DE102004048391B4

DE102004048391B4 - Typ-PepT1-Protein-Assay

Info

Publication number: DE102004048391B4
Application number: DE102004048391A
Authority: DE
Inventors: Natalie Dr. Watzke; Renate Dr. Gauß; Maarten Dr. Ruitenberg; Béla Dr. Kelety; Wolfgang Dr. Dörner; Joanna Tobien
Original assignee: Iongate Biosciences GmbH
Current assignee: Iongate Biosciences GmbH
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2004-10-01
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2024-10-02
Also published as: US20080248486A1; DE102004048391A1; WO2006037573B1; WO2006037573A1; EP1797434A1

Abstract

Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoff komplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines PepT1-Proteins enthält, mit den Schritten:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-PepT1-Protein enthaltenden Wirkortkomplex in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Anlagerungspuffer, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Anlagerungspuffer und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt- und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon und
(e) Bestimmen des qualitativen oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion...

Description

Die Erfindung betrifft einen Typ-PepT1-Protein-Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Substrats und/oder Modulatoren eines Typ-PepT1-Proteins.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, welches ein Substrat des Typ-PepT1-Proteins ist, oder durch Konjugation mit einem Substrat für ein Typ-PepT1-Protein zu einem solchen Substrat gemacht wurde, einen Testkit zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens, ein Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Testkits sowie des Arzneimittels.

Die rasanten Fortschritte in der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung bewirken ein rasches Ansteigen der Anzahl von potentiell zur Verfügung stehenden therapeutischen Mitteln. Es ist jedoch noch immer sehr häufig ein großes Problem, die entsprechenden Mittel so zu formulieren, dass sie oral gut bioverfügbar sind, d.h. bei oraler Aufnahme vom Körper hinreichend gut aufgenommen werden, um eine optimale Wirksamkeit bzw. Verträglichkeit zu sichern.

Natürliche Transportproteine spielen bei der Aufnahme unterschiedlichster Moleküle z.B. aus dem Darm eine wichtige Rolle.

Polare oder hydrophile Verbindungen werden im Darm meist nur schlecht absorbiert, da deren Transport über die Zellmembran energetisch ungünstig ist, und einen Energieaufwand bedingt. Aminosäuren, Di- und Tripeptide, Monosaccharide, Vitamine Nukleoside usw. sind solche polaren Verbindungen, deren Aufnahme für den Organismus jedoch essentiell ist. Für solche Substanzen gibt es zumeist spezifische Transportsysteme.

In Säugern wurden bisher zwei Peptidtransporter PepT1 und PepT2 nachgewiesen. PepT1 wird im Dünndarm, der Niere, dem Gallengang und der Pankreas exprimiert, während PepT2 in der Niere, dem Zentralnervensystem (ZNS), dem peripheren Nervensystem (PNS), der Lunge, der Brustdrüse, der Milz, dem Dickdarm und der Pankreas exprimiert wird (Übersicht bei Rubio-Aliaga & Daniel 2002).

Anfang der 1960er Jahre gelang der Nachweis der aktiven Aufnahme von Gly-Gly in intestinale Epithelzellen (Newey & Smyth 1962). Der Carrier ist von einem zelleinwärts gerichteten H+-Gradienten abhängig (Ganapathy & Leibach 1985). Er wird vom Membranpotential stimuliert, ist sättigbar und elektrogen. Durch Expressionsklonierung in Xenopus laevis Oocyten gelang es Mitte der 1990er Jahre, die Primärstruktur zunächst für den intestinalen Peptidtransporter (PepT1) und kurz darauf für die renale Isoform (PepT2) aufzuklären (Fei et al. 1994; Boll et al. 1996). Aus der großen Anzahl seiner strukturell diversen natürlichen Substrate (8400 Di- oder Tripeptide) resultiert, dass die Substratspezifität der Peptidtransporter nicht stark ausgeprägt ist.

So zeigten schon Anfang der 1970er Jahre einige Arbeiten, dass der Transporter neben seinen natürlichen Substraten auch β-Lactamantibiotika, die eine tripeptidtähnliche Struktur besitzen, erkennt (Quay 1972). Somit wird das Peptidtransportsystem für die pharmazeutische Industrie interessant, da mit dessen Hilfe die orale Applikation von Peptidpharmaka ermöglicht werden kann.

Aus den bisherigen Untersuchungen über die Substratspezifität des intestinalen H+/Peptidsymporters konnten wenige und zum Teil auch widersprüchliche Aussagen über die Faktoren für eine optimale Erkennung durch den Transporter abgeleitet werden.

Lange Zeit wurde die Peptidbindung und ein freier N- und C-Terminus für eine optimale Interaktion zwischen Substrat und Transporter als notwendig erachtet. Neuere Erkenntnisse geben Anlass zur Revision dieser Ansicht. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass der Peptidtransporter eine Ketomethylengruppierung (Döring et al. 1998a) oder eine Esterbindung (Ganapathy, M. E. et al. 1998) anstatt einer Peptidbindung mit ähnlicher Affinität erkennt.

In der Literatur über Inhibitoren des Peptidtransporters wurden bisher entweder widersprüchliche Ergebnisse publiziert (Taub et al. 1997; Abe et al. 1999; Yang et al. 2002) oder der beschriebene Inhibitor zeigte nur eine geringe Affinität zum Transporter (4-Aminomethylbenzoesäure: Meredith et al. 1998).

Darüber hinaus werden vom Transporter zum Teil auch voluminöse Blockierungsgruppen mit relativ geringer Affinitätserniedrigung toleriert. Neben der Identifizierung von Inhibitoren ergibt sich auch die Möglichkeit, Prodrugs zu entwickeln, in dem z.B. oral nicht verfügbare Medikamente an die Seitenkette des Dipeptids gekoppelt werden.

Da PepT1, nicht aber PepT2 im Darm exprimiert wird, haben sich die heutigen Bemühungen darauf gerichtet, die orale Verfügbarkeit von Arzneimitteln zu verbessern, in dem pharmakologische Mittel gesucht wurden, die Substrate für PepT1 sind bzw. so modifiziert werden können, dass sie von PepT1 erkannt und transportiert werden können.

Im Stand der Technik sind unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.

Es ist dabei wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. am PepT1-Protein, an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.

Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.

Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfälligkeit zukommen.

Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.

Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp-Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung zugänglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.

Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile aufweisen. Darüberhinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.

Ein besonders günstiges Verfahren zum Messen von elektrochemischen Vorgängen an beispielsweise Membranfragmenten wird in der WO 02/074983 beschrieben, auf die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung vollinhaltlich Bezug genommen wird. Eine Verwendung des dort offenbarten Verfahrens zur Testung an Typ-PepT1-Proteinen wird nicht offenbart.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-PepT1-Protein-Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.

Gelöst werden diese und weitere Aufgaben, die sich zwanglos aus dem eingangs diskutierten Stand der Technik ergeben, durch ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes mit allen Merkmalen des Anspruchs 1.

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 20, ein Screeningverfahren gemäß Anspruch 21, sowie Verwendungen des Verfahrens und des Testkits gemäß den Ansprüchen 22 bzw. 23 Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche.

Im Transportzyklus von PepT1 wird (werden) jeweils 1 (nach neuesten Erkentnissen möglicherweise 2) Proton(en) zusammen mit 1 Substratmolekül, natürlicherweise im Darm normalerweise 1 kleinen Peptid, insbesondere 1 Di- oder Tripeptid, über die Membran verschoben.

Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, die entstehende Ladungsverschiebung – also den Ionentransport von Protonen und/oder von geladenen Substraten wie z.B. Di- oder Tripeptiden oder auch von elektrisch ungeladenen Substraten – direkt durch Anbindung von Enzympräparationen auf einer geeigneten Oberfläche, die in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein Substratsprung durchgeführt werden kann, als elektrischen Strom oder als elektrische Potentialänderung zu messen und/oder den Einfluss verschiedener Substanzen auf die elektrischen Messgrößen Strom oder Potenzial zu untersuchen.

Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren von potentiellen Substraten und/oder Inhibitoren/Aktivatoren eines Typ-PepT1-Proteins, welche eine enzymatische Eigenschaft und/oder das Transportverhalten des Typ-PepT1-Proteins oder eines Teils davon enthält, modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren weist folgende Schritte auf:

(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-PepT1 Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in den Anlagerungspuffer, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Anlagerungspuffer und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt-Bringen und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon, und
(e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger, dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine zweite nicht-aktivierende Lösung, enthaltend einen Kompensator, und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine dritte oder aktivierende Lösung und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei die dritte oder aktivierende Lösung der zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-PepT1-Proteins sowie den Kompensator enthält.

Die erfindungsgemäßen Schritte (f) und (g) werden – ggf. mit Wiederholungen – bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.

Besonders günstig kann es sein, wenn vor Schritt (f) einmal ein Schritt (f') durchgeführt wird, wobei statt mit nicht-aktivierender Lösung mit einem Anlagerungspuffer inkubiert wird, wobei der Anlagerungspuffer der nicht-aktivierenden Lösung entspricht, wobei jedoch der Kompensator nicht in der Lösung enthalten ist.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff nur in der aktivierenden Lösung vorhanden sein, nicht jedoch in der nicht-aktivierenden Lösung.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ-PepT1-Protein aktiviert/inhibiert, kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.

Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines PepT1-Proteins verwendet.

Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck „Typ-PepT1-Protein", daß das Protein die typischen Charakteristika des PepT1-Proteins aufweist. Insbesondere werden darunter Proteine verstanden, die in ihren Transport- und Substraterkennungseigenschaften sowie ihrer Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren und Aktivatoren dem PepT1-Protein oder der renalen Isoform PepT2 ähneln oder entsprechen. Beide Isoformen sind im vorliegenden Testsystem einfach einsetzbar.

Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet wird, welcher auf einem Typ-PepT1-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus Dünndarm, Niere, Gallengang oder Pankreas, oder hieraus abgeleitet ist.

Insbesondere stammt das Typ-PepT1-Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt kloniert vor.

In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex (enthaltend das Typ-PepT1-Protein) aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzymatische Eigenschaft" des Typ-PepT1-Proteins immer das Transportverhalten, z.B. den durch diese Proteine vermittelten Peptid- bzw. Protonentransport, und nimmt damit auch Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeutet, daß wo von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, Untersuchungen erfindungsgemäß umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-PepT1-Protein transportiert wird und/oder ob ein bestimmter Stoff die Transporteigenschaften des Typ-PepT1-Proteins modifiziert, also ein erfindungsgemäßer Modulator des Typ-PepT1-Proteins ist.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck Wirkstoffkomplex entweder ein potentielles Substrat, dessen Transport via dem Typ-PepT1-Protein untersucht werden soll, oder einen sogenannten Modulator, der beispielsweise den Transport vorher bestimmter Substrate inhibiert oder aktiviert.

Erfindungsgmäß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/oder (d), gegebenenfalls auch (f), (f') und/oder (g) mittels

– Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
– Austauschen oder Zumischen der Messlösung oder eines Teils davon und/oder
– chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren der Messlösung oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon

durchzuführen.

Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in die Messlösung hinein zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach die jeweilige Messlösung ausgetauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren in der Messlösung freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von Strahlung erfolgen.

Der qualitative Einfluss und/oder der quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-PepT1-Protein vermittelt wird.

Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Meßreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-PepT1-Proteins.

Wie in der WO02/074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirkortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert.

Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen vielfältige Möglichkeiten.

Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber der Messlösung und gegenüber den Primärträgern elektrisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.

Im Hinblick auf die Primärträger, welche den Wirkortkomplex und insbesondere die Typ-PepT1-Proteine im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen werden kann.

Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an, dass als Primärträger jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet wird.

Es ist auch möglich, dass als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht-sphärische Struktur.

Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß von der Messlösung umströmt oder angeströmt wird. Auf diese Art und Weise lässt sich durch Wechsel der Messlösung zum Beispiel ein Konzentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung die erfindungsgemäßen Versuchsbedingungen einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettiervorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.

Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen der Messlösung, ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.

Wichtig ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht-aktivierender zu aktivierender Lösung in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.

Potentielle zu testende Modulatoren sind insbesondere bevorzugt monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper und Peptide. Es können jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, daß sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.

Besonders bevorzugte Substanzen, die als mögliche potentielle Substrate und/oder Modulatoren in dem erfindungsgemäßen Testsystem untersucht werden können, sind niedermolekulare Verbindungen. Solche Verbindungen haben oft keine oder nur geringe Nebenwirkungen, wenn sie als aktives Prinzip in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil solcher Substanzen ist die Möglichkeit der oralen Verabreichung.

Beispiele hierfür sind cyclische Pentapeptide, wie sie von Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7641–7472, beschrieben wurden. Erfindungsgemäß werden den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosäureanaloga, Steroide, Nukleotide und weitere organisch-chemische Stoffe mit einem Molekulargewicht von ≤ 5000, bevorzugt ≤ 3000 und besonders bevorzugt ≤ 2000 zugerechnet.

Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Anlagerungspuffer, in der nicht-aktivierenden als auch in der aktivierenden Messlösung zugesetzt oder dort freigesetzt werden.

Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primärträger mit dem Wirkstoffkomplex denkbar.

Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine [Wasch]Lösung, welche bevorzugt mit dem Anlagerungspuffer identisch ist.

Erfindungsgemäß werden wässrige Messlösungen und insbesondere wässrige Elektrolytlösungen als Messlösung verwendet, die als Anlagerungspuffer, nicht-aktivierende sowie aktivierende Lösung bezeichnet werden.

Alle verwendeten Messlösungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH-Wert stabilisierendes Mittel, bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u.a., wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbüchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Erfindungsgemäß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6–8, bevorzugt etwa 7 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex) abhängen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.

Der Anlagerungspuffer umfasst mindestens eine Kationenspezies, bevorzugt ausgewählt aus der Liste bestehend aus K+, Ca++, Na+, Li+, Mg++, Cholin+, Rb+, Sr++ in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Kation-Konzentration in der nicht-aktivierenden und in der aktivierenden Lösung.

Die Abk. "M", "mM" und "μM" stehen im Folgenden für die Einheiten mol/l, mmol/l bzw. μmol/l.

Beispielsweise kann diese Konzentration zwischen 1 μM und 1 M liegen, bevorzugt zwischen 10 und 200 mM, besonders bevorzugt zwischen 120–160 mM.

Die nicht-aktivierende Lösung enthält ebenfalls mindestens eine Kationenspezies in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Kationen Konzentration im Anlagerungspuffer.

Es handelt es sich bevorzugt um ein Kation der für den Anlagerungspuffer beschriebenen Liste, bevorzugt entspricht es dem Kation oder den Kationen des Anlagerungspuffers.

Weiterhin kann die nicht-aktivierende Lösung gegebenenfalls einen Kompensator umfassen. Dieser Kompensator dient dazu, dass beim Wechsel von nicht-aktivierender Lösung zu aktivierender Lösung z.B. durch Änderung der Ionenstärke kein Wirkortunabhängiges, falsch-positives Signal detektiert wird.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Kompensator um eine Aminosäure, und besonders bevorzugt um die Aminosäure Glycin, wenn bei Inhibitionsmessungen in der aktivierenden Lösung als Substrat das Dipeptid Gly-Gly verwendet wird.

Insbesondere hängt die Art des verwendeten Kompensators von der Art des verwendeten Substrats ab.

Wird als Substrat ein Di- oder Tripeptid verwendet, so wird als Kompensator bevorzugt eine Aminosäure mit einem pK-Wert verwendet, der in etwa gleich dem p_i-Wert des Di- oder Tripeptids ist.

Bei den Untersuchungen zum potentiellen Transport von Zielmolekülen wird als Kompensator eine Säure oder eine Base eingesetzt, die einen pK-Wert aufweist, der in etwa dem des untersuchten Zielmoleküls entspricht.

Die Konzentration des Kompensators richtet sich im allgemeinen nach der Konzentration des Substrats, und liegt im allgemeinen zwischen 0 bis 100 mM. Im Prinzip wird die Konzentration des Kompensators so lange variiert, bis eine Wirkort-unabhängige elektrische Aktion infolge des Wechsels von nicht-aktivierender zu aktivierender Lösung nicht mehr auftritt.

Die aktivierende Lösung kann den Kompensator unabhängig davon enthalten, ob dieser in der nicht-aktivierenden Lösung enthalten ist.

Die aktivierende Lösung enthält ebenfalls mindestens eine Kationenspezies in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Kationen Konzentration im Anlagerungspuffer.

Es handelt es sich bevorzugt um ein Kation der für den Anlagerungspuffer beschriebenen Liste, bevorzugt entspricht es dem Kation oder den Kationen des Anlagerungspuffers. Desweiteren enthält sie ein Substrat des Typ-PepT1-Proteins, bevorzugt ein Di- oder Tripeptid, besonders bevorzugt Gly-Gly für Inhibitions- oder Aktivierungsmessungen.

Weitere mögliche Substrate sind beispielsweise Monosaccharide, Vitamine Nukleoside sowie beta-Lactam-Antibiotika und ähnlich aufgebaute Verbindungen. Insbesondere handelt es sich um peptidähnliche Verbindungen. Die Konzentration kann je nach Anwendung zwischen > 0 und 1 mol/l schwanken.

Die entsprechenden Konzentrationen können vom Fachmann leicht ermittelt werden.

Unter einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Kompensator auch in der aktivierenden Lösung vorhanden sein, wenn so ein besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis, d.h. dass Ausbleiben Wirkort-unabhängiger, falsch-positiver Signale beim Wechsel von nicht-aktivierender Lösung zu aktivierender Lösung erreicht werden kann.

Erfindungsgemäß geeignete Kationen sind alle Kationen, die (a) PepT1 nicht inhibieren und (b) keine Messartefakte auslösen.

Unter anderem ist von Zn und Cu bekannt, dass sie PepT1 inhibieren.

Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes. Dieser Testkit weist auf:

– mindestens einen Primärträger mit dem Typ-PepT1-Protein,
– einen Messbereich,
– gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Anlagerungspuffer, die nicht-aktivierende Lösung sowie die aktivierende Lösung und
– weiterhin mindestens einen potenziellen Wirkstoffkomplex.

Erfindungsgemäß wird gemäß Anspruch 2 auch ein Screeningverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren:

– eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,
– des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein Typ-PepT1-Protein enthält.

Des Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit erfindungsgemäß verwendet zum Auffinden von Modulatoren, d.h. Inhibitoren oder Aktivatoren, z.B. partiellen oder temporären Inhibitoren eines einen Typ eines PepT1-Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes.

Bevorzugt enthält der Wirkortkomplex das PepT1-Protein.

Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten weiter erläutert:
Darüber hinaus ist eine z. B. wässrige Messlösung vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber der Messlösung (aktivierende bzw. nicht-aktivierende Lösung), den Primärträgern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert.

Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.

Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des Trägers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstärke von etwa 10 bis 200 nm.

Das Typ-PepT1-Protein kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Veränderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.

Besonders vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträger.

Das Nämliche gilt auch für die in dem Primärträger vorgesehenen Wirkortkomplexe und das Typ-PepT1-Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ-PepT1-Protein eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den jeweiligen Primärträger in etwa einheitlich sein.

Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-PepT1-Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulieren, sind als potentielle neuroprotektive Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch wären Substrate des Proteins, die von diesem transportiert werden, u.U. wichtige neue Moleküle.

Das erfindungsgemäße Vorgehen bietet folgende Vorteile:
Die Messung der Transportaktivität bzw. der Transporteigenschaften gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.

Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich.

BEISPIEL 1 Herstellung des EAAC1-Sensorchips
10μl einer Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 2–3 mg mLml^–1) aus einer CHO-Plasmamembranpräparation wurden auf einen vorbehandelten Sensorchip mit einer runden Goldelektrode (3 mm Durchmesser, erhältlich von IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) inkubiert.
Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 1000 nF cm^–2, die Leitfähigkeit G_1s bei ca. 10 nS cm^–2.
BEISPIEL 2 Aktivitätsmessung ohne Inhibitor
Die Durchflusszelle eines SurfE²R-Systems (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) mit integriertem proteinbeladenem Sensorchip wurde zunächst mit Anlagerungspuffer (siehe oben) durchspült. Für die eigentliche Messung wurde mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil zwischen nicht-aktivierender Lösung (140 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 30 mM Mes pH6.0 oder Hepes pH7.0 + 25mM Glycin) und aktivierender Lösung (140 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 30 mM Mes pH6.0 oder Hepes pH7.0 + 25mM Substrat, z.B. Gly-Gly) umgestellt.
BEISPIEL 3 Aktivitätsmessung mit Glibenclamid
Ergebnis siehe 1.
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings enthielten beide Lösungen aktivierende und nicht-aktivierende zusätzlich 100μM Glibenclamid. Glibenclamid ist ein Inhibitor für PepT1 (IC₅₀ in Oozyten ca. 100μM). Die Inhibition der Stromamplitude durch Glibenclamid beweist, dass es sich bei dem detektierten Signal tatsächlich um ein spezifisches PepT1-Signal handelt. Eine vollständige Inhibition mit Glibenclamid ist aufgrund der schlechten Löslichkeit von Glibenclamid nicht möglich.
1 zeigt in Form eines Graphen schematisch den durch das PepT1-Protein hervorgerufenen Transportstrom I(t) als durch die Biosensorelektrode messbare elektrische Aktion.
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoff komplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines PepT1-Proteins enthält, mit den Schritten: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-PepT1-Protein enthaltenden Wirkortkomplex in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten, (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Anlagerungspuffer, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Anlagerungspuffer und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird, (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes, (d) In-Kontakt- und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon und (e) Bestimmen des qualitativen oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger, wobei in mindestens einem der Verfahrensschritten (c), (d) und (e) ein oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden: (f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine zweite oder nicht-aktivierende Lösung enthaltend einen Kompensator und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine dritte oder aktivierende Lösung und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei die dritte oder aktivierende Lösung der zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-PepT1-Proteins sowie einen Kompensator enthält, wobei als nicht-aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl₂, 30 mmol/l Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/l Glycin verwendet wird und wobei als aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl₂, 30 mmol/l Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/l Gly-Gly verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber der Messlösung und gegenüber den Primärträgern bevorzugt elektrisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundärträger abdeckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran oder Bilayermembran ausgebildet wird oder ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils eine eukaryontische Zelle, eine prokaryontische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, Membranfragmente oder Verbände davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, in gereinigter, mikrobiologisch oder molekularbiologisch geänderter Form verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Typ-PepT1-Protein verwendet wird, welcher auf dem PepT1-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers, bevorzugt Dünndarm, Niere, Gallengang oder Pankreas, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PepT1-Protein aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PepT1-Protein zumindest zum Teil im Primärträger eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist oder wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial, welche jeweils erzeugt werden durch Ladungs- oder Stofftransport oder -verschiebung, Konformationsänderungen, Ligandenbindung, -anlagerung oder -freigabe, oder einer Kombination davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird: – die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon, – der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon, – die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon, – eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder – eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messlösung eine wässriges Messlösung oder eine wässrige Elektrolytlösung verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem mindestens einer der Verfahrensschritte (c) und (d) durchgeführt wird durch: – Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon, – Austauschen der Messlösung oder eines Teils davon und/oder – chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren der Messlösung oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß von der Messlösung umströmt oder angeströmt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinanderfolgendes Austauschen der Messlösung, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine Waschlösung.
Verfahren nach einem der der vorstehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (g) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem (a) der Anlagerungspuffer mindestens – ein geeignetes Kation umfasst, sowie – einen pH-Wert von 6–8, bevorzugt etwa 7 aufweist, (b) die nicht-aktivierende Lösung mindestens – ein geeignetes Kation und – gegebenenfalls einen Kompensator umfasst, sowie – einen pH-Wert von 6–8, bevorzugt etwa 7 aufweist, und (c) die aktivierende Lösung mindestens – ein geeignetes Kation und – gegebenenfalls einen Kompensator und – ein Substrat des Typ-PepT1-Proteins, bevorzugt Gly-Gly in einer Konzentration von etwa > 0 bis 100 mmol/l umfasst, sowie – einen pH-Wert von 6–8, bevorzugt etwa 7 aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die nicht-aktivierende und/oder die aktivierende Lösung einen Kompensator umfassen.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit: – mindestens einem Primärträger, – einem Messbereich, – einem ersten oder Anlagerungspuffer, einer zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung, einer dritten oder aktivierenden Lösung zur Aufnahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes und – weiterhin mindestens einem potenziellen Wirkstoffkomplex.
Screeningverfahren zum Identifizieren: – eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoff komplexes, Teils oder Derivats davon, – der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoff komplexes, Teils oder Derivats davon oder – einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaften durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/oder des Testkits gemäß Anspruch 20, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoff komplex, der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomple xes, welcher einen Typ eines PepT1-Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PepT1-Proteins oder eines humanen PepT1-Proteins enthält.
Verwenden des Testkits gemäß Anspruch 20, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PepT1-Proteins oder eines humanen PepT1-Proteins enthält.