEQ ID NO. 2 identisch ist.
Denn um eine solche handelt es sich bei der neu gefundenen und mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390).
Diese ist eine im Stand der Technik noch nicht bekannte Protease. Sie ist, wie in den Beispielen angegeben isolierbar, herstellbar und einsetzbar. Sie zeichnet sich, wie ebenfalls in den Beispielen dokumentiert, zusätzlich dadurch aus, daß sie bei Verwendung in einem entsprechenden Mittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen in der Leistung nahekommt, beziehungsweise sie teilweise sogar übertrifft.
Für die Entwicklung von technischen, insbesondere in Waschmitteln einsetzbaren Proteasen kann sie als ein natürlicherweise, mikrobiell gebildetes Enzym als Ausgangspunkt dienen, um über an sich bekannte Mutagenese-Verfahren, beispielsweise Punktmutagenese, Fragmentierung, Deletion, Insertion oder Fusion mit anderen Proteinen oder Proteinteilen oder über sonstige Modifikationen für den gewünschten Einsatz optimiert zu werden. Derartige Optimierungen können beispielsweise Anpassungen an Temperatur-Einflüsse, pH- Wert-Schwankungen, Redox-Verhältnissen und/oder sonstigen Einflüsse, sein, die für die technischen Einsatzgebiete relevant sind. Gewünscht sind beispielsweise eine Verbesserung der Oxidationsbeständigkeit, der Stabilität gegenüber denaturierenden Agentien oder proteolytischem Abbau, gegenüber hohen Temperaturen, sauren oder stark alkalischen Bedingungen, eine Veränderung der Sensitivität gegenüber Calciumionen oder anderen Cofaktoren, eine Senkung der Immunogenität oder der allergenen Wirkung.
Hierfür können beispielsweise in Anwendung der Lehre von WO 00/36069 durch gezielte Punktmutationen die Oberflächenladungen oder die an der Katalyse oder Substratbindungen beteiligten Loops geändert werden. Letzteres ist beispielsweise in WO 95/30011, WO 99/27082, WO 00/37599, WO 00/37621 bis WO 00/37627 und WO 00/71683 bis WO 00/71691 offenbart. Weitere, insbesondere über gentechnische Methoden einzuführende Modifikationen sind beispielsweise in Anwendung der Lehren aus den Anmeldungen WO 92/21760 und WO 95/23221 durchführbar. Ein Ausgangspunkt hierfür ist das in Fig. 1 der vorliegenden Anmeldung dargestellte Alignment. Dieses ermöglicht, aus den bekannten Enzymen interessante, in den genannten Anmeldungen beschriebene Positionen für die Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) abzuleiten und nach an sich bekannten Methoden entsprechend zu variieren.
Die Mutagenese-Verfahren beruhen auf der zugehörigen Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO. 1 angegeben ist, beziehungsweise den hierzu hinreichend ähnlichen Nukleotidsequenzen, die weiter unten als eigener Erfindungsgegenstand darstellt werden. Entsprechende molekularbiologische Methoden sind im Stand der Technik beschrieben, so beispielsweise in Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen führen Punktmutationen zu Verbesserungen der Leistung entsprechender Proteasen, insbesondere zur Verbesserung ihres Beitrags zur Wasch- oder Reinigungsleistung entsprechender Mittel. In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung ist gezeigt, daß das erfindungsgemäße Protein aus B. sp. (DSM 14390) teilweise bessere Leistungen als die sehr ähnlichen Enzyme Savinase® und die B. lentus-Alkalischen Protease aufweist. Wie aus dem Alignment der Fig. 1 abgelesen werden kann, unterscheidet sich die Protease aus B. sp. (DSM 14390) von der Savinase® in drei Positionen: in Position 224 (gemäß der Aminosäure-Zählung der erfindungsgemäßen Protease, wie in SEQ ID NO. 1) besitzt es ein V anstelle eines A; in Position 250 ein G anstelle eines S; und in Position 253 ein N anstelle eines S. Die gleichen Unterschiede bestehen gegenüber der Alkalischen Protease aus B. lentus (DSM 5483). Zusätzlich weist es gegenüber diesem Enzym die Unterschiede S anstelle von D in Position 97 (gemäß der Aminosäure-Zählung der erfindungsgemäßen Protease, wie in SEQ ID NO. 1), S anstelle von R in Position 99, S anstelle von A in Position 101, Vanstelle von I in Position 102 und G anstelle von S in Position 157 auf. Besonders bevorzugt sind somit innerhalb des oben angegebenen Schutzbereichs liegende Proteasen, die eine oder mehrere dieser der Protease aus B. sp. (DSM 14390) entsprechenden Aminosäurepositionen aufweisen. Ganz besonders bevorzugt sind darunter solche mit einer mehreren der drei Aminosäuren V, G und/oder N in den Positionen 224, 250, beziehungsweise 253.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind alle von einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleiteten Proteine oder Fragmente mit zunehmend bevorzugt mindestens 225, 230, 235, 240, 245, 250, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 343, 350 und 360 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden, am Anfang, intern oder am Ende der Ausgangsaminosäuresequenz gelegenen Aminosäuren oder solchen mit zunehmend bevorzugt 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 343 und 360 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden Aminosäuren, die die Position 224 gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1 umfassen.
Aus dem Alignment der Fig. 1 geht hervor, daß die Aminosäuresequenz der maturen Protease aus B. sp. (DSM 14390) bis zur Position 224 gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1, beziehungsweise der Position 230 nach der Zählung des Alignments mit der der Protease aus B. lentus (SUBS BACLE, Savinase®) identisch ist. Erfindungsgemäße durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitete Proteine oder Fragmente besitzen folglich größere, nicht mit bekannten Proteasen identische Bereiche oder solche, die diese zur Unterscheidung geeignete Position aufweisen. Hierfür müssen letztere, wie aus dem Vergleich mit der Alkalischen Elastase aus Bacillus Ya-B hervorgeht, mindestens 40 Aminosäuren lang sein. Denn diese nächstähnliche Protease, die an der Stelle 230 in der Zählung des Alignments ebenfalls ein V aufweist, ist in diesem Bereich über insgesamt 39 Positionen mit der Protease aus B. sp. (DSM 14390) identisch.
Bei den genannten Fragmenten und/oder Deletionsvarianten handelt es bevorzugt um solche, die dem Bereich der Aminosäuren 112 bis 381 gemäß SEQ ID NO. 2, das heißt dem maturen Protein entsprechen.
Dabei handelt es zunehmend bevorzugt um jeweils solche durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitete Proteine oder Fragmente, die zu den in SEQ ID NO. 2 angegebenen, homologen Sequenzen mindestens zu jeweils 99,3%, 99,5%, 99,75% und zu 100% identisch sind.
Unter erfindungsgemäßen Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als jene homologen Proteine, die denen von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 entsprechen, mit ihnen aber in den entsprechenden Teilsequenzen übereinstimmen. Bei diesen Fragmenten kann es sich beispielsweise um einzelne Domänen handeln oder um Bruchstücke, die nicht mit den Domänen übereinstimmen. Solche Fragmente können kostengünstiger herzustellen sein, bestimmte eventuell nachteilige Charakteristika des Ausgangsmoleküls nicht mehr besitzen, wie möglicherweise einen aktivitätssenkenden Regulationsmechanismus, oder ein günstigeres Aktivitätsprofil entfalten. Derartige Proteinfragmente können auch nicht-biosynthetisch, sondern beispielsweise chemisch hergestellt werden. Die chemische Synthese ist beispielsweise dann vorteilhaft, wenn im Anschluß an die Synthese chemische Modifikationen vorgenommen werden sollen.
Den Fragmenten sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen auch durch Deletionsmutation erhältliche Proteine zuzuordnen. Die Deletionsmutagenese ist zur Entfernung inhibierender Bereiche besonders sinnvoll. Im Ergebnis können mit den Deletionen sowohl eine Spezialisierung als auch eine Erweiterung des Anwendungsbereichs des Proteins einhergehen.
Als natürlicherweise gebildete Fragmente, beziehungsweise deletionsmutierte Proteine kann man auch die von Präproteinen durch Abspaltung der N-terminalen Aminosäuren erhältlichen Proteine und Signalpeptide ansehen. Solch ein Spaltungsmechanismus kann beispielsweise dazu verwendet werden, um mithilfe bestimmter Sequenzbereiche, die von Signalpeptidasen erkannt werden, in rekombinanten Proteinen spezifische Spaltstellen vorzugeben. Somit können in vitro Aktivierung und/oder Deaktivierung erfindungsgemäßer Proteine vorgenommen werden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind alle von einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ oder einem entsprechenden Fragment durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein oder Proteinfragment abgeleiteten Proteine.
Erfindungsgemäße chimäre Proteine weisen im weitesten Sinne eine proteolytische Aktivität auf. Diese kann von einem Molekülteil ausgeübt oder modifiziert werden, das sich von einem erfindungsgemäßen Protein herleitet. Die chimären Proteine können über ihre Gesamtlänge hinweg somit auch außerhalb des oben beanspruchten Bereichs liegen. Der Sinn einer solchen Fusion besteht beispielsweise darin, mithilfe des heranfusionierten erfindungsgemäßen Proteinteils eine bestimmte Funktion oder Teilfunktion einzuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht. Zur Realisierung der letztgenannten Alternative ist es beispielsweise möglich, posttranslational oder erst nach einem Aufreinigungsschritt durch eine gezielte proteolytische Spaltung eine einzelne chimäre Polypeptidkette in mehrere zu zerlegen.
So ist es beispielsweise in Anlehnung an WO 99/57254 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Solch eine Bindungsdomäne könnte auch aus einer Protease stammen, etwa um die Bindung des erfindungsgemäßen Proteins an ein Protease-Substrat zu verstärken. Dies erhöht die lokale Protease-Konzentration, was in einzelnen Anwendungen, beispielsweise in der Behandlung von Rohstoffen vorteilhaft sein kann. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
Die durch Insertionsmutation erhältlichen erfindungsgemäßen Proteine sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den erfindungsgemäßen chimären Proteinen zuzuordnen. Hierher gehören auch Substitutionsvarianten, also solche, bei denen einzelne Bereiche des Moleküls gegen Elemente aus anderen Proteinen ersetzt worden sind.
Der Sinn von Insertions- und Substitutionsmutagenese besteht wie bei der Hybridbildung darin, einzelne Eigenschaften, Funktionen oder Teilfunktionen erfindungsgemäßer Proteine mit denen anderer Proteine zu kombinieren. Hierzu gehört beispielsweise auch über ein Shuffling oder Neukombination von Teilsequenzen aus verschiedenen Proteasen zu erhaltende Varianten. Dadurch können Proteine erhalten werden, die zuvor noch nicht beschrieben worden sind. Solche Techniken erlauben drastische Effekte bis hin zu sehr subtilen Aktivitätsmodulationen.
Vorzugsweise werden solche Mutationen nach einem statistischen, dem Bereich Directed Evolution zuzuordnenden Verfahren, wie beispielsweise nach der StEP-Methode (Zhao et al. (1998), Nat. Biotechnol., Band 16, S. 258-261), der Random priming recombination (Shao et al., (1998), Nucleic Acids Res., Band 26, S. 681-683), dem DNA-Shuffling (Stemmer, W. P. C. (1994), Nature, Band 370, S. 389-391) oder Recursive sequence recombination (RSR; WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625) oder der Methode RACHITT (Coco, W. M. et al. (2001), Nat. Biotechnol., Band 19, S. 354-359) durchgeführt. Zweckmäßigerweise sind derartige Verfahren mit einem auf die Mutagenese und Expression folgenden Selektions- oder Screening-Verfahren gekoppelt, um Varianten mit den gewünschten Eigenschaften zu erkennen. Da diese Techniken auf der DNA-Ebene ansetzen, steht mit den jeweils zugehörigen neu erzeugten Genen der Ausgangspunkt für die biotechnologische Produktion zur Verfügung.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Solche Varianten können ebenfalls zielgerichtet oder zufallsgemäß erzeugt werden.
Bevorzugt sind all solche bislang ausgeführten Proteine, Proteinfragmente oder Fusionsproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie an sich Protein zu hydrolysieren vermögen.
Solche werden nach der offiziellen Enzyme Nomenclature 1992 der IUBMB unter 3.4 (Peptidasen) zusammengefaßt. Hierunter sind Endopeptidasen, besonders der Gruppen 3.4.21 Serin-Proteinasen, 3.4.22 Cystein-Proteinasen, 3.4.23 Aspartat-Proteinasen und 3.4.24 Metallo-Proteinasen bevorzugt. Unter diesen sind Serin-Proteinasen (3.4.21) besonders bevorzugt, hierunter Subtilasen und hierunter ganz besonders Subtilisine (vergleiche "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in "Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996). Hierunter sind wiederum die Subtilisine der Gruppe IS-2, der hochalkalischen Subtilisine, bevorzugt.
Hierbei sind aktive Moleküle inaktiven gegenüber bevorzugt, da beispielsweise in den unten ausgeführten Einsatzgebieten insbesondere die ausgeübte Proteolyse von Bedeutung ist.
Auch die oben ausgeführten Fragmente besitzen im weitesten Sinne eine proteolytische Aktivität, etwa zur Komplexierung eines Substrats oder zur Ausbildung eines für die Hydrolyse erforderlichen Strukturelements. Bevorzugt sind sie, wenn sie für sich betrachtet bereits zur Hydrolyse eines anderen Proteins eingesetzt werden können, ohne daß wietere Protease-Komponenten anwesend sein müssen. Dies betrifft die Aktivität, die von einer Protease an sich ausgeübt werden kann; die möglicherweise gleichzeitig notwendige Anwesenheit von Puffersubstanzen, Cofaktoren etc. bleibt hiervon unberührt.
Ein Zusammenspiel unterschiedlicher Molekülteile zur Hydrolyse von Proteinen besteht in Deletionsmutanten naturgemäß eher als in Fragmenten und ergibt sich insbesondere in Fusionsproteinen, ganz besonders solchen, die aus einem Shuffling verwandter Proteine hervorgegangen sind. Sofern dadurch eine im weitesten Sinne proteolytische Funktion aufrechterhalten, modifiziert, spezifiziert oder auch erst erreicht wird, handelt es sich bei den Deletionsvarianten wie bei den Fusionsproteinen um erfindungsgemäße Proteine. Bevorzugte Vertreter dieses Erfindungsgegenstands sind darunter die, die an sich dazu in der Lage sind, ein Protein-Substrat zu hydrolysieren, ohne daß weitere Protease-Komponenten anwesend sein müssen.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten Proteine, Proteinfragmente oder Fusionsproteine dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zusätzlich derivatisiert sind.
Unter Derivaten werden solche Proteine verstanden, die sich über eine zusätzliche Modifikation von den ausgeführten Proteinen ableiten. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.
Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den produzierenden Wirtsorganismus. Hier sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.
Derivatisierungen können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen, beispielsweise makromolekularen Verbindung an das Protein. Eine chemische Modifikation wird beispielsweise in der Anmeldung DE 40 13 142 beschrieben. Beispielsweise die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts geht aus WO 95/26398 hervor. Es können beispielsweise Makromoleküle wie Proteine, etwa über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. So ist es beispielsweise in Anwendung der Lehre von WO 99/57154 bis WO 99/57159, WO 00/18865 und WO 00/57155 möglich, ein erfindungsgemäßes Protein über einen Linker mit einer spezifischen Bindungsdomäne zu versehen. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Analog WO 00/01831 können auch Protease-Inhibitoren über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker an die erfindungsgemäßen Proteine gebunden werden. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol verbessern das Molekül hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit. Solch eine Modifikation wird beispielsweise in dem Patent US 5230891 für Proteasen für den Einsatz in Kosmetika beschrieben.
Unter Derivaten erfindungsgemäßer Proteine können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Enzyme verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist aus dem Stand der Technik bekannt (WO 00/01826).
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten Proteine, Proteinfragmente oder Fusionsproteine dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie zusätzlich stabilisiert sind.
Dadurch wird ihre Stabilität bei der Lagerung und/oder während ihres Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozeß erhöht, so daß ihre Aktivität länger anhält und damit verstärkt wird. Die Stabilität erfindungsgemäßer Proteasen kann beispielsweise durch Kopplung an Polymere erhöht werden. Solch eine Methode wird beispielsweise in US 5230891 beschrieben. Sie erfordert, daß die Proteine vor ihrem Einsatz in entsprechenden Mitteln über einen chemischen Kopplungsschritt mit derartigen Polymeren verbunden werden.
Bevorzugt sind Stabilisierungen, die über Punktmutagenese des Moleküls selbst möglich sind. Denn diese erfordern im Anschluß an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeigneten Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können gemäß US 6087315 und US 6110884 Proteasen dadurch stabilisiert werden, daß man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.
Andere Möglichkeiten sind beispielsweise:

- Der Austausch bestimmter Aminosäurereste gegen Prolin gemäß EP 583339;
- die Einführung polarerer oder geladener Gruppen auf der Oberfläche des Moleküls gemäß EP 995801;
- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise gemäß der Lehre der Anmeldungen WO 88/08028 und WO 88/08033.

Gemäß der ersten dieser Schriften müßten eine oder mehrere der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure-Reste gegen negativ geladene Aminosäuren ausgetauscht werden; gemäß der Lehre der Anmeldung WO 88/08033 müßten zur Stabilisierung über die Calcium-Bindung gleichzeitig in mindestens einer der Folgen der beiden Reste Arginin/Glycin Punktmutationen eingeführt werden;

- Gemäß des Patents US 5453372 können Proteine durch bestimmte Mutationen auf der Oberfläche gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden geschützt werden.

Weitere vergleichbare Möglichkeiten werden in den Patenten US 5340735, US 5500364, US 5985639 und US 6136553 angegeben.
Eine andere Möglichkeit zur Stabilisierung gegenüber erhöhter Temperatur und dem Einwirken von Tensiden wäre in Anwendung der Lehre aus WO 92/21760 und den bislang noch nicht veröffentlichten Anmeldungen DE 101 21 463 und DE 101 53 792 die Stabilisierung über den Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Molekül auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn beispielsweise nach WO 89/09819 kann davon ausgegangen werden, daß mehrere stabilisierende Mutationen additiv wirken.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen alle Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wenigstens eine antigene Determinante mit einem der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate gemeinsam haben.
Denn entscheidend für die enzymatischen Aktivitäten sind die Sekundärstrukturelemente eines Proteins und dessen dreidimensionale Faltung. So können in ihrer Primärstruktur deutlich voneinander abweichende Domänen räumlich weitgehend übereinstimmende Strukturen ausbilden und somit gleiches enzymatisches Verhalten ermöglichen. Solche Gemeinsamkeiten in der Sekundärstruktur werden üblicherweise als übereinstimmende antigene Determinanten von Antiseren oder reinen oder monoklonalen Antikörpern erkannt. Über immunchemische Kreuzreaktionen können somit einander ähnliche Proteine oder Derivate detektiert und zugeordnet werden. Deshalb werden in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gerade auch solche Proteine einbezogen, die möglicherweise nicht über ihre Homologiewerte in der Primärstruktur, wohl aber über ihre immunchemische Verwandtschaft den oben definierten erfindungsgemäßen Proteinen, Proteinfragmenten, Fusionsproteinen oder Derivaten zugeordnet werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen all solche bislang ausgeführten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich sind.
Dies können beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien sein. Denn sie lassen sich zumeist einfacher gewinnen und handhaben als vielzellige Organismen oder die von Vielzellern abgeleiteten Zellkulturen; obgleich diese für spezielle Ausführungsformen sinnvolle Optionen darstellen können und somit nicht grundsätzlich vom Erfindungsgegenstand ausgeschlossen sind.
Es ist möglich, daß natürlich vorkommende Produzenten zwar ein erfindungsgemäßes Enzym herstellen können, dieses aber unter den zunächst ermittelten Bedingungen nur in geringem Maße exprimieren und/oder in das umgebende Medium abgeben. Das schließt aber nicht aus, daß geeignete Umweltbedingungen oder sonstige Faktoren experimentell ermittelt werden können, unter deren Einwirken sie zu einer wirtschaftlich sinnvollen Produktion des erfindungsgemäßen Proteins angeregt werden können. Solch ein Regulationsmechanismus kann für die biotechnologische Produktion gezielt eingesetzt werden. Sollte auch dies nicht möglich sein, können sie immer noch der Isolierung des zugehörigen Gens dienen.
Besonders bevorzugt sind hierunter solche aus gram-positiven Bakterien.
Denn diese besitzen keine äußere Membran und geben sekretierte Proteine somit unmittelbar ins umgebende Medium ab.
Ganz besonders bevorzugt sind solche aus gram-positiven Bakterien der Gattung Bacillus.
Bacillus-Proteasen weisen von vornherein günstige Eigenschaften für diverse technische Einsatzmöglichkeiten auf. Dazu gehören eine gewisse Stabilität gegenüber erhöhter Temperatur, oxidierenden oder denaturierenden Agentien. Zudem hat man mit mikrobiellen Proteasen die größten Erfahrungen hinsichtlich ihrer biotechnologischen Produktion, was beispielsweise die Konstruktion günstiger Klonierungsvektoren, die Auswahl von Wirtszellen und Wachstumsbedingungen oder die Abschätzung von Risiken, wie beispielsweise die Allergenizität, angeht. Bacilli sind zudem als Produktionsorganismen mit einer besonders hohen Produktionsleistung in technischen Prozessen etabliert. Der Erfahrungsschatz, den man für die Herstellung und den Einsatz dieser Proteasen erworben hat, kommt zudem erfindungsgemäßen Weiterentwicklungen dieser Enzyme zugute. Dies betrifft beispielsweise ihre Kompatibilität mit anderen chemischen Verbindungen, wie beispielsweise die Inhaltsstoffe von Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Unter denen aus den Bacillus-Species, wiederum, sind solche aus der Spezies Bacillus sp., insbesondere aus dem Stamm Bacillus sp. (DSM 14390) bevorzugt.
Denn aus diesem wurde die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Enzyms ursprünglich erhalten. Seine zugehörigen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll angegeben und seine enzymatischen Charakteristika sind in den Beispielen beschrieben. Von diesem oder von verwandten Stämmen können die oben beschriebenen Varianten insbesondere unter Anwendung molekularbiologischer Standardmethoden, wie beispielsweise der PCR und/oder an sich bekannten Punktmutagenese-Verfahren hergestellt werden.
Eine weitere Lösung der Aufgabe und somit einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Nukleinsäuren dar, die der Verwirklichung der Erfindung dienen.
Denn Nukleinsäuren bilden den Ausgangspunkt nahezu aller molekularbiologischen Untersuchungen und Weiterentwicklungen sowie der Produktion von Proteinen. Dazu gehören insbesondere die Sequenzierung der Gene und die Ableitung der zugehörigen Aminosäure-Sequenz, jede Art von Mutagenese (siehe oben) und die Expression der Proteine.
Mutagenese zur Entwicklung von Proteinen mit bestimmten Eigenschaften wird auch als "Protein Engineering" bezeichnet. Eigenschaften, auf die optimiert wird, sind weiter oben bereits beispielhaft ausgeführt worden. Solch eine Mutagenese kann zielgerichtet oder über zufallsgemäße Methoden, beispielsweise mit einem anschließenden auf die Aktivität gerichteten Erkennungs- und/oder Auswahlverfahren (Screening und Selektion) an den klonierten Genen, etwa über Hybridisierung mit Nukleinsäure-Sonden, oder an den Genprodukten, den Proteinen, etwa über ihre Aktivität durchgeführt werden. Die Weiterentwicklung der erfindungsgemäßen Proteasen kann insbesondere auch an den in der Publikation "Protein engineering" von P. N. Bryan (2000) in Biochim. Biophys. Acta, Band 1543, S. 203-222, vorgestellten Überlegungen ausgerichtet werden.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit jede für eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 92,5% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich der Positionen 334 bis 1143.
Zunehmend bevorzugt sind darunter solche, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu jeweils 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5% 97%, 97,5%, 98%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% und zu 100% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich der Positionen 334 bis 1143. Für die Positionen des maturen Proteins und das Stop-Codon gilt das oben gesagte entsprechend.
Denn es ist zu erwarten, daß diese Nukleinsäuren für Proteine codieren, deren Eigenschaften denen der Alkalischen Protease aus B. sp. (DSM 14390) zunehmend ähnlich sind.
Weitere Vertreter dieses Erfindungsgegenstands sind alle Nukleinsäuren, die für eines der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codieren.
Die Nukleinsäuren, die für die oben ausgeführten, bevorzugten Formen codieren, sind entsprechend bevorzugt, insbesondere auch die durch Mutagenese erhaltenen Nukleinsäuren.
Insbesondere die Nukleinsäuren, die für Proteinfragmente codieren, werden ausdrücklich in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung einbezogen. Bei solchen Oligonukleotiden sind alle drei Leseraster sowohl in sense- als auch in antisense-Orientierung zu berücksichtigen. Denn sie können, insbesondere über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Ausgangspunkte zur Synthese verwandter Nukleinsäuren verwendet werden, beispielsweise zur Amplifikation verwandter Gene aus natürlichen Organismen. Sie können auch zur Erzeugung von Chimären über ein PCR-basiertes Shuffling-Verfahren dienen. Auch andere Shuffling-Verfahren, wie etwa die Recombining Ligation Reaction (RLR) gemäß der Anmeldung WO 00/09679 beruhen auf Oligonukleotiden, die zufallsgemäß oder zielgerichtet ausgewählten Proteinfragmenten entsprechen. Antisense-Oligonukleotide können beispielsweise auch zur Expressions-Regulation eingesetzt werden.
Entsprechend den oben gemachten Angaben sind unter den oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren folgende zunehmend bevorzugt:

- Solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich sind;
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt;
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt; und
- hierunter solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus sp., insbesondere um Bacillus sp. (DSM 14390) handelt.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Vektoren, die einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten, insbesondere einen, der für eines der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codiert.
Denn um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere die Produktion erfindungsgemäßer Proteine vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren sowie die zugehörigen Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren sind in großer Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Bacteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren. Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich zu etablieren vermögen, beispielsweise nach Vektoren für gram-negative, für gram-positive Bakterien, für Hefen oder für höhere Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.
Denn Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie transportierbare und lagerfähige Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die PCR oder In-vitro- Mutagenese-Verfahren.
Vorzugsweise handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.
Denn derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine zu produzieren. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ können einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale Kopienzahl, auf das gewählte Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.
Vorteilhaft für eine hohe Expressionsrate ist es weiterhin, wenn der Expressionsvektor möglichst nur das betreffende Gen als Insert enthält und keine größeren 5'- oder 3'-nichtcodierenden Bereiche. Solche Inserts werden beispielsweise erhalten, wenn das nach statistischer Behandlung der chromosomalen DNA des Ausgangsstamms mit einem Restriktionsenzym erhaltene Fragment nach der Sequenzierung vor der Integration in den Expressionsvektor noch einmal gezielt geschnitten worden ist.
Ein Beispiel für einen Expressionsvektor ist der in Fig. 2 der vorliegenden Anmeldung abgebildete und gemäß Beispiel 2 einsetzbare pAWA22. Weitere Vektoren stehen dem Fachmann aus dem Stand der Technik zur Verfügung und werden in großer Zahl kommerziell angeboten.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die einen der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche enthalten, insbesondere einen, der für eines der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codiert, vorzugsweise auf einem der oben bezeichneten, erfindungsgemäßen Vektoren.
Denn diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins. Sie ermöglichen beispielsweise die Amplifikation der entsprechenden Gene, aber auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes genetisches Element, das heißt bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese oder Selektion ab. So sind im Stand der Technik beispielsweise auf Bakteriophagen - und deren spezifischen Wirtszellen - beruhende Mutagenese- und Selektionsverfahren zur Entwicklung von Waschmittelenzymen beschrieben (WO 97/09446).
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Wirtszellen, die eines der zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate exprimieren oder zu dessen Expression angeregt werden können, insbesondere unter Einsatz eines der zuvor bezeichneten, erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche, ganz besonders unter Einsatz eines zuvor bezeichneten Expressionsvektors.
Denn die die Proteine bildenden Wirtszellen ermöglichen deren biotechnologische Produktion. Sie müssen dafür das betreffende Gen, geeigneterweise mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten haben und zu dessen Transkription, zur Translation und vorzugsweise den eventuell zusätzlichen Modifikationsschritten befähigt sein.
Als Wirtszellen zur Proteinexpression eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor, dessen stabile Etablierung und die Regulation der Expression angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Vorzugsweise werden Laborstämme gewählt, die auf die Expression ausgerichtet sind. Solche sind kommerziell oder über allgemein zugängliche Stammsammlungen erhältlich. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise theoretisch aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden. Aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme müssen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden.
Besonders vorteilhaft sind Wirtszellen, die selbst Protease-negativ sind und somit gebildete Proteine nicht abbauen. Um solch einen handelt es sich bei dem in Beispiel 2 verwendeten Stamm Bacillus subtilis DB 104.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund entsprechender genetischer Elemente in ihrer Aktivität regulierbar sind, beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder in Abhängigkeit von der jeweiligen Zelldichte. Diese kontrollierbare Expression ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine. Geeigneterweise sind Gen, Expressionsvektor und Wirtszelle aufeinander abgestimmt, was beispielsweise die zur Expression notwendigen genetischen Elemente (Ribosomen- Bindungsstelle, Promotoren, Terminatoren) oder die Codon-Usage betrifft. Letztere kann beispielsweise dadurch optimiert werden, daß in dem Gen jene Codons, die von dem betreffenden Wirt nur schlecht translatiert werden, bei jeweils gleicher Bedeutung durch die für den jeweiligen Wirt gebräuchlicheren ersetzt werden.
Bevorzugt sind darunter Wirtszellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Bakterien sind, insbesondere solche, die das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretieren.
Denn Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren etabliert werden. Zudem verfügt man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf etc. gram-negative oder gram-positive Bakterien geeignet sein.
Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli, geben demgegenüber sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium ab, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.
In der Anmeldung WO 01/81597 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gram-negative Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Solch ein System ist auch für die Herstellung erfindungsgemäßer Proteine geeignet. Als Wirtszellen sind demnach solche der Spezies Escherichia coli oder Klebsiella bevorzugt, besonders solche der Stämme E. coli JM 109, E. coli DH 100B, E. coli DH 12S oder Klebsiella planticola (Rf). Sie erfordern entsprechende mikrobiologische Modifikationen und/oder geeignete, in dieser Anmeldung beschriebene Vektoren, um die Freisetzung der produzierten Proteine zu ermöglichen.
Als Wirtszellen bevorzugte Bakterien sind solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie gram-positive Bakterien sind, insbesondere daß sie der Gattung Bacillus angehören, ganz besonders der Species Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt B. sp., insbesondere B. sp. (DSM 14390) selbst, um erfindungsgemäße Proteine (homolog) zu exprimieren. Demgegenüber ist jedoch die heterologe Expression bevorzugt. Hierfür werden Bakterien der Gattung Bacillus bevorzugt, weil sie unter den gram-positiven Bakterien produktionsstechnisch am besten charakterisiert sind. Hierzu gehören insbesondere solche der Species B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis oder andere Species oder Stämme von B. alcalophilus. Denn mit diesen Spezies hat man, beispielsweise über die Lehre der Anmeldung WO 91/02792, einschlägige Erfahrungen, was die Protease-Herstellung angeht. In dieser Anmeldung sind auch zahlreiche mögliche Expressionsvektoren offenbart. Diese verwandten Species verfügen zudem über eine ähnliche Codon-Usage und bilden vergleichbare Subtilisine selbst, so daß ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß über dieses Verfahren eine Mischung erfindungsmäßer Proteine mit den endogen von den Wirtsstämmen gebildeten Subtilisinen erhalten werden kann. Solch eine Coexpression geht ebenfalls aus der Anmeldung WO 91/02792 hervor. Sollte sie nicht gewünscht sein, müßten die in der Wirtszelle natürlicherweise vorhandenen Proteasegene dauerhaft oder vorübergehend inaktiviert werden (siehe oben).
Weiter bevorzugt sind Wirtszellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eukaryontische Zellen sind, insbesondere solche, die das gebildete Protein posttranslational modifizieren.
Beispiele für geeignete Eukaryonten sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Thermophile pilzliche Expressionssysteme werden beispielsweise in WO 96/02653 vorgestellt. Solche eignen sich besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins dar.
Beansprucht wird somit jedes Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats unter Einsatz einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder unter Einsatz eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Vektors und/oder unter Einsatz einer der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Zellen.
Hierzu gehören beispielsweise chemische Syntheseverfahren, die insbesondere für kürzere Fragmente wirtschaftlich sinnvoll sind.
Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren. Demnach können beispielsweise anhand der oben bezeichneten DNA- und Aminosäuresequenzen, wie sie beispielsweise auch aus dem Sequenzprotokoll abgeleitet werden können, vorzugsweise anhand derer aus SEQ ID NO. 1 und 2 selbst, entsprechende Oligonukleotide und Oligopeptide bis hin zu den vollständigen Genen und Proteinen nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden synthetisiert werden.
Ausgehend von den bekannten Subtilisin-produzierenden Mikroorganismen können, beispielsweise in Anlehnung an die Beispiel in der vorliegenden Anmeldung, auch weitere natürliche Produzenten von Subtilisinen identifiziert und isoliert werden, deren Subtilisin- Gen- und/oder Aminosäuresequenzen ermittelt und entsprechend der hier gemachten Vorgaben weiterentwickelt werden. Solche Bakterienspezies können auch für entsprechende Herstellungsverfahren kultiviert und eingesetzt werden. Analog können nach dem Vorbild der beispielsweise in der Anmeldung WO 91/02792 offenbarten Vektoren neue Expressionsvektoren entwickelt werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat enthalten.
Alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, werden hiermit in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch "Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.
Diesem Erfindungsgegenstand werden als bevorzugte Ausführungsform Wasch- oder Reinigungsmittel zugerechnet, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eines der zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate enthalten.
Denn wie in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt ist, konnte überraschenderweise festgestellt werden, daß sich die besonders bevorzugte Alkalische Protease aus B. sp. (DSM 14390), das heißt bereits das Wildtyp-Enzym dadurch auszeichnet, daß es bei Verwendung in einem entprechenden Wasch- oder Reinigungsmittel den für diesen Zweck etablierten Enzymen in ihren Beiträgen zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung mindestens nahekommt oder sie teilweise sogar übertrifft.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet. Jegliche Wasch- oder Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um ein erfindungsgemäßes Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat bereichert ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel die oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate in einer Menge von 2 µg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 µg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 µg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 µg bis 10 mg pro Gramm des Mittels.
Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird dementsprechend in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
Neben einem erfindungsgemäßen Protein, Fragment, Fusionsprotein oder Derivat enthält ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe wie Enzymstabilisatoren, Tenside, z. B. nichtionische, anionische und/oder amphotere Tenside, und/oder Bleichmittel, und/oder Builder, sowie gegebenenfalls weitere übliche Inhaltsstoffe, die im folgenden ausgeführt werden.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C_12-14- Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C_9-11-Alkohol mit 7 EO, C_13-15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C_12-8-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C_12-14-Alkohol mit 3 EO und C_12-18-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden kann, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)_z, in der R einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2- Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II),

in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R¹ für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III),

in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R¹ für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R² für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C_1-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C_9-13 -Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, das heißt Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C_12-18-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende Alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus C_12-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren geeignet.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierprodukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der C₁₂-C₁₈-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C₁₀-C₂₀-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C₁₂-C₁₆-Alkylsulfate und C₁₂-C₁₅-Alkylsulfate sowie C₁₄-C₁₅-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C_7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C_9-11-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C_12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C_8-18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe oben). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H₂O₂ liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H₂O₂ liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel H₂N-CO-NH₂.H₂O₂ beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α- Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12-Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.
Der Gehalt der Wasch- oder Reinigungsmittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird.
Um beim Waschen bei Temperaturen von 60°C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C- Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N- Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte Lactame, beispielsweise N- Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 44 43 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammoniumacetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n- Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyloxybenzolsulfonat (UDOBS), Natriumdodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyloxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru- oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Amminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 197 09 284 A1 beschrieben sind.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und - wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen - auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe.
Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilicate der allgemeinen Formel NaMSi_xO_2x+1.yH₂O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1,6 bis 4, vorzugsweise 1,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für × 2, 3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 164514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilicate Na₂Si₂O₅.yH₂O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS® (Firma Clariant). So handelt es sich bei SKS-6® vorwiegend um ein δ- Natriumdisilicat mit der Formel Na₂Si₂O₅.yH₂O, bei SKS-7® vorwiegend um das β-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (zum Beispiel Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit NaHSi₂O₅.yH₂O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9® beziehungsweise SKS-10® (Firma Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ-Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel x Na₂O.y SiO₂.z P₂O₅, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 196 01 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, zum Beispiel Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, zum Beispiel Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen.
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na₂O : SiO₂ von 1 : 2 bis 1 : 3, 3, vorzugsweise von 1 : 2 bis 1 : 2,8 und insbesondere von 1 : 2 bis 1 : 2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharfen Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharfe Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.
Ein gegebenenfalls einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co- Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S. p. A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben wird und durch die Formel

nNa₂O.(1 - n)K₂O.Al₂O₃.(2 - 2,5)SiO₂.(3,5 - 5,5)H₂O

beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße von weniger als 10 µm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser.
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall-(insbesondere Natrium- und Kalium-)-Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO₃)_n und Orthophosphorsäure H₃PO₄ neben höhermolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH₂O₄, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gcm^-3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gcm^-3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 200°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na₂H₂P₂O₇), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na₃P₃O₉) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH₂PO₄ reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH₂PO₄, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gcm^-3 hat einen Schmelzpunkt von 253°C [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO₃)_x] und ist leicht löslich in Wasser.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na₂HPO₄, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 Klebsiella Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gcm^-3 Schmelzpunkt 48°C unter Verlust von 5 H₂O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gcm^-3 Schmelzpunkt 35°C unter Verlust von 5 H₂O), wird bei 100°C wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na₄P₂O₇ über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K₂HPO₄, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.
Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na₃PO₄, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gcm^-3 und einen Schmelzpunkt von 73-76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19-20% P₂O₅) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39-40% P₂O₅) eine Dichte von 2,536 gcm^-3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter Alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K₃PO₄, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gcm^-3 hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit Alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na₄P₂O7, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gcm^-3, Schmelzpunkt 988°C, auch 880°C angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815-1,836 gcm^-3 Schmelzpunkt 94°C unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit Alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na₄P₂O₇ entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf > 200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K₄P₂O₇, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gcm^-3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25°C 10,4 beträgt.
Durch Kondensation des NaH₂PO₄ beziehungsweise des KH₂PO₄ entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium- beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.
Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat (Na₅P₃O₁₀; Natriumtripolyphosphat) ist ein wasserfrei oder mit 6 H₂O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na mit n = 3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60°C ca. 20 g, bei 100°C rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100°C entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K₅P₃O₁₀ (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P₂O₅, 25% K₂O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert:

(NaPO₃)₃ + 2 KOH → Na₃K₂P₃O₁₀ + H₂O
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system- und umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen M_w der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV- Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.
Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-)polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol- Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000g/mol.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472042, WO 97/25399, und EP 755944.
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolith-, carbonat- und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.
Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriaminpentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew.-% Alkalicarbonat und 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propylether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylenglykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.
Zur Einstellung der Viskosität können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein oder mehrere Verdicker, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicker stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.
Die Verdicker können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe, wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Silberkorrosionsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Farb- und/oder Duftstoffe, sowie mikrobielle Wirkstoffe, UV-Absorbenzien und/oder Enzymstabilisatoren enthalten.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'- disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino- Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2- sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2- sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(III)-chlorid oder CoSO₄. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosionsinhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO₄, V₂O₅, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiF₆, K₂ZrF₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃)₃, sowie deren Gemische.
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.
Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141, beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxid-terephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066 944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185 427 sind Methyl- oder Ethylgruppen-endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxid-terephthalat-Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release- Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1,2-Propylen-, 1,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1,2-propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit C₁- bis C₄-Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch C_1-4-Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274 907 beschreibt sulfoethyl-endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C_2-4-Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktionellen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/Baumwolle-Grenzfläche.
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylimidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinylpyrrolidon mit Vinylimidazol.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den betreffenden Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C₁₈- C₂₄-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.
Farb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8-18 C- Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, α-Isomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.
Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- oder Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5. Aufl. - Stuttgart; New York: Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetale sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyridinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4- dicyanobutan, Iodo-2-propyl-butyl-carbamat, Iod, Iodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.
Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholin-acetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1,10-decandiyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphenyl)-3,12- diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid, 1,6-Di- (N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-phenyl-N₁,N₁ -methyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido- N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,6-dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅ ')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-[N₁,N₁'-beta-(p-methoxyphenyl) diguanido-N₅,N₅']-hexane-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-alpha-methyl-.beta.-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-p-nitrophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-( N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N₁,N₁'- p-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁ '-2,4-dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁ '-p-methylphenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,4,5-trichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')- exan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-[N₁,N₁'-alpha-(p-chlorophenyl)ethyldiguanido-N₅,N₅'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N₁,N₁'-chlororophenyldiguanido-N₅,N₅')m-xyle- dihydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁'-p-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')dodecan-dihydrochlorid, 1,10-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-decan-tetrahydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁ '-phenyliguanido-N₅,N₅')dodecan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido- N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅ ')hexan-terahydrochlorid, Ethylen-bis-(1-tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis- (3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amyiphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylhenyliguanid), Ethylen-bis-(phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen- bis(2,5-diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o-dihenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis- (pheylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl bigunide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobroide, Citrate, Bisulfite, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophoshite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethyeniamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberlächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theohyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, Iodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R¹)(R²)(R³)(R⁴) N⁺ X^- auf, in der R¹ bis R⁴ gleiche oder verschiedene C₁-C₂₂-Alkylreste, C₇-C₂₈-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X^- Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere 12 bis 16, C-Atomen auf.
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzylammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12- alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis- (2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl-ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p-(1,1,3,3- tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121-54-0), Dialkyldimethylammonium-chloride wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyl-dimethylammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C₈-C₁₈-Alkylresten, insbesondere C₁₂-C₁₄ -Aklyl-benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können UV-Absorbenzien (UV- Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.
Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb® FD oder Tinosorb® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3-Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, zum Beispiel 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)- benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie zum Beispiel 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB); Propan-1,3-dione, wie zum Beispiel 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-(4'methoxyphenyl)propan-1,3- dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5- sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie zum Beispiel 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol-sulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.- Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan- 1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 197 12 033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, das heißt hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.
Zu den für Wasch- und Reinigungsmitteln üblichen Inhaltsstoffen werden im allgemeinen auch wasch-, beziehungsweise reinigungsaktive Enzyme gerechnet.
Somit stellen Wasch- oder Reinigungsmittel, die über ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat hinaus durch zusätzlich weitere Enzyme gekennzeichnet sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen wie beispielsweise β-Glucanasen, Oxidoreductasen wie beispielsweise Laccasen, Cutinasen und/oder Lipasen, aber auch Esterasen und alle anderen Enzyme, die aus dem Stand der Technik für dieses Einsatzgebiet beschrieben sind.
Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen oder Cellulasen werden seit Jahrzehnten als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet. Ihr jeweiliger Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des betreffenden Mittels ist im Fall von Protease die Fähigkeit zum Abbau proteinhaltiger Verunreinigungen, im Fall von Amylase der Abbau von stärkehaltigen Verunreinigungen und im Fall von Lipase die fettspaltende Aktivität. Cellulasen werden über ihre schmutzentfernende, das heißt primäre Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung hinaus, insbesondere wegen ihres Beitrags zur Sekundärwaschleistung eines Waschmittels und wegen ihrer Faserwirkung auf Textilien bevorzugt in Waschmitteln eingesetzt. Die jeweiligen Hydrolyseprodukte werden von den übrigen Wasch- oder Reinigungsmittel-Bestandteilen angegriffen, gelöst, emulgiert oder suspendiert oder aufgrund ihrer höheren Löslichkeit mit der Waschflotte ausgeschwemmt, so daß es günstigenfalls zu Synergieeffekten zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen kommt.
Einen dem Beitrag zur Sekundärwaschleistung eines Waschmittels durch Cellulase vergleichbaren Effekt können Proteasen auf natürliche Fasern, insbesondere auf Wolle oder Seide ausüben. Durch ihre Wirkung auf die Oberflächenstruktur solcher Gewebe können sie einen glättenden Einfluß auf das Material ausüben und damit dem Verfilzen entgegenwirken.
Weitere Enzyme erweitern die Reinigungsleistung entsprechender Mittel um ihre jeweils spezifische enzymatische Leistung. Dazu gehören beispielsweise Hemicellulasen wie beispielsweise β-Glucanasen (WO 99/06515 und WO 99/06516), Oxidoreduktasen wie zum Beispiel Laccasen (WO 00/39306) oder Pektin-lösende Enzyme (WO 00/42145), die insbesondere in Spezialwaschmitteln zum Einsatz kommen.
Zur Verwendung in erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln kommen in erster Linie aus Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, gewonnene Enzyme in Frage. Sie werden in bekannter Weise durch Fermentationsprozesse aus geeigneten Mikroorganismen gewonnen, die zum Beispiel in den deutschen Offenlegungsschriften DE 19 40 488, und DE 21 21 397, den US-amerikanischen Patentschriften US 3623957, US 4264738, der europäischen Patentanmeldung EP 006638 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 91/02792 beschrieben sind.
Ein erfindungsgemäßes Protein und/oder andere enthaltene Proteine können besonders während der Lagerung durch Stabilisatoren beispielsweise vor Denaturierung, Zerfall oder Inaktivierung, etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Dies gilt für alle erfindungsgemäßen Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren, die bei Verdünnung des Mittels in der Waschflotte abdissozieren. Benzamidin-Hydrochlorid und Leupeptin sind für diesen Zweck etabliert. Häufig werden Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester verwendet, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa gemäß WO 95/12655 ortho-substituierte, gemäß WO 92/19707 metasubstituierte und gemäß US 5972873 para-substituierte Phenylboronsäuren, beziehungsweise deren Salze oder Ester. In den Anmeldungen WO 98113460 und EP 583534 werden Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, und zwar solche aus 2-50 Monomeren, zur reversiblen Inhibierung von Wasch- und Reinigungsmittelproteasen offenbart. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehört u. a. Ovomucoid (WO 93/00418). Beispielsweise mit der Anmeldung WO 00/01826 werden spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin zur Verwendung in Protease-haltigen Mitteln offenbart, und mit WO 00/01831 entsprechende Fusionsproteine aus Protease und Inhibitor.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, wie beispielsweise aus den Anmeldungen EP 378261 und WO 97/05227 bekannt ist, wie Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Mit der Anmeldung DE 196 50 537 werden für diesen Zweck endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate offenbart. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.
Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Ebenso werden Calciumsalze verwendet, wie beispielsweise Calciumacetat oder das in der Patentschrift EP 028865 für diesen Zweck offenbarte Calcium-Formiat, und Magnesiumsalze, etwa gemäß der europäischen Anmeldung EP 378262.
Polyamid-Oligomere (WO 99/43780) oder polymere Verbindungen wie Lignin (WO 97/00932), wasserlösliche Vinyl-Copolymere (EP 828762) oder, wie in EP 702712 offenbart, Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym- Präparation u. a. gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere (EP 587550 und EP 581751) wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind die in WO 97/05227 neben anderen Bestandteilen offenbarten linearen C₈- C₁₈ Polyoxyalkylene. Alkylpolyglycoside könnten wie in den Anmeldungen WO 97/43377 und WO 98/45396 die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und sogar in ihrer Leistung steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen, wie in WO 98/17764 offenbart, erfüllen eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer wirkt in einer Mischung mit anderen Stabilisatoren gemäß der Anmeldung WO 97/32958 stabilisierend auf eine Cellulase, so daß sich solche oder ähnliche Bestandteile auch für das erfindungswesentliche Enzym eignen könnten.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen, wie u. a. in EP 780466 offenbart, die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall. Schwefelhaltige Reduktionsmittel sind beispielsweise aus den Patentschriften EP 080748 und EP 080223 bekannt. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfit (EP 533239) und reduzierende Zucker (EP 656058).
Vielfach werden auch Kombinatonen von Stabilisatoren verwendet, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax in der Anmeldung WO 96/31589, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren in der Anmeldung EP 126505 oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen, wie in der Anmeldung EP 080223 offenbart. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird gemäß WO 98/13462 durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und gemäß WO 98/13459 durch die zusätzliche Verwendung von Calcium-Ionen noch weiter verstärkt.
Mittel mit stabilisierten Enzymaktivitäten stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche mit Enzymen, die auf mehrere der dargestellten Weisen stabilisiert sind.
Da erfindungsgemäße Mittel in allen denkbaren Formen angeboten werden können, stellen erfindungsgemäße Enzyme, beziehungsweise Proteine in allen für die Zugabe zu den jeweiligen Mitteln zweckmäßigen Formulierungen jeweilige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Dazu gehören beispielsweise flüssige Formulierungen, feste Granulate oder Kapseln.
Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme oder andere Inhaltsstoffe vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 199 18 267 offenbart. Eine mögliche Verkapselungsmethode besteht darin, daß die Proteine, ausgehend von einer Mischung der Proteinlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in dieser Substanz verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der Anmeldung WO 01/38471 beschrieben.
Im Fall fester Mittel können die Proteine beispielsweise in getrockneter, granulierter und/oder verkapselter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 µm.
Flüssigen, gelförmigen oder pastösen erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme, und auch das erfindungsgemäße Protein ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, Suspension oder Emulsion zugesetzt werden, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.
Neben der primären Waschleistung können die in Waschmitteln enthaltenen Proteasen ferner die Funktion erfüllen, andere enzymatische Bestandteile durch proteolytische Spaltung zu aktivieren oder nach entsprechender Einwirkzeit zu inaktivieren, so wie beispielsweise in den Anmeldungen WO 94/29426 oder EP 747471 offenbart worden ist. Vergleichbare regulatorische Funktionen sind auch über das erfindungsgemäße Protein möglich. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind ferner solche Mittel mit Kapseln aus proteasesensitivem Material, welche beispielsweise von erfindungsgemäßen Proteinen zu einem beabsichtigten Zeitpunkt hydrolysiert werden und ihren Inhalt freisetzen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei anderen mehrphasigen Mitteln erzielt werden.
Eine weitere Ausführungsform stellen Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie allein oder neben anderen aktiven Inhaltsstoffen eines der oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate enthalten, insbesondere für Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Denn insbesondere natürliche Fasern, wie beispielsweise Wolle oder Seide, zeichnen sich durch eine charakteristische, mikroskopische Oberflächenstruktur aus. Diese kann, wie am Beispiel der Wolle im Artikel von R. Breier in Melliand Textilberichte vom 1.4.2000 (S. 263) ausgeführt worden ist, langfristig zu unerwünschten Effekten, wie etwa Verfilzung führen. Zur Vermeidung solcher Effekte werden die natürlichen Rohstoffe mit erfindungsgemäßen Mitteln behandelt, welche beispielsweise dazu beitragen, die auf Proteinstrukturen beruhende geschuppte Oberflächenstruktur zu glätten und damit einem Verfilzen entgegenwirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel mit einer erfindungsgemäßen Protease so konzipiert, daß es regelmäßig als Pflegemittel verwendet werden kann, beispielsweise indem es dem Waschprozeß zugesetzt, nach dem Waschen angewendet oder unabhängig von dem Waschen appliziert wird. Der gewünschte Effekt besteht darin, eine glatte Oberflächenstruktur des Textils über einen langen Zeitraum zu erhalten und/oder Schädigungen des Gewebes vorzubeugen und/oder zu verringern.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat aktiv wird, insbesondere in einer Menge von 40 µg bis 4 g, vorzugsweise von 50 µg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 µg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 µg bis 1 g pro Anwendung.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder daß das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Das gleiche gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefaßt werden. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um erfindungsgemäße Proteine bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform solcher Verfahren werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise erfindungsgemäße Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein oben beschriebenes, erfindungsgemäßes Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat aktiv wird, insbesondere für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.
Vorzugsweise gelten für diese Verwendung die oben ausgeführten Konzentrationsbereiche.
Denn erfindungsgemäße Proteine können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften und den oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche oder die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen einer der oben ausgeführten Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel, vorzugsweise Wasch-, beziehungsweise Reinigungsmittel bereitgestellt.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln dar.
Denn, wie bekannt ist, können Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es, wie oben beschrieben, möglich, daß durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 00/01831 offenbart worden ist. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle seiner Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteine können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.
Im folgenden werden allen anderen, außerhalb der Wasch- und Reinigungsproblematik angesiedelten technischen Verfahren, Verwendungen und zugehörigen Mittel ungeachtet ihrer Diversität zu einem Erfindungsgegenstand zusammengefaßt, sofern sie durch ein erfindungsgemäßes Protein gekennzeichnet sind. Diese Zusammenstellung ist nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern stellt die wichtigsten, derzeit zu erkennenden Einsatzmöglichkeiten erfindungsgemäßer Proteasen zusammen. Anhaltspunkte für weitere, ebenfalls eingeschlossene Einsatzmöglichkeiten bietet beispielsweise auch das Handbuch "Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. Sollte sich herausstellen, daß weitere technische Gebiete durch den Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen weiterentwickelt werden können, so sind diese in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen dar.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. Erfindungsgemäß und nach Römpp, "Lexikon Chemie" (Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) wird unter der enzymatischen Analyse jede biochemische Analytik verstanden, die sich spezifischer Enzyme oder Substrate bedient, um einerseits Substrate in ihrer Identität oder ihrer Konzentration oder andererseits Enzyme in Identität oder Aktivität zu bestimmen. Anwendungsgebiete sind alle mit der Biochemie verwandten Arbeitsgebiete, insbesondere die Molekularbiologie und die Proteinchemie. Diese Verwendung erfolgt bevorzugt im Rahmen eines enzymatischen Analyseverfahrens. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Sequenzanalyse dar.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen dar.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. So kann es im Verlauf der Aufreinigung von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen beispielsweise notwendig sein, diese von Proteinverunreinigungen zu befreien. Dabei kann es sich beispielweise um niedermolekulare Verbindungen, um alle Zellinhalts- oder Speicherstoffe oder um Proteine handeln. Dies ist sowohl im Labormaßstab, als auch in großtechnischer Dimension, beispielsweise nach der biotechnologischen Herstellung eines Wertstoffes durchführbar.
Die Verwendung eines erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen geschieht in Umkehrung der von ihnen natürlicherweise katalysierten Reaktion, beispielsweise dann, wenn Proteinfragmente miteinander verknüpft werden oder an eine nicht überwiegend aus Protein bestehende Verbindung Aminosäuren gebunden werden sollen. Derartige Verwendungsmöglichkeiten sind beispielsweise in Anlehnung an die Anmeldung EP 380362 möglich.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen dar, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. Sie ist beispielsweise dann erforderlich, wenn natürliche Rohstoffe von Protein- Verunreinigungen befreit werden sollen. Hierunter sind in erster Linie nicht-mikrobiologisch zu erhaltende Rohstoffe, etwa aus der Landwirtschaft, aber auch biotechnologisch über Fermentationen hergestellte Stoffe wie beispielsweise Antibiotika zu verstehen.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellt die Verwendung zur Oberflächenbehandlung, und ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung des wirtschaftlich bedeutenden Rohstoffs Leder dar. So werden im Verlauf des Gerbverfahrens, insbesondere im Schritt der Alkalischen Weiche (Römpp, "Lexikon Chemie", Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag, 1999) wasserlösliche Proteine mithilfe proteolytischer Enzyme aus dem Hautmaterial herausgelöst. Hierfür eignen sich, insbesondere wenn alkalische Bedingungen herrschen und/oder denaturierende Agentien anwesend sind, erfindungsgemäße Proteasen.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben dar.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. dar. Ein Beispiel für die Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung ist die Aufarbeitung von Baumwolle, die in einem als Schlichten bezeichneten Prozeß von den Kapselbestandteilen befreit werden muß; ein anderes die Behandlung von Wolle; ähnlich gestaltet sich auch die Verarbeitung von Rohseide. Enzymatische Verfahren, beziehungsweise Verwendungen sind vergleichbaren chemischen Verfahren besonders hinsichtlich ihrer Umweltverträglichkeit überlegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Proteine dazu verwendet, um Schutzschichten von Textilien, insbesondere Zwischenprodukten oder Werkstoffen zu entfernen oder ihre Oberfläche zu glätten, bevor sie in einem nachfolgenden Verarbeitungsschritt weiterbearbeitet werden.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, insbesondere zur Behandlung von Wolle oder Seide oder woll- oder seidenhaltigen Mischtextilien.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. Entsprechend dem oben Gesagten werden die betreffenden Textilrohstoffe durch die Protease von Verunreinigungen befreit; außerdem kommen einem wenigstens zum Teil aus Protein bestehenden Material die oberflächenglättenden und pflegenden Eigenschaften des proteolytischen Enzyms zugute. Aus diesem Grunde ist auch die Verwendung zur Pflege der betreffenden Materialien umfaßt. Insbesondere wird deshalb die Oberflächenbehandlung von Wolle oder Seide oder woll- oder seidenhaltigen Mischtextilien beansprucht. Dies gilt sowohl für die Herstellung für derartige Textilien, als auch für die Pflege während des Gebrauchs, beispielsweise im Zusammenhang mit der Textilreinigung (siehe oben).
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Behandlung von photographischen Filmen dar, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. Denn mit solchen Schutzschichten, insbesondere solchen aus Silbersalz-haltigen Gelatin-Emulsionen werden Filme, wie beispielsweise Röntgenfilme beschichtet. Diese Schichten müssen nach der Belichtung vom Trägermaterial abgelöst werden. Hierfür können insbesondere unter alkalischen oder leicht denaturierenden Reaktionsbedingungen erfindungsgemäße Proteasen verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln dar.
Vorzugsweise erfolgt diese Verwendung im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren. So werden Proteasen schon von alters her zur Lebensmittelherstellung verwendet. Ein Beispiel dafür ist die Verwendung von Lab für den Reifungsprozeß von Käse oder anderen Milchprodukten. Solche Prozesse können um ein erfindungsgemäßes Protein bereichert oder vollständig von ihm durchgeführt werden. Auch kohlenhydratreiche Lebensmittel oder Lebensmittelrohstoffe für Nicht-Ernährungszwecke, wie beispielsweise Getreidemehl oder Dextrin, können mit entsprechenden Proteasen behandelt werden, um sie von begleitenden Proteinen zu befreien. Auch für solche Anwendungen ist eine erfindungsgemäße Protease geeignet, insbesondere dann, wenn sie unter alkalischen oder leicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden sollen.
Entsprechendes gilt für die Futtermittelherstellung. Hier kann es neben einer vollständigen Befreiung von Proteinen auch von Interesse sein, die proteinhaltigen Ausgangsstoffe oder Stoffgemische mit Proteasen lediglich kurze Zeit zu behandeln, um sie für die Haustiere leichter verdaulich zu machen. Solch eine Behandlung kann beispielsweise auch für die Herstellung von Medienbestandteilen, etwa für die Fermentation von Mikroorganismen eingesetzt werden.
In einer weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands werden die oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteine für kosmetische Zwecke eingesetzt.
Beansprucht werden also Kosmetika mit einem oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat oder kosmetische Verfahren unter Einbeziehung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats oder die Verwendung eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venerol., Band 71 (1991), S. 471-474). Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen, beispielsweise gemäß der Anmeldungen WO 95/07688 oder WO 99/18219. Der Einsatz von Subtilisin-Proteasen, für kosmetische Zwecke wird beispielsweise in WO 97/07770 beschrieben. Auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, eignen sich als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger (vergleiche US 5230891) stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.
Dementsprechend wird auch die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist in diesen Anspruch eingeschlossen.
Wie oben bereits dargelegt unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) von den etablierten Proteasen aus B. lentus (Savinase® und B. lentus-Alkalische Protease) durch die Aminosäuren 224V, 250G und 253N, beziehungsweise 97S, 99S, 101S, 102V, 157G, 224V, 250G und 253N. Überraschenderweise verfügt sie, wie aus den Beispielen hervorgeht, in einigen Anwendungen über eine bessere Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung als diese etablierten Proteasen. Aus diesem Grunde ist in dem gezielten Einführen einer oder mehrerer dieser Positionen in Proteasen, vorzugsweise Subtilasen, ganz besonders bevorzugt Subtilisinen ein erfolgversprechender Ansatz zur Verbesserung deren Leistung zu sehen. Insbesondere bezieht sich dies auf die jeweiligen Beiträge zu Wasch- oder Reinigungsleistungen entsprechender Mittel. Solch eine Veränderung kann durch im Stand der Technik etablierte Mutagenese-Verfahren vorgenommen werden.
Im Falle der Alkalischen Protease aus B. lentus DSM 5483 können solche Austausche beispielsweise an dem im Alignment der Fig. 1 dargestellten Wildtypenzym oder an Varianten vorgenommen werden, die ihrerseits gegenüber dem Wildtyp bereits in Hinblick auf ihre Leistung in Wasch- und Reinigungsmitteln verbessert worden sind. Als solche Varianten seien beispielsweise die in der Anmeldung WO 95/23221 beschriebenen genannt, insbesondere M130, M131 und F49. Letztere diente in den Beispielen der vorliegenden Anmeldungen als Vergleichsenzym. Weitere Kandidaten hierfür sind in den Varianten der noch nicht veröffentlichten Anmeldungen DE 101 21 463 und DE 101 53 792 zu sehen.
Als eigener Erfindungsgegenstand werden deshalb alle Verfahren zur Verbesserung der Leistung einer Protease beansprucht, insbesondere hinsichtlich der Wasch- und/oder Reinigungsleistung eines entsprechenden Mittels, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Protease über Punktmutagenese eine oder mehrere der Aminosäuren 97S, 99S, 101S, 102V, 157G, 224V, 250G und 253N gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1, das heißt des maturen Proteins, erhält, vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren 224V, 250G und 253N.
Dieser Schutz gilt dementsprechend auch für alle Proteasen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie über Punktmutagenese eine oder mehrere der Aminosäuren 97S, 99S, 101S, 102V, 157G, 224V, 250G und 253N gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1 erhalten haben, vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren 224V, 250G und 253N.
Ebenso werden in diesen Schutz entsprechende einzelne oder mehrere konservierte Austausche einbezogen, beispielsweise eine andere hydrophobe Aminosäure als V in den Positionen 102 und 224, eine andere basische Aminosäure als N in der Position 253, T in den Positionen 97, 99, 101 und/oder A in den Positionen 157 und 250.

Beispiele

Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.

Beispiel 1

Isolierung und Identifizierung eines proteolytisch aktiven Bakterienstamms

0,1 g einer Bodenprobe wurden in 1 ml steriler 0,9%-iger NaCl-Lösung suspendiert und auf milchpulverhaltigen Agarplatten (1,5% Agar, 0,5% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% Hefeextrakt, 2% Pepton (Firma ICN, Eschwede, Art.-Nr. 104808), 1% Milchpulver (Skim milk; Firma Difco, Heidelberg, Art.-Nr. 232100), pH 10), ausplattiert. Nach 72-stündiger Inkubation bei 30°C zeigten sich Kolonien mit Klärungshöfen in dem milchigen Agar. Aus diesen wurden Einzelkolonien entnommen und in Horikoshi-Medium (0,1% K₂HPO₄, 0,5% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,02% MgSO₄, 0,3% Na_2CCO₃, pH 9) in Erlenmeyer- Kolben bei 37°C und unter Schütteln bei 200 rpm kultiviert.
Einer dieser Klone wurde am 1.3.2001 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DSMZ) hinterlegt. Er trägt dort die Bezeichnung ID 01-191 und die Eingangsnummer DSM 14390. Die maßgeblichen Angaben über die Merkmale dieses biologischen Materials, wie sie von der DSMZ am 19.4.2001 bei der Hinterlegung bestimmt worden sind, werden in folgender Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Mikrobiologische Eigenschaften des Bacillus sp. (DSM 14390). (Bestimmt von der DSMZ am 19.4.2001.)

Beispiel 2

Klonierung und Sequenzierung der maturen Protease

Chromosomale DNA aus Bacillus sp. (DSM 14390) wurde nach Standardmethoden präpariert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A behandelt und die erhaltenen Fragmente in den Vektor pAWA22 kloniert. Dabei handelt es sich um einen von pBC16 abgeleiteten Expressionsvektor für den Einsatz in Bacillus-Spezies (Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol., Band 133 (2), S. 897-903). Dieser Vektor wurde in den Protease-negativen Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J Bacteriol., Band 160 (1), S. 442-444) transformiert.
Die Transformanten wurden zunächst auf DM3-Medium (8 g/l Agar, 0,5 M Bernsteinsäure, 3,5 g/l, K₂HPO₄, 1,5 g/l KH₂PO₄, 20 mM MgCl₂, 5 g/l Casiaminoacids, 5 g/l, Hefeextrakt, 6 g/l, Glucose, 0,1 g/l BSA) regeneriert und dann auf TBY-Skimmilk-Platten (10 g/l, Pepton, 10 g/l, Milchpulver (siehe oben), 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l, NaCl, 15 g/l Agar) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt (p/B-5), dessen Plasmid isoliert und das Insert nach Standardmethoden sequenziert.
Das ca. 2,9 kb große Insert enthielt einen offenen Leserahmen von ca. 1 kb. Dessen Sequenz ist im Sequenzprotokoll unter der Bezeichnung SEQ ID NO. 1 angegeben. Es umfaßt 1143 bp. Die hiervon abgeleitete Aminosäuresequenz umfaßt 380 Aminosäuren, gefolgt von einem Stop-Codon. Sie ist im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 2 angegeben. Hiervon sind die ersten 111 Aminosäuren wahrscheinlich nicht im maturen Protein enthalten, so daß sich für das mature Protein voraussichtlich eine Länge von 269 Aminosäuren ergibt.
Diese Sequenzen wurden im August 2001 mit den aus den allgemein zugänglichen Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http:/ / www.genebio.com/sprot.html) und GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) erhältlichen Proteasesequenzen verglichen. Dabei wurden als nächstähnliche Enzyme die in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellten identifiziert.

Tabelle 2

Homologie der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) zu den nächstähnlichen und weiteren repräsentativen Proteinen (Prozentangaben gerundet)

Darin bedeuten

ID Die Eintragungsnummern bei den Datenbanken Genbank und Swiss-Prot;
Ident. DNA Identität auf DNA-Ebene in %;
Ident. Proprä. Identität auf Aminosäure-Ebene, bezogen auf das Propräprotein, in %;
Ident. mat. Prot. Identität auf Aminosäure-Ebene, bezogen auf das mature Protein, in %;
n. nicht in den Datenbanken angegeben.
Die Aminosäuresequenzen dieser Proteasen werden auch im Alignment der Fig. 1 miteinander verglichen.

Beispiel 3

Aufreinigung und Charakterisierung der Alkalischen Protease

Ein 500-ml Erlenmeyerkolben wurde mit 100 ml Horikoshi-Medium (siehe oben) versetzt, mit einer Kolonie des nach Beispiel 2 transformierten Bacillus-Stamms angeimpft und für 72 h bei 37°C kultiviert, bis die stationäre Wachstumsphase erreicht war.
Aus dem Überstand dieser Kultur konnte über folgende Aufreinigungsschritte ein singuläres proteolytisches Enzym erhalten werden: Dialyse des Überstands gegen 20 mM HEPES/NaOH-Puffer, pH 7,6; negative Anionenaustauschchromatographie an Q- Sepharose® (Firma Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden); Kationenaustauschchromatographie des Durchbruchs an S-Sepharose® (Firma Pharmacia-Amersham) bei Elution mit einem Gradientenpuffer von HEPES/NaOH, 0-1 M NaCl, pH 7,6. Die Protease eluierte bei 0,2 M NaCl und wurde anschließend mit einer Kationenaustauschchromatographie an Resource S® (Firma Pharmacia-Amersham) und HEPES/NaOH (pH 7,6) als Eluens aufkonzentriert.
Auf diese Weise wurde ein gemäß SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung reines Protein gewonnen.

Beispiel 4

SDS-Polyacrylgelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung

Bei denaturierender SDS-Polyacrylgelelektrophorese im PHAST®-System der Firma Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden, weist die nach Beispiel 2 und 3 erhaltene Alkalische Protease aus B. sp. (DSM 14390) ein Molekulargewicht von 26 kD auf.
Gemäß isoelektrischer Fokussierung, ebenfalls im PHASr-System der Firma Pharmacia- Amersham Biotech liegt der isoelektrische Punkt der Alkalischen Protease aus B. sp. (DSM 14390) bei 11.

Beispiel 5

Enzymatische Eigenschaften

Spezifische Aktivität

Die spezifische Aktivität der nach Beispiel 2 und 3 aufgreinigten Alkalischen Protease aus B. sp. (DSM 14390) wurde mit dem Substrat Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid (AAPF; Firma Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg) ermittelt. Während 5 minütiger Inkubation bei pH 8,6 und 25°C zeigte sie eine Aktivität von 69 U/mg. Dabei entspricht 1 U 1 µmol gespaltenem Substrat pro Minute.

pH-Abhängigkeit

Das pH-Profil der Alkalischen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) wurde über einen pH-Bereich von 6-12 aufgenommen. Dazu wurden Aktivitäten bei jeweils ganzzahligen pH-Werten mit Casein als Substrat bei 50°C gemessen. Das pH-Optimum liegt demnach bei pH 11. Nach 15 minütiger Inkubation bei 50°C liegen bei pH 12 noch 5%, bei pH 6 17% und bei pH 9 69% Aktivität vor.

Beispiel 6

Beitrag zur Waschleistung

Für dieses Beispiel wurden standardisiert mit Anschmutzungen versehene Textilien eingesetzt, die von der Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA), oder der Wäschereiforschungsanstalt, Krefeld, bezogen worden waren. Dabei wurden folgende Anschmutzungen und Textilien verwendet: A (Blut/Milch/Ruß auf Baumwolle), B (Blut/Milch/Tusche auf Baumwolle), C (Blut/Milch/Tusche auf einem Polyester-Baumwolle-Mischgewebe), D (Milch/Kakao auf Baumwolle) und E (Blut auf Baumwolle).
Mit diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen launderometrisch auf ihre Waschleistung hin untersucht. Dafür wurde jeweils ein Flottenverhältnis von 1 : 12 eingestellt und für 30 min bei einer Temperatur von 40°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,88 g des jeweiligen Mittels pro I Waschflotte. Die Wasserhärte betrug 16° deutscher Härte.
Als Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 4% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium- Salz), 4% C₁₂-C₁₈-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 5,5% C₁₂-C₁₈-Fettalkohol mit 7 EO, 1% Natrium-Seife, 11% Natriumcarbonat, 2,5% amorphes Natriumdisilikat, 20% Natriumperborat-Tetrahydrat, 5,5% TAED, 25% Zeolith A, 4,5% Polycarboxylat, 0,5% Phosphonat, 2,5% Schauminhibitorgranulat, 5% Natriumsulfat, Rest: Wasser, optischer Aufheller, Salze. Sie wurde für die verschiedenen Versuchsreihen so mit folgenden Proteasen versetzt, daß sich jeweils eine Endkonzentration von 2.250 PE an proteolytischer Aktivität pro I Waschflotte ergab: B. lentus-Alkalische Protease F49 (WO 95/23221; Hersteller: Firma Biozym, Kundl, Österreich), Savinase® (Firma Novozymes A/S. Bagsvaerd, Dänemark), beziehungsweise die erfindungsgemäße Protease aus B. sp. (DSM 14390).
Nach dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien im Vergleich zu dem von Bariumsulfat gemessen, der auf 100% normiert worden war. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Datacolor SF500-2 bei 460 nm (UV-Sperrfilter 3), 30 mm Blende, ohne Glanz, Lichtart D65, 10°, d/8°. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Remission, das heißt als Prozentangaben im Vergleich zu Bariumsulfat zusammen mit den jeweiligen Anfangswerten in folgender Tabelle 3 zusammengestellt. Angegeben sind die Mittelwerte aus jeweils 4 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluß auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms zur Waschleistung des verwendeten Mittels. Tabelle 3
Man erkennt, daß die erfindungsgemäße Protease aus B. sp. (DSM 14390) an allen getesteten Anschmutzungen eine deutlich bessere Leistung zeigt als die etablierten Proteasen B. lentus-Alkalische Protease F49 und Savinase® oder ihnen zumindest nahekommt.

Beispiel 7

Beitrag zur Reinigungsleistung bei niedriger eingesetzter Aktivität

Gefäße mit harten, glatten Oberflächen wurden standardisiert mit Mixstärke (F und G), beziehungsweise mit hartnäckigem Hackfleisch (H) versehen und mit handelsüblichen Haushaltsgeschirrspülmaschinen gespült. Die Proben F und H wurden dabei bei 45°C mit dem Normalprogramm der Geschirrspülmaschine Typ Miele® G 676 gespült und die Probe G bei 55°C mit dem Normalprogramm der Geschirrspülmaschine Typ Bosch® SGS 4002. Pro Spülgang wurden jeweils 20 g Spülmittel verwendet. Die Wasserhärte betrug 16° deutscher Härte.
Als Spülmittel diente folgende Basis-Rezeptur (alle Angaben jeweils in Gewichts-Prozent): 55% Natriumtripolyphosphat (berechnet als wasserfrei), 4% amorphes Natriumdisilikat (berechnet als wasserfrei), 22% Natriumcarbonat, 9% Natriumperborat, 2% TAED, 2% nichtionisches Tensid, Rest: Wasser, Farbstoffe, Parfüm. Diese Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen Versuche aktivitätsgleich so mit den verschiedenen Proteasen B. lentus-Alkalische Protease F49, Properase®, beziehungsweise der erfindungsgemäßen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) versetzt, daß sich jeweils eine Aktivität von 10.000 PE pro Spülgang ergab. Dies entsprach jeweils ca. 0,1 mg Protease- Protein pro g des Reinigungsmittelkonzentrats.
Nach dem Spülen wurde für die Proben F und G der Abtrag der Anschmutzungen gravimetrisch in Prozent ermittelt. Dafür wurde die Differenz aus dem Gewicht des verschmutzten und anschließend gespülten Gefäßes und dem Anfangsgewicht des Gefäßes in Relation zu der Gewichtsdifferenz des nicht gespülten Gefäßes zum Anfangsgewicht gesetzt. Diese Relation kann als Prozent Abtrag angesehen werden. Für die Anschmutzung H wurde nach dem Spülen eine visuelle Bewertung nach einer Skala von 0 (= unverändert, das heißt sehr starke Anschmutzung) bis 10 (= keinerlei Anschmutzung erkennbar) vorgenommen. Die jeweils erhaltenen Ergebnisse werden in folgender Tabelle 4 zusammengestellt. Angegeben sind dort die Mittelwerte aus jeweils 8 Messungen. Sie erlauben einen unmittelbaren Rückschluß auf den Beitrag des enthaltenen Enzyms auf die Reinigungsleistung des verwendeten Mittels. Tabelle 4
Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) hinsichtlich ihrer Leistung in maschinellen Geschirrspülmitteln den anderen getesteten Proteasen zumindest ebenbürtig ist; und dies bereits bei einer vergleichsweise niedrigen eingesetzten Aktivität.

Beispiel 8

Beitrag zur Reinigungsleistung bei höherer eingesetzter Aktivität

Wie in Beispiel 7 wurden Gefäße standardmäßig mit den Anschmutzungen Milch (I) und hartnäckigem Hackfleisch (J) versehen und auf die gleiche Weise mit den jeweils gleichen Reinigungsmittelrezepturen gespült. Sie wurden bei 45°C mit dem Normalprogramm der Geschirrspülmaschine Typ Miele® G 676 gespült. Der einzige Unterschied zu Beispiel 7 bestand darin, daß jeweils 20.000 PE an den jeweiligen Proteasen eingesetzt wurden. Dies entsprach jeweils ca. 0,2 mg Protease im Reinigungsmittelkonzentrat.
Die Ergebnisse wurden nach dem Spülen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 über eine visuelle Bewertung nach einer Skala von 0 (= unverändert, das heißt sehr starke Anschmutzung) bis 10 (= keinerlei Anschmutzung erkennbar) erhalten. Sie werden in folgender Tabelle 5 zusammengestellt. Angegeben sind dort die Mittelwerte aus jeweils 8 Messungen. Tabelle 5
Auch bei höheren eingesetzten Protease-Aktivitäten zeigt sich der höhere oder zumindest vergleichbare Beitrag der erfindungsgemäßen Protease zur Gesamtreinigungsleistung des betreffenden Mittels gegenüber den für maschinelle Geschirrspülmittel etablierten Proteasen B. lentus-Alkalische Protease F49 und Properase®.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Alignment der Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) mit den nächstähnlichen und den wichtigsten, in Tabelle 2 zusammengestellten bekannten Subtilisinen, jeweils in der maturen, das heißt prozessierten Form.
Folgende Nummern stehen für folgende Proteasen (in Klammem jeweils die ID des Datenbankeintrags; vergleiche auch Tabelle 2 in Beispiel 2):
Fig. 2 Der von pBC16 abgeleitete Expressionsvektor pAWA22, der einen Promotor aus B. licheniformis (PromPLi) und stromabwärts davon eine Bcl I-Restriktionsschnittstelle aufweist (vergleiche Beispiel 2 und Bernhard et al. (1978), J Bacteriol., 133 (2), S. 897-903). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,5% identisch ist.

2. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 98,75% identisch ist.

3. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 112 bis 381 mindestens zu 99,3% identisch ist.

4. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 112 bis 381 mindestens zu 99,5% identisch ist.

5. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, die sich von einer Nukleotidsequenz ableitet, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 92,5% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Positionen 112 bis 381 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

6. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, die sich von einer Nukleotidsequenz ableitet, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 95% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich, der den Positionen 112 bis 381 gemäß der SEQ ID NO. 2 entspricht.

7. Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ, deren Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz insgesamt, vorzugsweise in den Positionen 112 bis 381 identisch ist und/oder deren Aminosäuresequenz mit einer von der in SEQ ID NO. 1 angebenen Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz insgesamt, vorzugsweise in den Positionen 112 bis 381 gemäß SEQ ID NO. 2 identisch ist.

8. Von einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ nach einem der Ansprüche 1 bis 7 durch Fragmentierung oder Deletionsmutagenese abgeleitetes Protein oder Fragment mit mindestens 225, vorzugsweise mindestens 250, besonders bevorzugt mindestens 275 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden Aminosäuren oder solche mit mindestens 40, vorzugsweise mindestens 100, besonders bevorzugt mindestens 150 bereits im Ausgangsmolekül zusammenhängenden Aminosäuren, die die Position 224 gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1 umfassen.

9. Von einer Alkalischen Protease vom Subtilisin-Typ oder von einem abgeleiteten Protein oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durch Insertionsmutagenese, durch Substitutionsmutagenese und/oder durch Fusion mit mindestens einem anderen Protein oder Proteinfragment abgeleitetes Protein.

10. Protein, Proteinfragment oder Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es an sich Protein zu hydrolysieren vermag.

11. Protein, Proteinfragment oder Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich derivatisiert ist.

12. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich stabilisiert ist.

13. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens eine antigene Determinante mit einem der in den Ansprüchen 1 bis 12 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate gemeinsam hat.

14. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich ist.

15. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.

16. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.

17. Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus sp., insbesondere um Bacillus sp. (DSM 14390) handelt.

18. Für eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 92,5% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich der Positionen 334 bis 1143.

19. Für eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 95% identisch ist, insbesondere über den Teilbereich der Positionen 334 bis 1143.

20. Für eine Alkalische Protease vom Subtilisin-Typ codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz identisch ist, insbesondere über den Teilbereich der Positionen 334 bis 1143.

21. Nukleinsäure, die für eines der in den Ansprüchen 1 bis 14 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codiert.

22. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer natürlichen Quelle, insbesondere aus einem Mikroorganismus erhältlich ist.

23. Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-positives Bakterium handelt.

24. Nukleinsäure nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gram-positiven Bakterium um eines der Gattung Bacillus handelt.

25. Nukleinsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Bacillus-Spezies um Bacillus sp., insbesondere um Bacillus sp. (DSM 14390) handelt.

26. Vektor, der einen in den Ansprüchen 18 bis 25 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält, insbesondere einen, der für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codiert.

27. Klonierungsvektor nach Anspruch 26.

28. Expressionsvektor nach Anspruch 26.

29. Zelle, die einen in den Ansprüchen 18 bis 25 bezeichneten Nukleinsäurebereich enthält, insbesondere einen, der für eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate codiert, vorzugsweise auf einem Vektor nach einem der Ansprüche 26 bis 28.

30. Wirtszelle, die eines der in Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, insbesondere unter Einsatz eines in einem der Ansprüche 18 bis 25 bezeichneten Nukleinsäurebereichs, ganz besonders unter Einsatz eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 28.

31. Wirtszelle gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, das das gebildete Protein ins umgebende Medium sekretiert.

32. Bakterium gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gram-positives Bakterium ist, insbesondere eines der Gattung Bacillus, ganz besonders der Species Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Baillus alcalophilus.

33. Zelle gemäß Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational modifiziert.

34. Verfahren zur Herstellung eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten Proteine, Proteinfragmente, Fusionsproteine oder Derivate unter Einsatz einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18 bis 25 und/oder unter Einsatz eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28 und/oder unter Einsatz einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 29 bis 33.

35. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.

36. Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.

37. Mittel nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es das Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat in einer Menge von 2 µg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 µg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 µg bis 15 mg, ganz besonders bevorzugt von 50 µg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.

38. Mittel nach Anspruch 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich weitere Enzyme, insbesondere andere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Oxidoreduktasen und/oder Lipasen enthält.

39. Mittel zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch gekennzeichnet, daß es allein oder neben anderen aktiven Inhaltsstoffen ein Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält, insbesondere für Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

40. Verfahren zur maschinellen Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, insbesondere in einer Menge von 40 µg bis 4 g, vorzugsweise von 50 µg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 µg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 µg bis 1 g pro Anwendung.

41. Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte ein Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird, insbesondere für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.

42. Verwendung eines proteolytisch aktiven Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere in einer Menge von 40 µg bis 4 g, vorzugsweise von 50 µg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 µg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 µg bis 1 g pro Anwendung.

43. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch- oder Reinigungsmitteln.

44. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen.

45. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen.

46. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder.

47. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben.

48. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege, insbesondere zur Behandlung von Wolle oder Seide oder woll- oder seidenhaltigen Mischtextilien.

49. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten.

50. Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.

51. Kosmetikum mit einem Protein, Proteinfragment, Fusionsprotein oder Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder ein kosmetisches Verfahren unter Einbeziehung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder die Verwendung eines Proteins, Proteinfragments, Fusionsproteins oder Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zu kosmetischen Zwecken, insbesondere im Rahmen entsprechender Verfahren oder in entsprechenden Mitteln.

52. Verfahren zur Verbesserung der Leistung einer Protease, insbesondere hinsichtlich der Wasch- und/oder Reinigungsleistung eines diese Protease enthaltenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease über Punktmutagenese eine oder mehrere der Aminosäuren 97S, 99S, 101S, 102V, 157G, 224V, 250G und 253N gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1 erhält, vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren 224V, 250G und 253N.

53. Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sie über Punktmutagenese eine oder mehrere der Aminosäuren 97S, 99S, 101S, 102V, 157G, 224V, 250G und 253N gemäß der Aminosäurezählung in SEQ ID NO. 1 erhalten hat, vorzugsweise eine oder mehrere der Aminosäuren 224V, 250G und 253N.