DE102007010860B4

DE102007010860B4 - Verfahren zur Identifikation eines Partikels mit zwei oder mehr monodispers eingebetteten Fluorophoren

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Publication number: DE102007010860B4
Application number: DE200710010860
Authority: DE
Inventors: Dr. Schedler Uwe; Dipl.-Ing. Dimroth Jonas; Dipl.-Chem. Rexin Heiko; Dr. Thiele Thomas
Original assignee: Polyan Ges Zur Herstellung Von Polymeren fur Spezielle Anwendungen und Analytik Mbh; Polyan Gesellschaft Zur Herstellung Von Polymeren fur Spezielle Anwendungen und Analytik Mbh
Current assignee: Polyan Gesellschaft Zur Herstellung Von Polyme De
Priority date: 2007-03-01
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2014-05-15
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: DE102007010860A1

Abstract

Verfahren zur Identifikation eines Partikels aus einem polymeren Werkstoff, der zwei oder mehr monodispers in dem Werkstoff eingebettete Fluorophore mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthält, wobei die Fluorophore so ausgewählt sind, dass (i) die Absorptionsmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind; (ii) die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 10 nm voneinander beabstandet sind; und (iii) die Absorptionsmaxima und Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind in einer Probe, umfassend die Schritte: (i) Bestrahlen von vorzugsweise in Monoschicht vorliegenden Partikeln mit einer oder mehreren Anregungswellenlängen im Überlappungsbereich der Absorptionsspektren der Fluorophore bzw. im Bereich der Absorptionsmaxima der Fluorophore (+/–10% der Extinktion); (ii) Erfassen der Intensitäten der Fluoreszenz an vorgegeben Messpunkten, wobei für jeden im Partikel enthaltenen Fluorophor wenigstens ein Messpunkt vorgegeben wird, der in einem Bereich von mindestens 5% der Intensität des Fluoreszenzmaximums des jeweiligen Fluorophors liegt und wobei die Messpunkte um mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind; (iii) Bestimmen eines Intensitätsverhältnisses der an den Messpunkten erfassten Intensitäten; und (iv) Vergleichen des bestimmten Intensitätsverhältnisses mit einem Referenzwert zur Identifikation des Partikels, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsspektren der Fluorophore einen gemeinsamen Anregungswellenbereich aufweisen, wobei in diesem Bereich für jeden Fluorophor eine Extinktion von mindestens 0,001 und eine Quantenausbeute von mindestens 0,01 gilt und das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung einer einzigen Anregungswellenlänge erfolgt, die im Überlappungsbereich liegt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Partikeln aus einem polymeren Werkstoff, die zwei oder mehr monodispers in dem Werkstoff eingebettete Fluorophore mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthalten.
Technologischer Hintergrund und Stand der Technik
Monodisperse Partikel (i. d. R. Mikropartikel) aus polymeren Werkstoffen werden in vermehrtem Maße in der medizinischen Diagnostik, als Träger für immobilisierte Enzyme, als Marker in der Umweltanalytik sowie in zahlreichen mikrobiologischen Untersuchungsverfahren genutzt, in denen beispielsweise Zielverbindungen an der Oberfläche der Mikropartikel gebunden und auf spektroskopischem Wege identifiziert werden. Polymere Partikel einheitlicher Form und Größe können durch Fällungs-, Suspensions- oder Emulsionspolymerisation erhalten werden.
Es ist Stand der Technik, derartigen Partikeln Fluorophore zuzusetzen, also fluoreszierende Chromophore, deren Fluoreszenz (emittiertes Fluoreszenzlicht) zur Identifikation der Partikel dienen kann. In der Regel enthält das Partikel dabei nur einen einzigen Fluorophor, so dass zur Identifikation entweder die Lage des Fluoreszenzmaximums oder die absolute Intensität der Fluoreszenz erfasst werden muss. Letztere Identifikation über die absolute Intensität wurde bereits mit Partikeln, die zwei Fluorophore enthalten, realisiert. Die Intensitäten der Farbstoffe werden dabei jeweils getrennt ermittelt.
Liegen mehrere Fluorophore in einem Partikel vor, besteht jedoch grundsätzlich die Möglichkeit, dass photophysikalische Prozesse, wie strahlungslose Desaktivierung oder bimolekulare Prozesse (Sensilibisierung, Quenchen), sowie gegebenenfalls auch photochemische Primärprozesse unter Spinumkehr die Fluoreszenz beeinflussen. Bei Aggregation der Fluorophore im Partikel treten intermolekulare Wechselwirkungen auf. Es ist mit einem konzentrationsabhängig veränderten spektroskopischen Verhalten zu rechnen. Zudem ist die gemessene Fluoreszenzintensität von der absoluten Gesamtstoffmenge der Fluorophore im Partikel und somit auch von der jeweiligen Größe der Partikel abhängig. Liegen in einer zu untersuchenden Probe eine Anzahl n verschiedener Partikel vor, so müssen diese fluoreszenzspektroskopisch unterscheidbar sein; entsprechend ist bei herkömmlicher Vorgehensweise eine Anzahl n verschiedener und spektroskopisch unterscheidbarer Fluorophore einzusetzen bzw. bei einem vorgegebenen Fluorophor sind Partikel mit abgestuften Konzentrationen des Fluorophors herzustellen. Augenscheinlich nachteilig ist, dass die Anzahl der für die Zwecke tauglichen, in ausreichendem Maße zugänglichen, und in ihren Kosten wirtschaftlich vertretbaren Fluorophore begrenzt ist. Zu Bedenken ist auch, dass ein Austausch einer Komponente (d. h. eines Fluorophors oder einer Komponente des Polymermaterials) des Partikels unter Umständen eine Modifikation des gesamten Systems erfordert, sei es durch eine notwendige Anpassung des Herstellungsweges oder den Austausch weiterer Komponenten, die ansonsten eine die spektroskopische Untersuchung störende Interaktion bedingen könnten. Schließlich ist auch das Identifikationsverfahren für Proben mit einer Vielzahl verschiedener Partikel mit jeweils verschiedenen Fluorophoren aufwendig: Es sind geeignete Anregungswellenlängen für die verschiedenen Fluorophore vorzugeben und die Erfassung der Fluoreszenz ist gleichzeitig für die Vielzahl der verschiedenen Fluorophore zu optimieren. Die Zuordnung von Partikeln, die denselben Farbstoff in unterschiedlich hohen Konzentrationen enthalten, allein mittels Erfassung der absoluten Intensität kann aus verschiedenen Gründen nachteilig sein. Bereits geringe Schwankungen hinsichtlich der Partikelgröße oder Inhomogenitäten hinsichtlich der Farbstoffverteilung führen zu nicht eindeutigen Ergebnissen bzw. zu einer sehr eingeschränkten Anzahl unterscheidbarer Populationen.
DE 699 07 630 T2 beschreibt Mikropartikel mit multiplen Fluoreszenzsignalen. Die Partikel können mehrere Farbstoffe enthalten, wobei die Emissionsspektra Maxima aufweisen, die mehr als 10 nm voneinander getrennt sind. US 2005/0260676 A1 , US 6,632,526 B1 und DE 33 31 017 A1 sind weitere Beispiel für fluoreszierende Partikel mit zwei oder mehr Fluorophoren zu entnehmen. DE 600 27 576 T2 beschreibt ein Identifikationsverfahren für fluorophorhaltige Partikel, die eine unterschiedlicher Größe oder unterschiedliche Konzentrationen des Fluorophors aufweisen.
Die Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Partikelidentifikation von Partikeln mit zwei oder mehr Fluorophoren zu beschleunigen.
Erfindungsgemäße Lösung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation eines Partikels aus einem polymeren Werkstoff, der zwei oder mehr monodispers in dem Werkstoff eingebettete Fluorophore mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthält. Die Fluorophore sind dabei derart ausgewählt, dass

(i) die Absorptionsmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind;
(ii) die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 10 nm voneinander beabstandet sind; und
(iii) die Absorptionsmaxima und Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind.

Mit Hilfe eines Partikelsystems aus zwei (gegebenenfalls auch mehr) Fluorophoren können eine Vielzahl über Fluoreszenzspektroskopie unterscheidungsfähiger Partikel bereitgestellt werden, wenn die genannten Auswahlkriterien beachtet werden. Dadurch, dass die Wellenlängen der Fluoreszenzmaxima der Fluorophore mindestens 10 nm voneinander beabstandet sind, die Wellenlängen der Absorptionsmaxima um mindestens 5 nm voneinander entfernt liegen und Fluoreszenz- und Absorptionsmaxima aller Fluorophore sich um mindestens 5 nm hinsichtlich ihrer Lage unterscheiden, kann ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Fluorophore erfasst werden. Aus diesem Verhältnis kann eine – wie weiter unten noch näher erläuterte – Identifikation von Partikeln erfolgen. Eine zu untersuchende Probe kann also verschiedene Arten von Partikeln enthalten, die sich jeweils im Verhältnis der erfassten Fluoreszenzintensitäten und damit relativen Anteilen der Fluorophore unterscheiden, ansonsten jedoch einen identischen Aufbau besitzen. Natürlich können daneben auch Partikel mit unterschiedlichen Fluorophoren verwendet werden. Die in dem polymeren Werkstoff verteilten Fluorophore sind monodispers verteilt, liegen also im Idealfall als homogene Lösung der Fluorophore in der polymeren Matrix vor, oder sind, wenn es sich um eine Dispersion handelt, als Farbstoffteilchen weitgehend gleicher Größe in der polymeren Matrix eingebettet. Die Absorptionsspektren der Fluorophore weisen einen Überlappungsbereich auf, wobei in diesem Bereich für jeden Fluorophor eine Extinktion größer 0,001 und eine Quantenausbeute größer Null ist. Hierdurch kann – in noch näherer erläuterter Weise – das Identifikationsverfahren durch Anregung mit nur einer Wellenlänge eingeleitet werden. Gegenüber herkömmlichen Verfahren wird eine signifikant reduzierte Anzahl einzelner Partikelexemplare einer Population zur Identifizierung dieser Population benötigt.
Vorzugsweise sind die Absorptionsmaxima der Fluorophore um 10 bis 100 nm voneinander beabstandet. Unabhängig oder in Ergänzung hierzu sind die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um 20 bis 100 nm voneinander beabstandet.
Die Absorptions- und Fluoreszenzmaxima liegen im UV/VIS/NIR-Spektralbereich, dass heißt im Wellenlängenbereich von 250 bis 2500 nm. Vorzugsweise liegen die Absorptionsmaxima im Wellenlängenbereich von 350 bis 850 nm. Unabhängig oder in Ergänzung hierzu liegen die Fluoreszenzmaxima vorzugsweise im Wellenlängenbereich von 400 bis 900 nm.
Der polymere Werkstoff sollte in Wasser unlöslich und gegebenenfalls quellbar sein, so dass der Einsatz der Partikel in wässrigen Medien oder in vivo möglich ist. Der polymere Werkstoff kann ein Polymer enthalten, das aus einem oder mehreren Monomeren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Acrylaten, Vinylen und Allylen hergestellt ist. Daneben können insbesondere Polysilicate und Melaminharze Verwendung finden. Der polymere Werkstoff ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polysilicate, Polyaddukte (insbesondere Polyurethane, Polyharnstoffe, Polyisocyanate und Polydiole), Polykondensate (insbesondere Polyester/Polycarbonate, Polyamide, Polyimide, Polysulfone, Polyethersulfone und Melaminharzen), Polyacrylate (insbesondere Polymethylmethacrylat, Polymethylacrylat, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyethylenglycolmonomethacrylate verschiedener Kettenlänge, Poly-N-Isopropylacrylamid, Polydiethylacrylamid, Polyhexylmethacrylat, Poly-tert.-Butylmethacrylat und Polyacrylnitril), Polyolefine (insbesondere Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, alipatische Polyvinyle, aliphatische Polyallyle), deren Copolymeren oder Blends. Die genannten Materialien erlauben die Herstellung von Partikeln definierter Größe und sind daher als polymere Matrix für die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der Partikel besonders geeignet, da sie keine oder vernachlässigbare Störeinflüsse auf das chromophore System und die photophysikalischen Prozesse, insbesondere auf die Fluoreszenz der Fluorophore zeigen. Besonders bevorzugt besteht der polymere Werkstoff aus Polymethylmethacrylat (PMMA) oder aus Polystyrol (PS). Bei der Partikelherstellung werden vorzugsweise zudem Suspensionsstabilisatoren zugesetzt, wie beispielsweise die im Ausführungsbeispiel aufgeführten Substanzen PVP K-30 und Aerosol OT.
Ein Partikeldurchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 10 nm bis 2000 μm, insbesondere 1 μm bis 50 μm.
Als Fluorophore können organische oder metallorganische Verbindungen, aber auch aus einem Halbleitermaterial bzw. Metalloxiden oder Metallsulfiden bestehende Quantenpunkte Verwendung finden. Vorzugsweise enthält das Partikel ein oder mehrere Fluorophore ausgewählt aus der Gruppe der Polyene, Azo-Verbindungen, Carboximide/Nitro-Verbindungen/Chinacridone, Chinoide, Oxazine, Indigoide, Diphenylmethane/Triphenylmethane Polymethine, Porphyrine/Phthalocyanine, Metallkomplexe, insbesondere der Edelmetalle, Seltenerden oder Übergangsmetalle, konjugierten Betaine und multiplen Chromophore. Besonders bevorzugt enthält das Partikel eine Kombination aus Coumarin- und Rhodaminderivaten als Fluorophore.
Ein Testkit, das auf den vorgenannten Partikeln aufbaut, enthält zwei oder mehr Chargen aus Partikeln, wobei die Chargen jeweils die gleichen Fluorophore mit jedoch abweichendem Konzentrationsverhältnis enthalten. Natürlich lassen sich auch verschiedene Testkits mit unterschiedlichen Fluorophoren oder Fluorophorkombinationen kombinieren. Die Partikel verschiedener Chargen können demnach die gleiche Größe aufweisen und aus den gleichen Komponenten zusammengesetzt sein; sie unterscheiden sich voneinander im Konzentrationsverhältnis der Fluorophore. Die Partikel der verschiedenen Chargen lassen sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Identifikationsverfahrens in noch näher erläuterter Art und Weise unterscheiden. Mit anderen Worten, in einer zu vermessenden Probe kann eine Vielzahl gleich großer Partikel vorliegen, die allesamt zudem die gleichen Fluorophore enthalten. Durch die besondere Auswahl und Festlegung der Konzentrationsverhältnisse unabhängig von der Gesamtstoffmenge der Fluorophore ist es jedoch möglich, einzelne Partikel den bekannten Chargen zuzuordnen.
Die Partikel können gemäß dem nachfolgend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren sieht vor, dass die Partikel durch Polymerisation einer Lösung bzw. molekular oder kolloid dispersen Dispersion der Fluorophore in einem Monomer/Monomerengemisch erfolgt. Mit anderen Worten, die Fluorophore liegen zunächst gelöst im Monomer oder – bei Herstellung eines Copolymers – im Monomerengemisch vor. Sofern sie sich nicht hinreichend lösen, liegen sie vorzugsweise molekular dispers (Teilchengröße < 1 nm) oder zumindest kolloid dispers (Teilchengröße 1 nm bis 1 μm) vor. Hierdurch ist sichergestellt, dass die Fluorophore im herzustellenden Partikel monodispers verteilt sind, also Interaktionen, die die Emissionseigenschaften beeinflussen könnten, vermieden werden.
Vorzugsweise wird die Polymerisation unter radikalischen Bedingungen durchgeführt, insbesondere erfolgt eine thermisch induzierte freie radikalische Polymerisation bei 20 bis 90°C. Die genannten Bedingungen erlauben einerseits den Einsatz einer Vielzahl bekannter Fluorophore, die unter den genannten Versuchsbedingungen stabil sind, und ermöglichen andererseits den Rückgriff auf bekannte Herstellverfahren für monodisperse Mikropartikel. Bevorzugt werden für die Polymerisation eines oder mehrere der Monomere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Acrylaten, Vinylen und Allylen eingesetzt. Denkbar ist auch eine ionische Polymerisation.
Ferner ist bevorzugt, wenn der Lösung/Dispersion eine oder mehrere oberflächenaktive Substanzen zugesetzt werden.
Schließlich wird bevorzugt, wenn der Lösung/Dispersion Polyvinylpyrrolidon (PVP) und/oder eine geringe Menge anderer Polymere wie Polyethylenglykol (PEG) zugesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Identifikationsverfahren von Partikeln der vorgenannten Ausführungsform in einer Probe. umfasst die Schritte:

(i) Bestrahlen von vorzugsweise in Monoschicht vorliegenden Partikeln mit einer oder mehreren Anregungswellenlängen im Überlappungsbereich der Absorptionsspektren der Fluorophore bzw. im Bereich der Absorptionsmaxima der Fluorophore (+/–10% der Extinktion);
(ii) Erfassen der Intensitäten der Fluoreszenz an vorgegebenen Messpunkten, wobei für jeden im Partikel enthaltenen Fluorophor wenigstens ein Messpunkt vorgegeben wird, der in einem Bereich von mindestens 5% der Intensität des Fluoreszenzmaximums des jeweiligen Fluorophors liegt und wobei die Messpunkte um mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind;
(iii) Bestimmen eines Intensitätsverhältnisses der an den Messpunkten erfassten Intensitäten; und
(iv) Vergleichen des bestimmten Intensitätsverhältnisses mit einem Referenzwert zur Identifikation des Partikels.

Nach dem erfindungsgemäßen Identifikationsverfahren werden demnach zunächst im Schritt (i) idealerweise in einer Monoschicht vorliegende Partikel bestrahlt, und zwar in einem Wellenlängenbereich, in dem die Fluorophore zur Emission angeregt werden. Die Partikel können nur identifiziert werden, wenn sie jeweils direkt mit dem Anregungslicht erreichbar sind. Nicht direkt erreichbare Partikel können die Identifikation u. U. stören und stellen in jedem Fall einen ungenutzten Materialeinsatz dar. Es wird daher angestrebt, die Partikel derart anzuordnen, dass eine möglichst große Anzahl der in einer Probe vorliegenden Partikel direkt angestrahlt werden kann. Darüber hinaus wird angestrebt, dass viele Partikel in möglichst kurzer Zeit, d. h. nach Möglichkeit mehrere Partikel gleichzeitig, direkt angeregt und identifiziert werden. Diese Kriterien führen dazu, dass die optimale Verteilung der Partikel in einer Monoschicht besteht und nicht, wie in herkömmlichen Verfahren (z. B. Flowzytometer), in der Vereinzelung der Partikel.
Zur Erstellung einer Monoschicht werden sich in einer Lösung befindende Partikel in einer Mikrotiterplatte verteilt. Der Boden der Kavitäten der Mikrotiterplatte wird derart präpariert, dass die Partikel daran haften bleiben. Nicht am Boden haftende Partikel werden wieder abgenommen und können zu einem anderen Zeitpunkt zur Auswertung genutzt werden.
Ein hinreichend genaues Identifikationsergebnis ist auch erzielbar, wenn eine zweite Partikelschicht über den Zwischenräumen der Monoschicht liegt. In dem Fall sind sowohl die unteren als auch die oben liegenden Partikel identifizierbar. Zuletzt ist es auch möglich, die Partikel in Lösung, also zufällig verteilt, zuzuordnen. Es ist jedoch insofern nachteilig, als dass die Erkennung sich bewegender Partikel aufwändiger und zeitintensiver ist und übereinander liegende Partikel u. U. nicht eindeutig identifiziert werden können und zur Auswertung somit nicht zur Verfügung stehen.
Weil die Absorptionsspektren der Fluorophore einen Überlappungsbereich aufweisen, in dem für jeden Fluorophor eine Extinktion größer 0,001 und eine Quantenausbeute größer Null ist, erfolgt das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung einer einzigen Anregungswellenlänge, die im Überlappungsbereich liegt.
In dem sich anschließenden Schritt (ii) werden die Intensitäten der Fluoreszenz an vorgegebenen Messpunkten erfasst. Diese Messpunkte liegen am Fluoreszenzmaximum bzw. in einem Wellenlängenbereich, an dem mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 90% der Intensität des Fluoreszenzmaximums vorliegen für jeden einzelnen Fluorophor. Mit anderen Worten, enthält die Probe zwei Fluorophore, so sind wenigstens zwei Messpunkte vorzugeben; je einen für den ersten und einen für den zweiten Fluorophor. Natürlich können zur Steigerung der Messgenauigkeit auch mehrere Messpunkte in dem genannten Wellenlängenbereich dem jeweiligen Fluorophor zugeordnet werden, jedoch ist dies in der Regel nicht notwendig. Wenn die weiter oben genannten Bedingungen für die Lage der Absorptions- und Fluoreszenzmaxima eingehalten werden, können die Intensitäten an den Messpunkten eindeutig erfasst werden.
Im Schritt (iii) werden die zuvor an den Messpunkten erfassten Intensitäten zueinander ins Verhältnis gesetzt. Das so bestimmte Intensitätsverhältnis wird im Schritt (iv) mit einem hinterlegten Referenzwert verglichen und erlaubt so eine Identifikation des Partikels. Das heißt, für die einzelnen Chargen aus Partikeln mit Fluorophoren unterschiedlicher Konzentrationsverhältnisse werden im Vorfeld Referenzwerte erstellt, indem die Intensitäten an den Messpunkten vermessen und zueinander im Verhältnis gesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass anhand der Intensitätsverhältnisse bereits eine eindeutige Identifikation der Partikel unterschiedlicher Chargen möglich ist. Die Apparatur zur Durchführung der spektroskopischen Untersuchung als auch das Identifikationsverfahren selbst muss nur einmalig auf ein ganz spezifisches spektrales System eingestellt/optimiert werden, um eine Vielzahl unterschiedlicher Partikel zu identifizieren. Darin liegt ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Als weiterer Identifikationsparameter kann die Fluroreszenzlebensdauer herangezogen werden. Mit anderen Worten, im Schritt (ii) kann für ausgewählte Fluorophore zusätzlich eine Fluoreszenzlebensdauer erfasst werden. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn ein zusätzlicher Fluorophor (bspw. n-ter Farbstoff) zur Erweiterung der Anzahl unterscheidbarer Partikel genutzt wird und dieser Fluorophor nicht hinreichend von den anderen Fluorophoren verschiedene Eigenschaften bez. Absorption und Fluoreszenzverhalten aufweist.
Denkbar ist weiterhin, dass die zu vermessenen Partikel aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und im Schritt (ii) zusätzlich eine absolute Intensität der Fluoreszenz erfasst wird. Im Schritt (iv) wird dann anhand der erfassten absoluten Intensität der Fluoreszenz ein Partikeldurchmesser durch einen Vergleich mit einem Referenzwert bestimmt. Unter Berücksichtigung dieses Parameters können demnach Partikel gleicher Fluorophore und gleicher Konzentrationsverhältnisse der Fluorophore Einsatz finden, die sich jedoch im Durchmesser unterscheiden. Der Unterschied im Partikeldurchmesser bedingt eine unterschiedliche absolute Gesamtstoffmenge der Fluorophore, was wiederum zu Unterschieden in der absoluten Intensität der Fluoreszenz (an den Messpunkten oder in einem vorgegebenen Wellenlängenbereich) führt. Letztgenannter Unterschied dient dann als das Unterscheidungskriterium für die Partikel verschiedener Größe.
Gleichzeitig ruft auch eine unterschiedliche absolute Gesamtstoffmenge der Fluorophore bei gleicher Partikelgröße eine jeweils verschiedene Intensität hervor, die auf beschriebenem Wege zur Partikelidentifikation genutzt werden kann. Mit anderen Worten, die zu vermessenden Mikropartikel können denselben Durchmesser aber unterschiedliche absolute Fluorophorenstoffmengen aufweisen und im Schritt (ii) wird zusätzlich eine absolute Intensität erfasst und der jeweiligen Charge zugeordnet.
Liegen in einer Probe Partikel derselben Farbstoffcodierung und gleicher absoluter Gesamtchromophorenstoffmengen, aber unterschiedlicher Partikeldurchmesser vor, kann zusätzlich zur Erfassung der Intensitäten der Fluoreszenz eine optische Objektidentifikation erfolgen. Mit anderen Worten, wenn die zu vermessenden Partikel aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und gleiche absolute Fluorophorenstoffmengen aufweisen, kann zusätzlich zur Erfassung der absoluten Intensität der Fluoreszenz eine optische Objektidentifikation zur Bestimmung der Partikeloberfläche bzw. des Partikeldurchmessers durchgeführt werden.
Die erfasste absolute Intensität der Fluoreszenz als Flächenintegral ist eine Funktion der Partikelgröße und der enthaltenen Gesamtstoffmenge der Fluorophore. Eine identische erfasste Intensität der Fluoreszenz zweier Partikel kann also sowohl aus der tatsächlichen Gleichheit der Objekte sowie aus Unterschieden in der Partikelgröße bei gleicher absoluter Farbstoffmenge resultieren und lässt somit gerade keine eindeutigen Rückschlüsse auf den Partikeldurchmesser zu.
Über eine Auswertung der Projektion des emittierten Lichtes auf eine Bildfläche kann die Partikeloberfläche bzw. der Durchmesser in solchen Fällen bestimmt werden. Die Erfassung der absoluten Intensität zusammen mit der Ermittlung des Partikeldurchmessers macht dann eine eindeutige Unterscheidung möglich.
Eine alternative Erkennung der Partikelgröße liegt in der Erfassung des rückgestreuten Anregungslichtes. Die Erkennung der Partikelgröße kann sowohl, wie beschrieben, zur Unterscheidung verschiedener Populationen als auch zu Korrekturzwecken eingesetzt werden. Mit anderen Worten, die zu vermessenden Partikel können aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und im Schritt (ii) wird dann zusätzlich eine Intensität des rückgestreuten Anregungslichtes erfasst und im Schritt (iv) anhand der erfassten Intensität des rückgestreuten Anregungslichtes ein Partikeldurchmesser durch Vergleich mit einem Referenzwert bestimmt.
Im Schritt (ii) wird vorzugsweise zusätzlich ein Oberflächenpotenzial (z. B. ζ-Potenzial) bestimmt.
Die zwei oder mehr Fluorophore eines Partikels weisen einen überlappenden Absorptionsbereich auf und das Bestrahlen im Schritt (i) erfolgt unter Verwendung einer im Überlappungsbereich liegenden Anregungswellenlänge. Mit einer einzigen Anregungsquelle lassen sich gleichzeitig im Fall oben genannter Kriterien beide Fluorophore zur Fluoreszenz anregen, so dass das Identifikationsverfahren beschleunigt werden kann. In jedem Fall jedoch ist eine sehr hohe Identifikationsgenauigkeit (geringe Abweichung) gewährleistet. Vorzugsweise liegt die Anregungswellenlänge im Fall zweier vorliegender Fluorophore im Schnittpunkt der Absorptionsspektren bzw. im Bereich um den Schnittpunkt mit einer Differenz von bis zu 10% des Wertes der Extinktion am Schnittpunkt. Im Fall von drei oder mehr Fluorophoren müssen alle Fluorophore einen gemeinsamen Anregungswellenlängenbereich aufweisen, wobei in diesem Bereich für jeden Fluorophor eine Extinktion von mindestens 0,001, vorzugsweise 0,1 bis 1, und eine Quantenausbeute von mindestens 0,01, vorzugsweise 0,5 bis 1, gilt und das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung einer einzigen Anregungswellenlänge erfolgt, die im Überlappungsbereich liegt.
Die Anregung kann demnach mit einer Wellenlänge erfolgen.
Als Lichtquellen können Lampen (Gasentladungslampen ggf. in Kombination mit entsprechenden Filtern), Laser, LED's verwendet werden.
Kurzbeschreibung der Figuren
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von zwei Ausführungsbeispielen und den dazugehörigen Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1 bis 3 Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Systems Coumarin 314/Rhodamin 6G bei zwei unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen, das eine mögliche Anregung mit nur einer Wellenlänge zeigt (Abszisse: Wellenlänge [nm]; Ordinate: Intensität); und
4 Fluoreszenzverhalten in PMMA bei 11 unterschiedlichen Mischungsverhältnissen eines Systems der Fluorophore Coumarin 334/Rhodamin 6G, wobei mit zwei Wellenlängen angeregt wurde (Abszisse: Konzentrationsverhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe; Ordinate: Intensitätsverhältnis der ermittelten Intensitäten bei 550 nm und 490 nm).
5 Partikel des Farbstoffsystems Coumarin 334/Rhodamin 6G unterschiedlichen Durchmessers und bei verschiedenen Konzentrations- und somit ermittelten Intensitätsverhältnissen (Abszisse: Partikeldurchmesser [μm]; Ordinate: Intensitätsverhältnis der ermittelten Intensitäten bei 550 nm und 490 nm).
Ausführliche Beschreibung
Ausführungsbeispiel – Herstellung der Partikel
Allgemein kann auf alle Methoden, bei denen durch Reaktion in der Größe einstellbare Partikel entstehen, zurückgegriffen werden; speziell auf Fällungspolymerisation, Emulsionspolymerisation und Suspensionspolymerisation. Nachfolgend wird die Herstellung von Partikeln anhand der Fällungspolymerisation näher erläutert.
Eingesetzte Reagenzien für die polymere Matrix:

Methanol 70 ml

Methylmethacrylat (MMA) 10 ml

Polyvinylpyrrolidon (PVP K-30) 5 g

Natrium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinat (Aerosol-OT) 320 mg

Azobisisobutyronitril (AIBN) 40 mg
PVP und Aerosol-OT wurden in Methanol gelöst vorgelegt. Der Lösung wurde eine Lösung des Radikalstarters AIBN in dem Monomer MMA zugesetzt. Anschließend wurde bei 65°C Badtemperatur für 24 h mit zirka 100 rpm gerührt. Die noch warme Suspension wurde auf 300 ml Wasser gegossen, und der Niederschlag über eine Fritte abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
Eingesetzte Fluorophore:

Rhodamin 6G und Coumarin 314 bzw. 334

Die Fluorophore wurden in den in der Tab. 1 angegebenen Mengen der Lösung aus AIBN im MMA zugesetzt.

Partikel-Nr.	Rhodamin 6G [mg/g Kunststoff]	Coumarin 334 [mg/g Kunststoff]	ermitteltes Intensitätsverhältnis
1	0,475	0,015	2748
2	0,375	0,075	15
3	0,250	0,150	4
4	0,125	0,225	1
5	0,063	0,270	0,5
6	0,031	0,356	0,18
7	0,028	0,422	0,17
8	0,016	0,366	0,12
9	0,006	0,422	0,04
10	0,004	0,422	0,02
11	0,002	0,422	0,01

Tab. 1 – Mengenverhältnisse der Fluorophore

Insgesamt wurden 11 verschiedene Konzentrationsverhältnisse von Coumarin 334 und Rhodamin 6G in der genannten PMMA-Matrix hergestellt (vgl. 4).
Die nach dem Verfahren erhaltenen Mikropartikel haben einen mittleren Durchmesser von ca. 9 μm.
Identifikationsverfahren
Nach oben beschriebenem Verfahren wurden Farbstoffmischungen gem. Tab. 1 in den Werkstoff eingebracht. Die erhaltenen Partikel wurden auf Glasslides befestigt und im Fluoreszenz-Spektralphotometer analysiert. Das verwendete Gerät (Shimadzu RF-5301 PC) ist mit einer standardmäßigen Xenon-Lampe ausgestattet, die das gesamte UV/VIS-Spektrum abdeckt.
Jedes Exemplar wurde mit Licht der Wellenlängen 470 nm und 525 nm belichtet und die Werte der Intensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung bei jeweils 490 nm und 550 nm ermittelt. Diese Intensitätswerte wurden dann miteinander ins Verhältnis gesetzt, der erhaltene Wert ergibt den Identifikationsparameter (vg. 4).
Den 1 und 2 sind exemplarisch Anregungspeaks und überlagerte Fluoreszenzspektren des Systems Coumarin 314/Rhodamin 6G zu entnehmen. Es sind Fluoreszenzspektren bei zwei unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen, nämlich 1:15 (1) und 3:1 (2) abgebildet, die jeweils bei Einstrahlung mit drei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen wurden.
Der Peak bei 449 nm resultiert aus der Einstrahlung bei dieser Wellenlänge und entspricht dem Absorptionsmaximum von Coumarin 314, 525 nm entspricht analog dem Absorptionsmaximum von Rhodamin 6G. Bei jeweils unterschiedlichen vorliegenden Konzentrationsverhältnissen in einer Mischung dominiert daher die Gesamtfluoreszenzintensität (Integral) des einen oder des anderen Fluorophors und auch die Intensität an ausgesuchten Messpunkten, wie zusätzlich in 3 veranschaulicht.
Der Peak bei 470 nm resultiert aus der Einstrahlung bei eben der Wellenlänge, die das ungefähre Maximum des gemeinsamen Anregungsbereiches darstellt. Werden die Mischungen der Fluorophore nur bei dieser einen Wellenlänge bestrahlt, ergeben sich hinreichend unterschiedliche Fluoreszenzspektren, die eine Identifikation anhand der Verhältnisbildung von Intensitäten an zwei ausgesuchten Messpunkten erlauben.
Für die Fluoreszenz in den Messpunkten ergaben sich Intensitätsverhältnisse von (i) 2,43 (1:15) und (ii) 0,30 (3:1).
In der 4 sind die Intensitätsverhältnisse bei den verschiedenen Mischungsverhältnissen der Partikel-Nr. 1–11 zu entnehmen. Zu erkennen ist der lineare Zusammenhang der beiden Größen über einen sehr großen Bereich der Konzentrationen. Das Verhältnis eignet sich daher als Identifikationsparameter, ggf. auch ohne Hinterlegung konkreter Referenzwerte, wenn die Funktion bekannt ist.
5 zeigt Partikelpopulationen, die sich sowohl hinsichtlich der eingestellten Konzentrations- und somit ermittelten Intensitätsverhältnisses als auch hinsichtlich ihres Partikeldurchmessers unterscheiden.

Claims

Verfahren zur Identifikation eines Partikels aus einem polymeren Werkstoff, der zwei oder mehr monodispers in dem Werkstoff eingebettete Fluorophore mit Absorptions- und Fluoreszenzmaxima im UV/VIS/NIR-Spektralbereich enthält, wobei die Fluorophore so ausgewählt sind, dass (i) die Absorptionsmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind; (ii) die Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 10 nm voneinander beabstandet sind; und (iii) die Absorptionsmaxima und Fluoreszenzmaxima der Fluorophore um jeweils mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind in einer Probe, umfassend die Schritte: (i) Bestrahlen von vorzugsweise in Monoschicht vorliegenden Partikeln mit einer oder mehreren Anregungswellenlängen im Überlappungsbereich der Absorptionsspektren der Fluorophore bzw. im Bereich der Absorptionsmaxima der Fluorophore (+/–10% der Extinktion); (ii) Erfassen der Intensitäten der Fluoreszenz an vorgegeben Messpunkten, wobei für jeden im Partikel enthaltenen Fluorophor wenigstens ein Messpunkt vorgegeben wird, der in einem Bereich von mindestens 5% der Intensität des Fluoreszenzmaximums des jeweiligen Fluorophors liegt und wobei die Messpunkte um mindestens 5 nm voneinander beabstandet sind; (iii) Bestimmen eines Intensitätsverhältnisses der an den Messpunkten erfassten Intensitäten; und (iv) Vergleichen des bestimmten Intensitätsverhältnisses mit einem Referenzwert zur Identifikation des Partikels, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsspektren der Fluorophore einen gemeinsamen Anregungswellenbereich aufweisen, wobei in diesem Bereich für jeden Fluorophor eine Extinktion von mindestens 0,001 und eine Quantenausbeute von mindestens 0,01 gilt und das Bestrahlen im Schritt (i) unter Verwendung einer einzigen Anregungswellenlänge erfolgt, die im Überlappungsbereich liegt.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem im Schritt (ii) für ausgewählte Fluorophore zusätzlich eine Fluoreszenzlebensdauer erfasst wird.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem die zu vermessenden Partikel aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und im Schritt (ii) zusätzlich eine absolute Intensität der Fluoreszenz erfasst wird und im Schritt (iv) anhand der erfassten absoluten Intensität der Fluoreszenz ein Partikeldurchmesser durch Vergleich mit einem Referenzwert bestimmt wird.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem die zur vermessenden Partikel denselben Durchmesser aber unterschiedliche absolute Fluorophorenstoffmengen aufweisen und im Schritt (ii) zusätzlich eine absolute Intensität erfasst und der jeweiligen Charge zugeordnet wird.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem die zu vermessenden Partikel aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und im Schritt (ii) zusätzlich eine Intensität des rückgestreuten Anregungslichtes erfasst wird und im Schritt (iv) anhand der erfassten Intensität des rückgestreuten Anregungslichtes ein Partikeldurchmesser durch Vergleich mit einem Referenzwert bestimmt wird.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem die zu vermessenden Partikel aus Chargen unterschiedlicher Durchmesser bestehen und gleiche absolute Fluorophorenstoffmengen aufweisen und bei dem zusätzlich zur Erfassung der absoluten Intensität der Fluoreszenz eine optische Objektidentifikation zur Bestimmung der Partikeloberfläche bzw. des Partikeldurchmessers durchgeführt wird.
Identifikationsverfahren nach Anspruch 1, bei dem in Schritt (ii) zusätzlich ein Oberflächenpotenzial (z. B. ζ-Potenzial) bestimmt wird.