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Die
Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von mehrfach geladenen
Ionen aus einfach geladenen Ionen von Analytsubstanzen, insbesondere
von Biopolymeren. Die mehrfach geladenen Ionen erlauben die Anwendung
von Verfahren zur Fragmentierung, die in besonderer Weise für Strukturanalysen durch
Tandem-Massenspektrometrie geeignet sind.
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Die
Erfindung geht von einfach protonierten Ionen der Analytsubstanzen
aus, wie sie von vielen Arten von Ionenquellen geliefert werden,
und protoniert die einfach geladenen Ionen zu mehrfach protonierten
in einer Reaktionszelle durch gleichzeitiges, beschleunigtes Einschießen von
protonierten Ionen solcher Substanzen, die nur eine sehr geringe
Protonenaffinität
haben.
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Die
Tandem-Massenspektrometrie hat sich in den letzten vier Jahrzehnten
zu einem außerordentlich
erfolgreichen Zweig der Massenspektrometrie entwickelt. Ein Tandem-Massenspektrometer
(abgekürzt
MS/MS) filtert zunächst
aus einem Angebot eines Ionengemisches, meist in Form eines kontinuierlichen
Ionenstrahls, eine vorgewählte
Ionensorte aus, fragmentiert diese Ionensorte, und misst in einem
Massenanalysator das Spektrum der Fragment-Ionen. Die Ionen der
ausgewählten
Ionensorte werden häufig „Eltern-Ionen" genannt, die Fragment-Ionen
heißen
häufig „Tochter-Ionen" oder auch „Bruchstück-Ionen".
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Die
Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie liegt darin, dass sie durch
die Aufnahme der Fragment-Ionenspektren einerseits Einblicke in
die Struktur der selektierten Eltern-Ionen und andererseits eine sichere
Identifizierung der Art der Eltern-Ionen ermöglicht. In den Biowissenschaften
ermöglicht sie
insbesondere die Bestimmung von Sequenzen in Biopolymeren (oder
zumindest von Teilen dieser Sequenzen und auch von Modifizierungen
dieser Sequenzen). Insbesondere ermöglicht sie die Bestimmung von
Aminosäuresequenzen
in Proteinen und Peptiden.
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Die
Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie ist weiterhin dadurch gestiegen,
dass die beiden fast ausschließlich
angewandten Ionisierungsverfahren für Biomoleküle, Elektrosprühen (ESI)
und matrix-unterstützte
Laserdesorption (MALDI), außerordentlich
zart sind (so genannte „weiche" Ionisierungsverfahren)
und selbst praktisch keine Fragment-Ionen liefern, wie das für die frühen Ionisierungsverfahren
wie Elektronenstoß-Ionisierung
der Fall war. Die zarten Ionisierungsverfahren liefern nur so genannte
Pseudo-Molekül-Ionen,
meist protonierte oder deprotonierte Moleküle, die als einzige Information
die Masse des Moleküls
liefern, aber darüber hinaus
keine weiteren Kenntnisse über
Identität
und Struktur der Moleküle.
Für Strukturuntersuchungen, ja
bereits für
eine sichere Identifizierung einer Substanz sind daher weitergehende
Informationen notwendig, wie sie praktisch nur die Tandem-Massenspektrometrie
liefert. Selbst wenn es „nur" um eine quantitative
Bestimmung einer gesuchten, an sich bekannten Substanz handelt,
ist in der Bioanalytik eine sichere Identifizierung und damit die
Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie unabdingbar. In den Biowissenschaften
werden daher ganz überwiegend
Tandem-Massenspektrometer verwendet.
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Für die Informationen über die
Strukturen der Analytsubstanzen, die man mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie
aus deren Fragment-Ionen gewinnt, ist es außerordentlich vorteilhaft,
wenn die zu fragmentierenden Analyt-Ionen doppelt oder mehrfach
geladen vorliegen. Manche Fragmentierungsarten können überhaupt nur an mehrfach geladenen
Ionen vorgenommen werden. Elektrosprühen (ESI) erzeugt von sich
aus neben einfach geladenen Ionen auch beträchtliche Mengen an mehrfach
geladenen Ionen; es ist daher zu beobachten, dass das Elektrosprühen gegenüber anderen
Ionisierungsverfahren im Vormarsch ist. Da aber Elektrosprühen immer
eine flüssige
Phase voraussetzt, und Probenzuführungstransporte über flüssige Phasen
immer recht langsam sind und auch sonst einige Nachteile haben, ist
die zunehmende Begrenzung der bioanalytischen Massenspektrometrie
auf das Elektrosprühen
nicht durchwegs vorteilhaft. Die viel gepriesene Möglichkeit
der Kopplung mit Flüssigkeitschromatographie oder
Kapillar-Elektrophorese macht die Analyse insgesamt langsam, und
für die
Analyse der gerade in einem chromatographischen Peak angelieferten
Probe steht nur eine begrenzte Zeit zur Verfügung.
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Die
andere bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle ist die Ionisierung durch
matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI). Diese ionisiert die Proben aus der festen
Phase. Auf einem Probenträger
können
Hunderte von Proben aufgebracht werden. Dafür stehen Pipettierroboter zur
Verfügung. Der
Transport der Proben auf dem Probenträger in den Laserfokus dauert
nur Bruchteile von Sekunden, für
die Analyse dieser Probe steht so viel Zeit wie immer nötig zur
Verfügung
(bis zum vollständigen
Verbrauch der Probe). Für
die Identifizierung von tryptisch verdauten Proteinen, die durch
2D-Gelelektrophorese getrennt wurden, ist MALDI ideal. Auch die MALDI-Untersuchung
von Peptiden, die durch Flüssigkeitschromatographie
getrennt wurden, ist im Vormarsch (HPLC-MALDI). Es ist jedoch ein
Nachteil von MALDI, stets nur einfach geladene Ionen der Analytsubstanzen
zu liefern. Die bisherigen Verfahren der Analyse von MALDI-Ionen
in Flugzeitmassenspektrometern (MALDI-TOF und MALDI-TOF/TOF) haben Nachteile,
die hauptsächlich
in einer unzureichenden Massengenauigkeit liegen. Die Massengenauigkeit
ist selbst dann noch unbefriedigend, wenn jedes Massenspektrum einer
aufwändigen
mathematischen Nachkalibrierung an Hand von mit gemessenen Kalibriersubstanzen
unterzogen wird. Die unzureichende Massengenauigkeit wird durch
den MALDI-Prozess erzwungen, der den Ionen eine von Aufnahme zu
Aufnahme verschiedene Anfangsenergie mitgibt, die in einem mit axialem
Einschuss betriebenen Flugzeitmassenspektrometer zu ständigen Verschiebungen
der Ionensignale auf der Massenskala führen. Diese Instabilität der Massenskalierung
kennen andere Arten von Massenspektrometern nicht, darunter insbesondere
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss.
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Wir
haben bereits angedeutet, dass für
die Tandem-Massenspektrometrie, die in der Regel auf Massenspektrometern
mit stabiler Massenskala basieren, die Fragmentierung der selektierten
Ionen ein ganz wesentlicher Schritt ist. Hier hat sich über die letzten
Jahre die Erkenntnis herauskristallisiert, dass eine Fragmentierung,
die reich an Strukturinformationen ist, ganz bevorzugt von mehrfach
geladenen Ionen, mindestens aber von zweifach geladenen Ionen ausgeht.
Das gilt schon für
die älteste
Fragmentierungsart, die Stoßfragmentierung;
neuere Fragmentierungsarten, die auf der Übertragung von Elektronen beruhen,
können überhaupt
nur an mindestens doppelt geladenen Ionen ansetzen. Es ist also
für die Tandem-Massenspektrometrie
mit solchen Ionenquellen, die nur einfach geladene Ionen liefern,
eine wesentliche Frage, wie aus den einfach geladenen Ionen mindestens
doppelt geladene Ionen herzustellen sind.
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Elektrosprühen gelöster Biosubstanzen
und Desorption solcher Substanzen durch den Aufprall hoch geladener
Tröpfchen
(oder Cluster) sind bisher die einzigen Ionisierungsverfahren, die
zu mehrfach geladenen Bioanalyt-Ionen führen. Es muss anscheinend ein
Verdampfen des Lösungsmittels
aus einem hoch geladenen Tröpfchen
der Analytlösung
erfolgen, um zu mehrfach geladenen Ionen der Analytsubstanzen zu
gelangen. Andere Ionisierungsverfahren, unter ihnen die hoch interessante
matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI), aber auch chemische Ionisierung (CI) oder
Photoionisierung (PI), führen
nur zu einfach geladenen Ionen.
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Für Proteine
und Peptide hat sich inzwischen herausgestellt, dass es wohl im
Wesentlichen zwei grundsätzlich
verschiedene Arten der Fragmentierung dieser Biopolymere gibt. Diese
beiden Arten der Fragmentierung liefern voneinander unabhängige Informationen
(man spricht hier oft von „orthogonalen" Verfahren), wobei
ein Vergleich der Fragment-Ionenspektren der beiden Fragmentierungsarten
besonders wertvolle zusätzliche
Information ergibt. Ein Tandem-Massenspektrometer, das beide Arten
von Fragmentierung auf die gleichen Analyt-Ionen anzuwenden gestattet, ist daher
besonders wertvoll.
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Die
erste Art der Fragmentierung ist ein Zerfall der Eltern-Ionen, nachdem
sie durch einen oder mehrere Energieaufnahmeprozesse genügend innere
Energie aufgesammelt haben. Die Energie kann durch eine Vielzahl
von moderaten Stößen angesammelt
werden (CID = collision induced decomposition), aber auch durch
die Aufnahme einer Vielzahl von Infrarot-Quanten (IRMPD = infrared multi photon
decomposition). Die innere Energie verteilt sich dabei auf alle
inneren Schwingungssysteme des Eltern-Ions, wobei sich aber die
Lokalisierung der Energie stets ändert,
weil die Schwingungssysteme gekoppelt sind und daher fortdauernd
untereinander Energie austauschen. Tritt schließlich an einer Bindung des
Eltern-Ions eine Kraft auf, die die Bindungskraft übersteigt,
so bricht hier das Eltern-Ion in zwei Fragmente. Die Brüche betreffen
dabei in statistischer Weise nur solche Bindungen, die niedrige
Bindungsenergien aufweisen. Diese Art des Zerfalls führt bei
Proteinen überwiegend
zu so genannten b- und y-Fragment-Ionen. Für diese erste Art der Fragmentierung
ist es deshalb günstig,
von doppelt geladenen Ionen auszugehen, weil einfach geladene Ionen
nur schwer und nur unter Bildung sehr weniger Bruchstück-Ionen
fragmentieren. Bei der Fragmentierung von Peptid-Ionen entstehen
hier keine langen Signalleitern, die längere Teilstücke der
Aminosäuresequenzen
widerspiegeln. Die Fragment-Ionenspektren sind daher relativ informationsarm,
wenn von einfach geladenen Ionen ausgegangen wird.
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Eine
Abart davon ist die so genannte hochenergetische Stoßfragmentierung
(HE-CID). Bei Stößen im Bereich
kinetischer Energien von einigen Kiloeletronenvolt reicht ein Stoß, um zu
Fragmentierungen zu führen.
Hier kann man zwar von einfach geladenen Ionen ausgehen; die so
erzeugten Fragmentspektren sehen aber komplizierter aus als niederenergetische
CID-Fragment-Ionenspektren,
weil sie mehr Spontanfragmentierungen, beispielsweise Abspaltungen
von Seitenketten, und ebenfalls mehr Folgefragmentierungen (Doppel-
und Dreifach-Fragmentierungen
mit Auftreten so genannter innerer Fragmente) und daher insgesamt
mehr Fragment-Ionensignale enthalten. Diese Fragment-Ionenspektren
durch Hochenergie-Stöße sind
zwar informationsreich, aber schwer zu interpretieren und werden daher
eher vermieden. Prinzipiell enthalten diese Hochenergie-Fragment-Ionenspektren
von Proteinen ebenfalls vorwiegend b- und y-Fragment-Ionen.
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Die
zweite, grundsätzlich
andere Art der Fragmentierung wird durch einen Elektronenübertrag auf
mehrfach positiv geladene Eltern-Ionen hervorgerufen, wodurch ein
Proton neutralisiert wird; der Zerfall ist spontan und führt vorwiegend
zu so genannten c- und z-Fragment-Ionen,
wobei in der Regel die c-Fragment-Ionen überwiegen. Sie liefern sehr leicht
interpretierbare Fragment-Ionen, und eignen sich besonders für die Sequenzierung
von unbekannten Peptiden und Proteinen („De-novo-Sequenzierung"). Diese zweite Art
der Fragmentierung erfordert zwingend mehrfach geladene, mindestens
doppelt geladene, Ionen, damit nach Neutralisierung eines Protons
noch ein protoniertes Ion übrig
bleibt. Der Elektronenübertrag
kann durch direkten Einfang eines Elektrons (ECD = electron capture
dissociation), durch Übertragung
eines Elektrons eines negativ geladenen Ions (ETD = electron transfer
dissociation), oder durch den Übertrag
eines Elektrons aus einem hoch angeregten Atom auf das Elternion
hervorgerufen werden.
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Es
ist besonders günstig,
beide Fragmentierungsarten auf die gleichen Analyt-Ionen anwenden zu
können,
da der Vergleich der Fragmentierungsspektren durch konstante Massendifferenzen
sofort erkennen lässt,
welche der Ionensignale zu b- und c-Fragmenten, und welche zu y-
und z-Fragmenten gehören.
Dadurch wird die Sequenz sehr leicht eindeutig ablesbar, was bei
einem einzigen Fragment-Ionenspektrum durch die Mischung jeweils zweier
Fragmentsorten nicht der Fall ist.
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Die
Herstellung mehrfach negativ geladener Analyt-Ionen aus einfach
deprotonierten Analyt-Ionen ist bereits bekannt („Increasing
the Negative Charge of a Macroanion in the Gas Phase via Sequential
Charge Reversion Reactions",
M. He und S. A. McLucky, Anal. Chem. 2004, 76, 4189–4192).
Die Herstellung erfolgt dabei in zwei Schritten, in denen jeweils
negative und positive Ionen verschiedener Protonen-Affinitäten miteinander
reagieren. Das kann nur in Reaktionszellen vorgenommen werden, die
sowohl negative wie auch positive Ionen zu speichern gestatten,
beispielsweise in dreidimensionalen Ionenfallen mit Ring- und Endkappenelektroden. Eine
analoge Herstellung von mehrfach positiv geladenen Ionen ist noch
nicht bekannt geworden. Die Verwendung von Zweischritt-Verfahren
ist aber auch nicht besonders günstig
für die
Anwendung in Tandem-Massenspektrometern.
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Wenn
hier von „Masse
der Ionen" oder
auch nur einfach von „Masse" in Verbindung mit
Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene Masse" m/z gemeint, also
die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose
und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen,
die dieses Ion trägt.
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Unter „Analyse" einer Ionensorte
oder einer Substanz soll hier sowohl die Feststellung der Menge relativ
zu anderen Ionensorten oder anderen Substanzen (die „quantitative
Analyse") verstanden
werden, wie auch die Feststellung der Identität der Ionensorte oder Substanz
(die „qualitative
Analyse") über weitergehende
Messungen, beispielsweise aus Messungen der inneren Struktur der
Ionen, oder auch nur die Feststellung der Struktur, bei Biopolymeren
die Sequenz der unmodifizierten oder modifizierten Polymerbausteine
der Ionen einer Ionensorte überhaupt
(die „Strukturanalyse", „Sequenzanalyse", „Modifikationsanalyse" und dergleichen).
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Aufgabe der
Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren bereitzustellen, mit denen
aus einfach protonierten Analyt-Ionen mehrfach protonierte Analyt-Ionen
erzeugt werden können,
und es ist weiter die Aufgabe der Erfindung, Tandem-Massenspektrometer
bereitzustellen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet
werden kann, mehrfach protonierte Analyt-Ionen für eine informationsreiche Fragmentierung
zu erzeugen.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Im
Verfahren der Erfindung werden einfach protonierte Analyt-Ionen
und protonierte Donor-Ionen beschleunigt in einen Reaktionsraum
eingeschossen, wobei die Analyt-Ionen mit großer Ausbeute doppelt und sogar
mehrfach protoniert werden. Die Donor-Ionen sind Ionen von Substanzen,
die eine nur geringe Protonen-Affinität besitzen und leicht Protonen
abgeben. Günstig
für die
Erzeugung von Donor-Ionen sind beispielsweise Substanzen aus der Gruppe
der Phosphazene. Diese Reaktion ist überraschend, da sich nach bisheriger
Lehrmeinung die positiv geladenen Ionen durch Coulomb-Kräfte abstoßen und
sich kaum (außer
in sehr dichten, heißen Plasmen,
in denen sich aber die Analytsubstanzen zersetzen würden) so
nahe kommen können,
dass eine Protonen-Austausch-Reaktion zustande kommen könnte. Über den Mechanismus
kann bisher nur spekuliert werden. Es könnte sich um einen Tunnel-Effekt
der Protonen über
größere Abstände hinweg
durch den Coulombschen Potentialwall handeln.
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Für die Reaktion
ist es wesentlich, dass die beiden Ionenarten (oder zumindest eine
Ionenart) beschleunigt in den Reaktionsraum eingeschossen werden.
Dabei ist es günstig,
wenn der Reaktionsraum als geschlossene Reaktionszelle ausgebildet ist.
Günstig,
aber nicht unbedingt notwendig ist eine Reaktionszelle in der Form
eines Hochfrequenz-Multipol-Stabsystems,
das an beiden Enden Lochblendensysteme enthält, deren Potentiale die Ionen
größtenteils
wieder in die Reaktionszelle zurück
reflektieren. Die Analyt-Ionen wie auch die Donor-Ionen werden mit
einer Potentialdifferenz von mindestens zehn Volt, besser mit etwa
30 bis 50 Volt in die Reaktionszelle eingeschossen werden. Wahrscheinlich
(aber durchaus nicht sicher) findet die Protonenübertragung statt, wenn sich
die Analyt-Ionen und die Donor-Ionen
im Flug begegnen, entweder in frontalem Stoß oder zumindest in engem Vorbeiflug. Überraschend
ist dabei die hohe Ausbeute. Werden etwa gleiche Mengen an Analyt-Ionen
und Donor-Ionen eingeschossen, so werden (zumindest für die bisher untersuchten
Analyt-Ionen) weit mehr doppelt so viele protonierte Analyt-Ionen
erzeugt, als einfach protonierte Analyt-Ionen verbleiben. Ohne den Einschuss von
Donor-Ionen werden in der Regel keine mehrfach geladenen Analyt-Ionen
gebildet; unter bestimmten Bedingungen scheinen aber manchmal auch
Reaktionen stattzufinden, in der doppelt protonierte Ionen durch Übergabe
eines Protons von einem Ion zu einem anderen Ion gleicher Art entstehen (Auto-Ionisierung).
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Die
Analyt-Ionen und die Donor-Ionen können dabei die gleiche Beschleunigungsstrecke durchlaufen
und gleichzeitig durch das eingangsseitige Lochblendensystem eingeschossen
werden. Es ist daher vorteilhaft, Analyt-Ionen und Donor-Ionen zu
mischen und gemeinsam in die Reaktionszelle einzuschießen. Eine
Befüllung
der Reaktionszelle mit einem Dämpfungsgas
im Druckbereich von 10-2 bis 10 Pascal dämpft die
gebildeten Ionen nach einigen Millisekunden so, dass sie sich in
der Achse sammeln und durch ein elektrisches Extraktionsfeld, das nur
sehr achsennah im ausgangsseitigen Lochblendenbereich wirkt, herausgezogen
werden können.
Es ist so ein kontinuierlicher Betrieb der Reaktionszelle durchführbar, also
ein Betrieb, der kontinuierlich mehrfach geladene Analyt-Ionen liefert.
Es kann die Reaktionszelle aber auch diskontinuierlich betrieben werden.
Es ist bisher unbekannt, ob das Dämpfungsgas für die Protonenübertragungs-Reaktionen
notwendig ist.
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Das
erfindungsgemäße Tandem-Massenspektrometer,
das von dem erfindungsgemäßen Verfahren
der Herstellung mehrfach geladener Analyt-Ionen Gebrauch macht,
besteht mindestens aus einer Ionenquelle für die Analyt-Ionen, einer Ionenquelle
für die
Donor-Ionen, einer Beschleunigungsstrecke für die Analyt-Ionen und einer
für die
Donor-Ionen, wobei auch eine einzige Beschleunigungsstrecke für beide
Ionensorten gemeinsam genutzt werden kann, einer Reaktionszelle
für die
Erzeugung der mehrfach geladenen Analyt-Ionen, einer Selektionseinrichtung
zur Auswahl der mehrfach protonierten Analyt-Ionen für die Fragmentierung,
einer Fragmentierungseinrichtung für die ausgewählten Analyt-Ionen,
und einem Massenanalysator zur Aufnahme des Massenspektrums der
Fragment-Ionen.
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Als
Ionenquelle für
die Analyt-Ionen kann im Prinzip jede Ionenquelle für die Ionisierung
von Analytsubstanzen verwendet werden; in besonderer Weise kommen
hier aber solche Ionenquellen in Frage, die generell vorteilhaft
sind, aber nur einfach protonierte Analyt-Ionen herstellen können, wie
beispielsweise die chemische Ionisierung (CI) oder die Ionisierung
durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI). Die CI- oder MALDI-Ionenquellen können sich dabei
innerhalb oder auch außerhalb
des Vakuumsystems des Massenspektrometers befinden. Als Ionenquellen
für die
Donor-Ionen kommen ebenfalls alle Ionenquellenarten in Betracht,
günstig
sind hier Elektrosprühen
(ESI) und chemische Ionisierung. Auch diese Ionenquellen können sich
innerhalb oder außerhalb
des Vakuumsystems befinden.
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Als
Selektionseinrichtung kann, wie bei klassischen Tandem-Massenspektrometern,
ein Quadrupol-Massenfilter verwendet werden, das nur eine einzige
Ionensorte durchlässt
und alle anderen Ionensorten vernichtet. Dafür ist ein kontinuierlicher
Betrieb der Reaktionszelle günstig.
Es kann aber auch ein Ionentor verwendet werden, dass eine ausgewählte Ionensorte
exportiert und die anderen Ionen unbeschädigt vor dem Ionentor für spätere Analysen zurückhält, wobei
diese Ionen in einer geeignet geformten Zelle zwischengespeichert
werden. Ein solches Verfahren erzeugt einen diskontinuierlichen
Betrieb der Reaktionszelle.
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Für die Fragmentierung
können
jetzt, da die Analyt-Ionen mehrfach geladen vorliegen, alle bekannten
Fragmentierungsarten zur Anwendung kommen.
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Als
Massenanalysatoren kommen prinzipiell fast alle Arten von Massenspektrometern
in Frage. Besonders günstig
sind aber hier Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss,
da sie eine schnelle Spektrennahme, eine hohe Massengenauigkeit,
einen hohen Massenbereich, eine gute Ausnutzung der Ionen („duty cycle") und einen hohen
dynamischen Messbereich bei vergleichsweise geringen Herstellungskosten
bieten.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
ein einfaches Schema eines Tandem-Massenspektrometers nach dieser
Erfindung. Kernstück
bildet die Reaktionszelle (6) mit quadrupolarem Polstabsystem
und den beiden Lochblendensystemen (5) am Eingang und (7, 8, 9)
am Ausgang der Reaktionszelle (6). Das Tandem-Massenspektrometer
enthält
im Eingangsteil eine MALDI-Probenträgerplatte (1), einen
UV-Pulslaser (19), der über
einen Spiegel (3) einen Lichtstrahl (2) auf eine
Probe auf der Probenträgerplatte
(1) schießen kann,
und einen Ionentrichter (4). In der CI-Ionenquelle (20)
werden die Donor-Ionen erzeugt, die ebenfalls in den Ionentrichter
(4) gegeben werden. Die Beschleunigung findet für beide
Ionensorten durch Potentialabfall im Lochblendensystem (5)
statt. Das Ende der Reaktionszelle (6) bildet mit dem Lochblendensystem
(7, 8, 9) das Ionentor, wobei die erste Lochblende
(7) für
die Anregung der ausgewählten Ionensorte
für den
Export geschlitzt sein kann (in der schematischen Darstellung nicht
sichtbar). In der Fragmentierungskammer (10) kann sowohl
Stoßfragmentierung
wie auch eine Fragmentierung durch Elektronenübertrag von hoch angeregten
Neutralatomen aus der FAB-Neutralteilchenquelle
(21) vorgenommen werden. Der Flugzeitmassenanalysator,
bestehend aus Linsensystem (11) zur Formung eines feinen
Ionenstrahls, Pulser (12), Reflektor (13) und Ionendetektor
(14) misst die Fragment-Ionenspektren. Ein Stickstoff-Generator
(18) liefert den Reinststickstoff für die Dämpfung in den verschiedenen Kammern
des Tandem-Massenspektrometers. Das Pumpsystem mit den Pumpen (15),
(16) und (17) erzeugt die verschiedenen Vakua
in den Kammern.
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2 gibt
als Beispiel ein Massenspektrum der Ionen wieder, die nach Einschuss
von einfach geladenen Ionen von Glu-Fibrinopeptid zusammen mit Donor-Ionen
(fluoriertem Phosphyzen) mit 40 Volt Beschleunigung in die Reaktionszelle
erhalten wurden. Es wurden dabei doppelt geladene Ionen des Glu-Fibrinopeptids
im Überschuss
gebildet.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
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Bevorzugte
Ausführungsformen
des Verfahrens zur Erzeugung mehrfach protonierter Analyt-Ionen
aus einfach protonierten Analyt-Ionen und des zugehörigen Tandem-Massenspektrometers
werden in den Ansprüchen
1 bis 20 dargelegt.
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Eine
günstige
Ausführungsform
des Verfahrens verwendet eine Reaktionszelle (6), die zwischen vier
Polstäben
ein quadrupolares Hochfrequenzfeld zum Einsperren der Ionen aufbaut.
An beiden Enden des Polstabsystems sind Lochblendensysteme (5) und
(7, 8, 9) angebracht, deren Potentialverteilung zum
Inneren der Reaktionszelle hin positiv geladene Ionen ganz überwiegend
reflektiert, selbst wenn diese durch die Beschleunigung beim Einschuss
höhere Geschwindigkeiten
haben. Nur solche Ionen, die sich sehr achsennah befinden, können die
Reaktionszelle (6) durch das ausgangsseitige Lochblendensystem (7, 8, 9)
verlassen. Das eingangsseitige Lochblendensystem (5) sorgt
durch seinen Potentialabfall für die
Beschleunigung der Analyt-Ionen und der Donor-Ionen beim Einschuss.
Beide Ionensorten werden in dieser günstigen Ausführungsform
gemeinsam eingeschossen. Im Inneren der Reaktionszelle (6)
befindet sich vorzugsweise Reinststickstoff mit einem Druck von
etwa 1 Pascal, wodurch sich die Ionen nach etwa 10 Millisekunden
abgekühlt
in der Achse des Polstabsystems der Reaktionszelle (6) einfinden
und von dort extrahiert (oder exportiert) werden können. Der
Druck des Reinststickstoffs bildet sich durch das Gleichgewicht
einer Zuströmung aus
dem Generator (19) in die Ionenquellenkammer, die dort
einen Druck von etwa 100 Pascal aufrecht erhält, der Durchströmung des
Lochblendensystems (5) und der Leistung der Pumpe (16).
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Werden
die Analyt-Ionen und die Donor-Ionen mit etwa 30 bis 50 Volt beschleunigt
eingeschossen, so bilden sich überraschend
hohe Anteile an mehrfach geladenen Analyt-Ionen. Die Hauptmenge der Analyt-Ionen,
die aus der Reaktionszelle extrahiert werden können, ist doppelt geladen,
es finden sich aber auch, je nach Art der Analytsubstanzen, drei- und vierfach protonierte
Analyt-Ionen. Bei diesem Vorgang der Erzeugung mehrfach geladener Analyt-Ionen
werden überraschend
wenige der Analyt-Ionen in der Reaktionszelle fragmentiert. Die
Donor-Ionen verbrauchen sich bei diesem Verfahren fast vollständig.
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In
entsprechenden Experimenten haben sich Donor-Ionen aus der Substanzgruppe
der Phosphazene bewährt.
Diese wurden in einfacher und üblicher
Weise durch Elektrosprühen
erzeugt. Es ist jedoch zu erwarten, dass sich andere Substanzen,
beispielsweise teil-fluorierte Kohlenwasserstoffe im Molekülgewichtsbereich
von 100 bis 400 atomaren Masseneinheiten, ebenso als Donor-Ionen
verwenden lassen. Solche Substanzen, die einen hohen Dampfdruck
haben, können
leicht in einer Ionenquelle (20) für chemische Ionisierung (CI-Ionenquelle)
in hohen Raten erzeugt werden.
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Können sich
durch Verunreinigungen oder durch Mitbringsel der eingeschossenen
Ionen auch Natrium- oder Kalium-Addukte bilden, so findet nicht nur
eine Protonierung der Analyt-Ionen,
sondern auch eine Beladung mit Natrium- oder Kalium-Ionen statt.
Hauptsächlich
die drei- oder vierfach geladenen Analytionen weisen solche Beladungen
mit Natrium- oder Kalium-Ionen auf. Je nach analytischem Ziel kann
dieser Effekt ausgenutzt oder auch durch saubere Systeme und reine
Ausgangssubstanzen vermieden werden. Die doppelt geladenen Analyt-Ionen sind
von dieser Beladung mit Alkali-Ionen in überraschender Weise nur relativ
wenig betroffen.
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Das
ausgangsseitige Lochblendensystem (7, 8, 9)
der Reaktionszelle (6) kann so ausgebildet werden, dass
es durch eine sehr feine achsennahe Öffnung kontinuierlich solche
Ionen extrahiert, die sich nach Kühlung in der Achse gesammelt
haben. Dieses Extraktionsfeld kann so fein ausgebildet werden, dass
es nur sehr wenige der frisch eingeschossenen, noch ungekühlten Ionen
durchlässt,
weil sich diese Ionen in der Regel auch radial schwingend außerhalb
der Achse befinden und daher ganz überwiegend an den Lochblenden
(5) und (7) reflektiert werden. Ein leicht schräger Einschuss
der beschleunigten Ionen begünstigt
diese Reflektion. So ergibt sich durch diese kontinuierliche Extraktion
bei kontinuierlichem Einschuss von einfach protonierten Analyt-Ionen
ausgangs der Reaktionszelle (6) ein kontinuierlicher Ionenstrahl
von Analyt-Ionen mit einem hohen Anteil an doppelt und mehrfach
geladenen Ionen, wie er für
die heute verwendeten Tandem-Massenspektrometer gebraucht wird.
Auch eine getaktete Entnahme für
die Erzeugung eines getakteten Ionenstrahls ist möglich. Die
heutigen Tandem-Massenspektrometer verwenden praktisch ausschließlich Quadrupol-Massenfilter
(anders als in 1 gezeigt), um aus dem kontinuierlichen
Ionenstrahl die gewünschte Ionensorte
unter Vernichtung aller anderen Ionensorten auszufiltern und der
Fragmentierungseinrichtung zuzuführen.
(Eine Ausnahme bilden Ionenfallen-Massenspektrometer, die ein Tandem-Verfahren in
der Zeit ermöglichen,
aber auch in der Stufe der Selektion der Eltern-Ionen auch alle
nicht für
die Fragmentierung gewünschten
Ionensorten vernichten).
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Es
können
die Ionen aber auch in der Reaktionszelle (6) zwischengespeichert
werden. Es ist dann möglich,
durch eine besondere Vorrichtung, ein massenselektives Ionentor,
nur die gewünschte
Ionensorte zu exportieren, wobei die nicht zum Export ausgewählten Ionen
in der Reaktionszelle verbleiben und erst zu einem späteren Zeitpunkt
dem Tandem-Massenspektrometer zur Analyse zugeführt werden.
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Eine
besonders günstige
Art eines solchen massenselektiven Ionentors basiert auf dem Quadrupolfeld
zwischen den vier Polstäben
der Reaktionszelle (6) und exportiert die ausgewählte Sorte
der Analyt-Ionen axial durch das Lochblendensystem (7, 8, 9)
in ein zweites Speicherreservoir (10), das in günstiger
Weise wieder als quadrupolares Polstabsystem ausgebildet ist. Dieses
Ionentor nutzt die Schwächung
des hochfrequenten Quadrupolfeldes im Randbereich des Polstabsystems
vor dem ausgangsseitigen Lochblendensystem. Am Ort dieser zunehmenden
Schwächung
des radialen Quadrupolfeldes gibt es außerhalb der Achse axiale Komponenten
des Pseudopotentialgradientens (des elektrischen Pseudofeldes).
Werden die ausgewählten Analyt-Ionen
an diesem Ort radial resonant angeregt, beispielsweise durch eine
geschlitzte Lochblende (7) mit Zuführung einer Wechselspannung
zur Anregung, so erleben sie bei einer Vergrößerung ihrer radialen Oszillationen
zunehmend die axial nach außen
gerichtete Kraft der axialen Komponente des Pseudofeldes, durch
die sie eine axial gerichtete Beschleunigung erhalten, mit deren
Hilfe sie die Gleichspannungsbarriere des ausgangsseitigen Lochblendensystems
(7, 8, 9) überwinden und in das zweite, anschließende Speicherreservoir
(10) eintreten können.
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Es
gibt verschiedenartige Ausführungsformen
für ein
solches Ionentor, die aber hier nicht Gegenstand der Erörterung
sein sollen. Es lassen sich mit dieser Art von Ionentoren durchaus
sehr gute Massenauflösungsvermögen für den massenselektiven
Ionenexport erzielen. Es können
Massenauflösungsvermögen der
Selektion von R > 5000
erreicht werden. Das reicht für
die Abtrennung von Ionen einer nominalen Masse von Ionen der nächsten nominalen
Masse; es ist weit besser, als es die normalerweise verwendet Massenfilter
bieten. Es können aber
auch geringere Massenauflösungen
eingestellt werden.
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Normalerweise
kommt in der Tandem-Massenspektrometrie eine solch hohe Massenauflösung für die Selektion
nicht zur Anwendung, da es erwünscht
ist, dass alle Ionen einer Isotopengruppe fragmentiert werden. Nur
dann ist eine Isotopenverteilungstreue auch im Fragment-Ionenspektrum
zu erhalten. Eine solch hohe Massenauflösung kann aber sehr zweckmäßig sein,
beispielsweise, wenn durch die Auswahl der monoisotopischen Ionen
einer Ionensorte auch nur monoisotopische Fragment-Ionen erzeugt
und gemessen werden sollen. Gerade bei komplexen Gemischen kann
das für
die eindeutige Erkennung einer Substanz sehr hilfreich sein. Soll dagegen
eine Isotopenverteilungstreue auch im Fragment-Ionenspektrum erhalten
bleiben, so können
entweder geringere Massenauflösungen
eingestellt werden, oder es können
die verschiedenen Ionen der Isotopengruppe auch nacheinander mit
hoher Massenauflösung
exportiert und im zweiten Speicherreservoir (10) wieder
gemischt werden.
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Es
gibt eine Reihe von günstigen
Ausführungsformen
für Tandem-Massenspektrometer,
die das erfindungsgemäße Reaktionsverfahren
in der Reaktionszelle (6) für die Erzeugung von mehrfach geladenen
Ionen verwenden können.
So können
sich die Ionenquellen für
die Erzeugung der Analyt-Ionen und der Donor-Ionen beide jeweils
sowohl innerhalb wie auch außerhalb
des Vakuumsystems des Massenspektrometers befinden. Es können ausgewählte mehrfach
geladene Analyt-Ionen aus dem kontinuierlichen Ionenstrahl wie in üblichen
Tandem-Massenspektrometern durch Quadrupol-Massenfilter ausgefiltert
und dann den üblichen
Fragmentierungseinrichtungen zugeführt werden. Es können verschiedenartige
Massenanalysatoren verwendet werden. Es können, statt übliche Fragmentierungseinrichtungen
zu verwenden, die mehrfach geladenen Analyt-Ionen schließlich auch
in Ionenfallen-Massenspektrometern
weiter analysiert werden. Der Fachmann kann sich in Kenntnis der
Erfindung die für
ihn günstigste
Kombination zusammenstellen.
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Es
soll jedoch hier eine erste besonders günstige Ausführungsform eines Tandem-Massenspektrometers
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionszelle, unter Verwendung
einer MALDI-Ionenquelle im Vakuumsystem des Massenspektrometers,
unter Verwendung einer CI-Ionenquelle zur Erzeugung der Donor-Ionen
und unter Verwendung eines massenselektiven Ionentors für die Selektion
der ausgewählten
Sorte von Analyt-Ionen unter Rettung aller übrigen Analyt-Ionen für spätere Analysen
etwas detaillierter geschildert werden. Eine solche besonders günstige Ausführungsform
ist in 1 gezeigt.
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Eine
bewegbare Trägerplatte
(1) für
die Proben mit Matrix- und Analytsubstanzen befindet sich bei dieser
Ausführungsform
in einer Gehäusekammer,
die mit Reinststickstoff eines Drucks von etwa 100 Pascal aus einem
Stickstoffgenerator (18) gefüllt ist. Die zu analysierende
Probe wird mit einem fokussierten UV-Laserstrahl (2) einer
Wellenlänge
von 320 bis 360 Nanometer aus einem Pulslaser (19) beschossen.
Es sind mit geeigneten Lasern Pulsfrequenzen bis zu zehn Kilohertz
möglich.
Dadurch werden Matrix- und Analytsubstanzen in jedem Schuss in einer
kleinen Wolke verdampft, wobei ein kleiner Teil der Analytsubstanzen
einfach protoniert wird. Die Ausbeute kann durch die Formung des
Lichtstrahls (2) aus dem Laser günstig beeinflusst werden.
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Die
Wolke breitet sich nach jedem Schuss explosionsartig aus, wird aber
durch den Reinststickstoff sehr schnell gekühlt. (Es ist möglich, hier
die Ausbeute an Analytionen, die normalerweise nur etwa 10-4 beträgt,
durch die Zugabe von Donor-Ionen zu erhöhen, doch ist das hier nicht
der hauptsächliche
Gegenstand der Erfindung). Die MALDI-Ionen aus der Wolke werden
jetzt durch einen Ionentrichter (4) aufgefangen und durch
diesen zum eingangseitigen Lochblendensystem (5) der Reaktionszelle
geleitet. In diesem Lochblendensystem (5) und durch die Potentialdifferenz
zwischen dem Potential in der Achse des Ionentrichters (4)
und der Achse der Reaktionszelle (6) werden die Analyt-Ionen
mit der gewünschten
Energie in die Reaktionszelle (6) beschleunigt. Die Reaktionszelle
(6) ist ausgangsseitig mit einem Ionentor versehen. Das
Ionentor ist in dieser Zeit durch ein hohes Potential an der Lochblende (7)
völlig
verschlossen, so dass keine Ionen verloren gehen können. Ist
der Unterschied der gewünschten Drucke
zwischen Ionentrichter (4) und Reaktionszelle (6)
zu hoch, so kann ein weiterer Ionentrichter oder ein multipolares
Polstabsystem mit entsprechender differentieller Bepumpung zwischengeschaltet
werden.
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Eine
CI-Ionenquelle (20), die in der gleichen Gehäusekammer
untergebracht ist, in der sich auch die MALDI-Probenträgerplatte
(1) befindet, übernimmt
für diese
günstige
Ausführungsform
die Erzeugung der Donor-Ionen für
die weitere Beladung der Analyt-Ionen mit Protonen. Die CI-Ionenquelle
(20), die in dem Druckbereich dieser Gehäusekammer
von etwa 100 Pascal besonders gut arbeitet, schickt ihre Ionen durch
leichte Potentialgefälle
ebenfalls in den Ionentrichter (4). Die Donor-Ionen werden
so zusammen mit den Analyt-Ionen in die Reaktionszelle (6) beschleunigt.
Das Massenspektrometer kann durch die beiden vakuuminternen Ionenquellen
mit einem relativ kleinen Pumpsystem (15, 16, 17)
betrieben werden, anders als bei der Verwendung von vakuum-externen
Ionenquellen.
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MALDI-Proben
enthalten meist nicht nur eine Analytsubstanz, sondern mehrere.
In der Reaktionszelle werden jetzt also von allen Analytsubstanzen mehrfach
protonierte Analyt-Ionen
gebildet, wenn auch möglicherweise
nicht mit gleicher Ausbeute.
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Während oder
besser noch nach Abschluss der Füllung
der Reaktionszelle (6) mit mehrfach geladenen Analyt-Ionen
der verschiedenen Analytsubstanzen aus einer MALDI-Probe wird jetzt
eine Analyt-Ionensorte ausgewählt,
die zuerst analysiert werden soll. Dabei kann eine doppelt protonierte,
aber auch eine höher
protonierte Ionensorte einer der Analytsubstanzen ausgewählt werden.
Diese Sorte der Analyt-Ionen wird nun durch das massenselektive
Ionentor aus der Reaktionszelle (6) exportiert, ohne dabei
andere Ionen in der Reaktionszelle (6) zu vernichten. Die
exportierten Analyt-Ionen werden dann in einer der üblichen
Weisen fragmentiert und die Fragment-Ionen in dem Massenanalysator
des Tandem-Massenspektrometers durch die Aufnahme des Fragment-Ionenspektrums
analysiert.
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Die
Analyse durch Fragment-Ionenspektren kann sodann für andere
Ionensorten der ersten Analytsubstanz und für beliebig viele Ionensorten
der anderen Analytsubstanzen wiederholt werden, ohne dass dafür stets
neue Ionen aus neuem Probenmaterial erzeugt werden müssen, wie
das bei heute üblichen
Tandem-Massenspektrometern der Fall ist. Andere Ionensorten der
gleichen Analytsubstanz können
Ionen mit anderem Ladungszustand, beispielsweise dreifach statt
zweifach geladene Ionen, oder andere Ionen einer Isotopengruppe
sein. Es wird eine außerordentlich
gute Ausnutzung des Probenmaterials erreicht.
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Die
Ionen in der Reaktionszelle (6) bleiben bei entsprechender
Konstruktion des Vakuumsystems durchaus über Zeiten von einigen Minuten
hinweg praktisch unverändert,
aber abhängig
von der Reinheit des Vakuumsystems und der Reinheit des zugeführten Dämpfungs-
und Stoßgases
lassen sich störende
Veränderungen
der Ionen, hauptsächlich über teilweise
Entladungen der mühsam
gewonnenen höher
geladenen Ionen, über
längere
Zeiten hinweg nicht vermeiden. Da das erfindungsgemäße Tandem-Massenspektrometer
aber durchaus für
die Analyse einer Vielzahl von Ionensorten aus der gleichen MALDI-Probe
eingesetzt werden soll, beispielsweise für die Analyse von 20 bis 30
Ionensorten, ist hier ein schneller Massenanalysator zur Aufnahme der
Fragment-Ionenspektren durchaus günstig, möglicherweise sogar erforderlich.
Ein Massenanalysator soll hier als „schnell" betrachtet werden, wenn er etwa ein
volles Fragment-Ionenspektrum pro Sekunde aufnehmen kann. Da der
Export durch das Ionentor und die Fragmentierung weit weniger als
eine Sekunde in Anspruch nehmen, können dann viele Analytsubstanzen
in weniger als einer Minute analysiert werden.
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Es
ist besonders vorteilhaft für
den analytischen Zweck des Tandem-Massenspektrometers, wenn der
Massenanalysator ein hohes Massenauflösungsvermögen, beispielsweise R = m/Δm > 10 000, besitzt und
eine hohe Massengenauigkeit liefert, beispielsweise besser als drei
Millionstel der Masse (3 ppm). Weiter ist günstig, dass er zur Aufnahme
der Fragmentspektren einen hohen Massenbereich besitzt, dass er
beispielsweise Fragment-Ionenspektren für Verdau-Peptide über den
Bereich von etwa 50 bis 4000 atomaren Masseneinheiten aufzunehmen gestattet.
Ein solch günstiger
Massenanalysator ist ein Flugzeit-Massenanalysator mit orthogonalem
Ioneneinschuss, wie er auch in 1 wiedergegeben ist.
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Vor
der Aufnahme des Massenspektrums der Fragment-Ionen müssen aber
die exportierten Analyt-Ionen fragmentiert werden. Wie bereits eingangs
erwähnt,
ist die Art der Fragmentierung wesentlich für Art und Umfang der Informationen,
die man aus den Fragment-Ionenspektren gewinnen kann. Es können durch
die Erzeugung von mehrfach geladenen Analyt-Ionen in diesem erfindungsgemäßen Tandem-Massenspektrometer
nunmehr alle bekannten Fragmentierungsarien heutiger Tandem-Massenspektrometer
eingesetzt werden. Die heutigen Tandem-Massenspektrometer (abgesehen von
TOF/TOF-Geräten)
arbeiten alle mit Elektrosprüh-Ionenquellen,
die von sich aus in vorteilhafter Weise mehrfach geladene Analyt-Ionen
liefern. Das erfindungsgemäße Tandem-Massenspektrometer gleicht
den Mangel aus, der bei Benutzung solcher Ionenquellen entsteht,
die praktisch nur einfach protonierte Ionen liefern.
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Für die übliche Stoßfragmentierung
sind die massenselektierten Analyt-Ionen mit einer Stoßenergie
von 30 bis 100 Elektronenvolt in eine Fragmentierungskammer (10)
einzuschießen,
die wiederum als Quadrupol-Stabsystem ausgelegt sein kann. Die Fragmentierungskammer
(10) ist ebenfalls mit einem Dämpfungsgas befüllt, das
hier als Stoßgas
für die Fragmen tierung
wirkt. Es kann durchaus wieder Reinststickstoff des gleichen Drucks
wie in der Reaktionszelle (6) verwendet werden, so dass
von der Reaktionszelle (6) bis zur Stoßfragmentierungskammer (10)
der gleiche Druck herrscht. Der Druck kann durch einen Gasgenerator
(18), eine Druck mindernde Zuführung zur Ionenquellenkammer,
und durch das Zusammenspiel von Lochblenden und Pumpleistungen aufrecht
erhalten werden.
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Die
Stoßfragmentierung
kann aber auch in der Fragmentierungskammer (10) durch
eine radiale dipolare Anregung der Eltern-Ionen vorgenommen werden.
Diese Anregung benötigt
Zeiten von einigen zehn bis zu etwa hundert Millisekunden für eine Fragmentierung,
da viele Stöße notwendig
sind, um genügend
Energie für
einen Zerfall aufzunehmen. Diese Art der Stoßfragmentierung ist aber besonders
günstig,
weil im Wesentlichen nur direkte Tochter-Ionen generiert werden, keine Enkel-Ionen,
weil sich nach dem Zerfall der Eltern-Ionen die Tochter-Ionen nicht mehr
in Resonanz mit dem anregenden Dipolfeld befinden und sofort durch
das Stoßgas
gedämpft
und gekühlt
werden. Eine andere Art von Fragmentierung mit ähnlichen Fragmentierungsresultaten
kann durch die Einstrahlung eines Infrarot-Lasers (IRMPD) vorgenommen
werden (in 1 nicht gezeigt).
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Wie
oben schon mehrfach erwähnt,
können ganz
andere Fragmentierungsprodukte mit orthogonalem Informationsgehalt
durch eine Fragmentierung erhalten werden, die durch Elektronenübertragung eingeleitet
wird. Diese Elektronenübertragung
kann durch direkten Einfang niederenergetischer Elektronen (ECD),
durch Beschuss mit hoch angeregten Neutralteilchen aus einer FAB-Teilchenquelle
(FAB = fast atom bombardment) oder durch Elektronenübertragung
durch negative Ionen geringer Elektronenaffinität (ETD) erfolgen.
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Besonders
interessant ist hier der Beschuss mit hoch angeregten Neutralteilchen,
beispielsweise Helium, aus einer FAB-Teilchenquelle (21),
wie sie kommerziell angeboten wird. Diese hoch angeregten Teilchen
lassen sich einfach in Speicherzellen für Ionen einschießen, die
durch Hochfrequenzspannungen betrieben werden, da sich die Neutralteilchen nicht
durch die Hochfrequenzfelder stören
lassen. Es können
diese Teilchen beispielsweise leicht in ein quadrupolares Hochfrequenz-Stabsystem
(10) eingeschossen werden, das in 1 als Fragmentierungskammer
dient. Eine ausgiebige Fragmentierung lässt sich so in etwa 200 Millisekunden
durchführen.
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Die
als besonders günstig
geschilderte Ausführungsform
des Tandem-Massenspektrometers enthält also für die Fragmentierung eine Stoßzelle (10),
die als quadrupolares Hochfrequenz-Stabsystem ausgebildet ist, zugleich
mit einer FAB-Teilchenquelle (21), die hoch angeregte Helium-Atome
in diese Stoßzelle
(10) einschießen
kann. Es lassen sich dann Stoßfragment-Ionen
und Fragment-Ionen aus Elektronenübertrag sequentiell von der
gleichen Sorte von Analyt-Ionen erzeugen, was für die Bestimmung von bioanalytischen
Sequenzen besonders günstig
ist.
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Für diese
Ausführungsform
ist es günstig,
als Fragmentierungskammer (10) wieder ein Quadrupol-Stabsystem
zu verwenden, das mit einem Dämpfungsgas
beschickt wird. Es sammeln sich dann die Fragment-Ionen in der Längsachse
dieser Kammer (10) und können durch enge endständige Lochblenden
(11), die auch als Druckminderungsstufe zum Flugzeitmassenanalysator
hin dienen, als feiner Ionenstrahl in den Massenanalysator eingebracht
werden.
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Der
für diese
besonders günstige
Ausführungsform
beste Massenanalysator ist ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem
Ioneneinschuss. Die Ionen werden in Form eines sehr feinen Strahls
und möglichst
monoenergetisch in den Pulser (12) des Flugzeitmassenspektrometers
eingeschossen. Der Pulser pulst dann periodisch mit einer Frequenz
von etwa 10 bis 20 Kilohertz einen Abschnitt des Ionenstrahls senkrecht
zur bisherigen Flugrichtung in die Driftstrecke des Flugzeitmassenspektrometers
aus. Die Ionen trennen sich dabei nach ladungsbezogenen Massen,
weil die Geschwindigkeiten der verschiedenen Ionensorten unterschiedlich sind.
Die Ionen treten dann in einen Ionenreflektor (13) ein,
der sie auf einen Ionendetektor (14) reflektiert. Dabei
tritt eine Orts- und Energiefokussierung ein, die ein hohes Massenauflösungsvermögen ergibt.
Im Ionendetektor werden die Ionenströme der einzelnen Ionensorten
verstärkt
und dann über
einen elektrischen Nachverstärker
einem Transientenrekorder zugeführt,
der die Ionenströme
in einem Takt von jeweils etwa einer halben Nanosekunde digitalisiert
und die Werte zu den phasengleich aufgenommenen Werten der früher aufgenommenen
Spektren zeitsynchron hinzuaddiert. Es werden somit Einzelspektren
von etwa 50 bis 100 Mikrosekunden Länge gemessen. Es entstehen
Summenspektren, die beispielsweise in kommerziellen Geräten etwa
128 000 oder sogar 256 000 Ionenstromwerte umfassen.
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In
handelsüblichen
Tischgeräten
zeigen diese Flugzeitmassenspektren Massenauflösungen von m/Δm = 15 000
und Massengenauigkeiten von etwa 3 ppm (parts per million). Der
Pulser arbeitet mit etwa 15 Kilohertz, wenn Beschleunigungen im
Pulser von etwa 8 bis 10 Kilovolt verwendet werden. Es werden also
15 000 Massenspektren pro Sekunde generiert und addiert. Dabei werden
im Pulser sehr viele Ionen des feinen Ionenstrahls erfasst und periodisch
ausgepulst, gute Flugzeitmassenspektrometer haben Nutzgrade für die Ionen
des Ionenstrahls in der Größenordnung
von etwa 50 Prozent der eingeschossenen Ionen. Werden die Additionen
nach 1500 Spektren abgebrochen, so können zehn Summenspektren pro
Sekunde geliefert werden. Diese Geräte können also auch zur Verfolgung
schnell veränderlicher
Vorgänge
eingesetzt werden, sie verwenden einen großen Teil der Ionen des angebotenen
Ionenstrahls, und sie haben durch die einstellbare Anzahl der addierten
Massenspektren einen einstellbaren dynamischen Messbereich. Mit
größeren oder
anders konstruierten Geräten
können
noch wesentlich bessere Spezifikationen erreicht werden, beispielsweise
Auflösungsvermögen von
R > 50 000 und Massengenauigkeiten
von einem Millionstel und besser.
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Sind
noch höhere
Massengenauigkeiten erforderlich, so kann statt des Flugzeitmassenspektrometers
ein Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer nachgeschaltet werden.
Dieses arbeitet in der Regel mit einem Magnetfeld, das durch supraleitende
Magnetspulen erzeugt wird. Es sind Geräte mit sieben, neun und elf
Tesla erhältlich,
höhere
Magnetfelder sind in Entwicklung. Die Massengenauigkeiten können beträchtlich
besser sein als ein Millionstel der Masse. Diese FTMS-Massenspektrometer
arbeiten allerdings relativ langsam; sie liegen an der Grenze der
Definition eines „schnellen" Massenspektrometers.
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Da
aber ein Gemisch an Analyt-Ionen beim Einschuss in die Reaktionszelle
auch Protonierungsreaktionen untereinander erzeugen können, was nicht
immer wünschenswert
ist, sei hier eine zweite besonders günstige Ausführungsform des Tandem-Massenspektrometers
geschildert. In dieser Ausführungsform
werden die einfach geladenen Analyt-Ionen aus der MALDI-Probe zunächst sanft (ohne
Beschleunigung beim Einschuss) in einem Quadrupol-Stabsystem gespeichert,
ohne sie dabei einer Protonierungsreaktion zu unterwerfen. Dieses Polstabsystem
als erste Speicherzelle enthält
am Ende ein massenselektives Ionentor, aus dem massenselektiv ausgewählte Analyt-Ionen
in die anschließende
Reaktionszelle exportiert werden können. Dieser Export kann sofort
mit einer Beschleunigung verbunden werden, kann aber auch zunächst durch
ein Ionenleitsystem führen,
in dem auch die Donoir-Ionen zugemischt werden können. Ionenweichen für diese
Zumischung der Donor-Ionen sind bekannt.
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Es
können
die Donor-Ionen aber auch durch den Ionentrichter, der auch die
MALDI-Ionen einsammelt,
kontinuierlich in die erste Speicherzelle, in der sich die MALDI-Ionen
gespeichert befinden, eingefüttert
werden. Wir durch das Ionentor eine Sorte der MALDI-Ionen für eine Analyse
der Fragment-Ionen entnommen, so können auch gleichzeitig oder
intermittierend die Donor-Ionen entnommen werden. Die gleichzeitige
Entnahme der Donor-Ionen
kann durch eine Mischung der Anregungsfrequenzen vor dem Ionentor
erreicht werden. Es ist dann allerdings nur eine Sorte von Donor-Ionen
exportierbar, wenn das Frequenzgemisch nicht sehr komplex werden
soll. Die Donor-Ionen werden dann zusammen mit der ausgewählten Sorte
an Analyt-Ionen in die Reaktionszelle eingeschossen. Es werden dort
doppelt und mehrfach geladene Analyt-Ionen erzeugt, die dann dort
exportiert, anschließend
fragmentiert und dann als Fragment-Ionenspektrum analysiert werden.
Für den
Export der nächsten
Sorte an Analyt-Ionen aus der ersten Speicherzelle für deren
Analyse sind dort in der Zwischenzeit genügend Donor-Ionen hinzugekommen,
um zusammen mit den Analyt-Ionen exportiert werden zu können. Dieser
Vorgang kann dann für
alle Sorten von Analyt-Ionen wiederholt werden. Ein solches Tandem-Massenspektrometer
ist besonders günstig,
weil es vermeidet, dass sich in der Reaktionszelle verschiedene
Arten von Analyt-Ionen gegenseitig protonieren, wobei einige Arten
von Analyt-Ionen als Protonen-Donoren für andere Arten von Analyt-Ionen
wirken können.
Die als Donor-Ionen wirkenden Analyt-Ionen würden somit für weitere analytische
Untersuchungen verloren gehen.
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Das
Tandem-Massenspektrometer kann auch mit einer weiteren Einrichtung
zur Erzeugung von Enkel-Ionen ausgestattet sein. Dazu ist prinzipiell
hinter der ersten Fragmentierungseinrichtung ein weiteres Ionentor
anzuordnen, mit denen eine bestimmte Tochter-Ionensorte selektiert wird. Die selektierten
Tochter-Ionen werden dann in einer zweiten Fragmentierungseinrichtung
zu Enkel-Ionen fragmentiert. Der Massenanalysator nimmt dann das
Enkel-Ionenspektrum auf. Die zweite Fragmentierungsstufe erhöht die Selektivität des Verfahrens
beträchtlich
und damit die Identifizierungssicherheit. Die nicht selektierten
anderen Tochter-Ionen verbleiben in der ersten Fragmentierungseinrichtung
und können
in nachfolgenden Schritten ebenfalls nach selektiver Auswahl durch
weitere Fragmentierung analysiert werden.
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Als
Anwendungsbeispiel für
das Tandem-Massenspektrometer mit erfindungsgemäßer Reaktionszelle und einem
Ionentor sei hier ein Verfahren angeführt, mit dem die Proteine identifiziert werden
können,
die sich in einem 2D-Gel weitgehend aufgetrennt als so genannte „Spots" befinden. Das hier
beschriebene Verfahren hat eine außergewöhnlich hohe Empfindlichkeit,
da praktisch keine Ionen nach der Erzeugung verloren gehen.
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Die
angefärbten
Spots des 2D-Gels werden ausgestanzt, einem enzymatischen Verdau
des Proteins unterworfen und die Verdaupeptide werden anschließend aus
dem Gel eluiert. Wenige Mikroliter des Eluats wird in üblicher
Weise zusammen mit Matrixsubstanz auf einen Probenfleck einer MALDI-Probenträgerplatte
aufgebracht. Auf einer Probenträgerplatte
haben dabei in üblicher
Weise 384 oder sogar 1536 Proben Platz. Der Probenträger wird
durch eine Schleuse in die Ionenquelle des Tandem-Massenspektrometers
eingebracht. So weit stimmt dieses Verfahren mit dem in üblichen
MALDI-TOF oder MALDI-TOF/TOF-Geräten überein.
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Durch
Beschuss mit gepulstem Laserlicht (2) aus einem UV-Laser
(19) werden nun aus den Verdau-Peptiden einfach protonierte
Analyt-Ionen erzeugt. Diese werden zusammen mit Donor-Ionen aus einer
CI-Ionenquelle (20) in die Reaktionszelle (6)
hinein beschleunigt, wo sie zu mehrfach protonierten Analyt-Ionen
reagieren. Diese mehrfach protonierten Analyt-Ionen werden in der Reaktionszelle (6)
gespeichert. Ein kleiner repräsentativer
Teil der Ionen aus der Reaktionszelle wird nun ohne Selektion und Fragmentierung
dem Flugzeitmassenspektrometer (12, 13, 14)
zugeführt,
um einen Überblick über die Massen
der vorhandenen Verdaupeptid-Ionen zu erhalten. Anschließend werden
die mehrfach geladenen Analyt-Ionen der Verdaupeptide einzeln durch das
Ionentor exportiert und fragmentiert. Die Fragment-Ionenspektren dienen
in üblicher
Weise zur Identifizierung des Proteins im Spot, indem die Spektren
den bekannten Suchmaschinen für
Vergleiche mit Proteinsequenzdatenbanken zugeführt werden. Liefern diese Suchmaschinen
keine zufrieden stellende Ergebnisse, weil es sich beispielsweise
um ein bisher unbekanntes Protein handelt, so kann durch einen Vergleich
von Stoßfragment-Ionen
und Fragment-Ionen aus Elektronenübertrag eine Bestimmung von
großen
Teilen der Aminosäure-Sequenz vorgenommen
werden. Für
eine solche Identifizie rung des Proteins eines 2D-Gel-Spots ist
bei einem automatisierten Verfahren einschließlich der Ionisierung und der
Spektrennahme nur sehr kurze Zeit erforderlich, bei gut eingerichteten
Verfahren weniger als eine Minute.
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Diese
besonders günstige
Ausführungsform des
Tandem-Massenspektrometers mit Reaktionszelle für die Erzeugung mehrfach geladener
Analyt-Ionen, mit Ionentor und mit einer Fragmentierungseinrichtung
für zwei
Fragmentierungsarten ist bisherigen MALDI-TOF/TOF-Geräten weit überlegen, da es eine höhere Empfindlichkeit,
eine höhere Massengenauigkeit
und einen höheren
Informationsgehalt bietet.
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Das
neuartige Tandem-Massenspektrometer mit Reaktionszelle für die Erzeugung
mehrfach geladener Analyt-Ionen kann auch vorteilhaft für die Kopplung
der MALDI-Ionisierung
mit einer Trennung hochkomplexer Analytgemische durch die Flüssigkeitschromatographie
(HPLC-MALDI) genutzt werden. Die Ionen der Verdaupeptide eines sehr
komplexen Gemisches besetzen im Allgemeinen selbst nach mäßig guter
Trennung alle Massen des Massenbereichs vielfach. Es ist bekannt,
dass einfach geladene Verdaupeptid-Ionen bei jeder Massenzahl einen Cluster
bilden, der etwa 0,3 atomare Masseneinheiten breit ist. Doppelt
geladene Ionen bilden einen Cluster von 0,15 Masseneinheiten Breite
um halbzahlige Massenwerte. Selektiert man also die monoisotopischen
Ionen eines Verdaupeptids mit Einheitsauflösung (eine ganzzahlige Massenzahl wird
von der nächsten
getrennt), so ist mit einer Überlagerung
von mehreren Ionen gleicher Massenzahl, aber verschiedener Identität, zu rechnen.
Zur Erhöhung
der Selektivität
findet daher die Aufnahme der Fragment-Ionenspektren statt, da diese für jedes Verdaupeptid
weitgehend einmalig sind, ähnlich
einem Fingerabdruck. Da sich bei der gleichzeitigen Fragmentierung
mehrerer Verdaupeptide die Fragment-Ionenspektren überlagern,
muss das bekannte Fragment-Ionenspektrum des analytisch interessierenden
Verdaupeptids mit bekannten mathematischen Verfahren ausgefiltert
werden.
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Unter
den „monoisotopischen" Ionen des Verdaupeptids
versteht man diejenigen Ionen der Isotopengruppe die nur aus 12C, 1H, 14H, 16O, 32S und 31P bestehen.
Werden diese gut von den anderen Ionen der Isotopengruppe getrennt
selektiert und dann fragmentiert, so besteht das Fragment-Ionenspektrum
dieser monoisotopischen Ionen nur noch aus Einzellinien, nicht mehr
aus Isotopengruppen. Dieser Effekt kann bei dem Filterprozess gut
verwendet werden, da die meisten der überlagerten Ionensorten nicht
monoisotopische Ionen sind und nach der Fragmentierung als (meist
seltsam verzerrte) Isotopengruppen erscheinen.
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Für organische
Substanzen ist das monoisotopische Ionensignal bis zu einem Molekulargewicht von
m < 2200 atomaren
Masseneinheiten das stärkste
Signal, hier ist also die Wahl der monoisotopischen Ionen besonders
günstig.
Im anschließenden
Bereich der Molekülgewichte
von m = 2200 bis zu m = 3300 atomaren Masseneinheiten ist das Ionensignal der
Ionen, die ein 13C enthalten, das stärkste Signal. Werden
diese Ionen exportiert und fragmen tiert, so erhält man ein Fragment-Ionenspektrum
aus jeweils zwei Ionensignalen pro Isotopengruppe mit leicht vorhersagbaren
Intensitätsverhältnissen.
Auch dieses Fragment-Ionenspektrum lässt sich daher leicht erkennen
und für
eine Analyse verwenden. Im übertragenen
Sinne gilt das auch für
Ionen, die zwei und mehr 13C-Atome enthalten,
die Interpretation der Fragment-Ionenspektren wird aber immer komplizierter.
Es ist aber durchaus nicht immer notwendig, eine Isotopentreue im
Fragment-Ionenspektrum dadurch anzustreben, dass man alle Isotopensignale
einer Isotopengruppe exportiert und fragmentiert.
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Selbstverständlich können Proteingemische auch
ohne enzymatischen Verdau gemessen werden. Dann muss der Flugzeitmassenanalysator
auf einen hohen Massenbereich von einigen 100 000 atomaren Masseneinheiten
eingestellt werden.
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Die
Anwendung von Gerät
und Verfahren ist vielfältig.
Das Verfahren mit seinen vielen Abwandlungen kann beispielsweise
in der zellbiologischen Forschung, in der medizinischen Diagnostik
mit Biomarker-Proteinen, in klinischen Studien zur Pharmakokinetik
und vielen anderen forschungsmäßig wie routinemäßig durchgeführten Untersuchungen
zur Konzentrationsbestimmung von Substanzen in komplexen Gemischen
eingesetzt werden.