DE102007056231A1

DE102007056231A1 - Herstellung und Verwendung von Varianten humander Kunitz-Typ Protease-Inhibitoren (hKTPI)

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Publication number: DE102007056231A1
Application number: DE102007056231A
Authority: DE
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2007-09-08
Filing date: 2007-11-22
Publication date: 2009-03-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Protease-Inhibitoren des Kunitz-Typs, die als DNA-Fragmente aus humaner genomischer DNA isoliert wurden, deren Modifikation und Expression in geeigneten Expressionssystemen, sowie deren Herstellung und mögliche Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Protease-Inhibitoren des Kunitz-Typs, die als DNA – Fragmente aus humaner genomischer DNA isoliert wurden, deren Modifikation und Expression in geeigneten Expressionssystemen, sowie deren Herstellung und mögliche Verwendung.
Kunitz-Domänen sind Polypeptide von 55–62 Aminosäure (aa) Länge, die eine Vielzahl von Serin-Proteasen mit unterschiedlicher Wirkstärke hemmen. Sie enthalten meistens drei Disulfidbrücken, die das Protein stabilisieren und seine dreidimensionale Struktur bestimmen. Die Interaktion mit der jeweiligen Serin-Protease erfolgt hauptsächlich über einen ca. 9 aa langen Loop im N-terminalen Bereich der Kunitz-Domäne. Dieser Loop bindet an das katalytische Zentrum der Protease und verhindert so die Spaltung der entsprechenden Protease-Substrate (Laskowski und Kato, 1980; Bode und Huber, 1992).
Aprotinin, das auch als boviner pankreatischer Trypsin-Inhibitor (BPTI) bezeichnet wird, gilt als Prototyp der Kunitz-Domänen (Fritz und Wunderer, 1983). Es handelt sich hierbei um ein basisches Protein von 58 aa Länge, das aus verschiedenen Organen des Rindes isoliert werden kann (u. a. Pankreas, Lunge, Leber und Herz). Aprotinin wird durch drei Disulfidbrücken stabilisiert (Cys 5–Cys 55; Cys 14–Cys 38; Cys 30–Cys 51) und ist u. a. ein potenter Inhibitor von Trypsin, Plasmin und Plasma-Kallikrein.
Durch Röntgenstrukturanalyse des Komplexes zwischen Aprotinin und Rindertrypsin konnte gezeigt werden, daß der Kontaktbereich des Aprotinins zum katalytischen Zentrum der Protease im Wesentlichen durch einen aus den Aminosäureresten 11 bis 19 bestehenden Loop gebildet wird (siehe Bode und Huber, 1992 und darin aufgeführte Referenzen). Von zentraler Bedeutung für die inhibitorische Wirkung des Aprotinins ist der Aminosäurrest Lys/K 15, der in besonders engem Kontakt zu dem katalytisch aktiven Serinrest der Protease steht. Die Aminosäure Lys/K 15 wird daher per Definition als P1-Rest bezeichnet (Schechter und Berger,1967). N-terminal von Lys/K 15 befinden sich die Reste P2, P3 etc., während die Aminosäuren C-terminal von Lys/K15 als P1', P2' etc. bezeichnet werden. Es wurde bereits früher gezeigt, daß die inhibitorische Wirkung des Aprotinins durch gezielten Austausch von Aminosäureresten im Bereich von Rest 11 bis Rest 19 verändert werden kann (Otlewski et al., 2001, Apeler et al., 2004, Krowarsch et al., 2005). Für die Wirksamkeit des Aprotinins sind außerdem die Aminosäuren an Position 36–39 von Bedeutung (Fritz und Wunder, 1983, Krowarsch et al., 2005).
Aprotinin wird unter dem Handelsnamen Trasylol heute hauptsächlich in der Herzchirurgie eingesetzt, nachdem klinische Studien gezeigt haben, daß eine Behandlung mit Aprotinin den Transfusionsbedarf bei derartigen Operationen signifikant verringert und zur Reduktion von Nachblutungen führt (Royston, 1992). Seine klinische Wirkung wird auf die Hemmung der Fibrinolyse, die Inhibition der intrinsischen Blutgerinnung (Kontaktaktivierung) und die Reduktion der Thrombinbildung zurückgeführt (Blauhut et al., 1991, Dietrich et al., 1995). Somit ist für die blutungsstillende Wirkung des Aprotinins die Hemmung sowohl von Plasmins als auch von Plasmakallikrein und Faktor XIa von Bedeutung.
Als bovines Protein führt Aprotinin im Menschen zur Bildung von Antikörpern. Bei wiederholter Gabe von Trasylol kann es zu allergischen Reaktionen (anaphylaktischer Schock) kommen. Das Risiko hierfür liegt bei 2.8%, wodurch die Möglichkeit einer mehrfachen Anwendung von Aprotinin eingeschränkt ist (Dietrich et al., 2001, Beierlein et al., 2005). Es besteht somit ein hoher medizinischer Bedarf an Wirkstoffen mit einer ähnlichen oder besseren klinischen Wirkung als Aprotinin, die keine allergische Reaktion hervorrufen.
Im humanen Genom existieren eine Reihe von Genen, die eine oder mehrere Kunitz-Domänen (KD) enthalten, wie z. B. Amyloid beta (A4) precursor Protein (peptidase nexin-II, Alzheimer disease, Ponte et al., 1988, Oltersdorf et al., 1989), Serine peptidase inhibitor-like, mit Kunitz und WAP domains 1 (Eppin, Richardson et al., 2001), Serine peptidase inhibitor, Kunitz type, 2, SPINT 2 (placentales Bikunin, 2 KD, Delaria et al., 1997), Tissue factor pathway inhibitor 2 precursor (TFPI-2, 3 KD, Sprecher et al., 1994), Tissue factor pathway inhibitor, TFPI (lipoprotein-associated coagulation inhibitor, 3 KD, Wun et al., 1988, van der Logt et al., 1991), Amyloid beta (A4) precursor-like Protein 2, APLP2 (Yang et al., 1996), Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor, AMBP, 2 KD (Vetr and Gebhard, 1990), Hepatocyte growth factor activator inhibitor typet, (HAI-1, SPINT 1, 2 KD, Shimomura et al., 1997), Collagen, type VI, apha 3 (COL6A3, Chu et al., 1988), Collagen, type VII, apha 1 (epidermolysis bullosa, dystrophic, dominant and recessive, COL7A1, Parente et al., 1991), Kunitz-type protease inhibitor 3 precursor (HKIB9, SPIT 3, Deloukas et al., 2001), WAP four-disulfide core domain 8 (WFDC8, Clauss et al., 2002), WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing (WFIKKN, 2 KD, Trexler et al., 2001), WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing 2 (WFIKKN2, 2 KD, Hill et al., 2003), sowie hypothetische Proteine bzw. offene Leseraster, die bei der Analyse des humanen Genoms identifiziert wurden, wie z. B. Serine peptidase inhibitor, Kunitz type 4 (SPINT 4, Corf 137), Papilin, proteoglycan-like sulfated glycoprotein (PAPLN, hypothetical Protein), Q9BQP5 – OTTHUMP00000031164 (Fragment, C20orf168), LOC285929, similiar to matrilin 2 precursor (hypothetical Protein).
Für einige der Kunitz-Domänen aus den o. g. Genen konnte gezeigt werden, dass sie Serinproteasen mit hoher Wirkstärke inhibieren (Nexin-II: Dennis und Lazarus, 1994, Dennis et al., 1995, Wagner et al., 1992, Navaneetham et al., 2005, Van Nostrand et al., 1990; Spint-1: Kirchhofer et al., 2003; HAI-1: Shimomura et al., 1997, Denda et al., 2002; COL6A3: Kohlfeldt et al., 1996; WFIKKN: Nagy et al., 2003), andere sind jedoch hinsichtlich ihres inhibitorischen Wirkspektrums nicht näher charakterisiert. Ziel war es daher die via PCR aus humaner genomischer DNA isolierten Kunitz-Domänen in geeigneten Expressionssystemen zu exprimieren, sie auf ihre inhibitorische Wirkung hin zu testen und Varianten herzustellen, die mit Aprotinin vergleichbare Eigenschaften besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die rekombinante Herstellung von Kunitz-Domänen, die aus humaner genomischer DNA isoliert wurden und eine mit Aprotinin vergleichbare Wirkung besitzen. Die gewünschten Eigenschaften wurden durch PCR- und Mutagenesetechniken erreicht, wobei die Mutagenesen zu Aminosäureresten führen, die in natürlichen oder nicht-natürlichen Kunitz-Domänen vorkommen können.
Diese Vorgehensweise führt zu Varianten humaner Kunitz-Domänen

• die in geeigneten Hefe- und weiteren Expressionssystemen rekombinant hergestellt werden können
• die Serin-Proteasen inhibieren können (Tabelle 1)
• deren Plasmin-, Plasmakallikrein- und Faktor XIa-Inhibition mit Aprotinin vergleichbar ist (Tabelle 1)
• die in funktionellen in vitro Assays zu Aprotinin vergleichbare Effekte auf Fibrinolyse und Koagulation zeigen

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Kunitz-Domänen im Sinne dieser Erfindung sind Homologe des Aprotinins mit 55 bis 62 Aminosäureresten, die meistens sechs Cysteinreste und drei Disulfidbrücken enthalten, die jeweils zwischen den Positionen Cys 5–Cys 55, Cys 14–Cys 38 und Cys 30–Cys 51 (Nummerierung gem. Aprotinin, siehe Seq. A) ausgebildet sind. Zusätzlich können am N- oder/und C-Terminus bis zu drei weitere beliebige Aminosäuren angefügt werden. 1 zeigt den Aufbau einer Kunitz-Domäne. Die Aminosäuren einer Kunitz-Domäne werden so nummeriert, dass sich die sechs Cysteinreste in den Positionen 5, 14, 30, 38, 51 und 55 befinden. Entsprechend wird die vierte Aminosäure N-terminal von Cys 5 mit der Nummer 1 bezeichnet. Werden am N-Terminus zusätzliche Aminosäuren angefügt, erhalten sie die Nummern –1, –2, –3. Bestimmte Aminosäuren, die in bisher bekannten Kunitz-Domänen vorkommen, sind in 1 entsprechend bezeichnet. Alle nicht näher bezeichneten Positionen können beliebige Aminosäuren enthalten.
1 zeigt die Definition einer Kunitz-Domäne.
Aprotinin, das auch als boviner pankreatischer Trypsin-Inhibitor (BPTI) bezeichnet wird, gilt als Prototyp der Kunitz-Domänen (Fritz und Wunderer, 1983). Es handelt sich hierbei um ein basisches Protein von 58 aa Länge, das die für Kunitz-Domänen typischen Cysteinreste an den Positionen 5, 14, 30, 38, 51 und 55 enthält. Die Cysteinreste bilden drei Disulfidbrücken aus (Cys 5 – Cys 55; Cys 14 – Cys 38; Cys 30 – Cys 51), die das Molekül stabilisieren. Die Nummerierung der Aminosäuren der Kunitz-Domänen im Sinne dieser Erfindung entspricht der Nummerierung des Aprotinins (siehe Seq. A). Dabei befindet sich Aminosäure 1 vier Positionen N-terminal von Cys 5 und entspricht der Aminosäure Arg 1 des Aprotinins. Werden am N-Terminus zusätzliche Aminosäuren angefügt, erhalten sie die Nummern –1, –2, –3.
Seq. A: Aprotinin
Kunitz-Inhibitoren wurden bisher in verschiedenen Vertebraten sowie Invertebraten gefunden (Laskowski und Kato, 1980). Diese in der Natur vorkommenden Kunitz-Domänen werden in dieser Anmeldung als „natürliche Kunitz-Domänen" bezeichnet (Shimomura et al., 1997, Li et al., 1998, Ponte et al., 1988, Richardson et al., 2001, Wun et al., 1988, Marlor et al., 1997, Petersen et al., 1994, Vetr und Gebhard, 1990, Chun et al., 1990, Parente et al., 1991, Norris et al., 1993, Claus et al., 2002, Trexler et al., 2001, 2002), Kunitz-Domänen, die mittels gentechnischer Methoden modifiziert sind, z. B. durch Austausch von Aminosäurereste und/oder Deletionen und so in der Natur nicht vorkommen, werden in dieser Anmeldung als nicht-natürlich Kunitz-Domänen" bezeichnet ( US 6010880 , US 5795865 , WO 92/06111 , US 5777568 , US 6482798 , P 0 238993 , EP 0 307592 EP 0 821007 , US 5863893 , US 5914315 , US 7019123 ).
Aprotinin ist ein potenter Inhibitor von Plasmin, Plasmakallikrein und Faktor XIa, dessen klinische Wirkung auf die Hemmung der Fibrinolyse, die Inhibition der intrinsischen Blutgerinnung (Kontaktaktivierung) und auf die Reduktion der Thrombinbildung zurückgeführt wird (Blauhut et al., 1991, Dietrich et al., 1995).
Als bovines Protein führt Aprotinin im Menschen zur Bildung von Antikörpern. Bei wiederholter Gabe von Trasylol kann es zu allergischen Reaktionen (anaphylaktischer Schock) kommen, wodurch die Möglichkeit einer mehrfachen Anwendung von Aprotinin eingeschränkt ist (Dietrich et al., 2001, Beierlein et al., 2005).
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Kunitz-Domänen humanen Ursprungs oder Varianten dieser Kunitz-Domänen zu identifizieren, die eine dem Aprotinin vergleichbare oder verbesserte funktionelle Aktivität besitzen. Erfindungsgemäße Kunitz-Domänen hemmen sowohl Plasmin als auch Plasmakallikrein und Faktor XIa mit hoher Wirkstärke. Sie sind außerdem potente Inhibitoren der Fibrinolyse und der intrinsischen Koagulation.
Erfindungsgemäße Kunitz-Domänen und deren Varianten hemmen Plasmin mit einem IC50 < 2 μM, besser jedoch mit einem IC50 < 100 nM. Plasmakallikrein wird von erfindungsgemäßen Kunitz-Domänen und deren Varianten mit einem IC50 < 2 μM, besser jedoch mit einem IC50 < 100 nM gehemmt. Ferner hemmen erfindungsgemäße Kunitz-Domänen und deren Varianten Faktor XIa mit einem IC50 < 2 μM, besser jedoch mit einem IC50 < 100 nM.
Im folgenden sind Beispiele für erfindungsgemäße humane Kunitz-Domänen mit einer dem Aprotinin vergleichbaren oder verbesserten Wirkung aufgeführt (siehe Tabelle 1):
Seq. Nr. 38 (APP4)
Seq. Nr. 50 (APLP-2)
Seq. Nr. 54 (AMBP-D2)
Es wurde außerdem gefunden, dass verschiedene humane Kunitz-Domänen die Serin-Proteasen Plasmin, Plasmakallikrein und/oder Faktor XIa nur mit geringer Wirkstärke oder gar nicht hemmen. Im folgenden sind Beispiele für solche humanen Kunitz-Domänen aufgeführt (siehe Tabelle 1):
Seq. Nr. 42 (TFPI1-D2)
Seq. Nr. 48 (TFPI2-D3)
Seq. Nr. 66 (WFI-2-D2)
Seq. Nr. 63 (WFI-1-D2)
Seq. Nr. 27 (COL6A3-6His)
Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch das gezielte Einführen von Mutationen die inhibitorische Wirkung solcher humaner Kunitz-Domänen gegenüber Plasmin, Plasmakallikrein und Faktor XIa verbessert werden kann, so dass die dadurch entstehenden Varianten eine dem Aprotinin vergleichbare oder verbesserte Wirkung aufweisen.
Erfindungsgemäße Varianten humaner Kunitz-Domänen weisen an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren auf:
X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = HX19 = P, X20 = R, X21 = W, X22 = W.
Die übrigen Positionen enthalten beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen.
Weitere erfindungsgemäße Varianten humaner Kunitz-Domänen weisen an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren auf:
X10 = V, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F.
Die übrigen Positionen enthalten beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen.
Weitere erfindungsgemäße Varianten humaner Kunitz-Domänen weisen an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren auf:
X10 = E, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F.
Die übrigen Positionen enthalten beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen.
Weitere erfindungsgemäße Varianten humaner Kunitz-Domänen weisen an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren auf:
X10 = V, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F.
Die übrigen Positionen enthalten beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen.
Weitere erfindungsgemäße Varianten humaner Kunitz-Domänen weisen an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren auf:
X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F.
Die übrigen Positionen enthalten beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen.
Besonders bevorzugt sind folgende Varianten humaner Kunitz-Domänen:
Seq. Nr. 60d (COL6A3-mut4)
Seq. Nr. 60e (COL6A3-mut5)
Seq. Nr. 63a (WFI1-D2-mut1)
Seq. Nr. 63c (WFI1-D2-mut3)
Seq. Nr. 63d (WFI1-D2-mut4)
Erfindungsgemäße humane Kunitz-Domänen und deren Varianten hemmen außerdem die Fibrinolyse und intrinsischen Koagulation in humanem Plasma mit dem Aprotinin vergleichbarer oder verbesserter Wirksamkeit (1 und 2)
Die beschriebenen und mit Aprotinin vergleichbare Eigenschaften besitzenden humanen Kunitz-Domänen sowie deren Varianten eignen sich für die Behandlung von folgenden Krankheitszuständen: Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; Therapie thromboembolischer Zustände (z. B. nach Operationen, Unfällen), Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem) , Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns, Tendinopathie.
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Protein oder Polypeptid, welches eine Kunitz-Domäne enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist:
X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = HX19 = P, X20 = R, X21 = W, X22 = W, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten;
oder
dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist:
X10 = V, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten;
oder
dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist:
X10 = E, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten;
oder
dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist:
X10 = V, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten;
oder
dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist:
X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten.
Erfindungsgemäß ist ein isoliertes Protein wie oben beschrieben, wobei die übrigen Positionen der Kunitz-Domäne Aminosäuren einer bestimmten humanen Kunitz Domäne enthalten.
Besonders bevorzugt ist ein isoliertes Protein oder Polypeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 60d (COL6A3-mut4, SEQ ID NO: 121), Seq. Nr. 60e (COL6A3-mut5, SEQ ID NO: 122), Seq. Nr. 63a (WFI1-D2-mut1, SEQ ID NO: 126), Seq. Nr. 63c (WFI1-D2-mut3, SEQ ID NO: 128) und Seq. Nr. 63d (WFI1-D2-mut4, SEQ ID NO: 129).
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Fragment eines der im Vorhergehenden beschriebenen Proteine oder Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine inhibitorische Wirkung gegenüber Plasmin, Plasmakallikrein, oder Faktor XIa aufweist, die mit der Wirkung des Aprotinins vergleichbar oder besser als die Wirkung des Aprotinins ist.
Ebenfalls erfindungsgemäß ist eine Nukleinsäure, welche für ein Polypeptid oder Protein wie oben beschrieben kodiert. Die Nukleinsäure kann heterologe Vektorsequenzen oder eine heterologe Promotorsequenz 5' zur kodierenden Region enthalten.
Erfindungsgemäß ist auch eine Zelle oder ein nicht-humaner Organismus, die eine oben beschriebene Nukleinsäure enthalten.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides oder Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle, die eine für ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält kultiviert wird und das Protein aufgereinigt wird.
Die Erfindung betrifft auch einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, spezifisch für ein erfindungsgemäßes Protein.
Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem), Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns und Tendinopathie.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins oder Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, und Wundheilung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Definition einer Kunitz-Domäne.
2 beschreibt die antifbrinolytische Aktivität von WFI1-D2-mut4 in humanem Plasma.
3 beschreibt die antikoagulierende Aktivität von WFI1-D2-mut4 in humanem Plasma.
Ausführungsbeispiele
Molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Techniken
Routinemäßige Klonierungsarbeiten wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1989) durchgeführt. Für die Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli (sog. mini- und midipreps) wurden Qiagen-tips (Qiagen) verwendet. Als Wirtsorganismus für Transformationen wurde der E. coli Stamm DH5α (Stratagene) eingesetzt. Die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde mit Hilfe des Qiagen gel extraction kits nach Angaben des Herstellers (Qiagen) durchgeführt.
Oligonukleotide für 'site directed mutagenesis' Experimente, Primer für PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden von der Firma Operon bezogen, synthetische Gene (optimiert für S. cerevisiae coden-usage) von der Firma Geneart.
In-vitro Mutagenesen wurden mit Hilfe des Quick-change II XL Site-directed Mutagenesis Kits nach Angaben des Herstellers (Stratagene) durchgeführt. Für PCR – Experimente wurden Kits der Firma Qiagen (Hot Star Mastermix), Stratagene (PfuUltra Hotstart DNA Polymerase ) oder Novagen (KOD HiFi, Hot Start and XL DNA Polymerases) nach Angaben der Hersteller eingesetzt, zur Aufreinigung von PCR-Fragmenten wurde der PCR Purification Kit der Firma Qiagen verwendet.
Für zellfreie Transkriptions- und Translationsexperimente wurde das Rapid Translation System (RTS) pIVEX HIS-tag, 2^nd Generation Vector Set nach Angaben des Herstellers (Roche) eingesetzt. Alle Vektorkonstruktionen und Mutagenesen wurden mittels Cycle-DNA-Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Terminatoren (Big Dye Terminator, Version 1.1, Firma Applied Biosystems) auf einem Sequenzer (3100 Avant Genetic Analyzer, Firma Applied Biosystem) bestätigt.
Beispiel 1
Klonierung von Protease-Inhibitordomänen des Kunitz-Typs aus humaner genomischer DNA mittels PCR
Zur Klonierung via PCR wurden für folgende humane Gene, die in ihren kodierenden Sequenzen Protease-Inhibitordomänen des Kunitz-Typs enthalten ( im folgenden humane Kunitz-Domänen genannt), entsprechende PCR-Primer (1a, b–23a, b) abgeleitet:

• Amyloid beta (A4) precursor Protein (peptidase nexin-II, Alzheimer disease)
• Serine peptidase inhibitor-like, with Kunitz and WAP domains 1 (Eppin)
• Tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein-associated coagulation inhibitor, TFPI-1), Domäne 2 und 3
• Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI-2 ), Domäne 2 und 3
• Amyloid beta (A4) precursor-like Protein 2 (APLP 2)
• Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP), Domäne 1 und 2
• Serine peptidase inhibitor, Kunitz type 1 (SPINT 1, HAI-1), Domäne 1 und 2
• Collagen, type VI, alpha 3 (COL6A3)
• Collagen, type VII, alpha 1 (COL7A1)
• WAP four-disulfide core domain 8 (WFDC 8, WAP 8)
• WFIKKN1 WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing (WFI-1), Domäne 1 und 2 (NM_175575)
• WAP, follistatin/kazal, immunoglobulin, kunitz and netrin domain containing (WFI-2), Domäne 1 und 2 (NM_053284)
• Serine peptidase inhibitor, Kunitz type 4 (SPINT 4, C20orf137)
• Papilin, proteoglycan-like sulfated glycoprotein (PAPLN, Hypothetical Protein – hypro)
• Q9BQP5_HUMAN (c20orf168)
• Homo sapiens similar to matrilin 2 precursor, transcript variant 2 (LOC285929)
• Similar to Kunitz-type protease inhibitor 3 precursor (HKIB9, SPIT 3, P49223)

Die PCR-Reaktionen enthielten je ca. 100 ng humane genomische DNA, 10 pMol genspezifische Primer-up, 10 pMol genspezifische Primer-down (dwn), 1 mM dNTPs, 1xPCR Reaktionspuffer (Stratagene), 2.5 U PfuUltrahotstart DNA Polymerase (Stratagene) in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
Die 'Cycle'-Bedingungen waren 5 min. bei 94°C, 35 Zyklen mit jeweils 1 min. bei 94°C, 1 min. bei 50°C, 1 min. bei 72°C und eine anschließende Inkubation für 10 min bei 72°C. Die einzelnen PCR-Reaktionen wurden mit einem Purification-kit (Qiagen) aufgereinigt, in den Plasmidvektor pCR-blunt (invitrogen) subkloniert und jede Sequenz mittels Cycle-DNA-Sequenzierung überprüft und bestätigt.
Die mittels PCR aus humaner genomischer DNA amplifizierten Protease-Inhibitordomänen des Kunitz-Typs hatten folgende abgeleitete Aminosäuresequenzen:
Beispiel 2
Klonierung humaner Kunitz-Domänen in den Vecktor pIVEX2.3d
Für zellfreie Transkriptions- und Tranlationsexperimente wurden humane Kunitz-Domänen mittels PCR und geeigneten Restriktionsenzymen in den Vektor pIVEX2.3d kloniert. Beispielhaft ist die Klonierung der humanen Kunitz-Domäne APP4 (Amyloid beta – A4 – precursor Protein, peptidase nexin-II) gezeigt:
Flankierende und Restriktionsschnittstellen umfaßende Sequenzen (24a: NcoI: ccatgg, 24b: XmaI: cccggg) sind in Kleinbuchstaben dargestellt, Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind unterstrichen, für humane Kunitz-Domänen kodierende Sequenzen sind in Großbuchstaben dargestellt. Die PCR wurde mit einem Purification-kit (Qiagen) aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen NcoI und XmaI geschnitten und in den ebenfalls mit NcoI und XmaI geschnittenen Vektor pIVEX2.3d ligiert.
Mit dem Ligationsansatz wurden E. coli DH5α Zellen transformiert. Von dem entstandenen Klon (BezeichnungAPP4.pIVEX) wurde die Sequenz durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt.
Die kodierende Region des Klons APP4.pIVEX umfaßt 212 bp (gefogt von 2 Stop-codon), kodiert für ein Protein (APP4.pep ) von insgesamt 71 Aminosäuren und besitzt folgende Sequenz:
Aminosäure (aa) 1 und 2 am N-Terminus stammen aus dem Vektorkonstrukt, aa 3–60 repräsentieren die humane Kunitz-Domäne, aa 61–71 bestehen aus linker und einem Histidinteil (6 × His). Das Protein APP4 wurde in einem zellfreien Transkiptions- und Translationssystem (RTS, Roche) eingesetzt und es konnte erfolgreich ein Protein der erwarteten Größe (c. 8 kDa) erzeugt werden. Analog zu dem oben beschriebenen Beispiel APP4 wurden folgende humane Kunitz-Domänen jeweils in den Vektor pIVEX2.3d kloniert:
Beispiel 3
Klonierung der humanen Kunitz-Domänen in Hefe-Sekretionsvektoren pIU10.10.W und p1U3.12.M
Der kommerziell erhältliche E. coli/S. cerevisiae 'shuttle'-Vektor pYES2 (Invitrogen) wurde modifiziert und diente als Ausgangsmaterial für die Konstruktion der Hefe-Sekretionsvektoren pIU10.10.W und pIU3.12.M (Apeler, 2005).
Mittels PCR und entsprechenden Primern mit geeigneten Restriktionsschnittstellen wurden die humanen Kunitz-Domänen aus dem Vektor pIVEX2.3d in die Hefe-Sekretionsvektoren pIU10.10.W und pIU3.12.M umkloniert.
Beispielhaft ist die Klonierung der humanen Kunitz-Domäne APP4 (Amyloid beta – A4 – precursor Protein, peptidase nexin-II) gezeigt.
Die Klonierung in den Hefe-Sekretionsvektor pIU10.10.W erfolgte über die Restriktionsschnittstellen BsaBI (GAT tccc ATC in Primer 25a), und XhoI (CTCGAG in Primer 25b), für die Klonierung in pIU3.12.M wurden die Restriktionsschnittstellen HindIII (AAGCTT in Primer 26a) und BamHI (GGATCC in Primer 26b) verwendet. Eingesetzt als Template in die jeweiligen PCR-Reaktionen wurde Seq. Nr. 1.
Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Die PCR Reaktionen wurden mit einem Purification-kit (Qiagen) aufgereinigt, mit den Restriktionsenzymen BsaBI und XhoI für die Klonierung in pIU10.10.W bzw. mit HindiIII und BamHI für die Klonierung in pIU3.12.M geschnitten und in die entsprechenden Vektoren ligiert.
Mit den Ligationsansätzen wurden E. coli DH5α Zellen transformiert und von den entstandenen Klonen die DNA-Sequenz durch Sequenzanalyse bestimmt.
Abgeleitete Aminosäuresequenz der humanen Kunitz-Domäne APP4 kloniert in Hefe-Sekretionsvektor pIU10.10.W (die Pre-Sequenz des MFα – Mating Factor α – ist unterstrichen, die Aminosäuresequenz von APP4 ist fett gedruckt):
Abgeleitete Aminosäuresequenz der humanen Kunitz-Domäne APP4 kloniert in Hefe-Sekretionsvektor pIU3.12.M (die Pre-Sequenz des MFα – Mating Factor α – ist unterstrichen, die MFα-Pro-Sequenz ist kursiv, die Aminosäuresequenz der humanen Kunitz-Domäne APP4 ist fett gedruckt ): Seq. Nr. 38, SEQ ID NO: 95:
Beide Expressionskonstrukte (APP4 in Hefe-Sekretionsvektor pIU10.10.W und pIU3.12.M) wurden erfolgreich in Bäckerhefe exprimiert.
Analog wie am Beispiel der humanen Kunitz-Domäne APP4 gezeigt, wurden weitere humane Kunitz-Domänen in die Hefe-Sekretionsvektoren pIU10.10.W und pIU3.12.M kloniert. Sämtliche Konstrukte im Hefe-Sekretionsvektor pIU10.10.W enthalten jeweils die Pre-Sequenz des Mating Factors α (MFα) vor der für die humane Kunitz-Domäne kodierenden Sequenz (siehe Seq. 37), Konstrukte im Hefe-Sekretionsvektor pIU3.12.M enthalten jeweils die Pre-Pro-Sequenz des Mating Factors α (siehe Seq. 38). Als synthetische Gene wurden eingesetzt Seq. Nr. 63a–Seq. Nr. 63d und Seq. Nr. 64a–Seq. Nr. 64d (mutierte Sequenzen sind unterstrichen).
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen lauten wie folgt:
Beispiel 4
Transformation von Saccharomyces cerevisiae
Hefezellen, z. B. der Stamm JC34.4D (MATα, ura3-52, suc2) wurden in 10 ml YEPD (2% Glucose; 2% Pepton; 1% Difco Hefeextrakt) angezogen und bei einer OD₆₀₀ von 0,6 bis 0,8 geerntet. Die Zellen wurden mit 5 ml Lösung A (1 M Sorbitol; 10 mM Bicin pH 8,35; 3% Ethylenglycol) gewaschen, in 0,2 ml Lösung A resuspendiert und bei –70°C gelagert.
Plasmid DNA (5 μg) und Carrier DNA (50 μg DNA aus Herringssperma) wurden zu den gefrorenen Zellen gegeben. Die Zellen wurden anschließend durch Schütteln für 5 min bei 37°C aufgetaut. Nach Zugabe von 1,5 ml Lösung B (40% PEG 1000; 200 mM Bicin pH 8,35) wurden die Zellen für 60 min bei 30°C inkubiert, nach dem Pelletieren mit 1,5 ml Lösung C (0,15 M NaCl; 10 mM Bicin pH 8,35) gewaschen und in 100 μl Lösung C resuspendiert. Die Ausplattierung erfolgte auf einem Selektionsmedium mit 2% Agar. Transformanden wurden nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 30°C erhalten.
Beispiel 5
Fermentation der Hefezellen
Nährlösungen

Zur Fermentation von Hefezellen zur Expression von Aprotinin oder KTPI-Varianten mit modifizierter Aminosäuresequenz wurden die folgenden Nährlösungen verwendet

	Nährlösung
Einsatzstoff	SD2	SC5
Bacto-Yeast Nitrogen Base	6,7 g/l	-
Difco Bacto-Yeast Extrakt	-	20,0 g/l
Glucose	20,0 g/l	20,0 g/l
KH2PO4	6,7 g/l	6,7 g/l
(NH4)2SO4	-	2,0 g/l
MgSO4 × 7H2O	-	1,0 g/l
Spurenelementelösung 4	-	1,0 ml/l
pH-Wert nach NaOH-Titr.	6	6

SL4-Lösung:

Titriplex III	(Merck 8418)	5 g
FeSO₄·7H₂O	(Merck 3965)	2 g
ZnSO₄·7H₂O	(Merck 8883)	0,1 g
MnCl₂·4H₂0	(Merck 5927)	30 mg
H₃BO₃	(Merck 165)	0,3 g
CoCl₂·6H₂O	(Merck 2533)	0,2 g
CuCl₂·2H₂O	(Merck 2733)	10 mg
NiCl₂·6H₂O	(Merck 6717)	20 mg
Na₂MoO₄·2H₂O	(Merck 6521)	30 mg

(Ad 1000 ml in H₂O dest. lösen, pH-Wert mit NaOH auf 3–4 einstellen. Charge in max. 12 Gebinde aufteilen und bei –18°C lagern; die einzelnen Gebinde aufgetaut max. 1 Monat einsetzen.)

Die Einsatzstoffe wurden in demineralisiertem Wasser angesetzt und der pH-Wert auf pH 5,5 eingestellt. Die Sterilisation erfolgte für 20 min bei 121°C. Glucose wurde in 1/5 des erforderlichen Volumens in demineralisiertem Wasser gelöst, getrennt sterilisiert und nach dem Abkühlen zur übrigen Nährlösung gegeben.
Stammkonserven
Stammkonserven aller Hefetransformanden wurden durch Vermischung von 1-ml-Aliquots einer Vorkultur mit 1 ml 80% Glycerin-Lösung und Lagerung bei –140°C angelegt.
Vorkulturen
Die Vorkulturfermentationen wurden in 50 ml- (für Hauptkulturen im kleinen Volumen) bzw. 1-Ltr.-Schüttelkolben (für Hauptkulturen im mittleren Volumen), gefüllt mit 10 bzw. 100 ml SD2-Nährlösung durchgeführt. Die Beimpfung erfolgte mit einer Stammkonserve oder mit einer Einzelkolonie von einer SD2-Agarplatte. Die Kulturen wurden unter ständigem Schütteln (240 U/min) für 2–3 Tage bei 28–30°C inkubiert.
Hauptkulturfermentationen
Die Hauptkulturfermentationen im kleinen Maßstab erfolgte unter Verwendung von 1-Ltr.-Schüttelkolben gefüllt mit 100 ml SC5-Nährlösung. Die Beimpfung erfolgte in der Regel mit 3 ml der oben beschriebenen Vorkultur. Anschließend wurden die Kulturen unter ständigem Schütteln (240 U/min) für 4 Tage bei 28–30°C inkubiert.
Im Falle der Hauptkulturfermentation im mittleren bzw. großen Maßstab wurde auf das Bioreactor-System von Wave Biotech (Tagelswangen, CH) zurückgegriffen. Im Einzelnen wurden 1000 bzw. 10000 ml SC5-Medium mit 30 bzw. 300 ml Vorkultur angeimpft und für 4 Tage bei 30°C im Wavebag bei einer Wippfrequenz von 32/min inkubiert (Winkel: 10°; Luftzufuhr: 0,25 Ltr./min). Der pH-Wert der Kulturen wurde an Tag 1 bis 3 kontrolliert und soweit notwendig mit 5 N NaOH auf pH 5–6 adjustiert. Die Kulturen wurden an Tag 1 bis 3 gefüttert, und zwar mit je 1 ml 50%-iger Hefe-Extrakt Lösung und 4 ml 4 M Glucose-Lösung im Falle der 100 ml-Kulturen. Im Falle der 1000 und 10000 ml-Kulturen erfolgte entsprechend die Zugabe des 10 bzw. 100-fachen Volumens an Futterlösungen kontinuierlich über Tag. Zur Wachstumskontrolle konnte an verschiedenen Zeitpunkten die OD₆₀₀ der Kulturen bestimmt werden.
Nach 4 Tagen erfolgte die Ernte der zellfreien Überstände durch Zentrifugation (15 min bei 6000 UPM im JA14-Rotor).
Beispiel 6
Reinigung von humanen Kunitz-Domänen aus Überständen fermentierter Hefezellen
Die in der Hauptkulturfermentation hergestellten, die humane Kunitz-Domäne mit der Seq. Nr. 35 enthaltenden zellfreien Überstände wurden mit 1 M NaOH versetzt, bis der pH-Wert 7.8 betrug. In dem Überstand vorhandene Schwebeteilchen wurden durch Zentrifugation mit 2,000 rpm bei 4°C (15 min; Beckman-Allegra 6KR) sedimentiert. Der Überstand wurde mit 1 ml/min auf eine 10 ml Trypsinagarose-Säule (Sigma-T1763) aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit 70 ml 50 mM Tris pH 7.8, 250 mM NaCl sowie mit 50 ml 50 mM Tris pH 7.8, 600 mM NaCl gewaschen. Danach wurde mit 180 ml 50 mM KCl/10 mM HCl pH 2.0 sowie mit 100 ml 50 mM KCl/250 mM HCl pH 0.9 eluiert. Die 2 ml Fraktionen wurden in Röhrchen aufgefangen, die jeweils 500 μl 200 mM Tris pH 7.6, 2 M NaCl zum Neutralisieren enthielten. Humane Kunitz-Domänen mit der Sequenz Nr. 35 enthaltende Fraktionen wurden durch den unten beschriebenen Test über die Hemmung von Trypsin identifiziert. Trypsin-hemmende Fraktionen wurden gepoolt, mit dem gleichem Volumen 0.1% TFA gemischt und auf eine Source 15 RPC-Säule (GE Healthcare) aufgetragen. Die Säule wurde mit 6 ml 0.1% TFA (Puffer HPLC-A) gewaschen, und anschließend wurde die humane Kunitz-Domäne mit der Seq. Nr. 35 mit einem 25 ml Gradienten auf 50% Puffer HPLC-B (0.1% TFA, 60% Acetonitril) sowie einem weiteren 5 ml Gradienten auf 100% Puffer HPLC-B eluiert. Die Seq. Nr. 35 enthaltenden Eluate wurden lyophilisiert und das Lyophilisat in 250 μl 50 mM Tris pH 7.5 pro Fraktion aufgenommen.
Beispiel 7
Herstellung humaner Kunitz-Domänen durch in vitro Translation und Reinigung über Ni-NTA-Agarose
Die Kunitz-Domäne mit der Seq. Nr. 27e wurde unter Verwendung des Plasmids pIVEX2.3d mittels in vitro-Translation mit dem RTS-500 E. coli Disulfide Kit (Roche Diagnostics) nach den Vorschriften des Herstellers exprimiert.
Nach Ende der Expression wurden beide Lösungen (Reaktionslösung und Versorgungslösung) vermischt und mit 1 ml 0.1% Tween-20 versetzt. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation bei 3,000 rpm (4°C, 30 min) entfernt. Anschließend wurde der klare Überstand mit 300 μl Ni-NTA-Superflow (Qiagen) vermischt und die so entstehende Suspension unter ständiger Bewegung 90 min bei 4°C inkubiert. Die Affinitätsmatrix wurde durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand verworfen. Ni-NTA-Superflow wurde dreimal durch Inkubation mit je 1 ml 50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM Imidazol gewaschen und jeweils durch Zentrifugation sedimentiert. Anschließend wurde die an Ni-NTA-Superflow gebundene Kunitz-Domäne mit der Seq. Nr. 27e durch dreimalige Inkubation der Affinitätsmatrix mit je 900 μl 50 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 250 mM Imidazol eluiert. Die Eluate wurden gepoolt und durch Entsalzen mit NAP-25-Säulen (GE Healthcare) auf 10 mM Tris pH 7.5 umgepuffert. Nach Lyophilisation wurde die Kunitz-Domäne mit der Seq. Nr. 27e in Wasser aufgenommen und bei –80°C gelagert.
Beispiel 8
Charakterisierung von APP4 anhand der tryptischen Peptide und des Molekulargewichtes
Zur Molekulargewichtsbestimmung von APP4 wurde das gereinigte Protein mit einer 0,1% Ameisensäure Lösung auf 2 pmol/μl verdünnt und gleichzeitig sauer gestellt. Diese Probe wurde nach Trennung über eine GromSil 120 ODS-4 HE (3 μm, 250 × 0,2 mm) massenspektrometrisch analysiert. Anhand der mehrfach geladenen Molekülionen konnte das Molekulargewicht von APP4 nachgewiesen werden.
Zur genaueren Bestimmung der Aminosäurensequenz wurde das Protein nach Denaturierung mit Guanidinium Hydrochlorid mit Dithiotreitol reduziert, mittels lodacetamid derivatisiert und dann tryptisch gespalten. Die entstandenen Spaltpeptide wurden danach massenspektrometrisch analysiert und anhand der nachgewiesenen Peptidmassen sowie MS/MS-Spektren die Sequenzabdeckung von APP4 ermittelt. Hierbei konnte die gesamte Aminosäurensequenz nachgewiesen werden.
Beispiel 9
Bestimmung der inhibitorischen Potenz von humanen KTPI-Muteinen gegen Trypsin, Plasmin, FXIa und Plasmakallikrein

Die inhibitorische Potenz von humanen KTPI-Muteinen gegen die enzymatischen Aktivitäten von Trypsin, Plasmin, FXIa und Plasmakallikrein wurden in biochemischen Assays in weißen 384-Loch-Mikrotiterplatten mit Hilfe von fluorogenen Substraten bestimmt. Der Assaypuffer setzte sich zusammen aus 50 mM Tris/Cl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 0.08% (w/v) BSA. Die Testbedingungen waren im Einzelnen wie folgt:

Enzym	Enzmyendkonz.	Best.-Nr.	Substrat	Substratendkonz.	Best.-Nr.
Trypsin	5 ng/ml	T-6424 (Sigma)	Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC	5 μM	I-1100 (Bachem)
Plasmin	50 ng/ml	Hplas (Enzyme Research)	MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC	50 μM	I-1275 (Bachem)
FXIa	462 nM	HFXIa 1111a-1 (Enzyme Research)	Boc-Glu-(Obzl)-Pro-Arg-AMC	5 μM	I-1575 (Bachem)
Plasmakallikrein	1 nM	420307 (Calbiochem)	Boc-Val-Pro-Arg-AMC	80 μM	ES-011 (R&D)

Je Loch wurden 10 μl einer seriellen Verdünnung vorgelegt und mit 20 μl Enzym für 5 min bei RT vorinkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von je 20 μl Substrat gestartet. Die Messung erfolgte nach 60–90 min in einem Tecan Reader bei einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm. Dosis-Wirkungskurven und halbmaximale inhibitorische Konstanten (IC50-Werte) wurden mittels Software GraphPad Prism (Version 4.02). ermittelt. Tabelle 1: IC50-Werte einiger Kunitz-Domänen für die Hemmung von humanem Trypsin, Plasmin, Faktor XIa und Plasmakallikrein

Kunitz-Domäne	Trypsin IC50 [nM]	Plasmin IC50 [nM]	Faktor XIa IC50 [nM]	Plasmakalli-krein IC50 [nM]
Seq. A ( Aprotinin, BPTI)	11	3	393	41
Seq. Nr. 38 (APP4)	<1	299	<1	41
Seq. Nr. 42 (TFPI-1-D2)	<1	2266	2578	3714
Seq. Nr. 36 (TFPI-2-D3)	>10000	>10000	>10000	>10000
Seq. Nr. 50 (APLP-2)	<1	227	28	117
Seq. Nr. 54 (AMBP-D2)	12	692	189	377
Seq. Nr. 66 (WFI-2-D2)	24	>10000	1696	827
Seq. Nr. 63 (WFI-1-D2)	54	1042	>3000	>3000
Seq. Nr.63a (WFI-1-D2-mut1)	70	475	976	149
Seq. Nr. 63d (WFI-1-D2-mut4)	<1	11	85	5
Seq. Nr. 63c (WFI-1-D2-mut3)	<1	12	680	152
Seq. Nr. 27 (Col6A3)	>10000	>10000	>10000	>10000
Seq. Nr. 27a (Col6A3-mut1)	>10000	>10000	>10000	>10000
Seq. Nr. 27b (Col6A3-mut2)	>10000	>10000	>10000	>10000
Seq. Nr. 60d (Col6A3-mut4)	2	229	1919	287
Seq. Nr. 60e (Col6A3-mut5)	30	107	371	23

Beispiel 10
Inhibition der Fibrinolyse durch Seq. Nr. 63d (WFI-1-D2-mut-4)
Die Wirkung von WFI-1-D2-mut-4 wurde in einem in-vitro Fibrinolysemodell getestet und mit der Wirkung von Trasylol (Aprotinin) verglichen. Humanes Citratplasma wurde mit 0.13 pMTissue factor (TF) und 164 U/ml Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) sowie mit WFI-1-D2-mut-4 oder Aprotinin in verschiedenen Konzentrationen (0.1 μM bis 10 μM) versetzt und 40 min bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wurde anstelle der Kunitz-Domänen physiologische Kochsalzlösung verwendet. Die Clot-Bildung durch TF und die Clot-Lyse durch tPA wurden durch Messungen der optischen Dichte (OD₄₀₅ nm) mit einem Tecan Safire bestimmt. Die Fibrinolyse wurde definiert als die relative Abnahme der OD nach Clot-Bildung. Die Hemmung der relativen Abnahme der OD ist das Maß für die antifibrinolytische Aktivität. WFI-1-D2-mut-4 hemmte die Fibrinolyse mit einer IC₅₀ von 2.0 ± 0.2 μM. Trasylol (Aprotinin) hemmte die Fibrinolyse in diesem Modell mit einer IC₅₀ von 1.2 ± 0.2 μM. 2 beschreibt die antifbrinolytische Aktivität von WFI1-D2-mut4 in humanem Plasma.
Beispiel 11
Inhibition der intrinsischen Koagulation durch Seq. Nr. 63d (WFI-1-D2-mut-4)
Die Wirkung von WFI-1-D2-mut-4 wurde in einem in-vitro Koagulationsmodell getestet und mit der Wirkung von Trasylol (Aprotinin) verglichen. Humanes Citratplasma wurde mit 12 mM CaCl₂ zur Gerinnungsauslösung sowie mit WFI-1-D2-mut-4 oder Aprotinin in verschiedenen Konzentrationen (0.1 μM bis 30 μM) versetzt. Als Kontrolle wurde anstelle der Kunitz-Domänen physiologische Kochsalzlösung verwendet. Während der Inkubation über 90 min bei 37°C wurde der Anstieg der OD bei 405 nm als Maß für die Koagulation bestimmt. Daraus wurde die halbmaximale Koagulationszeit berechnet. Eine Verlängerung der halbmaximalen Koagulationszeit bedeutet Hemmung der Koagulation. WFI-1-D2-mut-4 hemmte die Koagulation mit einer CT2 (Verdopplung der halbmaximalen Koagulationzeit) von 0.8 ± 0.02 μM. Die CT2 für Trasylol (Aprotinin) lag bei 12 ± 0.2 μM
3 beschreibt die antikoagulierende Aktivität von WFI1-D2-mut4 in humanem Plasma.
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- Van Notstrand et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 9591–9594 [0091]
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- Yang et al., 1996, Genomics 35, 24–29 [0091]

Claims

Ein isoliertes Protein oder Polypeptid, welches eine Kunitz-Domäne enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäß Aprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist: X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = HX19 = P, X20 = R, X21 = W, X22 = W, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten; oder dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäßAprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist: X10 = V, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten; oder dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäßAprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist: X10 = E, X11 = T, X15 = R oder K, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten; oder dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäßAprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist: X10 = V, X11 = T, X15 = R , X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21= F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten; oder dadurch gekennzeichnet, dass die Domäne an den gemäßAprotinin nummerierten Positionen folgende Aminosäuren aufweist: X10 = E, X11 = T, X15 = R, X16 = A, X17 = A, X18 = M, X19 = K, X20 = R, X21 = F, wobei die übrigen Positionen beliebige Aminosäuren humaner Kunitz-Domänen enthalten.
Ein isoliertes Protein gemäß Anspruch 1, wobei die übrigen Positionen der Kunitz Domäne Aminosäuren einer bestimmten humanen Kunitz Domäne enthalten.
Ein isoliertes Protein oder Polypeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 60d (COL6A3-mut4, SEQ ID NO: 121), Seq. Nr. 60e (COL6A3-mut5, SEQ ID NO: 122), Seq. Nr. 63a (WFI1-D2-mut1, SEQ ID NO: 126), Seq. Nr. 63c (WFI1-D2-mut3, SEQ ID NO: 128), Seq. Nr. 63d (WFI1-D2-mut4, SEQ ID NO: 129) und Seq. Nr. 64e (WFI1-D2-mut5-pIU3.12.M, SEQ ID NO: 146).
Ein Fragment eines Proteins oder Polypeptids gemäß Ansprüchen 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment eine inhibitorische Wirkung gegenüber Plasmin, Plasmakallikrein, oder Faktor XIa aufweist, die mit der Wirkung des Aprotinins vergleichbar oder besser als die Wirkung des Aprotinins ist.
Eine Nukleinsäure, welche für ein Polypeptid oder Protein gemäß Ansprüchen 1–4 kodiert.
Die Nukleinsäure gemäß Anspruch 5, enthaltend heterologe Vektorsequenzen oder eine heterologe Promotorsequenz 5' zur kodierenden Region.
Zelle, eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 6 enthaltend.
Nicht-humaner Organismus, eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 6 enthaltend.
Eine Methode zur Isolierung eines Polypeptides oder Proteins gemäß Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle gemäß Anspruch 7 kultiviert wird und das Protein aufgereinigt wird.
Ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, spezifisch für ein Protein gemäß Ansprüchen 1–4.
Ein Protein oder Polypeptid gemäß Ansprüchen 1–4 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, ein Protein gemäß Ansprüchen 1–4 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 enthaltend.
Ein Protein oder Polypeptid gemäß Ansprüchen 1–4 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 als Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem), Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns und Tendinopathie.
Ein Protein oder Polypeptid gemäß Ansprüchen 1–4 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 als Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, und Wundheilung.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß Ansprüchen 1–4 oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem), Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns und Tendinopathie.
Verwendung eines Proteins oder Polypeptids gemäß Ansprüchen 1–4 oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, und Wundheilung.
Ein Protein enthaltend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 38 (SEQ ID NO: 95, APP4), Seq. Nr. 50 (SEQ ID NO: 107, APLP-2), und Seq. Nr. 54 (SEQ ID NO: AMBP-D2) oder eine Nukleinsäure, die solche Proteine kodiert als Arzneimittel.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung beinhaltend ein Protein enthaltend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 38 (SEQ ID NO: 95, APP4), Seq. Nr. 50 (SEQ ID NO: 107, APLP-2), und Seq. Nr. 54 (SEQ ID NO: AMBP-D2) oder eine Nukleinsäure, die solche Proteine kodiert.
Ein Protein enthaltend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 38 (SEQ ID NO: 95, APP4), Seq. Nr. 50 (SEQ ID NO: 107, APLP-2), und Seq. Nr. 54 (SEQ ID NO: AMBP-D2) oder eine Nukleinsäure, die solche Proteine kodiert als Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem), Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns und Tendinopathie.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung beinhaltend ein Protein enthaltend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 38 (SEQ ID NO: 95, APP4), Seq. Nr. 50 (SEQ ID NO: 107, APLP-2), und Seq. Nr. 54 (SEQ ID NO: AMBP-D2) oder eine Nukleinsäure, die solche Proteine kodiert zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Polytrauma, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), instabile Angina, Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, entzündliche Erkrankungen (z. B. Rheuma, Asthma), invasives Tumorwachstum und Metastasierung, Schmerz-und Ödemtherapie (Gehirnödem, Rückenmarksödem), Verhinderung der Aktivierung der Hämostase bei Dialysebehandlung, Behandlung von Symptomen der Hautalterung (Elastose, Atrophie, Faltenbildung, Gefäßveränderungen, Pigmentveränderungen, aktinische Keratose, Mitesser, Zysten), Wundheilung, Hautkrebs, Behandlung von Symptomen des Hautkrebses (aktinische Keratose, Basalzellkarzinom, Schuppenzellkarzinom, malignes Melanom), multiple Sklerose, Fibrose, Gehirnblutung, Entzündungen des Gehirns und des Rückenmarks, Infektionen des Gehirns und Tendinopathie.
Ein Protein enthaltend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq. Nr. 38 (SEQ ID NO: 95, APP4), Seq. Nr. 50 (SEQ ID NO: 107, APLP-2), und Seq. Nr. 54 (SEQ ID NO: AMBP-D2) oder eine Nukleinsäure, die solche Proteine kodiert als Arzneimittel zur Behandlung von Zuständen oder Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blutverlust bei Operationen mit erhöhtem Blutungsrisiko; thromboembolische Zustände, Schock, Sepsis, disseminierte intravasale Gerinnung (DIC), Multiorganversagen (MOF), Herzinfarkt, Schlaganfall, Embolie, tiefe Venenthrombosen, und Wundheilung.