DE102007027195A1

DE102007027195A1 - Thermally modified clay minerals as carrier materials for enzymes

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Publication number: DE102007027195A1
Application number: DE200710027195
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr. Sohling; Kirstin Dr. Suck; Friedrich Dr. Ruf
Original assignee: Sued Chemie AG
Current assignee: Sued Chemie IP GmbH and Co KG
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2008-12-18
Also published as: WO2008151822A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen festen Enzymkomplex, umfassend zumindest ein Enzym, welches auf einem Träger immobilisiert ist, der erhalten wurde durch Erhitzen eines Tonminerals auf eine Temperatur und für eine Dauer, dass der Träger eine Quellfähigkeit in Wasser von weniger als 15 ml/2 g aufweist. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des festen Enzymkomplexes und dessen Verwendung in enzymkatalysierten Reaktionen.The invention relates to a solid enzyme complex comprising at least one enzyme immobilized on a carrier obtained by heating a clay mineral to a temperature and for a period of time that the carrier has a swelling capacity in water of less than 15 ml / 2 g , Furthermore, the invention relates to a process for the preparation of the solid enzyme complex and its use in enzyme-catalyzed reactions.

Description

Die Erfindung betrifft einen festen Enzymkomplex, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie die Verwendung des festen Enzymkomplexes.The The invention relates to a solid enzyme complex, a method for the same Production and use of the solid enzyme complex.

Wegen ihrer hohen Selektivität sowie des relativ geringen Energiebedarfs gewinnen enzymatisch katalysierte Reaktionen zunehmende Bedeutung auch für in industriellem Maßstab durchgeführte Synthesen. Sind die Herstellungskosten der Enzyme jedoch hoch, ist es erforderlich, dass diese wiederholt eingesetzt werden können. Sie müssen sich daher kostengünstig aus der Reaktionsmischung abtrennen lassen. Methoden wie Chromatographie oder Ultrafiltration sind im Allgemeinen jedoch für industrielle Verfahren zu teuer. Man versucht daher, die Enzyme in geeigneter Weise zu immobilisieren. Dazu stehen im Wesentlichen zwei Verfahren zur Verfügung.Because of their high selectivity and relatively low energy requirements Enzymatically catalyzed reactions are becoming increasingly important also for industrial scale Syntheses. However, when the production cost of the enzymes is high, it is it requires that these can be used repeatedly. They therefore need to be inexpensive from the reaction mixture let disconnect. Methods such as chromatography or ultrafiltration However, they are generally used in industrial processes expensive. It is therefore attempted to immobilize the enzymes in a suitable manner. Essentially two methods are available for this purpose.

Beim ersten Verfahren werden die Enzyme auf einem Träger gebunden. Die Bindung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Eine physikalische Bindung kann durch Adsorption des Enzyms auf der Oberfläche des Trägers erreicht werden. Die Bindung erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen oder durch ionische Kräfte, wobei geladene Gruppen des Enzyms mit entgegengesetzt geladenen Gruppen auf der Oberfläche des Trägers in Wechselwirkung treten. Vorteil dieser Methode ist ihre einfache Ausführbarkeit sowie der relativ geringe Einfluss auf die Aktivität des Enzyms. Nachteilig ist jedoch, dass die Enzyme relativ leicht wieder von der Oberfläche des Trägers verdrängt werden können. Eine irreversible Bindung des Enzyms kann erreicht werden, indem eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Träger ausgebildet wird. Hier muss jedoch in Kauf genommen werden, dass unter Umständen die Aktivität des Enzyms erniedrigt wird, da das Enzym beispielsweise so auf der Oberfläche fixiert sein kann, dass das aktive Zentrum nicht mehr zugänglich ist. Schließlich kann die Stabilität des Enzym/Träger-Komplexes noch erhöht werden, indem die Enzyme durch zumindest bifunktionelle Moleküle vernetzt werden. Es entstehen dabei größere Aggregate die eine geringere Löslichkeit aufweisen. Die Kontrolle der Immobilisierung ist bei diesem Verfahren jedoch sehr schwierig. Ferner muss meist eine deutliche Deaktivierung des Enzyms in Kauf genommen werden, da dessen Konformation stark verändert wird oder das aktive Zentrum nicht mehr frei zugänglich ist.At the In the first method, the enzymes are bound on a carrier. The binding can be done in different ways. A physical Binding can be achieved by adsorption of the enzyme on the surface of the Carrier can be achieved. The binding takes place over hydrophobic interactions or by ionic forces, wherein charged groups of the enzyme are oppositely charged Groups interact on the surface of the carrier to step. The advantage of this method is its ease of execution as well as the relatively small influence on the activity of the Enzyme. The disadvantage, however, is that the enzymes are relatively easily recovered displaced from the surface of the carrier can be. An irreversible binding of the enzyme can be achieved by a covalent bond between enzyme and Carrier is formed. Here, however, must be accepted that may be the activity of the Enzyme is lowered, for example, because the enzyme on the surface It can be fixed that the active center is no longer accessible is. Finally, the stability of the enzyme / carrier complex can still be increased by the enzymes by at least bifunctional Molecules are crosslinked. There are larger ones Aggregates which have a lower solubility. The However, immobilization control is very important in this process difficult. Furthermore, usually a significant deactivation of the enzyme be accepted as its conformation changes greatly or the active center is no longer freely accessible is.

Beim zweiten Verfahren wird das Enzym in einer kugel- oder schlauchförmigen Matrix eingeschlossen. Die Matrix muss für die Edukte und Produkte der katalysierten Reaktion durchlässig sein, nicht jedoch für die Enzyme. Für diese Technik werden natürliche Polymere, wie z. B. Alginate, Gelatine oder Agar, oder auch syn thetische Polymere, wie Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol verwendet. Bei dieser Methode wird das Enzym bei Reaktionen in organischen Medien vor der Inaktivierung durch das Lösungsmittel geschützt. Als Nachteil muss jedoch in Kauf genommen werden, dass die Matrix als Diffusionsbarriere für die Edukte und Produkte der enzymkatalisierten Reaktion wirken kann.At the second method, the enzyme is in a spherical or tubular Matrix included. The matrix must be for the educts and Products of the catalyzed reaction are permeable, not however, for the enzymes. For this technique will be natural polymers, such as. As alginates, gelatin or Agar, or syn thetische polymers such as polyacrylamide or polyvinyl alcohol used. In this method, the enzyme in reactions in organic Media protected from inactivation by the solvent. As a disadvantage, however, must be accepted that the matrix as a diffusion barrier for the educts and products of enzyme-catalyzed reaction can act.

Schichtsilikate sind bereits als Träger für die Immobilisierung von Enzymen vorgeschlagen worden. So wird in der DE 2 154 672 ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzym-Komplexes beschrieben, wobei ein Enzym in einer wässrigen Pufferlösung mit einem Träger in Kontakt gebracht wird, der zuvor mit einem Kopplungsmittel modifiziert worden ist. Als Träger wird bevorzugt Bentonit verwendet, der mit Cyanurchlorid als Kopplungsmittel behandelt wurde. Die Immobilisierung des Enzyms erfolgt sehr rasch, d. h. innerhalb weniger Minuten, und wird bei Temperaturen von weniger als 40°C, vorzugsweise bei etwa 0°C durchgeführt, sodass die thermische Belastung des Enzyms gering bleibt.Phyllosilicates have already been proposed as carriers for the immobilization of enzymes. So will in the DE 2 154 672 discloses a process for preparing a solid enzyme complex wherein an enzyme in an aqueous buffer solution is contacted with a carrier which has been previously modified with a coupling agent. Bentonite which has been treated with cyanuric chloride as the coupling agent is preferably used as the support. The immobilization of the enzyme is very rapid, ie within a few minutes, and is carried out at temperatures of less than 40 ° C, preferably at about 0 ° C, so that the thermal load of the enzyme remains low.

In der US 6,180,378 werden feste Komplexe beschrieben, in welchen ein Enzym auf einem Schichtsilikat immobilisiert ist. Zur Immobilisierung wird das Schichtsilikat zunächst in Wasser delaminiert. Dazu können die Ionen des Schichtsilikats auch zunächst gegen Natrium- oder Alkylammoniumionen ausgetauscht werden. Zur Suspension des delaminierten Schichtsilikats wird dann das Enzym sowie ein Vernetzungsagens, wie Tetraethylorthosilikat, gegeben. Im Lauf der Reaktion bilden sich größere Aggregate, wobei das Enzym in Zwischenschichten des Schichtsilikats eingeschlossen ist. Der Feststoff kann mit einem geeigneten Puffer neutral gewaschen und dann getrocknet werden. Beim Trocknen muss darauf geachtet werden, dass die Bedingungen ausreichend milde gewählt werden, sodass die Struktur des Schichtsilikats nicht zerstört und das Enzym nicht denaturiert wird. Beim Trocknen unter reduziertem Druck bleibt die Aktivität des Enzyms weitgehend erhal ten, während beim Gefriertrocknen eine deutliche Deaktivierung eintritt. Im Feststoff bilden sich Makroporen aus, die eine Diffusion des Substrats zu den aktiven Zentren der Enzymmoleküle ermöglicht.In the US 6,180,378 describes solid complexes in which an enzyme is immobilized on a sheet silicate. For immobilization, the phyllosilicate is first delaminated in water. For this purpose, the ions of the layered silicate can also initially be exchanged for sodium or alkylammonium ions. To suspend the delaminated sheet silicate, the enzyme and a crosslinking agent, such as tetraethyl orthosilicate, are then added. As the reaction progresses, larger aggregates form, with the enzyme trapped in interlayers of the layered silicate. The solid can be washed neutral with a suitable buffer and then dried. When drying, care must be taken that the conditions are chosen to be sufficiently mild so that the structure of the layered silicate is not destroyed and the enzyme is not denatured. Drying under reduced pressure largely maintains the activity of the enzyme, whereas freeze drying results in marked deactivation. In the solid macropores form, which allows diffusion of the substrate to the active centers of the enzyme molecules.

In der US 5,279,948 wird ein auf einem Polymer immobilisiertes Enzym beschrieben, das sich beispielsweise auch in Säulen verwenden lässt. Als Polymer wird entweder ein Homopolymer aus 1-Aminoethylen oder ein Copolymer aus 1-Aminoethylen und N-Vinylformamid verwendet. Das Polymer wird zu einer wässrigen Lösung des Enzyms gegeben und dann ein Vernetzungsmittel zugefügt, welches mit Aminogruppen reagieren kann. Geeignete Vernetzungsmittel sind beispielsweise Glutaraldehyd, Diisocyanate und Polyazetidin. Es wird ein Niederschlag erhalten, der vom flüssigen Medium abgetrennt und entwässert wird, sodass eine pastenartige Masse erhalten wird, die sich zu Partikeln einer gewünschten Größe verarbeiten lässt. Die Herstellung eines derartigen in einer festen Matrix immobilisierten Enzyms ist jedoch relativ aufwendig.In the US 5,279,948 describes an immobilized on a polymer enzyme, which can be used for example in columns. The polymer used is either a homopolymer of 1-aminoethylene or a copolymer of 1-aminoethylene and N-vinylformamide. The polymer becomes an aq solution of the enzyme and then added a crosslinking agent which can react with amino groups. Suitable crosslinking agents are, for example, glutaraldehyde, diisocyanates and polyazetidine. A precipitate is obtained which is separated from the liquid medium and dewatered to give a paste-like mass which can be made into particles of a desired size. However, the preparation of such an immobilized in a solid matrix enzyme is relatively expensive.

H. W. Morgan und C. T. Corke, Can. J. Microbiol. Vol. 22, 1976, – s. 684–693 , beschreiben die Adsorption von Glucoseoxidase auf verschiedenen Tonen. Für die Untersuchungen wurden Montmorillonit und Kaolinit mit einer Partikelgröße von weniger als 2 μm verwendet. Der Ton wurde in einem Natriumacetatpuffer bei 25°C mit Glucoseoxidase umgesetzt. Das Maximum der adsorbierten Enzymmenge wurde bei einem pH-Wert beobachtet, welcher unterhalb des isoelektrischen Punktes des Enzyms lag. Zu Beginn der Adsorption zeigte das adsorbierte Enzym eine deutlich niedrigere Aktivität als das freie Enzym. Mit steigender adsorbierter Enzymmenge stieg jedoch auch dessen Aktivität und näherte sich der des freien Enzyms an. HW Morgan and CT Corke, Can. J. Microbiol. Vol. 22, 1976, - s. 684-693 , Describe the adsorption of glucose oxidase on different clays. For the investigations, montmorillonite and kaolinite with a particle size of less than 2 μm were used. The clay was reacted with glucose oxidase in a sodium acetate buffer at 25 ° C. The maximum amount of enzyme adsorbed was observed at a pH which was below the isoelectric point of the enzyme. At the beginning of adsorption, the adsorbed enzyme showed significantly lower activity than the free enzyme. As the amount of adsorbed enzyme increased, however, its activity also increased and approached that of the free enzyme.

M. S. Carrasco, J. C. Rad und S. Gonzáles-Carcedo, Bioresource Technology 51 (1995), 175–181 berichten über die Immobilisie rung von alkalischer Phosphatase auf Natriumsepiolit. Die besten Bedingungen für die Immobilisierung wurden in einem Phosphatpuffer (pH 7,2) bei einer Temperatur von 4°C, einer Enzymkonzentration von 0,25 mg/ml und einem Verhältnis von Enzym/Ton von 10 ml/g aufgefunden. Die immobilisierte Phosphatase kann dazu genutzt werden, um die biologische Verfügbarkeit von Phosphorverbindungen in Böden zu verbessern. Für die Herstellung des immobilisierten Enzyms wurde zunächst Sepiolit mit einer Partikelgröße von < 2 mm in die Natriumform überführt, indem der Sepiolit wiederholt in einer Natriumchloridlösung aufgeschlämmt wird. Für die Immobilisierung wird das Enzym in einem Phosphatpuffer (pH 7) bei 4°C mit dem in der Natriumform vorliegenden Sepiolit umgesetzt und der Feststoff durch Zentrifugieren abgetrennt. Der abgetrennte Pellet wird mit Puffer gewaschen, wobei beim zweiten Waschschritt Natriumchlorid zugesetzt wird, um schwach gebundenes Enzym vom Ton abzutrennen. Anschließend wird die Enzymaktivität bestimmt. MS Carrasco, JC Rad and S. Gonzales-Carcedo, Bioresource Technology 51 (1995), 175-181 report on the immobilization of alkaline phosphatase on sodium sepiolite. The best conditions for immobilization were found in a phosphate buffer (pH 7.2) at a temperature of 4 ° C, an enzyme concentration of 0.25 mg / ml and an enzyme / clay ratio of 10 ml / g. The immobilized phosphatase can be used to improve the bioavailability of phosphorus compounds in soils. For the preparation of the immobilized enzyme sepiolite was first converted with a particle size of <2 mm in the sodium form by the sepiolite is repeatedly slurried in a sodium chloride solution. For the immobilization, the enzyme is reacted in a phosphate buffer (pH 7) at 4 ° C. with the sepiolite present in the sodium form and the solid is separated by centrifuging. The separated pellet is washed with buffer, sodium chloride being added in the second washing step to separate weakly bound enzyme from the clay. Subsequently, the enzyme activity is determined.

T. Tietjen und R. G. Wetzel, Aquatic Ecology, 37, 331–339, 2003 , untersuchten den Einfluss der Immobilisierung von Enzymen auf Tonmineralien auf deren Aktivität. Dazu wurden verschiedene Enzyme auf Montmorillonit sowie auf einem Ton aus einer natürlichen Quelle adsorbiert, wobei eine Verringerung der Enzymaktivität gefunden wurde. Wurden die Enzymkomplexe Sonnenlicht ausgesetzt, wurde eine Verringerung der Aktivität beobachtet, die sich jedoch nicht wesentlich von der Verringerung der Aktivität unterschied, die allein durch die Immobilisierung verursacht wurde. Für die Immobilisierung wurde eine Suspension der Tonpartikel, welche eine Partikelgröße von weniger als 2 μm aufwiesen, mit dem jeweiligen Enzym versetzt. T. Tietjen and RG Wetzel, Aquatic Ecology, 37, 331-339, 2003 , investigated the influence of immobilization of enzymes on clay minerals on their activity. For this purpose, various enzymes were adsorbed on montmorillonite and on a clay from a natural source, with a reduction in enzyme activity was found. When the enzyme complexes were exposed to sunlight, a reduction in activity was observed, but not significantly different from the reduction in activity caused solely by the immobilization. For the immobilization, a suspension of the clay particles, which had a particle size of less than 2 μm, was mixed with the respective enzyme.

Über die Immobilisierung von Cellulase auf silikatischen Tonmineralien berichten A. R. S. Sinegani, G. Emtiazi und H. Shariatmadari, J. Colloid Interface Sci. 290, 2005, 39–44 . Als Tonmine ralien wurden Illit, Kaolinit, Montmorillonit, Palygorskit sowie eine undefinierte Bodenprobe verwendet. Die adsorbierte Enzymmenge konnte durch eine Beschichtung der Mineralien mit Aluminiumhydroxid gesteigert werden. Nach der Adsorption des Enzyms zeigt die Kristallstruktur der Tonmineralien keine Aufweitung des Schichtabstands, sodass nach Meinung der Autoren kein Enzym in die Zwischenschichten der Kristallstruktur eingelagert wird.Report on the immobilization of cellulase on silicate clay minerals ARS Sinegani, G. Emtiazi and H. Shariatmadari, J. Colloid Interface Sci. 290, 2005, 39-44 , The clay minerals used were illite, kaolinite, montmorillonite, palygorskite and an undefined soil sample. The adsorbed amount of enzyme could be increased by coating the minerals with aluminum hydroxide. After adsorption of the enzyme, the crystal structure of the clay minerals does not show any widening of the layer distance, so that, according to the authors, no enzyme is incorporated into the intermediate layers of the crystal structure.

Y. Yeşiloğlu, Process Biochemistry, 40, 2005, 2155–2159 berichtet über die adsorptive Immobilisierung des Enzyms Lipase aus Candida rugosa auf Bentonit. Versuche zur Temperaturstabilität des Enzyms zeigen, dass sich die Halbwertszeit der geträgerten Lipase im Vergleich zum ungeträgerten Enzym bei 50°C von 17 auf 45 Minuten erhöht. Y. Yeşiloğlu, Process Biochemistry, 40, 2005, 2155-2159 reports on the adsorptive immobilization of the enzyme lipase from Candida rugosa to bentonite. Experiments on the temperature stability of the enzyme show that the half-life of the supported lipase in comparison to the unsupported enzyme at 50 ° C increased from 17 to 45 minutes.

K. Buchholz und I. Mikhael, Zuckerind. 114, 1989, 558–561 beschreiben die Isolierung des Enzyms Tyrosinase aus Zuckerrüben durch Adsorption an Bentonit. Mit dem immobilisierten Enzym wurde anschließend die enzymatische Oxidation von Tyrosin und Dopa untersucht. K. Buchholz and I. Mikhael, Zuckerind. 114, 1989, 558-561 describe the isolation of the enzyme tyrosinase from sugar beets by adsorption on bentonite. The enzymatic oxidation of tyrosine and dopa was then investigated using the immobilized enzyme.

In den genannten Zitaten werden die Enzyme auf Tonmineralien, insbesondere Bentonit, immobilisiert, die in einer wässrigen Pufferlösung in kolloidaler Form vorliegen. Eine solche feinverteilte Suspension ist jedoch für technische Anwendungen nicht geeignet, da die feinen Partikel nach dem Ende der Reaktion nur schwer vom Reaktionsmedium abgetrennt werden können. Ferner ist es nicht möglich, derartig feine Tonpartikel in Form einer Säule zu packen, die sich in einem kontinuierlichen Durchflussprozess verwenden lässt.In The citations mentioned, the enzymes on clay minerals, in particular Bentonite immobilized in an aqueous buffer solution in colloidal form. Such a finely divided suspension However, it is not suitable for technical applications because the fine particles after the reaction is difficult from the reaction medium can be separated. Furthermore, it is not possible to pack such fine clay particles in the form of a column, which can be used in a continuous flow process.

In der US 5,342,768 wird eine teilchenförmige immobilisierte Lipase beschrieben, die im Wesentlichen aus einer thermostabilen Lipase besteht, die aus einem Mikroorganismus aus der Gruppe von Spezien der Gattung Humicola, Candida antarctica und Rhizomucor miehei isoliert wurde, und die auf Partikeln eines makroporösen Trägers adsorbiert wurde. Der Träger besteht zu zumindest 65% aus Silicagel oder Silikaten, wobei zumindest 90% der Partikel eine Partikelgröße zwischen 100 und 1000 μm aufweisen und wobei zumindest 80% der Poren der Partikel einen Durchmesser aufweisen, der dem 12 bis 45-fachen des Durchmessers eines Lipasemoleküls entspricht, und wobei der Wassergehalt der teilchenförmigen immobilisierten Lipase zwischen 1 und 20% beträgt. Für die Adsorption wird der teilchenförmige Träger in eine wässrige Lösung der Lipase gegeben. Die beladenen Trägerpartikel werden abgetrennt, ggf. gewaschen und bis auf den angegebenen Wassergehalt getrocknet.In the US 5,342,768 For example, a particulate immobilized lipase consisting essentially of a thermostable lipase isolated from a microorganism selected from the group of species of the genus Humicola, Candida antarctica and Rhizomucor miehei and adsorbed on particles of a macroporous support is described. The carrier consists of at least 65% silica gel or silicates, wherein at least 90% of the particles have a particle size between 100 and 1000 microns and wherein at least 80% of the pores of the particles have a diameter which corresponds to 12 to 45 times the diameter of a lipase molecule, and wherein the water content of the particulate immobilized lipase between 1 and 20%. For adsorption, the particulate carrier is added to an aqueous solution of the lipase. The loaded carrier particles are separated, optionally washed and dried to the specified water content.

Über die Verwendung von Schichtsilicaten zur Abtrennung von Enzymen aus dem filtrierten Saft homogenisierter Zuckerrüben berichten C. Buttersack, K. Nowikow, A. Schaper und K. Buchholz (Zuckerind. 119 (1994) Nr. 4, S. 284–291) . Durch Adsorption an Natriumbentonit und anschließende Desorption mit einem pH-Puffer konnten auf einfache Weise Enzyme in reiner Form abgetrennt werden. Die Arbeiten zeigen die gute Eignung von Schichtmineralien zur Abtrennung bzw. Anreicherung von Proteinen bzw. Enzymen. Die Handhabung der Schichtmineralien ist jedoch kompliziert, da diese in Wasser zu einer starken Erhöhung der Viskosität der Aufschlämmung führen und die Schichtmineralien in sehr kleine Partikel zerfallen. Es ist daher sehr schwierig, die Anreicherung von Proteinen in der Weise durchzuführen, dass das Schichtmineral in eine Säule gepackt wird, über welche dann die das Protein enthaltende Flüssigkeit geleitet wird. Ohne Hilfsmaßnahmen verstopft die Säule relativ rasch, da das Schichtmineral stark quillt. Um dennoch eine Abtrennung der Enzyme in einer Säule zu ermöglichen, schlagen die Autoren vor, den Natriumbentonit in ein Calciumalginatgel einzugießen. Das hydrierte Homogenat wird bei pH = 5,0 über die Säule gepumpt, die mit Perlen des immobilisierten Bentonits gefüllt ist. Nachdem die nicht-adsorbierte Fraktion aus der Säule ausgetreten ist, wird mit einer auf pH 8 eingestellten Pufferlösung das Enzym eluiert. Für die großtechnische Abtrennung von Proteinen ist die Verwendung von Natriumbentonit, welcher wie von den Autoren beschrieben, in einem Calciumalginat fixiert ist, wegen der hohen anfallenden Kosten wenig geeignet.Report the use of layered silicates to separate enzymes from the filtered juice of homogenized sugar beet C. Buttersack, K. Novikow, A. Schaper and K. Buchholz (Zuckerind 119 (1994) No. 4, pp. 284-291) , By adsorption on sodium bentonite and subsequent desorption with a pH buffer enzymes could be separated in a simple manner in a pure form. The work shows the good suitability of layered minerals for the separation or enrichment of proteins or enzymes. However, the handling of the layered minerals is complicated as they result in a large increase in the viscosity of the slurry in water and the layered minerals disintegrate into very small particles. It is therefore very difficult to carry out the accumulation of proteins in such a way that the layered mineral is packed in a column, through which the liquid containing the protein is then passed. Without assistance, the column clogged relatively quickly, as the layer mineral swells strongly. However, to allow separation of the enzymes in a column, the authors suggest that sodium bentonite be poured into a calcium alginate gel. The hydrogenated homogenate is pumped at pH = 5.0 across the column packed with beads of immobilized bentonite. After the non-adsorbed fraction has exited the column, the enzyme is eluted with a buffer solution adjusted to pH8. For the large-scale separation of proteins, the use of sodium bentonite, which is fixed in a calcium alginate as described by the authors, is unsuitable because of the high costs involved.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein geträgertes Enzym zur Verfügung zu stellen, welches einfach und kostengünstig hergestellt werden kann, in technischen Prozessen eingesetzt werden kann und bei der Anwendung eine hohe Aktivität und eine lange Halbwertszeit aufweist.Of the Invention was based on the object, a supported enzyme to provide, which is simple and inexpensive can be produced in technical processes can and when using a high activity and a has a long half-life.

Diese Aufgabe wird mit einem festen Enzymkomplex mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen festen Enzymkomplexes sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.These Task is with a solid enzyme complex with the characteristics of Patent claim 1 solved. Advantageous developments of the solid enzyme complex of the invention Subject of the dependent claims.

Die gute Eignung von Schichtsilikaten als Trägermaterial zur Immobilisierung von Enzymen ist bereits bekannt. Um die Nachteile dieses Trägermaterials zu vermeiden, seine starke Quellbarkeit bzw. die Delaminierung in feine Partikel, wird beim erfindungsgemäßen festen Enzymkomplex ein hitzebehandeltes Tonmineral verwendet. Durch die Hitzebehandlung wird erreicht, dass die Quellfähigkeit des Tons deutlich reduziert bzw. ganz unterdrückt wird. Gleichzeitig bleiben jedoch die guten Bindungseigenschaften der Schichtsilikate für Enzyme erhalten. Das hitzebehandelte Tonmineral lässt sich ohne weiteres zu größeren stabilen Partikeln agglomerieren. Es ist daher möglich, den festen Enzymkomplex nach Beendigung der Reaktion einfach abzutrennen, beispielsweise durch Filtration oder Absetzen lassen des festen Enzymkomplexes und Dekantieren der flüssigen Phase. Andererseits lassen sich die Reaktionen auch im Durchfluss durchführen, wenn der erfindungsgemäße feste Enzymkomplex als Säule oder in einer Kartusche bereitgestellt wird. Der erfindungsgemäße feste Enzym komplex lässt sich sehr einfach und kostengünstig sowie in großen Mengen herstellen. Der Träger wird erhalten, indem das als Ausgangsmaterial verwendete Tonmineral erhitzt wird, bis die gewünschten Eigenschaften erreicht sind. Auf dem hitzebehandelten Tonmaterial kann dann mit üblichen Verfahren das interessierende Enzym immobilisiert werden.The good suitability of phyllosilicates as carrier material for Immobilization of enzymes is already known. To the disadvantages This carrier material to avoid its strong swellability or the delamination into fine particles, is in the inventive solid enzyme complex uses a heat-treated clay mineral. By the heat treatment is achieved that the swelling ability the tone is significantly reduced or completely suppressed. At the same time, however, the good binding properties of the Obtained phyllosilicates for enzymes. The heat-treated Clay mineral can be easily larger agglomerate stable particles. It is therefore possible to easily separate the solid enzyme complex after completion of the reaction, For example, by filtration or settling let the solid Enzyme complex and decanting the liquid phase. on the other hand can the reactions also be carried out in the flow, when the solid enzyme complex of the invention as Column or in a cartridge is provided. Of the inventive solid enzyme complex very easy and inexpensive as well as in big ones Produce quantities. The carrier is obtained by the as the starting material used clay mineral is heated until the desired properties are achieved. On the heat-treated Clay material may then be the one of interest by conventional methods Immobilized enzyme.

Erfindungsgemäß wird also ein fester Enzymkomplex zur Verfügung gestellt, umfassend zumindest ein Enzym, welches auf einem Träger immobilisiert ist, der erhalten wurde durch Erhitzen eines Tonminerals auf eine Temperatur und für eine Dauer, dass der Träger eine Quellfähigkeit in Wasser von weniger als 15 ml/2 g aufweist.According to the invention Thus, a solid enzyme complex provided comprising at least one enzyme immobilized on a support obtained by heating a clay mineral to one Temperature and for a duration that the carrier a swelling capacity in water of less than 15 ml / 2 g having.

Der durch Erhitzen eines Tonminerals erhaltene Träger weist eine Quellfähigkeit auf, die im Wesentlichen dem Sedimentvolumen entspricht. Auch bei längerem Stehenlassen in Wasser oder einem wässrigen Reaktionsmedium quillt der Träger nicht auf und zeigt auch keine Delaminierung, sodass er beispielsweise auch keine Erhöhung der Viskosität des Reaktionsmediums bewirkt. Der erfindungsgemäße feste Enzymkomplex kann daher problemlos in größeren Mengen zu einem flüssigen, insbesondere wässrigen Medium gegeben werden, ohne dass dadurch beispielsweise die Viskosität der Suspension drastisch ansteigt. Ferner lässt sich der erfindungsgemäße feste Enzymkomplex ohne Schwierigkeiten mit üblichen Verfahren, wie Filtration oder Zentrifugation wieder vom flüssigen Medium abtrennen. Die Enzyme bleiben dabei überwiegend am Träger adsorbiert, sodass der Träger ggf. auch in einer weiteren Reaktion bzw. Charge eingesetzt werden kann.The carrier obtained by heating a clay mineral has a swelling capacity which substantially corresponds to the sediment volume. Even if left to stand for a long time in water or an aqueous reaction medium, the carrier does not swell and also shows no delamination, so that it does not cause, for example, any increase in the viscosity of the reaction medium. The solid enzyme complex according to the invention can therefore be added without problems in relatively large amounts to a liquid, in particular aqueous medium without, for example, the viscosity of the suspension thereby increasing drastically. Furthermore, the solid enzyme complex according to the invention can be separated from the liquid medium without difficulty by conventional methods, such as filtration or centrifugation. The enzymes remain predominantly on Trä ger adsorbed, so that the carrier may also be used in a further reaction or batch.

Auf dem durch Hitzebehandlung eines Tonminerals erhaltene Träger können Enzyme in solchen Mengen gebunden werden, dass der feste Enzymkomplex eine Aktivität aufweist, die für technische Anwendungen interessant ist. An sich geht man nach herrschender Meinung bei Schichtsilikaten davon aus, dass bei einem vollständi gen Verlust des Quellvermögens der Tonmaterialien die für eine Adsorption von Enzymen zur Verfügung stehende innere Oberfläche stark verringert wird, da die Schichten chemisch miteinander verbunden werden. Man erwartet daher, dass durch eine Hitzebehandlung das Adsorptionsvermögen des Tonminerals drastisch abgesenkt wird. Überraschend wurde nun gefunden, dass durch eine Temperaturbehandlung das Quellvermögen von Tonmineralien, insbesondere von smektitischen Schichtsilikaten, wie z. B. von Bentoniten, zerstört werden kann, wobei trotzdem das hohe Bindevermögen für Enzyme erhalten bleibt.On the carrier obtained by heat-treating a clay mineral Enzymes can be bound in such quantities that the solid enzyme complex has an activity for technical applications is interesting. In itself one goes after prevailing ones Opinion in the case of phyllosilicates, that in a complete gen Loss of swelling capacity of the clay materials used for an adsorption of enzymes available inside Surface is greatly reduced because the layers are chemically be connected to each other. It is therefore expected that by a Heat treatment the adsorption capacity of the clay mineral drastically lowered. Surprisingly, it has now been found that by a temperature treatment, the swelling capacity clay minerals, in particular smectite phyllosilicates, such as B. bentonites, can be destroyed while still the high binding capacity for enzymes is maintained.

Die Eigenschaften des Trägers lassen sich durch die Temperaturbehandlung steuern.The Properties of the carrier can be determined by the temperature treatment Taxes.

Eine hohe Ionenaustauschkapazität korreliert im Allgemeinen mit einer guten Bindekapazität für Enzyme. Bei dem aus einem Tonmineral durch Hitzebehandlung hergestellten Träger beträgt die Kationenaustauschkapazität vorzugsweise zumindest 5 meq/100 g, bevorzugt zumindest 10 meq/100 g, besonders bevorzugt zumindest 15 meq/100 g. Bevorzugt weist der Träger eine möglichst hohe Ionenaustauschkapazität auf. Bevorzugt weist der Träger eine Kationenaustauschkapazität von zumindest 40 meq/100 g, insbesondere bevorzugt zumindest 60 meq/100 g auf. Besonders bevorzugt liegt die Kationenaustauschkapazität im Bereich von 65 bis 130 meq/100 g. Die Ionenaustauschkapazität des durch eine Hitzebehandlung aus einem Tonmineral hergestellten Trägers ist ein wichtiges Kriterium, um beispielsweise den im erfindungsgemäßen festen Enzymkomplex enthaltenen Träger von Tonmaterialien zu unterscheiden, wie sie beispielsweise durch Extrahieren mit heißer Säure aus natürlichen Tonmineralien gewonnen werden können. Letztere zeigen keine oder nur eine geringe Fähigkeit zum Ionenaustausch. Hochaufgeschlossene Bleicherden, die nicht mehr quellen, zeigen typischerweise eine Kationenaustauschkapazität im Bereich von weniger als 30 meq/100 g.A high ion exchange capacity generally correlates with a good binding capacity for enzymes. at the carrier prepared from a clay mineral by heat treatment the cation exchange capacity is preferably at least 5 meq / 100 g, preferably at least 10 meq / 100 g, especially preferably at least 15 meq / 100 g. Preferably, the carrier the highest possible ion exchange capacity. Prefers the carrier has a cation exchange capacity of at least 40 meq / 100 g, more preferably at least 60 meq / 100g. Particularly preferred is the cation exchange capacity in the range of 65 to 130 meq / 100 g. The ion exchange capacity of a clay mineral produced by a heat treatment Carrier is an important criterion, for example contained in the solid enzyme complex according to the invention To distinguish carriers of clay materials, as for example by extracting with hot acid from natural Clay minerals can be obtained. The latter show no or only a small ability for ion exchange. high Digested Bleaching earths that do not swell typically show one Cation exchange capacity in the range of less than 30 meq / 100g.

Durch die Hitzebehandlung wird die innere Oberfläche des Tonminerals deutlich verringert. Vorzugsweise weist der Träger eine spezifische Oberfläche von weniger als 300 m²/g, insbesondere bevorzugt weniger als 200 m²/g auf, besonders bevorzugt weniger als 120 m²/g. Um eine ausreichende Absorptionskapazität für Enzyme zu erreichen, darf die spezifische Oberfläche allerdings auch nicht zu weit abgesenkt werden, das Tonmineral also nicht "totgebrannt" werden. Vorzugsweise beträgt die spezifische Oberfläche des Trägers zumindest 30 m²/g, insbesondere bevorzugt zumindest 60 m²/g.The heat treatment significantly reduces the inner surface of the clay mineral. The support preferably has a specific surface area of less than 300 m ² / g, particularly preferably less than 200 m ² / g, particularly preferably less than 120 m ² / g. In order to achieve a sufficient absorption capacity for enzymes, however, the specific surface area may not be lowered too far, so the clay mineral will not be "deadburned". The specific surface of the support is preferably at least 30 m ² / g, particularly preferably at least 60 m ² / g.

Der im erfindungsgemäßen festen Enzymkomplex enthaltene Träger weist nahezu keine Quellfähigkeit in Wasser mehr auf. Das Quellvolumen entspricht in diesem Fall dem Sedimentvolumen. Auch bei einer längeren Lagerung in Wasser ist keine oder nahezu keine Zunahme des Sedimentvolumens zu beobachten. Bevorzugt weist der Träger nach einer Lagerung in Wasser für drei Tage ein Sedimentvolumen von weniger als 15 ml/2 g, bevorzugt weniger als 10 ml/2 g, insbesondere bevorzugt von weniger als 8 ml/2 g auf.Of the contained in the solid enzyme complex according to the invention Carrier has almost no swellability in water more on. The swelling volume in this case corresponds to the sediment volume. Even with a longer storage in water is no or to observe almost no increase in sediment volume. Prefers indicates the carrier after storage in water for three days a sediment volume of less than 15 ml / 2 g, preferably less than 10 ml / 2 g, more preferably less than 8 ml / 2 g.

Der erfindungsgemäße feste Enzymkomplex kann als feines Pulver oder aber auch in Form größer dimensionierter Formkörper bereitgestellt werden. Da der Träger keine oder allenfalls eine sehr geringe Quellfähigkeit in Wasser aufweist, können beispielsweise auch Granulate von an sich beliebiger Größe hergestellt werden, auf welchen dann das Enzym immobilisiert wird. Um bei größer dimensionierten Formkörpern eine ausreichende Stabilität zu erreichen, sodass der feste Enzymkomplex beispielsweise in einem wässrigen Reaktionsmedium nicht zerfällt, wird die thermische Behandlung vorzugsweise erst nach der Formgebung durchgeführt.Of the solid enzyme complex according to the invention can be used as a fine Powder or in the form of larger sized Shaped bodies are provided. As the carrier no or at most a very low swelling capacity in water, for example, granules of any size, on which then the enzyme is immobilized. To get bigger dimensioned moldings sufficient stability reach so that the solid enzyme complex, for example, in a aqueous reaction medium does not decompose the thermal treatment preferably after molding carried out.

An sich bestehen keine Einschränkungen in Bezug auf das Enzym, welches in Form des erfindungsgemäßen festen Enzymkomplexes bereitgestellt wird. Es können an sich alle Enzyme in den erfindungsgemäßen festen Enzymkomplex eingebunden werden, die für die Durchführung enzymkatalysierter Reaktionen bekannt sind. Bevorzugt ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe, welche gebildet ist aus Lipasen, Oxireduktasen, wie Glucose-Oxidase oder Pyruvatdehydrogenase, Transferasen, wie Hexokinase oder Glykogenphophorylase, Hydrolasen, wie Amylasen, Chymotrypsin, Peptidasen oder Esterasen, Isomerasen, wie Glucose-Isomerase, Ligasen, wie Carboxylasen, Lyasen, wie Aldolase oder Katalase. Besonders bevorzugt ist das Enzym eine Lipase, insbesondere aus der Enzymklasse der Hydrolasen.At there are no restrictions on the enzyme, which in the form of the solid enzyme complex according to the invention provided. It can in itself all the enzymes in the integrated solid enzyme complex according to the invention which are enzyme catalyzed for the implementation Reactions are known. Preferably, the enzyme is selected from the group consisting of lipases, oxireductases, such as glucose oxidase or pyruvate dehydrogenase, transferases, such as Hexokinase or glycogen phosphorylase, hydrolases, such as amylases, Chymotrypsin, peptidases or esterases, isomerases, such as glucose isomerase, Ligases, such as carboxylases, lyases, such as aldolase or catalase. Especially Preferably, the enzyme is a lipase, especially from the enzyme class the hydrolases.

Lipasen sind Enzyme, die Lipide, wie Triglyceride oder Diglyceride, zu freien Fettsäuren und Glycerin spalten. Lipasen (Triacylglycerin-Hydrolasen) katalysieren sowohl die Hydrolyse als auch die Synthese von Estern aus Glycerin und langkettigen Fettsäuren. Weitere von Lipasen katalysierte Reaktionen sind die Umesterung von Lipiden und die Veresterung primärer, sekundärer und tertiärer Alkohole. Die industrielle Nutzung dieser Enzyme ist sehr vielseitig. Die Zugabe zu Waschmitteln ist das größte Anwendungsgebiet für Lipasen. Ca. 1000 Tonnen Enzym werden jährlich Waschmitteln zugefügt. In der Kosmetikindustrie werden Lipasen zur Herstellung von Emulgatoren und Aromastoffen verwendet. In der Lebensmittelindustrie werden Lipasen für die Synthese von Glyceriden und Aromastoffen, sowie zur Modifikation von Fetten eingesetzt. Ein weiteres großes Einsatzgebiet für Lipasen ist die Herstellung von Bulk- und Feinchemikalien. Dabei gewinnt die Verwendung der Enzyme für stereoselektive Reaktionen immer mehr an Bedeutung. Weiter finden Lipasen Anwendung bei der Herstellung von Schmiermitteln, Hydraulikölen sowie Biodiesel.Lipases are enzymes that cleave lipids, such as triglycerides or diglycerides, to free fatty acids and glycerol. Lipases (triacylglycerol hydrolases) catalyze the hydrolysis as well as the synthesis of esters of glycerine and long-chain fatty acids. Other lipase-catalyzed reactions are the transesterases tion of lipids and the esterification of primary, secondary and tertiary alcohols. The industrial use of these enzymes is very versatile. Addition to detergents is the largest field of application for lipases. Approximately 1000 tons of enzyme are added to detergents every year. In the cosmetics industry, lipases are used to make emulsifiers and flavorings. In the food industry lipases are used for the synthesis of glycerides and flavorings, as well as for the modification of fats. Another major application for lipases is the production of bulk and fine chemicals. The use of the enzymes for stereoselective reactions is becoming increasingly important. Lipases are also used in the production of lubricants, hydraulic oils and biodiesel.

Das Enzym kann über eine kovalente Bindung oder auch über eine nicht-kovalente Bindung an den Träger gebunden sein. Für eine kovalente Bindung des Enzyms an den Träger werden Kopplungsmittel verwendet, wie sie bereits aus der Immobilisierung von Enzymen bzw. Proteinen bekannt sind. Derartige Kopplungsmittel sind Moleküle mit zumindest zwei reaktiven Gruppen, wobei eine Gruppe mit einer auf der Oberfläche des Trägers bereitgestellte Hydroxygruppe und die zumindest eine weitere reaktive Gruppe mit einer entsprechenden Gruppe am Enzym, wie einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe oder einer Thiolgruppe reagiert, sodass das Enzym über das Kopplungsmittelmolekül auf der Oberfläche des Trägers durch kovalente Bindungen fixiert wird.The Enzyme may be via a covalent bond or over a non-covalent bond to the support. For covalent attachment of the enzyme to the carrier Coupling agents are used as they are already from immobilization of enzymes or proteins are known. Such coupling agents are molecules with at least two reactive groups, where a group with one on the surface of the carrier provided hydroxy group and the at least one further reactive Group with an appropriate group on the enzyme, such as a hydroxy group, an amino group or a thiol group reacts, so that the enzyme over the coupling agent molecule on the surface of the support is fixed by covalent bonds.

Es ist auch möglich, dass das Enzym durch entsprechende zumindest bifunktionelle Moleküle vernetzt wird, sodass das Molekülgewicht des Enzyms erhöht und damit seine Löslichkeit im Reaktionsmedium verschlechtert wird.It it is also possible that the enzyme is replaced by appropriate at least bifunctional molecules is cross-linked, so the molecular weight of the enzyme increases and thus its solubility is deteriorated in the reaction medium.

Bevorzugt ist das Enzym über eine nicht-kovalente Bindung an dem Träger gebunden. Der Träger besitzt auch nach der thermischen Behandlung eine ausreichend hohe Kationenaustauschkapazität, sodass eine Adsorption des Enzyms auf dem Träger über ionische Bindungen erfolgen kann. Ebenso kann eine Immobilisierung des Enzyms über hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Enzym und Träger erfolgen. Durch die nicht-kovalente Bindung des Enzyms auf dem Träger wird die Struktur des Enzyms weniger gestört, sodass sich die Immobilisierung nicht übermäßig auf die Aktivität des Enzyms auswirkt.Prefers is the enzyme via a non-covalent bond to the Carrier tied. The carrier also owns the thermal treatment has a sufficiently high cation exchange capacity, so that adsorption of the enzyme on the carrier via ionic bonds can be made. Likewise, an immobilization of the enzyme via hydrophobic interactions between enzyme and carriers take place. By the non-covalent bond the enzyme on the carrier becomes the structure of the enzyme less disturbed, so that the immobilization is not excessive affects the activity of the enzyme.

Die Menge des Enzyms, welche auf dem Träger immobilisiert ist, wird bevorzugt hoch gewählt, um eine ausreichend hohe Aktivität des festen Enzymkomplexes zu erreichen. Bevorzugt beträgt der Anteil des Enzyms, bezogen auf das Gewicht des festen Enzymkomplexes, zwischen 3 und 35 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 20 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 8 bis 15 Gew.-%.The Amount of the enzyme immobilized on the carrier, is preferably chosen to be sufficiently high in activity of the solid enzyme complex. Preferred is the proportion of the enzyme, based on the weight of the solid enzyme complex, between 3 and 35 wt .-%, particularly preferably 5 to 20 wt .-%, in particular preferably 8 to 15 wt .-%.

Das im festen Enzymkomplex enthaltene Enzym ist wie bereits erläutert an sich keinen besondere Beschränkungen unterworfen. Bevorzugt weist das Enzym ein Molekülgewicht im Bereich von 10 bis 200 kDa auf.The Enzyme contained in the solid enzyme complex is as already explained in itself is not subject to any particular restrictions. Prefers the enzyme has a molecular weight in the range of 10 to 200 kDa on.

Der erfindungsgemäße feste Enzymkomplex lässt sich auf einfache und kostengünstige Weise herstellen, sodass auch größere Mengen des erfindungsgemäßen festen Enzymkomplexes zugänglich sind. Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung eines festen Enzymkomplexes, wie er oben beschrieben wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei die folgenden Schritte:

– Bereitstellen eines Trägers, der erhalten wurde durch Erhitzen eines Tonminerals auf eine Temperatur und für eine Dauer, dass der Träger eine Quellfähigkeit in Wasser von weniger als 15 ml/2 g aufweist;
– Bereitstellen eines Enzyms;
– Inkontaktbringen des Enzyms und des Trägers in einem Reaktionsmedium, wobei das Enzym auf dem Träger immobilisiert wird; und
– ggf. Entfernen des festen Enzymkomplexes aus dem Reaktionsmedium.

The solid enzyme complex according to the invention can be prepared in a simple and cost-effective manner, so that even larger amounts of the solid enzyme complex according to the invention are accessible. The invention therefore also relates to a process for the preparation of a solid enzyme complex as described above. The method according to the invention comprises the following steps:

Providing a carrier obtained by heating a clay mineral to a temperature and for a duration that the carrier has a swelling capacity in water of less than 15 ml / 2 g;
- providing an enzyme;
Contacting the enzyme and the carrier in a reaction medium, wherein the enzyme is immobilized on the carrier; and
- If necessary, removing the solid enzyme complex from the reaction medium.

In einem ersten Reaktionsschritt wird der Träger bereitgestellt, indem ein Tonmineral einer thermischen Behandlung unterworfen wird, sodass es eine bestimmte, sehr niedrige Quellfähigkeit erhält. Da das als Ausgangsmaterial verwendete Tonmineral aus einer natürlichen Quelle gewonnen wird und daher Schwankungen in den Eigenschaften der verschiedenen Tonmineralien auftreten können, wird bevorzugt in der Weise vorgegangen, dass zunächst durch Reihenuntersuchungen die optimale Temperatur für das Tonmineral ermittelt wird, bei welchem die gewünschte niedrige Quellfähigkeit des Trägers eingestellt wird. Bevorzugt wird dabei eine möglichst niedrige Temperatur gewählt und gegebenenfalls die Dauer der Temperaturbehandlung angepasst. Bevorzugt werden für die Temperaturbehandlung Temperaturen von zumindest 400°C, bevorzugt zumindest 450°C, insbesondere bevorzugt zumin dest 500°C gewählt. Das Tonmineral sollte jedoch auch keine zu hohe thermische Belastung erfahren, da sonst die Adsorptionskapazität absinkt. Bevorzugt werden die Temperaturen daher niedriger als 1000°C, vorzugsweise niedriger als 900°C und insbesondere bevorzugt unterhalb von 800°C gewählt. Die Dauer der Behandlung ist abhängig von der Menge des eingesetzten Tonminerals sowie vom Ofentyp. Bevorzugt werden Drehrohröfen für die Hitzebehandlung verwendet, da diese ein gleichmäßiges Erhitzen des Tonminerals ermöglichen. Die Behandlungsdauer wird vorzugsweise möglichst kurz gewählt, um eine übermäßige thermische Belastung des Tonminerals zu vermeiden. Bei einer industriellen Durchführung des Verfahrens werden Behandlungszeiten von zumindest 10 Minuten, vorzugsweise zumindest 20 Minuten gewählt. Um eine thermische Überbelastung zu vermeiden, wird die Behandlungszeit bevorzugt kürzer als 2 Stunden, insbesondere bevorzugt kürzer als 1 Stunde gewählt. Die geeignete Behandlungsdauer kann vom Fachmann leicht ermittelt werden, indem während der thermischen Behandlung des Tonminerals regelmäßig Proben entnommen und auf ihre Quellfähigkeit untersucht werden. Weitere Parameter, wie die Ionenaustauschkapazität, die spezifische Oberfläche oder das Porenvolumen, können für die Überwachung der thermischen Behandlung ebenfalls unterstützend herangezogen werden.In a first reaction step, the support is provided by subjecting a clay mineral to a thermal treatment so that it obtains a certain, very low swelling capacity. Since the clay mineral used as starting material is obtained from a natural source and therefore variations in the properties of the various clay minerals may occur, it is preferred to first determine by screening the optimum temperature for the clay mineral at which the desired low swelling capacity the carrier is set. Preferably, the lowest possible temperature is selected and, if appropriate, the duration of the temperature treatment is adjusted. For the temperature treatment, preference is given to temperatures of at least 400 ° C., preferably at least 450 ° C., particularly preferably at least 500 ° C. However, the clay mineral should not experience too high a thermal load, otherwise the adsorption capacity drops. The temperatures are therefore preferably chosen to be lower than 1000.degree. C., preferably lower than 900.degree. C. and particularly preferably below 800.degree. The duration of treatment depends on the amount of Tonmi used and the kiln type. Rotary kilns are preferably used for the heat treatment, since they allow a uniform heating of the clay mineral. The treatment time is preferably chosen as short as possible in order to avoid excessive thermal stress on the clay mineral. In an industrial implementation of the method, treatment times of at least 10 minutes, preferably at least 20 minutes are selected. In order to avoid a thermal overload, the treatment time is preferably chosen shorter than 2 hours, particularly preferably shorter than 1 hour. The suitable duration of treatment can easily be determined by a person skilled in the art by regularly taking samples during the thermal treatment of the clay mineral and examining their swelling capacity. Other parameters, such as the ion exchange capacity, the specific surface area or the pore volume, can also be used to assist in the monitoring of the thermal treatment.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Trägers können an sich beliebige Tonmineralien verwendet werden, die aus natürlichen Quellen zugänglich sind. Bevorzugt werden Tonmineralien verwendet, die eine hohe Ionenaustauschkapazität sowie eine hohe Quellfähigkeit aufweisen. Bevorzugt werden Tonmaterialien verwendet, die eine Ionenaustauschkapazität von zumindest 5 meq/100 g, vorzugsweise zumindest 10 meq/100 g, besonders bevorzugt zumindest 20 meq/100 g, insbesondere bevorzugt zumindest 40 meq/100 g aufweisen, und besonders bevorzugt werden Tonmineralien verwendet, deren Kationenaustauschkapazität im Bereich von 50 bis 130 meq/100 g, insbesondere bevorzugt im Bereich von 70 bis 120 meq/100 g liegt. Ferner werden bevorzugt Tonmineralien verwendet, die eine hohe Quellfähigkeit aufweisen. Vorzugsweise weisen die als Ausgangsmaterial verwendeten Tonmineralien eine Quellfähigkeit in Wasser nach einer Stunde von zumindest 5 ml/2 g, bevorzugt zumindest 8 ml/2 g, besonders bevorzugt zumindest 10 ml/2 g auf. Bevorzugt weisen die als Ausgangsmaterialien verwendeten Tonmineralien eine Quellfähigkeit im Bereich von 6 bis 80 ml/2 g, besonders bevorzugt 9 bis 40 ml/2 g, insbesondere bevorzugt 10 bis 20 ml/2 g auf. Geeignet sind beispielsweise Natriumbentonite oder Calciumbentonite.When Starting material for the preparation of the carrier in itself any clay minerals can be used which are accessible from natural sources. Prefers Clay minerals are used which have a high ion exchange capacity and have a high swelling capacity. To be favoured Clay materials used that have an ion exchange capacity of at least 5 meq / 100 g, preferably at least 10 meq / 100 g, more preferably at least 20 meq / 100 g, especially preferred at least 40 meq / 100 g, and are particularly preferred Clay minerals used their cation exchange capacity in the range of 50 to 130 meq / 100 g, more preferably in the range from 70 to 120 meq / 100g. Furthermore, clay minerals are preferred used, which have a high swelling capacity. Preferably the clay minerals used as starting material have a swelling capacity in water after one hour of at least 5 ml / 2 g, preferably at least 8 ml / 2 g, more preferably at least 10 ml / 2 g. Prefers have the clay minerals used as starting materials one Swelling capacity in the range of 6 to 80 ml / 2 g, especially preferably 9 to 40 ml / 2 g, particularly preferably 10 to 20 ml / 2 g on. For example, sodium bentonites or calcium bentonites are suitable.

Die für die Herstellung des Trägers verwendeten Tonmineralien weisen bevorzugt neutrale bis schwach basische Eigenschaften auf. Eine 2 Gew.-% -ige Suspension des Tonminerals in destilliertem Wasser weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 11 auf.The clay minerals used to make the carrier have preferably neutral to weak basic properties. A 2% by weight suspension of the clay mineral in distilled water Preferably, a pH in the range of 6 to 11 on.

Als Ausgangsmaterialien für die Herstellung der Träger werden bevorzugt smektitische Schichtsilikate verwendet. Hierunter fallen beispielsweise geladene Tonminerale vom 2:1 Schichttyp mit einer negativen Ladung von 0,2 bis 0,6 pro Formeleinheit.When Starting materials for the preparation of the carrier smectite phyllosilicates are preferably used. this includes For example, charged clay minerals of the 2: 1 layer type are included a negative charge of 0.2 to 0.6 per formula unit.

Die Kationenaustauschkapazität der als Ausgangsmaterialien für die Herstellung des Trägers verwendeten Tonmineralien lässt sich durch Austausch mit Ammoniumchlorid und anschließende Stickstoffbestimmung ermitteln und liegt vorzugsweise im oben beschriebenen Bereich von 10 bis 130 meq/100 g. Beispiele für geeignete smektitische Tonminerale sind Bentonit, Montmorillonit, Beidellit, Nontronit, Hectorit und Saponit. Ein weiteres geeignetes smektitisches Tonmineral ist Stevensit. Seine Struktur leitet sich vom Talk ab, wobei die Positionen der Magnesiumionen durch Leerstellen ersetzt sind.The Cation exchange capacity of as starting materials clay minerals used to make the carrier can be exchanged with ammonium chloride and subsequent Determine nitrogen determination and is preferably in the above-described Range from 10 to 130 meq / 100g. Examples of suitable smectite clay minerals are bentonite, montmorillonite, beidellite, Nontronite, hectorite and saponite. Another suitable smectite Clay mineral is Stevensit. Its structure is derived from talc, wherein the positions of the magnesium ions are replaced by vacancies are.

Durch die Wahl des Tonminerals lässt sich der Anteil der Ladungswechselwirkungen und hydrophoben Wechselwirkungen, mit wel chen das jeweils ausgewählte Enzym auf der Oberfläche des Trägers fixiert wird, gezielt auswählen. So sind Träger, die aus montmorillonithaltigen Tonmineralien mit hohen Kationenaustauschkapazitäten von vorzugsweise mehr als 65 meq/100 g, bevorzugt mehr als 85 meq/100 g, durch thermische Behandlung hergestellt werden, eher dazu geeignet, die zu immobilisierenden Enzyme über Ladungswechselwirkungen zu binden, während Träger, die z. B. aus Stevensiten, Keroliten oder Saponiten hergestellt werden, sich insbesondere für die Immobilisierung von Enzymen eignen, die über hydrophobe Wechselwirkungen an den Träger gebunden werden. Geeignete Saponite weisen beispielsweise eine Kationenaustauschkapazität von vorzugsweise 5 bis 60 meq/100 g sowie vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von 100 bis 170 m²/g auf.By selecting the clay mineral, the proportion of charge interactions and hydrophobic interactions with which the particular enzyme selected is fixed on the surface of the support can be selected specifically. Thus, supports made from montmorillonite-containing clay minerals with high cation exchange capacities of preferably greater than 65 meq / 100 g, preferably greater than 85 meq / 100 g, by thermal treatment are more likely to bind the enzymes to be immobilized via charge interactions, while Carriers, the z. B. from stevensites, kerolites or saponites are made, in particular for the immobilization of enzymes are suitable, which are bound via hydrophobic interactions to the carrier. Suitable saponites have, for example, a cation exchange capacity of preferably 5 to 60 meq / 100 g and preferably a specific surface area of 100 to 170 m ² / g.

Soll eine Enzym bevorzugt über hydrophobe Wechselwirkungen am Träger gebunden werden, so werden bevorzugt Tonmineralien für die thermische Behandlung ausgewählt, die eine Kationenaustauschkapazität von weniger als 80 meq/100 g, bevorzugt weniger als 75 meq/100 g, insbesondere bevorzugt in einem Bereich von 40 bis 70 meq/100 g aufweisen. Bevorzugt weisen diese Tonmineralien eine hohe spezifische Oberfläche auf. Vorzugsweise weisen die Tonmineralien eine spezifische Oberfläche von mehr als 100 m²/g, bevorzugt von mehr als 120 m²/g, besonders bevorzugt mehr als 150 m²/g auf.If an enzyme is to be bound to the carrier preferably via hydrophobic interactions, preference is given to selecting clay minerals for the thermal treatment which have a cation exchange capacity of less than 80 meq / 100 g, preferably less than 75 meq / 100 g, particularly preferably in a range of 40 to 70 meq / 100 g. Preferably, these clay minerals have a high specific surface area. The clay minerals preferably have a specific surface area of more than 100 m ² / g, preferably of more than 120 m ² / g, particularly preferably more than 150 m ² / g.

Die für die Herstellung des Trägers verwendeten Tonmineralien können vor der Hitzebehandlung ggf. getrocknet werden, vorzugsweise auf einen Feuchtegehalt von weniger als 20 Gew.-%, insbesondere auf einen Feuchtegehalt im Bereich von 5–15 Gew.-%. Ferner kann das Rohtonmaterial vor der Hitzebehandlung vermahlen werden, vorzugsweise auf eine mittlere Korngröße D₅₀ von weniger als 3 mm, besonders bevorzugt weniger als 1 mm, insbesondere bevorzugt weniger als 0,2 mm.If necessary, the clay minerals used for the preparation of the support may be dried before the heat treatment, preferably to a moisture content of less than 20% by weight, in particular to ei Moisture content in the range of 5-15 wt .-%. Furthermore, the raw clay material can be ground before the heat treatment, preferably to a mean particle size D ₅₀ of less than 3 mm, more preferably less than 1 mm, particularly preferably less than 0.2 mm.

Die als Ausgangsmaterial für die Herstellung des Trägers verwendeten Tonmineralien, insbesondere smektitischen Tonmineralien, können sowohl in der Natriumform als auch in der Calcium- oder Magnesiumform vorliegen. Ebenso können auch Mischformen verwendet werden, in welchen einwertige Alkalimetallionen und zweiwertige Erdalkalimetallionen als Zwischenschichtionen in den Tonmineralien enthalten sind. Der Anteil der ein- bzw. zweiwertigen Kationen kann vor der Hitzebehandlung eingestellt werden, indem das Tonmineral mit einem entsprechenden Alkalimetallsalz, beispielsweise Natriumcarbonat oder Natriumhydrogencarbonat, umgesetzt wird. Dazu kann beispielsweise ein naturfeuchter Calciumbentonit mit einer Sodalösung besprüht oder mit festem Natriumcarbonat verknetet werden. Soll der Anteil an zweiwertigen Erdalkalimetallionen erhöht werden, kann das Tonmineral mit einer geeigneten Erdalkaliverbindung, beispielsweise Calciumchlorid, umgesetzt werden.The as starting material for the preparation of the carrier used clay minerals, especially smectitic clay minerals, can be used both in the sodium form and in the calcium or magnesium form. Likewise also mixed forms can in which monovalent alkali metal ions and divalent Alkaline earth metal ions as interlayer ions in the clay minerals are included. The proportion of monovalent or divalent cations can be adjusted before the heat treatment by the clay mineral with a corresponding alkali metal salt, for example sodium carbonate or sodium bicarbonate. This can for example a naturally moist calcium bentonite with a soda solution sprayed or kneaded with solid sodium carbonate. If the proportion of divalent alkaline earth metal ions increases can be the clay mineral with a suitable alkaline earth compound, for example, calcium chloride.

Bevorzugt wird das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete hitzebehandelte Tonmineral aus einem Rohtonmaterial hergestellt, welches auf Zwischenschichtplätzen zumindest einen Anteil an zweiwertigen Erdalkalimetallionen, vorzugsweise Calciumionen, aufweist.Prefers is used in the process according to the invention heat-treated clay mineral produced from a raw clay material, which at intermediate market places at least a share of divalent alkaline earth metal ions, preferably calcium ions, having.

Bei Bentoniten wird an sich eine umso höhere Bindungskapazität für Proteine beobachtet, je höher der Anteil an Alkalimetallionen an den austauschfähigen, in den Zwischenschichten des Bentonits angeordneten Ionen ist. Die hohe Bindungskapazität von Natriumbentoniten wird auf die starke Delaminierung zurückgeführt, die bei der Herstellung einer Suspension in Wasser eintritt. Dadurch erhöht sich die für eine Absorption zur Verfügung stehende Oberfläche stark. Bei Calciumbentoniten besteht ein stärkerer Zusammenhalt der Schichten, wodurch bei der Herstellung einer wässrigen Suspension eine Delaminierung nur in geringerem Maß auftritt und damit auch eine im Vergleich zu Natrium bentoniten geringere Oberfläche für die Absorption zur Verfügung steht.at Bentonite in itself becomes a higher binding capacity for proteins, the higher the proportion of Alkali metal ions on the exchangeable, in the intermediate layers the bentonite is arranged ions. The high binding capacity of sodium bentonites is attributed to the strong delamination that occurs in the preparation of a suspension in water. Thereby increases the available for absorption standing surface strong. In the case of calcium bentonites a stronger cohesion of the layers, resulting in the Preparation of an aqueous suspension delamination occurs only to a lesser extent and therefore also one in comparison to sodium bentonite lower surface for the absorption is available.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat sich jedoch gezeigt, dass eine höhere Absorptionskapazität für Enzyme erreicht werden kann, wenn von einem Tonmineral ausgegangen wird, das einen Anteil an Erdalkaliionen auf Zwischenschichtplätzen aufweist.At the However, the process according to the invention has shown that a higher absorption capacity for Enzymes can be achieved when starting from a clay mineral which is a proportion of alkaline earth ions on interlayer sites having.

Bevorzugt beträgt beim hitzebehandelten Tonmaterial der Anteil an zweiwertigen Kationen an der Ionenaustauschkapazität zumindest 15%, besonders bevorzugt zumindest 30%, insbesondere bevorzugt zumindest 70%. Der Anteil der zweiwertigen Kationen, insbesondere Calcium und Magnesium, an der Kationenaustauschkapazität beträgt bevorzugt weniger als 95%, insbesondere weniger als 85%. Es wurde beobachtet, dass durch einen hohen Anteil an austauschbaren zweiwertigen Kationen die Bindungsneigung von Enzymen an das hitzebehandelte Tonmaterial verbessert werden kann. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, nehmen die Erfinder an, dass die in Zwischenschichten angeordneten Erdalkaliionen bei der thermischen Behandlung des Tonminerals eine Stützfunktion ausüben, sodass die Schichten des Tonminerals nicht so stark zusammensinken, wie bei reinen Natriumbentoniten. Der Anteil der zwei- bzw. einwertigen Kationen kann entsprechend vor der Hitzebehandlung beim Tonmineral eingestellt werden. Dieses kann dazu beispielsweise mit einem geeigneten Natriumsalz, wie Natriumcarbonat, umgesetzt werden, indem das Tonmineral beispielsweise mit einer Sodalösung besprüht oder mit festem Natriumcarbonat verknetet wird.Prefers is the proportion of heat-treated clay material divalent cations on the ion exchange capacity at least 15%, more preferably at least 30%, most preferably at least 70%. The proportion of divalent cations, especially calcium and magnesium, at which cation exchange capacity is preferably less than 95%, in particular less than 85%. It was observed that by a high proportion of exchangeable divalent Cations the binding tendency of enzymes to the heat-treated Clay material can be improved. Without being tied to this theory want to be, the inventors assume that in intermediate layers arranged alkaline earth ions in the thermal treatment of the clay mineral perform a supporting function so that the layers of clay mineral do not sink as much as pure sodium bentonites. The proportion of divalent or monovalent cations can be correspondingly be adjusted before the heat treatment of the clay mineral. This For example, with a suitable sodium salt, such as sodium carbonate, be implemented by the clay mineral, for example, with a Sodalösung sprayed or with solid sodium carbonate is kneaded.

Wie bereits erläutert, weist der Träger nach der thermischen Behandlung bevorzugt eine spezifische Oberfläche von weniger als 300 m²/g, besonders bevorzugt weniger als 200 m²/g, insbesondere bevorzugt weniger als 120 m²/g auf. Bevorzugt beträgt die Oberfläche des Trägers zumindest 30 m²/g, besonders bevorzugt zumindest 35 m²/g, insbesondere bevorzugt zumindest 60 m²/g. Die spe zifische Oberfläche lässt sich daher neben der bereits beschriebenen Quellfähigkeit dazu verwenden, die thermische Behandlung des Tonminerals zu überwachen.As already explained, after the thermal treatment, the support preferably has a specific surface area of less than 300 m ² / g, more preferably less than 200 m ² / g, particularly preferably less than 120 m ² / g. The surface of the support is preferably at least 30 m ² / g, particularly preferably at least 35 m ² / g, particularly preferably at least 60 m ² / g. The spe cific surface can therefore be used in addition to the swelling ability already described to monitor the thermal treatment of the clay mineral.

Der Träger weist nach der thermischen Behandlung nahezu keine Quellfähigkeit in Wasser mehr auf. Das Quellvolumen entspricht in diesem Fall dem Sedimentvolumen. Auch bei einer längeren Lagerung in Wasser ist keine oder nahezu keine Zunahme des Sedimentvolumens zu beobachten. Vorzugsweise weist der Träger nach einer Lagerung in Wasser für drei Tage ein Quellvolumen von weniger als 15 ml/2 g, bevorzugt weniger als 10 ml/2 g, besonders bevorzugt von weniger als 8 ml/2 g auf. Das Quellvolumen kann auch noch niedrigere Werte annehmen, beispielsweise Werte von weniger als 5 ml/2 gOf the Carrier has almost no after the thermal treatment Swelling in water more. The volume of the source corresponds in this case the sediment volume. Even with a longer one Storage in water is no or almost no increase in sediment volume to observe. Preferably, the carrier has a Storage in water for three days a swelling volume of less as 15 ml / 2 g, preferably less than 10 ml / 2 g, particularly preferred less than 8 ml / 2 g. The source volume can be even lower Take values, for example values of less than 5 ml / 2 g

Nach der thermischen Behandlung wird der Träger bevorzugt keiner weiteren Aktivierung mehr unterzogen. Es kann noch durch physikalische Verfahrensschritte, wie Mahlen und Sieben, eine gewünschte Korngröße eingestellt werden. Bevorzugt wird der Träger auf eine mittlere Korngröße D₅₀ im Bereich von 10–200 μm eingestellt. Durch Granulation können auch größere Teilchen hergestellt werden. Die größeren Teilchen können durch eine, ggf. erneute, thermische Behandlung in ihrer Gestalt stabilisiert werden. Geeignet wird dazu der teilchenförmige Träger, insbesondere das Granulat für 2 min bis 5 Stunden auf eine Temperatur im Bereich von 400 bis 750°C erhitzt. Bevorzugt wird jedoch in der Weise vorgegangen, dass das Tonmineral zunächst granuliert bzw. geformt wird und erst dann die thermische Behandlung durchgeführt wird, wobei gleichzeitig eine Stabilisierung des Granulats bzw. Formkörpers erreicht wird.After the thermal treatment, the support preferably no longer under further activation pulled. It can still be adjusted by physical process steps, such as grinding and sieving, a desired grain size. Preferably, the support is adjusted to a mean particle size D ₅₀ in the range of 10-200 microns. Granulation can also produce larger particles. The larger particles can be stabilized in their shape by a, possibly renewed, thermal treatment. Suitably, the particulate carrier, in particular the granules, is heated to a temperature in the range from 400 to 750 ° C. for 2 minutes to 5 hours. Preferably, however, proceeding in such a way that the clay mineral is first granulated or formed and only then the thermal treatment is carried out, at the same time a stabilization of the granules or shaped body is achieved.

Vorzugsweise erfolgt die Granulation des Tonminerals, welche bevorzugt vor der thermischen Behandlung durchgeführt wird, in der Weise, dass das Tonmineral in einem schnell laufenden Mischer vorgelegt wird und dass ein wässriges Bindemittel, wie z. B. Wasser oder Wasserglas, innerhalb eines kurzen Zeitraums in seiner gesamten Menge zugegeben wird. Die Granulierung kann sowohl in einem Batchverfahren als auch in einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden. Für die Granulation im Batchverfahren kann ein sogenannter Eirichmischer und für die kontinuierliche Granulation beispielsweise ein kontinuierlich arbeitender Pflugscharmischer, wie er z. B. von der Firma Lödige angeboten wird, oder ein Ringschichtmischer, wie ein Lödige CB Mischer, verwendet werden.Preferably the granulation of the clay mineral, which preferably takes place before the thermal treatment is carried out in the way that presented the clay mineral in a fast-running mixer and that an aqueous binder, such as. B. water or water glass, within a short period of time in its entirety Amount is added. The granulation can be done both in a batch process as well as in a continuous process become. For granulation in a batch process, a so-called Eirichmischer and for continuous granulation for example, a continuously operating plowshare mixer, as he z. B. offered by the company Lödige, or a ring layer mixer such as a Lödige CB mixer become.

Neben dem beschriebenen Granulierverfahren können auch andere Formgebungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann das trockene pulverförmige thermisch behandelte Tonmineral unter hohem Druck zu Formkörpern gepresst werden, die ggf. nach der Formgebung auch wieder auf die gewünschte Größe zerkleinert werden können. Eine derartige hoch kompaktierende Formgebung kann beispielsweise in einer Tablettierpresse, einer Ringscheibenpresse oder einer Brikettierpresse durchgeführt werden. Es ist aber beispielsweise auch möglich, das trockene pulverförmige thermisch behandelte Tonmineral mit Wasser anzufeuchten und zu einer plastischen Masse zu kneten. Diese plastische Masse kann dann beispielsweise zu einem Strang extrudiert werden, der zu einem Granulat der gewünschten Größe zerkleinert wird. Es ist aber auch möglich, die plastische Masse in kleinere Klumpen zu brechen und diese zunächst zu trocknen. Die getrockneten Klumpen können dann gebrochen werden und das Granulat der gewünschten Größe durch Sieben abgetrennt werden.Next the described granulation can also others Shaping process can be used. For example, that can dry powdered thermally treated clay mineral be pressed under high pressure into shaped bodies, which may be after shaping also shredded again to the desired size can be. Such a highly compacting shape For example, in a tableting press, a ring press or a briquetting press. It is but for example also possible, the dry powdery thermally treated clay mineral with water to moisten and to a to knead plastic mass. This plastic mass can then, for example extruded into a strand resulting in a granulate of the desired Size is crushed. But it is also possible break the plastic mass into smaller lumps and these first to dry. The dried lumps can then be broken and the granules of the desired size be separated by sieving.

Neben dem Träger wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Enzym bereitgestellt, welches auf dem Träger immobilisiert werden soll. Es bestehen an sich keine Beschränkungen bei der Auswahl des Enzyms. Bevorzugte Enzyme wurden bereits genannt. Das Enzym wird bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt. Um das Enzym zu stabilisieren, wird das Enzym bevorzugt in einer gepufferten Lösung bereitgestellt. Der pH-Wert des Puffers wird in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Enzym ausgewählt und liegt vorzugsweise im Bereich von 3 bis 9. Der ideale Bereich für den pH-Wert hängt vom spezifischen Enzym ab. Für Lipasen wird der pH-Wert des Puffers bevorzugt im Bereich von 3 bis 5 gewählt. Allgemein wird der Puffer geeignet in der Weise ausgewählt, dass seine Pufferwirkung bei einem pH-Wert möglichst groß ist, der ungefähr eine Einheit unterhalb des isoelektrischen Punktes des betreffenden Enzyms liegt. Das Enzym weist dann eine positive Gesamtladung auf und kann durch eine ionische Bindung auf dem Träger fixiert werden. Die Konzentration des Puffers wird geeignet im Bereich von 10 bis 300 mmol/l, bevorzugt 50 bis 200 mmol/l eingestellt. Die Konzentration des Enzyms in der Lösung wird bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 mg/ml gewählt. Um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu verhindern, wird die Immobilisierung bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 37°C, insbesondere bevorzugt 4 bis 10°C durchgeführt. Enzym und Träger können in an sich beliebiger Weise in Kontakt gebracht werden. So kann der Träger in einer Lösung des Enzyms suspendiert werden. Es ist aber auch möglich, die Lösung des Enzyms auf den Träger aufzusprühen, während dieser beispielsweise bewegt wird. Die Dauer, welche für die Immobilisierung des Enzyms benötigt wird, hängt vom verwendeten Träger und vom verwendeten Enzym ab. Bevorzugt wird die Reaktionszeit im Bereich von 10 Minuten bis 5 Stunden gewählt.Next the carrier is in the inventive Method provided an enzyme which is on the support to be immobilized. There are no restrictions per se in the selection of the enzyme. Preferred enzymes have already been mentioned. The enzyme is preferably in the form of an aqueous solution provided. To stabilize the enzyme, the enzyme is preferred provided in a buffered solution. The pH of the buffer becomes dependent on the one to be immobilized Enzyme selected and is preferably in the range of 3 to 9. The ideal range for the pH depends from the specific enzyme. For lipases, the pH is the buffer is preferably selected in the range of 3 to 5. Generally the buffer is suitably selected in such a way that its buffer effect at a pH value is as large as possible, which is about one unit below the isoelectric Point of the enzyme in question. The enzyme then has one positive total charge on and can be due to an ionic bond on be fixed to the carrier. The concentration of the buffer is suitable in the range of 10 to 300 mmol / l, preferably 50 to 200 mmol / l set. The concentration of the enzyme in the solution is preferably chosen in the range of 1 to 10 mg / ml. Around To prevent premature deactivation of the enzyme, the Immobilization preferably at a temperature in the range of 0 to 37 ° C, particularly preferably 4 to 10 ° C. Enzyme and carrier can be arbitrary in themselves Be brought into contact. So can the wearer in a solution of the enzyme are suspended. But it is also possible, the solution of the enzyme on the carrier spraying while this is moving, for example becomes. The duration necessary for the immobilization of the enzyme needed depends on the carrier used and the enzyme used. The reaction time is preferred in the Range from 10 minutes to 5 hours.

Abschließend kann das Reaktionsmedium noch vom festen Enzymkomplex abgetrennt werden. Dies kann mit üblichen Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Der feste Enzymkomplex kann dann noch gewaschen werden, um ungebundenes Enzym zu entfernen. Zum Waschen kann beispielsweise der gleiche Puffer verwendet werden, wie er auch bei der Umsetzung von Enzym und Träger verwendet worden ist. Ist nur relativ wenig Lösungsmittel, insbesondere Wasser im festen Enzymkomplex ent halten, beispielsweise weil das Enzym auf den Träger aufgesprüht worden ist, kann das Lösungsmittel auch verdampft werden. Dazu kann beispielsweise auch unter vermindertem Druck das Lösungsmittel abdestilliert werden. Auch hier wird die Temperatur möglichst niedrig gewählt, um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu vermeiden.Finally the reaction medium can still be separated from the solid enzyme complex become. This can be done by conventional methods, for example by filtration or centrifugation. The solid enzyme complex can then washed to remove unbound enzyme. For example, the same buffer can be used for washing as he also used in the implementation of enzyme and carrier has been. Is only relatively little solvent, in particular Keep water in the solid enzyme complex ent, for example because the Enzyme has been sprayed on the carrier can the solvent will also be evaporated. This can for example also be distilled off under reduced pressure, the solvent. Again, the temperature is chosen as low as possible, to avoid premature deactivation of the enzyme.

Um eine Denaturierung des Enzyms zu vermeiden, sowie um einen geeigneten pH-Wert für eine möglichst effiziente Adsorption des Enzyms auf dem Träger bereitzustellen, wird der Träger vor der Aufgabe des Enzyms bevorzugt auf einen pH-Wert von bevorzugt 3,0 bis 7,0 equilibriert. Dazu kann der Träger beispielsweise in einem geeigneten Puffermedium aufgeschlämmt werden.Around To avoid denaturation of the enzyme, as well as to a suitable pH value for the most efficient adsorption of the enzyme on the carrier becomes the carrier before the task of the enzyme preferably to a pH of preferably 3.0 to 7.0 equilibrated. For this purpose, the carrier, for example slurried in a suitable buffer medium.

Bevorzugt wird das Enzym zwar durch nicht-kovalente Bindungen auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert. Es ist jedoch auch möglich, das Enzym über kovalente Bindungen auf der Oberfläche des Trägers zu fixieren. Dazu werden Träger und Enzym mit einem Kopplungsmittel umgesetzt, welches mindestens zwei reaktive Gruppen aufweist, sodass eine der Gruppen mit beispielsweise Hydroxygruppen auf der Oberfläche des Trägers und die andere Gruppe mit einer geeigneten Gruppe am Enzym reagieren kann, wie einer Hydroxy-, einer Amino- oder einer Thiolgruppe. Ein geeignetes Kopplungsmittel ist beispielsweise Cyanurchlorid.Prefers Although the enzyme is formed by non-covalent bonds on the surface immobilized the carrier. However, it is also possible the enzyme via covalent bonds on the surface to fix the carrier. These are carriers and Enzyme reacted with a coupling agent containing at least two reactive Groups, so that one of the groups with, for example, hydroxy groups on the surface of the carrier and the other Group can react with a suitable group on the enzyme, such as a hydroxy, an amino or a thiol group. A suitable one Coupling agent is, for example, cyanuric chloride.

Als Kopplungsmittel besonders geeignet sind funktionalisierte Silane, wie sie üblicherweise zur Fixierung von Enzymen auf anorganischen Trägern verwendet werden. Dabei bindet man zunächst funktionalisierte Alkoxy- oder Chlorsilane auf dem Träger. Als Alkoxygruppen werden beispielsweise Methoxy- oder Ethoxygruppen verwendet. Die Anbindung des funktionalisierten Silans erfolgt beispielsweise über die Ausbildung von Si-O-Si-Bindungen unter Abspaltung von Alkohol oder HCl. Setzt man funktionalisierte Silane ein, die funktionelle Gruppen tragen, welche direkt mit Gruppen am Enzym reagieren können, so kann in einem zweiten Schritt das Enzym direkt an den Träger gebunden werden. Ein typisches Beispiel hierfür sind Epoxysilanverbindungen, wie Epoxyalkyltrialkoxysilane. Hier kann die Epoxygruppe des Silans nach Aufbringen auf den Träger direkt mit freien NH₂-Gruppen des Enzyms reagieren.Particularly suitable as coupling agents are functionalized silanes, as are commonly used for fixing enzymes on inorganic supports. This binds first functionalized alkoxy or chlorosilanes on the support. As alkoxy groups, for example, methoxy or ethoxy groups are used. The attachment of the functionalized silane takes place for example via the formation of Si-O-Si bonds with elimination of alcohol or HCl. If functionalized silanes are used which carry functional groups which can react directly with groups on the enzyme, in a second step the enzyme can be bound directly to the carrier. A typical example of this is epoxysilane compounds, such as epoxyalkyltrialkoxysilanes. Here, the epoxy group of the silane after application to the carrier can react directly with free NH ₂ groups of the enzyme.

In einer zweiten Variante setzt man das funktionalisierte Silan nach dem Aufbringen auf dem Träger zunächst mit einem Aktivierungsagens um. Mit dem Aktivierungsagens werden Gruppen in das auf der Oberfläche des Trägers gebundene Silan eingeführt, welche mit einer Gruppe am Enzym reagieren können, beispielsweise einer Aminogruppe. Erst nachdem das Aktivierungsagens mit einer Gruppe am Silan reagiert hat, kann das Enzym in einem weiteren Reaktionsschritt an eine Gruppe des Aktivierungsagens angebunden werden. Beispielsweise kann der oben beschriebene, durch thermische Behandlung eines Tonminerals erhaltene Träger mit einem Aminoalkoxysilan umgesetzt werden. Das Aminoalkoxysilan reagiert beispielsweise mit einer Hydroxygruppe an der Oberfläche des Trägers. Durch die Fixierung des Aminoalkoxysilans werden auf der Oberfläche des Trägers Aminogruppen bereitgestellt. Diese Aminogruppen können dann mit einem bifunktionellen Aktivierungsagens, beispielsweise einem Dialdehyd oder einem Diisocyanat, umgesetzt werden. Dabei reagiert eine funktionelle Gruppe mit der auf der Oberfläche des Trägers bereitgestellten Aminogruppe und die andere funktionelle Gruppe steht für die Reaktion mit einer Gruppe am Enzym zur Verfügung. Ein geeigneter bifunktioneller Aldehyd ist beispielsweise Glutaraldehyd.In In a second variant, the functionalized silane is replenished the application on the carrier first with a Activation agent order. With the Activation Agent, groups in the silane bound on the surface of the support introduced, which react with a group on the enzyme can, for example, an amino group. Only after the activation agent has reacted with a group on the silane can the enzyme in a further reaction step to a group of Activation agent be tethered. For example, the above described carrier obtained by thermal treatment of a clay mineral be reacted with an aminoalkoxysilane. The aminoalkoxysilane For example, it reacts with a hydroxy group on the surface of the carrier. By fixing the aminoalkoxysilane become on the surface of the carrier amino groups provided. These amino groups can then with a bifunctional activating agent, for example a dialdehyde or a diisocyanate. It reacts a functional Group with the on the surface of the carrier provided amino group and the other functional group is available for reaction with a group on the enzyme. A suitable bifunctional aldehyde is, for example, glutaraldehyde.

Schließlich betrifft die Erfindung noch die Verwendung des oben beschriebenen festen Enzymkomplexes für enzymkatalysierte Reaktionen. Die Reaktionen können an sich unter bekannten Bedingungen und in bekannten Vorrichtungen durchgeführt werden. So können die Reaktionen in Suspension durchgeführt werden, wozu der feste Enzymkomplex in einer, vorzugsweise gepufferten, Lösung des Substrats aufgeschlämmt wird, der noch weitere übliche Komponenten, wie Coenzyme, ATP, usw. zugesetzt sein können. Es ist aber auch möglich, die enzymkatalysierte Reaktion kontinuierlich durchzuführen, indem der feste Enzymkomplex beispielsweise in Form einer Säule gepackt wird, durch welche dann kontinuierlich eine Lösung des Substrat geleitet wird.After all the invention still relates to the use of the above-described solid enzyme complex for enzyme-catalyzed reactions. The reactions can be carried out under known conditions and in known devices. So the reactions can be carried out in suspension which includes the solid enzyme complex in one, preferably buffered, Solution of the substrate is slurried, the still other common components such as coenzymes, ATP, etc. added could be. But it is also possible, the enzyme-catalyzed To carry out the reaction continuously by adding the solid Enzyme complex, for example, packed in the form of a column becomes, through which then a solution of the Substrate is passed.

Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Beispielen sowie unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert. Dabei zeigt:The The invention will be further described by way of example and by reference explained in more detail on the attached figures. Showing:

1: eine Adsorptionsisotherme, die für eine Lipase bei pH 4 in einem 50 mM Acetatpuffer an Bentonit 1₅₀₀ aufgenommen wurde; 1 : An adsorption isotherm, which was recorded for a lipase at pH 4 in a 50 mM acetate buffer of bentonite _1500;

2: eine Adsorptionsisotherme, die für eine Lipase bei pH 4 in einem 50 mM Acetatpuffer an Bentonit 3₅₀₀ aufgenommen wurde; und 2 : An adsorption isotherm, which was recorded for a lipase at pH 4 in a 50 mM acetate buffer of bentonite _3500; and

3: eine Adsorptionsisotherme, die für eine Lipase bei pH 4 in einem 50 mM Acetatpuffer an Saponit 1₆₀₀ aufgenommen wurde. 3 : An adsorption isotherm, which was recorded for a lipase at pH 4 in a 50 mM acetate buffer at saponite _1600.

Es wurden die folgenden Analysenmethoden verwendet:It the following analytical methods were used:

BET-Oberfläche/Porenvolumen nach BJH und BET:BET surface area / pore volume after BJH and BET:

Die Oberfläche und das Porenvolumen wurden mit einem vollautomatischen Stickstoffporosimeter der Firma Mikromeritics, Typ ASAP 2010 bestimmt.The Surface and pore volume were combined with a fully automatic Nitrogen porosimeter from the company Mikromeritics, type ASAP 2010 determined.

Die Probe wird im Hochvakuum auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff abgekühlt. Anschließend wird kontinuierlich Stickstoff in die Probenkammer dosiert. Durch die Erfassung der adsorbierten Gasmenge als Funktion des Druckes wird bei konstanter Temperatur eine Adsorptionsisotherme ermittelt. Nach einem Druckausgleich wird das Analysengas schrittweise entfernt und eine Desorptionsisotherme aufgenommen.The Sample is heated to the temperature of liquid under high vacuum Nitrogen cooled. Subsequently, it becomes continuous Nitrogen dosed into the sample chamber. By capturing the adsorbed amount of gas as a function of pressure is at constant temperature determined an adsorption isotherm. After a pressure equalization is the analysis gas is gradually removed and a desorption isotherm added.

Zur Ermittlung der spezifischen Oberfläche und der Porosität nach der BET-Theorie werden die Daten gemäß DIN 66131 ausgewertet.To determine the specific surface area and the porosity according to the BET theory, the data according to DIN 66131 evaluated.

Das Porenvolumen wird ferner aus den Messdaten unter Anwendung der BJH-Methode ermittelt ( E. P. Barret, L. G. Joiner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951, 373) . Bei diesem Verfahren werden auch Effekte der Kapillarkondensation berücksichtigt. Porenvolumina bestimmter Porengrößenbereiche werden durch Aufsummieren inkrementeller Porenvolumina bestimmt, die aus der Auswertung der Adsorptionsisotherme nach BJH erhalten werden. Das Gesamtporenvolumen nach der BJH-Methode bezieht sich auf Poren mit einem Durchmesser von 1,7 bis 300 nm.The pore volume is also determined from the measurement data using the BJH method ( EP Barret, LG Joiner, PP Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951, 373) , This procedure also takes into account effects of capillary condensation. Pore volumes of certain pore size ranges are determined by summing up incremental pore volumes, which are obtained from the evaluation of the adsorption isotherm according to BJH. The total pore volume according to the BJH method refers to pores with a diameter of 1.7 to 300 nm.

Teilchengrößenbestimmung mittels dynamischer Lichtstreuung (Malvern)Particle Size Determination by means of dynamic light scattering (Malvern)

Die Messungen werden mit einem Gerät "Mastersizer" der Firma Malvern Instruments Ltd., UK, entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Messungen werden mit der vorgesehenen Probenkammer ("dry powder feeder") in Luft durchgeführt und die auf das Probenvolumen bezogenen Werte ermittelt.The Measurements are made with a device "Mastersizer" of the company Malvern Instruments Ltd., UK, according to the manufacturer's instructions carried out. The measurements are provided with the Sample chamber ("dry powder feeder") performed in air and determines the values related to the sample volume.

Wassergehalt:Water content:

Der Wassergehalt der Produkte bei 105°C wird unter Verwendung der Methode DIN/ISO-787/2 ermittelt.The water content of the products at 105 ° C is determined using the method DIN / ISO 787/2 determined.

Elementaranalyse:Elemental analysis:

Diese Analyse beruht auf dem Totalaufschluss der Tonmaterialien bzw. des entsprechenden Produktes. Nach dem Auflösen der Fest stoffe werden die Einzelkomponenten mit herkömmlichen spezifischen Analysemethoden, wie z. B. ICP analysiert und quantifiziert.These Analysis is based on the total digestion of the clay materials or the appropriate product. After dissolving the solids The individual components are made with conventional specific ones Analysis methods, such. For example, ICP is analyzed and quantified.

Ionenaustauschkapazität:Ion exchange capacity:

Zur Bestimmung der Kationenaustauschkapazität wird das zu untersuchende Tonmaterial über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 105°C getrocknet. Danach wird das getrocknete Tonmaterial mit einem Überschuss an wässriger 2N NH₄Cl-Lösung 1 Stunde unter Rückfluss zur Reaktion gebracht. Nach einer Standzeit von 16 Stunden bei Raumtemperatur wird filtriert, worauf der Filterkuchen gewaschen, getrocknet und vermahlen wird und der NH₄-Gehalt im Tonmaterial durch Stickstoffbestimmung (CHN-Analysator "Vario EL III" der Firma Elementar in Hanau) nach den Herstellerangaben ermittelt. Der Anteil und die Art der ausgetauschten Metallionen wird im Filtrat durch ICP-Spektroskopie bestimmt.To determine the cation exchange capacity, the clay material to be examined is dried at 105 ° C. over a period of 2 hours. Thereafter, the dried clay material is reacted with an excess of aqueous 2N NH ₄ Cl solution for 1 hour under reflux. After a service life of 16 hours at room temperature is filtered, whereupon the filter cake is washed, dried and ground and determined the NH ₄ content in the clay by nitrogen determination (CHN analyzer "Vario EL III" from Elementar in Hanau) according to the manufacturer. The proportion and type of exchanged metal ions is determined in the filtrate by ICP spectroscopy.

Bestimmung des Sedimentvolumens:Determination of sediment volume:

Ein graduierter 100 ml Messzylinder wird mit 100 ml destilliertem Wasser gefüllt. 2 g der zu vermessenden Substanz werden langsam und portionsweise, je etwa 0,1 bis 0,2 g, mit einem Spatel auf die Oberfläche des Wassers gegeben. Nach dem Absinken einer zugegebenen Portion wird die nächste Portion zugegeben. Nachdem die 2 g Substanz zugegeben und auf den Grund des Messzylinders abgesunken sind, wird der Zylinder für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird an der Graduierung des Messzylinders die Höhe des Sedimentsvolumens in ml/2g abgelesen. Für die Bestimmung des Sedimentvolumens nach 3-tägiger Lagerung in Wasser wird der Probenansatz mit Parafilm^® verschlossen und für 3 Tage bei Raumtemperatur erschütterungsfrei stehen gelassen. Danach wird an der Graduierung des Messzylinders das Sedimentvolumen abgelesen.A graduated 100 ml graduated cylinder is filled with 100 ml of distilled water. 2 g of the substance to be measured are added slowly and in portions, each about 0.1 to 0.2 g, with a spatula on the surface of the water. After a drop of added portion, the next portion is added. After the 2 g of substance have been added and dropped to the bottom of the measuring cylinder, the cylinder is allowed to stand for one hour at room temperature. Then the height of the sediment volume in ml / 2g is read off the graduation of the measuring cylinder. To determine the sediment volume after storage in water for 3 days, the sample ^{batch is} sealed with Parafilm® and allowed to stand vibration-free for 3 days at room temperature. Then the sediment volume is read off the graduation of the measuring cylinder.

Bestimmung des Montmorillonitgehalts über die MethylenblauadsorptionDetermination of montmorillonite content via the methylene blue adsorption

Der Methylenblauwert ist ein Maß für die innere Oberfläche der Tonmaterialien.

a) Herstellung einer Tetranatriumdiphosphat-Lösung 5,41 g Tetranatriumdiphosphat werden auf 0,001 g genau in einen 1000 ml Messkolben eingewogen und unter Schütteln bis zur Eichmarke mit dest. Wasser aufgefüllt.
b) Herstellung einer 0,5 %-igen Methylenblaulösung In einem 2000 ml Becherglas werden 125 g Methylenblau in ca. 1500 ml dest. Wasser gelöst. Die Lösung wird abdekantiert und auf 25 1 mit dest. Wasser aufgefüllt. 0,5 g feuchter Testbentonit mit bekannter innerer Oberfläche werden in einem Erlenmeyerkolben auf 0,001 g genau eingewogen. Es werden 50 ml Tetranatriumdiphosphatlösung zugegeben und die Mischung 5 Minuten zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 10 ml 0,5 molare H₂SO₄ zugegeben und 80 bis 95% des zu erwartenden Endverbrauchs an Methylenblaulösung zugegeben. Mit dem Glasstab wird ein Tropfen der Suspension aufgenommen und auf ein Filterpapier gegeben. Es bildet sich ein blau-schwarzer Fleck mit einem farblosen Hof. Es wird nun in Portionen von 1 ml weitere Methylenblaulösung zugegeben und die Tüpfelprobe wiederholt. Die Zugabe erfolgt solange, bis sich der Hof leicht hellblau färbt, also die zugegebene Methylenblaumenge nicht mehr vom Testbentonit absorbiert wird.
c) Prüfung von Tonmaterialien Die Prüfung des Tonmaterials wird in der gleichen Weise durchgeführt wie für den Testbentonit. Aus der verbrauchten Menge an Methylenblaulösung lässt sich die innere Oberfläche des Tonmaterials berechnen. 381 mg Methylenblau/g Ton entsprechen nach diesem Verfahren einem Gehalt von 100 Montmorillonit.

The methylene blue value is a measure of the inner surface of the clay materials.

a) Preparation of a tetrasodium diphosphate solution 5.41 g tetrasodium diphosphate are weighed to 0.001 g exactly in a 1000 ml volumetric flask and with shaking to the calibration mark with dist. Water filled up.
b) Preparation of a 0.5% Methylene Blue Solution In a 2000 ml beaker, 125 g of methylene blue are distilled in about 1500 ml. Water dissolved. The solution is decanted off and distilled to 25 l with dist. Water filled up. 0.5 g of wet test bentonite with a known internal surface are weighed to the nearest 0.001 g in an Erlenmeyer flask. Add 50 ml of tetrasodium diphosphate solution and heat the mixture to boiling for 5 minutes. After cooling to room temperature, 10 ml of 0.5 molar H ₂ SO _{4 are} added and 80 to 95% of the expected final consumption of methylene blue solution is added. With the glass rod, a drop of the suspension is taken and placed on a filter paper. It forms a blue-black spot with a colorless yard. It is then added in portions of 1 ml more Methylenblaulösung and repeated the dot sample. The addition takes place until the yard turns slightly light blue, so that the added Methylenblaumenge is no longer absorbed by the test bentonite.
c) Testing of clay materials Testing of the clay material is carried out in the same way as for the test bentonite. From the used amount of methylene blue solution, the inner surface of the clay material can be calculated. 381 mg methylene blue / g clay correspond to a content of 100 montmorillonite according to this method.

Bestimmung des TrockensiebrückstandesDetermination of dry residue

Etwa 50 g des zu untersuchenden lufttrockenen Tonmaterials werden auf einem Sieb der entsprechenden Maschenweite eingewogen. Das Sieb wird an einen Staubsauger angeschlossen, der über ein unter dem Siebboden kreisenden Saugschlitz alle Anteile, die feiner als das Sieb sind, durch das Sieb heraussaugt. Das Sieb wird mit einem Plastikdeckel abgedeckt und der Staubsauger eingeschaltet. Nach 5 Minuten wird der Staubsauger abgeschaltet und die Menge der auf dem Sieb verbliebenen gröberen Anteile durch Differenzwägung ermittelt.Approximately 50 g of the examined air-dry clay material on weighing a sieve of the appropriate mesh size. The sieve is connected to a vacuum cleaner, which has an under the sieve bottom circular suction slot all shares, the finer than the strainer are sucked out through the strainer. The sieve comes with a Covered plastic lid and turned on the vacuum cleaner. To 5 minutes, the vacuum cleaner is turned off and the amount of up the coarser portions remaining by sieving by differential weighing determined.

Bestimmung des NasssiebrückstandesDetermination of wet sieve residue

Es wird zunächst eine 5 %-ige Suspension hergestellt, indem eine entsprechende Menge des zu untersuchenden Tonmaterials bei ca. 930 UpM ca. 5 Minuten in Wasser eingerührt wird. Die Suspension wird für weitere 15 Minuten bei ca. 1865 UpM gerührt und die Suspension dann durch ein Sieb der gewünschten Maschenweite gegossen. Der Rückstand wird so lange mit Leitungswasser gewaschen, bis das Waschwasser klar abläuft. Das Sieb mit dem Rückstand wird dann für 5 Minuten in ein Ultraschallbad gesetzt, um restliche Feinanteile zu entfernen. Der verbliebene Rückstand wird kurz mit Leitungswasser gewaschen und die Ultraschallbehandlung ggf. wiederholt, bis während der Ultraschallbehandlung keine Feinstoffe mehr in das Wasser übertreten. Das Sieb wird dann bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Zum Auswiegen wird der auf dem Sieb verbliebene Rückstand in eine gewogene Porzellanschale überführt.It First, a 5% suspension is prepared by an appropriate amount of the clay material to be examined about 930 rpm is stirred for about 5 minutes in water. The Suspension is for about 15 minutes at about 1865 rpm stirred and then the suspension through a sieve of the desired Mesh size cast. The residue is with so long Washed tap water until the wash water runs clear. The sieve with the residue is then left for 5 minutes placed in an ultrasonic bath to remove residual fines. The remaining residue is briefly with tap water washed and if necessary the sonication repeated until while the ultrasound treatment no more fines pass into the water. The sieve is then dried to constant weight. For weighing the residue remaining on the sieve is weighed Porcelain bowl transferred.

Bestimmung des pH-Wertes einer BentonitprobeDetermination of the pH of a bentonite

2 g der Probe werden in 98 ml destilliertem Wasser dispergiert. Danach wird mit einer kalibrierten Glaselektrode der pH-Wert bestimmt.2 g of the sample are dispersed in 98 ml of distilled water. After that The pH is determined with a calibrated glass electrode.

Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Lowry-MethodeDetermination of protein concentration according to the Lowry method

Die Proteinquantifizierung nach dem modifizierten Lowry-Protokoll beruht auf der Reaktion von Proteinen mit Kupfersulfat und Kupfertartrat in alkalischer Lösung, welche zur Bildung eines vierzähnigen Kupfer-Protein-Komplexes führt.The Protein quantification is based on the modified Lowry protocol on the reaction of proteins with copper sulfate and copper tartrate in alkaline solution, resulting in the formation of a tetradentate Copper-protein complex leads.

Im nächsten Schritt erfolgt eine Reduktion durch Zusatz des Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz (Enthält Phosphomolybdat-Phosphowolframsäure), wobei eine intensive Blaufärbung auftritt. Die Konzentration des entstehenden Reaktionsproduktes wird bei 750 nm photometrisch bestimmt.in the next step is a reduction by adding the Folin-Ciocalteau phenol reagent (contains phosphomolybdate-phosphotungstic acid), wherein an intense blue coloration occurs. The concentration of resulting reaction product is determined photometrically at 750 nm.

Durchführung:Execution:

Die Bestimmung wurde mit Reagenzien durchgeführt, die von der Firma Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE gebrauchsfertig bezogen wurden.The Determination was carried out with reagents used by the Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE ready to use were.

100 μl der Protein/Enzymlösung werden in eine Kavität einer 96-Loch-Platte pipettiert. 100 μl Lowry-Reagenz wird zupipettiert und die Mischung homogenisiert. Nach 20 Minuten werden 50 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz zugegeben und die Mischung erneut homogenisiert. 30 Minuten nach Zugabe des Folin-Ciocalteu-Reagenzes wird die Extinktion gegen einen Blindwert bei 750 nm im Plattenphotometer gemessen.100 μl the protein / enzyme solution will be in a cavity a 96-well plate pipetted. 100 μl of Lowry's reagent pipetted and the mixture homogenized. After 20 minutes will be Add 50 μl Folin-Ciocalteu reagent and mix Homogenized again. 30 minutes after the addition of the Folin Ciocalteu reagent the absorbance against a blank at 750 nm in the plate photometer measured.

Bestimmung der Proteinkonzentration nach der BCA-MethodeDetermination of protein concentration according to the BCA method

Bei der BCA-Methode dient Bicinchoninsäure (BCA) als Detektionssystem. Dabei kommt es zunächst zur Komplexbildung von Protein mit Cu²⁺-Ionen in alkalischer Lösung. Die Cu²⁺-Ionen des Komplexes werden zu Cu⁺-Ionen reduziert, welche durch Komplexbildung mit BCA durch Absorptionsmessung bei 562 nm detektiert werden können.Bicinchoninic acid (BCA) serves as a detection system in the BCA method. First of all, the complex formation of protein with Cu ²⁺ ions in alkaline solution occurs. The Cu ²⁺ ions of the complex are reduced to Cu ⁺ ions, which can be detected by complex formation with BCA by absorption measurement at 562 nm.

Durchführung:Execution:

Die Bestimmung wurde mit Arbeitsreagenzien durchgeführt, die von der Firma Pierce, Illinois, US, gebrauchsfertig bezogen wurden.The Determination was carried out with working reagents, which from Pierce, Illinois, US.

25 μl der Enzym/Protein-Lösung werden in eine Kavität einer 96-Loch-Platte pipettiert. 200 μl Arbeitsreagenz wird dazu pipettiert und die Mischung homogenisiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Extinktion bei 550 nm im Plattenphotometer gemessen. Standardkurve für beide Proteinbestimmungen: Standard 1 0,125 mg/ml Standard 2 0,25 mg/ml Standard 3 0,5 mg/ml Standard 4 1,0 mg/ml Standard 5 1,5 mg/ml Standard 6 2,0 mg/ml Blindwert nur Puffer 25 μl of the enzyme / protein solution are pipetted into a well of a 96-well plate. 200 μl of working reagent are pipetted in and the mixture is homogenized. After 30 minutes incubation at 37 ° C, the absorbance at 550 nm in the plate photometer is measured. Standard curve for both protein determinations: Standard 1 0.125 mg / ml Standard 2 0.25 mg / ml Standard 3 0.5 mg / ml Standard 4 1.0 mg / ml Standard 5 1.5 mg / ml Standard 6 2.0 mg / ml blank value only buffers

Beispiel 1: Hitzebehandlung von BentonitenExample 1: Heat treatment of bentonites

Für die Hitzebehandlung wurden zwei unterschiedliche Bentonite verwendet. Bentonit 1 ist ein natürlicher Calcium/Natriumbentonit. Bentonit 2 wurde durch Vermengen von Bentonit 1 mit 4,3 Gew.-% Soda, anschließendem Verkneten, Trocknen und Mahlen hergestellt. Die Bentonite wiesen einen Trockensiebrückstand von < 15 Gew.-% auf einem Sieb der Maschenweite 45 μm und einen Rückstand von < 7 Gew.-% auf einem Sieb der Maschenweite 75 μm. Die Eigenschaften der als Ausgangsmaterialien verwendeten Bentonite 1 und 2 sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Eigenschaften der als Ausgangsmaterialien verwendeten Bentonite 1 und 2 Bentonit 1 Bentonit 2 Montmorillonitgehalt, bestimmt nach der Methylenblaumethode [%] 75 78 Kationenaustauschkapazität [meq/100 g] 76 72 Quellvolumen in destilliertem Wasser [ml/2 g) 11 > 15 Two different bentonites were used for the heat treatment. Bentonite 1 is a natural calcium / sodium bentonite. Bentonite 2 was prepared by blending bentonite 1 with 4.3% by weight of soda, then kneading, drying and milling. The bentonites had a dry sieve residue of <15% by weight on a sieve of mesh size 45 μm and a residue of <7% by weight on a sieve of mesh size 75 μm. The properties of the bentonites 1 and 2 used as starting materials are shown in Table 1. Table 1: Properties of bentonites 1 and 2 used as starting materials Bentonite 1 Bentonite 2 Montmorillonite content, determined by the methylene blue method [%] 75 78 Cation exchange capacity [meq / 100 g] 76 72 Swelling volume in distilled water [ml / 2 g] 11 > 15

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Bentonite 1 und 2 wurden in einem Ofen für jeweils 1 Stunde auf die in Tabelle 2 angegebenen Temperaturen erhitzt. Die hitzebehandelten Bentonite 1 und 2 wurden aus dem Ofen herausgenommen und unter Luftzutritt auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurde für die hitzebehandelten Bentonite jeweils das Quellvolumen bestimmt. Die gefundenen Werte sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Quellvolumina von thermisch behandelten und unbehandelten Bentoniten 1 und 2 Behandlungstemperatur Bentonit 1 Quellvolumen [ml/2 g] Bentonit 2 Quellvolumen [ml/2 g] Keine Behandlung 11,0 17,0 300°C 12,0 16,5 400°C 9,5 10,5 500°C 4,0 3,0 The bentonites 1 and 2 used as starting material were heated in an oven for 1 hour each to the temperatures indicated in Table 2. The heat-treated bentonites 1 and 2 were taken out of the oven and cooled to room temperature while in the air. Thereafter, the swelling volume was determined for each of the heat-treated bentonites. The values found are summarized in Table 2. Table 2: Swelling volumes of thermally treated and untreated bentonites 1 and 2 treatment temperature Bentonite 1 swelling volume [ml / 2 g] Bentonite 2 swelling volume [ml / 2 g] No treatment 11.0 17.0 300 ° C 12.0 16.5 400 ° C 9.5 10.5 500 ° C 4.0 3.0

Durch die thermische Behandlung wird mit zunehmender Temperatur das Quellvermögen der Bentonite reduziert. Bei 500°C entspricht das Quellvolumen der Schüttdichte des Bentonits in Wasser, also dem Sedimentvolumen. Bringt man Bentonite, welche bei diesen hohen Temperaturen behandelt wurden, in wässrige oder andere Flüssigkeiten ein, so zeigt sich auch bei langem Lagern kein Aufquellen der Bentonite mehr. Die typische Gelbildung des Bentonits kann nicht beobachtet werden. Die Partikel sinken schnell auf den Boden der Gefäße ab.By the thermal treatment becomes the swelling capacity with increasing temperature the bentonite is reduced. At 500 ° C corresponds to the swelling volume the bulk density of the bentonite in water, ie the sediment volume. Bring bentonite, which is treated at these high temperatures were, in watery or other liquids A, so shows no swelling of the bentonite even with long storage more. The typical gelation of bentonite can not be observed become. The particles quickly sink to the bottom of the vessels from.

In Tabellen 3a, b sind die Eigenschaften eines unbehandelten Bentonits 1 einem bei 500°C thermisch behandelten Bentonit 1500 gegenübergestellt. Tabelle 3a: Physikalische Eigenschaften des thermisch behandelten und unbehandelten Bentonits 1 Bentonit 1 Bentonit 1₅₀₀ BET-Oberfläche [m²/g] 80 74,5 Mikroporenoberfläche (BJH) [m²/g] 18 14 Externe Oberfläche (BJH) [m²/g] 61 61 Kumulatives Porenvolumen nach der BJH-Methode für Poren mit Durchmessern von 1,7 bis 300 nm, [cm³/g] 0,19 0,19 Durchschnitt sporendurchmesser [4V/A] nach BET 8.9 9,3 Durchschnittsporendurchmesser [4V/A] nach BJH 11,1 11,5 Tabelle 3b: Siebrückstände des thermisch unbehandelten und behandelten Bentonits 1 Bentonit 1 1₅₀₀ Trockensiebrückstand auf 45 μm (Gew.-%) 13,2 12,5 Nasssiebrückstand auf: 45 μm (Gew.-%) 14,7 15,2 25 μm (Gew.-%) 21,2 29 In Tables 3a, b the properties of an untreated bentonite 1 are compared with a bentonite 1500 thermally treated at 500 ° C. Table 3a: Physical properties of the thermally treated and untreated bentonite 1 Bentonite 1 Bentonite 1 ₅₀₀ BET surface area [m ² / g] 80 74.5 Microporous surface (BJH) [m ² / g] 18 14 External surface (BJH) [m ² / g] 61 61 Cumulative pore volume according to the BJH method for pores with diameters of 1.7 to 300 nm, [cm ³ / g] 0.19 0.19 Average spore diameter [4V / A] according to BET 8.9 9.3 Average pore diameter [4V / A] according to BJH 11.1 11.5 Table 3b: Sieve residues of the thermally untreated and treated bentonite 1 bentonite 1 1 ₅₀₀ Dry sieve residue to 45 μm (wt.%) 13.2 12.5 Wet sieve residue on: 45 μm (wt.%) 14.7 15.2 25 μm (wt.%) 21.2 29

Ferner wurde die Kationenaustauschkapazität der thermisch behandelten und unbehandelten Bentonite 1 und 2 bestimmt. Die entsprechenden Werte sind in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4: Kationenaustauschkapazität von thermisch behandelten (500°C) und unbehandelten Bentoniten 1 und 2 Gesamt-Kationenaustausch-kapazität in meq/100 g Anteil der einwertigen Ionen in % der GesamtKationenaustauschkapazität Bentonit 1 70 20 Bentonit 1₅₀₀ 65 20 Bentonit 2 75 100 Bentonit 2₅₀₀ 75 100 Further, the cation exchange capacity of the thermally treated and untreated bentonites 1 and 2 was determined. The corresponding values are given in Table 4. Table 4: Cation exchange capacity of thermally treated (500 ° C) and untreated bentonites 1 and 2 Total cation exchange capacity in meq / 100 g Proportion of monovalent ions in% of total cation exchange capacity Bentonite 1 70 20 Bentonite 1 ₅₀₀ 65 20 Bentonite 2 75 100 Bentonite 2 ₅₀₀ 75 100

Beispiel 2: Untersuchung von weiteren BentonitenExample 2: Study of others bentonites

Analog Beispiel 1 wurden ein Bentonit 3 sowie ein Bentonit 4 für 1 Stunde bei 500°C thermisch behandelt. Bentonit 4 wird aus Bentonit 3 durch eine stöchiometrische Aktivierung mit Soda erhalten. Bentonit 3 ist ein natürlicher Ca/Na-Bentonit. Die Eigenschaften der als Ausgangsmaterial verwendeten Bentonite 3 und 4 sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die Quellvolumina für die thermisch unbehandelten und die bei verschiedenen Temperaturen behandelten Bentonite 3 und 4 sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 5: Eigenschaften der als Ausgangsmaterial verwendeten Bentonite 3 und 4 Bentonit 3 Bentonit 4 Montmorillonitgehalt, bestimmt nach der Methylenblaumethode [%] 100 100 Kationenaustauschkapazität [meq/100 g] 105 105 Quellvolumen in destilliertem Wasser [ml/2 g) 12–18 > 30 Trockensiebrückstand auf 45 μm (Gew.-%) 11 15 Nasssiebrückstand auf: 45 μm (Gew.-%) 0,9 1,5 25 μm (Gew.-%) 7,3 2,5 Tabelle 6: Quellvolumina von thermisch behandelten und unbehandelten Bentoniten 3 und 4 Behandlungstemperatur Bentonit 3 Quellvolumen [ml/2 g] Bentonit 4 Quellvolumen [ml/2 g] Keine Behandlung 14,0 39,0 400°C 12,0 17,0 500°C 8,0 8,0 600°C 5,0 6,0 Analogously to Example 1, a bentonite 3 and a bentonite 4 were thermally treated at 500 ° C for 1 hour. Bentonite 4 is obtained from bentonite 3 by stoichiometric activation with soda. Bentonite 3 is a natural Ca / Na bentonite. The properties of the starting bentonites 3 and 4 are summarized in Table 5. The swelling volumes for the thermally untreated and the different temperatures treated bentonites 3 and 4 are summarized in Table 6. Table 5: Properties of Bentonites 3 and 4 used as starting material Bentonite 3 Bentonite 4 Montmorillonite content, determined by the methylene blue method [%] 100 100 Cation exchange capacity [meq / 100 g] 105 105 Swelling volume in distilled water [ml / 2 g] 12-18 > 30 Dry sieve residue to 45 μm (wt.%) 11 15 Wet sieve residue on: 45 μm (wt.%) 0.9 1.5 25 μm (wt.%) 7.3 2.5 Table 6: Swelling volumes of thermally treated and untreated bentonites 3 and 4 treatment temperature Bentonite 3 swelling volume [ml / 2 g] Bentonite 4 swelling volume [ml / 2 g] No treatment 14.0 39.0 400 ° C 12.0 17.0 500 ° C 8.0 8.0 600 ° C 5.0 6.0

Die physikalischen Daten für den thermisch unbehandelten sowie den bei 500°C bzw. 600°C behandelten Bentonit 3 sind in Tabelle 7, die physikalischen Daten für den thermisch unbehandelten sowie den bei 500°C behandelten Bentonit 4 sind in Tabelle 8 wiedergegeben. Tabelle 7: Physikalische Eigenschaften des thermisch behandelten und unbehandelten Bentonits 3 Bentonit 3 Bentonit 3₅₀₀ Bentonit 3₆₀₀ BET-Oberfläche [m²/g] 80 74,5 46,6 Mikroporenoberfläche (BJH) [m²/g] 31 14 12 Externe Oberfläche (BJH) [m²/g] 49 61 35 Kumulatives Porenvolumen nach der BJH-Methode für Poren mit Durchmessern von 1,7 bis 300 nm, [cm³/g] 0,14 0,19 0,1 Durchschnittsporendurchmesser [4V/A] nach BET 7 9,3 8,1 Durchschnittsporendurchmesser [4V/A] nach BJH 10,3 11,5 10,7 Gesamtkationenaustauschkapazität [meq/100 g] 105 74 30 Anteil der einwertigen Ionen an der Gesamtkationenaustauschkapazität [%] 38 37 65 Tabelle 8: Physikalische Eigenschaften des thermisch behandelten und unbehandelten Bentonits 4 Bentonit 4 Bentonit 4₅₀₀ BET-Oberfläche [m²/g] 24 19,5 Mikroporenoberfläche (BJH) [m²/g] 0 3,0 Externe Oberfläche (BJH) [m²/g] 8,1 16,5 Kumulatives Porenvolumen nach der BJH-Methode für Poren mit Durchmessern von 1,7 bis 300 nm, [cm³/g] 0,04 0,062 Durchschnittsporendurchmesser [4V/A] nach BET [nm] 18,7 11,9 Durchschnittsporendurchmesser [4V/A] nach BJH [nm] 13,0 14,0 Gesamtkationenaustauschkapazität [meq/100 g] 93 93 Anteil der einwertigen Ionen an der Gesamtkationenaustauschkapazität [%] 100 100 The physical data for the thermally untreated and treated at 500 ° C and 600 ° C bentonite 3 are in Table 7, the physical data for the thermally untreated and treated at 500 ° C bentonite 4 are shown in Table 8. Table 7: Physical properties of the thermally treated and untreated bentonite 3 Bentonite 3 Bentonite 3 ₅₀₀ Bentonite 3 ₆₀₀ BET surface area [m ² / g] 80 74.5 46.6 Microporous surface (BJH) [m ² / g] 31 14 12 External surface (BJH) [m ² / g] 49 61 35 Cumulative pore volume according to the BJH method for pores with diameters of 1.7 to 300 nm, [cm ³ / g] 0.14 0.19 0.1 Average pore diameter [4V / A] according to BET 7 9.3 8.1 Average pore diameter [4V / A] according to BJH 10.3 11.5 10.7 Total cation exchange capacity [meq / 100 g] 105 74 30 Proportion of monovalent ions in total cation exchange capacity [%] 38 37 65 Table 8: Physical properties of the thermally treated and untreated bentonite 4 Bentonite 4 Bentonite 4 ₅₀₀ BET surface area [m ² / g] 24 19.5 Microporous surface (BJH) [m ² / g] 0 3.0 External surface (BJH) [m ² / g] 8.1 16.5 Cumulative pore volume according to the BJH method for pores with diameters of 1.7 to 300 nm, [cm ³ / g] 0.04 0.062 Average pore diameter [4V / A] to BET [nm] 18.7 11.9 Average pore diameter [4V / A] according to BJH [nm] 13.0 14.0 Total cation exchange capacity [meq / 100 g] 93 93 Proportion of monovalent ions in total cation exchange capacity [%] 100 100

Die für die Bentonite 3 und 4 ermittelten Daten zeigen, wie schon bei den Bentoniten 1 und 2 beobachtet, dass die Temperatur der Hitzebehandlung in einem Bereich von etwa 500°C zu einer nahezu vollständigen Unterdrückung des Quellens in Wasser führt. Der durch einen Austausch mit Natriumionen aktivierte Bentonit 4 zeigt im Vergleich zum natürlichen Na/Ca-Bentonit 3 nach der Temperaturbehandlung eine wesentlich niedrigere BET-Oberfläche. Ein analoges Verhalten zeigt sich bei den Daten zum kumulierten Porenvolumen.The for the bentonites 3 and 4 data show how already at the bentonites 1 and 2 observed that the temperature the heat treatment in a range of about 500 ° C. an almost complete suppression of swelling in water. The one by exchange with sodium ions activated bentonite 4 shows in comparison to natural Na / Ca bentonite 3 after the temperature treatment a much lower BET surface area. An analogous behavior is shown by the Data on the cumulated pore volume.

Beispiel 3: Untersuchungen von SaponitmineralienExample 3: Studies of Saponite Minerals

Es wurde ein Saponit verwendet, der analog zu den Beispielen 1 und 2 thermisch behandelt wurde. Die Eigenschaften des als Ausgangsmaterials verwendeten Saponits 1 sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Tabelle 9: Eigenschaften des als Ausgangsmaterial verwendeten Saponits 1 BET-Oberfläche [m²/g] 125,3 Gesamtkationenaustauschkapazität [meq/100 g] 46 Begleitminerale 2–3% Quarz 2–3% Feldspat 0,5–1% Calcit Silikatanalyse [Gew.-%] Al₂O₃ 6,6 Fe₂O₃ 1,9 CaO 1,1 MgO 26,0 Na₂O 0,32 K₂O 1,4 TiO₂ 0,25 SiO₂ 52,0 Verhältnis SiO₂/MgO 2,00 Glühverlust 9,5 A saponite was used which was thermally treated analogously to Examples 1 and 2. The properties of the saponite 1 used as starting material are summarized in Table 9. Table 9: Properties of the saponite used as starting material 1 BET surface area [m ² / g] 125.3 Total cation exchange capacity [meq / 100 g] 46 Begleitminerale 2-3% quartz 2-3% feldspar 0.5-1% calcite Silicate analysis [% by weight] Al ₂ O ₃ 6.6 Fe ₂ O ₃ 1.9 CaO 1.1 MgO 26.0 Na ₂ O 0.32 K ₂ O 1.4 TiO ₂ 0.25 SiO ₂ 52.0 Ratio SiO ₂ / MgO 2.00 loss on ignition 9.5

Der in Tabelle 9 charakterisierte Saponit wurde analog Beispiel 1 und 2 einer Temperaturbehandlung bei 500°C (Saponit 1₅₀₀) sowie bei 600°C (Saponit 1₆₀₀) unterzogen. Die physikalischen Eigenschaften des thermisch unbehandelten und thermisch behandelten Saponits sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Tabelle 10: Physikalische Eigenschaften des thermisch behandelten und unbehandelten Saponits 1 Saponit 1 Saponit ¹500 Saponit 1₆₀₀ Gesamtkationenaustauschkapazität [meq/100 g] 49 23 21 Anteil der einwertigen Ionen an der Gesamtkationenaustauschkapazität [%] 16 47 52 BET-Oberfläche [m²/g] 127 120 106 Quellvolumen [ml/2 g] 14,5 5 5 The saponite characterized in Table 9 was subjected, as in Examples 1 and 2, to a temperature treatment at 500 ° C. (saponite 1 ₅₀₀ ) and at 600 ° C. (saponite 1 ₆₀₀ ). The physical properties of the thermally untreated and thermally treated saponite are shown in Table 10. Table 10: Physical properties of the thermally treated and untreated saponite 1 Saponite 1 Saponite ¹ 500 Saponite 1 ₆₀₀ Total cation exchange capacity [meq / 100 g] 49 23 21 Proportion of monovalent ions in total cation exchange capacity [%] 16 47 52 BET surface area [m ² / g] 127 120 106 Swelling volume [ml / 2 g] 14.5 5 5

Beispiel 4: Granulation des TrägermaterialsExample 4: Granulation of the carrier material

In einem Eirich Intensivmischer R02E (Firma Eirich, Hartheim, DE) wurden jeweils 1500 g des Tonminerals vorgelegt und über einen Trichter 400 ml Wasser als Agglomerationsmittel zudosiert.In an Eirich Intensive Mixer R02E (Eirich, Hartheim, DE) submitted in each case 1500 g of the clay mineral and a Funnel 400 ml of water added as an agglomerating agent.

Dabei wurde die niedrige Einstellung für die Umdrehungsgeschwindigkeit des Tellers sowie die maximale Umdrehungsgeschwindigkeit für den Wirbler gewählt. Die nassen Granulate wurden zunächst bei 70°C getrocknet und dann während einer Stunde einer thermischen Behandlung bei der angegebenen Temperatur unterworfen. Die Granulate wurden dann in einem Größenbereich von 0,1 bis 1,5 mm abgesiebt. Die physikalischen Eigenschaften der Granulate sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Tabelle 11: physikalische Eigenschaften von Granulaten Bentonit 1₆₀₀ Bentonit 3₆₀₀ Saponit 1₆₀₀ Schüttgewicht [g/l] 780 + 100 1060 + 150 835 + 100 pH (5 Gew.-% in Wasser) 8,5 9,3 8,3 BET-Oberfläche [m²/g] 58 67 45 Wassergehalt (Gew.-%) < 3 < 4 < 3 Here, the low setting for the rotational speed of the plate and the maximum rotational speed for the swirler was selected. The wet granules were first dried at 70 ° C and then subjected to thermal treatment at the indicated temperature for one hour. The granules were then screened in a size range of 0.1 to 1.5 mm. The physical properties of the granules are summarized in Table 11. Table 11: physical properties of granules Bentonite 1 ₆₀₀ Bentonite 3 ₆₀₀ Saponite 1 ₆₀₀ Bulk density [g / l] 780 + 100 1060 + 150 835 + 100 pH (5% by weight in water) 8.5 9.3 8.3 BET surface area [m ² / g] 58 67 45 Water content (wt.%) <3 <4 <3

Um die Stabilität der Granulate in wässrigen Medien zu testen, wurden diese 7 Tage in destilliertem Wasser sowie in unterschiedlichen Puffern gelagert. Hierzu wurden jeweils 0,5 g des Granulats in 20 ml Flüssigkeit gegeben.Around the stability of the granules in aqueous media These were tested in distilled water as well as in 7 days stored in different buffers. In each case 0.5 g of the granules in 20 ml of liquid.

Es wurden die folgenden Puffer verwendet: Puffer pH-Wert Citrat 3 Na-Acetat 5 HEPES 7 TRIS 9 The following buffers were used: buffer PH value citrate 3 Na acetate 5 HEPES 7 TRIS 9

Nach einer Woche Lagerzeit waren die Granulate unverändert. Es war kein Zerfall, der durch die Bildung von Trübungen oder feinem Bodensatz angezeigt wird, erkennbar.To One week of storage time, the granules were unchanged. There was no decay caused by the formation of cloudiness or fine sediment is visible.

Beispiel 5: Trägerung von Lipase auf thermisch behandelten TonmineralienExample 5: Supports lipase on thermally treated clay minerals

Für die Trägerung auf den thermisch behandelten Tonmineralien wurde eine Lipase aus Candida rugosa (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE) verwendet. Die Lipase aus dem Organismus Candida rugosa, einem Hefepilz, hat eine Größe von ca. 60–65 kDa und einen isoelektrischen Punkt von 5,2. Lipasen aus dem Organismus Candida rugosa gehören zu den unspezifischen Lipasen, die keine regiospezifischen Eigenschaften aufweisen und somit alle Esterbindungen hydrolisieren.For the support on the thermally treated clay minerals was a lipase from Candida rugosa (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE). Lipase from an organism Candida rugosa, a Yeast mushroom, has a size of approx. 60-65 kDa and an isoelectric point of 5.2. Lipases from the organism Candida rugosa belong to the nonspecific lipases that no have regiospecific properties and thus all ester bonds hydrolyze.

a.) Bestimmung der Enzym-Bindekapazität im statischen Systema.) Determination of the enzyme binding capacity in the static system

Vorbereitung der TrägerPreparation of the carrier

Jeweils 25 mg der in den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Träger werden in 10 ml der in Tabelle 12 aufgeführten 50 mMol Puffer equilibriert. Der im Puffer suspendierte Träger wird 30 Minuten im Ultraschallbad behandelt und bei 15 Upm für 30 min in einem Überkopfmischer geschüttelt. Die Suspension wird anschließend bei 3219 g und 10°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Tabelle 12: Für die Equilibrierung verwendete Puffer (50 mM) (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) pH-Wert Puffer 3 Citrat 4 Na-Acetat 5 Na-Acetat 6 BISTRIS 7 HEPES 8 Tris 9 Tris In each case 25 mg of the carrier prepared in Examples 1 to 4 are equilibrated in 10 ml of the 50 mM buffer listed in Table 12. The carrier suspended in the buffer is sonicated for 30 minutes and shaken at 15 rpm for 30 minutes in an overhead mixer. The suspension is then centrifuged at 3219 g and 10 ° C for 10 minutes and the supernatant discarded. Table 12: Buffers used for the equilibration (50 mM) (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen) PH value buffer 3 citrate 4 Na acetate 5 Na acetate 6 BISTRIS 7 HEPES 8th Tris 9 Tris

Vorbereitung der EnzymePreparation of the enzymes

Für die Beispiele wird eine Stammlösung der Lipase mit einer Konzentration von 2 mg/ml in dem entsprechenden Puffer hergestellt.For the examples, a stock solution of the lipase at a concentration of 2 mg / ml in the ent speaking buffer produced.

Untersuchung der pH-Abhängigkeit der EnzymadsorptionInvestigation of pH dependence enzyme adsorption

Zu jeweils 25 mg des bei einem in Tabelle 13 angegebenen pH-Wert equilibrierten Trägers werden 10 ml der Enzymstammlösung gegeben und die Suspension für 30 min bei 4°C und 15 Upm im Überkopfschüttler inkubiert. Danach wird der Feststoff bei 3219 g (10°C) für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand nach der Lowry- und der BCA-Methode bestimmt. Anschließend wird der Feststoff erneut in 10 ml des entsprechenden Puffers suspendiert, für 5 min bei 4°C und 15 Upm im Überkopfschüttler vermischt und bei 3219 g (10°C) erneut abzentrifugiert. Der Proteingehalt des Waschwassers wird ebenfalls bestimmt. Die auf dem Träger adsorbierte Enzymmenge wurde aus der Differenz zwischen eingesetzter Enzymmenge und der Summe der im Überstand bzw. im Waschwasser gemessenen Enzymmenge berechnet. Alle Versuche werden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die für Bentonit 1₅₀₀ bestimmten Beladungen sind in Tabelle 13 angegeben. Tabelle 13: pH-Abhängikeit der Adsorption von Lipase (Candida rugosa) an thermisch behandeltem Bentonit 1₅₀₀ pH-Wert Beladung Enzym [g/g Träger] Bentonit 1₅₀₀ 3 0,45 Bentonit 1₅₀₀ 4 0,51 10 ml of the enzyme stock solution are added to 25 mg each of the carrier equilibrated at a pH indicated in Table 13, and the suspension is incubated for 30 min at 4 ° C. and 15 rpm in an overhead shaker. Thereafter, the solid is centrifuged off at 3219 g (10 ° C.) for 10 min and the protein content in the supernatant is determined by the Lowry and the BCA method. Subsequently, the solid is resuspended in 10 ml of the appropriate buffer, mixed for 5 min at 4 ° C and 15 rpm in the overhead shaker and again centrifuged at 3219 g (10 ° C). The protein content of the wash water is also determined. The amount of enzyme adsorbed on the support was calculated from the difference between the amount of enzyme used and the sum of the amount of enzyme measured in the supernatant or in the wash water. All experiments are carried out in triplicate. The loadings determined for Bentonite 1 ₅₀₀ are given in Table 13. Table 13: pH dependency of the adsorption of lipase (Candida rugosa) on thermally treated bentonite 1 ₅₀₀ PH value Loading enzyme [g / g carrier] Bentonite 1 ₅₀₀ 3 0.45 Bentonite 1 ₅₀₀ 4 0.51

Nachdem der Überstand restlos entfernt ist, wird der mit dem Enzym beladene Träger in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen und die Suspension für die Aktivitätstests eingesetzt.After this the supernatant is completely removed, the one with the enzyme loaded carriers in 1 ml of distilled water and the suspension used for the activity tests.

Aktivitätsbestimmung der geträgerten Lipase (Candida rugosa)Activity determination of the supported Lipase (Candida rugosa)

i. Messwert Lipaselösungi. Reading lipase solution

In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden 2,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl einpipettiert. Die Proben werden ca. 5 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37°C vorgewärmt. Dann wird 1,0 ml Lipaselösung (Stammlösung) zupipettiert und 30 Minuten unter Rühren im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Danach werden 3,0 ml Ethanol (95%) zupipettiert und nach Zugabe von 50 μl Thymolphthalein-Lösung wird mit 0,1 M NaOH Maßlösung bis zum Umschlag nach blau titriert.In a 50 ml Erlenmeyer flask 2.5 ml distilled water 1.0 ml TRIS buffer 200 mM 3.0 ml olive oil pipetted. The samples are preheated for about 5 minutes with stirring in a water bath at 37 ° C. Then 1.0 ml of lipase solution (stock solution) is pipetted in and incubated with stirring in a water bath at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, 3.0 ml of ethanol (95%) are pipetted in and after addition of 50 .mu.l of thymolphthalein solution is titrated with 0.1 M NaOH standard solution until the envelope to blue.

ii. Blindwert Lipaselösungii. Blank value of lipase solution

In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils 25 mg der in den Beispielen 1 bis 4 dargestellten Träger eingewogen und dann 3,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl einpipettiert. Die Proben werden 30 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Danach werden 1,0 ml Lipaselösung (Stammlösung) und 3,0 ml Ethanol (95%) zupipettiert und nach Zugabe von 50 μl Thymolphthalein-Lösung wird mit 0,1 M NaOH Maßlösung bis zum Umschlag nach blau titriert.In a 50 ml Erlenmeyer flask 25 mg each of the carrier shown in Examples 1 to 4 are weighed in each case and then 3.5 ml distilled water 1.0 ml TRIS buffer 200 mM 3.0 ml olive oil pipetted. The samples are incubated for 30 minutes with stirring in a water bath at 37 ° C. Thereafter, 1.0 ml of lipase solution (stock solution) and 3.0 ml of ethanol (95%) are pipetted in, and after adding 50 μl of thymolphthalein solution, titrated with 0.1 M NaOH standard solution until blue.

iii. Messwert geträgerte Lipaseiii. Measured value of lipase

In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden 2,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl einpipettiert. Die Proben werden ca. 5 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37°C vorgewärmt. Die Aktivitätsbestimmung wird im Abstand von 1 Minute angesetzt. Das auf dem Träger adsorbierte Enzym wird in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zu der Lösung im Erlenmeyerkolben gegeben. Die weiteren Proben folgen jeweils im Abstand von 1 Minute. Nach Zugabe von 3,0 ml Ethanol (95%) und 50 μl Thymolphthaleinlösung wird mit 0,1 M NaOH Maßlösung bis zum Umschlag nach blau titriert.In a 50 ml Erlenmeyer flask 2.5 ml distilled water 1.0 ml TRIS buffer 200 mM 3.0 ml olive oil pipetted. The samples are preheated for about 5 minutes with stirring in a water bath at 37 ° C. The activity determination is scheduled at intervals of 1 minute. The enzyme adsorbed on the carrier is taken up in 1 ml of distilled water and added to the solution in the Erlenmeyer flask. The further samples follow at intervals of 1 minute. After adding 3.0 ml of ethanol (95%) and 50 μl of thymolphthalein solution, titrate with 0.1 M NaOH standard solution until blue.

iv. Blindwert geträgerte Lipaseiv. Blank value-supported lipase

In einem 50 ml Erlenmeyerkolben werden 2,5 ml destilliertes Wasser 1,0 ml TRIS-Puffer 200 mM 3,0 ml Olivenöl einpipettiert. Die Proben werden 30 Minuten lang unter Rühren im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Das auf dem jeweiligen Träger adsorbierte Enzym wird in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen und zusammen mit 3,0 ml Ethanol (95%) zur Lösung in den Erlenmeyerkolben gegeben. Nach Zugabe von 50 μl Thymolphthaleinlösung wird mit 1,0 M NaOH Maßlösung bis zum Umschlag nach blau titriert.In a 50 ml Erlenmeyer flask 2.5 ml distilled water 1.0 ml TRIS buffer 200 mM 3.0 ml olive oil pipetted. The samples are incubated for 30 minutes with stirring in a water bath at 37 ° C. The enzyme adsorbed on the respective carrier is taken up in 1 ml of distilled water and added to the solution in the Erlenmeyer flask together with 3.0 ml of ethanol (95%). After addition of 50 μl thymolphthalein solution, titrate with 1.0 M NaOH standard solution until blue.

Die Aktivität des Enzyms wird über den NaOH-Verbrauch ermittelt.The Activity of the enzyme is above the NaOH consumption determined.

Unit-DefinitionUnit-Definition

Eine Unit hydrolisiert 1,0 μM Fettsäure (aus Triglyceriden) in einer Stunde bei pH 7,7 und 37°C.A Unit hydrolyzes 1.0 μM fatty acid (from triglycerides) in one hour at pH 7.7 and 37 ° C.

Die ermittelten Lipaseaktivitäten sind im Vergleich zur ungeträgerten Lipase in Tabelle 14 angegeben. Tabelle 14: Vergleich der Lipase-Aktivität (Candida rugosa) von nicht geträgertem und geträgertem Enzym pH-Wert Aktivität [U/mg] Aktivität [%] Lipaselösung 3 1656 100 Bentonit 1₅₀₀ 3 229,5 14 Lipase-Lösung 4 865,5 100 Bentonit 1₅₀₀ 4 408,5 47 The lipase activities determined are given in Table 14 in comparison to the unsupported lipase. Table 14: Comparison of lipase activity (Candida rugosa) of unsupported and supported enzyme PH value Activity [U / mg] Activity [%] lipase 3 1656 100 Bentonite 1 ₅₀₀ 3 229.5 14 Lipase solution 4 865.5 100 Bentonite 1 ₅₀₀ 4 408.5 47

Aufnahme von AdsorptionsisothermenAbsorption of adsorption isotherms

Die Messwerte aus den Tabellen 13 und 14 zeigen, dass bei pH 4 die Beladung des Trägers mit dem Enzym höher ist. Ferner wird beim adsorbierten Enzym eine höhere Aktivität gemessen. Für die folgenden Messungen wurde daher das Enzym bei einem pH-Wert von 4 auf den Trägern adsorbiert.The Measurements from Tables 13 and 14 show that at pH 4 the loading the carrier with the enzyme is higher. Furthermore, will the adsorbed enzyme has a higher activity measured. For the following measurements, therefore, the enzyme adsorbed on the carriers at a pH of 4.

In der gleichen Weise wie oben beschrieben, wurden Adsorptionsisothermen für die Adsorption der Lipase an verschiedene Träger aus thermisch behandelten Tonmineralien ermittelt. Dazu wurden jeweils 25 mg der mit 50 mMol Na-Acetatpuffer bei einem pH von 4 equilibrierten Träger in 10 ml Enzymlösung gegeben. Die Enzymlösungen wurden durch Verdünnung der Enzymstammlösung (Na-Acetat 50 mM, pH 4) mit Na-Acetatpuffer (50 mM, pH 4) hergestellt. Es wurden die folgenden Konzentrationen bereitgestellt:
0,25 mg/ml
0,5 mg/ml
1,0 mg/ml
2,0 mg/ml
3,0 mg/ml
4,0 mg/mlIn the same manner as described above, adsorption isotherms for the adsorption of the lipase to various supports of thermally treated clay minerals were determined. For this purpose, in each case 25 mg of the support equilibrated with 50 mmol of Na acetate buffer at a pH of 4 in 10 ml of enzyme solution were added. The enzyme solutions were prepared by dilution of the enzyme stock solution (Na-acetate 50 mM, pH 4) with Na-acetate buffer (50 mM, pH 4). The following concentrations were provided:
0.25 mg / ml
0.5 mg / ml
1.0 mg / ml
2.0 mg / ml
3.0 mg / ml
4.0 mg / ml

Die Bestimmungen wurden mit Bentonit 1₅₀₀, Bentonit 3₅₀₀ und Saponit 1₅₀₀ durchgeführt. Die Werte für die Adsorptionsisothermen sind in Tabelle 15 sowie in den 1 bis 3 wiedergegeben. Tabelle 15: Adsorption von Lipase an thermisch behandelten Bentoniten Enzymkonz (mg/ml) Beladung Lipase (mg/mg_Träger) Bentonit 1₆₀₀ (Fig. 1) Bentonit 3₅₀₀ (Fig. 2) Saponit 1₅₀₀ (Fig. 3) 0,25 0,05 0,10 0,09 0,5 0,12 0,18 0,13 1 0,29 0,25 0,13 2 0,44 0,63 0,30 3 0,34 0,88 0,31 4 0,48 1,18 0,49 The determinations were carried out with bentonite 1 ₅₀₀ , bentonite 3 ₅₀₀ and saponite 1 ₅₀₀ . The values for the adsorption isotherms are shown in Table 15 and in the 1 to 3 played. Table 15: Adsorption of lipase on thermally treated bentonites Enzyme concentration (mg / ml) Loading lipase (mg / mg _carrier ) Bentonite 1 ₆₀₀ (FIG. 1) Bentonite 3 ₅₀₀ (FIG. 2) Saponite 1 ₅₀₀ (Figure 3) 0.25 0.05 0.10 0.09 0.5 0.12 0.18 0.13 1 0.29 0.25 0.13 2 0.44 0.63 0.30 3 0.34 0.88 0.31 4 0.48 1.18 0.49

Weiter wurde für die geträgerte Lipase jeweils die Aktivität in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Die Werte sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Tabelle 16: Lipaseaktivität in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration Enzymkonz (mg/ml) Lipaseaktivität im Vergleich zur Stammlösung (100%) (%) Bentonit 1₆₀₀ Bentonit 3₅₀₀ Saponit 1₅₀₀ 0,25 58 12 11 0,5 105 51 20 1 82 71 13 2 40 56 13 3 33 42 8 4 26 24 8 Furthermore, the activity was determined in the manner described above for the supported lipase. The values are shown in Table 16. Table 16: Lipase activity as a function of the enzyme concentration Enzyme concentration (mg / ml) Lipase activity compared to stock solution (100%) (%) Bentonite 1 ₆₀₀ Bentonite 3 ₅₀₀ Saponite 1 ₅₀₀ 0.25 58 12 11 0.5 105 51 20 1 82 71 13 2 40 56 13 3 33 42 8th 4 26 24 8th

ErgebnisseResults

In den Tabellen 13 bis 16 sind die Ergebnisse zur Adsorption und Aktivität des geträgerten Enzyms Lipase (Candida rugosa) wiedergegeben. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich das Enzym mit sehr guten Bindekapazitäten von bis zu 1,1 mg Protein pro mg Träger adsorbieren lässt. Üblicherweise liegen Proteinbindekapazitäten bzw. Enzymbindekapazitäten von kommerziell erhältlichen Trägermaterialien oder Chromatographiematerialien im Bereich von 0,1 mg bis 0,3 mg pro Milligramm Träger. Zusätzlich zeigt sich, dass auch die Enzymaktivität der geträgerten Enzyme noch hoch ist, d. h. vergleichbar mit der Aktivität in Lösung oder gegenüber der Lösungsaktivität nur wenig verringert. Dies ist insbesondere bei Bentonit 1₅₀₀, Bentonit 1₆₀₀, sowie Bentonit 3₅₀₀ und Bentonit 3₆₀₀ der Fall.Tables 13 to 16 show the results for the adsorption and activity of the supported enzyme lipase (Candida rugosa). Surprisingly, it has been found that the enzyme can be adsorbed with very good binding capacities of up to 1.1 mg of protein per mg of carrier. Usually, protein binding capacities or enzyme binding capacities of commercially available carrier materials or chromatography materials are in the range from 0.1 mg to 0.3 mg per milligram of carrier. In addition, it is found that the enzyme activity of the supported enzymes is still high, ie only slightly reduced, comparable to the activity in solution or to the activity of solution. This is particularly the case with bentonite 1 ₅₀₀ , bentonite 1 ₆₀₀ , and bentonite 3 ₅₀₀ and bentonite 3 ₆₀₀ .

Beispiel 6: Trägerung von Lipase (Candida rugosa) auf Granulaten. Die in Beispiel 4 erhaltenen Granulate wurden zunächst wie in Beispiel 5 beschrieben mit einem Na-Acetatpuffer auf pH 4 equilibriert. Durch die Verwendung von Granulaten ergeben sich gegenüber der Verwendung von Pulver größere eingesetzte Träger mengen. Im Vergleich zu Beispiel 5 wurde daher die vierfache Menge an Träger und Enzymlösung verwendet.example 6: Carrier of lipase (Candida rugosa) on granules. The granules obtained in Example 4 were initially as described in Example 5 with a Na acetate buffer to pH 4 equilibrated. Through the use of granules arise opposite the use of powder larger amounts of carrier used. Compared to Example 5, therefore, four times the amount of carrier and enzyme solution.

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EP Barret, LG Joiner, PP Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73 (1951, 373) [0069]
- DIN / ISO-787/2 [0071]

Claims

Solid enzyme complex comprising at least one Enzyme immobilized on a carrier, the was obtained by heating a clay mineral to a temperature and for a period of time that the carrier has a swelling capability in water of less than 15 ml / 2 g.

Solid enzyme complex according to claim 1, characterized in that that the clay mineral to a temperature of at least 400 ° C has been heated.

Solid enzyme complex according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the carrier has an ion exchange capacity of at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 15 meq / 100 g.

Solid enzyme complex according to one of the preceding claims, characterized in that the support has a specific surface area of less than 300 m ² / g, preferably less than 200 m ² / g, particularly preferably less than 120 m ² / g.

Solid enzyme complex according to one of the preceding Claims, characterized in that the solid enzyme complex is formed as a shaped body, in particular as granules.

Solid enzyme complex according to one of the preceding Claims, characterized in that the enzyme is selected is from the group which is formed from lipases, reductases, Transferases, hydrolases, isomerases, ligases, lyases.

Solid enzyme complex according to one of the preceding Claims, characterized in that the enzyme via a non-covalent bond is attached to the support.

Solid enzyme complex according to one of the preceding Claims, characterized in that the proportion of Enzyme, based on the weight of the solid enzyme complex, between 3 and 35 wt .-% is.

Solid enzyme complex according to one of the preceding Claims, characterized in that the enzyme has a molecular weight in the range of 10 to 200 kDa.

Process for the preparation of a solid enzyme complex according to one of claims 1 to 9, characterized that - a carrier is provided, the was obtained by heating a clay mineral to a temperature and for a period of time that the carrier has a swelling capability in water of less than 15 ml / 2 g; - one Enzyme is provided; - the enzyme and the carrier be contacted in a reaction medium, wherein the enzyme immobilized on the support; and - of the solid enzyme complex: optionally separated from the reaction medium.

Method according to claim 10, characterized in that that the clay mineral to a temperature of at least 400 ° C is heated.

Method according to claim 10 or 11, characterized that the wearer has a relationship of exchangeable divalent to exchangeable monovalent cations of at least 4: 1.

Method according to one of claims 10 to 12, characterized in that the carrier a share on divalent cations on the ion exchange capacity of at least 50%.

Method according to one of claims 10 to 13, characterized in that the carrier has a specific surface area of less than 300 m ² / g, preferably less than 200 m ² / g, more preferably less than 120 m ² / g.

Method according to one of claims 10 to 14, wherein the carrier before the immobilization of the enzyme to a shaped body, in particular a granulate is formed.

Method according to one of claims 10 to 15, characterized in that the carrier according to a Storage in water for 3 days has a sediment volume of less than 15, preferably less than 10 ml / g.

Method according to one of claims 10 to 16, characterized in that the carrier before the immobilization of the enzyme is equilibrated to a pH of 3.5 to 6.0.

Method according to one of claims 10 to 17, characterized in that the enzyme with a binder is fixed on the carrier.

Method according to one of claims 10 to 18, characterized in that the reaction medium by an aqueous Buffer system is formed.

Method according to one of claims 10 to 19, characterized in that the reaction medium for immobilization to a temperature of 0 to 30 ° C is tempered.

Use of a solid enzyme complex after a of claims 1 to 9 for enzyme-catalyzed reactions.