DE102009024603A1 - Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Biosilica als Bestandteil einer bioaktiven Zahnpasta und Verwendung - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, die auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse ein Polypeptid eingesetzt wird, das eine Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne umfasst. Das Polypeptid kann entweder an Polylactid-Nanosphären oder über eine Oligo-Glutamat-Sequenz an die Oberfläche des Zahnhartgewebes (Enamels) gebunden sein.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, die auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse ein Polypeptid eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist. Dieses Verfahren ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt werden.
- Biomoleküle, die an der Kontrolle von natürlichen Prozessen der Biomineralisation im nanoskaligen Bereich beteiligt sind, haben in den letzten Jahren zunehmendes Interesse in der Nano(bio)technologie gefunden.
- Beispiele für „Nanotechnologie in der Natur” sind die aus Calciumcarbonat-Kristallen (Aragonit) bestehenden Perlen oder die aus Calcit-Kristallen aufgebauten Schalen der Abalone-Muscheln, die durch den Einbau spezifischer Proteine neue, vorteilhafte Materialeigenschaften erlangen, oder das optische Mikrolinsensystem des Seesterns Ophiocoma wendtii. Insbesondere besitzen einige marine oder aquatische Organismen wie die Diatomeen und die Kieselschwämme die Fähigkeit, Skelettstrukturen aus biogenem Silica aufzubauen.
- Siliciumdioxid (SiO2) kommt in kristalliner und in amorpher Form vor. Amorphes SiO2 („Biosilica”) ist das Material, aus dem die durch Biomineralisation gebildeten Skelettstrukturen vieler ein- und vielzelliger Organismen bestehen, wie die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen) und die Nadeln (Spicula) von Kieselschwämmen.
- Kieselschwämme besitzen die einzigartige Fähigkeit, Silica (”Biosilica”) unter milden Bedingungen – bei Raumtemperatur – über einen enzymatischen Mechanismus zu bilden (Shimizu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6234–6238). Chemische Methoden zur Herstellung von Silica erfordern dagegen die Anwendung hoher Temperaturen, Drucke und aggressiver Chemikalien. Das von den Schwämmen produzierte Biosilica dient zum Aufbau ihrer nadelförmigen Skelettelemente („Spicula”) (Müller et al. (2005) FERS J. 272, 3838–3852; Müller et al. (2006) Micron 37, 107–120).
- Die beteiligten Enzyme (Silicateine; siehe
1A ) wurden aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula und einer Reihe weiterer Schwämme kloniert (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887) und ihre technische Verwendung beschrieben; bei dem zuerst beschriebenen Enzym handelt es sich um Silicatein-α (auch lediglich Silicatein genannt) (PCT/US99/30601 DE 10037270 A1 . Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches Patentamt 2000. Anmelder und Erfinder: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC;PCT/EP01/08423 EP 1320624 undUS-Patent US 7,169,589 B2 . Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants: Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC). - Mit Hilfe dieser Enzyme ist es möglich, Glas-ähnliche Materialien im Nano-Maßstab bei Raumtemperatur herzustellen (Schröder et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 12001–12009; Schröder et al. (2007) Naturwissenschaften 94, 339–359). Die Silicateine können in Escherichia coli exprimiert werden. Die erhaltenen rekombinanten Proteine sind in der Lage, aus Siliziumalkoxiden oder Kieselsäure/Orthosilicat Polysilicate bei Raumtemperatur, neutralem pH und in wässrigen Puffersystemen zu bilden.
- In Demospongien (marine Schwämme und Süßwasserschwämme) konnten verschiedene Isoformen von Silicatein identifiziert werden (Müller et al. (2007) Gene 395, 62–71). In Meeresschwämmen wie S. domuncula kommen zwei Silicatein-Isoformen vor: Silicatein-α und Silicatein-β (Krasko et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 4878–4887; Schröder et al. (2004) Cell Tissue Res. 316, 271–280; Müller et al. (2007) Gene 395, 62–71; Patentanmeldung Silicatein-β:
DE 103 52 433.9 . Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. Deutsches Patentamt 2003. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Schwertner H, Schröder HC), in Süßwasserschwämmen wie Lubomirskia baicalensis sogar vier Silicatein-Isoformen (Wiens et al. (2006) Dev. Genes Evol. 216, 229–242; Patentanmeldung:DE102006001759.5 ). Diese konnten kloniert und rekombinant dargestellt werden. - Die Silicateine gehören zur Cathepsin-Familie der Proteasen; die größte Ähnlichkeit besteht mit Cathepsin L. Die Silicateine unterscheiden sich jedoch von diesen Enzymen durch den Ersatz des Cysteinrestes im aktiven Zentrum durch einen Serinrest (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887), der wahrscheinlich essentiell für den katalytischen Mechanismus des Enzyms ist (
2 ). Weiterhin besitzen sie ein Cluster aus Hydroxyaminosäuren (Serin-Cluster), das an der Oberfläche des Moleküls lokalisiert ist und als Templat bei der Präzipitation von Biosilica dient. - Ebenfalls gelang es, aus S. domuncula ein Enzym („Silicase”) zu klonieren, das in der Lage ist, amorphes Siliciumdioxid aufzulösen (Schröder HC, Krasko A, Le Pennec G, Adell T, Wiens M, Hassanein H, Müller IM, Müller WEG (2003) Silicase, an enzyme which degrades biogenous amorphous silica: Contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula. Progr Molec Subcell Biol 33: 250–268; Deutsches Patent
DE10246186 . Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. Deutsches Patentamt 2002. Anmelder: Johannes Gutenberg-Universität Mainz; Erfinder: Müller WEG, Krasko A, Schröder HC) (1B ). Das Silica-anabole Enzym Silicatein sowie das Silica-katabole Enzym Silicase (1B ) sind von außerordentlichem Interesse für eine Vielzahl von Anwendungen in der Nanobiotechnologie. - Das rekombinante Silicatein (His-tagged Silicatein) behält seine katalytische Aktivität auch nach Immobilisierung an Oberflächen (Tahir et al. (2004) Chem. Commun. 2848–2849). Silicatein kann an die Oberfläche von Gold nach Funktionalisierung mit Nitrilotriessigsäure(NTA)-Alkanthiol immobilisiert werden. Das rekombinante Protein bindet dabei über sein Histidin-Tag an den Chelatbildner NTA-Alkanthiol durch Bildung eines Ni2 +-Komplexes, an dem beide Moleküle beteiligt sind. Die Bildung von Biosilica durch das immobilisierte Protein konnte mit Hilfe verschiedener Techniken wie Raster-Kraft-Mikroskopie („Scanning Force Microscopy”; SFM) und Rasterelektronenmikroskopie („Scanning Electron Microscopy”; SEM) nachgewiesen werden (Tahir et al. (2004) Chem. Commun. 2848–2849).
- Silicatein ist auch zur Katalyse der Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid (TiO2) und Zirkoniumdioxid (ZrO2) aus wasserstabilen Präkursoren in der Lage (Tahir et al. (2005) Chem. Commun. 28: 5533–5535). Es wurde auch ein Verfahren zur Immobilisierung von His-Tag-Silicatein an TiO2-Nanodrähte beschrieben (Angew. Chem. Int. Ed. 45, 4803–4809, 2006; Patentanmeldung:
DE102006001759.5 ). - Silica ist ein wichtiger Bestandteil von Materialien („bioaktive Gläser”), die als Gerüst beim Tissue Engineering benutzt werden. Es wurde beschrieben, dass die Mineralisierung (Bildung von Calciumphosphat) von humanen Osteobiastenzelllinien (SaOS-2-Zellen) stark ansteigt, wenn sie auf Kulturplatten wachsen, die mit enzymatisch, über Silicatein gebildetem Biosilica beschichtet worden waren (Schröder et al. (2005) J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 75B: 387–392;
DE102004021229.5 ). - Ein Vorteil der enzymatisch (Silicatein) vermittelten Beschichtung liegt in den Eigenschaften von Silicatein selbst. Das Enzym besitzt sowohl anabole (Silica-Polymerase) als auch katabole Aktivität (Silica-Esterase). Deshalb ermöglicht es die Herstellung einer flexiblen Silica-Hülle, die – über die Esterase-Aktivität von exprimierten Silicateins – umgebaut oder perforiert werden kann.
- Der wahrscheinliche der Silica-Esterase-Aktivität von Silicatein zugrunde liegende Mechanismus ist in
2A gezeigt. Angenommen wird, dass die Hydrolyse von Oligo/Polysilicat-Substraten auf einem nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe des Serinrestes im aktiven Zentrum des Silicateins an einem der Siliziumatome des polymeren Substrats basiert. Dabei wird die Sauerstoffbindung in dem polymeren Silicat gespalten. Diese Reaktion wird durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Imidazol-Stickstoff des Histidins und der Hydroxylgruppe des Serins im aktiven Zentrum erleichtert, was zu einem Anstieg der Nukleophilie des Serin-Sauerstoffs führt. Die transiente kovalente Bindung zwischen Enzym und Substrat wird dann durch Wasser unter Freisetzung von Kieselsäure hydrolysiert.2B zeigt den wahrscheinlichen Mechanismus der Silica-Polymerase-Aktivität von Silicatein. Der Histidinrest im aktiven Zentrum des Enzyms fungiert als Säure-Base-Katalysator. Die Übertragung eines Protons von der Orthokieselsäure zu dem Imidazol-Stickstoff führt zur Bildung einer reaktiven Silicat-Spezies, die in der Lage ist, ein zweites Orthosilicat-Molekül anzugreifen. Das gebildete negative geladene, pentavalente Intermediat wird dann in Dikieselsäure (oder höhere Oligomere) überführt unter Freisetzung von Wasser, das durch Übertragung eines Protons vom protonierten Imidazolring des Histidinrestes gebildet wird. - Beschrieben wurde auch ein „osteoinduktives” biomimetisches Nanokomposit-Füllmaterial, das auf enzymatisch (über Silicatein) synthetisiertem Biosilica basiert. Dieses Biosilica-Silicatein-Füllmaterial fördert die Rekrutierung von Osteoblasten und den natürlichen Biomineralisationsprozess (Apatit-Bildung). Als organische Komponente enthält es entweder Silicatein alleine oder in Kombination mit Schmelzprotein („Amelogenin”) oder Seidenfibroin (adhäsives Protein) (USPTO-Patentantrag
US 60/839,601 PCT/EP2007/007363 - Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, die auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse ein Polypeptid eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit, insbesondere 25% Sequenzidentität, weiter bevorzugt 50%, 75%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt werden.
- Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass es gelingt, eine dichte und fest haftende Versiegelung der Zahnoberfläche mit einer Biosilica-Nanoschicht zu erzielen. Hierbei kommt es auch zum Verschluss feinster Fissuren, dadurch bedingt, dass sich die enzymatisch gebildeten Biosilica-Nanopartikel auf Grund ihres geringen Durchmessers diesen Fissuren flexible anpassen können.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird allgemein ein Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta beschrieben, das auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei das Polypeptid an die Oberfläche von Polylactid-Nanosphären gebunden wird. Polylactide (PLA) sind bioabbaubare Polymere.
- Zur Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären kann ein bifunktioneller Linker verwendet werden, wobei der bifunktionelle Linker aus einem Polymer besteht, das Nitrilotriessigsäure-Gruppen enthält, wobei diese Gruppen an das mit einem Histidin-Tag verknüpften Polypeptid, das eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit, insbesondere 25% Sequenzidentität, weiter bevorzugt 50%, 75%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist, über Nickel-Komplexierung gebunden werden.
- Alternativ kann die Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären über physikalisch-chemische Wechselwirkung erfolgen.
- Bisher war nicht bekannt und nicht aus dem Stand der Technik zu erkennen, dass es möglich ist, durch eine enzymkatalytische Reaktion die Versiegung der Oberfläche von Zahnhartgewebe (Enamel) erreichen.
- Bei dem enzymgemäßen Verfahren werden die zur Versiegelung benötigten Komponenten als Bestandteil einer Zahnpasta hinzugefügt.
- Es wird weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta eingesetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid, das zur enzymkatalysierten Bildung von aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehenden Nanopartikeln (Nanosphären) benötigt, in Polylactid-Nanosphären eingeschlossen wird.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids vor Anwendung der Zahnpasta silizifiziert, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, wobei als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion Kieselsäure, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt wird.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Silizifizierung der Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids bei Anwendung der Zahnpasta, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, auch dadurch erfolgen, dass das Substrat der enzymkatalytischen Reaktion bei der Anwendung als zweite Komponente einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta bereitgestellt wird.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann zur Silizifizierung der Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, bei Anwendung der Zahnpasta auch dadurch erfolgen, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion die im Speichel oder der Nahrung natürlich vorhandenen Kieselsäure- und Silicat-Moleküle dienen.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta beschrieben, wobei das zur Enzymkatalyse verwendete Polypeptid an die Oberfläche des Zahnhartgewebes (Enamels) gebunden wird, dadurch dass das Polypeptid eine Oligo-Glutamat-Sequenz aufweist. Bei dem eine Oligo-Glutamat-Sequenz aufweisenden Polypeptid kann es sich um ein rekombinant hergestelltes Fusionsprotein handeln. Als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion können Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt werden.
- Hierbei kann die Silizifizierung bei Anwendung der Zahnpasta auch dadurch erfolgen, dass das Substrat der enzymkatalytischen Reaktion bei der Anwendung als zweite Komponente einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta bereitgestellt wird.
- Ebenfalls kann hierbei die Versiegelung des Zahnhartgewebe (Enamel) mit Hilfe des an deren Oberfläche gebundenen enzymkatalytisch aktiven Polypeptids auch dadurch erfolgen, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion die im Speichel oder der Nahrung natürlich vorhandenen Kieselsäure- und Silicat-Moleküle dienen.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kieselsäure-enthaltende Versiegelung von Zahnhartgewebe (Enamel), die nach einem Verfahren der voranstehenden Ansprüche erhalten wurde.
- Das erfindungsgemäße Polypeptid (Silicatein-α- oder Silicatein-β aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit, insbesondere 25% Sequenzidentität, weiter bevorzugt 50%, 75%, 80%, 90% oder 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz besitzt) kann, neben der natürlichen Form, ferner dadurch gekennzeichnet sein, dass es synthetisch hergestellt worden ist oder dass das Polypeptid in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder -lysat vorliegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex vivo oder ex vitro gewonnen werden, zum Beispiel einer rekombinanten bakteriellen Zelle oder einem Meeresschwamm.
- Das erfindungsgemäße Polypeptid kann nach herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden und somit im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorliegen.
- Die Eigenschaften der für das Silicatein-α-Polypeptid und das Silicatein-β-Polypeptid aus S. domuncula codierende cDNAs sowie die aus der Nucleotidsequenz abgeleiteten Polypeptide wurden beschrieben (
PCT/US99/30601 DE 10037270 A1 ;PCT/EP01/08423 DE 103 52 433.9 ). - Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den beigefügten Abbildungen und den Sequenzprotokollen aufgeführt. Es zeigen:
- SEQ ID No. 1: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Silicatein-α-Polypeptids aus S. domuncula.
- SEQ ID No. 2: Die Nukleinsäuresequenz der cDNA des erfindungsgemäßen Silicatein-α- Polypeptids aus S. domuncula.
- SEQ ID No. 3: Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Silicateins-β aus S. domuncula (SIA_SUBDO).
- SEQ ID No. 4: Die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Silicateins-β aus S. domuncula.
- In den Figuren zeigt:
-
1 : Computer-Modelle der Silica-metabolen Enzyme. (A) Silica-Synthese-Enzym: Silicatein. Die drei Aminosäuren des aktiven Zentrums („catalytic centre”; cc) sind rot markiert. Die Aminosäuren des Serin-Clusters sind grün markiert. (B) Silica-Abbau-Enzym: Silicase. Die drei Histidin-Reste (Bindung von Zn2+) im aktiven Zentrum des Enzyms sind rot markiert. -
2 : Silica-Esterase-Aktivität (A) und Silica-Polymerase-Aktivität (B) von Silicatein. -
3 : Ergebnisse für die Probe Nr. 2 (50 nm Silica-Nanosphären). -
4 : Amplifikation der für das Hydroxylapatit-bindende Silicatein-α-Protein codierenden cDNA. -
5 : Ligation des Amplikons mit dem bakteriellen Expressionsvektor pTRC-His2 (Invitrogen) über T/A Klonierung. - 2.2. Herstellung der Silicatein-Polypeptide
- Die Silicatein-Polypeptide können aus Geweben oder Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt werden.
- 2.2.1. Reinigung der Silicatein-Polypeptide aus natürlichen Quellen
- Die Reinigung des Silicatein-α und Silicatein-β kann aus isolierten Spicula von Schwämmen durchgeführt werden.
- 2.2.2. Herstellung der rekombinanten Silicatein-Polypeptide
- Die cDNAs für Silicatein-α und -β werden von einer cDNA-Bibliothek des Schwammes Suberites domuncula, die beispielsweise in einem pBK-CMV-Vektor (Stratagene) hergestellt wird, isoliert. Die den reifen Proteinen entsprechenden offenen Leseraster (ORF) werden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Benutzung geeigneter Primer erhalten.
- Die Herstellung der rekombinanten Proteine (Silicatein-α: SEQ ID No. 1; Silicatein-β: SEQ ID No. 3) kann in E. coli erfolgen. Auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich. Hierzu wird die jeweilige cDNA in einen Expressionsvektor, z. B. pQE-30, einkloniert. Nach Transformation von E. coli wird die Expression der Proteine durch mit IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert (Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York). Die Aufreinigung der rekombinanten Proteine über das Histidin-Tag wird an einer Ni-NTA-Matrix durchgeführt.
- Zwischen Oligohistidin und Silicatein kann eine Sequenz, die der Enterokinase-Spaltstelle entspricht, eingebracht werden. Das Fusionsprotein wird dann mit Enterokinase gespalten.
- Alternativ kann zur Expression der rekombinanten Proteine z. B. das „GST (Glutathion-S-Transferase) Fusions”-Systems (Firma Amersham) benutzt werden. Es können zwei Inserte benutzt werden, um potentielle Effekte von Signalpeptiden während der Expression zu eliminieren; ein Insert umfasst das gesamte abgeleitete Protein (lange Form) und das andere Insert lediglich den aktiven Bereich (kurze Form). Die entsprechenden Klone werden in das Plasmid pGEX-4T-2 eincloniert, welches das GST-Gen von Schistosoma japonicum enthält. Nach Transformation von E. coli wird die Expression der Proteine durch IPTG induziert. Die erhaltenen GST-Fusionsproteine werden durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose 4B gereinigt. Zur Abtrennung der Glutathion-S-transferase werden die Fusionsproteine mit Thrombin gespalten.
- Eine weitere Alternative (benutzt für die hier beschriebenen Experimente) ist die Herstellung des rekombinanten Silicatein-α in E. coli unter Benutzung des Oligo-Histidin-Expressionsvektors pBAD/gIIIA (Invitrogen), bei dem auf Grund der Gen III- Signalsequenz das rekombinante Protein in den periplasmatischen Raum sezerniert wird. Die für das Silicatein-α kodierende cDNA-Sequenz (SEQ ID No. 2) wird mittels PCR unter Verwendung folgender Primer amplifiziert (kurze Form des Silicatein-α): Forward Primer: TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC und Reverse Primer: TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC; und in pBAD/gIIIA einkloniert (Restriktionsnucleasen zur Insertion in den Expressionsvektor: NcoI und XbaI). Nach Transformation von E. coli XL1-Blue wird die Expression des Fusionsproteins mit L-Arabinose induziert.
- Ebenso kann auch ein Insert benutzt werden, welches das gesamte abgeleitete Silicatein-α-Protein (lange Form) umfasst.
- Auf analoge Weise kann eine kurze und eine lange Form des Silicatein-β (cDNA: SEQ ID No. 4; davon abgeleitete Aminosäuresequenz: SEQ ID No. 3) exprimiert werden.
- 2.3. Mikroemulsions-Verfahren zur Herstellung der Polylactid-Silica-Nanosphären (Synthese der Nanosphären mittels Silicatein)
- Die Silicatein-enthaltenden Nanosphären werden wie folgt hergestellt: 5 ml Cyclohexan, Triton X-100, TEOS und Silicatein. Als Kontrollen werden NH3, BSA und Ansätze ohne Katalysator benutzt. Üblicherweise werden das Detergens und TEOS in Cyclohexan gelöst und für 30 min bei Raumtemperatur zur Bildung der Mikroemulsion gerührt. Danach wird rekombinantes Silicatein hinzugegeben um die Silica-Polymerisation in Gang zu setzen. Die Reaktion erfolgt für 3 h bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation werden die Polylactid-Silica-Nanosphären durch Präzipitation mittels Aceton gesammelt und bei 5000 Upm und Raumtemperatur für 10 min zentrifugiert. Die Nanosphären werden dann zweimal mit Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen, um das Detergens und nicht reagierte Silica-Monomere zu entfernen. Die Proben werden mittels Transmissionelektronenmikroskopie (TEM) analysiert.
- Verschiedene Verhältnisse zwischen Detergens (Triton X-100), TEOS und rekombinantem Silicatein können wie in der folgenden Tabelle beschrieben benutzt werden. Tabelle 1. Zusammensetzung der möglichen Kombinationen zur Herstellung der Polylactid-Silica-Nanosphären
Zusammensetzung Probe Hexan (mL) Triton X-100 (μL) TEOS (μL) Silicatein (0.04 mg/mL in PBS) (μL) 1 5 450 40 50 2 5 600 40 50 3 5 750 40 50 4 5 600 25 50 5 5 600 50 50 6 5 600 75 50 7 5 600 40 10 8 5 600 40 50 9 5 600 40 100 Kontrolle 5 600 40 - BSA 5 600 40 - NH3 5 600 40 - - Die für die Probe Nr. 2 (50 nm Silica-Nanosphären) erhaltenen Ergebnisse sind in
3 gezeigt. - Anstatt von TEOS kann auch Natriummetasilicat eingesetzt werden. Die Polylactid-Silica-Nanosphären können in HF und SDS/WB gelöst werden.
- 2.4. Herstellung des rekombinanten Hydroxylapatit-bindenden Silicatein-α-Proteins
- Den Erfindern gelang die Herstellung eines rekombinanten Silicateins, welches durch die Präsenz eines 6 × His-Tags nicht nur durch Ni-NTA Metal-Affinity Chromatographie aufgereinigt, sondern auch durch die Präsenz eines 8 × Glu Tags Hydroxyapatit-bindende Eigenschaften besitzt und somit z. B. als Additiv in Zahnreinigungsprodukten eingesetzt werden kann.
- Die Vorgehensweise zur Herstellung des Hydroxylapatit-bindenden Silicatein-α-Proteins ist wie folgt:
- (1) Einsatz von Oligonukleotiden
zur Herstellung eines modifizierten Silicatein-α Amplikons:
Primer-Design.
Als Forward Primer kann beispielsweise dienen: Unterstrichen: HA-bindender Glu-Tag Rot-markiert: Beginn des reifen Silicatein-Proteins Als Reverse Primer kann beispielsweise dienen:Fett-markiert: das letzte, für reifes Silicatein-α kodierende Codon
- (2) PCR: Die Amplifikation ist bei allen Annealing-Temperaturen
(56–60°C) erfolgreich (
4 ) - (3) Ligation des Amplikons mit dem bakteriellen Expressionsvektor
pTRC-His2 (Invitrogen) über T/A Klonierung (
5 ). - (4) Klonierung des Konstrukts in E. coli BL21 Zellen (Invitrogen)
- (5) Isolierung von 10 Kolonien, welche das korrekte Konstrukt integriert haben
- Das finale rekombinante Protein hat folgendes Aussehen:
- Tags sind unterstrichen, Vektorsequenzen kursiv.
- Die einzelnen Klone werden mit 1 mM IPTG (2–8 h) zur Synthese des rekombinanten Proteins stimuliert.
- 2.5. Bestimmung der Silicatein-Aktivität
- Zur Bestimmung der Enzymaktivität der (rekombinanten) Silicateine kann ein Assay angewandt werden, der auf der Messung von polymerisiertem und präzipitiertem Silica nach Hydrolyse und nachfolgender Polymerisation von Tetraethoxysilan (TEOS) basiert. Hierbei wird das Enzym üblicherweise in 1 ml eines MOPS-Puffers (pH 6,8) gelöst und mit 1 ml einer 1–4,5 mM Tetraethoxysilan-Lösung versetzt. Die enzymatische Reaktion wird für verschieden lange Zeiten üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Zum Nachweis der Silica-Produkte wird das Material abzentrifugiert, mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend wird das Sediment mit 1 M NaOH hydrolysiert. In der entstandenen Lösung wird unter Anwendung eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens (Silicon-Assay von Fa. Merck) das freigesetzte Silicat quantitativ gemessen.
- 2.6. Bestimmung der Silica-Bildung
- Die funktionelle Aktivität der Silicateingenprodukte und die Silicatein-vermittelte Bildung und physikalisch-chemischen Charakteristika der porösen (Bio)silica-Nanoschichten (Versiegelungen) werden mit Hilfe verschiedener Methoden analysiert (SEM, SDS-PAGE, Molybdat-Assay der Silica-Bildung in Gegenwart von exogenem Na-Silicat oder Tetraethoxysilan, Zymographie etc.).
- Die Bildung von Biosilica wird durch Färbung der sich bildenden Silica-Partikel mit dem Fluorochrom Rhodamine 123 (Einbau des Fluorochroms in die sich bildenden Partikel) oder mit Hilfe des β-Silicomolybdato-Farbsystems (Silicat-Nachweisreagens ”Aquaquant kit”) bestimmt (Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 361–365; Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267: 4878–4887). Weiterhin können die Proben mittels EDX („Energy Dispersive X-ray”)-Analyse analysiert werden.
- Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
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Claims (17)
- Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, umfassend den Schritt einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen, wobei zur Enzymkatalyse ein Polypeptid eingesetzt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne umfasst, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilandiole, Trialkoxysilanole oder Tetraalkoxysilane oder Chelat-Komplexe der Kieselsäure eingesetzt werden.
- Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid an die Oberfläche von Polylactid-Nanosphären gebunden wird.
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei zur Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären ein bifunktioneller Linker verwendet wird.
- Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der bifunktionelle Linker aus einem Polymer besteht, das Nitrilotriessigsäure-Gruppen enthält, wobei diese Gruppen an das mit einem Histidin-Tag verknüpfte Polypeptid über Nickel-Komplexierung gebunden werden.
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bindung des Polypeptids an die Polylactid-Nanosphären über physikalisch-chemische Wechselwirkung erfolgt.
- Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta, die auf einer enzymkatalysierten Bildung von Nanopartikeln basiert, die aus amorphem Siliciumdioxid (Silica) bestehen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid in Polylactid-Nanosphären eingeschlossen wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids vor Anwendung der Zahnpasta silizifiziert werden, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, wobei als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion ein Substrat nach Anspruch 2 eingesetzt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids bei Anwendung der Zahnpasta silizifiziert werden, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, wobei das Substrat der enzymkatalytischen Reaktion nach Anspruch 2 bei der Anwendung als zweite Komponente einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta bereitgestellt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Polylactid-Nanosphären mit Hilfe des an die Oberfläche gebundenen oder eingeschlossenen enzymatisch-aktiven Polypeptids bei Anwendung der Zahnpasta silizifiziert werden, entweder durch Bildung einer Silica-Schale auf der Oberfläche der Nanosphären oder durch Bildung eines Silica-Kerns, wobei als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion die im Speichel oder der Nahrung natürlich vorhandenen Kieselsäure- und Silicat-Moleküle dienen.
- Verfahren zur Herstellung einer bioaktiven, Zahnhartgewebe (Enamel) versiegelnden Zahnpasta nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das zur Enzymkatalyse verwendete Polypeptid durch eine Oligo-Glutamat-Sequenz an die Oberfläche des Zahnhartgewebes (Enamels) gebunden wird.
- Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem eine Oligo-Glutamat-Sequenz aufweisenden Polypeptid um ein rekombinant hergestelltes Fusionsprotein handelt.
- Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion eine Verbindung nach Anspruch 2 verwendet wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Versiegelung des Zahnhartgewebes (Enamel) mit Hilfe des an dessen Oberfläche gebundenen enzymkatalytisch aktiven Polypeptids durch Silizifizierung bei Anwendung der Zahnpasta dadurch erfolgt, dass das Substrat der enzymkatalytischen Reaktion nach Anspruch 13 bei der Anwendung als zweite Komponente einer Zwei-Komponenten-Zahnpasta bereitgestellt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Versiegelung des Zahnhartgewebe (Enamel) mit. Hilfe des an deren Oberfläche gebundenen enzymkatalytisch aktiven Polypeptids durch Silizifizierung bei Anwendung der Zahnpasta dadurch erfolgt, dass als Substrat der enzymkatalytischen Reaktion die im Speichel oder der Nahrung natürlich vorhandenen Kieselsäure- und Silicat-Moleküle dienen.
- Kieselsäure-enthaltende Versiegelung von Zahnhartgewebe (Enamel), die nach einem Verfahren der voranstehenden Ansprüche erhalten wurde.
- Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid des Silicatein-α- oder Silicatein-β aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Silicatein-α- oder Silicatein-β-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz besitzt, in vivo, in einem Zellextrakt oder -lysat oder in gereinigter Form zur Verfügung gestellt wird.
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| DE102009024603A DE102009024603A1 (de) | 2009-06-10 | 2009-06-10 | Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Biosilica als Bestandteil einer bioaktiven Zahnpasta und Verwendung |
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| DE102009024603A DE102009024603A1 (de) | 2009-06-10 | 2009-06-10 | Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Biosilica als Bestandteil einer bioaktiven Zahnpasta und Verwendung |
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