DE102005020003A1

DE102005020003A1 - fluorescence microscope

Info

Publication number: DE102005020003A1
Application number: DE200510020003
Authority: DE
Inventors: Stefan Prof.Dr. Hell; Johann Dr. Engelhardt
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2005-04-27
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2025-04-28
Also published as: DE102005020003B4; WO2006114247A1

Abstract

Bei einem Fluoreszenzmikroskop (12) mit einer Anregungslichtquelle (14) für Anregungslicht (5), um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe (19) während eines begrenzten Zeitraums in einem räumlichen Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht (6) mit Wellenlängen in einem Wellenlängenbereich anzuregen, und mit einer gepulsten Abregungslichtquelle (15) für Abregungslicht (7), um den Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich verkleinerten Restbereich wieder abzuregen, wobei Licht von der Probe (19) mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts (5) und des Abregungslichts (7) der spontanen Emission von Fluoreszenzlicht (6) aus dem Restbereich des räumlichen Bereichs zuordbar ist, ist die Abregungslichtquelle (15) ein modengekoppelter Gaslaser (13) mit einer Linienbreite des Abregungslichts (7) von weniger als 2 nm.In a fluorescence microscope (12) having an excitation light source (14) for excitation light (5) for exciting a fluorescent dye in a sample (19) for a limited time in a spatial region for spontaneously emitting fluorescent light (6) having wavelengths in a wavelength range, and with a pulsed de-excitation light source (15) for de-excitation light (7) to de-excite the fluorescent dye except for a reduced residual area, wherein light from the sample (19) having wavelengths different from those of the excitation light (5) and the depletion light (7) is assignable to the spontaneous emission of fluorescent light (6) from the remaining area of the spatial area, the de-excitation light source (15) is a mode-locked gas laser (13) with a line width of the depletion light (7) of less than 2 nm.

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungslichtquelle für Anregungslicht, um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer Probe während eines begrenzten Zeitraums in einem räumlichen Bereich zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht mit Wellenlängen in einem Wellenlängenbereich anzuregen, und mit einer gepulsten Abregungslichtquelle für Abregungslicht, um den Fluoreszenzfarbstoff bis auf einen gegenüber dem räumlichen Bereich verkleinerten Restbereich wieder abzuregen, wobei Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts der spontanen Emission von Fluoreszenzlicht aus dem Restbereich des räumlichen Bereichs zuordbar ist.The The invention relates to a fluorescence microscope with an excitation light source for excitation light, to a fluorescent dye in a sample for a limited period of time in a spatial Sphere for spontaneous emission of fluorescent light with wavelengths in a wavelength range and with a pulsed depletion light source for de-excitation light, to the fluorescent dye down to one compared to the spatial area reduced Restrain remaining area, taking light from the sample with others wavelength as those of the excitation light and the depletion light of the spontaneous Emission of fluorescent light from the residual area of the spatial Area is assignable.

Das Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs kann dabei so betrieben werden, dass der Restbereich, d. h. der Teilbereich der Probe, in dem der Fluoreszenzfarbstoff angeregt bleibt und aus dem spontan emittiertes Fluoreszenzlicht von der Probe ausschließlich stammt, kleiner als die Beugungsgrenze wird. D. h., mit einem Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art kann die Abbe'sche Beugungsgrenze bei der räumlichen Auflösung unterschritten werden.The Re-raining the fluorescent dye can be operated this way be that the remaining area, d. H. the partial area of the sample, in the fluorescent dye remains excited and spontaneously emitted fluorescent light comes from the sample exclusively, becomes smaller than the diffraction limit. That is, with a fluorescence microscope of the type described above, the Abbe'sche diffraction limit in the spatial resolution be fallen below.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein solches Fluoreszenzmikroskop, bei dem die Abregungslichtquelle vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Restbereichs durch stimulierte Emission mit der Wellenlänge des Abregungslichts wieder abzuregen. Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop wird auch als STED-Fluoreszenzmikroskop bezeichnet, wobei die Abkürzung STED für Stimulated Emission Depletion = Entvölkerung (des fluoreszenzfähigen Zustands) durch stimulierte Emission steht.Especially the invention relates to such a fluorescence microscope, wherein the depletion light source is provided to the fluorescent dye outside of the remaining region by stimulated emission with the wavelength of De-energizing light again. Such a fluorescence microscope is also referred to as STED fluorescence microscope, where the abbreviation STED for Stimulated Emission Depletion = Depopulation (of fluorescable State) by stimulated emission.

Ein STED-Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art ist aus der WO 95/21393 bekannt. Zu einem gepulsten Laser, der als Anregungslichtquelle verwendet werden kann, ist hier angegeben, dass er das Anregungslicht vorzugsweise mit einer Pulsbreite von 1 fs bis 1 ns abgibt. Ein als Abregungslichtquelle verwendeter Laser soll das Abregungslicht hingegen mit einer bevorzugten Pulsbreite von 1 ps bis 1 ns abgeben. Mit welchen Lasern dies realisiert werden soll, ist in der WO 95/21393 nicht offenbart. Beide angegebenen Pulsbreiten sind deutlich kürzer als die Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands eines typischen Fluoreszenzfarbstoffs von einigen wenigen Nanosekunden.One STED fluorescence microscope of the type described above is made WO 95/21393 known. To a pulsed laser, the excitation light source can be used here is stated that he is the excitation light preferably with a pulse width of 1 fs to 1 ns. One used as Abregungslichtquelle laser is the de-excitation light with a preferred pulse width of 1 ps to 1 ns. With which lasers this is to be realized is not in WO 95/21393 disclosed. Both specified pulse widths are significantly shorter than the lifetime of the fluorescent state of a typical fluorescent dye of a few nanoseconds.

In der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie hat sich herausgestellt, dass die Pulsbreite des Abregungslichts vorzugsweise länger als etwa 100 ps sein sollte. Längere Pulse führen zu einer Ineffizienz bei der stimulierten Emission, kürzere hingegen bei den für eine vollständige Abregung erforderlichen hohen Energien pro Puls zu die Probe schädigenden Prozessen, vermutlich durch Mehrfotonenabsorption. Als Abregungslichtquellen für die STED-Fluoreszenzmikroskopie werden derzeit verschiedene Dioden- und Festkörperlaser verwendet. Mit Diodenlasern werden die für STED-Fluoreszenzmikroskopie benötigten Energien pro Puls kaum erreicht. Bei Festkörperlasern, z. B. Titan-Saphir Lasern, sind die im gepulsten Betrieb erreichbaren Pulsbreiten deutlich kürzer als 100 ps und müssen durch nachgeschaltete Systeme gestreckt werden, die jedoch die Strahlqualität beeinträchtigen. Zudem ist die Linienbreite von gepulsten Festkörperlasern mit einigen Nanosekunden vergleichsweise breit.In The practice of STED fluorescence microscopy has been that the pulse width of the depletion light is preferably longer than should be about 100 ps. longer Pulse lead to an inefficiency in the stimulated emission, while shorter ones the for a complete De-excitation of high energies per pulse to sample damaging processes, presumably by multi-photon absorption. As depletion light sources for the STED fluorescence microscopy is currently used for various diode and solid-state lasers used. With diode lasers, the energies required for STED fluorescence microscopy become barely reached per pulse. For solid state lasers, z. For example, titanium sapphire Lasers, the achievable in pulsed operation pulse widths are clear shorter than 100 ps and have to be stretched by downstream systems, but affect the beam quality. In addition, the linewidth of pulsed solid-state lasers is a few nanoseconds comparatively wide.

Eine weitere Anforderung an die Abregungslichtquelle und auch an die Anregungslichtquelle besteht in der Praxis der STED-Fluoreszenzmikroskopie darin, für die Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe Anregungslicht mit unterschiedlichen Wellenlängen und hierauf abgestimmtes Abregungslicht mit entsprechend ebenfalls unterschiedlichen Wellenlängen bereitzustellen. Hierzu sind durchstimmbare Laserlichtquellen bekannt, z. B. Titan-Saphir Laser mit nachgeschaltetem optisch parametrisiertem Oszillator (OPO). Diese durchstimmbaren Laserlichtquellen sind jedoch als solche extrem komplex und weisen zudem die oben zu Festkörperlasern aufgeführten grundsätzlichen Nachteile auf.A further request to the de-excitation light source and also to the Excitation light source consists in the practice of STED fluorescence microscopy in it, for the use of different fluorescent dyes excitation light with different wavelengths and matched de-energizing light with accordingly also different wavelengths provide. For this purpose, tunable laser light sources are known, z. B. titanium sapphire laser followed by optically parametrized Oscillator (OPO). However, these tunable laser light sources are As such, they are extremely complex and also have the basic principles listed above for solid state lasers Disadvantages.

Für ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, also ein Fluoreszenzmikroskop, bei dem keine Erhöhung der räumlichen Auflösung durch Wiederabregen des Fluoreszenzfarbstoffs in der räumlichen Umgebung eines interessierenden Teilbereichs der Probe erfolgt, ist es aus der WO 99/42884 bekannt, akusto-optische Elemente als spektral selektive Elemente einzusetzen, um das von der Probe kommende Fluoreszenzlicht von dem Anregungslicht zu trennen. Akusto-optische Elemente zeichnen sich durch eine besonders hohe spektrale Selektivität aus. So ist es mit einem akusto-optischen Element möglich, Licht mit einer Linienbreite von 1 nm auszublenden. Derart schmalbandiges Licht wird in aktuellen konfokalen Fluoreszenzmikroskopen von als Anregungslichtquellen verwendeten und als Dauerstrichlaser betriebenen Festkörperlasern bereitgestellt.For a confocal Fluorescence microscope, so a fluorescence microscope in which no increase the spatial resolution by re-raining the fluorescent dye in the spatial Surrounding a region of interest of the sample, it is known from WO 99/42884, acousto-optical elements as To use spectrally selective elements to that coming from the sample To separate fluorescent light from the excitation light. Acousto-optic Elements are characterized by a particularly high spectral selectivity. So it is possible with an acousto-optic element, light with a line width of 1 nm. Such narrow-band light is in current Confocal fluorescence microscopes of as excitation light sources used and operated as a continuous wave laser solid state lasers provided.

Diese Filterbreite von akusto-optischen Elementen kann nicht erhöht werden, um sie an auszublendendes Licht mit größerer Linienbreite anzupassen.These Filter width of acousto-optic elements can not be increased to adjust them to be blended light with larger line width.

Neben gepulsten Dioden- und Festkörperlasern sind auch gepulste Gaslaser in Form so genannter modengekoppelter Gaslaser bekannt. Diese sind jedoch derzeit nicht kommerziell verfügbar. Kommerziell verfügbar sind derzeit nur als Dauerstrichlaser zu betreibende Gaslaser.In addition to pulsed diode and solid-state lasers, pulsed gas lasers in the form of so-called mode-locked gas lasers are also known. These are but currently not commercially available. Currently only commercially available as continuous wave laser gas lasers are commercially available.

Ein bekannter Gaslaser ist der ArKr-Laser, der als Dauerstrichlaser z. B. in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt wird. Ein Vorteil des ArKr-Lasers ist, dass er eine Mehrzahl von Wellenlängen im zur Anregung von Fluoreszenzfarbstoff nutzbaren Spektralbereich aufweist. Es besteht jedoch eine grundsätzliche Tendenz, alle Gaslaser aus Kosten- und Stabilitätsgründen durch Festkörperlaser zu ersetzen. Aus den genannten Kosten- und Stabilitätsgründen ist es häufig sogar sinnvoll, statt eines ArKr-Lasers mehrere Festkörperlaser, möglicherweise kombiniert mit optisch parametrisierten Oszillatoren (OPOs) einzusetzen, um bei einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop Anregungslicht mit unterschiedlicher Wellenlänge bereitzustellen.One known gas laser is the ArKr laser, the continuous wave laser z. B. is used in confocal fluorescence microscopy. An advantage of the ArKr laser is that it has a plurality of wavelengths in the spectral range useful for excitation of fluorescent dye having. However, there is a fundamental tendency to all gas lasers for cost and stability reasons Solid-state lasers to replace. For the cost and stability reasons mentioned is it often even useful, instead of an ArKr laser several solid-state lasers, possibly combined with optically parameterized oscillators (OPOs), around a confocal fluorescence microscope excitation light with different wavelength provide.

AUFGABE DER ERFINDUNGTASK OF THE INVENTION

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Fluoreszenzmikroskop der eingangs beschriebenen Art, insbesondere ein STED-Fluoreszenzmikroskop, aufzuzeigen, bei dem grundsätzlich besonders günstige Voraussetzungen für das Trennen des Fluoreszenzlichts aus einem interessierenden Teilbereich der Probe von anderem Licht von der Probe gegeben sind.Of the Invention is based on the object, a fluorescence microscope of initially described type, in particular a STED fluorescence microscope, to show, in principle especially cheap Requirements for separating the fluorescent light from a subregion of interest Sample of other light from the sample are given.

LÖSUNGSOLUTION

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 11 beschrieben.The The object of the invention is achieved by a fluorescence microscope with the Characteristics of the independent Patent claim 1 solved. Preferred embodiments of the new fluorescence microscope are in the dependent claims 2 to 11 described.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDESCRIPTION THE INVENTION

Bei dem neuen Fluoreszenzmikroskop ist die Abregungslichtquelle ein modengekoppelter Gaslaser mit einer Linienbreite des Abregungslichts von weniger als 2 nm. Überraschenderweise stellt sich heraus, dass der Aufwand für einen kommerziell nicht verfügbaren modengekoppelten Gaslaser und auch die mit seinem Betrieb verbundenen Stabilitätsprobleme dadurch aufgewogen werden, dass insbesondere das Abregungslicht mit einer Linienbreite von weniger als 2 nm bereitgestellt werden kann. Modengekoppelte Gaslaser sind ohne weiteres in der Lage, gepulstes Abregungslicht mit einer Linienbreite von maximal 1,0 nm und auch noch deutlich weniger bereitzustellen. Dies ermöglicht es, Licht von der Probe mit der Wellenlänge des Abregungslichts sehr schmalbandig von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht von der Probe zu trennen. Hierdurch werden Bandbreitenverluste bei der Detektion des aus dem jeweiligen Restbereich der Probe spontan emittierten Fluoreszenzlichts minimiert. Mit einem modengekoppelten Gaslaser als Abregungslichtquelle sind jedoch noch weitere grundsätzliche Vorteile verbunden. Die Kohärenzlänge von modengekoppelten Gaslasern ist vergleichsweise lang, so dass die gezielte Ausbildung von Interferenzmustern mit dem Abregungslicht, wie sie beispielsweise im Rahmen der so genannten 4 Pi-Fluoreszenzmikroskopie zur räumlichen Verteilung des Abregungslichts um einen interessierenden Teilbereich einer Probe eingesetzt wird, ohne kritische Justagen im Strahlengang möglich ist. Modengekoppelte Gaslaser besitzen auch eine ausgezeichnete transversale Mode TEM00 mit sehr guter Strahlqualität. Daneben können modengekoppelte Gaslaser zur gezielten Beeinflussung des abgestrahlten Laserlichts auch selektiv in einer höheren Mode, wie beispielsweise TEM01, TEM10, TEM11 usw. betrieben werden. Die verfügbaren Pulsenergien sind bei einem Gaslaser ausreichend hoch, und dies bei in aller Regel mehreren für das Abregungslicht verfügbaren Linien, bei denen der Gaslaser selektiv oder auch simultan betrieben werden kann.at the new fluorescence microscope, the depletion light source is a Mode-locked gas laser with a line width of the de-excitation light less than 2 nm. Surprisingly turns out that the overhead of a commercially unavailable mode-locked Gas lasers and also the stability problems associated with its operation be offset by the fact that in particular the de-excitation light with a line width of less than 2 nm can. Mode-locked gas lasers are readily capable of pulsed De-excitation light with a maximum line width of 1.0 nm and also to provide even less. This allows light from the sample with the wavelength of the depletion light very narrow band of the spontaneously emitted To separate fluorescent light from the sample. This results in bandwidth losses in the detection of the spontaneous from the respective residual region of the sample emitted fluorescence light minimized. With a mode-locked Gas lasers as a depletion light source, however, are still more fundamental Benefits connected. The coherence length of Mode-locked gas lasers are comparatively long, so that the targeted formation of interference patterns with the de-excitation light, as for example in the context of so-called 4 Pi fluorescence microscopy to the spatial Distribution of the depletion light around a subregion of interest a sample is used without critical adjustments in the beam path possible is. Mode-locked gas lasers also have an excellent Transverse mode TEM00 with very good beam quality. Besides can mode-locked gas lasers for the targeted influence of the radiated Laser light also selectively in a higher mode, such as TEM01, TEM10, TEM11, etc. are operated. The available pulse energies are sufficiently high for a gas laser, and all at once Usually several for the de-energizing light available Lines in which the gas laser operated selectively or simultaneously can be.

Die Vorteile eines modengekoppelten Gaslasers als Abregungslichtquelle sind zum Beispiel voll nutzbar, wenn die Abregungslichtquelle vorgesehen ist, um den Fluoreszenzfarbstoff außerhalb des Restbereichs der Probe durch stimulierte Emission wieder abzuregen. Die von dem Abregungslicht stimulierte Emission der Probe weist die Wellenlänge des Abregungslichts auf. Das heißt, wenn die Linienbreite des Abregungslichts, wie bei dem modengekoppelten Gaslaser besonders schmal ist, gilt dies auch für die stimulierte Emission der Probe. Diese kann also mit einem schmalbandigen Filter zusammen mit reflektierten Anteilen des Abregungslichts von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht abgetrennt werden. Selbst wenn die Wellenlänge des Abregungslichts mitten innerhalb des Wellenlängenbereichs liegt, in dem der Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiert, bleibt es daher bei nur kleinen Bandbreitenverlusten bei der Detektion des in einem interessierenden Teilbereich der Probe spontan emittierten Fluoreszenzlichts. Da jedoch festzustellen ist, dass der relative Anteil der stimulierten Emission der Probe an dem Licht von der Probe mit der Wellenlänge des Abregungslichts gegenüber den von der Probe reflektierten Anteilen des Abregungslichts in aller Regel vernachlässigbar gering ist, stellen sich wesentlichen Vorteile des neuen Fluoreszenzmiroskops allein dadurch ein, dass das Abregungslicht spektral schmalbandig ist und entsprechend seine von der Probe reflektierten Anteile von dem Fluoreszenzlicht spektral schmalbandig, d.h. mit geringen Detektionsbandbreitenverlusten, von der Probe abtrennbar sind.The Advantages of a mode-locked gas laser as a depletion light source are fully usable, for example, when the depletion light source is provided, around the fluorescent dye outside the rest of the sample by stimulated emission again. The stimulated by the de-excitation light emission of the sample has the wavelength of depletion light. That is, when the line width of the depletion light, as is particularly narrow with the mode-locked gas laser applies this also for the stimulated emission of the sample. So this can be with a narrowband Filter together with reflected portions of the depletion light of be separated from the spontaneously emitted fluorescent light. Even if the wavelength of the depletion light is within the wavelength range in which the fluorescent dye emits spontaneously, it therefore remains only small bandwidth losses in the detection of in one interesting portion of the sample spontaneously emitted fluorescent light. However, it should be noted that the relative proportion of stimulated Emission of the sample to the light from the sample at the wavelength of the sample Diminishing light opposite the portions of the depletion light reflected by the sample in generally negligible is low, provide significant benefits of the new fluorescence microscope solely by the fact that the de-excitation light spectrally narrowband and, accordingly, its portions of the spectral narrowband fluorescence light, i. with low detection bandwidth losses, from the sample can be separated.

Ein weiterer wichtiger Vorteil von modengekoppelten Gaslasern ist, dass sie in der Lage sind, Licht mit Pulsbreiten in einem Bereich von 50 bis 1000 ps und dabei insbesondere auch in einem Bereich von 100 bis 500 ps bereitzustellen. Hierdurch wird der für die STED-Fluoreszenzmikroskopie ideale Pulsbreitenbereich des Abregungslichts von mehr als 100 bis etwa 300 ps voll abgedeckt.One Another important advantage of mode-locked gas lasers is that They are able to produce light with pulse widths in a range of 50 to 1000 ps, and especially in a range of Provide 100 to 500 ps. This will be the one for STED fluorescence microscopy ideal pulse width range of the depletion light of more than 100 to about 300 ps fully covered.

Wenn der modengekoppelte Gaslaser des neuen Fluoreszenzmikroskops ein ArKr-Gaslaser ist, so kann bei dem Abregungslicht auf die Vielzahl der für die Abregung eines Fluoreszenzfarbstoffs brauchbaren Linien eines ArKr-Gaslasers zurückgegriffen werden. Dabei kann auch die Lichtquelle für das Anregungslicht ein ArKr-Gaslaser sein. Es ist sogar möglich, einen einzigen ArKr-Gaslaser sowohl als Anregungslichtquelle als auch als Abregungslichtquelle vorzusehen, wobei er Laserlicht mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen zugleich abgibt. In diesem Fall sind für das Anregungslicht und das Abregungslicht vorzugsweise partiell unterschiedliche Strahlengänge zu der Probe vorzusehen, wobei die Weglänge mindestens eines der beiden Strahlengänge gegenüber derjenigen des anderen Strahlengangs veränderbar ist, um die zeitliche Abfolge des Eintreffens des Anregungslichts und des Abregungslichts in der Probe einzustellen.If the mode-locked gas laser of the new fluorescence microscope ArKr gas laser is so can in the de-excitation light on the variety the for the depletion of a fluorescent dye useful lines of a ArKr gas laser can be used. In this case, the light source for the excitation light, an ArKr gas laser be. It is even possible a single ArKr gas laser both as an excitation light source as Also provide as Abregungslichtquelle, wherein he laser light with at least two different wavelengths at the same time. In this Case are for the excitation light and the de-excitation light preferably partially different beam paths to provide the sample, wherein the path length of at least one of the two beam paths relative to that the other beam path changeable is to the temporal sequence of the arrival of the excitation light and the de-excitation light in the sample.

Der modengekoppelte Gaslaser als Anregungslichtquelle des neuen Fluoreszenzmikroskops kann aber auch in an sich bekannter Wiese mit einem weiteren Laser synchronisiert sein, der die Anregungslichtquelle ausbildet. Der weitere Laser kann, wie im Zusammenhang mit dem ArKr-Gaslaser schon angedeutet wurde, ein weiterer modengekoppelter Gaslaser sein. Es kann sich aber beispielsweise auch um einen Dioden- oder Festkörperlaser handeln. Eine Synchronisation des modengekoppelte Gaslaser des neuen Fluoreszenzmikroskops mit einem oder mehreren weiteren Lasern gleicher oder unterschiedlicher Bauart kann auch zum Zweck von Mehrfarbenanwendungen erfolgen.Of the Mode-locked gas laser excitation light source of the new fluorescence microscope can but synced in a familiar per se with another laser be, which forms the excitation light source. The further laser can, as already indicated in connection with the ArKr gas laser became another mode-locked gas laser. It may be but also for example a diode or solid-state laser act. A synchronization of the mode-locked gas laser of the new Fluorescence microscope with one or more other lasers of the same or different type may also be used for the purpose of multi-color applications respectively.

In besonders bevorzugten konkreten Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzmikroskops ist mindestens ein akusto-optisches Element vorgesehen, das Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts von dem Fluoreszenzlicht von der Probe abtrennt. Aufgrund der geringen Linienbreite des Abregungslichts kann bei dem neuen Fluoreszenzmikroskop ein akusto-optisches Element eingesetzt werden, um das von der Probe kommende Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts selektiv auszublenden. Dabei kann das akusto-optische Element ein so genanntes AOD (Acousto-Optical-Deflector) oder ein AOTF (Acousto-Optical-Tuneable-Filter) sein.In Particularly preferred concrete embodiments of the new fluorescence microscope is at least one acousto-optical element provided with the light the wavelength the de-excitation light is separated from the fluorescent light from the sample. Due to the small line width of the Abregungslicht can at the new fluorescence microscope an acousto-optical element are used, to the light coming from the sample with the wavelength of the Selectively suppressing the emission light. Here, the acousto-optical Element a so-called AOD (Acousto-Optical-Deflector) or a AOTF (acousto-optical tuneable filter).

Jedes akusto-optische Element kann gleichzeitig auch dazu vorgesehen sein, von der Probe reflektiertes Anregungslicht von dem Fluoreszenzlicht von der Probe abzutrennen. Auf diese Weise bleibt nur das spontan emittierte Fluoreszenzlicht aus dem interessierenden Teilbereich der Probe übrig.each acousto-optic element can also be provided at the same time excitation light reflected from the sample from the fluorescent light from to separate the sample. In this way, only the spontaneously emitted remains Fluorescent light from the interesting portion of the sample left over.

Mindestens eines der akusto-optischen Elemente kann auch zur Ausbildung eines akusto-optischen Strahlteilers verwendet werden, mit dem zugleich das Anregungslicht und/oder das Abregungslicht in den Strahlengang zwischen einem Fotodetektor und der Probe eingekoppelt wird.At least One of the acousto-optic elements can also be used to form a acousto-optical Beam splitter can be used, with the same time the excitation light and / or the de-excitation light in the beam path between a photodetector and the sample is coupled.

Der Restbereich des räumlichen Bereichs, dessen spontaner Emission von Fluoreszenzlicht das Licht von der Probe mit anderen Wellenlängen als denjenigen des Anregungslichts und des Abregungslichts zuordbar ist, kann aus einem einzelnen punktförmigen oder linienförmiger Teilbereich der Probe oder aus einem Muster aus mehreren punkt- oder linienförmigen Teilbereichen bestehen. D. h., der durch das Abregungslicht gegenüber dem räumlichen Bereich, in dem die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs mit dem Anregungslicht erfolgte, verkleinerte Restbereich kann sowohl einen als auch mehrere punktförmige Teilbereiche, aber auch einen oder mehrere linienförmige Teilbereiche umfassen. eine Verbesserung der räumlichen Auflösung bis unter die Beugungsgrenze wird bereits dann erreicht, wenn die Abmessungen der jeweiligen Teilbereiche die Beugungsgrenze in einer einzigen Richtung unterschreiten.Of the Remaining area of the spatial Area whose spontaneous emission of fluorescent light is the light from the sample with wavelengths different from those of the excitation light and the Abregungslicht is assignable, can from a single punctual or line-shaped Part of the sample or from a sample of several or linear Subareas exist. D. h., By the Abregungslicht opposite the spatial Area where the excitation of the fluorescent dye with the excitation light Reduced residual area can be both one and several punctate Subareas, but also one or more linear subregions include. an improvement in spatial resolution up below the diffraction limit is already achieved when the dimensions the respective subareas the diffraction limit in a single Fall below the direction.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und der gesamten Beschreibung. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche abweichend von den gewählten Rückbeziehungen ist ebenfalls möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungsfiguren dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.advantageous Further developments of the invention will become apparent from the dependent claims and the entire description. Other features are the drawings - in particular the illustrated geometries and the relative dimensions of several Components to each other and their relative arrangement and operative connection - refer. The combination of features of different embodiments deviating from the invention or features of different claims from the chosen ones The antecedents is also possible and is hereby stimulated. This also applies to such features are shown in separate drawing figures or in their description to be named. These features can be combined with features of different claims.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGURENSUMMARY THE FIGURES

Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.in the The invention is described below with reference to the figures preferred embodiments further explained and described.

1 zeigt die Energieniveaus eines Fluoreszenzfarbstoffs, die im Rahmen seiner Verwendung bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie eine Rolle spielen. 1 shows the energy levels of a fluo fluorescent dyes that play a role in its use in STED fluorescence microscopy.

2 skizziert den zeitlichen Ablauf der Pulse des Anregungslichts und des Abregungslichts bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie. 2 outlines the timing of the pulses of the excitation light and the de-excitation light in STED fluorescence microscopy.

3 skizziert die zu 1 zugehörigen Wellenlängen und Wellenlängenspektren. 3 sketched those too 1 associated wavelengths and wavelength spectra.

4 zeigt ein Blockdiagramm zu dem neuen Fluoreszenzmikroskop. 4 shows a block diagram of the new fluorescence microscope.

5 skizziert eine Realisation des Fluoreszenzmikroskops gemäß 4; und 5 outlined a realization of the fluorescence microscope according to 4 ; and

6 zeigt eine Anordnung von zwei akusto-optischen Elementen im Strahlengang zwischen einer Probe und einem Fotodetektor gemäß 4 oder 5. 6 shows an arrangement of two acousto-optical elements in the beam path between a sample and a photodetector according to 4 or 5 ,

FIGURENBESCHREIBUNGDESCRIPTION OF THE FIGURES

1 zeigt das Energiespektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs. Durch Anregungslicht 5 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff aus seinem Grundzustand 1 innerhalb seines elektrischen S₀-Zustands in einen angeregten Zustand 4 innerhalb seines elektrischen S₁-Zustands. Dieser angeregte Zustand 4 zerfällt innerhalb des elektrischen S₁-Zustands in den fluoreszierenden Zustand 3. Aus dem fluoreszierenden Zustand 3 gelangt der Fluoreszenzfarbstoff unter spontaner Emission von Fluoreszenzlicht 6 wieder in einen Zustand innerhalb seines elektrischen S₀-Zustands. Der Fluoreszenzfarbstoff kann aber auch durch Abregungslicht 7 zu stimulierter Emission gezwungen werden, insbesondere dann, wenn die Intensität des Abregungslichts 7 über einer Sättigungskonzentration für die Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten Emission liegt. Die Stimulation des Fluoreszenzfarbstoffs zu der stimulierten Emission wird bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie dazu genutzt, eine mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierte Probe, die aufgrund der Abbe'schen Beugungsgrenze nur innerhalb eines einen interessierenden Teilbereich einschließenden und größeren räumlichen Bereichs mit dem Anregungslicht 5 zur spontanen Fluoreszenz angeregt werden kann, außerhalb des Teilbereichs mit dem Abregungslicht 7 wieder abzuregen, wodurch die räumliche Auflösung beim Messen der Probe durch Erfassen des aus dem Teilbereich emittierten Fluoreszenzlichts unter deutlichem Überschreiten der Beugungsgrenze gesteigert werden kann. Aufgrund der Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands 3 von typischerweise einigen wenigen Nanosekunden ist es eine technische Herausforderung, das interessierende Fluoreszenzlicht 6 aus dem jeweiligen Teilbereich der Probe sowohl von reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 als auch von reflektierten Anteilen des Abregungslichts 7 zu separieren. Daneben tritt zwar auch noch zusätzliches Licht in Form der mit dem Abregungslicht 7 stimulierten Emission des Fluoreszenzfarbstoffs auf; diese stimulierte Emission weist aber dieselbe Wellenlänge wie das Abregungslicht 7 auf, ist also von diesem nicht zu unterscheiden, und ihre Intensität ist viele Größenordnungen kleiner als diejenige der reflektierten Anteile des Abregungslichts 7. D. h., dieses zusätzliche Licht ist in aller Regel praktisch vernachlässigbar, auch wenn es im Folgenden extra angesprochen wird. 1 shows the energy spectrum of a fluorescent dye. By excitation light 5 the fluorescent dye comes out of its ground state 1 within its electrical S ₀ state in an excited state 4 within its electrical S ₁ state. This excited state 4 decomposes into the fluorescent state within the electrical S ₁ state 3 , From the fluorescent state 3 the fluorescent dye passes under spontaneous emission of fluorescent light 6 back to a state within its electrical S ₀ state. However, the fluorescent dye can also by Abregungslicht 7 be forced to stimulated emission, especially if the intensity of the depletion light 7 is above a saturation concentration for the stimulation of the fluorescent dye to the stimulated emission. The stimulation of the fluorescent dye to the stimulated emission is used in the STED fluorescence microscopy, a sample labeled with the fluorescent dye, which due to the Abbe'schen diffraction limit only within a region of interest and a larger spatial area with the excitation light 5 can be excited to spontaneous fluorescence, outside the subarea with the de-excitation light 7 again to be depleted, whereby the spatial resolution during the measurement of the sample by detecting the fluorescent light emitted from the sub-region can be increased while significantly exceeding the diffraction limit. Due to the lifetime of the fluorescent state 3 of typically a few nanoseconds, it is a technical challenge to have the fluorescent light of interest 6 from the respective partial area of the sample both of reflected portions of the excitation light 5 as well as of reflected portions of the depletion light 7 to separate. In addition, there is also additional light in the form of the de-excitation light 7 stimulated emission of the fluorescent dye; but this stimulated emission has the same wavelength as the de-excitation light 7 is, therefore, indistinguishable from it, and its intensity is many orders of magnitude smaller than that of the reflected portions of the depletion light 7 , That is, this extra light is usually practically negligible, even if it will be discussed separately below.

2 zeigt ein Beispiel für die zeitliche Abfolge der Intensitäten des Anregungslichts 5, des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 und des Abregungslichts 7 bei der STED-Fluoreszenzmikroskopie. Einem Puls 8 des Anregungslichts 5 folgt ein Puls 9 des Abregungslichts 7. Der Puls 9 weist günstiger Weise eine Pulsdauer von über 100 ps bis zu etwa 300 ps auf, um einerseits deutlich kürzer als der Zeitraum zu sein, über den das Fluoreszenzlicht 6 von dem Fluoreszenzfarbstoff spontan emittiert wird, und um andererseits trotz der gewünschten Sättigung bei der stimulierten Emission die Probe und den Fluoreszenzfarbstoff nicht mit übermäßigen Energiedichten zu belasten. Der Puls 8 des Anregungslichts 5 kann, wie hier dargestellt, kürzer als der Puls des Abregungslichts 7 sein. Dies ist jedoch nicht zwingend. Auch der zeitliche Abstand der beiden Pulse 8 und 9 ist hier nur als Beispiel zu verstehen. So ist auch eine weitgehende zeitliche Überschneidung der Pulse 8 und 9 möglich. Die zeitliche Relativlage der Pulse 8 und 9 ist dahingehend zu optimieren, dass das Signal des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden Teilbereich der Probe besonders deutlich ist. Eine zeitliche Separation des Fluoreszenzlichts 6 aus dem interessierenden Teilbereich der Probe ist aufgrund der dichten Abfolge der Pulse 8 und 9 und des sich daran unmittelbar anschließenden interessierenden Fluoreszenzlichts 6 allerdings allenfalls mit extremem Aufwand möglich und bislang nicht realisiert worden. 2 shows an example of the time sequence of the intensities of the excitation light 5 , the spontaneously emitted fluorescent light 6 and the de-energizing light 7 in STED fluorescence microscopy. A pulse 8th of the excitation light 5 follows a pulse 9 of the depletion light 7 , The pulse 9 Advantageously, it has a pulse duration of more than 100 ps up to about 300 ps in order, on the one hand, to be considerably shorter than the time period over which the fluorescent light is emitted 6 from the fluorescent dye is spontaneously emitted, and on the other hand, despite the desired saturation in the stimulated emission, the sample and the fluorescent dye are not burdened with excessive energy densities. The pulse 8th of the excitation light 5 can, as shown here, shorter than the pulse of the de-excitation light 7 be. However, this is not mandatory. Also the time interval of the two pulses 8th and 9 This is just an example. Such is also a far-reaching temporal overlap of the pulses 8th and 9 possible. The temporal relative position of the pulses 8th and 9 is to be optimized so that the signal of the fluorescent light 6 is particularly clear from the interesting portion of the sample. A temporal separation of the fluorescent light 6 from the region of interest of the sample is due to the dense sequence of the pulses 8th and 9 and the fluorescence light of interest immediately thereafter 6 but possibly with extreme effort possible and not yet realized.

Praktisch erfolgt daher die Abtrennung des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 von dem interessierenden Fluoreszenzlicht 6 durch eine spektrale Selektion. 3 skizziert die Wellenlängen Lambda, die bei dem anhand der 1 und 2 erläuterten Vorgang auftreten. Wenn man von vernachlässigbar kleinen Anteilen des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6 absieht, weist das Anregungslicht 5 die kürzeste Wellenlänge, d. h. die höchste Quantenenergie, auf. Das Fluoreszenzlicht 6 weist auch in dem hier dargestellten Fall von spektral schmalbandigem Anregungslicht 5 Wellenlängen Lambda aus einem vergleichsweise ausgedehnten Wellenlängenbereich 10 von einigen Nanometern Breite auf. Die Wellenlänge des Abregungslichts 7 ist länger als diejenige des Anregungslichts 5 und hier auch länger als die meisten auftretenden Wellenlängen des spontan emittierten Fluoreszenzlichts 6. Damit bleibt ein Detektionsfenster 11 zwischen den Wellenlängen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7, in dem spontan emittiertes Fluoreszenzlicht 6 detektiert werden kann, ohne zugleich von der jeweiligen Probe reflektiertes Anregungslicht 5 oder Abregungslicht 7 bzw. die stimulierte Emission mit derselben Wellenlänge wie das Abregungslicht 7 aus anderen Bereichen der Probe als dem interessierenden Teilbereich zu detektieren. Die spektrale Breite des Detektionsfenster 11 hängt stark davon ab, wie groß die Linienbreiten des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 tatsächlich sind, die hier sehr schmalbandig wiedergegeben sind. Insbesondere kommt es dabei auf die Linienbreite des Abregungslichts 7 an, da sich dessen Wellenlänge grundsätzlich viel tiefer innerhalb des Wellenlängenbereichs 10 befindet, während die Wellenlänge des Abregungslichts 5 immer am äußeren Rand des Wellenlängenbereichs 10 liegt. Insbesondere dann, wenn die Wellenlänge des Abregungslichts 7 noch tiefer als in 3 dargestellt in dem Wellenlängenbereich 10 liegt, kann es zur Erzielung einer großen Detektionsbandbreite nötig werden, auch Anteile des Fluoreszenzlichts 6 mit größerer Wellenlänge als der Wellenlänge des Abregungslichts 7 zu detektieren. Hierzu muss dann aus einem sich weiter zu größeren Wellenlängen hin erstreckenden Detektionsfenster 11 das Abregungslicht 7 selektiv ausgeblendet werden. Dies gelingt nur mit sehr schmalbandigen Filtern. Als solche schmalbandigen Filter sind konkret akusto-optische Elemente bekannt, mit denen Licht mit einer Linienbreite von etwa 1 nm selektiv ausgeblendet werden kann. Diese spektral schmalbandigen Filter können jedoch nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn das Abregungslicht 7 und die von ihm stimulierte Emission gleicher Wellenlänge eine entsprechend schmale Linienbreite aufweisen. Dies wird bei dem im nachfolgend beschriebenen Fluoreszenzmikroskop erreicht.Practically, therefore, the separation of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 of the fluorescent light of interest 6 through a spectral selection. 3 outlines the wavelengths lambda, which in the basis of the 1 and 2 explained process occur. If one of negligible proportions of spontaneously emitted fluorescent light 6 disregards, points the excitation light 5 the shortest wavelength, ie the highest quantum energy. The fluorescent light 6 also shows spectral narrow-band excitation light in the case shown here 5 Wavelengths lambda from a comparatively extended wavelength range 10 of a few nanometers wide. The wavelength of the depletion light 7 is longer than that of the excitation light 5 and here even longer than most occurring wavelengths of the spontaneously emitted fluorescent light 6 , This leaves a detection window 11 between the wavelengths of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 , in which spontaneously emitted fluorescent light 6 can be detected without at the same time reflected by the respective sample excitation light 5 or de-energizing light 7 or the stimulated emission having the same wavelength as the de-excitation light 7 from areas of the sample other than the region of interest. The spectral width of the detection window 11 strongly depends on how big the line widths of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 actually are, which are reproduced here very narrow band. In particular, it comes down to the line width of the Abregungslicht 7 because its wavelength is generally much deeper within the wavelength range 10 is located while the wavelength of the depletion light 5 always at the outer edge of the wavelength range 10 lies. In particular, when the wavelength of the depletion light 7 even deeper than in 3 shown in the wavelength range 10 It may be necessary to achieve a large detection bandwidth, including portions of the fluorescent light 6 with longer wavelength than the wavelength of the depletion light 7 to detect. For this purpose must then from a further to larger wavelengths extending detection window 11 the de-energizing light 7 be selectively hidden. This is only possible with very narrow band filters. As such narrow-band filters concrete acousto-optical elements are known with which light with a line width of about 1 nm can be selectively hidden. However, these spectrally narrow-band filters can only be usefully used if the de-excitation light 7 and stimulated by him emission of the same wavelength have a correspondingly narrow line width. This is achieved in the fluorescence microscope described below.

Das Blockdiagramm gemäß 4 gibt eine Übersicht über den Aufbau eines STED-Fluoreszenzmikroskops 12 als konkrete Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskops. Ein modengekoppelter Gaslaser 13 ist hier sowohl als Anregungslichtquelle 14 als auch als Abregungslichtquelle 15 vorgesehen. Das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 werden von den modengekoppelten Gaslaser 13 in gleichzeitigen Pulsen abgegeben. In einem Verzögerungsgenerator 16 wird eine Verzögerung zwischen den Pulsen des Abregungslichts 7 gegenüber den Pulsen des Anregungslichts 5 herbeigeführt (vgl. 2). In einer Phasenkontrolleinrichtung 17 wird die räumliche Verteilung der Phasen des Abregungslichts 7 in einer solchen Weise moduliert, dass sich in dem den interessierenden Teilbereich der Probe einschließenden räumlichen Bereich die gewünschte Intensitätsverteilung des Abregungslichts 7 relativ zu dem Anregungslicht 5 ergibt. In einer Einkoppeleinrichtung 18 wird das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 in den Strahlengang des STED-Fluoreszenzmikroskops 12 zwischen der Probe 19 und einem Fotodetektor 20 eingekoppelt. Von der Einkoppeleinrichtung 18 gelangt das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 zu der Probe 19. Von der Probe 19 zurück gelangen neben reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 sowohl das interessierende Fluoreszenzlicht 6 von der spontanen Emission aus dem jeweiligen Teilbereich der Probe als auch die stimulierte Emission der Probe 19 mit derselben Wellenlänge wie das Abregungslicht 7. Eine Separation des Fluoreszenzlichts 6 erfolgt in einer Filtereinrichtung 21, die vor dem Fotodetektor 20 angeordnet ist. Auch die Einkoppeleinrichtung 18 kann an der Filterung beteiligt sein, damit nur das interessierende Fluoreszenzlicht 6 den Detektor 20 erreicht.The block diagram according to 4 gives an overview of the structure of a STED fluorescence microscope 12 as a concrete embodiment of a fluorescence microscope according to the invention. A mode-locked gas laser 13 is here both as an excitation light source 14 as well as a depletion light source 15 intended. The excitation light 5 and the de-energizing light 7 are from the fashion-coupled gas laser 13 delivered in simultaneous pulses. In a delay generator 16 there will be a delay between the pulses of the de-excitation light 7 opposite to the pulses of the excitation light 5 brought about (cf. 2 ). In a phase control device 17 becomes the spatial distribution of the phases of the depletion light 7 in such a way that the desired intensity distribution of the depletion light is modulated in the spatial area enclosing the region of interest of interest of the sample 7 relative to the excitation light 5 results. In a coupling device 18 becomes the excitation light 5 and the de-energizing light 7 into the beam path of the STED fluorescence microscope 12 between the sample 19 and a photodetector 20 coupled. From the coupling device 18 reaches the excitation light 5 and the de-energizing light 7 to the sample 19 , From the sample 19 come back next to reflected portions of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 both the fluorescent light of interest 6 from the spontaneous emission from the respective portion of the sample as well as the stimulated emission of the sample 19 with the same wavelength as the de-excitation light 7 , A separation of the fluorescent light 6 takes place in a filter device 21 in front of the photodetector 20 is arranged. Also the coupling device 18 may be involved in the filtering so that only the fluorescent light of interest 6 the detector 20 reached.

5 zeigt eine Realisation des STED-Mikroskops 12 gemäß dem Blockdiagramm in 4. Der modengekoppelte Gaslaser 13 ist ein ArKr-Gaslaser 22, in dessen Laserkavität ein Modenkoppler 23 vorgesehen ist, um das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 mit dem Gaslaser 13 in Form von einzelnen Pulsen zu erzeugen. Dabei ist die Laserkavität des Gaslasers 13 mit einem Umlenkspiegel 24 gefaltet, um die Gesamtbaulänge des Gaslasers 13 zu reduzieren. Um bei der Modenkopplung eine Dispersionskompensation zwischen dem Anregungslicht 5 und dem Abregungslicht 7 herbeizuführen, ist die Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits des Modenkopplers 13 in zwei unterschiedliche Arme für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 aufgeteilt. Dabei kann die dispersive Wirkung des Modenkopplers 23 für die Aufteilung der Laserkavität in die unterschiedlichen Arme für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 ausreichend sein oder beispielsweise durch eine zusätzliche dispersive Wirkung des Umlenkspiegels 24 unterstützt werden. Die Linienspezifizität der Laserkavität für das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 ist jeweils durch eine Lochblende 25 bzw. 26 vor dem in unterschiedlichem Abstand zu dem Umlenkspiegel 24 angeordneten Resonatorspiegeln 27 und 28 realisiert. Der modengekoppelte Gaslaser 22 wird in der transversalen TEM00-Mode betrieben, in der er eine hohe Strahlqualität mit hoher Kohärenzlänge aufweist. Insbesondere in dem Bereich der Laserkavität des Gaslasers 13 jenseits des Modenkopplers 23 kann aber auf die Mode auch willentlich so Einfluss genommen werden, dass der Gaslaser 13, z. B. zur Strahlformung, gezielt in einer höheren Mode, so wie TEM01, TEM10 oder TEM11, betrieben wird. Der Verzögerungsgenerator 16 ist in 5 durch eine Anordnung mit einem dichroitischen Spiegel 29, zwei Umlenkprismen 31 und 32 und einem Umlenkspiegel 33 realisiert. Durch die Verschiebung eines der Umlenkprismen 31 und 32, was hier bei dem Umlenkprisma 32 durch einen Doppelpfeil 34 angedeutet ist, verändert sich die Weglänge für das Abregungslicht 7 gegenüber dem Anregungslicht 5 und damit die zeitliche Lage des Pulses 9 gemäß 2 gegenüber dem Puls 8 gemäß 2. Über weitere Umlenkspiegel 34 und 35 sowie durch ein Linsensystem 36 aus mindestens einer Linse gelangt das Anregungslicht 5 zusammen mit dem Abregungslicht 7 zu einem dichroitischen Spiegel 37. Von dort gelangt das Anregungslicht 5 durch ein weiteres Linsensystem 39 aus mindestens einer Linse zu einem akusto-optischen Strahlteiler 40 und wird dort in dem Strahlengang zwischen der Probe 19 und dem Fotodetektor 20 eingekoppelt. Das Abregungslicht 7 gelangt von dem dichroitischen Spiegel 37 durch ein Linsensystem 41 aus mindestens einer Linse zu einem so genannten Spatial Light Modulator 42 als Realisation der Phasenkontrolleinrichtung 17. Von dort gelangt das modulierte Abregungslicht 7 durch ein weiteres optisches System 43 aus mindestens einer Linse zu einem dichroitischen Spiegel 44, der hier zum Einkoppeln des Abregungslichts 7 in den Strahlengang zwischen der Probe 19 und dem Fotodetektor 20 dient. In diesem Strahlengang ist zwischen dem dichroitischen Spiegel 44 und der Probe 19 ein Objektiv 45 vorgesehen. Durch dieses Objektiv 45 gelangt von der Probe 19 das Fluoreszenzlicht 6 zusammen mit reflektierten Anteilen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 sowie die von dem Abregungslicht 7 stimulierte Emission gleicher Wellenlänge zurück zu dem dichroitschen Spiegel 44. Von dort gelangt das von der Probe kommende Licht durch ein optisches System 46 aus mindestens einer Linse zu dem akusto-optischen Strahlteiler 40, der sowohl Licht mit der Wellenlänge des Anregungslichts 5 als auch Licht mit der Wellenlänge des Abregungslichts 7 auskoppelt. Dasselbe gilt für einen weiteren akusto-optischen Strahlteiler 47, der hier ausschließlich zum Herausfiltern weiterer Anteile von Licht mit den Wellenlängen des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dient. Von dort gelangt das Fluoreszenzlicht 6 durch ein optisches System aus mindestens einer Linse 48 durch eine konfokal zu dem interessierenden Teilbereich der Probe 19 angeordnete Lochblende 49 sowie durch ein Sperrfilter 50 zu dem Fotodetektor 20. Das Sperrfilter 50 ergänzt die Sperrwirkung der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 für das von der Probe 19 reflektierte Abregungslicht 7 und die von dem Abregungslicht 7 in der Probe stimulierte Emission gleicher Wellenlänge. Der Einsatz der akusto-optischen Strahlteiler 40 und 47 zum Ausblenden sowohl des Anregungslichts 5 als auch des Abregungslichts 7 und der von diesem außerhalb des jeweils interessierenden Teilbereichs der Probe stimulierten Emission gleicher Wellenlänge ist bei dem STED-Fluoreszenzmikroskop 12 deshalb möglich, weil der ArKr-Gaslaser 22 sowohl das Anregungslicht 5 als auch das Abregungslicht 7 mit jeweils schmaler Linienbreite von weniger als 1 nm bereitstellt. Bei einer derart schmalen Linienbreite weisen akusto-optische Elemente für die durch Ihre akustische Ansteuerung ausgewählten Wellenlängen eine gute Sperrwirkung auf. Weiterhin können die Pulse des modengekoppelten ArKr-Gaslasers direkt in dem Fluoreszenzmikroskop 12 verwendet werden, ohne dass sie in ihrer Länge verändert werden müssen. Sie weisen die für STED-Fluoreszenzmikroskopie optimale Pulsbreite von wenigen 100 ps auf. Durch Veränderung der Lagen der zur Linienselektion dienenden Lochblenden 25 und 26 ist es unter gleichzeitiger Abstimmung der Dispersionskorrektur mit den Resonatorspiegeln 27 und 28 überdies möglich, aus der Vielzahl der bei einem ArKr-Gaslaser grundsätzlich zur Verfügung stehenden Linien jeweils die beiden auszuwählen, die für die Anregung und Abregung eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs in der Probe 19 besonders gut geeignet sind. 5 shows a realization of the STED microscope 12 in accordance with the block diagram in 4 , The mode-locked gas laser 13 is an ArKr gas laser 22 , in whose laser cavity a mode coupler 23 is provided to the excitation light 5 and the de-energizing light 7 with the gas laser 13 in the form of individual pulses. Here is the laser cavity of the gas laser 13 with a deflection mirror 24 folded to the overall length of the gas laser 13 to reduce. For the mode coupling, a dispersion compensation between the excitation light 5 and the de-energizing light 7 is the laser cavity of the gas laser 13 beyond the fashion coupler 13 in two different arms for the excitation light 5 and the de-energizing light 7 divided up. In this case, the dispersive effect of the mode coupler 23 for the division of the laser cavity into the different arms for the excitation light 5 and the de-energizing light 7 be sufficient or, for example, by an additional dispersive effect of the deflection mirror 24 get supported. The line specificity of the laser cavity for the excitation light 5 and the de-energizing light 7 is each through a pinhole 25 respectively. 26 before at different distances to the deflection mirror 24 arranged resonator mirrors 27 and 28 realized. The mode-locked gas laser 22 is operated in the transversal TEM00 mode in which it has a high beam quality with high coherence length. Especially in the area of the laser cavity of the gas laser 13 beyond the fashion coupler 23 But can also be deliberately influenced on the fashion so that the gas laser 13 , z. B. for beam forming, specifically in a higher mode, such as TEM01, TEM10 or TEM11 operated. The delay generator 16 is in 5 by an arrangement with a dichroic mirror 29 , two deflecting prisms 31 and 32 and a deflecting mirror 33 realized. By shifting one of the deflecting prisms 31 and 32 , what here at the deflection prism 32 by a double arrow 34 is indicated, the path length for the de-excitation light changes 7 opposite the excitation light 5 and thus the temporal position of the pulse 9 according to 2 opposite to the pulse 8th according to 2 , About further deflection mirrors 34 and 35 as well as through a lens system 36 from at least one lens reaches the excitation light 5 together with the de-energizing light 7 to a dichroic mirror 37 , From there the excitation light arrives 5 through another lens system 39 from at least one lens to an acousto-optic beam splitter 40 and will be there in the beam path between the sample 19 and the photodetector 20 coupled. The de-energizing light 7 arrives from the dichroic mirror 37 through a lens system 41 from at least one lens to a so-called Spatial Light Modulator 42 as realization of the phase control device 17 , From there, the modulated de-energizing light arrives 7 through another optical system 43 from at least one lens to a dichroic mirror 44 , who is here for coupling the excitement light 7 in the beam path between the sample 19 and the photodetector 20 serves. In this beam path is between the dichroic mirror 44 and the sample 19 a lens 45 intended. Through this lens 45 gets from the sample 19 the fluorescent light 6 together with reflected portions of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 as well as those of the de-excitation light 7 stimulated emission of the same wavelength back to the dichroic mirror 44 , From there, the light coming from the sample passes through an optical system 46 from at least one lens to the acousto-optic beam splitter 40 , which both light with the wavelength of the excitation light 5 as well as light with the wavelength of the de-excitation light 7 couples out. The same applies to another acousto-optical beam splitter 47 , which here exclusively for filtering out further portions of light with the wavelengths of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 serves. From there, the fluorescent light passes 6 by an optical system of at least one lens 48 by a confocal to the region of interest of the sample 19 arranged pinhole 49 as well as a blocking filter 50 to the photodetector 20 , The blocking filter 50 complements the blocking effect of the acousto-optic beam splitters 40 and 47 for that of the sample 19 reflected de-excitation light 7 and that of the de-excitation light 7 in the sample stimulated emission of the same wavelength. The use of the acousto-optical beam splitter 40 and 47 to hide both the excitation light 5 as well as the de-energizing light 7 and the emission of the same wavelength stimulated by it outside the particular region of interest of the sample is in the STED fluorescence microscope 12 therefore possible because the ArKr gas laser 22 both the excitation light 5 as well as the de-energizing light 7 each having a narrow line width of less than 1 nm. With such a narrow linewidth, acousto-optic elements have a good barrier effect for the wavelengths selected by their acoustic drive. Furthermore, the pulses of the mode-locked ArKr gas laser can be directly in the fluorescence microscope 12 can be used without having to be changed in their length. They have the optimum pulse width of a few 100 ps for STED fluorescence microscopy. By changing the layers of pinholes used for line selection 25 and 26 it is with simultaneous adjustment of the dispersion correction with the resonator mirrors 27 and 28 Moreover, it is possible to select from the large number of lines that are basically available in the case of an ArKr gas laser the two that are responsible for the excitation and de-excitation of a specific fluorescent dye in the sample 19 are particularly well suited.

6 zeigt als vergrößertes Detail von 5 den Aufbau des akusto-optischen Strahlteilers 40. Der akusto-optische Strahlteiler 40 weist zwei akusto-optische Elemente 51 und 52 auf. Das akusto-optische Element 51 wird aktiv angesteuert, um das Anregungslicht 5 über einen Umlenkspiegel 53 in den Strahlengang zwischen dem Detektor 20 und der Probe 19 einzukoppeln und um im Gegenzug sowohl das von der Probe reflektierte Anregungslicht 5 als auch das von der Probe reflektierte Abregungslicht 7 sowie die von diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge von dem spontan emittierten Fluoreszenzlicht 6 abzutrennen. Das zweite akusto-optische Element 52 dient hier im Wesentlichen zur Kompensation von Dispersions- und Doppelbrechungseffekten, da das akusto-optische Element 51 auch das Fluoreszenzlicht 6, das keine feste Wellenlänge aufweist (s. 3) spektral aufspaltet. D. h., das zweite akusto-optische Element 52 richtet die einzelnen spektralen Anteile des Fluoreszenzlichts 6 wieder parallel zueinander aus. Es kann zusätzlich zur Ein- und insbesondere Auskopplung bzw. Ausfilterung weiterer Anteile des Anregungslichts 5 und des Abregungslichts 7 dienen. Die hier verwendeten akusto-optischen Elemente 51 und 52 sind als Acousto-Optical Tuneable Filters bekannt. Es können auch so genannte Acousto-Optical Deflectors als die akusto-optischen Elemente 51 und 52 eingesetzt werden. Weiterhin sind auch bekannte akusto-optische Elemente verwendbar, die einen speziellen Kristall mit dispersionsfreier nullter Ordnung umfassen, so dass keine Dispersionskorrektur benötigt wird, sondern vielmehr mit jedem akusto-optischen Element eine Unterdrückung einer oder mehrerer Linien aus dem Licht von der Probe betrieben werden kann. Die typische Extinktion jedes als AOTF realisierten akusto-optischen Elements liegt für die selektierten Linien mit der Linienbreite von ca. 1 nm bei etwa 95 %. Bei Verwendung mehrerer aktiver akusto-optischer Elemente 51 in Verbindung mit dem Sperrfilter 50 gemäß 5 können das Anregungslicht 5 und das Abregungslicht 7 sowie die von diesem stimulierte Emission gleicher Wellenlänge sehr effektiv von dem Fotodetektor 20 ferngehalten werden. 6 shows as an enlarged detail of 5 the structure of the acousto-optical beam splitter 40 , The acousto-optical beam splitter 40 has two acousto-optic elements 51 and 52 on. The acousto-optic element 51 is actively driven to the excitation light 5 via a deflection mirror 53 in the beam path between the detector 20 and the sample 19 and in return both the excitation light reflected from the sample 5 as well as the reflected light from the sample 7 as well as the stimulated by this emission of the same wavelength of the spontaneously emitted fluorescent light 6 separate. The second acousto-optic element 52 Here, essentially serves to compensate for dispersion and birefringence effects, since the acousto-optical element 51 also the fluorescent light 6 that does not have a fixed wavelength (s. 3 ) spectrally splits. That is, the second acousto-optic element 52 directs the individual spectral components of the fluorescent light 6 again parallel to each other. It can, in addition to the input and in particular decoupling or filtering out further portions of the excitation light 5 and the de-energizing light 7 serve. The acousto-optical elements used here 51 and 52 are known as Acousto-Optical Tuneable Filters. It can also be called Acousto-Optical Deflectors as the acousto-optic elements 51 and 52 be used. Furthermore, it is also possible to use known acousto-optical elements which comprise a special dispersion-free zeroth-order crystal, so that no dispersion correction is required, but instead a suppression of one or more lines of light from the sample can be operated with each acousto-optic element , The typical extinction of each AOTF realized acousto-optic element is for the selected lines with the line width of about 1 nm at about 95%. When using several active acousto-optic elements 51 in conjunction with the blocking filter 50 according to 5 can the excitation light 5 and the de-energizing light 7 as well as the stimulated by this Emissi on the same wavelength very effectively from the photodetector 20 be kept away.

11: ZustandStatus
22: ZustandStatus
33: ZustandStatus
44: ZustandStatus
55: Anregungslichtexcitation light
66: Fluoreszenzlichtfluorescent light
77: Anregungslichtexcitation light
88th: PulsPulse
99: PulsPulse
1010: WellenlängenbereichWavelength range
1111: Detektionsfensterdetection window
1212: STED-FluoreszenzmikroskopSTED fluorescence microscope
1313: modengekoppelter Gaslasermode-locked gas lasers
1414: AnregungslichtquelleExcitation light source
1515: Abregungslichtquellede-excitation light
1616: Verzögerungsgeneratordelay generator
1717: PhasenkontrolleinrichtungPhase control device
1818: Einkoppeleinrichtunglaunching device
1919: Probesample
2020: Detektordetector
2121: Filtereinrichtungfiltering device
2222: ArKr-GaslaserArKr gas laser
2323: Modenkopplermodelocker
2424: Umlenkspiegeldeflecting
2525: Lochblendepinhole
2626: Lochblendepinhole
2727: Resonatorspiegelresonator
2828: Resonatorspiegelresonator
2929: dichroitischer Spiegeldichroic mirror
3131: Umlenkprismadeflecting prism
3232: Umlenkprismadeflecting prism
3333: Umlenkspiegeldeflecting
3434: Umlenkspiegeldeflecting
3535: Umlenkspiegeldeflecting
3636: Linsensystemlens system
3737: dichroitischer Spiegeldichroic mirror
3939: LinsenssystemLinsenssystem
4040: akusto-optischer Strahlteileracousto-optical beamsplitter
4141: Linsensystemlens system
4242: Spatial Light ModulatorSpatial Light modulator
4343: Linsensystemlens system
4444: dichroitischer Spiegeldichroic mirror
4545: Objektivlens
4646: Linsensystemlens system
4747: akusto-optischer Strahlteileracousto-optical beamsplitter
4848: Linsensystemlens system
4949: Lochblendepinhole
5050: Sperrfiltercut filter
5151: akusto-optisches Elementacousto-optical element
5252: akusto-optisches Elementacousto-optical element
5353: Umlenkspiegeldeflecting

Claims

A fluorescence microscope with an excitation light source for excitation light to excite a fluorescent dye in a sample for a limited period of time in a spatial region for spontaneously emitting fluorescent light having wavelengths in a wavelength region, and a pulsed deenergizing light source for de-excitation light to control the fluorescent dye except one Ablate area reduced residual area, wherein light from the sample with other wavelengths than those of the excitation light and the Abregungslicht the spontaneous emission of fluorescent light from the remaining area of the spatial area is assignable, characterized in that the de-excitation light source ( 15 ) a mode-locked gas laser ( 13 ) with a line width of the de-excitation light ( 7 ) of less than 2 nm.

Fluorescence microscope according to claim 1, characterized in that the de-excitation light source ( 15 ) is provided to the fluorescent dye outside the remainder range by stimulated emission with the wavelength of the de-excitation light ( 7 ) again.

Fluorescence microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the pulse width of the excitation light ( 7 ) Is 100 to 500 ps.

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 3, characterized in that the mode-locked gas laser ( 13 ) an ArKr gas fiber ( 22 ).

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 4, characterized in that the mode-locked gas laser ( 13 ) is designed for laser operation in the transverse fundamental mode or a higher mode.

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 5, characterized in that the mode-locked gas laser ( 13 ) is designed for laser operation at a single, but from a plurality of possible wavelengths selectable wavelength.

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 5, characterized in that the mode-locked gas laser at the same time as the excitation light source ( 14 ) is provided, wherein it is designed for a simultaneous laser operation at two wavelengths.

Fluorescence microscope according to claim 7, characterized in that for the excitation light ( 5 ) and the de-excitation light ( 7 ) partially different beam paths to the sample ( 19 ) are provided, wherein the path length of at least one of the two beam paths relative to the other can be changed in order to determine the time sequence of the arrival of the excitation light (FIG. 5 ) and the de-excitation light ( 7 ) in the sample ( 19 ).

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 8, characterized in that at least one acousto-optical element ( 51 ) is provided, the light with the wavelength of the de-excitation light ( 7 ) of the fluorescent light ( 6 ) from the sample ( 19 ) separates.

Fluorescent microscope according to claim 9, characterized in that each acousto-optical element ( 51 ) also reflected by the sample excitation light ( 5 ) of the fluorescent light ( 6 ) from the sample ( 19 ) separates.

Fluorescence microscope according to claim 10, characterized in that at least one acousto-optical element ( 51 . 52 ) an acousto-optical beam splitter ( 40 ), which at the same time generates the excitation light ( 5 ) and / or the de-excitation light ( 7 ) in the beam path between a photodetector ( 20 ) and the sample ( 19 ).

Fluorescence microscope according to one of claims 1 to 11, characterized in that the remaining area of the spatial Area of a single punctiform or linear portion of the Sample or a pattern of several point or line-shaped sections consists.