DE102005049527B4

DE102005049527B4 - Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie Mikroorganismus

Info

Publication number: DE102005049527B4
Application number: DE102005049527A
Authority: DE
Inventors: Dr. Eggeling Lothar; Dr. Peters-Wendisch Petra; Michael Stolz; Prof. Dr. Sahm Hermann
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2025-10-18
Also published as: WO2007045210A1; KR20080049094A; ZA200804137B; DE102005049527A1; US20090181435A1; JP2009511076A; BRPI0617498A2; EP1937823A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure-produzierenden Organismus reduziert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin sowie dafür geeignete Gensequenzen, Vektoren und Mikroorganismen.
Stand der Technik
Die Aminosäure L-Serin findet in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, der Lebensmittelindustrie und in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie L-Serin produzieren. So ist ein coryneformes Bakterium beschrieben, das eine Resistenz gegenüber Azaserin oder beta-(2-Thienyl)-DL-Alanin aufweist und L-Serin produziert ( EP 0 943 687 A2 ). Ferner ist es Stand der Technik, dass mittels gentechnischer Methoden Aktivitäten des Biosynthesewegs erhöht werden können und dies zu erhöhter Aminosäurebildung führt. So ist zum Beispiel in EP 0 931 833 A2 beschrieben, dass eine Erhöhung des Biosyntheseenzyms Phosphoserin-Phosphatase und Phosphoserin-Transaminase vorteilhaft für die L-Serinbildung ist. Ferner ist beschrieben, dass ein Gen das für die D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodiert für die L-Serinbildung genutzt werden kann ( EP 0 931 833 A2 , WO 93/12235 A1 ).
Es ist darüber hinaus bekannt, dass neben einer Erhöhung der Aktivität von Enzymen des L-Aminosäuresynthesewegs auch die Verminderung oder sogar die Ausschaltung von Enzymen die an Abbaureaktionen der L-Aminosäure beteiligt sind zu einer Verbesserung der L-Aminosäureakkumulation führen können. So ist gefunden, dass die Ausschaltung des Enzyms L-Serindehydratase zu höheren L-Serin-Akkumulationen führt ( WO 2004/081166 A2 ). Ferner führt auch eine Verminderung der Aktivität des Enzyms Serinhydroxymethyltransferase zu einem verringerten L-Serinabbau ( US-Patent 6,596,516 ; Simic et al. (2002) Appl. Environ Microbiol. 68: 3321–3327).
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und einen dafür geeigneten Mikroorganismus sowie Vektoren zur Verfügung zu stellen mit denen die Produktion von L-Serin gesteigert werden kann. Weiterhin soll ein Verfahren, sowie Mikroorganismen und Vektoren zur Verfügung gestellt werden, mit denen eine Steigerung der Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin erzielt werden kann.
In überraschender Weise wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Modifizierung oder Ausschaltung der für die Folsäuresynthese kodierenden Gene in verbesserter Weise L-Serin produzieren. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren sowie den erfindungsgemäßen Bakterien und den erfindungsgemäßen Gensequenzen die für Enzyme oder Regulatoren, die die Folsäuresynthese katalysieren, bzw. an der Regulation der Folsäuresynthese beteiligt sind, ist es nunmehr möglich, L-Serin mit einer Ausbeute herzustellen, die erheblich höher liegt, als die der nicht erfindungsgemäß veränderten Stämme. Der Umfang der Steigerung der L-Serin-Produktion ist in Tabelle 2 dargestellt.
Im Folgenden soll die Erfindung in der allgemeinen Form beschrieben werden:
Erfindungsgemäß wird die L-Serinproduktion sowie die Produktion von Cystein, Tryptophan und Methionin dadurch gesteigert, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure produzierenden Organismus verringert wird. Vorzugsweise produziert der Organismus bereits vor der erfindungsgemäßen Veränderung L-Serin.
Beispielsweise kann die Verringerung der Folsäurekonzentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder deren Abbau erreicht werden.
Die Verringerung oder Verhinderung der Synthese von Folsäure kann durch gerichtete oder ungerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erreicht werden.
Beispiele für Mutationen, die zu einer Verringerung oder Ausschaltung der Folsäureproduktion führen, sind die Deletionsmutation, Insertionsmutation, Substitutionsmutation oder eine Punktmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind.
Weiterhin kann bei genetisch veränderten oder unveränderten Genen von Proteinen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind eine Verringerung oder Ausschaltung der Folsäureproduktion erfolgen, indem die Expression von an der Biosynthese von Folsäure beteiligten Genen verringert oder verhindert wird.
Eine Verringerung oder Ausschaltung der Expression von Genen, die am Biosyntheseweg von Folsäure beteiligt sind kann durch Veränderung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung von Promotoren, wie Signalstrukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen oder Startkodons, Terminatoren, oder weiterhin durch Veränderung, vorzugsweise Abschwächung, besonders bevorzugt Ausschaltung oder Schwächung von Regulatoren, oder der Stabilität der Transskripte erreicht werden. Weiterhin können regulierbare Promotoren, insbesondere abgeschwächte Promotoren eingesetzt werden.
Auf der Enzymebene kann die Aktivität der an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Enzyme durch Reduzierung oder Ausschaltung der katalytischen Aktivität und der Stabilität der Enzyme erreicht werden. Die gleiche Wirkung kann durch Veränderung des allosterischen Zentrums bzw. einer Feedback-Inhibierung der Enzyme erreicht werden. Typische Möglichkeiten die Aktivität der Enzyme zu vermindern oder auszuschalten ist die Proteinmodifikation beispielsweise durch Phosphorylierung oder Adenylierung. Es kann auch der proteolytische Abbau von am Biosyntheseweg der Folsäure beteiligten Enzymen gesteigert werden.
Typische Enzyme, deren Aktivität auf die beschriebene Art verringert oder ausgeschaltet werden kann, sind GTP-Cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpyrophosphatase, Neopterinaldolase, 6-Hydroxymethylpterinpyrophosphokinase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, der ein Tool beinhaltet, welches geeignet ist erfindungsgemäße genetische Veränderungen in einem Produktionsorganismus herbeizuführen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren beinhalten Tools welche geeignet sind, das Gen für die Synthese von 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase und oder 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase zu deletieren.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthasegens ist in Seq. Nr. 1 dargestellt. Seq. Nr. 2 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 1 trägt.
Die Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 3 dargestellt. Seq. Nr. 4 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 3 trägt.
Sequenz für die Deletion des 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthasegens und des 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyasegens ist in Seq. Nr. 5 dargestellt. Seq. Nr. 6 zeigt die Struktur eines Vektors, welcher die Seq. Nr. 5 für die Deletion des 4-Amino-4deoxy-chorismatsynthasegens und des 4-Amino-4deoxy-chorismatlyasegens trägt.
In Seq. Nr. 7 ist ein Plasmid dargestellt, welches geeignet ist, die L-Serin-Produktion zusätzlich zu steigern. Es entspricht dem in 4 dargestellten Plasmid mit der Bezeichnung pEC-T18mob2-serA^fbrCB-.
Die für die Deletion verantwortlichen Strukturen können auch in andere Vektorgerüste eingebaut werden, die für den entsprechenden Organismus geeignet sind. Als Vektoren kommen neben den häufig verwendeten cyclischen Vektoren auch lineare Vektoren oder Phagen in Frage.
Die Figuren zeigen Vektoren, die beispielhaft für die erfindungsgemäßen Veränderungen des L-Serin Produzierenden Organismen herangezogen werden können. Es zeigt:
1: pK19mobsacB_aabAB entsprechend Seq. Nr. 2.
2: pK19mobsacB_pabC entsprechend Seq. Nr 4.
3: pK19mobsacB_pabABC entsprechend Seq. Nr 6.
4: pEC-T18mob2-serA^fürCB entsprechend Seq. Nr 7.
Vorzugsweise werden die Tools nach den Sequenzen 1, 3 und 5 auf Vektoren in L-Serin-Produktionsorganismen eingebracht, welche bereits vor der Veränderung L-Serin produzieren.
Alle angegebenen Sequenzen sollen auch Varianten umfassen, welche 90%, vorzugsweise 95% Homologie besitzen.
Geeignete Organismen sind Beispielsweise Corynebacterien, wie Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium. Es können auch Enterobakterien, Bacillaceen oder Heefearten, die eine verringerte Folsäurekonzentration aufweisen als Produktionsorganismen eingesetzt werden.
Im Folgenden soll die Erfindung genauer beschrieben werden:
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Serin unter Verwendung von coryneformen Bakterien, bei denen die Gene, die für die Folsäuresynthese kodieren, modifiziert, ausgeschaltet oder in ihrer Expression verändert werden oder aber bei natürlicherweise Folsäure bedürftigen Bakterien ein Folsäuremangel herbeigeführt wird, oder aber die Regulation der Folsäuresynthese derartig beeinflusst wird das Folsäuremangel entsteht. Da die Folsäuresynthese von einem Intermediat der Nukleotidsynthese sowie einem Intermediat der Synthese aromatischer Aminosäuren ausgeht, können prinzipiell auch diese entsprechenden Reaktionen modifiziert oder ausgeschaltet werden, vorausgesetzt, dass Nukleotide und aromatische Aminosäuren selbst noch ausreichend zur Verfügung stehen, wie es zum Beispiel durch externe Supplementation der Fall ist. Darüber hinaus kann der Folsäuremangel auch durch Deletion oder Modifikation von Regulatoren, die die Expression von Genen der Folsäure oder der damit verknüpften Stoffwechselwege, kontrolliert herbeigeführt werden.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Unteransprüchen.
Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise bereits vor der Modifizierung der Folsäuresynthese L-Serin.
Der Begriff Modifizierung beinhaltet die Abschwächung von Folsäuresynthesegenen und die vollständige Deletion von Folsäuresynthesegenen. Hierzu gehören ungerichtete Mutagenesen sowie gerichtete rekombinante DNA-Techniken. Mit Hilfe dieser Methoden können zum Beispiel Gene der Folsäuresynthese im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69–73) oder auch Link et al. (J. Bacteriology (1998) 179: 6228–6237) beschrieben. Auch können nur Teile des Gens deletiert werden oder auch mutierte Fragmente von Genen ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so der Verlust, oder eine Reduktion der Folsäuresynthese-Aktivität, erreicht. Eine vorteilhafte Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist beispielsweise der erfindungsgemäß veränderte C. glutamicum Stamm ATCC13032DpykDsdaADpabAB pserABC, der unter anderem eine Deletion im pabAB-Gen trägt.
Eine weitere Möglichkeit die Aktivität der Folsäuresynthese abzuschwächen oder auszuschalten sind Mutageneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit anschließender Suche der gewünschten Mikroorganismen auf Verminderung oder Verlust der Folsäuresynthese-Aktivität. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) nachgelesen werden.
Darüber hinaus kann auch die Expression von Genen der Folsäuresynthese durch Veränderung der Signalstrukturen zur Genexpression reduziert werden. Signalstrukturen sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol. 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al. (Microbiology (1996) 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik”, 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990). Es kann die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden.
Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Serinbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Dies kann erreicht werden, indem die Stabilität durch zusätzliche und/oder veränderte Sequenzen am 5'-Ende oder 3'-Ende des Gens geschwächt wird. Beispiele dazu sind für Gene aus Bacillus subtilis (Microbiology (2001) 147: 1331–41) oder Hefe (Trends Biotechnol. 1994, 12: 444–9) beschrieben. Es ist ferner möglich, durch intrinsische proteolytische Aktivität, wie beschrieben, die Enzymaktivität zu beeinflussen (Mol Microbiol. (2005) 57: 576–91).
Des Weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym der Folsäuresynthese mit geringer Aktivität kodieren. Mutationen, die zu einer Veränderung oder Reduktion der katalytischen Aktivität von Enzymproteinen führen, sind bekannt. Beispiele dazu finden sich in den Arbeiten von Qiu and Goodman (J Biological Chemistry (1997) 272: 8611–8617), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry (1997) 61: 1760–1762) und Möckel (”Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms”, Reports from the Jülich Research Centre, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Zusammenfassende Darstellungen können in Textbüchern der Genetik und der Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. dem von Hagemann (”Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression und Aktivität der Folsäuresynthese-Enzyme durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EP 0 472 869 , im US Patent 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246 .
Auf diese Weise können Gene der Folsäuresynthese von C. glutamicum vermindert exprimiert oder deletiert, oder die Enzymaktivitäten reduziert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vorteilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe,

• das für die 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierende serA-Gen,
• das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
• das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen zu verstärken insbesondere zu überexprimieren, oder Allele dieser Gene, insbesondere
• die für feedback-resistente 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierenden serA-Gene einzeln oder in Kombinationen zu verstärken oder zu überexprimieren,

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Serin vorteilhaft sein, zusätzlich zum herbeigeführten Mangel an Folsäure eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe,

• das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen,
• das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen,
• das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen,
• das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen,
• das für die beta-Untereinheit der Tryptophansynthase kodierende trpB-Gen,
• das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen,
• das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination zu reduzieren oder zu deletieren.

Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen umfassen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Bakterien aus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, die durch klassische und/oder molekulagenetische Methoden derart verändert sind, dass ihr Stoffwechselfluss verstärkt in Richtung der Biosynthese von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft. Die vorliegende Erfindung umfasst hierbei sämtliche bereits bekannten Aminosäure-Produktionsstämme. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfasst, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe-Arten nach gängiger Methode herstellen kann. Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Aminosäure-Produktionsstämme umfasst, bei denen der Abbau von L-Serin verändert oder abgeschwächt ist. Dies kann beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an L-Serin degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen. Im Folgenden sollen einige erfindungsgemäß geeignete Mikroorganismen beispielhaft genannt werden. Diese Auswahl gilt jedoch nicht beschränkend:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine pabAB und pabC-Gensequenz Nr. 1, 3 und 5, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil der Sequenz mittels definierter Deletion herausgeschnitten wurde, so dass nur inaktivierte oder abgeschwächte Aminodeoxychorismatsynthase oder Aminodeoxychorismatlyase Aktivität resultieren kann. Die pabAB und pabC-Gensequenzen werden vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium isoliert. Beispielhaft seien hier einige näher spezifizierte Mikroorganismen aufgeführt:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERN BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder
Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Beispiel 1:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabAB
Das pabAB-Gen von C. glutamicum wird nach bekannten Methoden im Chromosom durch ein um 1734 bp verkürztes pabAB-Gen ersetzt (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228–37; Gene (1994) 145: 69–73). Zur Konstruktion des für den Genaustausch verwendeten Vektors wurden die nachfolgend angegebenen Primer synthetisiert, die von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession-Nummer YP_225287; NC_006958) abgeleitet wurden: pabAB-del-A
pabAB-del-B:
pabAB-del-C:
pabAB-del-D:
Primer pabAB-del-A beginnt 522 bp vor dem Translationsstart und pabAB-del-D 436 bp hinter dem Translationsstop des pabAB-Gens. Der Primer pabAB-del-B liegt 21 bp hinter dem Translationsstart, der primer pabAB-del-C liegt 66 bp vor dem Translationsstop und beide verfügen über jeweils komplementäre Linker-Regionen wie bei Link et al. angegeben (J. Bacteriol. (1997) 179: 6228–37). Parallel wurden mit der Primerkombination pabAB-del-A und pabAB-del-B sowie der Primerkombination pabAB-del-B und pabAB-del-C mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 PCR-Amplifikationen durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 600 nM der entsprechenden Oligonukleotide, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 40 Sekunden. Der Elongationsschritt bei 72°C wurde nach 10 Zyklen um 5 Sekunden pro Zyklus verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 563 bp große Fragment des 5'-flankierenden Bereichs, sowie das 528 bp große Fragment des 3'-flankierenden Bereichs mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und beide Fragmente als Template in die zweite PCR mit den Primern pabAB-del-A und pabAB-del-D eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte in 35 Zyklen in Gegenwart von 200 μM Deoxynukleotidtriphosphaten, je 600 nM des entsprechenden Oligonukleotids, jeweils 20 ng der isolierten Template-DNA aus der ersten PCR, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten der Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung unter folgenden Bedingungen:
94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 80 Sekunden. Der Elongationsschritt wurde nach 10 Zyklen um jeweils 5 Sekunden verlängert. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1122 bp lange DNA-Fragment, dass nun das inaktivierte pabAB-Gen mit einer 1734 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert, und in den Vektor pK19mobsacB kloniert (Gene 145: 69–73 (1994). Das daraus resultierende Plasmid pK19mobsacBDpabAB (1) wurde durch Sequenzierung auf seine Richtigkeit bestätigt.
Beispiel 2:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation wurden wiederum von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession-Nummer YP_225288.1; NC_006958) abgeleitet. Sie sind nachfolgend angegebenen: pabC-del-A:
pabC-del-B:
pabC-del-C:
pabC-del-D:
Primer pabC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabC-del-D 500 bp hinter dem Translationsstop des pabC-Gens. Die Primer pabC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart und pabC-del-C 48 bp vor dem Translationsstop. Die letzten zwei Primer verfügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Primerkombination pabC-del-A und pabC-del-B ein 602 bp großer 5'-flankierender Bereich sowie mit der Primerkombination pabC-del-C und pabC-del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierenden Fragments amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren, wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032, durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA-Fragmente mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) isoliert und beide Fragmente als Template in einer weiteren PCR eingesetzt. Als Primer wurden pabC-del-A und pabC-del-D eingesetzt. Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1178 bp lange DNA-Fragment, das nun das inaktivierte pabC-Gen mit einer 585 bp langen zentralen Deletion beinhaltet, aus einem 0,89%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB ligiert (Schäfer et al. Gene 145: 69–73 (1994). Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645–4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (2) wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.
Beispiel 3:
Konstruktion des Plasmids pK19mobsacBDpabABC
Analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde zur Deletion des pabABC-Gens von C. glutamicum der für den Genaustausch geeignete Vektor pK19mobsacBDpabABC konstruiert. Die dazu erforderlichen Primer zur PCR-Amplifikation, abgeleitet von der öffentlich zugänglichen Genom-Sequenz (NCBI Accession-Nummer YP 225287; YP 225288.1; NC 006958), sind nachfolgend angegebenen: pabABC-del-A:
pabABC-del-B:
pabABC-del-C:
pabABC-del-D:
Primer pabABC-del-A beginnt 500 bp vor dem Translationsstart und pabABC-del-D 500 bp hinter dem Translationsstop des pabABC-Gens. Primer pabABC-del-B liegt 51 bp hinter dem Translationsstart von pabAB und pabABC-del-C 48 bp vor dem Translationsstop von pabC. Die letztgenannten zwei Primer verfügen jeweils über komplementäre Linker-Regionen. Parallel wurde mit der Primerkombination pabABC-del-A und pabABC-del-B ein 593 bp großer 5'-flankierender Bereich sowie mit der Primerkombination pabABC-del-C und pabABC-del-D ein 597 bp großer 3' flankierender Bereich des zu deletierenden Fragments amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurden die erhaltenen DNA-Fragmente mit dem QIAExII Gelextraktionskit (Qiagen) isoliert, und beide Fragmente als Template in einer weiteren PCR eingesetzt. Als Primer wurden die Primer pabABC-del-A und pabABC-del-D eingesetzt. Die PCR-Reaktion wurde nach den Standardverfahren wie beispielsweise in Beispiel 1 mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Nach der PCR-Reaktion wurde das erhaltene 1169 bp lange DNA-Fragment, das das inaktivierte pabABC-Gen mit einer 2475 bp langen zentralen Deletion beinhaltet aus einem 0,8%igen Agarose-Gel isoliert und mit dem Vektor pK19mobsacB ligiert (Schäfer et al. Gene 145: 69–73 (1994). Mit dem Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645–4649) transformiert. Das erhaltene Plasmid pK19mobsacBDpabC (3) wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung auf seine Richtigkeit überprüft.
Beispiel 4:
Konstruktion der Folsäure auxotrophen Stämme C. glutamicum DsdaADpabAB, C. glutamicum DsdaADpabC, C. glutamicum DsdaADpabABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpabAB, bzw. pK19mobsacBDpabC und pK19mabsacBDpabABC in C. glutamicum DsdaA der in der Patentanmeldung PCT/DE2004/000248 beschrieben ist eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert. Nur solche Klone, bei denen das Plasmid über homologe Rekombination in das Chromosom integriert war, waren Kanamycin-resistent. Es wurde jeweils ein Klon ausgewählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte (Gene (1994) 145: 69–73). Dieser wurde in 50 ml BHI-Medium (Brain-Heart-Infusion-Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2-, 10-3- bzw. 10-4-fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS-Platten (BHI-Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10% (w/v) Saccharose ausplattiert (FEMS Microbiol Lett. (1989) 53: 299–303). Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivität überprüft und über PCR-Analyse verifiziert. Dabei wurden folgende Primerkombinationen verwendet: Deletion von pabAB:
Deletion von pabC:
Deletion von pabABC:
Die erfolgreiche Deletion ergab für den pabAB Genort eine Bande von 1426 bp, für den pabC Genort eine Bande von 1663 bp und für den pabABC Genort eine Bande von 1447 bp. Auf diese Weise konnten vom Ausgangsstamm Klone erhalten werden, die jeweils über spezifische Deletionen in Genen der Folsäuresynthese verfügen.
Diese Stämme wurden als C. glutamicum DsdaADpabAB, C. gluta-micum DsdaADpabC, bzw. C. glutamicum DsdaADpabABC bezeichnet.
Diese drei Stämme wurden auf dem Minimalmedium CGXIT (J Bacteriol. (1993) 175: 5595–603) ausplattiert, sowie auf identischem Medium, das 1 mM Folsäure enthielt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Folsäurebedürftigkeit der hergestellten Mutanten von Corynebacterium glutamicum.

Wachstum

Folsäure C. glu. DsdaA C. glu. DsdaADpabAB C. glu. DsdaADpabC C. glu. DsdaADpabABC

0 mM + – – –

1 mM + + + +
Beispiel 5:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pEC-T18mob2-serAfbrserCserB in den Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB eingebracht. Das Plasmid (4) setzt sich zusammen aus dem Vektor pEC-T18mob2 (Curr. Microbiol. (2002) 45, 362–367), den corynebakteriellen Genen serAfbr (Appl Microbiol Biotechnol. (2002) 60: 437–41) sowie serC und serB ( Deutsche Patentanmeldung 100 44 831.3 ). Tetracycline resistente Klone wurden mittels bekannter Standardverfahren auf Anwesenheit und Integrität des Plasmids pEC-T18mob2-serAfbrserCserB geprüft (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und ein Klon als C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC bezeichnet.

Zur L-Serinbildung wurde der Stamm C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC in Komplexmedium (CgIII mit 2% Glukose, 5 μg/l Tetracyclin) angezogen und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595–5603) daraus beimpft. Das Fermentationsmedium CGXII enthielt 0,1 oder 1 mM Folsäure. Als Kontrolle wurde der Stamm C. glutamicum DsdaA pserABC in gleicher Weise kultiviert. Es wurden je mindestens zwei unabhängige Fermentationen durchgeführt. Nach Kultivierung für 30 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Upm wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Analyse der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitchromatographie (J Chromat (1983) 266: 471–482). Das Ergebnis der Fermentation ist in Tabelle 2 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Nutzung der konstruierten und beschriebenen Mutante in der Folsäuresynthese ein Verfahren darstellt, um die L-Serinbildung entscheidend zu verbessern. Tabelle 2: Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaA pserABC.

Folsäure (mM)	Stamm	L-Serin (mM)
0,01	C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC	49
0,1	C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC	89
1,0	C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC	2
0,01	C. glutamicum DsdaA pserABC	2
0,1	C. glutamicum DsdaA pserABC	1
1,0	C. glutamicum DsdaA pserABC	1

Beispiel 6:
Konstruktion und L-Serinbildung des Stammes C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC.
Mittels Elektroporation wurde das Plasmid pK19mobsacBDpyk (Arch Microbiol. (2004) 182: 354–63) in den Stamm C. glutamicum 13032DsdaADpabABC eingebracht und auf Kanamycin-Resistenz selektioniert. Nur solche Klone, bei denen das Plasmid über homologe Rekombination in den chromosomalen pyk-Genlokus integriert war, waren Kanamycin-resistent. Es wurde ein Klon ausgewählt, der nach Überprüfung die durch das Plasmid vermittelte Saccharose-Sensitivität zeigte und in 50 ml BHI-Medium (Brain-Heart-Infusion-Medium, Difco Laboratories, Detroit, USA) ohne Kanamycin und Saccharose kultiviert. Anschließend wurden je 100 μl einer 10-2, 10-3- bzw. 10-4-fachen Verdünnung der Kultur auf BHIS-Platten (BHI-Medium mit 0,5 M Sorbitol) mit 10% (w/v) Saccharose ausplattiert. Die erhaltenen Saccharose resistenten Klone wurden dann auf Kanamycin-Sensitivität überprüft und über PCR-Analyse die erfolgreiche Deletion verifiziert. Auf diese Weise konnte vom Ausgangsstamm der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB erhalten werden. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit pEC-T18mob2-serAfbrserCserB transformiert und es wurde dadurch der Stamm C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC erhalten. Dieser Stamm wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, zur L-Serinbildung im Vergleich mit C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC herangezogen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand von C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC und C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC.

Folsäure (mM) Stamm L-Serin (mM)

0,1 C. glutamicum DsdaADpabAB pserABC 89

0,1 C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC 98

1,0 C. glutamicum DpykDsdaADpabAB pserABC 2

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Serin, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration in einem Aminosäure-produzierenden Organismus reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch Verringerung der Synthese von Folsäure oder durch deren Abbau verringert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Folsäurekonzentration durch gerichtete oder angerichtete Mutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung der Folsäureproduktion durch Deletionsmutation, Insertionsmutation, Punktmutation und/oder Substitutionsmutation von Genen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression, von an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Gene, verringert oder reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression durch Veränderung bzw. Abschwächung oder Ausschaltung von Promotoren, Signalstrukturen, Repressorgenen, Aktivatoren, Operatoren, Attenuatoren, Ribosomenbindestellen, Startkodons, Terminatoren, Regulatoren, die Stabilität der Transkripte verringert wird oder das regulierbare Promotoren eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für GTP-Cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpyrophosphatase, Neopterinaldolase, 6-Hydroxymethylpterinpyrophosphokinase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase verändert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene kodierend für Amino-4-deoxy-chorismatsynthase deletiert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr. 1 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Nr. 2 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gen kodierend für 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase deletiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNS nach Seq. Nr. 3 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass für die Deletion ein Vektor nach Seq. Nr. 4 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen kodierend für Amino-4-deoxy-chorismatsynthase und 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase deletiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mit einer DNA Sequenz nach Seq. Nr. 5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor nach Seq. Nr. 6 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass für die Synthese von L-Serin ein Organismus eingesetzt wird, der bereits vor der Veränderung L-Serin produziert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus über ein Plasmid nach Seq. Nr. 7 verfügt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Aktivität der an der Biosynthese der Folsäure beteiligten Enzyme abgeschwächt oder ausgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschwächung oder Ausschaltung durch Verringerung der Stabilität erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Verringerung oder Ausschaltung durch Veränderung des allosterischen Zentrums erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der Enzyme durch Phosphorylierung oder Adenylierung verringert oder ausgeschaltet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das die Enzyme durch proteolytischen Abbau in ihrer Aktivität verringert oder ausgeschaltet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym aus der Gruppe bestehend aus GTP-Cyclohydrolase, Neopterintriphosphatpyrophosphatase, Neopterinaldolase, 6-Hydroxymethylpterinpyrophosphokinase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatsynthase, 4-Amino-4-deoxy-chorismatlyase, Pteroatsynthase, Folatsynthase und Dihydrofolatreduktase in seiner Aktivität verringert oder ausgeschaltet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eins oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe – das für die 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierende serA-Gen, – das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen, – das für die Phosphoserin-Phosphatase kodierende serB-Gen, einzeln oder in Kombinationen verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass Allele dieser Gene, insbesondere die für feed-back-resistente 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodierenden serA-Gene einzeln oder in Kombinationen verstärkt oder überexprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe – das für die Cystathioninlyase kodierende aecD-Gen, – das für die Cystathioninlyase kodierende metC-Gen, – das für die Serindehydratase kodierende sdaA-Gen, – das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen, – das für die beta-Untereinheit der Tryptophansynthase kodierende trpB-Gen, – das für die Threonindehydratase kodierende ilvA-Gen, – das für die Pyruvatkinase kodierende pyk-Gen einzeln oder in Kombination in seiner Aktivität reduziert oder deletiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Corynebakterium, Brevibakterium, Bacillaceen, Enterobakterium ein Methanol verwertendes Bakterium oder eine Hefe eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Synthese von Cystein, Trytpophan oder Methionin eingesetzt wird.
Gensequenz die mindestens eine 85%-ige Homologie zu den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 aufweist.
Gensequenz nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit den Seq. Nr. 1, 3 oder 5 identisch ist.
Vektor, dessen Gensequenz mindestens eine 85%-ige Homologie zu den Sequenzen Nr. 2, 4 oder 6 aufweist.
Vektor nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass er mit den Vektoren der Seq. Nr. 2, 4 oder 6 identisch ist.
Vektor die mindestens eine 85%-ige Homologie zu der Seq. Nr. 7 aufweist.
Vektor nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass er mit der Seq. Nr. 7 identisch ist.
Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er nach mindesten einem der Schritte des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 27 verändert ist.
Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Corynebakterium, Brevibakterium, Bacillacceen, Enterobakterium oder eine Hefe ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 38. dadurch gekennzeichnet, dass er ein Organismus aus der Gruppe bestehend aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 oder Brevibacterium divaricatum ATCC14020 ist.