DE10197266T5

DE10197266T5 - Verfahren zur örtlichen Betäubung und Schmerzstillung

Info

Publication number: DE10197266T5
Application number: DE10197266T
Authority: DE
Inventors: Baoshan Ku; Shiquan Qi
Original assignee: Wex Medical Ltd
Current assignee: Wex Medical Ltd
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2005-05-12
Also published as: CN1343491A; GB0406274D0; US6599906B1; AU2002213784A1; WO2002022128A1; CN1203857C

Abstract

Verfahren zum Bewirken von örtlicher Schmerzstillung oder Betäubung im Nervengewebe eines Säugetiers, welches Schmerz empfindet, der durch Beschädigung oder Reizung des Nervengewebes verursacht ist, umfassend topisches Verabreichen ins Nervengewebe des Säugetiers einer anästhetisch und analgetisch effektiven Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche eine Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, und ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel umfasst.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher Betäubung und Schmerzfreiheit in einem Bereich des Nervengewebes eines Säugetiers durch topische Verabreichung von Natriumkanalblockierverbindungen, welche Tetrodotoxin und Saxitoxin umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Schmerz wird mit einer tatsächlichen oder potenziellen Verletzung oder Gewebebeschädigung infolge einer Entzündung, Blutleere und mechanischen oder anderen Irritation verbunden. Örtliche Betäubungsmittel werden verwendet, um Schmerz durch Blockieren der Neurotransmission zu behandeln, und wirken sich sowohl auf die Sinnesempfindung als auch den Schmerz aus. Schmerzstillende Mittel werden verwendet, um Schmerz zu lindern, und können außerdem die Aktivität von chemischen Übertragungssubstanzen, welche Entzündung verursachen, beeinflussen.
Die Schädigung oder Reizung eines Bereichs der Sinnesnerven, wie beispielsweise des Zahnmarks, ist für gewöhnlich mit starkem Schmerz verbunden und kann von einer chemischen oder physikalischen Ursache, zum Beispiel einem kariösen Zahn oder einer Zahnwurzelhautentzündung, und zahnärztlichen Eingriffen an einem Zahn herrühren.
Schmerz, der durch Zahnmarkreizung ausgelöst wird, ist zu stark, als dass die Patienten ihn ertragen könnten. Heutzutage werden zwar örtliche Betäubungsmittel verwendet, um Schmerz zu lindern, aber infolge ihrer begrenzten Wirksamkeit und kurzen Wirkungsdauer können sie bei den Patienten keine zufrieden stellende Wirkung erzeugen. Zum Beispiel werden Procain und Tetracain allgemein als topische Betäubungsmittel zur Zahnschmerzbehandlung verschrieben. Diese topischen Betäubungsmittel stellen lediglich eine teilweise Schmerzlinderung für kurze Zeiträume, z.B. etwa 1 Stunde, bereit.
Auf dem Fachgebiet besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Bewirkung einer andauernden, wirksamen Betäubung und Schmerzstillung ohne bedeutende Nebenwirkungen.

Tetrodotoxin kann als ein örtliches Betäubungsmittel verwendet werden und ist zehntausend mal stärker als allgemein verwendete, örtliche, nicht-narkotische Mittel, wie durch C.Y. Kao und F.A. Fulman, J. Pharmacol., 140, S. 31–40 (1965) erörtert wird. Tetrodotoxinpräparate in Verbindung mit anderen gemeinhin verwendeten Betäubungsmitteln wurden im US-Patent Nr. 4,022,899 und US-Patent Nr. 4,029,793 erwähnt. Gemäß US-Patent Nr. 6,030,974 bezieht sich "Tetrodotoxin" oder "TTX" auf die Aminoperhydrochinazolinverbindungen mit der Molekularformel C₁₁H₁₇N₃O₈ und Derivate davon, welche Anhydrotetrodotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin, Ethoxytetrodotoxin, Deoxytetrodotoxin und Tetrodonsäure (Kao) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für TTX-Analogstoffe umfassen neuartige TTX-Analogstoffe, welche von verschiedenen Organismen isoliert werden, sowie jene, welche teilweise oder zur Gänze chemisch synthetisiert werden, siehe z.B. Yotsu et al., Agric. Biol. Chem., 53 (3): S. 893–895 (1989). Diese Analogstoffe binden sich an dieselbe Seite auf der Alpha-Untereinheit von Natriumkanälen, wie das TTX.

Adams et al., US-Patent Nr. 9,022,899 und 4,029,793 betrifft eine örtliche Betäubungsmittelzusammensetzung, welche eine Mischung eines bestimmten Toxins, nämlich Tetrodotoxin oder Desoxytetrodotoxin, mit einer anderen Verbindung, im Allgemeinen eine herkömmliche, örtliche Betäubungsmittelverbindung oder ähnliche Verbindung mit Nervenblockierungseigenschaften, in einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz umfasst. Das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel kann ein Aminoacylanilid, wie beispielsweise Lidocain; ein Aminoalkylbenzoat, wie beispielsweise Procain oder Cocain; ein Aminocarbamat, wie beispielsweise Diperodon; ein N-Phenylamidin, wie beispielsweise Phenacin; ein N-Aminoalkylamid, wie beispielsweise Dibucain; ein Aminoketon, wie beispielsweise Falicain, oder ein Aminoether, wie beispielsweise Pramoxin, sein.

US-Patent Nr. 6,030,974 beschreibt ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher Betäubung bei einem Säugetier, welches in einem Bereich des Epithelgewebes Schmerz empfindet. Das Verfahren umfasst die topische Verabreichung einer effektiven Dosis einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung in einem geeigneten, pharmazeutischen Vehikel in dem Bereich. Die Natriumkanalblockierverbindung von US-Patent Nr. 6,030,974 kann eine Tetrodotoxin- oder Saxitoxinformulierung bei einer Konzentration von zwischen 0,001 und 10 mM sein.

Zapata et al., Pain, 72: S. 41–49 (1997), erörtert die Verwendung von Tetrodotoxin zur Hemmung der neuropathischen, ektopischen Aktivität bei Nervenfasergeschwülsten, Hinterwurzelganglien und Hinterhornnervenzellen. Die neuronale Aktivität ist auf ein Nervenfasergeschwulst zurückzuführen, welches durch mechanische, chemische oder ischämische Verletzung verursacht wird. Es wurde die Wirkung von intravenös verabreichtem TTX bei der neuronalen Induktion durch Hüftnerven bei männlichen Ratten erforscht. Die Dosierungen und Wirkungen, welche von Zapata et al. untersucht wurden, wurden jedoch bei Tieren unter Narkose und bei künstlicher Beatmung angewendet, weshalb diese Dosen über der höchsten, verträglichen Dosis liegen und die Verabreichung unter Bedingungen erfolgte, welche auf die zurzeit beabsichtigte, klinische Verwendung von Tetrodotoxin nicht anwendbar sind.

Die topische Verabreichung irgendeiner Natriumkanalblockierverbindung in der Umgebung der Zähne wird in keinem der zuvor erwähnten Fälle beschrieben.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lösen den auf dem Fachgebiet seit langem erkannten Bedarf an Verfahren zur Bewirkung einer wirksamen, örtlichen Betäubung und Schmerzstillung von langer Dauer. In der konkreten Ausführungsform zur Bewirkung einer lang dauernden wirksamen, örtlichen Betäubung und Schmerzstillung am Zahn befassten sich die Erfinder mit einem Problem von großer, klinischer Bedeutung, wobei sie zum ersten Mal zeigten, dass Natriumkanalblockierverbindungen, wie beispielsweise Tetrodotoxin und Saxitoxin, bei Schmerz, der durch Zahnmarkreizung verursacht wird, wirksame, betäubende und schmerzstillende Wirkungen von langer Dauer und ohne offensichtliche Nebenwirkungen erzeugen können. Außerdem zeigten die Erfinder, dass die effektiven Dosen dieser Natriumkanalblockierverbindungen eine große Sicherheitstoleranz aufweisen.

Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können für jede Bedingung, welche Zahnschmerz mit sich bringt, einschließlich örtlicher Betäubung nach einem zahnärztlichen Eingriff oder nach einer Verletzung des Zahns, verwendet werden. Die Verfahren sorgen für bedeutende Vorteile, welche die Bereitstellung örtlicher Betäubung und Schmerzstillung von wenigstens 1 Stunde, vorzugsweise 2 Stunden und insbesondere 6 Stunden ohne offensichtliche Nebenwirkungen umfassen.

Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Bewirkung einer wirksamen lang dauernden, örtlichen Betäubung und Schmerzstillung, welche die Verabreichung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung umfassen, wobei sich die Verbindung an die extrazelluläre Mündung des Natriumkanals bindet. Auf diese Weise wird die Natriumkanalaktivität durch einen Mechanismus gehemmt, welcher sich von dem örtlicher Betäubungsmittel, wie beispielsweise Procain, Lidocain und Tetracain, unterscheidet. Vorzugsweise erreichen diese Verfahren eine wirksame, örtliche Schmerzstillung und Betäubung von einer langen Dauer von bis zu 6 Stunden. Bevorzugte Verbindungen umfassen Toxine oder Analogstoffe davon, welche sich speziell an eine Stelle binden, die zum Teil durch einen extrazellulären Bereich der Alpha-Untereinheit eines Natriumkanals gebildet wird. Die am meisten bevorzugten Verbindungen umfassen die Klasse von Toxinen und Analogstoffen, die sich speziell an eine Seite binden, welche durch die extrazellulären SSl und SS2-Bereiche der Alpha-Untereinheit eines Natriumkanals gebildet werden, wobei diese Verbindungen Tetrodotoxin, Saxitoxin und Analogstoffe davon umfassen. Überraschenderweise stellen diese lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindungen, welche allgemein bekannte, wirksame Neurotoxine sind, eine wirksame, lang dauernde, örtliche Schmerzstillung und Betäubung ohne offensichtliche Nebenwirkungen bereit.

Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bewirkung einer wirksamen, örtlichen Schmerzstillung und Betäubung bei Patienten, welche Schmerz empfinden, wie beispielsweise jenen, der mit der Schädigung des Zahnmarks verbunden ist, wie beispielsweise ein kariöser Zahn, eine Zahnwurzelhautentzündung und zahnärztliche Eingriffe an einem Zahn.

In einem Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bewirkung einer wirksamen, örtlichen Schmerzstillung und Betäubung bei einem Versuchstier, das im Zahnmark Schmerz empfindet.

Das Verfahren umfasst die topische Verabreichung einer effektiven Dosis von Tetrodotoxin oder Saxitoxin oder Analogstoffen davon in einem geeigneten, pharmazeutischen Vehikel in die Zahnmarkhöhle.

In einer Ausführungsform wird die wirksame Dosis von Tetrodotoxin oder Saxitoxin von einer Formulierung verabreicht, welche Tetrodotoxin oder Saxitoxin bei einer Konzentration von zwischen 1 mM bis 20 mM enthält, die eine schmerzlindernde Wirkung für bis zu 6 Stunden bewirkt.

Bei dieser Anwendung wird das Tetrodotoxin normalerweise in einem Vehikel mit einem pH-Wert von zwischen 3,5 bis 6,8 formuliert.

Bei dieser Anwendung erzeugt die pharmazeutische Zusammensetzung keine toxischen Wirkungen oder irgendwelche ersichtlichen, schädlichen Nebenwirkungen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Zusammensetzung, die eine herkömmliche, örtliche Betäubungsmittelverbindung, welche eine Natriumkanalblockierverbindung ist, und eine Verbindung, welche sich an die SS1- und SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, umfasst. Die Zusammensetzung der Erfindung sorgt für eine synergistische Wirkung ihrer Teilverbindungen, um entweder einen wirksameren oder längeren Betäubungseffekt oder beides bereitzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 stellt eine Zeit-Wirkung-Beziehung von TTX nach der Verabreichung in die Zahnmarkhöhle dar.

2 stellt die synergistische Wirkung von TTX, wenn mit Tetracain verabreicht, dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher Schmerzstillung und Betäubung bei einem Versuchstier bereit, welches Schmerz in einer Bereich der Sinnesnerven, normalerweise im Zahnmark, empfindet, welcher durch eine chemische oder physikalische Ursache verletzt oder gereizt wird, indem eine therapeutisch effektive Dosis einer Natriumkanalblockierverbindung, normalerweise Tetrodotoxin, verabreicht wird.

Tetrodotoxin ist ein Nicht-Protein-Nervengift, das in vielen verschiedenen Tierarten, einschließlich Kugelfisch, Meeresgrundel, Wassermolch, Frösche und der Blauringkrake, vorkommt.

Saxitoxin ist eine Verbindung, welche einen Tetrahydropurinanteil, bestehend aus zwei Guanidineinheiten, die zu einer stabilen Azaketalbindung vereinigt sind, umfasst und die Molekularformel C₁₀H₁₇N₇O₄ aufweist.

In den hierin beschriebenen Beispielen wurde Tetrodotoxin topisch in die Zahnmarkhöhle verabreicht, wobei sich herausstellte, dass es eine wirksame, lang wirkende Schmerzlinderung ohne Anzeichen systemischer oder örtlicher Toxizität bereitstellte. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Verwendung bei der Bereitstellung von örtlicher Schmerzstillung und Betäubung für Schmerzen bestimmt, welche mit der Zahnmarkreizung, die aus verschiedenen Zahnerkrankungen und zahnärztlichen Eingriffen resultiert, verbunden sind.

Tetrodotoxin, welches für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, kann aus Kugelfischorganen gewonnen werden. Eine ausführliche Beschreibung der Herstellung von Tetrodotoxin und Derivaten davon wird in der am 18. September 2000 eingereichten, chinesischen Patentanmeldung Nr. 00124516.3 bereitgestellt.

Formulierung und Dosierungen von Tetrodotoxin und Saxitoxin

Zur Verwendung im Zahnbereich werden Tetrodotoxin und/oder Saxitoxin normalerweise in einer wässrigen Lösung verabreicht. Normalerweise wird der aktive Bestandteil Tetrodotoxin oder Saxitoxin in geläutertes Wasser oder eine physiologische Salzlösung als Hauptvehikel formuliert. Es ist jedoch zu erkennen, dass die Dentalformulierung andere Komponenten enthalten kann, welche Puffermittel zur Aufrechterhaltung oder Einstellung des pH-Wertes, wie beispielsweise Acetatpuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer und Boratpuffer, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein; die Verabreichung von Tetrodotoxin wurde bei etlichen Tierarten gründlich untersucht, und die tödliche, orale Dosis beim Menschen wurde auf etwa 10 bis 18 μg/kg geschätzt. Für eine 70 kg schwere Person wäre die tödliche Dosis daher 0,7 bis 1,26 mg.

Bei den Versuchen, die zur Unterstützung der zuvor beschriebenen, vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde eine 20-μL-Teilmenge von 1 mM, 1,25 mM, 2,5 mM, 5 mM oder 10mM Tetrodotoxin topisch in die Zahnmarkhöhle von Kaninchen verabreicht. Dies entspricht einer Dosis von zwischen 6,4 und 64 μg Tetrodotoxin. Wenn das Tetrodotoxin in 10 μL verabreicht wird, liegt die Tetrodotoxindosis im Bereich von 3,2 bis 32 μg. Diese Dosen sind beträchtlich unter der tödlichen, oralen Dosis für den Menschen und ergeben eine ausreichende Sicherheitstoleranz, um jegliche Unterschiede bei der systemischen Aufnahme zwischen topischer und oraler Verabreichung zu berücksichtigen.

Es ist zu erkennen, dass die Dosierung und Konzentration des Tetrodotoxins oder Saxitoxins, das verabreicht wird, auf individueller Basis bestimmt wird, wobei solche Faktoren, wie das Alter und Körpergewicht des Patienten, sowie der Applikationsweg und die klinischen Erfordernisse hinsichtlich der Schmerzstillung und Betäubung, berücksichtigt werden.

Der Natriumkanalblocker, vorzugsweise Tetrodotoxin oder Saxitoxin, wird im schmerzenden Zahnbereich durch Anwenden einer Formulierung mit einer Tetrodotoxin- oder Saxitoxinkonzentration von zwischen etwa 1 und 10 mM normalerweise topisch verabreicht. Die tatsächliche Tetrodotoxin- oder Saxitoxindosis, die verabreicht wird, hängt natürlich von der Formulierung, die angewendet wird, und der Oberfläche, auf die sie angewendet wird, ab.

Aus den vorstehenden Ausführungen ist zu erkennen, wie verschiedene Merkmale und Ziele der Erfindung erreicht werden können. Das Verfahren der Erfindung stellt eine effektive, lang dauernde, örtliche Schmerzstillung und Betäubung durch topische Verabreichung einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung in einem schmerzenden Zahnbereich bereit. Die folgenden Beispiele veranschaulichen unter Verwendung eines Versuchs mit Kaninchen, dass eine einzige Dosis Tetrodotoxin bei einer Konzentration zwischen 1 mM und 10 mM eine wirksame, örtliche Schmerzstillung und Betäubung erreicht. Der Grad und die Dauer der Wirkungen hängen von der Tetrodotoxinkonzentration ab.

Für den Fachmann ist zu erkennen, dass jede der lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindungen gemäß den Verfahren und Prozeduren, die hierin beschrieben werden, verwendet werden können, um pharmazeutisch oder dental effektive Dosen und andere Aspekte der Erfindung zu bestimmen.

Synergistische Zusammensetzungen der Erfindung umfassen wenigstens eine Verbindung, die sich speziell an die SS1- oder die SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, zusammen mit wenigstens einem herkömmlichen, örtlichen Betäubungsmittel. In solchen synergistischen Verbindungen ist die Verbindung, welche sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, vorzugsweise Saxitoxin oder Tetrodotoxin und insbesondere Tetrodotoxin.

Das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel ist eine Natriumkanalblockierverbindung, vorzugsweise Tetracain. In den Zusammensetzungen der Erfindung ist die Verbindung, welche sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, normalerweise in einer Menge von 1 bis 10 mM und vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 3 mM gegenwärtig. Das herkömmliche Betäubungsmittel ist normalerweise in einer Menge gegenwärtig, welche ein halbes bis zwei Mal ihre effektive Konzentration darstellt, für gewöhnlich eine Menge von 0,2 bis 5 Gewichtsprozent der Zusammensetzung. In Abhängigkeit von den Komponenten, welche als die SS1- oder SS2-Bindungsbestandteile und als das örtliche Betäubungsmittel gewählt werden, kann die Zusammensetzung durch Mischen der Bestandteile unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt werden, oder sie kann gemischt und dann für eine spätere Verabreichung aufbewahrt werden. Diese Wahl hängt zum Teil davon ab, welcher pH-Wert jedem Bestandteil eine gute Stabilität verleiht. Bestandteile, welche sehr unterschiedliche pH-Werte für eine langfristige Stabilität benötigen, sollten unmittelbar vor der Verabreichung gemischt werden.

BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen zwar die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, ohne aber die Erfindung auf irgendeine Weise beschränken zu wollen.
Tiere
Weiße Neuseeland-Kaninchen, die vom Tierzentrum der Universität Peking, Peking, VR China, gekauft wurden.
Materialien
Tetrodotoxin, Reinstoff, Lösemittel; Acetatpuffer, bereitgestellt durch Nanning Maple Pharmaceutical Co., Ltd. (Nanning, Guangxi, VR China).
Vorrichtung
CSI60-Hochgeschwindigkeitszahnbohrer, Shanghai Dental Appliance Factory (Shanghai, VR China); SEN-7103-Elektrostimulator, Nihon Kohden, Japan.
Die Textrodotoxinlösung wurde in einem Acetatpuffer (pH 4,0) aufgelöst und vor jedem Versuch hergestellt.
Verfahren
Die Versuche wurden gemäß dem Verfahren durchgeführt, das durch Voges et al. entwickelt wurde. Die Spannung, die das Kaninchen veranlasste, das erste Mal zu lecken, wurde als die schmerzauslösende Schwellenspannung definiert. Die Elektrostimulationsspannung wurde bei 0 V gestartet und stufenweise um jeweils 0,25 Volt erhöht, bis die schmerzauslösende Schwellenspannung festgestellt wurde. Die schmerzstillenden und narkotisierenden Wirkungen wurden durch die prozentuale Änderung der Schwellenspannung vor und nach der Verabreichung der Medikamente ausgewertet:
Versuchsbeispiel 1 – Wirkung der topischen Verabreichung von Tetrodotoxin bei Schmerz, der durch Zahnmarkreizung ausgelöst wird
60 weiße Neuseeland-Kaninchen wurden willkürlich in sechs Gruppen aufgeteilt, die mit Acetatpuffer (als Lösemittelkontrolle) oder TTX bei 1 mM, 1,25 m, 2,5 m, 5 mM beziehungsweise 10 mM zu behandeln waren. Die Versuchsmedikamente wurden durch eine Injektion von 20 μL in die Zahnmarkhöhle gespritzt. Die Zahnmarkhöhle wurde durch Durchbohren des Zahns erreicht. Die schmerzauslösende Schwellenspannung wurde vor der Verabreichung von Medikamenten und dann 10 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 8 Stunden nach der Verabreichung wieder gemessen. Die Ergebnisse wurden als mittlere, prozentuale Änderung der schmerzauslösenden Schwellenspannung ± Standardabweichung dargestellt und in Tabelle 1 tabellarisch zusammengestellt.
Die Ergebnisse zeigten an, dass sich die Schwellenspannungen bei den Kaninchen, welchen die Acetatpufferlösung verabreicht worden war, nicht merklich änderten. TTX bei allen fünf Konzentrationen erhöhte die Schmerzschwellenspannung erheblich, was deutlich eine konzentrationsabhängige Beziehung zeigt. TTX bei 1 mM erzeugte eine verhältnismäßig schwache Wirkung (p < 0,001, F = 32,55), während TTX bei 10 mM die stärkste Wirkung erzeugte (p < 0,0001, F = 91,51) . Bei den drei anderen Gruppen erhöhten sich die Schwellenspannungen jeweils bedeutend (p < 0,0001, F-Werte waren 107,13, 75,31 beziehungsweise 102,44). Die Wirkung von TTX, welche die Schwellenspannung erhöhte, setzte 5 Minuten nach Verabreichen der Dosis ein, und eine Spitze wurde 1 Stunde nach Verabreichen der Dosis erreicht.
Unter der Annahme, dass eine 50%-ige oder stärkere Zunahme der Schwellenspannung wirksam ist, zeigten die Ergebnisse, dass die schmerzstillende Wirkung von TTX bei 10 mM über 6 Stunden; TTX bei 5 mM 4 Stunden; TTX bei 2,5 mM 2 Stunden und TTX bei 1,25 mM nur 1 Stunde andauerte.
Die Leistungsfähigkeit von TTX nahm bei zunehmender Konzentration von TTX bei 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Verabreichen der Dosis merklich zu, und TTX bei 10 mM erzeugte die stärkste Wirkung (p < 0,0001). TTX bei 1 mM zeigte eine beträchtliche Wirkung zu drei Zeitpunkten mit Ausnahme von 120 Minuten nach Verabreichen der Dosis (p < 0,001, 0,01 beziehungsweise 0,05). Die Ergebnisse in Tabelle 1 und 1 legten auch nahe, dass die Dauer der Wirksamkeit von TTX ebenfalls konzentrationsabhängig war.
Versuchsbeispiel 2 – Bestimmung der mittleren, effektiven Konzentration (EC₅₀) von TTX
Eine 50%-ige Zunahme der Schwellenspannung wurde als ein Kriterium für eine effektive, örtliche Schmerzstillung angesehen. Es wurde ein vereinfachtes Probiteinheitsverfahren zur Untersuchung und Bestimmung der EC₅₀ von TTX für die örtliche Zahnschmerzstillung verwendet.
Dreißig Kaninchen wurden in drei Gruppen, bestehend aus jeweils 10 Kaninchen, aufgeteilt und erhielten TTX bei 1 mM, 1,125 mM beziehungsweise 1,25 mM durch eine Injektion von 20 μL in die Zahnmarkhöhle verabreicht. Die Schmerzschwellenspannungen bei den Kaninchen wurden vor Verabreichen der Dosis und zu Zeitpunkten von bis zu 2 Stunden nach Verabreichen der Dosis gemessen, und es wurden die prozentualen Änderungen berechnet. Effektive Schmerzmittel sollten als erreicht gelten, wenn das TTX die Schwellenspannung zu jedem Zeitpunkt um 50% oder mehr erhöhte. Die positiven Ansprechraten, die berechnet wurden, betrugen 30% für TTX bei 1 mM, 80% für TTX bei 1,125 mM und 100% für TTX bei 1,25 mM. Der EC₅₀-Wert von TTX und 95% Konfidenzintervall, basierend auf dem vereinfachten Probiteinheitsverfahren, betrug 1,04 ± 0,03 mM.
Versuchsbeispiel 3 – Vergleich der örtlichen, schmerzstillenden Wirkung von TTX und drei herkömmlichen, klinischen Betäubungsmitteln
Drei herkömmliche, klinische Betäubungsmittel, nämlich Lidocain, Procain und Tetracain, wurden zum Vergleich mit TTX ausgewählt. Es wurden dieselben Tierversuche in diesem Experiment verwendet. Die Kaninchen wurden in sechs Gruppen zu je 10 aufgeteilt und erhielten Acetatpuffer (Lösemittelkontrolle), TTX bei 1 mM, TTX bei 1,25 mM, 2% Lidocainchlorid (entspricht 74 mM) beziehungsweise 1% Tetracain (entspricht 33 mM) durch eine Injektion von 20 μL in die Zahnmarkhöhle verabreicht. Die Schwellenspannung wurde vor Verabreichen der Dosis und an sechs Zeitpunkten innerhalb 1 Stunde nach Verabreichen der Dosis gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigten an, dass 2% Procain, das ähnlich wirkte, wie die Lösemittelkontrolle, keine klare Wirkung auf die Schwellenspannung bei den Kaninchen hatte (p > 0,05, F = 0,15). 2% Lidocain und 1% Tetracain wirkten ähnlich, indem sie die Schwellenspannung im Vergleich zur Lösemittelkontrolle merklich erhöhten, p > 0,01, F = 10,09 beziehungsweise p < 0,001, F = 23,43. Die Wirkungen von Lidocain und Tetracain näherten sich jenen von TTX bei 1 mM (p > 0,05, F = 0,0007 beziehungsweise 0,077) an, waren aber schwächer als jene von TTX bei 1,25 mM (p < 0,01, F = 13,6 beziehungsweise p < 0,001, F = 18,5). TABELLE 2 – Vergleich der Wirkungen von TTX und drei örtlichen Betäubungsmitteln
Der Vergleich zwischen den Differenzgruppen basierte auf der Varianzanalyse für mehrere Messungen.
Versuchsbeispiel 4 – Toxizität von TTX durch topische Verabreichung
Klinische Anzeichen von TTX-Toxizität durch topische Verabreichung
Es wurden keine Todesfälle oder negativen, klinischen Anzeichen bei den Kaninchen, welche bei allen Versuchen TTX in Konzentrationen im Bereich von 1 mM bis 20 mM verabreicht erhielten, festgestellt. Nur 4 von 10 Kaninchen, die TTX bei 10 mM erhielten, zeigten eine verstärke Exkretion im Atmungstrakt.
Wirkung von TTX durch topische Verabreichung auf die Herzfrequenz, die Atemfrequenz und das EKG der Kaninchen
Fünf Kaninchen wurden mit 3% Natriumpentobarbital (30 mg/kg, iv) betäubt, dann bewegungsunfähig gemacht und an einen Elektrokardiographen angeschlossen. Die Herzfrequenz, die Atemfrequenz und das EKG wurden aufgezeichnet. Dann wurden den Kaninchen 20 μL TTX bei 20 mM in einer Injektion in das Mark eines Zahns gespritzt. Dieselben Parameter wurden bei 15, 30, 60, 120, 240 und 360 Minuten nach Verabreichen der Dosis gemessen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 3 dargestellt sind, zeigten an, dass eine Injektion von 20 μL TTX bei 20 mM die Herzfrequenz oder die Atemfrequenz der Kaninchen innerhalb von 6 Stunden nicht wesentlich änderten (p > 0,05). Das EKG legte auch keine bedeutende Wirkung von TTX nahe (p > 0,05).
Blutbiochemische Wirkungen von Tetrodotoxin durch topische Verabreichung
Acht Kaninchen wurden in zwei Gruppen unterteilt; eine Gruppe mit akuter Dosierung und eine Gruppe mit chronischer Dosierung. Jedes Kaninchen in der Gruppe mit akuter Dosierung wurde mit 3% Natriumpentobarbital (30 mg/kg, iv) betäubt und auf einem Operationstisch bewegungsunfähig gemacht. Eine 3-mL-Blutprobe wurde dem Herz entnommen, wobei 1 mL zur Analyse des Blutzelleninhalts und 2 mL zur Messung von blutbiochemischen Parametern verwendet wurden. Anschließend wurden 20 μL von TTX bei 20 mM durch eine Injektion in die Zahnmarkhöhle gespritzt, und 1 Stunde nach Verabreichen der Dosis wurde dem Herz erneut eine Blutprobe (3 mL) entnommen. Für die Gruppe mit chronischer Dosierung wurde den Kaninchen 4 Tage lang TTX bei 20 mM durch eine Injektion von 20 μL pro Tag in die Zahnmarkhöhle eingespritzt. Nach der letzten Verabreichung wurden die Kaninchen wieder betäubt, um dem Herz Blutproben zu entnehmen. Alle Blutproben wurden unter Verwendung von klinischen Standard-Blutanalyseverfahren am selben Tag untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabellen 4, 5 und 6 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigten an, dass TTX bei 20 mM, das einmal oder über 4 aufeinander folgende Tage verabreicht wurde, keine bedeutende Wirkung auf die blutzellulären und -biochemischen Parameter der Kaninchen hatten.
Versuchsbeispiel 5 – Synergistische Aktivität von TTX und einem anderen, örtlichen Betäubungsmittel
Die Kaninchen wurden in 7 Gruppen aufgeteilt und erhielten TTX bei 1 mM, 2% Lidocain, 1% Tetracain, TTX + Lidocain (zuerst wurde TTX bei 1 mM verabreicht und 10 Minuten später Lidocain), Lidocain + TTX (zuerst wurden 2% Lidocain verabreicht und 10 Minuten später TTX bei 1 mM), TTX + Tetracain (zuerst wurde TTX bei 1 mM verabreicht und 10 Minuten später 1% Tetracain) und Tetracain + TTX (zuerst wurde 1% Tetracain verabreicht und 10 Minuten später TTX) durch eine Injektion von 20 μL in die Zahnmarkhöhle eingespritzt. Die Schwellenspannung wurde vor Verabreichen der Dosis und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verabreichen der Dosis gemessen. Die prozentuale Änderung der Schwellenspannung wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 und 2 dargestellt.
Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigten, dass Tetracain + TTX eine wesentlich stärkere Wirkung als TTX bei 1 mM allein (p < 0,001, F = 23,85) oder 1% Tetracain allein (p < 0,001, F = 23,5) erzeugten. Das Ergebnis war sogar stärker als die Summe der beiden Letzteren. Lidocain zeigte keine ähnliche, synergistische Aktivität mit TTX. Die Wirkung von Tetracain + TTX währte 90 Minuten, die längste Dauer aller Gruppen.
Um festzustellen, ob die positive, synergistische Wirkung von TTX und Tetracain, wenn zusammen verabreicht, zu beobachten ist, wird der folgende Versuch durchgeführt:
Das Versuchsmaterial und die Tierversuche sind dieselben wie zuvor.
Feststellen der Schwellenspannungen von Tetracain bei Konzentrationen von 1%, 0,1% und 0,01% durch Reizung des Zahnmarks der Versuchskaninchen: Die Wirkung von Tetracain gilt als positiv, wenn sich die Schwellenspannung um 30% erhöht. Die Mindestkonzentration von Tetracain, welche eine derartige Erhöhung der Schwellenspannung bewirkt, wird als die effektive Konzentration Ce definiert. Getrenntes Feststellen der Wirkung des Verabreichens von 10 μL TTX bei 1 mM auf die Schwellenspannung und der Dauer der Wirkung.
Mischen von 10 μL TTX bei 1 mM mit 10 μL Tetracain bei einer Konzentration von 2 × Ce und Verabreichen der Mischung in einer Injektion in das Zahnmark der Kaninchen und Beobachten der Wirkung der Formulierung auf die Schwellenspannung und die Dauer der Zunahme der Schwellenspannung: Die Beobachtung einer Zunahme der Schwellenspannung oder der Dauer der Betäubung oder von beidem gegenüber den Additionseffekten von Tetracain bei Ce und TTX bei 10 mM allein weist auf eine synergistische Wirkung hin.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung erwähnt wurden, werden hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und durch Erwähnung hierin für alle Zwecke aufgenommen.
Obwohl die Erfindung in Bezug auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurde, ist für den Fachmann zu erkennen, dass viele Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne sich vom Geist und Rahmen der Erfindung zu entfernen.
Bezugsquellen

1. Du, P. und Yan, Y.J., Effect and Pharmacological Action of Tetrodoxin on Sodium Channel, China Marine Drugs, 1–2: S. 49–50 (1988).
2. Schwartz, D.M. et al., Tetrodoxin: Anesthetic Activity in the De-epithelialized Cornea, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 236(10): S. 790–4 (1998).
3. Schwartz, D.M. et al., Experimental Use of Tetrodotoxin for Corneal Pain After Excimer Laser Keratectomy, Cornea 17(2): S. 196–199 (1998).
4. Vogel, H.G. und Vogel, W.H., Drug discovery and evaluation-pharmacological Essays, Springer, Berlin, S. 374–75 (1997).
5. Xu, J.G., Molecular Biology of Foreign Medical Science, 26: S. 1655 (1987).
6. Liu, Z.C. und Yu, S.Y (Editors-in-Chief), Nutrition and Food Hygiene, 2^nd Edition, People's Hygiene Publishing Services, Beijing (1984).
7. Chen, Y.C. und Yuan, S.L., Research and Utilization of Toxins, Compilation of Theses of China Biochemistry Society Seminars, Vol.4, Sciences Publishing Services, Beijing (1988).

Zusammenfassung
Diese hier aufgeführte Erfindung bezieht sich auf einen neuen Prozess zur Extraktion von Tetrodotoxin aus dem Gewebe eines Organismus. Die Erfindung bietet einen erhöhten Ertrag an Tetrodotoxin aus tierischem Gewebe.

Claims

Verfahren zum Bewirken von örtlicher Schmerzstillung oder Betäubung im Nervengewebe eines Säugetiers, welches Schmerz empfindet, der durch Beschädigung oder Reizung des Nervengewebes verursacht ist, umfassend topisches Verabreichen ins Nervengewebe des Säugetiers einer anästhetisch und analgetisch effektiven Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche eine Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, und ein pharmazeutisch geeignetes Vehikel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nervengewebebereich ein Zahnmarkbereich, ein Hirnnervenbereich oder ein Hüftnervenbereich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nervengewebebereich der Zahnmarkbereich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die effektive Dosis keine toxischen oder irreversiblen Nebenwirkungen erzeugt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Tetrodotoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die effektive Dosis bei einer Tetrodotoxinkonzentration von 1 mM bis 20 mM verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die effektive Dosis von Tetrodotoxin für einen Zeitraum von 0,5 bis 7 Stunden örtliche Betäubung und Schmerzstillung im Nervengewebebereich bewirkt.
Verfahren zum Bewirken von örtlicher Schmerzstillung oder Betäubung, umfassend das Verabreichen einer effektiven Menge einer Formulierung, welche eine herkömmliche, örtliche Betäubungsmittelverbindung und eine Verbindung, welche sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die herkömmliche, örtliche Betäubungsmittelverbindung Tetracain ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Tetrodotoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Tetrodotoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die herkömmliche, örtliche Betäubungsmittelverbindung eine Natriumkanalblockierverbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Tetrodotoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Tetracain bei einer Konzentration von 0,1% bis 5% verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das herkömmliche Betäubungsmittel zur Natriumkanalblockierung bei einer Konzentration von 0,1% bis 5% verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung wenigstens eine Verbindung umfasst, welche Tetrodotoxin, Anhydrotetrodotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin, Ethoxytetrodotoxin, Deoxytetrodotoxin oder Tetrodonsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Saxitoxin ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Saxitoxin in einer Konzentration im Bereich von 1 mM bis 20 mM verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Saxitoxin eine Verbindung ist, welche einen Tetrahydropurinanteil bestehend aus zwei Guanidineinheiten, die zu einer stabilen Azaketalbindung vereinigt sind, umfasst und eine Molekularformel C₁₀H₁₇N₇O₄ aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Saxitoxin Hydrosaxitoxin oder Nevsaxitoxin ist.
Zusammensetzung, umfassend eine herkömmliche Betäubungsmittelverbindung und eine Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, Tetrodotoxin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel Tetracain ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel Tetracain ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, in einer Menge von 1 bis 10 mM gegenwärtig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung, die sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet, in einer Menge von 1 bis 3 mM gegenwärtig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel in einer Menge von 0,2 bis 5 Gewichtsprozent der Zusammensetzung gegenwärtig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel in einer Menge der Ce des herkömmlichen Betäubungsmittels gegenwärtig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das herkömmliche, örtliche Betäubungsmittel in einer Menge der Ce des herkömmlichen Betäubungsmittels gegenwärtig ist.