DE102014018308A1

DE102014018308A1 - Temperierkörper für eine Multiwell-Platte und Verfahren und Vorrichtung zum Einfrieren und/oder Auftauen von biologischen Proben

Info

Publication number: DE102014018308A1
Application number: DE102014018308.4A
Authority: DE
Inventors: Günter R. Fuhr; Heiko Zimmermann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2016-06-16
Also published as: KR20170093173A; WO2016091344A3; WO2016091344A2; KR102103237B1; JP6715841B2; CN107257710A; CN107257710B; US10987673B2; EP3229965A2; JP2018510321A; US20170333905A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Temperierkörper (4) für eine Multiwell-Platte (1), die eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten (2) aufweist, zum Einfrieren und/oder zum Auftauen von biologischen Proben. Der Temperierkörper (4) umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper (6) aus einem thermisch leitfähigen Material; und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers (6) in Reihen und Spalten angeordnete abragende Temperierfinger (5), die thermisch leitend mit dem Grundkörper (6) verbunden sind, wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger (5) einem Rasterabstand der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung und Verfahren zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe.

Description

Die Erfindung betrifft einen Temperierkörper für eine Multiwell-Platte. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe.
Die zunehmende Verbreitung institutioneller und kommerzieller Kryobiobanken, insbesondere zur Ablage von lebendem Zellmaterial, mit Probenzahlen von einigen Zehntausend bis zu einigen Millionen erfordert eine Automatisierung der Prozessabläufe. Einmal ist dies erforderlich, um kostengünstige Lagenbedingungen zu erreichen, zum anderen zur konsequenten Umsetzung von SOP-Bedingungen (SOP: Standard Operation Procedures), zur lückenlosen Dokumentation und zum Ausschluss subjektiver Einflüsse durch Laborpersonal, wie er im biomedizinischen Bereich zunehmend gefordert wird.
Im Pharmabereich, in der Medizin und in weiten Teilen der Biotechnologie haben sich automatisierte Probenaufnahmestandards durchgesetzt, die vor allem im Laufe der Entwicklungen des Hochdurchsatz-Screenings („High-Throughput Screenings”) entwickelt wurden (sog. SBS-Standard). Hierbei kommen in der Laborpraxis Multiwell-Substrate von spalten- und zeilenförmig angeordneten, eine Rundwabenstruktur bildenden, sehr kleinen Reaktionsräumen, auch Wells, Kavitäten oder Näpfchen genannt, zum Einsatz, in die jeweils kleinste Anteile einer Probe, z. B. Zellmaterial, eine Blutprobe etc., eingebracht werden. Es handelt sich dabei um Multiwell-Substrate, mit 6, 8, 16, 24 bis 96 und mehr Einzelwells in flachen Plastikausführungen. Diese Formate sind inzwischen weltweit standardisiert und werden in Pipettierautomaten, Zell-Kulturautomaten aber auch der Geräteplattform der Analysetechnik sowie Diagnostik eingesetzt.
Derartige Multiwell-Substrate werden auch als Multiwell-Platten oder Mikrotiterplatten bezeichnet. Die genauen Abmessungen (Länge × Breite × Höhe) betragen gemäß ANSI-Standard auf Empfehlung der Society for Biomolecular Screening (SBS) 127,76 mm × 85,48 mm × 14,35 mm. Von der ANSI wurden auf Empfehlung der Society of Biomolecular Screening (SBS) Standards für Mikrotiterplatten veröffentlicht, die insbesondere die Abmessungen und Positionen der Vertiefungen bei Mikrotiterplatten mit 96, 384 und 1536 Vertiefungen betreffen. Hierbei handelt es sich um die Normen ANSI/SBS 1 bis 4-2004 und die Norm SBS-6-2009.
Zu der Kette der Verarbeitung, Charakterisierung und Handhabung von Proben in der Medizin, Pharmaentwicklung und Biotechnologie gehören mehr und mehr auch Kryobiobanken, in denen die Proben, insbesondere lebende Zellen und hier Stammzellen vom Tier und Mensch abgelegt und bei Bedarf wieder einer Nutzung zugeführt werden. Das erfolgt in der Regel über Kryokonservierung, definierte Einfrier- und Auftauprotokolle sowie über eine Lagertemperatur unter minus 140°C, allerdings in Einzeltubes, Straws, einzelnen Plastikcontainern etc., so dass die in den Wellsubstraten befindlichen Suspensionen entnommen und transferiert werden müssen.
Wie zahlreiche Experimente gezeigt haben, nimmt die Qualität einer biologischen Probe, insbesondere wenn Zellen an Oberflächen adhäriert wachsen, mit jedem Transfer ab, da diese durch Enzymbehandlung oder mechanische Behandlung abgelöst werden müssen und dadurch einem nicht unerheblichen Stress unterliegen. Auch ist es wichtig, dass alle Proben einer Wellplatte, z. B. bei 96 Wells, in gleicher oder vorgebbarer Weise behandelt und damit auch eingefroren, gelagert und aufgetaut werden können.
Aus der Praxis sind des Weiteren sowohl gesteuerte Kühl- als auch Erwärmungssysteme bekannt, wie beispielsweise die „Cryo Freezers” der Firma Planar Plc mit programmierbaren Temperaturprogrammen oder einfache Kryoboxen, wie beispielsweise die unter der Bezeichnung „Mr. Frosty” angebotene Kryobox der Firma ThermoFisher Scientific Inc.. Insbesondere bei wichtigen medizinischen Zelltypen, wie Immunzellen, Stammzellen, insbesondere den IPS-Zellen (Induced Pluripotent Stemcells), erweisen sich in letzter Zeit kontrollierte Einfrier- und Auftauprotokolle als außerordentlich wichtig für die Qualität der Probe und deren Vitalität. Dabei werden sehr gute Ergebnisse mit sehr raschen Abkühlungen und Erwärmungen erzielt. Das alles und insbesondere schnelle Abkühlungen und Erwärmungen unter 1°/sec sind bisher für Multiwell-Substrate nicht verfügbar, weswegen die Bioproben in andere Gefäße transferiert werden müssen. Aber auch in den konventionellen Plastiktubes lassen sich aufgrund der Dicke der Plastikwand und Anordnung der Volumina derartig exakte, vor allem aber rasche Temperaturverläufe nicht erreichen.
Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe, bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden und die insbesondere eine Kryokonservierung mit einer schnellen Abkühlung und/oder Erwärmung sowie einer erhöhten Vitalitätsrate ermöglicht. Eine weitere Aufgabe ist es, eine derartige Vorrichtung bereitzustellen, die sich prozesseffizient in automatisierte Hochdurchsatzverfahren, z. B. High-Throughput Screening-Verfahren, integrieren lässt. Des Weiteren ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, bereitzustellen, mit dem vitalitätsbeeinflussende Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden und das insbesondere eine vereinfachte Nachverarbeitung (post-processing) der aufgetauten biologischen Probe ermöglicht.
Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Temperierkörper für eine Multiwell-Platte bereitgestellt, zum Einfrieren und/oder zum Auftauen von Proben, insbesondere biologischen Proben, die sich in den Kavitäten der Multiwell-Platte befinden. Die Multiwell-Platte weist hierbei in an sich bekannter Weise eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten auf.
Der erfindungsgemäße Temperierkörper umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper aus einem thermisch leitfähigen Material und vorzugsweise hoher Wärmekapazität und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers in Reihen und Spalten angeordneten abragenden Temperierfingern, die thermisch leitend mit dem Grundkörper verbunden sind, wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger einem Rasterabstand der Kavitäten der Multiwell-Platte entspricht. Der Abstand benachbarter Temperierfinger entspricht somit dem Abstand benachbarter Kavitäten.
Die Erfindung umfasst also die allgemeine technische Lehre, einen Temperierkörper bereitzustellen, der an die matrixartige, regelmäßige Anordnung der Kavitäten der Multiwell-Platte angepasst ist und hierzu eine korrespondiere maxtrixartige Anordnung von Temperierfingern im Rastermaß der Anordnung der Kavitäten aufweist. Hierbei können die Kühlfinger mit ihren Stirnseiten mit den Bodenplatten der Kavitäten in Verbindung gebracht werden, wobei vorzugsweise jeweils ein Temperierfinger einer Kavität zuordenbar ist. Hierbei können die Temperierfinger stab- bzw. zäpfchenförmig ausgeführt sein, und die Stirnseiten der Temperierfinger sind so ausgeführt, dass sie flächige Auflagen für die Böden der Kavitäten der Multiwell-Platte bilden.
Ein besonderer Vorzug der Erfindung liegt somit darin, dass Proben zum Einfrieren und Auftauen nicht mehr in Einzeltubes, Straws oder spezielle Plastikcontainer etc. transferiert werden müssen, sondern mittels des erfindungsgemäßen Temperierkörpers direkt in und mit der Multiwell-Platte eingefroren und nachfolgend wieder aufgetaut werden können. Dadurch kann die Vitalitätsrate bei der Kryokonservierung von biologischen Proben erhöht werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass ein derartig ausgeführter Temperierkörper ein schnelles Einfrieren und/oder Auftauen ermöglicht, da die Temperierfinger sehr nahe an der Probe positioniert werden können und hohe Kühl- und Erwärmungsraten direkt in der Bioprobe über die Bodenwand der Kavitäten generiert werden können.
Ferner entfällt das zeitaufwändige Transferieren in separate Einfrierbehälter; stattdessen können in einer Prozesskette durchgehend handelsübliche Multiwell-Platten verwendet werden, so dass die Verarbeitungsgeschwindigkeit und Effizienz, insbesondere für Hochdurchsatzverfahren, gesteigert werden können.
Mit dem Begriff ”Probe” wird jeder Gegenstand bezeichnet, welcher in der Kavität der Kryokonservierung unterzogen wird. Das Probenmaterial umfasst typischerweise biologisches Material wie Zellen, Gewebe, Zellbestandteile oder biologische Makromoleküle sowie ggf. eine Nährlösung, Reagenzien, Gefrierschutzmittel oder weitere Substanzen.
Gemäß einer Variante der Erfindung kann ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement in zumindest einigen der Temperierfinger, vorzugsweise in allen, integriert sein. Beispiele für derartige Heizelemente können auch Mikrowellen- oder Hochfrequenz-Elemente sein, die bei entsprechender Ansteuerung gegen die Fluidkühlung des Grundkörpers eine definierte Wärmeeinleitung setzen können. Diese Variante bietet den Vorteil, dass einzelne Temperierfinger oder Teilgruppen von Temperierfingern, beispielsweise einzelne Reihen und/oder Spalten, unterschiedlich temperiert werden können. Dadurch kann der Wärme- oder Kälteeintrag über die Anordnung der Kavitäten gezielt variiert und an die in den einzelnen Kavitäten gelagerten Proben angepasst werden.
Gemäß einer weiteren Variante besteht die Möglichkeit, dass zur Überwachung des Wärme- oder Kälteeintrags in die Kavitäten im Stirnbereich von zumindest einem der Temperierfinger ein Temperatursensor, wie z. B. ein thermoelektrischer Sensor, integriert ist. Beispielsweise kann der Temperatursensor als flache Ausführung eines Platinwiderstands-Temperatursensors, wie ein PT 100- oder PT 1000-Sensor, ausgeführt sein.
Um ein möglichst schnelles Einfrieren oder Auftauen der Proben zu erreichen, ist es vorteilhaft, wenn die Stirnseiten der Temperierfinger hochpoliert sind, vorzugsweise mit Rauigkeiten unter 20 μm, und/oder eine Beschichtung hoher thermischer Leitfähigkeit aufweisen, vorzugsweise mit einer thermischen Leitfähigkeit, die vergleichbar zu der von Kupfer oder Silber ist, vorzugsweise eine Beschichtung aus Graphit oder Diamant.
Entsprechend den Abmessungen handelsüblicher Multiwell-Platten können die Temperierfinger innerhalb einer Fläche mit einer Länge von 127,8 mm und einer Breite von 85,5 mm angeordnet sein. Ferner kann die Anzahl der Temperierfinger der Anzahl der Kavitäten der Multiwell-Platte entsprechen und vorzugsweise einen der folgenden Werte aufweisen: 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536. Ferner besteht die Möglichkeit, dass eine davon unterschiedliche Anzahl von Temperierfingern auf dem Grundkörper angeordnet ist, insbesondere ein Vielfaches der vorgenannten Varianten, um beispielsweise mit einem Temperierkörper mehrere Multiwell-Platten gleichzeitig zu temperieren.
Die Temperierfinger sind vorzugsweise aus einem Material hoher Wärmekapazität und hoher Wärmeleitfähigkeit gefertigt, vorzugsweise aus einem metallischen Werkstoff. Insbesondere ist die Wärmekapazität der Temperierfinger höher als die einer handelsüblichen Multiwell-Platte.
Der Grundkörper des Temperierkörpers umfasst wenigstens eine von einem Kühlfluid durchströmbare Leitung, mit einem Zuflussanschluss und einem Abflussanschluss zur Verbindung der wenigstens einen Leitung mit einem Kühlkreislauf und/oder einem Heizkreislauf. Der Leitungsverlauf der wenigstens einen Leitung ist vorzugsweise mäanderförmig oder spiralförmig, um ein gewünschtes Temperaturprofil gleichmäßig verteilt über den Grundkörper zu erreichen. Eine vorteilhafte Variante sieht hierbei vor, dass der Fluss eines Temperierfluids durch die wenigstens eine Leitung so steuerbar ist, dass vorbestimmte einzelne Temperierfinger und/oder wenigstens eine vorbestimmte Teilgruppe der Temperierfinger unterschiedlich im Vergleich zu den restlichen Temperierfingern temperierbar sind. Dies kann beispielsweise durch mehrere zu- und abschaltbare Fluidleitungen oder Leitungsabschnitte für unterschiedliche Bereiche des Kühlkörpers realisiert werden, um Teilgruppen von Temperierfingern unterschiedlich zu temperieren.
Die Stirnseiten der Temperierfinger können plan oder leicht gekrümmt ausgeführt sein. Diese Ausführung eignet sich vorzugsweise für die Temperierung von Multiwell-Platten, die Kavitäten mit einem Flachboden oder einem leicht gekrümmten Rundboden aufweisen.
Eine weitere Variante dieser Ausgestaltungsform ist durch eine von der Mitte zu zwei gegenüberliegenden Randbereichen des Temperaturkörpers hin zunehmende Neigung der Stirnseiten der Temperierfinger gegenüber einer planen Oberseite des Grundkörpers gekennzeichnet. Die zunehmende Neigung kann durch eine zunehmende Schrägstellung der auf der planen Oberseite des Grundkörpers angeordneten Temperierfinger oder durch eine zunehmende Abschrägung der Stirnseiten der Temperierfinger ausgebildet sein. Gemäß dieser Ausgestaltungform wird ausgenutzt, dass Multiwell-Platten meist aus Kunststoff, z. B. aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid, gefertigt sind und sich bei Druck leicht verbiegen. Diese Verbiegung kann durch die nach außen zunehmend geneigte Ausführung der Stirnseiten der Temperierfinger vorteilhafterweise ausgenutzt werden, um sicherzustellen, dass alle Kavitäten in planaren Kontakt mit dem Temperierkörper gelangen.
Eine weitere alternative Ausführungsform sieht vor, dass eine Außenwandung der Böden der Kavitäten und eine Stirnseite der Temperierfinger zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane Oberflächenform aufweisen. Mit anderen Worten ist die Stirnseite der Temperierfinger gemäß dem Schlüssel-Schloss-Prinzip als Gegenkontur zur Kontur der Unterseite der Kavitäten ausgeführt. Beispielsweise können eine Oberflächenform der Stirnseiten der Temperierfinger und eine Oberflächenform der Außenwandungen der Böden der Kavitäten zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses als ineinandergreifende Verzahnung ausgeführt sein. Diese alternative Ausführungsform bietet den Vorzug, dass auch bei Kavitäten mit kleinen Durchmessern ein großer flächiger Kontakt zwischen Kavität und korrespondierendem Kühlfinger und damit eine vergleichsweise große Kühlfläche und schnellere Temperierung ermöglicht werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine Anordnung aus einem Temperierkörper, wie hierin offenbart, und einer Multiwell-Platte, deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger entspricht.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Temperiervorrichtung zum Einfrieren von Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe bereitgestellt. Die Proben können insbesondere biologische Proben sein. Die Temperiervorrichtung umfasst einen Temperierkörper wie in diesem Dokument offenbart. Die Temperiervorrichtung umfasst des Weiteren eine Positioniereinrichtung zum Positionieren des Temperierkörpers einer Multiwell-Platte in einer vorbestimmten Lage relativ zueinander, wobei der Rasterabstand der in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten der Multiwell-Platte dem Rasterabstand der Temperierfinger entspricht und wobei in der vorbestimmten Lage die Multiwell-Platte oberhalb des Temperierkörpers und die Kavitäten jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger fluchtend positioniert sind. Die Temperiervorrichtung umfasst des Weiteren eine Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen der Temperierfinger des Temperierkörpers mit den Böden der Kavitäten einer in der vorbestimmten Lage positionierten Multiwell-Platte.
Eine Möglichkeit der Realisierung sieht hierbei vor, dass die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen einen Anpresskörper umfasst, der von oben auf eine oberhalb des Temperierkörpers positionierte Multiwell-Platte pressbar ist, um die Böden der Kavitäten der Multiwell-Platte infolge des Anpressdrucks in Kontakt mit den Stirnseiten der Temperierfinger zu bringen. Der Anpresskörper umfasst hierbei vorzugsweise eine Kontaktfläche mit der Multiwell-Platte von wenigstens der gleichen Länge und Breite wie die matrixartige Anordnung der Kavitäten der Multiwell-Platte.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante der Temperiervorrichtung umfasst die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen eine Mehrzahl elektrisch ansteuerbarer Stellglieder, die ausgeführt sind, an der Oberseite einer über der Temperiervorrichtung positionierten Multiwell-Platte mittelbar, z. B. über den vorgenannte Anpresskörper, oder unmittelbar anzugreifen, um bei Ansteuerung der Stellglieder einen Relativabstand zwischen der Multiwell-Platte und dem Temperierkörper zu verändern, um die Temperierfinger und die Böden der Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt zu bringen. Die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder können als mikromechanische Aktoren oder als piezo-elektrische Stellglieder ausgeführt sein.
Es ist weiterhin vorteilhaft, die Temperiervorrichtung so auszuführen, dass die Mehrzahl der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder von der Temperiervorrichtung einzeln und/oder in Teilgruppen ansteuerbar sind, um einzelne Kavitäten und/oder Teilgruppen von Kavitäten, z. B. einzelne Reihen oder Spalten, unabhängig von den anderen Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper bringen zu können. Diese Ausführungsvariante macht sich wiederum die Verbiegbarkeit von Multiwell-Platten in Plastikausführung zu Nutze, indem durch Ansteuerung nur derjenigen Stellglieder, die in einem ausgewählte Bereich über der Multiwell-Platte angeordnet sind, nur diejenigen Kavitäten in diesem Bereich in Kontakt oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper gebracht werden können.
Anders als bei Kryomikroskopen, bei denen die Kühl- und Erwärmungsrate über die Temperierung eines Kühlmediums gesteuert wird, erfolgt dies gemäß der Temperiervorrichtung über eine vorzugsweise sehr schnelle Änderung des Kontaktes vortemperierter Kühlkörper zur Multiwell-Platte. Hierbei können die Temperierfinger alle zugleich oder in Gruppen, im Einzelfall auch nur ein einzelner Temperierfinger, an die Unterseite der Kavitäten der Multiwellplatte angedrückt und zurückgeführt werden, so dass eine Temperaturbrücke zwischen dem Boden der Multiwellplatte und den Temperierfingern hergestellt und gelöst wird, so dass die Wärme aus der Probe heraus oder in sie hineingeführt werden kann.
Ein weiterer Vorteil der Ausführungsvariante, bei der die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder als hochpräzise mikromechanische Aktoren oder als piezo-elektrische Stellglieder ausgeführt sind, liegt darin, dass derartige Stellglieder von einer Steuereinheit der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen so ansteuerbar sind, dass ein aufeinanderfolgendes In-Kontakt-Bringen, ein Außer-Kontakt-Bringen und ein Wieder-in-Kontakt-Bringen von Multiwell-Platte und Temperierkörper innerhalb einer Zeit durchführbar ist, die im Bereich von 1 ms (Millisekunde) bis 1 s (Sekunde) liegt und dies mit einer Abstandsgenauigkeit < 1 μm durchführbar ist. Gemäß einem weiteren Aspekt sind mittels der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder Auslenkungen der Multiwell-Platte in Richtung des Temperierkörpers im Bereich von 1 μm bis 1 mm erzeugbar. Dadurch können nahezu beliebige Temperaturprogramme und Temperaturgradientenverläufe realisiert werden.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, ist die Temperiervorrichtung zur Handhabung einer Multiwell-Platte, deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger eines Temperierkörpers der Temperiervorrichtung entspricht, ausgeführt. Ferner kann die Temperiervorrichtung eine solche Multiwell-Platte umfassen.
Die Multiwell-Platte kann eine handelsübliche Multiwell-Platte sein. Ferner kann die Multiwell-Platte sich von handelsüblichen Multiwell-Platten unterscheiden und für die Verwendung zur Kryokonservierung und zur Verwendung mit dem Temperierkörper und/oder der Temperiervorrichtung angepasst sein. Hierbei besteht im Rahmen der Erfindung insbesondere die Möglichkeit, dass in die Böden der Kavitäten jeweils ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement, vorzugsweise ein Peltier-Element, integriert ist und/oder dass in zumindest einen der Böden der Kavitäten ein Temperatursensor integriert ist. Ferner können die Böden der Kavitäten dünn und aus einem wärmeleitenden Material ausgeführt sein oder mit einer Struktur auf der Unterseite versehen sein, die einen größeren Flächenkontakt zum Temperierkörper ergeben.
Die gemäß den vorstehenden Varianten modifizierte Multiwell-Platte soll ferner auch als eigenständiger Gegenstand offenbart und beanspruchbar sein.
Die Temperiervorrichtung kann ferner in an sich bekannter Weise eine von unten kühlbare Temperierkammer bzw. Hausung, die mit einem trockenem Gas befüllbar ist und/oder befüllt ist und im gekühlten Zustand eine vertikale Temperaturschichtung in der Temperierkammer mit einer unteren Kaltschicht und einer oberen Warmschicht aufweist, sowie wenigstens eine an einer Gehäusewand der Temperierkammer vorgesehene Schleuse zum Einbringen und/oder Ausführen einer Multiwell-Platte aufweisen. Vorteilhafterweise sind zwei derartige Schleusen vorgesehen: eine erste Schleuse, über die eine Multiwell-Platte im warmen Zustand in die Kammer eingebracht oder ausgeführt werden kann, und eine zweite Schleuse, über die eine Multiwell-Platte im kalten Zustand in die Kammer eingebracht oder ausgeführt werden kann.
Vorstehend wurde bereits festgestellt, dass die Temperiervorrichtung einen erfindungsgemäßen Temperierkörper umfasst. Insbesondere kann die Temperiervorrichtung einen in der unteren Kaltschicht der Temperierkammer angeordneten, an einen Kühlkreislauf angeschlossenen ersten Temperierkörper zur Kryokonservierung biologischer Proben und/oder einen in der oberen Warmschicht angeordneten, an einen Wärmekreislauf angeschlossenen zweiten Temperierkörper zum Auftauen kryokonservierter biologischer Proben umfassen.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt dieser Variante kann eine in der unteren Kaltschicht der Temperierkammer gelagerte, wenigstens eine aufzutauende Probe enthaltende Multiwell-Platte mittels der Positioniereinrichtung über dem zweiten Temperierkörper positionierbar sein. Ferner kann eine über die wenigstens eine Schleuse in die Temperierkammer eingebrachte, und wenigstens eine zu gefrierende Proben enthaltende Multiwell-Platte mittels der Positioniereinrichtung über dem ersten Temperierkörper positionierbar sein. Hierzu kann die Positioniereinrichtung eine zweckmäßig ausgebildete Führungsmechanik aufweisen, um die Multiwellplatte innerhalb der Temperierkammer zu verfahren. Gemäß diesem Gesichtspunkt kann eine über dem ersten und/oder zweiten Temperierkörper positionierte Multiwell-Platte mittels der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen gesteuert oder geregelt abgesenkt und/oder angehoben werden, um in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper gebracht zu werden.
Alternativ kann die Positioniereinrichtung auch ausgebildet sein, stattdessen den oder die Temperierkörper hin zu der Multiwell-Platte zu verfahren.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt kann die Temperierkammer mit flüssigen Gasen wie LN2, N2-Gas oder einem Sterling-Motor gekühlt sein. Beispielsweise kann in einer Wanne am Boden der Temperierkammer offen oder in ein schwammartiges Material eingebracht flüssiger Stickstoff gelagert werden, wodurch sich die vertikale Temperaturschichtung ergibt.
Ferner ist es vorteilhaft, eine Eisfalle in der Temperierkammer anzuordnen, um eine Eisbildung über die Eisfalle zu erzwingen, falls feuchte Luft durch das Einbringen oder Ausführen einer Multiwell-Platte von außen in die Temperierkammer eindringen sollte.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist der vertikale Temperaturverlauf innerhalb der Temperierkammer so eingestellt, dass die Warmschicht eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Starttemperatur eines Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Zieltemperatur eines Auftauprozesses entspricht, während die Kaltschicht eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Zieltemperatur des Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Starttemperatur des Auftauprozesses entspricht.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, unter Verwendung eines Temperierkörpers, wie in diesem Dokument offenbart, und/oder einer Temperiervorrichtung, wie in diesem Dokument offenbart.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Aufbringen einer Substanz auf eine in einer Kavität der Multiwell-Platte gelagerte Probe.
Gemäß einer vorteilhaften Variante ist die aufgebrachte Substanz eine Lösung, die beim Festwerden eine Oberfläche des Kavitäteninhaltes gegenüber dem Außenraum abschließt, vorzugsweise gasdicht abschließt, so dass kein Deckel oder Ähnliches als Verschluss benötigt wird. Die Substanz kann beispielsweise ein natürliches oder synthetische Öl, eine Flüssigkeit oder ein Gel, welche mit einer wässrigen Lösung nicht mischbar sind, oder festes CO2 sein.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Variante wird die Substanz auf die bereits gefrorene Probe aufgebracht wird, wobei die Substanz nach und/oder beim Auftauen der Probe eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt. Vorzugsweise wird eine Substanz eingesetzt, aus deren Zustand ableitbar ist, ob nach dem Einfrieren der Probe ein zwischenzeitliches Auftauen erfolgt ist.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Variante weist die Substanz eine höhere Dichte als die eine die Probe umgebende Nährlösung auf, so dass sich die Reihenfolge der Probe und der Substanz nach dem Auftauen umdreht, so dass beispielsweise in einer Nährlösung schwimmende Zellen einfach entnommen werden können.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Variante wird eine Substanz aufgebracht, wobei aus dem Zustand der eingebrachten Substanz eine Information über die Probe ableitbar ist und/oder die Substanz beim Auftauen der Probe eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt. Es können beispielsweise Flüssigkeiten zugegeben werden, die beim Auffrieren ein bestimmtes Muster ergeben oder eine Temperatursensorfunktion besitzen, an der man erkennen kann, ob es zwischenzeitlich ein Auftauen gegeben hat, bzw. durch die die Struktur, Farbe, Mischung etc. verändert wurden. Dabei kann es sich auch um Umkristallisierungsvorgänge handeln, die makroskopisch nicht sichtbar sind, über Streulicht-, Fluoreszenz-, Raman-Messungen oder Ähnliches aber leicht erkannt und quantifiziert werden können. Beispielsweise kann die Substanz eine Verdünnungs- und Waschlösung oder ein Gefrierschutzmittel sein, als Differenzierungsfaktor in Bezug auf die Probe wirken oder eine Substanz sein, die Antioxidantien, Anti-Apoptosesubstanzen und/oder lebend-tot-Farbstoffe enthält.
Es wird betont, dass die vorgenannten Verfahrensaspekte betreffend das Aufbringen der Substanz auf eine in der Kavität gelagerte Probe auch unabhängig von der Verwendung der Temperiervorrichtung und/oder des Temperierkörpers möglich sind und daher auch unabhängig von der Verwendung der Temperiervorrichtung und/oder des Temperierkörpers beansprucht werden können.
Zur Vermeidung von Wiederholungen sollen rein vorrichtungsgemäß offenbarte Merkmale auch als im Rahmen des Herstellungsverfahrens offenbart gelten und beanspruchbar sein.
Zusammengefasst können mit der vorliegenden Erfindung Multiwell-Platten direkt für die Kryokonservierung genutzt werden, so dass jeder Transfer in neue Behältnisse entfällt. Durch Anpassen des Temperierkörpers an das Format der jeweils verwendeten Multiwell-Platte können prinzipiell Multiwell-Platten beliebiger Kavitätenanzahl direkt zur Kryokonservierung verwendet werden. Dadurch können bekannte Kryotechnologien effizient in die bestehenden Hochdurchsatz-Prozessketten eingebunden werden können, so dass auch im Kryobereich die Automatisierungskette der Multiwell-Platten-basierten Geräteplattformen geschlossen wird.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
1 eine perspektivische Ansicht einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
2 eine Anordnung einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers, aus welchen ein Ausschnitt vergrößert und im Schnitt wiedergegeben ist;
3 einen Querschnitt einer Multiwell-Platte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung;
4 schematisch eine Temperiervorrichtung und ein Temperierverfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
5 schematisch das Aufbringen einer Substanz gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens;
6A und 6B eine Einheit aus einem Temperierfinger und einer gefüllten Kavität;
7A und 7B einen Querschnitt einer Multiwell-Platte auf einem Temperierkörper gemäß einer weiteren Ausführungsform; und
8A und 8B einen Querschnitt einer Multiwellplatte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform.
Gleiche Teile sind in den Figuren mit denselben Bezugszeichen versehen.
1 zeigt eine Multiwell-Platte 1 und eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Temperierkörpers 4 in einer perspektivischen Darstellung. Hierbei ist in der Mitte schematisch in Schrägansicht eine handelsübliche Plastik-Multiwell-Platte 1 im standardisierten 96-Well-Format gezeigt. Die Kavitäten (Wells) 2 liegen dem Standard entsprechend matrixartig in acht Reihen von jeweils zwölf Kavitäten nebeneinander und stellen Vertiefungen zur Aufnahme der Probe(n) auf einer solchen Multiwell-Platte 1 dar. Gemäß der Norm ANSI/SBS 4-2004 beträgt der Rasterabstand benachbarter Kavitäten bei einer Multiwell-Platte im 96-Well-Format 9 mm.
Derartige Multiwell-Platten 1 können mit einem Plastikdeckel 3 abgedeckt sein, der in den Automaten zur Befüllung, Entleerung und zu anderen Manipulationen auch weggelassen werden kann. Auf der Unterseite sind die Kavitäten 2 planar mit einer dünnen Plastikscheibe oder -folie abgeschlossen, die in ihrer optischen Qualität in der Regel Mikroskopaufnahmen von adhärierten Zellen zulässt.
Unterhalb des Multiwell-Platte 1 ist in 1 ein beispielhafter Temperierkörper 4 für die Multiwell-Platte 1 gezeigt. Der Temperierkörper 4 umfasst einen von einem Temperierfluid durchströmbaren quaderförmigen Grundkörper 6 und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers 6 in Reihen und Spalten exakt im Muster der 96er-Multiwell-Platte 1 angeordneten abragenden zylinderförmigen Temperierfingern 5. Der Temperierkörper 4 ist aus einem Material hoher Wärmekapazität bzw. guter Wärmeleitung gefertigt. In der Regel handelt es sich um Metalle, wie Silber oder Legierungen.
Korrespondierend zu der Multiwell-Platte 1 sind somit ebenfalls 96 Temperierfinger 5 matrixartig in acht Reihen von jeweils zwölf Temperierfingern 5 angeordnet. Der Rasterabstand der Temperierfinger 5 entspricht einem Rasterabstand der Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1, d. h., der Abstand benachbarter Temperierfinger entspricht somit dem Abstand benachbarter Kavitäten und beträgt vorliegend somit ebenfalls 9 mm. Die Temperierfinger 5 sind jeweils im Wesentlichen gleich geformt und regelmäßig in zwei die Kontaktfläche mit der Multiwellplatte 1 aufspannenden und im Wesentlichen rechtwinklig zueinander stehenden Flächenrichtungen jeweils im Wesentlichen äquidistant angeordnet. Die Temperierfinger 5 können einstückig mit dem Grundkörper 6 bereitgestellt sein. Die Temperierfinger 5 stehen in sehr gutem, in der Regel thermischen Kontakt mit dem darunter angeordneten Temperierkörper 6.
Der Grundkörper 6 kann über mindestens 2 Öffnungen 7a, 7b mit einem Temperiergas oder einer Temperierflüssigkeit durchströmt werden. Im Temperierkörper 6 ist hierzu ein mäanderförmiger oder auch spiralförmiger Verlauf einer die beiden Öffnungen verbindenden Fluidführung realisiert, so dass ein gleichmäßiges oder gewünschtes Temperaturprofil erreicht wird, über das die Temperierfinger 5 jeweils die an ihrem Ort herrschende Temperatur annehmen.
Die Temperierfinger 5 besitzen eine möglichst hohe Wärmekapazität, die weit größer als die der Bodenbereiche der Multiwellplatten ist, so dass sie bei In-Kontakt-Bringung die Temperatur des Kavitätenbereichs mit der Bioprobe dominieren und bestimmen, d. h., die Abkühlung und Erwärmung werden im Wesentlichen nur noch durch die Wärmeleitfähigkeit der Bodenbereiche der Multiwell-Platte 1 und die der Bioprobe limitiert.
Zur Kühlung und/oder Erwärmung von Bioproben, die in einer Multiwell-Platte mit einem anderen Format gelagert sind, beispielsweise in einer Multiwell-Platte mit 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Kavitäten, kann ein entsprechend an dieses Format angepasster Temperierkörper verwendet werden, der dann entsprechend 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Temperierfinger 5 aufweist, deren Rastermaß an das Rastermaß der Multiwell-Platte angepasst ist.
Das Prinzip der Kühlung einer 96-er Multiwell-Platte 1 von Raumtemperatur auf eine Zieltemperatur von z. B. minus 150°C wird im Folgenden am Beispiel einer gleichartigen Abkühlung aller 96 Kavitäten 2 erläutert. Durch verschiedene Temperierung der Reihen oder Spalten der Temperierfinger 5 oder über in den Temperierfingern 5 befindliche Heizelemente (nicht gezeigt) können auch unterschiedliche Temperaturen an den einzelnen Temperierfingern 5 realisiert werden.
Für das Einfrieren einer 96er-Multiwell-Platte 1 wird diese zunächst auf eine Temperatur zwischen 1°C und 15°C gebracht, bei der von oben über Pipetten das Gefrierschutzmedium zugegeben wird. In der Zwischenzeit wurde der Temperierkörper 4 über die Durchleitung von Stickstoffgas einer Temperatur von –150°C bis –195°C auf die Zieltemperatur gebracht, so dass auch alle Temperierfinger 5 diese Temperatur annehmen. Nun wird über eine nachfolgend im Rahmen von 4 beschriebene Mechanik die 96er-Multiwell-Platte 1 mittels eines flächig von oben aufdrückenden Andruckkörpers 8 so auf den Temperierkörper 4 gepresst, dass die Stirnseiten 5a der Temperierfinger 5 in direkten Materialkontakt zu den einzelnen Böden der 96 Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1 kommen. Statt des Andruckkörpers 8 kann auch eine piezogesteuerte Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen der Temperierfinger 5 mit den Böden der Kavitäten 2 zum Andruck genutzt werden (dargestellt in 3), die es gestattet, den Kontakt des Multiwell-Substrats mit den Temperierfingern 5 durch senkrechte Bewegung zu öffnen und wieder zu schließen. Hierzu sind nur geringe Spalten im Mikrometerbereich erforderlich. Durch vielfache Wiederholung kann allein auf diesem Weg ein Temperaturprofil der gesamten Platte gefahren werden.
Zusätzlich oder alternativ kann auch die Temperatur des Gasstromes durch den Grundkörper 6 verändert werden, womit sich langsame T-Profile fahren lassen, wie sie ebenfalls in der Kryokonservierung von Zellen üblich sind (beispielsweise im Bereich weniger Bruchteile °C pro Minute, einige °C pro Minute). Bei der Erwärmung wird konträr verfahren: Sehr schnell wird die Multiwell-Platte 1 mit einem auf eine hohe Temperatur gebrachten Temperierkörper 4 in Kontakt gebracht. Dieser kann mit einem warmen oder heißen Gas oder aber auch einer entsprechenden Flüssigkeit durchströmt werden, dessen oder deren Temperatur im einfachsten Fall der Zieltemperatur, z. B. 10°C, entspricht, bei der dann das Gefrierschutzmedium ausgewaschen wird, oder direkt auf 37°C. Hierbei wird die Multiwell-Platte 1 ebenfalls rasch an den Temperierkörper 4 angedrückt.
Für extrem rasche Erwärmungen, die bei Stammzellen und insbesondere IPS erwünscht sind, wird der Temperierkörper 4 auf 40°C bis 300°C gebracht und nur so lange in thermischen Kontakt mit der Multiwell-Platte 1 gebracht, bis die Zieltemperatur erreicht ist. Auch bei der Erwärmung lassen sich über Öffnen und Schließen des thermischen Kontakts zwischen den Temperierfingern 5 und den Kavitäten 2 die Temperaturverläufe steuern.
2 zeigt im unteren Teil im Schnitt einen Temperierkörper 24, der wiederum einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper 6 und eine Mehrzahl von auf der Oberseite 6a des Grundkörpers 6 in Reihen und Spalten angeordneten abragenden Temperierfingern 25 aufweist. Der Rasterabstand der Temperierfinger 25 entspricht wieder dem Rasterabstand der Kavitäten 2 der Multiwell-Platte 1, die in 2 mittig in einem Ausschnitt vergrößert und im Schnitt wiedergegeben ist. Darüber ist die Multiwell-Platte 1 in schräger Aufsicht mit dem markierten Bereich gezeigt, der als Schnitt benutzt wird.
In den Kavitäten 2 befindet sich jeweils oben ein Gasraum 23 und die Bioprobe 20 mit adhärierten Zellen 21 an der Oberseite der Bodenplatte 11 der Kavitäten 2. Im Ausführungsbeispiel ist die Multiwell-Platte 1 noch mit einem Deckel 3 abgedeckt.
Um einen guten Andruck und damit thermischen Kontakt zwischen dem Temperierkörper 24 und der Multiwell-Platte 1 zu erreichen, sind die Temperierfinger 25 gemäß dieser Ausführungsvariante nicht senkrecht stehend auf der Oberfläche 6a des Grundkörpers 6, sondern zu den Rändern der Multiwell-Platte 1 zunehmend geneigt. Dies ist in der Figur durch die gestrichelte Linie 5c und die beiden Längsachsen 5b von im Außenbereich angeordneten Temperierfingern 25, die im Vergleich zu der Längsachse 5d eines mittig angeordneten Temperierfingers 25 nach außen gekippt sind, übertrieben dargestellt. Durch den flächigen Andruck von oben oder unten wird die Multiwell-Platte 1 ein wenig linsenförmig verbogen, wodurch gesichert ist, das alle Kavitäten 2 mit ihrer Bodenunterseite 11 in gleich guten planaren Kontakt mit den Temperierfingern 25 gelangen. Die Oberfläche der Temperierfinger, insbesondere der Stirnseite 25a kann, wie an einem Beispielzylinder in 2 beispielhaft illustriert, mit einer gut wärmeleitfähigen Schicht 9 bedeckt sein, wodurch sehr rasche Abkühlungen und Erwärmungen möglich werden. Zusätzlich können Heiz- bzw. Kühlelemente 10 in den Temperierfingern 25 integriert sein, über die einzelne Elemente in der Temperatur gesteuert werden. Hierzu befinden sich nahe oder auf der Stirnfläche der Temperierfinger 5 Temperatursensoren 12, z. B. in flacher Ausführung eines Platinwiderstands-Temperatursensors, wie ein PT 100- oder PT 1000-Sensor. Zur Vereinfachung der Darstellung sind die vorgenannten Temperatursensoren 12, die Schicht 9 hoher Wärmeleitfähigkeit oder die Heiz- bzw. Kühlelemente 10 schematisch nur für ein bzw. zwei Temperierfinger 25 eingezeichnet, können jedoch an allen Temperierfingern 25 vorgesehen sein.
3 zeigt in Analogie zu 2 einen Querschnitt einer Multiwell-Platte 1, die sich in Kontakt zum Temperierkörper 24 befindet. Die Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels liegt darin, dass piezo-elektrische Stellglieder 30 auf dem Deckel der Multiwell-Platte 1 fest angeordnet sind, so dass über die Ausdehnung oder Schrumpfung der piezo-elektrischen Stellglieder 30 (dargestellt durch die Pfeile) der Kontakt der Kavitäten 2 zu den Temperierfingern 25 hergestellt oder unterbrochen wird. Es handelt sich um Auslenkungen im Bereich von 1 bis einigen 100 μm.
4 zeigt beispielhaft eine Temperiervorrichtung 40 zur automatisierten und direkten Kryokonservierung von in Multiwell-Platten 1 gelagerten Bioproben. Die Vorrichtung 40 umfasst eine temperierte Kammer 48, in der sich keine Feuchtigkeit befindet, damit sich keine Luftfeuchtigkeit als Eis niederschlagen kann. Die Kammer 48 weist des Weiteren Bereiche auf, die mindestens die Ausgangstemperatur der Multiwell-Platte als auch die gewünschte Zieltemperatur besitzen.
Am Boden der Temperierkammer 48 befindet sich hierzu eine Wanne 43, in der sich offen oder in einem schwammartigen Material, z. B. Stahlwolle, poröses Aluminium etc., flüssiger Stickstoff (LN2) befindet. Dieser ist mit einem Lochblech 44 abgedeckt, das verhindern soll, dass Teile in den Stickstoffsee mit einer Temperatur von –196°C hineinfallen können.
Durch die Verdunstung des LN2 entsteht im Innenraum eine trockene Stickstoffatmosphäre, die sich in horizontalen Schichten so strukturiert, dass sich ein nahezu linearer T-Gradient mit einer unteren Kaltschicht 43a bei ca. –196°C und einer oberen Warmschicht 43b bei ca. 10°C oder wärmer herausbildet.
Des Weiteren sind zwei Schleusen 47a und 47b dargestellt, die an der Gehäusewand der Temperierkammer 48 angeordnet sind. Über die Schleuse 47a wird eine Multiwell-Platte 1 warm in die Temperierkammer 48 eingebracht oder ausgeführt. Über die Schleuse 47b kann eine Multiwell-Platte 1 kalt in die Temperierkammer 48 eingebracht oder ausgeführt werden.
Falls durch das Einbringen oder bei der Entnahme einer Multiwell-Platte 1 von außen feuchte Luft in die Temperierkammer 48 eindringen sollte, wird die Eisbildung über eine Eisfalle 49 erzwungen. Das ist ein gekühlter Körper im warmen Bereich 43b. Um über die Eingriffe keine Feuchtigkeit einzubringen, kann nochmals eine Haube (nicht dargestellt) oben auf die Temperierkammer 48 und über die Schleusen 47a, 47b aufgesetzt werden, über die der gasförmige trockene Stickstoff entweicht. Das Gesamtsystem 40 ist nicht druckdicht abgeschlossen, sondern besitzt oben ein siphonartiges Auslassrohr (hier nicht dargestellt).
In der Temperierkammer 48 befindet sich ortsfest ein erster gekühlter Temperierkörper 41 für die Abkühlung von eingebrachten Bioproben bzw. der Multiwellplatte 1 und ein zweiter erwärmter Temperierkörper 42 für die Erwärmung der Bioproben bzw. Multiwellplatten. Beide müssen nicht gleichartig ausgeführt sein. So kann z. B. die Fläche der Stirnseiten bei der Erwärmungstemperiereinheit 42 der geschrumpften Multiwellsubstratgeometrie bei –150°C angepasst sein, d. h. die Fläche der Stirnseiten des Temperierkörpers 42 für die Erwärmung sind etwas kleiner ausgeführt als die Stirnseiten des Temperierkörpers 41 für die Abkühlung.
Die Vorrichtung 40 umfasst ferner eine Positioniereinrichtung (nicht dargestellt), mittels der die zu temperierenden Multiwell-Platten 1 innerhalb der Kammer 49 gemäß den durch die Pfeile 45a–c oder durch die Pfeile 46a–c illustrierten Verfahrwegen verfahren werden können und mittels der die Multiwell-Platten insbesondere exakt ausgerichtet oberhalb der Temperierkörper 41 und 42 positioniert werden können. Die Pfeile 45a–c zeigen hierbei den zeitlichen und räumlichen Ablauf bei einer Erwärmung einer tiefkalten Multiwell-Platte 1. Die Pfeile 46a–c illustrieren den Verlauf bei einer Abkühlung einer Multiwell-Platte 1. Die über die Pfeile angegebenen Wege werden mittels mechanischer Elemente der Positioniereinrichtung durchlaufen, deren Antriebe sich vorzugsweise außerhalb der Temperierkammer 48 befinden und über eine herkömmliche Führungsmechanik, wie z. B. Stangen, Wendeln etc. (nicht dargestellt), die Multiwell-Platten 1 verfahren.
So wird beispielweise eine Multiwell-Platte 1, die zu gefrierende Bioproben enthält, über die Schleuse 47a in die Temperierkammer 48 eingebracht (Pfeil 46a) und mittels der Positioniereinrichtung in die Kaltschicht 43a verfahren und dort oberhalb des ersten, auf der Lochplatte 44 stehenden Temperierkörpers 41 positioniert (Pfeil 46b). Die Positionierung erfolgt derart, dass die Kavitäten der Multiwell-Platte 1 jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger des Temperierkörpers 41 fluchtend positioniert sind. Anschließend wird die so positionierte Multiwell-Platte mittels einer Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen (nicht dargestellt), wie z. B. vorstehend im Zusammenhang mit 3 beschrieben, gesteuert oder geregelt abgesenkt, um in Kontakt mit dem Temperierkörper 41 gebracht zu werden.
Nach Erreichung der Zieltemperatur kann die Multiwell-Platte 1 entweder zur Lagerung in der unteren Kaltschicht 43a abgelegt werden oder zur Weiterverarbeitung über die zweite Schleuse 47a aus der Temperierkammer 48 herausgeführt werden (Pfeil 46c).
5 illustriert schematisch das Aufbringen einer Substanz auf die in den Kavitäten 2 gelagerten Bioproben und zeigt hierzu Reihe von Kavitäten 2 mit einer Flüssigkeitsfüllung 20 und Zellen 21 auf den Kavitätenböden 11. Die Reihe der Kavitäten 2 befindet sich mit den Bodenplatten 11 in thermischem Kontakt zu den Temperierfingern 5. Vor, während der Kühlung oder Erwärmung sowie danach im gefrorenen oder aufgetauten Zustand werden weitere Substanzen 51 mit einer Pipettiereinrichtung 50, z. B. mit einem Pipettierroboter, in die Kavitäten 2 zugegeben. Das können zum Beispiel Gefrierschutzmittel, Partikelsuspensionen, sich verfestigende Gele und Ähnliches sein, die beim Einfrieren hilfreich sind, es kann sich dabei aber auch um Verschlussmaterial handeln, das beim Festwerden die Oberfläche des eigentlichen Kavitäteninhaltes gegenüber dem Außenraum abschließt, so dass kein Deckel oder anderes als Verschluss benötigt wird, was die Automatisierungsprozesse vereinfacht. Es können aber auch Flüssigkeiten zugegeben werden, die beim Auffrieren ein bestimmtes Muster ergeben oder eine Temperatursensorfunktion besitzen, an der man erkennen kann, ob es zwischenzeitlich ein Auftauen gegeben hat, bzw. durch die die Struktur, Farbe, Mischung etc. verändert wurde. Dabei kann es sich auch um Umkristallisierungsvorgänge handeln, die makroskopisch nicht sichtbar sind, über Streulicht-, Fluoreszenz-, Raman-Messungen oder Ähnliches aber leicht erkannt und quantifiziert werden können.
Von besonderer Bedeutung ist das Aufbringen von Substanzen in fester oder flüssiger Form in die Kavitäten 2, wenn deren Inhalt 20 bereits gefroren ist. Das können Differenzierungsfaktoren für Stammzellen, die nach dem Auftauen sofort wirksam werden, Schutzmaterialien, oder genetisches Material sein, das sich erst nach dem Auftauen mit der darunter befindlichen Lösung verbindet. Das können auch Verdünnungsmedien sein, die nach dem Auftauen die Konzentration der Gefrierschutzmittel verringern.
6A zeigt eine Anordnung aus einem Temperierfinger 5 und einer Kavität 2. In der Kavität 2 befindet sich eine Füllung, die aus drei Materialien besteht. Unten am Boden befindet sich das Kulturmedium 60, in dem sich die Bioproben (hier als Zellen auf der Bodenplatte dargestellt) befinden, darüber ein Medium 61, das nach dem Gefrieren des Mediums 60 aufgebracht wurde, so dass es mit diesem nicht vermischt ist. Das Ganze wird abgedeckt mit einem weiteren Medium 62, das einen gasdichten Abschluss zur Außenatmosphäre ergibt. Bei dem Medium 62 kann es sich um ein natürliches oder synthetisches Öl, eine mit wässrigen Lösungen nicht mischbare Flüssigkeit, ein Gel oder auch um festes CO2 handeln. Der Vorteil derartiger Anordnungen ist, dass sie optimal auf den Vorgang des Auftauens oder Tiefgefrierens angepasst werden können. Die Art und Anordnung der Medien bestimmt die Reaktion beim Auftauen. So finden gestaffelte Verflüssigungen bei unterschiedlichen Temperaturen statt. Je nach Zusammensetzung der Füllung können sich Medien sich so verlagern, dass eine neue Reihenfolge entsteht, wie in 6B dargestellt.
6B zeigt zwei unterschiedliche Zustände einer Anordnung aus einem Temperierfinger 5 und einer Kavität 2. Im ersten, mit „I” bezeichneten Zustand ist die Anordnung im kalten Zustand gezeigt, in dem Nährmedium 60 gefroren ist, während im zweiten, mit „II” bezeichneten Zustand die Anordnung im warmen Zustand gezeigt ist, in dem die Nährlösung 60 aufgetaut ist. Bringt man zum Beispiel im gefrorenen Zustand ein Silikonöl 63 auf das feste Nährmedium 60 auf, das eine höhere Dichte als die Nährlösung 60 aufweist, dann wird sich diese Schichtung nach dem Flüssigwerden beider Phasen bei Temperaturerhöhung in der Reihenfolge umdrehen. Da sich beim Auftauen Zellen 64 leicht von der Oberfläche lösen und in Suspension gehen, schwimmen diese nach dem Auftauen in der nach oben steigenden, am Ende überschichteten Nährlösung 60, die sehr einfach, ohne einen Deckel abnehmen zu müssen, in Automaten entnommen werden können.
Alternative Varianten lassen sich für das Einfrieren entwickeln, indem z. B. Glyzerinlösungen verwendet werden, die bis zu Temperaturen von –40°C und tiefer flüssig bleiben oder aber überhaupt keinen festen Zustand einnehmen. Ein besonderer Vorteil dieser Anordnung und Verfahrensweise ist die Möglichkeit der Kontrolle der eingehaltenen Tiefkühllagerung von Proben und die Kombination von Materialien in festem und flüssigem Zustand, die bei Normaltemperatur nicht möglich sind.
Die 7A und 7B zeigen zwei klassische Wellplatten 70, 71 mit größeren Kavitäten 72, mit einem Durchmesser von ca. 2 bis 3 cm. Die Wellplatten 70, 71 sind als Spritzgussteil in einer für das Einfrieren in der Gesamtheit der Multiwellplatte modifizierten Form ausgeführt. Die Bodenplatte 75 besteht aus einem die Wärme gut leitenden dünnen Material, z. B. aus einem Polymer, einem Metall, einer Metallbeschichtung oder auch Diamant, so dass die Wärme gut über den Kühl- oder Erwärmungsraum 74, der sich in einem stabilen Kühl- oder Erwärmungskörper 73 befindet, ab- oder eingeleitet werden kann.
Die Wellplatten 70, 71 werden von oben an die Temperiereinheit 73 angedrückt und können durch Erzeugen eines leichten Unterdrucks über die Hohlräume 76 in der Wellplatte gebogen werden. Diese Variante der Gesamtkühlung der Multiwellsubstrate ist eine vereinfachte Form, die mit den Temperierkörpervarianten entsprechend den 1 bis 6 kombiniert werden kann. Eine solche Möglichkeit der Kombination ist die Einbringung des Temperierkörpers 4, 24 in den Raum 74. Dieser wird mit einer Kühl- oder Erwärmungsflüssigkeit oder dem Temperiergas durchströmt, wodurch die entsprechenden Temperaturverläufe über den Multiwellsubstratboden 75 in die Kavitäten 72 übertragen werden. Bei allen Varianten können wiederum Temperatursensoren integriert sein, z. B. in Form von flachen Pt-100- oder Pt-1000-Sensoren, die auf der Bodenplatte 75 oder in jeder Kavität 72 angeordnet sind. Alternativ kann auch in einer Referenzkavität mit ähnlicher oder gleicher Füllung ein Temperatursensor angeordnet sein, der die Regelwerte für die Steuerung der Temperaturverläufe liefert.
Die 8A und 8B zeigen einen Querschnitt einer Multiwellplatte und eines Temperierkörpers gemäß einer weiteren Ausführungsform. Hierbei zeigt 8A einen Querschnitt einer Anordnung aus einer Multiwell-Platte 1 und einem Temperierkörper 4, die beide noch nicht in Kontakt miteinander stehen. In 8B ist eine einzelne Kavität 2 mit dem darunter stehenden Temperierzylinder 25 gezeigt. Gekennzeichnet durch die gestrichelten Linien ist in 8B ferner ein stark vergrößerter Ausschnitt des Kavitätenbodenbereichs mit den Zellen 21 zu sehen. Der Kühlkontakt kann nun für schnellere Temperatur-Gradienten-Prozesse wesentlich erhöht werden, indem die Topographie der auf der Bodenplatte 11 der Kavitäten 2 befindlichen Schicht 82 mit einem Gegenstück auf dem Temperierkörper nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip ausgeführt wird. Mit anderen Worten weisen die Stirnseiten 25a der Temperierzylinder 25 und die untere Bodenseite 11 der Kavitäten 2 zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane Oberflächenform 82, 83 auf. Die gezeigte Spitzentopographie ist nur eine beispielhafte Möglichkeit.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente als Ersatz verwendet werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Zusätzlich können viele Modifikationen ausgeführt werden, ohne den zugehörigen Bereich zu verlassen. Folglich soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele begrenzt sein, sondern soll alle Ausführungsbeispiele umfassen, die in den Bereich der beigefügten Patentansprüche fallen. Insbesondere beansprucht die Erfindung auch Schutz für den Gegenstand und die Merkmale der Unteransprüche unabhängig von den in Bezug genommenen Ansprüchen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Normen ANSI/SBS 1 [0004]
4-2004 [0004]
Norm SBS-6-2009 [0004]
Norm ANSI/SBS 4-2004 [0061]

Claims

Temperierkörper (4; 24) für eine Multiwell-Platte (1), die eine Mehrzahl von in Reihen und Spalten angeordnete Kavitäten (2) aufweist, zum Einfrieren und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, umfassend einen von einem Temperierfluid durchströmbaren Grundkörper (6) aus einem thermisch leitfähigen Material; und eine Mehrzahl von auf einer Oberseite des Grundkörpers (6) in Reihen und Spalten angeordneten abragenden Temperierfingern (5; 25), die thermisch leitend mit dem Grundkörper (6) verbunden sind, wobei ein Rasterabstand der Temperierfinger (5; 25) einem Rasterabstand der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht.
Temperierkörper (24) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement (10) in zumindest einigen der Temperierfinger (25) integriert ist.
Temperierkörper (24) gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Stirnbereich (25a) von zumindest einem der Temperierfinger (25) ein Temperatursensor (9) integriert ist.
Temperierkörper gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stirnseiten (5a; 25a) der Temperierfinger (5; 25) (a) flächige Auflagen für die Böden (11) der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) bilden; und/oder (b) eine Beschichtung (9) hoher thermischer Leitfähigkeit aufweisen, vorzugsweise eine Beschichtung aus Graphit oder Diamant; und/oder (c) hochpoliert sind.
Temperierkörper (4; 24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die Temperierfinger (5; 25) innerhalb einer Fläche mit einer Länge von 127,8 mm und einer Breite von 85,5 mm angeordnet sind; und/oder (b) dass die Anzahl der Temperierfinger (5; 25) der Anzahl der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) entspricht und vorzugsweise einen der folgenden Werte aufweist: 6, 8, 12, 16, 24, 48, 96, 384 oder 1536.
Temperierkörper (24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, (a) dass eine Außenwandung der Böden (11) der Kavitäten (2) und eine Stirnseite (25a) der Temperierfinger (5) zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses jeweils eine zueinander komplementäre formkorrespondierende nicht-plane Oberflächenform (82, 83) aufweisen; und/oder (b) dass eine Oberflächenform (83) der Stirnseiten (25a) der Temperierfinger (25) und der Außenwandungen (82) der Böden (11) der Kavitäten (2) zur Ausbildung eines lokalen Formschlusses als ineinandergreifende Verzahnung ausgeführt sind.
Temperierkörper (24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine von der Mitte zu zwei gegenüberliegenden Randbereichen des Temperaturkörpers (24) hin zunehmende Neigung der Stirnseiten (25a) der Temperierfinger (25) gegenüber einer planen Oberseite (6a) des Grundkörpers (6).
Temperierkörper (24) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zunehmende Neigung durch eine zunehmende Schrägstellung der auf der planen Oberseite (6a) des Grundkörpers (6) angeordneten Temperierfinger (25) oder durch eine zunehmende Abschrägung der Stirnseiten der Temperierfinger ausgebildet ist.
Temperierkörper (4; 24) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Grundkörper (6) wenigstens eine von einem Kühlfluid durchströmbare Leitung integriert ist, mit einem Zuflussanschluss (7a) und einem Abflussanschluss (7a) zur Verbindung der wenigstens einen Leitung mit einem Kühlkreislauf und/oder einem Heizkreislauf, wobei der Fluss eines Temperierfluids durch die wenigstens eine Leitung so steuerbar ist, dass vorbestimmte einzelne Temperierfinger (5; 25) und/oder wenigstens eine vorbestimmte Teilgruppe der Temperierfinger (5; 25) unterschiedlich im Vergleich zu den restlichen Temperierfingern (5; 25) temperierbar sind.
Temperiervorrichtung (40) zum Einfrieren von biologischen Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen von biologischen Proben, insbesondere einer kryokonservierten Probe, umfassend einen Temperierkörper (4; 24; 41, 42) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, eine Positioniereinrichtung zum Positionieren einer Multiwell-Platte (1), deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger (5; 25) entspricht, und des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) in einer vorbestimmten Lage relativ zueinander, wobei in der vorbestimmten Lage die Multiwell-Platte oberhalb des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) und die Kavitäten (2) jeweils zur Längsachse eines der Temperierfinger (5; 25) fluchtend positioniert sind; und eine Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen der Temperierfinger (5) des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) mit den Böden (11) der Kavitäten (2) einer in der vorbestimmten Lage positionierten Multiwell-Platte (1).
Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen einen Anpresskörper (8) umfasst, der von oben auf eine oberhalb des Temperierkörpers (41, 42) positionierte Multiwell-Platte (1) pressbar ist, um die Böden (11) der Kavitäten (2) der Multiwell-Platte (1) in Kontakt mit den Stirnseiten (5a) der Temperierfinger (5; 25) zu bringen.
Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen eine Mehrzahl elektrisch ansteuerbarer Stellglieder umfasst, die ausgeführt sind, an der Oberseite einer über der Temperiervorrichtung (4; 24; 41, 42) positionierten Multiwell-Platte (1) mittelbar oder unmittelbar anzugreifen, um bei Ansteuerung der Stellglieder einen Relativabstand zwischen der Multiwell-Platte (1) und dem Temperierkörper (4; 24; 41, 42) zu verändern, um die Temperierfinger (5; 25) und die Böden (11) der Kavitäten (2) in Kontakt und/oder außer Kontakt zu bringen.
Temperiervorrichtung (40) gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder als mikromechanische Aktoren oder als piezo-elektrische Stellglieder (30) ausgeführt sind; und/oder (b) dass die Mehrzahl der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder von der Temperiervorrichtung (4; 24; 41, 42) einzeln und/oder in Teilgruppen ansteuerbar sind, um einzelne Kavitäten (2) und/oder Teilgruppen von Kavitäten (2) unabhängig von den anderen Kavitäten in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper (4; 24; 41, 42) zu bringen; und/oder (c) dass mittels der elektrisch ansteuerbaren Stellglieder eine Auslenkung der Multiwell-Platte (1) in Richtung des Temperierkörpers (4; 24; 41, 42) im Bereich von 1 μm bis 1 mm erzeugbar ist; und/oder (d) dass die elektrisch ansteuerbaren Stellglieder von einer Steuereinheit der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen so ansteuerbar sind, dass ein aufeinanderfolgendes In-Kontakt-Bringen, ein Außer-Kontakt-Bringen und ein Wieder-In-Kontakt-Bringen von Multiwell-Platte (1) und Temperierkörper (4; 24; 41, 42) innerhalb einer Zeit durchführbar ist, die im Bereich von 1 ms (Millisekunde) bis 1 s (Sekunde) liegt.
Temperiervorrichtung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, gekennzeichnet durch eine Multiwell-Platte (1), deren Rasterabstand ihrer in Reihen und Spalten angeordneten Kavitäten dem Rasterabstand der Temperierfinger (5; 25) entspricht.
Temperiervorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, (a) dass in die Böden der Kavitäten (2) jeweils ein elektrisch ansteuerbares Heiz- und/oder Kühlelement, vorzugsweise ein Peltier-Element, integriert ist; und/oder (b) dass in zumindest einen der Böden der Kavitäten (2) ein Temperatursensor integriert ist; und/oder (c) dass die Böden der Kavitäten (2) wärmeleitend ausgeführt sind.
Temperiervorrichtung (40) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15, gekennzeichnet durch eine von unten kühlbare Temperierkammer (48), die mit einem trockenem Gas befüllbar ist und/oder befüllt ist und im gekühlten Zustand eine vertikale Temperaturschichtung in der Temperierkammer (48) mit einer unteren Kaltschicht (43a) und einer oberen Warmschicht (43b) aufweist; wenigstens eine an einer Gehäusewand der Temperierkammer (48) vorgesehene Schleuse (47a, 47b) zum Einbringen und/oder Ausführen einer Multiwell-Platte (1); einen in der unteren Kaltschicht (43a) angeordneten, an einen Kühlkreislauf angeschlossenen ersten Temperierkörper (41) zur Kryokonservierung biologischer Proben und/oder einen in der oberen Warmschicht (43b) angeordneten, an einen Wärmekreislauf angeschlossenen zweiten Temperierkörper (42) zum Auftauen kryokonservierter biologischer Proben.
Temperiervorrichtung gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, (a) dass eine aufzutauende Proben enthaltende Multiwell-Platte (1) mittels der Positioniereinrichtung über dem zweiten Temperierkörper (42) positionierbar ist; und (b) dass eine über die wenigstens eine Schleuse (47a) in die Temperierkammer (48) eingebrachte, zu gefrierende Proben enthaltende Multiwell-Platte (1) mittels der Positioniereinrichtung über dem ersten Temperierkörper (41) positionierbar ist; und (c) dass eine über dem ersten und/oder zweiten Temperierkörper (41, 42) positionierte Multiwell-Platte (1) mittels der Einrichtung zum In-Kontakt-Bringen gesteuert oder geregelt abgesenkt und/oder angehoben werden kann, um in Kontakt und/oder außer Kontakt mit dem Temperierkörper (41, 42) gebracht zu werden.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die Temperierkammer (48) mit LN2, N2-Gas oder einem Sterling-Motor gekühlt ist; und/oder (b) dass in der Temperierkammer (48) eine Eisfalle (49) angeordnet ist; und/oder (c) dass die Warmschicht (43b) eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Starttemperatur eines Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Zieltemperatur eines Auftauprozesses entspricht, während die Kaltschicht (43a) eine Temperatur aufweist, die im Wesentlichen einer vorgegebenen Zieltemperatur des Einfrierprozesses oder einer vorgegebenen Starttemperatur des Auftauprozesses entspricht.
Verfahren zum Einfrieren biologischer Proben, insbesondere zur Kryokonservierung, und/oder zum Auftauen biologischer Proben, insbesondere kryokonservierter Proben, unter Verwendung eines Temperierkörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einer Temperiervorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 18, umfassend den Schritt: Aufbringen einer Substanz (51, 61, 62, 63) auf eine in einer Kavität (2) der Multiwell-Platte (1) gelagerte Probe (20).
Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die aufgebrachte Substanz eine Lösung (62) ist, die beim Festwerden eine Oberfläche des Kavitäteninhaltes gegenüber dem Außenraum abschließt, vorzugsweise gasdicht abschließt; und/oder (b) dass die Substanz ein natürliches oder synthetisches Öl, eine Flüssigkeit oder ein Gel, welche mit einer wässrigen Lösung nicht mischbar sind, oder festes CO2 ist; und/oder (c) dass die Substanz (63) eine höhere Dichte als die eine die Probe umgebende Nährlösung (60) aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, (a) dass aus dem Zustand der eingebrachten Substanz eine Information über die Probe ableitbar ist und/oder die Substanz beim Auftauen der Probe eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt; und/oder (b) dass die Substanz eine Verdünnungs- und Waschlösung oder ein Gefrierschutzmittel ist, als Differenzierungsfaktor in Bezug auf die Probe wirkt oder eine Substanz ist, die Antioxidantien, Anti-Apoptosesubstanzen und/oder lebend-tot-Farbstoffe enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, (a) dass die Substanz (63) auf die bereits gefrorene Probe (60, 64) aufgebracht wird und die Substanz nach und/oder beim Auftauen der Probe (60, 64) eine vorbestimmte Reaktion oder Interaktion mit der Probe bewirkt (60, 64); und/oder (b) dass die Substanz eine Substanz (63) ist, aus deren Zustand ableitbar ist, ob nach dem Einfrieren der Probe ein zwischenzeitliches Auftauen erfolgt ist.