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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung
einer Mischprobe enthaltend wenigstens zwei Zellen mit darin enthaltenen
Nukleinsäuren
unterschiedlicher Individuen, wobei jede Zelle Nukleinsäure eines
Individuums umfasst, bei dem die absolute und/oder relative Anzahl
an in der Mischprobe vorliegenden Zellen mit Nukleinsäure eines
Individuums bestimmt oder die absolute oder relative Kopienzahl
eines Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts bestimmt wird.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung dieses
Verfahrens.
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Auf
einer Vielzahl technischer Gebiete ergibt sich die Notwendigkeit,
Mischproben, d. h. biologische Proben enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher
Individuen, zu charakterisieren, um Rückschlüsse auf die Identität und/oder
ein oder mehrere spezifische genotypische Merkmale eines oder mehrerer
der Individuen, dessen bzw. deren Nukleinsäure(n) in der Mischprobe enthalten
ist/sind, zu gewinnen. Lediglich beispielsweise seien Anwendungen
in der Forensik, in der Gentechnik, z. B. im Rahmen von Klonierungen,
oder in der medizinischen Diagnostik genannt.
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In
der Forensik stehen beispielsweise häufig von einem Tatort lediglich
Proben zur Verfügung,
welche die Nukleinsäuren
von zwei oder mehr unterschiedlichen Personen enthalten, um aus
dieser Mischprobe Rückschlüsse auf
die Identität
des Täters
erlaubende Erkenntnisse zu gewinnen. In der Regel ist dabei unbekannt,
wie sich die Mischprobe zusammensetzt, insbesondere von wie vielen
verschiedenen Individuen Nukleinsäure in der Mischprobe enthalten
ist und wie das Mengenverhältnis
der Nukleinsäuren
der einzelnen Individuen in der Mischprobe untereinander ist.
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Auch
in der medizinischen Diagnostik stellt sich häufig die Aufgabe, eine Mischprobe
zu charakterisieren. Als Alternative zu der Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie,
welche für
die untersuchte schwangere Frau Infektionsrisiken bergen, wird in
der pränatalen
Diagnostik in jüngster
Zeit versucht, den Genotyp eines Fötus aus maternalem, fetale
Zellen enthaltendem Blut zu bestimmen, um etwaige schwere Erkrankungen
bereits im pränatalen
Stadium erkennen zu können.
Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen
von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen im Genom verursacht
wird, lassen sich durch eine Bestimmung der Kopienzahl bestimmter
Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte entsprechende Krankheiten
schon im Frühstadium
der Entwicklung zuverlässig
diagnostizieren. Beispiele für
zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen
zurückzuführen sind,
sind die Trisomie 18 (Edward's
Syndrom), Trisomie 13 (Pätau-Syndrom)
sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl
des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen
gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen
pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopienzahl des betreffen den
Chromosoms zu schwersten Entwicklungsstörungen. Neben Krankheiten,
welche auf eine erhöhte
Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl
von Erkrankungen bekannt, welche auf einer veränderte Kopienzahl von Genen
oder Genabschnitten beruhen. Lediglich beispielsweise sei in diesem
Zusammenhang die Huntington-Krankheit,
eine progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankung gekennzeichnet
durch abnormale, unwillkürliche
Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen
Fähigkeiten,
genannt. Durch die Bestimmung der Kopienzahl der entsprechenden
Chromosomen, Gene oder Genabschnitte in den fetalen Zellen lässt sich
so bereits pränatal
eine etwaige entsprechende Erkrankung diagnostizieren. Allerdings ist
die Bestimmung des Genotyps eines Fötus aus maternalem Blut problematisch,
da fetale Zellen in maternalem Blut lediglich in einer Häufigkeit
von etwa 1:1.000.000 (fetale Zellen/maternale Zellen) vorkommen
und das genaue relative Verhältnis
zwischen maternalen und fetalen Zellen zunächst nicht bekannt ist und
ohne weitere, aufwendige Untersuchungen nicht ermittelt werden kann.
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Eine ähnliche
Problematik ergibt sich auch in der Krebsdiagnostik, beispielsweise
bei der Untersuchung einer Körperprobe
auf die Anwesenheit von Krebszellen. Sofern die Körperprobe
tatsächlich
Krebszellen enthält,
handelt es sich um eine Mischprobe enthaltend gesunde Zellen und
Krebszellen (welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Zellen
zweier verschiedener Individuen angesehen werden), wobei das Mengenverhältnis der
einzelnen Zelltypen untereinander nicht bekannt ist und mit aufwendigen
Untersuchungen bestimmt werden muss, um festzustellen, in welchem
fortgeschrittenen Stadium sich der Krebs befindet.
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Aufgrund
des Vorliegens von Nukleinsäuren
verschiedener Individuen und des unbekannten Mengenverhältnisses
dieser verschiedenen Nukleinsäu ren
untereinander ist eine direkte genetische Untersuchung von Mischproben
häufig
nicht möglich
oder führt
zu falschen Ergebnissen, da die neben der Nukleinsäure des zu
charakterisierenden Individuums enthaltene(n) Nukleinsäure(n) anderer
Individuen die Charakterisierung der Nukleinsäure des zu charakterisierenden
Individuums stören.
Dies ist insbesondere dann gegeben, wenn die Menge an der Nukleinsäure des
zu charakterisierenden Individuums in der Mischprobe signifikant
geringer ist als die Menge der daneben vorliegenden Nukleinsäure eines
anderen Individuums, wie im Falle von maternalem, fetale Zellen
enthaltenem Blut. In dem Fall, dass die Mischprobe hinsichtlich
des zu charakterisierenden Individuums angereichert wird, bspw.
durch Anreicherung der fetalen Zellen mittels fluoreszenzmarkierter
Antikörper,
gelingt es in der Regel nicht, eine reine Probe hinsichtlich des
zu charakterisierenden Individuums zu erhalten. Es kommt bei den
bekannten Verfahren zu falsch positiven Ergebnissen (eine maternale
Zelle wird fälschlicherweise
als fetale Zelle typisiert) und/oder falsch negativen Ergebnissen
(eine fetale Zelle wird übersehen).
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Die
vorgenannte Problematik ergibt sich auch bei Einzelzelluntersuchungen,
wenn die entsprechende Zelle nicht sauber isoliert wurde und in
dem Isolat, unerkannt, andere an dieser angelagerte Zelle(n) vorhanden sind.
Insbesondere bei der Isolierung von einzelnen Zellen aus Gewebe
kommt es häufig
zu einer unerwünschten
Kontamination der Einzelzelle mit Nukleinsäuren anderer Zellen, weil an
der Zielzelle zumindest nukleinsäurehaltige
Zellmembranfragmente anderer Zellen angelagert sind. Die bei der
Charakterisierung mit einem solchen Zellisolat erhaltenen Ergebnisse
sind aufgrund des vorhandenen Hintergrunds anderer Zellen oftmals falsch
(Fendt&Raffeld,
J. Clinical Pathology (2000), 53: 666–672).
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Dies
sei an folgendem Gedankenexperiment erläutert: Es soll anhand einer
Körperprobe
eines Patienten bestimmt werden, ob Zellen zu Krebszellen mutiert
sind. Dabei ist bekannt, dass eine Krebszelle ein bestimmtes Gen überexprimiert,
weswegen die zu detektierende Krebszelle eine doppelte Kopienzahl
an mRNA des vorgenannten Gens aufweist als die gesunde Zelle. Untersucht
man nun eine Mischprobe, die beispielsweise aus einer Krebszelle
besteht, an der eine gesunde Zelle anhaftet, erhält man eine Mischantwort, die
sich aus Summe der Expression des entsprechenden Gens der gesunden
Zelle und der Expression des entsprechenden Gens der mutierten Zelle
zusammensetzt. Die durch den mRNA-Gehalt quantifizierbare Genexpression
wird im Vergleich zur gesunden Zelle gemessen. Dabei beträgt die entsprechende
Genexpression einer gesunden Zelle 100%, die von 2 gesunden Zellen
200% und die von 3 gesunden Zellen 300%, wohingegen die Genexpression
einer Krebszelle 200% beträgt.
Daher ergibt die Untersuchung der aus einer gesunden Zelle und einer
Krebszelle bestehenden Mischprobe eine Genexpression von 300% (100%
für die
gesunde Zelle plus 200% für
die Krebszelle), was im Verhältnis
zu einer aus zwei gesunden Zellen bestehenden Referenz mit einer
Genexpression von (100% + 100% =) 200% zu einem Verhältnis Probe/Referenz
von 300/200 = 1,5 führt.
Hätte man
hingegen zwei Experimente mit von Zellbestandteilen anderer Zellen
freien Einzelzellen durchgeführt,
hätte man
für eine
untersuchte gesunde Zelle (100% Genexpression) ein Verhältnis Probe
zu Referenz (1 gesunde Zellen mit 100% Genexpression) von 1 erhalten.
Bei der Untersuchung einer Krebszelle (200% Genexpression) hätte man
hingegen ein Verhältnis
Probe zu Referenz (1 gesunde Zellen mit 100% Genexpression) von
2 erhalten, was im Vergleich zu dem erhaltenen Verhältnis von
1,5 für
das Zwei-Zellen-Experiment deutlich leichter festzustellen ist.
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Aber
selbst wenn reine, von Fremdnukleinsäure freie Einzelzellen für eine Einzelzelluntersuchung
vorgelegt werden, wird mit einer hieran durchgeführten PCR statistisch gesehen
nur in 40 bis 70% der Fälle
ein Amplifikationsprodukt erhalten, da Einzelzellen in herkömmlichen
Mikrotiterplatten häufig,
unerkannt, am Rand des Gefäßes abgelegt
werden und so nach Zugabe der Reaktionslösung in einem für die PCR
typischen Volumen von kleiner 50 µl nicht suspendiert werden.
Bei einer in einer 96-well Mikrotiterplatte, in der pro well genau
eine Zelle mit herkömmlichen
Pipettiervorrichtungen abgelegt wurde, durchgeführten Amplifikationsreaktion
werden daher mit den herkömmlichen
Verfahren lediglich für
etwa 35 bis 65 der Proben Amplifikationsprodukte erhalten.
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U.
Schmidt et al. offenbaren in Int J Legal Med, 120 (1), Seiten 42
bis 48 ein Verfahren zur effizienten DNA-Amplifikation, bei dem
unterschiedliche Mengen von aus genetisch identischen menschlichen
Zellen isolierter DNA auf einzelnen hydrophilen Reaktionsstellen
eines Chips in einem Volumen von maximal 1 μl abgelegt werden und anschließend auf
den einzelnen Reaktionsstellen eine PCR durchgeführt wird.
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Aus
der
DE 100 06 188
A1 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays diskreter
Volumina zur parallelen Durchführung
chemischer Tests bekannt, bei dem jeweils vorbestimmte Mengen eines
Matrixbildners auf einer Träger-Grundfläche angeordnet
werden und der Matrixbildner behandelt wird, so dass aus diesen unter
jeweiliger Volumenvergrößerung ortsfeste
Matrizes gebildet werden, welche jeweils ein diskretes Volumen definieren.
Zudem offenbart diese Druckschrift einen Träger bzw. ein Substrat, welches
beispielsweise die Form einer flachen Scheibe aufweisen kann, und
auf dem hydrophile Reaktionsstellen von einem hydrophoben Bereich
umgeben sind.
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Ein
Objektträger,
der hydrophile Reaktionsstellen, welche von einem hydrophoben Bereich
umgeben sind, aufweist, wird auch in der
DE 299 23 907 U1 beschrieben.
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In
der
DE 102 42 359
A1 wird ein Verfahren zur Amplifikation genetischer Informationen
aus genetischem Material, das mehrere voneinander abgrenzbare Teilmengen
genetischen Materials umfasst, mittels PCR offenbart, bei dem Primer
eingesetzt werden, die komplementär zu Primerbindungsstellen
sind, die in dem genetischen Material an mehreren Stellen vorhanden
sind und jeweils benachbart zu einer für jeweils eine Teilmenge spezifischen
Zielsequenz mit vorbestimmter Länge
sind, so dass ein Amplifikationsprodukt erhalten wird, das im Wesentlichen
nur amplifizierte Sequenzen aufweist, die eine für die jeweilige genetische
Information spezifische Zielsequenz mit vorbestimmter Länge umfassen,
die zur Detektion mittels Hybridisierung geeignet ist.
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Derzeit
gibt es kein Verfahren, mit dem eine Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen
enthaltende Mischprobe, deren qualitative und/oder quantitative
Zusammensetzung, d. h. von der die Anzahl der verschiedenen Individuen,
von denen in der Mischprobe Nukleinsäure enthalten ist, und/oder
das Mengenverhältnis der
einzelnen, unterschiedlichen Nukleinsäuren untereinander, unbekannt
ist, zuverlässig
und schnell hinsichtlich des Genotyps eines in der Mischprobe enthaltenen
Individuums analysiert werden kann. Vielmehr führen die zu diesem Zweck bekannten
Verfahren aufgrund des Hintergrunds an Nukleinsäuren der anderen, von dem zu
untersuchenden Individuum verschiedenen Individuen zu falschen oder
zumindest unzuverlässigen
Ergebnissen. Zudem sind diese Verfahren zumeist zeitaufwendig und
kostenintensiv.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Charakterisierung
einer Mischprobe enthaltend wenigstens zwei Zellen mit darin enthaltenen
Nukleinsäuren
unterschiedlicher Individuen bereitzustellen, mit dem die absolute
und/oder relative Anzahl an in einer Mischprobe vorliegenden Zellen
mit Nukleinsäure
eines Individuums oder die relative oder absolute Kopienzahl eines
Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts einfach, schnell
und insbesondere zuverlässig
bestimmt werden kann.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe gelöst
durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 und insbesondere durch
ein Verfahren zur Charakterisierung einer Mischprobe enthaltend
wenigstens zwei Zellen mit darin enthaltenen Nukleinsäuren unterschiedlicher
Individuen, wobei jede Zelle Nukleinsäure eines Individuums umfasst,
umfassend die Schritte:
- a) Vereinzeln der Zellen
der Mischprobe, wobei die Mischprobe eine Mischung aus Zellen verschiedener Personen
ist oder eine Mischung aus Zellen unterschiedlichen Genotyps einer
Person ist, und Aufbringen von mindestens zwei einzelnen Zellen
auf ein Substrat, wobei jede der wenigstens zwei Zellen jeweils
einzeln in einem Volumen von weniger als 10 μl auf eine von einem hydrophoben
Bereich umgebene hydrophile Reaktionsstelle des Substrats abgelegt
wird, so dass pro Reaktionsstelle genau eine Zelle vorliegt, wobei
der die hydrophile Reaktionsstelle umgebende hydrophobe Bereich
auf dem Substrat außenseitig von
einem hydrophilen Bereich umgeben ist und der äußere hydrophile Bereich außenseitig
von einem hydrophoben Bereich umgeben ist, und
- b) Untersuchung von wenigstens zwei der auf dem Substrat abgelegten
Zellen auf der Reaktionsstelle des Substrats mittels einer Amplifikationsreaktion,
um die Zellen jeweils durch Genotypisierung Individuen aus der Mischprobe
zuzuordnen, wobei wenigstens 80% der untersuchten Zellen einem Individuum
der unterschiedlichen Individuen zugeordnet werden, und wobei die
absolute und/oder relative Anzahl an in der Mischprobe vorliegenden
Zellen mit Nukleinsäure
eines Individuums bestimmt oder die relative oder absolute Kopienzahl
eines Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts bestimmt wird.
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Unter
einer Mischprobe wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Probe,
insbesondere eine biologische Probe, verstanden, welche wenigstens
zwei, jeweils Nukleinsäure
enthaltende Zellen umfasst, wobei in der Probe, in der Gesamtheit
der Zellen, Nukleinsäuren
von wenigstens zwei verschiedenen Individuen enthalten sind.
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Der
Begriff Individuum umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht
nur eine – im
Falle von Menschen – von
anderen unterschiedliche Person, sondern auch verschiedene Zelltypen
einer Person, welche sich voneinander hinsichtlich ihres Genotyps
unterscheiden. Beispiele hierfür
sind genetische Mosaike oder Chimären, also Zellen unterschiedlichen
Genotyps einer Person, die sich durch Vermischung oder Austausch
unterschiedlicher Genotypen erst bilden (Chimäre) oder in einem Individuum
entstehen (genetisches Mosaik). Ein Beispiel für ein genetisches Mosaik sind
Krebszellen, die beispielsweise durch LOH ("loss of heterozygosity") entstanden sind.
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Relative
quantitative Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in
einem Individuum bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung die
Bestimmung, ob das Genom eines Individuum weniger, gleich viel oder
mehr Kopien einer vorbestimmten Sequenz enthält als das einer Referenzprobe
und absolute quantitative Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten
Sequenz in einem Individuum bedeutet die Bestimmung, welche konkrete
Anzahl an Kopien der vorbestimmten Sequenz in dem Genom des Individuums
enthalten ist.
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Zudem
bezeichnet der Begriff homologe Sequenz im Sinne der vorliegenden
Erfindung Sequenzen, welche untereinander eine Ähnlichkeit bezüglich deren
Nukleotidsequenz von wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders
bevorzugt wenigstens 90% und ganz besonders bevorzugt wenigstens
95% aufweisen, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind,
welche untereinander eine entsprechend geringere Sequenzähnlichkeit
aufweisen.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann eine Mischprobe schnell, einfach und insbesondere zuverlässig charakterisiert
werden. Insbesondere lassen sich mit diesem Verfahren zuverlässige Ergebnisse
bezüglich
der absoluten und relativen Anzahl an in einer Mischprobe vorliegenden
Zellen mit Nukleinsäure
eines Individuums erzielen. Des Weiteren erlaubt dieses die zuverlässige Bestimmung
des Genotyps eines oder mehrerer Individuen aus der Mischprobe.
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Ein
wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass
die Zellen einer Mischprobe in Schritt a) zunächst derart vereinzelt werden,
dass eine spätere
Ablage genau einer Zelle, welche im Gegensatz zu einer Vielzahl
der aus dem Stand der Technik bekannten Einzelzellverfahren frei
an daran gebundenen anderen Zellen bzw. Bestandteilen anderer Zellen
ist, pro Reaktionsstelle des Substrats möglich ist. Dadurch wird gewährleistet,
dass diese Zelle ohne Hintergrund an individuumsfremder Nukleinsäure analysiert werden
kann.
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Zudem
wird durch die Ablage jeweils einer Zelle auf der von einem hydrophoben
Bereich umgebenen hydrophilen Reaktionsstelle eines Substrats die
Ausbildung eines aus der in dem Zellisolat enthaltenen oder aus
der der Zelle nach dem Ablegen auf der Reaktionsstelle zugefügten Flüssigkeit
gebildeten Flüssigkeitstropfens
ermöglicht,
der vergleichsweise fest an dem Substrat haftet, so dass der nachfolgende
Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
direkt auf der Reaktionsstelle durchgeführt werden kann, ohne dass
die Zelle in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen überführt werden
muss. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte
vermieden. Ferner wird dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat
umfassend eine entsprechen de Anzahl an voneinander räumlich getrennten
hydrophilen Reaktionsstellen mehrere Proben parallel aufbereitet
werden können,
ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden
Flüssigkeitstropfen
bei geringfügigen
Erschütterungen
oder aufgrund des Verlaufens von Flüssigkeitstropfen infolge zu
hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen.
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Insbesondere
besteht der Vorteil der erfindungsgemäß vorgesehenen Ablage von Zellen
auf einem solchen Substrat im Gegensatz zur konventionellen Mikrotiterplatte
darin, dass unmittelbar vor der eigentlichen Analyse eine optische
Kontrolle des zu analysierenden Materials möglich ist. Beispielsweise kann
per Mikroskop zweifelsfrei festgestellt werden, dass nur genau eine
einzige Zelle auf jeder Reaktionsstelle abgelegt wurde. In einem
3-dimensionalen Reaktionsgefäß ist das
aufgrund fehlender Tiefenschärfe
des Mikroskops und anderer Gründe
nicht ohne erheblichen Aufwand möglich.
So kann in Kombination mit der Optimierung der Genotypisierung in
Schritt b), welche bspw. durch eine PCR erfolgt erreicht werden,
dass wenigstens 80% der untersuchten Zellen einem Individuum zuzuordnen
sind bzw. einem Individuum zugeordnet werden.
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Indem
die Zelle in einem Volumen von vorzugsweise weniger als 1 µl auf die
Reaktionsstelle aufgebracht wird, kann der Verfahrensschritt b)
direkt auf der Reaktionsstelle ausgeführt werden, ohne dass vorher die
Probe eingedampft oder in ein geschlossenes Reaktionsgefäß transferiert
werden muss. Des Weiteren wird durch das minimale, nach der Vereinzelung
bei der Zelle verbleibende Flüssigkeitsvolumen
die Ablage größerer Mengen
an potentiell den nachfolgenden Verfahrensschritt b) störenden Kontaminanten
auf der Reaktionsstelle verhindert. Im Unterschied dazu wird bei
einer Vielzahl der bekannten Einzelzellverfah ren die Zelle aus Zellkulturmedium
oder Körperflüssigkeit,
wie Blut oder dergleichen, isoliert, wobei die Zelle in einem beträchtlichen
Volumen an Zellkulturmedium oder Körperflüssigkeit in einem Reaktionsgefäß abgelegt
wird. Aufgrund der in diesem Volumen an Zellkulturmedium oder Körperflüssigkeit
enthaltenen, signifikanten Mengen an Kontaminanten ist bei diesen
Verfahren eine enzymatische Reaktion ohne weitere zeit- und arbeitsaufwendige
Aufreinigung der Probe nicht möglich.
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Aus
dem vorstehenden Grund ist es bevorzugt, die wenigstens zwei einzelnen
Zellen jeweils in einem Volumen von weniger als 100 nl, besonders
bevorzugt weniger als 10 nl, ganz besonders bevorzugt weniger als
1 nl und höchst
bevorzugt weniger gleich 100 pl auf der entsprechenden Reaktionsstelle
des Substrats abzulegen.
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Ein
weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Zuordnung
der wenigstens zwei auf den Reaktionsstellen jeweils einzeln abgelegten
Zellen zu einem in der Mischprobe enthaltenen Individuum durch eine
auf der Reaktionsstelle des Substrats durchgeführte Bestimmung mittels einer
Amplifikationsreaktion, von welchen der in der Mischprobe vertretenen
Individuen die abgelegten Partikel Nukleinsäure enthalten, wobei wenigstens
80% der untersuchten Zellen einem Individuum zugeordnet werden.
Dadurch wird zum einen verifiziert, dass es sich bei den auf den
Reaktionsstellen abgelegten Zellen tatsächlich um reine, an Bestandteilen
individuumsfremder Zellen freie Einzelzellen handelt. Zum anderen
kann dadurch verifiziert werden, ob es sich bei jeder der abgelegten
Zellen um eine Zielzelle oder um eine falsch positive Zelle handelt.
Mithin können
die Ergebnisse einer im Anschluss daran durchgeführten weiteren Charakterisierung der
un tersuchten Zelle eindeutig einem Individuum zugeordnet werden.
Aufgrund der Vereinze lung und der anschließenden Zuordnung der abgelegten
Zellen zu einem in der Mischprobe enthaltenden Individuum durch genetische
Analyse kann so eine zweifelsfreie Aussage getroffen werden kann.
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Vorzugsweise
werden bei der Untersuchung durch Genotypisierung in Verfahrensschritt
b) wenigstens 85%, insbesondere bevorzugt wenigstens 90%, besonders
bevorzugt wenigstens 95%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 98%
und höchst
bevorzugt 100% der untersuchten Partikel einem Individuum zugeordnet.
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Erfindungsgemäß wird in
dem Schritt b) die absolute und/oder relative Anzahl an in der Mischprobe vorliegenden
Zellen mit Nukleinsäure
eines Individuums bestimmt oder die relative oder absolute Kopienzahl eines
Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts bestimmt. Damit
werden Ergebnisse betreffend die quantitative und/oder qualitative
Zusammensetzung der Mischprobe erhalten, wobei beispielsweise aus
maternalem, fetale Zellen enthaltendem Blut bestimmt werden kann,
ob der Fötus
Trisomie 21 aufweist oder nicht. Alternativ dazu kann das Fortschreiten
von Krebs bei einem Patienten ermittelt werden, indem der prozentuale Anteil
an Krebszellen in einem Krebsgewebe, d. h. einer Mischprobe enthaltend
Krebszellen und gesunde Körperzellen,
bestimmt wird.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei den auf den Reaktionsstellen des Substrats abgelegten
Zellen um unlysierte Zellen. Dies ist deshalb bevorzugt, weil bei
einer unlysierten Zelle im Unterschied zu einer lysierten Zelle
durch optische Kontrolle sichergestellt ist, dass diese das ganze
Genom eines Individuums umfasst.
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In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Vereinzelung
und/oder das Aufbringung der wenigstens zwei Zellen auf das Substrat
mittels einer Kapillare, mittels Laser-Druck-Katapult-Technik ("Laser Pressure Catapulting"-Technik) oder mittels
eines Durchflusszytometers, vorzugsweise mittels eines Fluoreszenz
aktivierten Zellsorters ("Fluorescence
Activated Cell Sorters";
FACS), durchzuführen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass mit
jeder der vorgenannten Techniken aus einer Mischprobe gezielt an
Bestandteilen anderer Zellen freie Einzellzellen präpariert
und auf einem Substrat abgelegt werden können. Dies ist deshalb vorteilhaft,
weil die Zelle nur Nukleinsäure
eines Individuums aufweist und so ohne Hintergrund an Fremdnukleinsäure genetisch
untersucht werden kann. Ein weiterer Vorteil der vorgenannten Verfahren
ist, dass sich mit diesen die Zellen in einem äußerst geringen Flüssigkeitsvolumen auf
dem Substrat ablegen lassen und so direkt, d. h. ohne weitere Aufreinigung,
enzymatisch untersucht werden können.
Im Unterschied dazu werden mit den herkömmlichen Verfahren für eine Einzelzellpräparation, beispielsweise
der Mikromanipulation, bei der die Einzelzelle aus einer hochverdünnten Suspension
mit einer Kapillare unter Einsatz eines Mikroskops abgesaugt wird,
die Zellen mit erhebliche Mengen an Flüssigkeit isoliert. Aufgrund
der in der Flüssigkeit,
beispielsweise Zellkulturmedium oder Blut, enthaltenen Kontaminanten, wie
Proteasen, Nukleasen, Salzen und dergleichen, erfordern solche Isolate
eine Entfernung nicht nur der Flüssigkeit,
sondern auch der Kontaminanten, bevor die so isolierte Zelle in
einer enzymatischen Reaktion eingesetzt werden kann.
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Beispiele
für kommerziell
erhältliche
Geräte,
welche eine der vorgenannten Techniken nutzen, sind das manuelle
Kapillarsystem bspw. der Firma Eppendorf, Hamburg, das automatisiertes
System CellCelector der Firma AVISO GmbH, Gera, auf Laser Pressure
Catapulting Technik basierende Geräte bspw. der Firma PALM, Bernried
und FACS-Vorrichtungen bspw. der Firmen Becton Dickinson und Dako
Cytomation.
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Die
Funktionsweise von FACS-Vorrichtungen ist üblicherweise wie folgt:
Eine
die Zellen enthaltende Flüssigkeitssuspension
wird durch eine Düse
geführt,
an der der Flüssigkeitsstrom in
einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt
wird, wobei die einzelnen Flüssigkeitstropfen
jeweils eine vorbestimmte Anzahl an Zellen enthalten, alle oder
selektiv einzelne Flüssigkeitstropfen
nach der Abtrennung von der Düse
elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen
durch ein elektrisches Feld geführt
werden, wodurch ein oder mehrere elektrisch aufgeladene Flüssigkeitstropfen
selektiv auf ein Substrat gelenkt werden können. Beim Durchführen der
einzelnen Flüssigkeitstropfen
durch das elektrische Feld wird nur der elektrisch aufgeladene Tropfen
bzw. werden nur die elektrisch aufgeladenen Tropfen abgelenkt und
auf das entsprechend positionierte Substrat aufgebracht. Die Auftrennung
der Flüssigkeitssuspension
an der Düse
erfolgt durch piezoelektrische Modulation, bei der auf den durch
die Düse
strömenden Flüssigkeitsstrahl
eine periodische Druckschwankung ausgeübt wird, aufgrund der sich
an der Düse
Flüssigkeitstropfen
mit einer definierten und reproduzierbaren Größe ausbilden und diese von
dem Flüssigkeitsstrahl abreißen. Durch
entsprechende Einstellung der Konzentration der Zellen in der Flüssigkeitssuspension,
der Strömungsgeschwindigkeit
der Suspension und entsprechende Einstellung der piezoelektrischen
Modulation kann erreicht werden, dass jeder Flüssigkeitstropfen definierter
und reproduzierbarer Größe eine
vorbestimmte Anzahl an Zellen, beispielsweise genau eine Zelle,
enthält.
Die Abtrennung der Tropfen von der Düse erfolgt aufgrund des Impulses
der Druckschwankungen unterstützt
durch die Schwerkraft.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten
Substrat um einen Objektträger,
besonders bevorzugt um einen Glasobjektträger, zum einen weil diese flach
sind und zum anderen weil sich diese hervorragend zum Aufbringen
hydrophiler Bereiche (hier auch als Reaktionsstellen bezeichnet)
und hydrophober Bereiche eignen.
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Um
nachfolgende enzymatische Reaktionen in den auf dem Substrat abgelegten
Flüssigkeitstropfen zu
ermöglichen,
wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die
hydrophilen Reaktionsstellen auf dem Substrat kreisförmig auszubilden
und diese mit einem kreisringförmigen
hydrophoben Bereich zu umgeben. Um eine symmetrische Anordnung zu
erhalten sollte der kreisringförmige
hydrophobe Bereich die kreisförmig
ausgebildeten hydrophilen Bereiche vorzugsweise konzentrisch umgeben.
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Erfindungsgemäß ist der
die hydrophile Reaktionsstelle umgebende hydrophobe Bereich auf
dem Substrat außenseitig
von einem hydrophilen Bereich umgeben, welcher vorzugsweise kreisringförmig ist
und den hydrophoben Bereich, besonders bevorzugt, konzentrisch,
umgibt. Zudem ist erfindungsgemäß auch der äußere hydrophile
Kreisring außenseitig
von einem hydrophoben Bereich umgeben. Somit besteht eine besonders
bevorzugte Anordnung aus einem von zwei Kreisringen konzentrisch
umgebenen kreisförmigen
hydrophilen Bereich, wobei der innere der beiden Kreisringe hydrophob
und der äußere der
beiden Kreisringe hydrophil ist, wobei der äußere hydrophile Kreisring außenseitig
von einem hydrophoben Bereich umgeben ist.
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Besonders
gute Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn die Hydrophilie
der hydrophilen Reaktionsstelle und die Hydrophobie des diese umgebenden
Bereichs derart eingestellt werden, dass sich bei Auftrag von weniger
10 µl
Wasser auf die Reaktionsstelle ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel
von 20 bis 70°,
bevorzugt von 30 bis 60° und
besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
Dadurch wird gewährleistet,
dass sich ein stabiler Flüssigkeitstropfen
ausbildet, der fest an der Reaktionsstelle haftet, so dass sich
der Flüssigkeitstropfen
nicht schon bei geringsten Vibrationen des Substrats, wie diese
etwa beim Transport des Substrats beispielsweise innerhalb eines
Labors vorkommen, von der Glasplatte löst oder auf der Glasplatte verläuft.
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Vorzugsweise
beträgt
der Durchmesser der hydrophilen Reaktionsstelle, sofern diese, wie
dies bevorzugt ist, kreisförmig
ausgestaltet ist, zwischen 0,3 und 3 mm.
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Um
das parallele Aufbereiten mehrerer Proben zu ermöglichen, wird in Weiterbildung
des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, auf dem Substrat 2 bis 1.000,
vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz
besonders bevorzugt 48 verschiedene, kreisförmige hydrophile Reaktionsstellen
vorzusehen, die jeweils konzentrisch von einem kreisringförmigen hydrophoben
Bereich umgeben sind, welcher außenseitig von einem kreisringförmigen hydrophilen
Bereich umgeben ist, an den sich außenseitig vorzugsweise wiederum
ein hydrophober Bereich anschließt.
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Grundsätzlich ist
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Charakterisierung aller Mischproben geeignet, unabhängig von
der Anzahl der in der Mischprobe vertretenen verschiedenen Individuen.
Gute Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn die Mischprobe
Nukleinsäure
von wenigstens zwei, aber weniger gleich 10 verschiedenen Individuen,
besonders bevorzugt von wenigstens zwei, aber weniger gleich 5 verschiedenen Individuen,
ganz besonders bevorzugt von zwei oder drei verschiedenen Individuen
und höchst
bevorzugt von genau zwei verschiedenen Individuen enthält.
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Grundsätzlich kann
das erfindungsgemäße Verfahren
für alle
Mischproben eingesetzt werden, unabhängig von den Konzentrationsunterschieden
der einzelnen Nukleinsäuren
untereinander. Gute Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn
der Konzentrationsunterschied der von den einzelnen Individuen in
der Mischprobe enthaltenen Nukleinsäuren untereinander zwischen
1:1.000 und 1:1, bevorzugt zwischen 1:100 und 1:1 und besonders
bevorzugt zwischen 1:10 und 1:1 beträgt.
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Beträgt jedoch
der Anteil der Nukleinsäure
des zu untersuchenden Individuums an der Mischprobe, relativ zu
den Nukleinsäuren
der anderen Individuen, weniger als 1:1.000, wie dies beispielsweise
bei maternalem Blut enthaltend fetale Zellen regelmäßig der
Fall ist, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Mischprobe vor
der Vereinzelung und vor dem Aufbringen auf das Substrat gemäß Schritt
a) bezüglich
der Zellen mit der Nukleinsäure
des zu untersuchenden Individuums anzureichern, da andernfalls eine
große
Zahl an Zellen untersucht werden muss, bis statistisch eine Zielzelle
des zu untersuchenden Individuums auf dem Substrat aufgebracht ist.
Die Anreicherung kann auf jede dem Fachmann bekannte Weise erfolgen,
beispielsweise mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper, die
spezifisch an den anzureichernden Zelltyp binden und ihn so markieren. Alternativ
dazu können
beschichtete Fängerpartikel
bzw. beschichtete Magnetpartikel eingesetzt werden. Ein weiteres
Beispiel für
eine geeignete Anreicherungsmethode ist der Einsatz eines Durchflusszytometers,
insbesondere eines Fluoreszenz aktivierten Zellsorters ("Fluorescence Activated
Cell Sorters"; FACS),
der in der Regel mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur Klassifizierung von
Zellen und/oder deren Anreicherung arbeitet. Das Gerät bietet
bei der Anreicherung der anzureichernden Zellspezies den Vorteil,
dass die Fluoreszenzerkennung und die Anreicherung in einem Gerät vereinigt
sind.
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Aufgrund
der vorgenannten Charakteristika eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren
insbesondere zur Charakterisierung von Mischproben, die maternales
Blut enthaltend fetale Zellen umfassen, und bevorzugt zur Charakterisierung
von aus maternalem Blut enthaltend fetale Zellen bestehenden Mischproben.
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Gleichermaßen ist
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Charakterisierung einer gesunde Zellen sowie durch LOH ("loss of heterozygosity") gekennzeichnete
Krebszellen enthaltenden Mischprobe oder bevorzugt einer aus gesunden
Zellen sowie durch LOH gekennzeichneten Krebszellen bestehenden
Mischprobe prädestiniert.
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Zudem
hat sich das erfindungsgemäße Verfahren
als ebenso geeignet zur Charakterisierung einer gesunde Zellen sowie
durch MIN (Mikrosatelliten-Instabilität) gekennzeichnete
Krebszellen enthaltenden Mischprobe oder bevorzugt einer aus gesunden
Zellen sowie durch MIN gekennzeichneten Krebszellen bestehenden
Mischprobe erwiesen.
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Erfindungsgemäß wird nach
der Vereinzelung der Zellen und dem Aufbringen von wenigstens zwei einzelnen
Zellen auf jeweils eine von einem hydrophoben Bereich umgebene hydrophile
Reaktionsstelle eines Substrats in einem Volumen von weniger als
10 µl
die auf jeder einzelnen Reaktionsstelle des Substrats abgelegte
Zelle gemäß Verfahrensschritt
b) einem in der Mischprobe vertretenen Individuum zugeordnet und
weiter charakterisiert. Erfindungsgemäß erfolgt die Zuordnung der
Zellen zu einem in der Mischprobe enthaltenen Individuum gemäß Schritt
b) mittels einer Amplifikationsreaktion, wobei in der Amplifikationsreaktion
geeigneterweise Primerpaare für
für das
Zielindividuum spezifische Genabschnitte eingesetzt werden.
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Bei
der weiteren Charakterisierung der untersuchten Zellen wird erfindungsgemäß die absolute und/oder
relative Anzahl an in der Mischprobe vorliegenden Zellen mit Nukleinsäure eines
Individuums bestimmt oder die relative oder absolute Kopienzahl
eines Chromosoms, eines Gens oder eines Genabschnitts bestimmt.
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Bei
der Amplifikationsreaktion kann es sich um jede dem Fachmann bekannte
Reaktion handeln, mit der Nukleinsäuren, sei es DNA oder RNA,
vervielfältigt,
vorzugsweise nahezu exponentiell vervielfältigt werden kann. Insbesondere
die Durchführung
einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Amplifikationsreaktion hat
sich als vorteilhaft erwiesen.
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Unabhängig von
der Art der durchgeführten
Amplifikationsreaktion hat es sich als vorteilhaft erwiesen, vor
der Durchführung
der Amplifikationsreaktion die auf den Reaktionsstellen abgelegten
Zellen thermisch oder durch wenigstens einen Gefrier/Tau-Zyklus
aufzuschließen.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei der durchgeführten
Amplifikationsreaktion um eine spezifische Amplifikationsreaktion.
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Insbesondere
in den Fällen,
in denen die Zellen in der Mischprobe extrem wenig Nukleinsäure, beispielsweise
weniger als 1 pg, enthalten, hat es sich als vorteilhaft erwiesen,
vor der Amplifikationsreaktion in Schritt b) die in den Zellen enthaltenen
Nukleinsäuren
durch eine unspezifische PCR zu vermehren. Nach der unspezifischen
PCR kann eine spezifische PCR erfolgen.
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Erfindungsgemäß werden
in Schritt b) wenigstens zwei, jeweils einzeln auf jeweils einer
Reaktionsstelle auf dem Substrat abgelegte Zellen untersucht, um
diese durch Genotypisierung auf den Reaktionsstellen des Substrats
Individuen aus der Mischprobe zuzuordnen. Zu diesem Zweck haben
sich die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen als besonders
geeignet erwiesen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die für die Durchführung der
Amplifikationsreaktion notwendigen Reaktionskomponenten, im Falle
einer PCR vorzugsweise die Primer, auf der hydrophilen Reaktionsstelle
vorgelegt, bevor die Zelle auf der Reaktionsstelle abgelegt wird. Allerdings
ist es auch möglich,
die Reaktionskomponenten nach Ablegen der Zelle auf der hydrophilen
Reaktionsstelle des Substrats in Form von Flüssigkeit auf die Zelle aufzubringen.
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In
Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Amplifikationsreaktion
dazu anzupassen, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder
nicht homologe Sequenzen aus dem kodierenden DNA-Bereich und/oder
bevorzugt aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren. Bekanntermaßen ist
der nicht kodierende DNA-Bereich
wesentlich polymorpher als der kodierende DNA-Bereich, so dass durch
Amplifikation von Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich mit einer
relativ großen Wahrscheinlichkeit
individuenspezifische Sequenzen amplifiziert werden können. Dies
ist sowohl bei forensischen Mischproben als auch bei der Charakterisierung
des Genotyps fetaler Zellen aus maternalem Blut enthaltend fetale
Zellen vorteilhaft.
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Aus
demselben Grund hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Amplifikationsreaktion
dazu anzupassen, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder
nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifizieren. Insbesondere
in den Fällen,
in denen die Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens
zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren,
welche aus der STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und
beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind,
werden gute Ergebnisse erhalten. STR- bzw. short tandem repeat-Sequenzen
sind hochpolymorphe Sequenzen, welche aus lediglich zwei bis vier
bp langen Wiederholungseinheiten bestehen und zwischen den einzelnen
Individuen eine hohe Variabilität
aufweisen. Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable number of tandem repeat-Sequenzen
aus etwa 15 bis 30 bp Länge
aufgebauten repetitiven DNA-Abschnitten, deren Gesamtlänge durch
die Anzahl der Wiederholungen dieser Grundeinheit bestimmt ist. Auch
VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpolymorph, d. h. die Anzahl
der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich zwischen
den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNP's (single nucleotide polymorphism) handelt
es sich um die einfachsten Polymorphismen, bei denen sich die homologen
Sequenzen nur durch jeweils eine Base unterscheiden. Auch diese
Sequenzen eignen sich hervorragend für die Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens,
da sich diese zwischen den einzelnen Individuen sehr stark unterscheiden.
Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen
als Marker für das
erfindungsgemäße Verfahren
geeignet.
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Ferner
ist es bevorzugt, dass die Amplifikationsreaktion dazu angepasst
ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht
homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche in dem Genom des Individuums
jeweils pro Allel nur einmal vorkommen. So können bei der Charakterisierung
der Amplifikationsprodukte Rückschlüsse auf
die einzelnen Allele eines Individuums gezogen werden, so dass beispielsweise
die Anzahl einzelner Allele eines Individuums in einer Mischprobe
bestimmt werden kann.
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Vorzugsweise
ist die Amplifikationsreaktion dazu angepasst, zwischen 1 und 100,
vorzugsweise zwischen 2 und 20 und besonders bevorzugt zwischen
5 und 15 zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen des
zu untersuchenden Individuums der Mischprobe zu amplifizieren. Dadurch
werden genügend verschiedene
Amplifikationsprodukte erhalten, um gezielte individuenspezifische
Ergebnisse bei der Charakterisierung der Amplifikationsprodukte
zu erhalten. Andererseits ist der experimentelle Aufwand noch nicht
zu groß.
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Zur
Analyse der Amplifikationsreaktion der Zellen kann bspw. die Anzahl
der bei der Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte bestimmt werden, wobei die Bestimmung der
Anzahl vorzugsweise die Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit wenigstens
eines Amplifikationsprodukts sowie Bestimmen eines zweiten physikalisch
und/oder chemisch messbaren Parameters der erhaltenen Amplifikationsprodukte
umfasst. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit von Amplifikationsprodukten
können
alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt
werden, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, gängige Hybridisierungstechniken,
beispielsweise solche auf einem DNA-Array, genannt seien. Dabei
kann es in Abhängigkeit
von den eingesetzten Detektionsverfahren zweckmäßig sein, Schwellenwerte zu
definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines PCR-Produktes und
unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes angenommen wird.
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Um
den korrekten Ablauf der Amplifikationsreaktion zu überprüfen und
insbesondere Fehler an dem eingesetzten Thermocycler frühzeitig
zu erkennen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen,
parallel zu der Amplifikationsreaktion eine Amplifikationsreaktion
unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe, die bei korrektem
Ablauf der PCR zu einer bekannten Anzahl an Amplifikationsprodukten mit
einer bekannten Länge
führt,
durchzuführen.
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Insbesondere
in den Fällen,
in denen die relative Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz eines
in der Mischprobe vertretenen Individuums bestimmt werden soll,
sollte zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte vor, nach
oder bevorzugt parallel zu der Amplifikationsreaktion für die wenigstens
zwei zu untersuchenden Zellen wenigstens eine Amplifikationsreaktion
unter denselben Bedingungen wie den für die wenigstens zwei aus der
Mischprobe auf jeweils einer Reaktionsstelle abgelegten Zellen eingesetzten
mit einer Referenzprobe durchgeführt
werden, wobei die Referenzprobe vorzugsweise die gleiche Menge an
Nukleinsäure wie
die abgelegten Zellen aufweist und die Referenzprobe vorzugsweise
einen bekannten Genotyp aufweist. Aus dem Vergleich der Anzahl der
mit dieser wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen
Amplifikationsprodukte mit der Anzahl an mit der mit den abgelegten
Zellen durchgeführten
Amplifikationsreaktion(en) erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
kann so die relative Kopienzahl der untersuchten, vorbestimmten
Sequenz des untersuchten Individuums ermittelt werden.
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Für die Fälle, in
denen die absolute Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz des zu
untersuchenden Individuums bestimmt werden soll, wird in Weiterbildung
des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die Anzahl an mit den wenigstens
zwei abgelegten Zellen durchgeführten
Amplifikationsreaktion(en) erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung
zu vergleichen. Eine solche Häufigkeitsverteilung
wird vorzugsweise erhalten durch getrenntes, jeweils mehrmaliges
Durchführen
der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie den für die wenigstens
zwei aus der Mischprobe auf den Reaktionsstellen abgelegten Zellen
eingesetzte Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen
Referenzproben, wobei in den Amplifikationsreaktionen die gleiche
wie in den Zellen enthaltene Menge an Nukleinsäure eingesetzt wird und die
wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte,
voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen.
Dabei können
die Amplifikationsreaktionen für
die Referenzproben vor, nach oder besonders bevorzugt parallel zu
der Amplifikationsreaktion für
die zu untersuchenden Zellen durchgeführt werden. Durch anschließendes Bestimmen
der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
und Vergleich dieser Anzahlen mit der mit den für die auf den Reaktionsstellen
des Substrats abgelegten Zellen durchgeführten Amplifikationsreaktionen
erhaltenen Anzahlen an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
kann so die absolute Kopienzahl einer vorbestimmten Se quenz des
zu untersuchenden Individuums bzw. der zu untersuchenden Individuen
ermittelt werden.
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Vorzugsweise
wird eine Häufigkeitsverteilung
verwendet, für
deren Aufnahme die für
jede der wenigstens zwei Referenzproben durchgeführte Amplifikationsreaktion
mehrfach, bspw. zehn- oder hundertfach, durchgeführt wurde. Da in den Amplifikationsreaktionen
für die
Aufnahme der Häufigkeitsverteilung
Ausgangsmaterial mit einer bekannten Kopienzahl der vorbestimmten
Sequenz eingesetzt wird, kann aus diesem Vergleich zuverlässig auf
die Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden
Zelle der Mischprobe geschlossen werden.
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Des
weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung des
vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend:
- a) wenigstens ein Primerpaar, welches dazu
angepasst ist, in wenigstens einer PCR einen polymorphen Bereich,
der von wenigstens einer der in der Mischprobe enthaltenen Nukleinsäuren umfasst
ist, zu amplifizieren,
- b) ein Substrat, vorzugsweise ein Glasobjektträger, auf
dem wenigstens zwei, jeweils von einem hydrophoben Bereich umgebene
hydrophile Reaktionsstellen vorgesehen sind,
- c) PCR-Puffer und
- d) ein Protokoll für
die Durchführung
der PCR gemäß a),
wobei
die auf dem in dem Kit enthaltenden Substrat vorgesehenen hydrophilen
Reaktionsstellen kreisförmig
ausgebildet und jeweils von einem kreisringförmigen hydrophoben Bereich,
der außenseitig
von einem kreisringförmig
ausgebildeten hydrophilen Bereich konzentrisch umgeben ist, konzentrisch
umgeben sind, wobei der äußere hydrophile
Kreisring außenseitig
von einem hydrophoben Bereich umgeben ist, und wobei der Durchmesser
der hydrophilen Reaktionsstellen zwischen 0,3 und 3 mm beträgt.
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Unter
einem polymorphen Bereich wird im Sinne der vorliegenden Erfindung
ein Bereich aus dem Genom verstanden, der sich zwischen zwei zufällig ausgewählten, untereinander
nicht verwandten Individuen mit einer Wahrscheinlichkeit von wenigstens
25%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens
80% und ganz bevorzugt wenigstens 90%, bspw. in der Länge der
Sequenz oder in der Sequenz selbst, unterscheidet.
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Vorzugsweise
sind auf dem Substrat zwischen 2 und 1.000 und besonders bevorzugt
zwischen 24 und 96, jeweils von einem hydrophoben Bereich umgebene
hydrophile Reaktionsstellen vorgesehen.
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Optional
kann das erfindungsgemäße Kit neben
den Bestandteilen a), b), d) und ggf. c) wenigstens einen der nachfolgenden
Bestandteile umfassen:
- e1)
eine Referenzprobe mit einem bekannten Genotyp und vorzugsweise
mit einer bezüglich
einer vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl und/oder
- e2) das Ergebnis wenigstens einer, unter
den gleichen wie in dem Protokoll gemäß e) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion
mit einer Referenzprobe, wobei die Reaktionsbedingungen so gewählt waren,
dass wenigstens ein Amplifikationsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit
zwischen 20% und weniger als 100% entstand, und/oder
- e3) wenigstens eine Häufigkeitsverteilung,
welche durch getrenntes jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen
und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in dem Protokoll
e) vorgeschriebenen wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit
wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, wobei die wenigstens
zwei verschiedenen Referenzproben jeweils eine bekannte, voneinander
verschiedene Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz aufwiesen, sowie
anschließendes
Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen
Amplifikationsprodukten erhalten wurde, und
-
Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von diese erläuternden,
diese aber nicht einschränkenden
Beispielen erläutert:
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Beispiel 1
-
Ziel
der nachfolgenden Untersuchung war die quantitative relative Bestimmung
der Anzahl an in einer Mischprobe umfassend gesunde Zellen und Krebszellen
einer Person enthaltenen Krebszellen.
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Für die Untersuchungen
wurde als Substrat ein Glasobjektträger eingesetzt, auf dem 48
räumlich
voneinander getrennte kreisrunde, hydrophile Reaktionsstellen, welche
jeweils, von innen nach außen
betrachtet, von einem kreisringförmigen,
hydrophoben Bereich und einem sich daran anschließenden kreisringförmigen, hydrophilen
Bereich konzentrisch umgeben waren, angeordnet waren.
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Für die Bestimmung
wurden mit einem LaserCapture Mikroskop Zellen aus der Mischprobe,
d. h. dem Krebsgewebe, vereinzelt und zufällig jeweils 1 Zelle aus der
Mischprobe in einem Volumen von weniger als 1 μl auf den 48 hydrophilen Reaktionsstellen
des Substrats abgelegt. Anschließend wurde auf jede Reaktionsstelle
eine Reaktionslösung
enthaltend ein den Genabschnitt D85522 amplifizierendes Primerpaar,
Reaktionspuffer und Taq-Polymerase zugefügt, so dass das Gesamtvolumen
der auf jeder Reaktionsstelle vorliegenden Flüssigkeit 1 μl betrug. Anschließend wurden
die einzelnen Flüssigkeitstropfen
mit Öl überschichtet,
das Substrat in einen PCR-Thermocycler überführt und eine PCR durchgeführt. Abschließend wurde
von jedem Flüssigkeitstropfen
eine Teilmenge entnommen, diese auf ein Gel aufgetragen, die in
den Teilmengen enthaltenden Amplifikationsprodukte durch Gelektrophorese
elektrophoretisch aufgetrennt und die einzelnen DNA-Banden visualisiert.
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Während eine
gesunde heterozygote Zelle zwei Allele des Genabschnitts D85522
enthält,
weist eine LOH-Krebszelle nur ein solches Allel auf, da das andere
durch Deletion verloren gegangen ist ("loss of heterozygosity").
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Die
Gelektrophorese ergab, dass 12 der untersuchten 48 Zellen bei der
PCR nur ein Amplifikationsprodukt ergaben und mithin den LOH-Krebszellen zugeordnet
werden konnten, wohingegen die anderen 36 Proben bei der PCR zwei
Amplifikationsprodukte ergaben. Folglich betrug die relative Häufigkeit
an Krebszellen in dem Gewebe 25%.
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Beispiel 2
-
Es
sollte überprüft werden,
ob es sich bei einer vorliegenden biologischen Probe um eine Mischprobe mit
weiblichen und männlichen
Zellen handelt und wenn ja, wie groß der Anteil der weiblichen
Zellen in der Mischprobe ist.
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Eine
Stichprobe der Zellsuspension wurde mit einem FACS Sorter der Firma
DAKO sortiert und jeweils eine der Zellen auf den 48 Reaktionsstellen
des in Beispiel 1 beschriebenen Substrats abgelegt.
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Anschließend wurde
auf jede Reaktionsstelle eine Reaktionslösung enthaltend die für männliche
und weibliche Zellen spezifischen Primerpaare, Reaktionspuffer und
Taq-Polymerase zugefügt.
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Dabei
wurden je 2 pmol von fünf
Primerpaaren eingesetzt, welche daran angepasst waren in einer Multiplex
PCR fünf
verschiedene PCR-Fragmente aus humaner männlicher DNA (Typ XY) oder
4 unterschiedliche PCR-Fragmente
aus humaner weiblicher DNA (Typ XX) zu amplifizieren. Es handelte
sich dabei um die folgenden Primer:
| Primername | Länge des
amplifizierten Genabschnitts |
| ChrX-STR5589-CX1 | 243
bp |
| ChrX-STR861-CX2 | 312
bp |
| ChrX-STR3309-CX3 | 346
bp |
| ChrX-STR6285-CX5 | 467
bp |
| ChrY-STR596-CY2 | 604
bp |
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Insgesamt
enthielt die Reaktionslösung
die nachfolgend aufgeführten
Inhaltsstoffe:
| Komponente | Endkonzentration | 1
Reaktion | 50
Reaktionen |
| 2x
QIAGEN Multiplex PCR Master Mix | 1× | 0.5 μL | 25 μL |
| 5x
Q-Solution | 0.7× | 0.14 μL | 7 μL |
| Primer | 0.2
pmol | 0.1 μL | 5 μL |
| Template:Einzelzelle | 1×/Reaktion | 0.1 μL | 5 μL |
| AdvaGold
PCR dye | 1× | 0.1 μL | 5 μL |
| ddH2O | | 0.06 μL | 3 μL |
-
Jeweils
1 μl dieser
Reaktionslösung
wurde auf die einzelnen Reaktionsstellen pipettiert. Anschließend wurden
die einzelnen Flüssigkeitstropfen
mit Öl überschichtet,
das Substrat in einen PCR-Thermocycler überführt und eine PCR mit der nachfolgenden
Temperaturführung
durchgeführt.
| 94°C 10 Min. | |
| 94°C 30 Sek. | |
| 64°C 60 Sek. | |
| 72°C 60 Sek. | 35
Zyklen |
| 72°C 10 Min. | |
-
Nach
der PCR wurde zu jedem Flüssigkeitstropfen
4 μl "6× loading dye" (MBI Fermentas)
zugegeben, dann 3 μl
der so erhaltenen PCR/Farbstoffmischung auf ein 8%-iges PAA-TBE
Gel aufgetragen und unter üblichen
Elektrophoresebedingungen elektrophoretisiert. Als Standard wurde
eine 100 bp-Leiter von Promega eingesetzt. Abschließend wurde
das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt
und die für
jede einzelne Probe erhaltene Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten
bestimmt.
-
Dabei
ergab sich, dass 2 der 48 Proben männliche Zellen waren, während die
restlichen 46 Proben weibliche Zellen waren. Der Anteil der weiblichen
Zellen an der Mischprobe betrug demnach 96%.
-
Beispiel 3
-
Es
sollte in einem Verfahrensschritt bestimmt werden, ob in einer Mischprobe
Zellen mit dem Genotyp Trisomie 21 vorliegen.
-
Während gesunde
Körperzellen
diploid sind, also 2 Kopien von Chromosom 21 aufweisen, enthalten entsprechende
Trisomiezellen 3 Kopien des Chromosoms 21.
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Für die Versuchsdurchführung wurden
aus der Mischprobe 48 Einzelzellen auf jeweils einer Reaktionsstelle
eines wie in Beispiel 1 beschriebenen Substrats abgelegt und einer
Multiplex PCR unterzogen, wobei Primerpaare eingesetzt wurden, die
20 für
Chromosom 21 spezifische PCR-Produkte amplifiziert.
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Es
wurde folgendes Ergebnis erhalten (Anzahl untersuchte Zellen: 48):
| Anzahl
der detektierten Banden | Anzahl
der Fälle
(von 48) |
| 0 | 0 |
| 1 | 4 |
| 2 | 5 |
| 3 | 10 |
| 4 | 21 |
| 5 | 6 |
| 6 | 0 |
| 7 | 0 |
| 8 | 0 |
| 9 | 0 |
| 10 | 0 |
| 11 | 0 |
| 12 | 0 |
| 13 | 0 |
| 14 | 0 |
| 15 | 1 |
| 16 | 0 |
| 17 | 0 |
| 18 | 1 |
| 19 | 0 |
| 20 | 0 |
-
Die
erhaltenen Werte wurden mit einer Häufigkeitstabelle verglichen,
in denen die vorgenannte PCR unter denselben Bedingungen mit zwei
verschiedenen Referenzproben, nämlich
einmal einer gesunden, zwei Kopien Chromosom 21 aufweisenden Zelle
und einmal einer Trisomie 21-Zelle, mehrmals durchgeführt wurde sowie
die Anzahl der bei jeder Bestimmung erhaltenen Amplifikationsprodukte
bestimmt und in Form einer Häufigkeitstabelle
aufbereitet wurde.
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Der
Vergleich mit der Häufigkeitstabelle
zeigte, dass in der untersuchten Mischprobe 2 Zellen enthalten waren,
die eine Trisomie 21 aufweisen, nämlich diejenigen Proben, die
bei der PCR 15 Amplifikationsprodukte bzw. 17 Amplifikationsprodukte
ergaben, wohingegen die anderen 46 Proben nur zwei Kopien des Chromosoms
21 enthielten.